JP4152462B2 - ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス(prrsv)のヨーロッパワクチン株 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス(PRRSV)のヨーロッパ血清型の生弱毒株、この種の株の生産方法、それに基づくワクチン、並びにこの種のワクチンの製造方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
1987年、当時まで未知であったブタの病気が北米で検出され、その後にそこからカナダまで伝染した[H.ヒル;プロシーディング・オブ・ミステリー・スワイン・ディジーズ・コミティー・ミーティング、1990年10月6日、デンバー、コロラド、家畜保護協会、マジソン・ウィ、USA:ケファバー等;アメリカン・アソシェーション・スワイン・プラクト・ニュースレター、第1巻、第1〜9頁(1989)]。流産および呼吸病の両者を誘発するという事実を特徴とする病気は最初にミステリー・スワイン・ディジーズ(MSD)と呼ばれた。現在、米国およびカナダでは、この病気はブタ不妊症および呼吸症候群(SIRS)としても知られる。
【0003】
1990年以来、この病気はヨーロッパでも見られ、先ず最初にドイツ国で発生し、次いでオランダおよびベルギーでも発生し、さらに病気は現在ではヨーロッパ全体に伝染している。ヨーロッパにおいて、この病気はブタ生殖呼吸症候群(PRRS)として、およびブタ流行流産および呼吸症候群(PEARS)として一般に知られている。現在、この病気は世界的にPRRSと呼ばれる。
【0004】
その病理学は流産および呼吸病に限定されない。この病気に伴う他の徴候は次の通りである:嘔吐(off feed)、拒食症、四肢(特に耳)の青色変化。
【0005】
流産および呼吸病の両者に関する病気の病原作用がクリスチャンソン等によるコンプリヘンシブ・レビューに広範に記載されている[スワイン・ヘルス・アンド・プロダクション、第2巻、第10〜28頁(1994)]。
【0006】
現在、この病気の原因は、アルテリビリデー(Arteriviridae)の群に属する小エンベロプドRNAウィルスであることが知られている。
【0007】
ウェンスボート等によりなされた観察[J.Vet.Diagn.Invest、第4巻、第134〜138頁(1992)]およびムルトー等によりなされた観察[アーカイブ・バイロロジー、第140巻、第1451〜1460頁(1995)]は、疑う余地なくウィルスの2種の完全に異なる(血清)型、すなわちアメリカ(血清)型およびヨーロッパ(血清)型が存在することを明らかにした。
【0008】
このウィルスのヨーロッパ型がベンスボート等により記載されている[Vet.Quarterly、第13巻、第121〜130頁(1991)]。
【0009】
「レリースタッドウィルス」(LV)と呼ばれるこのヨーロッパ型の株がセントラル・ベテリナリー・インスチチュート、レリースタッド、オランダ国によるPCT WO 92/21375号と関連してインスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1102として寄託されている。他のヨーロッパ株がEPA No.91,202,646.5号に記載されており、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1140として寄託された。最近、このヨーロッパ株がコンツェルマン等により記載されている[バイロロジー、第193巻、第329〜339頁(1993)]。
【0010】
アメリカ型のウィルスはベンフィールド等により記載されている[J.Vet.Diagn.Invest、第4巻、第127〜133頁(1992)]。アメリカ型の菌株はNo.VR−2332としてATCCに寄託されており、PCT WO 93/03760号およびヨーロッパ特許出願第0,529,584号に挙げられている。アメリカ血清型の弱毒株はヨーロッパ特許出願第0,529,584号に記載されている。この株は寄託されたアメリカVR−2332株から直接に得られる。したがって、この株がワクチン接種された動物は、ヨーロッパ株による感染に対し効率的保護が得られない。これは、ヨーロッパ血清型に対するワクチンの基礎として使用すべくヨーロッパ血清型の生弱毒株の開発を必要とした。
【0011】
ヨーロッパ特許出願EP 0,676,467号において、ヨーロッパ血清型の生弱毒株が初めて開示された。ヨーロッパ血清型の弱毒株の例はウィルス株PRRS CおよびPRRS Dであって、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)に受託番号I−1387(株D)および受託番号I−1388(株C)として寄託されている。
【0012】
これら株はPRRSVに対する生弱毒化ワクチンの基礎として効果的である。しかしながら、これらは或る程度の毒力がまだ残留する。したがって、代案の弱毒化PRRSV株およびこの種のウィルスの製造方法が望まれる。
【0013】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、現存する弱毒化PRRSVウィルス株と比較して異なる弱毒特性の所望の特徴を有するヨーロッパ血清型の生弱毒化PRRSウィルス株を提供することにある。さらに本発明の課題は、この種の生弱毒化PRRSウィルス株の製造方法を提供することにある。
【0014】
【課題を解決するための手段】
これら課題は、マクロファージに対し感染性でないと言う独特の特徴を有するヨーロッパ血清型の生弱毒化PRRSウィルスを提供する本発明により解決される。これは、この種の株がマクロファージに対しまだ感染性である親株よりも弱毒化した特性をブタにて示す実施例にて示される。
【0015】
「マクロファージに対し非感染性」という表現は次のように理解せねばならない:本発明による<104組織培養感染性投与量(TCID)50の量は、感染の7日後でさえマクロファージ培養物に対し目に見えるCPEを与えない。典型的なマクロファージ感染性PRRSV野性株は、1 TCID50以上の感染粒子投与量にて完全CPEを与える。
【0016】
ヨーロッパ血清型のウィルスは、ヨーロッパPRRSウィルスLV[インスチチュート・パッスールにI−1102として寄託されたCDI−NL−2.91]に対する抗血清のパネルによる免疫ペルオキシダーゼ モノレイヤー・アッセイにて、アメリカPRRSウィルスSIRSV(ATCC VR−2332)に対する抗血清のパネルとの反応と比較し、より高い血清タイターを示すことを特徴とする。
【0017】
本発明の他の特徴は、本発明による生弱毒化PRRS株の製造方法を提供することである。現在、全てのヨーロッパPRRSV株は感染動物のマクロファージから得られ、次いで可能ならばMA 104細胞もしくはそのクローンに増殖につき保持される。本発明による方法は、非−MA 104細胞に対するMA 104−増殖PRRSウィルスの適応に関する。これら非−MA 104細胞は、たとえば限定された寿命期間を有する細胞または確立された不滅細胞ラインとすることができる。一般に、非−MA 104細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物非−MA 104細胞はたとえばBHK細胞ライン、CRFK細胞ラインおよびマジン・ダルビー・ボビン腎臓細胞ラインのような汎用目的の細胞ラインまたは、たとえばブタ睾丸細胞もしくはブタ腎臓細胞のようなブタ細胞であり、或いはこれらはたとえばベロ細胞のような非−MA 104霊長類細胞とすることができる。天然宿主細胞以外の細胞に対するPRRSVの適応は、次のように行いうる標準的方法からなっている:特定PRRSウィルス分離物を、ブタ細胞またはウィルスが増殖しうる他の非ブタ起源の感受性細胞(たとえばMA 104細胞)を含有する培地で増殖させる。増殖の後、PRRSVを、細胞培養液および/または細胞を集めた後に細胞培養液および/または細胞を適応用の他の細胞型で継代(passage)させて回収する。最初に1種の非−MA 104細胞ラインに適応させた株は、さらに弱毒化すべく他の非−MA 104細胞ラインに適応させることができる。所望ならば、この適応過程をさらに他の非−MA 104細胞で反復することもできる。種々異なる温度での増殖に対する適応は弱毒化過程の1部とすることができる。非−MA 104細胞で継代させた後、非−マクロファージ感染特性が小継代数の後に得られる。5継代数、一般にマスターシードウィルスを得るのに必要な継代数にて、しばしば本発明による非−マクロファージ−感染性ウィルスを得るのに充分である。
【0018】
【発明の実施の形態】
好適実施形態において、この方法は適応用の細胞として非−MA 104霊長類細胞を使用する。非−MA 104霊長類細胞への適応の後、さらに他の適応を他の任意の適する細胞で行いうることも明かである。
【0019】
より好適な実施形態において、この方法は適応用の非−MA 104霊長類細胞としてベロ細胞を使用する。
【0020】
このようにして得られた生弱毒株の非−マクロファージ感染特性の検査はマクロファージにおける得られたウィルス株のインビトロでの増殖が存在しないことを試験して容易に行うことができる。
【0021】
マクロファージ培養物の作成およびマクロファージ感染性ウィルスの増殖の両者に関する標準的技術は当業界にて公知であり、たとえばWO 93/07898号に記載されている。標準条件下で分離および増殖されたマクロファージに基づく簡単な試験システムは、本発明による生弱毒化PRRS株をまだマクロファージ感染特性を保持する他の生弱毒化PRRSウィルスから区別する試験システムと同様である。1つの可能な試験システムを実施例2に説明する。
【0022】
本発明によるPRRSV株の弱毒特性は、2種の株:I−1140(すなわちオランダ国にて1991年に分離された病原性PRRSV株)およびI−1387(すなわち低病原性PRRSV野性株)[両株はコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にその各番号で寄託]から出発して例示することができる。これら親株はマクロファージに対し感染性である。これら親株のうち、本発明による弱毒化された非−マクロファージ−感染性株を実施例1に記載するように作成した。マクロファージ−感染特性を実施例2に記載したように判定した。
【0023】
次の株を試験用に入手した:
1. I−1140 MA 104細胞にて第88継代
2. I−1140 ベロ細胞にて第61継代
3. I−1387 MA 104細胞にて第20継代
2. I−1387 ベロ細胞にて第49継代。
【0024】
下表は、これら株の感染特性を検査した試験結果を示す。
【0025】
【表1】
【0026】
さらに本発明による弱毒化につき親株として極めて適するものは、他面(すなわちマクロファージ感染性に関連しない)にて既に弱毒化されたPRRSウィルスである。この種のウィルスは、上記ヨーロッパ特許出願EP 0,676,467号に記載されている。これらウィルス株はヨーロッパ血清型に属し、これらはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1401として寄託されたハイブリドーマA27により生産されるモノクローナル抗体A27に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1402として寄託されたハイブリドーマA35により生産されるモノクローナル抗体A35に対しては反応性でない。この種のウィルスが本発明の方法によりマクロファージに対し非感染性にされれば、これらは一層安全となる。何故なら、その弱毒特性は一方が非−マクロファージ−感染特性である2つもしくはそれ以上の異なる面に依存するからである。したがって本発明の一層好適な実施形態において、本発明による生弱毒化PRRSVはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1401として寄託されたハイブリドーマA27により生産されるモノクローナル抗体A27に対し反応性であるが、インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にNo.I−1402として寄託されたハイブリドーマA35により生産されるモノクローナル抗体A35に対しては反応性でないという追加特性を有する。
【0027】
I−1387株から得られた本発明による非−マクロファージ−感染性株はベロ細胞に対し継代した後に高度に弱毒化されるので、この生弱毒株は動物に投与する際に、極めて安全である(実施例2以降参照)。したがって他の一層好適な本発明の実施形態において、生弱毒化PRRSVはコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス・オブ・インスチチュート・パッスール、25ルー・ド・ドクツール・ルー、75724パリ・セデックス15に受託番号I−1758としてアクゾ・ノーベルNV社により寄託されたウィルス株である。この株には「PRRSV株DV」という同定記号が与えられ、したがって本明細書では株DVとも称する。
【0028】
本発明による生弱毒化ウィルスは、マクロファージに感染する能力を持たない結果、次の理由でワクチンの極めて適する基礎となる:これら株はマクロファージに対し感染性でない。マクロファージは野性型PRRSVの主たる標的細胞および免疫系の重要細胞の1種である。しかしながら、これらは免疫系を始動させる能力をまだ保持している。したがって、ヨーロッパ特許出願EP 0,676,467号に記載されたヨーロッパ血清型の公知の生弱毒株に基づくワクチンとは異なり、本発明による生弱毒化ウィルスからなるワクチンは免疫系を同時に阻害することなく免疫系を始動させる。
【0029】
したがって本発明のウィルス株に基づくワクチンは、公知の弱毒株に基づくワクチンとは異なる種類の安全性を与える。
【0030】
したがって、さらに他の実施形態において本発明は、PRRSV−感染に対しブタを保護するためのワクチンを提供し、これらワクチンは上記生非−マクロファージ−感染性弱毒化PRRS株に基づくものである。
【0031】
非−マクロファージ−感染性ウィルスの安全性により、これらウィルスに基づくワクチンは典型的には103〜1010個の生ウィルス粒子を含有しうる。
【0032】
本発明によるワクチンは医薬上許容しうるキャリヤを含みうる。1種の可能なキャリヤは生理学的食塩溶液である。他の医薬上許容しうるキャリヤは、たとえば細胞増殖を維持すべく使用される組織培養液であり、そこでウィルスが感染細胞から遊離される。
【0033】
アジュバントおよび必要に応じ1種もしくはそれ以上の乳化剤(たとえばツイーン(登録商標)およびスパン(登録商標))も本発明による生弱毒化ワクチンに混入することができる。適するアジュバントは、たとえばビタミン−E酢酸塩溶解物、水酸化アルミニウム、燐酸アルミニウムもしくはアルミニウム酸化物、(鉱物)油エマルジョン(たとえばバイオール(登録商標)およびマルコール52(登録商標))、並びにサポニンである。イスコムにおける抗原の混入も可能なアジュバントの形成法(adjuvation)である。
【0034】
本発明によるワクチンは好ましくは凍結乾燥型で製造される。特に生ウィルスの乾燥組成物を凍結乾燥により作成する場合は、安定化剤を生弱毒化ウィルスに添加するのが有利である。適する安定化剤はたとえばSPGA[ボバルニク等、ジャーナル・バクテリオロジー、第59巻、第509頁(1950)]、炭水化物(たとえばソルビトール、マニトール、トレハロース、澱粉、蔗糖、デキストランもしくはグルコーズ)、蛋白質(たとえばアルブミンもしくはカゼイン)、またはその分解生成物、並びに緩衝剤(たとえばアルカリ金属燐酸塩)である。所望ならば、上記アジュバント活性を有する1種もしくはそれ以上の化合物も添加することができる。
【0035】
本発明によるワクチンは筋肉内もしくは皮下注射または鼻腔内、気管内、経口、皮膚(cutane)、経皮/皮膚内又は皮膚内の各投与により投与することができる。極めて便利な投与ルートは皮膚内もしくは筋肉内投与である。したがって、好適具体例において本発明によるワクチンは皮膚内もしくは筋肉内投与に適するキャリヤを含む。生理学的食塩溶液が皮膚内もしくは筋肉内投与のための簡単かつ適するキャリヤである。
【0036】
本発明によるワクチンは1週令、3週令、6週令もしくは10週令の雌ブタ、または交配前および/または分娩の6週間前までの雌ブタ(ブースターワクチン接種)、或いはそれぞれ半年の雄ブタ(ブースター)のワクチン接種履歴に応じてブタに投与することができる。
【0037】
好適実施形態において本発明のワクチンは生弱毒化PRRSウィルスの他に、他の無関係(すなわち非−PRRSV−)の弱毒化もしくは失活病原体または他の病原体からの抗原性物質をも含む。この種の病原体はたとえば細菌もしくは寄生虫としうるが、ウィルス起源であってもよい。一般に、無関係の病原体またはその抗原物質はブタ病原体である。
【0038】
この種の追加の弱毒化もしくは失活病原体または他の病原体からの抗原性物質をも含む本発明によるワクチンは、数種の感染に対する保護を同時に誘起するという利点を有する。抗原性物質は、免疫反応を誘発しうる物質であると理解される。抗原性物質の例は蛋白質、多糖類およびリポ多糖類である。
【0039】
より好適な実施形態において病原体はシュードラビエスウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エッシェリチア・コリ、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニュモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニウモニアエの群から選択される。
【0040】
本発明によるワクチンは、本発明によればヨーロッパ血清型の任意の生弱毒化PRRSウィルス分離物から得ることができる。本発明による方法を用いて開発された寄託PRRSV株DVは、極めて適するワクチン株になる全ての特性を有する。したがって好適実施形態において、ワクチンはインスチチュート・パッスールに受託番号I−1758として寄託されたPRRSV株DVから得られる。
【0041】
さらに他の実施形態において、本発明はPRRSに対処するための生弱毒化ワクチンの製造方法をも提供する。本発明による生弱毒化PRRSVに基づくワクチンを得る便利な方法は、適量の本発明によるウィルスを医薬上許容しうるキャリヤと混合することからなっている。
【0042】
さらに、たとえば上記したアジュバント、乳化剤および安定化剤のような他の物質を添加してワクチンの性能および安定性を向上させることもできる。
【0043】
実施例1:適応実験
ベロ細胞に対するPRRSV分離物I−1140の適応:
1991年にオランダ国で分離された病原性PRRSV株I−1140[上記した通りであって、コレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にこの番号にて寄託]を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養し、次いで次のようにMA 104細胞にて増殖させた。
【0044】
MA 104細胞の半密集(confluence)モノレイヤー(70cm2)に、1のMOIを有する80%密集にてPRRSV株を接種した。先ず最初に組織培養培地を取出して接種を行い、次いで1mLのPRRSVウィルスを添加し、モノレイヤー上に少なくとも2時間にわたり37℃にて放置した。この時間の後、新たな組織培養培地を添加し、細胞をさらに湿潤CO2(5%CO2)中で37℃にて培養した。CPEが観察された際、上澄液を集めて細胞を3回にわたり凍結および解凍させ、2000rpmにて10分間にわたり遠心分離して上澄液を集めた。次いで両上澄液をプールし、これを使用して同じ細胞の新たなモノレイヤーに接種した。次いで、この過程をウィルスが細胞ラインに充分適応すると共にマクロファージ培養物に匹敵するタイターがこの細胞ラインにて得られるまで反復した。この過程に際し、ウィルスの同定を免疫蛍光分析(IFA)によりPRRSV特異性ポリクローナル血清およびPRRSV特異性モノクローナル抗体の両者を用いて決定した。
【0045】
MA 104細胞におけるI−1140の第5継代を用いて次の方法によりCV1(アフリカ ミドリザル腎臓)細胞に感染させた:
CV1細胞を標準細胞増殖条件下で増殖させた。
【0046】
70〜80%密集にて培地をCV1モノレイヤーから取出した。MA 104細胞の感染モノレイヤーから最大CPEにて得られた上澄液を先ず最初に0.2μmフィルタで濾過し、次いでCV1モノレイヤーに載せた。37℃および5%CO2で1日間培養した後、培地を新たな組織培養培地で置換した。細胞をさらに37℃および5%CO2にて7日間にわたり培養した。この期間に際し毎日顕微鏡検査した。7日間の後、細胞を3回凍結および解凍させ、上澄液を遠心分離により回収すると共に0.2μmフィルタで濾過した。濾過された材料を次いで上記したように新たなCV1細胞のモノレイヤーを培養すべく用いた。この過程を3回行い、第3回の後、回収されかつ濾過された上澄液をMA 104細胞での上澄液の培養によりPRRSVの存在につき検査した。PRRSVの存在は、PRRSV特異性モノクローナル抗体I−1401を用いてPRRSV特異性蛍光の存在により示した[モノクローナル抗体I−1401はコレクション・ナショナーレ・デ・カルチュール・デ・ミクロオルガニスメス(CNCM)・オブ・インスチチュート・パッスール(パリ、フランス国)にこの番号で寄託した]。
【0047】
6.6 TCID50/mLのPRRSVタイターがCV1細胞の上澄液に見られた。CV1細胞におけるI−1140の第13継代を上記方法によりベロ細胞で行った。今回は、3回の盲検継代の後にPRRSVがベロ細胞の上澄液に検出された。このウィルスをさらにベロ細胞における第61継代を行ってさらに適応させた。
【0048】
比較のため、MA 104細胞における親株I−1140の第88継代(したがって非−MA 104細胞に適応していない)を表1に対照として使用し、ここで各種のウィルス株のマクロファージ感染性を比較した。
【0049】
ベロ細胞に対するPRRSV分離物I−1387の適応
分離物I−1387を先ず最初にブタ肺マクロファージで培養した。次いでI−1387の第5継代を上記方法によりMA 104細胞に載せた。
【0050】
MA 104細胞におけるI−1387の第38継代を用いて、上記方法によりベロ細胞に感染させた。
【0051】
PRRSVがベロ細胞の上澄液に検出された。この分離物をさらにこれら細胞での第49継代を行ってベロ細胞に適応させた。
【0052】
このウィルス株を安全性実験およびワクチン接種実験に用い、これを実施例2および3で説明する。
【0053】
比較のため、MA 104細胞における親株I−1387の第20継代(したがって非−MA 104細胞に対し適応していない)を表1に対照として用い、ここで各種の株のマクロファージ感染性を比較した。
【0054】
実施例2:マクロファージ感染性試験システム
この試験において、表1に挙げた4種のウィルス株(上記)を次のようにマクロファージ感染性につき検査した:
次のようにブタ肺胞マクロファージを得た:SPFブタを殺し、その肺を剔出して3000mLのPBSで洗浄した。細胞を遠心分離により集め、MEM−培地(ギブコ)+10%FCSに0.3×106細胞/mLの濃度まで再懸濁させた。最後に細胞を225μL細胞懸濁物/ウェルにて96ウェル微小培養プレートにシーディングすると共にプレートをCO2培養器にて4日間貯蔵した。
【0055】
滴定の直前に、ミクロタイタープレートを空け、新たな培地を再充填した。試験すべきウィルスの104MA 104−感染性ウィルス粒子を含む25μLの試料をウェルに施し、10倍シリーズ希釈物を作成した。最後に、プレートをCO2培養器にて7日間培養した。
【0056】
CPEにより測定されるマクロファージにおける増殖は非−MA 104−細胞に適応した株につき検出されなかったのに対し、非適応の対照株は予想通りマクロファージに対し感染性であった。その結果を表1に示す(上記参照)。
【0057】
実施例3:弱毒化試験
これら細胞に対するウィルスの適応が毒力の積極的弱毒化を誘発したかどうかを試験するため、全てのウィルス株を次の方法により妊娠雌ブタにて試験した:PRRSウィルスおよびPRRSV特異性抗体に対し陰性である雌ブタに上記PRRSV株の1種を妊娠の約90日にて感染させた。上記株の毒力を測定するため、流産した小ブタおよび1週間以内に死亡した小ブタの頭数を測定した。次の結果が得られた:
【0058】
【表2】
【0059】
上記表2から結論しうるように、マクロファージ感染性を喪失したPRRSV株は好適な弱毒特性を示す。
【0060】
I−1140につき、顕著に少ない死亡小ブタが非−マクロファージ感染株での雌ブタの感染後に見られた。親I−1140株と対比してベロ細胞に適応したI−1140の投与量における300倍の増加量を投与したという事実のため、毒力における極めて著しい減少が確認された。
【0061】
同様な結果が、I−1387を雌ブタに投与した実験でも観察される。107.5TCID50の投与量はまだ顕著な頭数の死亡小ブタをもたらした。しかしながら、非−マクロファージ感染株を用いれば毒力における顕著な低下が観察された。極めて多い投与量(107.5TCID50の投与量に対し10倍の増加)で投与したが、顕著に低い頭数の小ブタが死亡すると判明した。
【0062】
実施例4:安全性実験
(I)5〜6週令の小ブタにおける株DVの安全性、単一投与および高投与
3種の実験は標的動物(すなわち若い小ブタ)のワクチン接種を含んだ。これら実験の設定を表3に要約する。
【0063】
安全性試験のため、各動物をワクチン接種に寄与しうる可能な臨床的徴候につきスクリーニングした。
【0064】
【表3】
【0065】
結果:
これら実験において、ワクチン接種の後にはワクチン接種に起因する臨床的徴候は認められなかった。
【0066】
結論:
本発明によるウィルス株は標的動物、すなわち若い小ブタに対し完全に安全である。
【0067】
(II)妊娠雌ブタに対する安全性
妊娠雌ブタを安全性試験のための最も敏感な動物と見なす。何故なら、妊娠の約90日にてPRRSウィルスでの感染が高比率の流産およびミイラ化(30〜100%)並びに生存出産小ブタの出産第1週後における高比率の死亡をもたらすからである。
【0068】
この安全性試験にて、各雌ブタには妊娠の94日にて筋肉内および皮膚内の両者で注射部位1ケ所につき108.3TCID50の大投与量を接種した。
【0069】
各試験は次の項目を含んだ:
−各雌ブタにおける局部的および全身的反応
−ワクチンの「取入れ」を示す出産時の雌ブタにおける抗体レベル
−雌ブタの生殖性能
−出産日に採取した小ブタの血清試料からのウィルス再分離物。
【0070】
結果:
免疫蛍光分析で測定した抗体レベルは全ての雌ブタにて>8(log2)であり、これはウィルスが採取されたことを示す。ワクチン接種の後、5日間にわたり温度を監視すると共に14日間にわたり臨床観察を行って全身的反応が観察されなかった。筋肉内ワクチン接種後の7日における1頭のブタでのみ僅かな局部的反応が観察された。皮膚内投与の1週間後に局部的皮膚反応が見られた:赤色化、発熱、触診しうる斑点、および幾つかの病巣。これら局部的皮膚反応は急速に消失し、もはや第2週目には見られなかった。
【0071】
生殖性能の結果を表4に要約する:
【0072】
【表4】
【0073】
生存した小ブタの頭数は少なくとも公称平均数(ハンドブック・ボア・デ・バーケンショウデリジISBN 90−800999−3−7にしたがい>=10.08)であると思われる。これは、これら同じ雌ブタにて従来見られた生殖性能に完全に一致する。
【0074】
結論:
この実験にて流産を誘発する妊娠の最適時点における極めて高い投与量にて投与したが、PRRSウィルス感染の臨床徴候は観察されなかった。
【0075】
実施例5:ワクチン接種−チャレンジ実験
2回のワクチン接種−チャレンジ実験にて、本発明によるPRRSウィルスでワクチン接種した保護特性につき検査した。両実験にて10頭のPRRS抗体フリーの小ブタの群に5〜6週令にて103.5〜106.9TCID50の範囲で変化するタイターにてワクチン株DV PRRSウィルスをワクチン接種した(表2参照:群131および135)。これら実験において、安全性および伝染性の面も検査した。ワクチン接種の4週間後、これら小ブタには鼻腔内にて105TCID50の異質野性型PRRSウィルスを接種した。ワクチン接種およびウィルス接種の後、血清学的反応をワクチン接種動物にて監視すると共に、ワクチン接種動物と直接接触させたセンチネル動物および同じ建物内であるが物理的に分離した場所(異なるブタ小屋)に入れた対照についても監視した。
【0076】
ワクチンの保護特性を判定する主たる基準は、チャレンジ後の種々の時間で得られた血清からの再分離されたチャレンジ株の量である。再分離は2種の異なるパラメータで判定した:チャレンジウィルスが再分離されうる時間、および再分離の時点におけるウィルスのタイターを測定した。
【0077】
結果
血清学的反応
ワクチン接種およびチャレンジの後にlog2単位にてIFAで測定した抗体タイターをワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表5に示す。
【0078】
【表5】
【0079】
最高の抗体タイターが実験131にて見られた。この実験は、明瞭な抗体反応が既にワクチン接種の2週間後に検出されうることを示した。両実験にて、ワクチン接種動物におけるタイターは対照におけるよりもずっと高く、同様にチャレンジ後も同様であった。これは特に実験131の場合であった。筋肉内および皮膚内投与後の実験135で測定された血清学的反応も匹敵するものであった。恐らく、観察された最低のタイターおよび最も遅いブースター反応は103.5TCID50の投与量でワクチン接種した群に見られたが、試験したこの最低の投与量でも顕著なタイターが得られた。センチネル:4頭の動物のうち2頭が実験131にて血清変化し、実験135では12頭のうち1頭であった。両実験にて、ワクチン接種体と同じ区域に保たれたが物理的に分離された対照では血清変化が見られなかった。
【0080】
再分離(チャレンジ)ウィルス
血清に見られた平均PRRSVタイター(log10)(各群につき平均)をワクチン接種体、センチネルおよび対照につき表6に示す。
【0081】
【表6】
【0082】
実験131にて、チャレンジウィルスはワクチン接種動物から再分離されなかった。実験135において、再分離割合および再分離の期間における顕著な低下が、非ワクチン接種対照と対比して全ての群で見られた。103.5TCID50の投与量にて筋肉内ワクチン接種した群における低下率に関する効果は他の群におけるよりも僅かに低かった。
【0083】
実験131における4頭のセンチネルのうち2頭のみがワクチン接種後に血清変化し、実験135では12頭の動物のうち1頭のみが血清変化した。同じ群の他の1頭のセンチネル動物(i.m.104.5)にて、PRRSウィルスがチャレンジの時点で分離され、これは恐らくワクチンウィルスであった。
【0084】
結論:
明瞭な抗体反応がワクチン接種の2週間後に既に検出でき、これは高タイターである。
【0085】
筋肉内および皮膚内投与の後の血清学的反応は匹敵するものである。103.5TCID50の投与量でさえ顕著なタイターが得られる。非ワクチン接種対照と対比し、全ての群にて再分離は見られず或いは顕著に減少した再分離割合および再分離の期間が見られた。ウィルスは極めて低い割合でのみ直接対照に伝染する。この伝染割合にて、ワクチンウィルスは数回の複製にて明確となり、これは本発明によるウィルス株の弱毒化特性を示す。
Claims (7)
- インスチチュート・パッスール(Institut Pasteur)に受託番号I−1758として寄託された株であることを特徴とするヨーロッパ血清型の生弱毒化ブタ生殖および呼吸症候群ウィルス(PRRSV)。
- 請求項1に記載の生弱毒化PRRSVと医薬上許容しうるキャリヤとからなることを特徴とするPRRSV感染に対しブタを保護するためのワクチン。
- 1種もしくはそれ以上の非−PRRSV弱毒化もしくは失活病原体またはその抗原物質をさらに含むことを特徴とする請求項2に記載のワクチン。
- 非−PRRSV病原体がシュードラビエスウィルス、ブタインフルエンザウィルス、ブタパルボウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、ロタウィルス、エッシェリチア・コリ(Escherichia coli)、エリシペロ・ルシオパチエ(Erysipelo rhusiopathiae)、ボルデテラ・ブロンチセプチカ(Bordetella bronchiseptica)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、ヘモフィルス・パラスイス(Haemophilus parasuis)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエ(Mycoplasma hyopneumoniae)およびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)から選択されることを特徴とする請求項3に記載のワクチン。
- 皮膚内もしくは筋肉内の投与に適するキャリヤを含むことを特徴とする請求項2〜4のいずれか一項に記載のワクチン。
- 凍結乾燥型であることを特徴とする請求項2〜5のいずれか一項に記載のワクチン。
- 請求項1に記載の生弱毒化PRRSVを医薬上許容しうるキャリヤと混合することを特徴とするPRRSVに対処するための生弱毒化ワクチンの製造方法。
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