JPH0463862B2 - - Google Patents
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Description
本発明はウシのウイルス性下痢症（BVD）ウ
イルスの変異株を含むワクチンに関する。 ウシのウイルス性下痢疾患は家畜の最も広範囲
に広まつた、経済上重大な疾患のひとつである。
該疾患は消化器粘膜の潰瘍化および下痢症を伴な
つた急性で致死率の高い牛疫様症候群の群の発生
が観察されて初めて米国で確認されたものであ
る。〔オラフソンら（OLAFSON et al.，
Cornell Vet.，Vol.36、205〜213、1946）参照〕
同時期、重度、慢性度および蔓延率の程度が異な
る類似の症例がラムセイ．エフ．ケイら
（RAMSEY，F.K.et al.，North.Am.Vet.，
Vol.34、629〜633、1953）によつて報告され、粘
膜病と命名された。暫くの間、数種の異なつた感
染が存在すると考えられていた。しかし、両方の
用語が文献中に浸透し、粘膜病症候群なる語が常
用されるようになつた後、結局、同じウイルスが
この２つの症候群の原因であると結論されるに至
つた。そこで、該疾患は優先性により、ウイルス
性下痢疾患と称されるようになつた。 BVDの病因因子は、トガビリダエ
（Togaviridae）科のペストウイルス
（pestivirus）として分類されるRNAウイルスで
ある〔アンドリユース・シイら（ANDREWES.
C.et al.，Viruses of the Vertebrates，4th
ed.，London；Bailliere Tindall、1978）参照〕。 飼育場における臨床症状の発現はかなり変化す
る。一般に、７〜11日の潜伏期間後、一相性また
は二相性の39.5〜41.5℃の発熱、食欲不振、下痢
が起こる。時々、該下痢症は激しいしぶりを伴な
つて、未消化食物、血液凝集粘液およびジフテリ
アストランドの排泄に進行する。多飲多渇症の併
発にもかかわらず、該動物は脱水状態となり、速
かに、衰弱する。 BVDは主に消化管の感染と関連するが、一連
の症状は、通常、呼吸器併発症、すなわち、呼吸
頻繁および咳と共に、後に化膿する漿液性または
粘液性の鼻漏から開始することが示唆されている
（エス・エフ・ロスナー（S.F.ROSNER，Iowa
Vet.Vol.35、11〜14、1964）参照〕。多くの著者
も鼻漏が漿液性から粘液化膿性に進行することを
報告している。 該疾患に関連する主な病理学的変化は消化器粘
膜の充血、出血、浮腫、びらんおよび潰瘍であ
る。肺性浮腫と共に気道粘膜表面の充血も観察さ
れる。通常、著しい白血球減少が特に感染の早期
においてみられる。総白血球数は実験的接種後約
14日で正常値に回復することが観察されている
〔スコツト・エフ・ダブリユウら（SCOTT F.W.
et al.，Cornell Vet.，Vol.63、536〜560、1973）
参照〕。 これらに基づいて、ミルズ・ジエイ・エイチ・
エルら（MILLS J.H.L.et al.，Am.J.Vet.Res.，
Vol.29、1367〜1375、1968）は、「呼吸経路によ
る伝播が１つの可能な拡散様式である」と示唆し
ている。 BVD感染に対する先天性免疫耐性がこの希に
みる致命症の潜在的原因とされており、またコル
チコイド処理によつて誘発される免疫抑制が
BVDの人工感染の発病力を増強させることが知
られている。該免疫抑制動物は、しばしば、全身
ウイルス性血症で死ぬことがある〔ローデ・ジイ
ら（ROHDE，G.et al.，Zbl.Vet.Med.，Vol.17、
Ｂ：686、1970）およびシヨーペ・アール・イー
（Shope，R.E.et al.，Can.J.Comp.Med.，
Vol.40、355〜359、1976）参照〕。 一旦、明白な臨床的徴候が群の中に観察される
と、通常、おかされている固体および群において
該感染が十分に確立していることとなる。これら
の臨床症例を治療するために用いる特異的な治療
方法はない。重度ならば通常は死亡するし、軽度
ならば抗生物質によつて二次感染を制御して回復
を早めることができる。 普通の飼育場条件下で「隔離群」を維持す試み
はBVDウイルスによる感染を防ぐには不十分で
あることが立証されている。そのため、予防法は
主にワクチンに基く。 不活性ワクチンについてはかなりの研究が行な
われてきた〔マツク・クラーキン・エイ・ダブリ
ユウら（McCLURKIN A.W.et al.，Pro.
USAnim.Health.Assoc.，Vol.79、114〜123、
1975）参照〕。しかし、今までのところまだ商業
上利用できるものではない。所望の抗原物質を経
済的に許容できる様式で投与するために許容され
る剤形を製造する技術を欠くため、その実用化が
妨げられている。 いくつかの商業用BVD生ワクチンが知られて
いる。アール・エム・フイリツプスら〔R.M.
PHILLIPS et al.，Am.J.Vet.Res.，Vol，36、
135〜140（1975）〕は「BVD抑制用生ワクチンの
早期開発は、ウサギまたはウシ腎細胞培養での連
続継代によるウイルスの弱毒化に基づいて行なわ
れた。これらのワクチンは家畜におけるBVDウ
イルス感染を防ぐのに有効であることが証明され
たが、一方では接種後の合併症についての報告が
みられた」と報告している。同じ報文においてフ
イリツプスらはまた、ブタ細胞系弱毒化BVD生
ウイルスワクチンの開発について記載している。 しかしながら、これらの入手可能な生BVDワ
クチンは以前から知られているワクチンの他の固
有の弊害をさけられない（TERPSTRA，C.
EIKELENBOOM，J.L.and GLAS，C.
Proceedings of the XII th world congress
on diseases of cattle，Vol.1、1773、1982）。 飼育場において種々の頻度で発生する重篤なワ
クチン接種後合併症を説明する試みにおいて、ワ
クチン株自体の発病力以外にいくつかのもつとも
らしい理由が仮定された。しかし、合併症の原因
は評価するのが難しく、該ワクチンは非常に疑問
視されてきた。 本発明は、BVDウイルスの温度感受性（ts）
変異株、すなわち、動物の体温にかなり制限され
る複製能を示すが、重篤な副作用なしでウシに免
疫を誘起させることのできる株を提供することに
よつて今日まで知られているBVD生ワクチンの
弊害を克服するものである。 本発明の変異株は、BVDウイルス株の突然変
異誘発、さらに詳しくは、感染動物から単離され
たBVDウイルス、例えば、単離され、ヨーロツ
パ特許条約（EPC）の規定に従つてパリのアン
ステイチユー・パスツール（Institute Pasteur，
Collection Nationale de Cultures de
Microorganisms）に1982年７月20日付で受託番
号−198として寄託されているBVD野性型株の
亜硝酸処理のごとく、化学変異誘発剤による
BVDウイルス株の処理によつて調製される。 化学的薬剤による突然変異は当該分野で公知の
技術であり、突然変異を誘発することが知られて
おり、かつ、本発明方法に使用することのできる
化学的薬剤は、前記の亜硝酸の他にＮ−メチル−
Ｎ−ニトロソ−Ｎ−ニトログアニジン、メタンス
ルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル、５−
ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒドロキシ
ルアミン、５−アミノアクリジンのようなアクリ
ジン系染料およびプロフラビンがある。さらに詳
述すると、米国特許第3907986号および第3962424
号は亜硝酸処理による温度感受性ウイルス変異株
の調製および家畜における呼吸器疾患を予防する
のに有用な生ワクチン調製での該変異株の使用に
ついて記載している。しかし、BVDウイルスの
温度感受性変異体は本発明以前には知られていな
い。 本発明によれば、野生型BVDウイルス株から
ワクチンを調製するために、該株を化学的突然変
異誘発剤、例えば亜硝酸と初期ウイルス力価を２
〜3log10減少させる操作条件下で反応させ、得ら
れた変異株を35℃および39.5℃で各々培養するこ
とによつて39.5℃（ウシの体内器管温度）におい
てその35℃における増殖能よりも約3log10小さい
増殖能を示す温度感受性（ts）変異株を単離す
る。該温度感受性変異株は、ウシのウイルス性下
痢症ウイルスの増殖用の公知の組織培養〔例え
ば、入手制限なしでアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに受託番号ATCC CC144と
して寄託されているウシ腎細胞系または、マツク
ラーキン・エイ・ダブリユウら（McCLURKIN
A.W.et al.，Arch.Gesam.Virusforsch.，
Vol.45、285〜289、1974）によつて記載されてい
るウシ鼻甲介単層細胞〕中で適当な希釈度でクロ
ーンし、終点希釈によりクローンの選択を行なう
ことにより単離される。 さらに詳述すると、ウシのウイルス性下痢症の
典型的な症状を示す動物から単離した野性型株、
例えばC.N.C.M.−198ウイルス株を、ウシ下痢
症ウイルスを増殖させる組織培養、例えばウシ腎
細胞系またはウシ鼻甲介細胞系のような細胞系で
増殖させ、該株を前記組織培養に順応させた後、
前記ウシ下痢症ウイルスの懸濁液を室温にて化学
的突然変異誘発剤、例えば、亜硝酸緩衝水溶液、
例えば、培養液中の亜硝酸および酢酸緩衝液の濃
度が各々4Nおよび1Nであるような酢酸緩衝液中
亜硝酸と、１〜15分間、例えば、６（±１）分間、
PH５〜６、例えば、PH5.7（±0.1）で反応させ、
その後、例えば、1N水酸化ナトリウムを滴下し
てPHを7.5に調整することにより反応を止める。
ついで、該懸濁液を好ましくは透析し、希釈した
各希釈物を前記に示すような組織培養中で増殖さ
せる。その後、陽性の培養を35℃および39.5℃で
比較培養し、力価を測定し、両温度間で約
3log10TCID50の力価差を示す培養を選択する。
ついで、かかる温度感受性変異株を前記に示すよ
うなウイルス増殖用の組織培養中で増殖させ、該
温度感受性変異株、例えばC.N.C.M.−199ウイ
ルス株を単離するために、少なくとも１回終点希
釈継代によりクローンする。 C.N.C.M.−199株含有ワクチンを用いて免疫
抑制動物で行なわれた実験は、本発明によるこの
ワクチンが従来存在しているワクチンより著しく
改善されていることの強力な証拠を示した。 C.N.C.M.−199株で観察される症候の低レベ
ルはビルレントまたは「弱毒化」BVD株を免疫
抑制動物に使用した研究に記載されている重い病
像とは実にきわだつて対照的である。ビルレント
株を用いた研究結果はシヨーペ・アール・イーら
（SHOPE R.E.et al.，Can.J.Vomp.Med.，Vol
40、355〜359、1976）によつて報告されており、
また「弱毒化」株を用いた研究結果はビトル・ジ
エイ・エスら（BITTLE J.S.and HOUSE J.
A.，J.A.V.M.A.，Vol.163、878〜879、1973）に
よりウシを実験動物にして報告されている。後者
の場合、ビトルらは２頭の仔ウシをデキサメタゾ
ンで11日間処理し、「弱毒化ウイルス（C24V）」
によるワクチン接種以前では該動物は正常なまま
であつたが免疫抑制処理を中止すると直ちに熱お
よび白血球減少を伴なう典型的な粘膜病の症状が
発現すると報告している。ワクチン接種後24時間
で１頭が死亡したが、もう１頭は最終的に回復し
た。 本発明のC.N.C.M.−199株含有ワクチンを免
疫抑制された仔ウシに使用した試験では、平穏に
おさまる種々な程度の下痢以外には典型的な粘膜
病の臨床滴徴候は何ら観察されなかつた。また、
消化上の問題が観察された期間、毎日、ウイルス
の回収を試みたが、ワクチン接種動物から該
BVDウイルスは回収されなかつた。すなわち、
該臨床所見はワクチン接種動物の糞便中または眼
鼻分泌物におけるワクチンウイルスの存在とは関
連がない。観察された症候はウイルス血病とも関
係ない。また、遺伝学的に変化したワクチンウイ
ルスの出現が観察されなかつたことも注目すべき
ことである。 さらに、活性成分が温度感受性変異株であつ
て、生体の低温部位に投与される従来のワクチン
とは対照的に、本発明のワクチンはこのような経
路で投与された場合は感染性ではなく、伝統的な
非経口的経路、すなわち、動物の皮下または筋肉
内のいずれかに投与されなければならない。但
し、前記非経口投与後、例えば２〜３週間後、何
らかのブースター（追加抗原刺激）を投与する。 本発明によるワクチンの好ましい投与量単位は
少なくとも103.5TCID50、より好ましくは、少な
くとも104TCID50の変異ウイルス株を含む。本発
明方法より得られるBVD変異ウイルス株および
非経口投与することのできるその他のウシ生呼吸
器ウイルスワクチン（すなわち、ウシ呼吸器シン
シチウム（BRS）ウイルスワクチン）を含む複
合ワクチンで行つた実験は、該変異BVDウイル
ス株がもう一方の接種ウイルスの免疫原性を干渉
しない（すなわち、影響を及ぼさない）ことを示
しており、それゆえ他の態様に従えば、本発明は
前記に示すような温度感受性BVDウイルス変異
株と、非経口的経路によつて投与することのでき
る他のウシ用生ウイルスワクチンからなる複合生
ウイルスワクチンに関する。 本発明を次の実施例によつてさらに詳しく説明
するが、これらに限定されるものではない。 実施例 １ 突然変異誘発および突然変異株の選択 該疾患の典型的な症状を発現する仔ウシの鼻粘
膜由来のウシ下痢症ウイルス株を、仔ウシ睾丸細
胞培養中で10継代して該組織培養中に順応させ、
ヨーロツパ特許条約の規定に従つて、パリのアン
ステイチユー・パスツール〔Institute Pasteur，
Collection Nationale de Culture de
Microorganisms（C.N.C.M）〕に受託番号−
198として1982年７月20日に寄託した。 該ウイルスを、ウシラクトアルブミン水解物
0.25％（Ｗ／Ｖ）で補足したイーグル（Eagle）
の基礎および最少培地の50／50（Ｖ／Ｖ）混合物
からなる培地を用い、本明細書ではNLBK4細胞
系と称するウシ腎細胞系中で６継代して増殖させ
る。 第16代継代から得られる104.0TCID50／0.1mlを
含有するウイルス懸濁液1.25ml容を、１モル酢
酸／酢酸ナトリウム緩衝液1.25mlおよび４モル亜
硝酸ナトリウム水溶液1.25mlと混合する。該混合
液の最終PHは5.7であつた。ついで、該混合液を
室温にて６分間反応させ、その後、PH7.5（±0.5）
まで1N水酸化ナトリウムを滴下して該反応を止
める。PH調整は、ウイルス懸濁液中に存在させた
フエノールレツド指示薬の変色に従う。 該処理ウイルス懸濁液を、NaCl8ｇ、KCl0.2
ｇ、Na2HPO41.15ｇ、KH2PH40.2ｇおよび蒸留
水（800mlまで）からなり、蒸留水100ml中
MgCl2・6H2O溶液、その後蒸留水100ml中
CaCl20.1ｇ溶液と混合し、最終溶液を滅菌過
し、最終PHを7.2〜7.4としたリン酸緩衝食塩水中
で５℃にて５時間透析する。透析後、該ウイルス
懸濁液を液体窒素中で保存する。 感染力価試験は、10倍希釈当り４本の試験管を
用い、37℃で行なう。得られたウイルス懸濁液の
残留感染力は、出発C.N.C.M.−198ウイルス懸
濁液の感染力101.7TCID50／0.1mlであつた。ウイ
ルス懸濁液の一部0.1mlづつをウシラクトアルブ
ミン水解物0.25％（Ｗ／Ｖ）を補足したイーグル
の基礎および最少培地の50／50（Ｖ／Ｖ）混合培
養液で１／９に希釈し、NLBK4ウシ腎細胞系の
試験官80本に接種し、ついで、37℃にて５日間イ
ンキユベートする。試験管80本のうち31本がウイ
ルス増殖による細胞変性効果を示した。 細胞変性効果を示した各試験管を35℃および
39.5℃で比較培養し、力価を測定する。これらの
インキユベーシヨン温度は、出発ウイルス（C.
N.C.M.−198）が両温度では同等に増殖するが
40℃では増殖困難であつたことから、各々許容温
度および制限温度として選択した。該単離物の１
つは35℃および39.5℃の力価差が3.0log10TCID50
（培養物の50％を感染させる組織培養感染用量）
であつて温度感受性を示す。先の継代と同じ操作
条件下でさらに継代して増殖（第19代）させ、こ
れを凍結乾燥する。 ついで、該ウイルスを前記と同様の培養液を用
い、本明細書ではNLBT1と称するウシ鼻甲介細
胞系で２継代して増殖し、第21代の継代の時点で
ウイルスのストツクを調製する。 このウイルス・ストツクから、10-4.5希釈で、
同様な操作条件において96培養物を用いてさらに
クローン継代を行ない、８個の陽性培養を得た。
このうちの１つを、同じ条件でさらに１代継代し
（第24代）、種ロツトを形成させ、各々、103.6
TCID50のウイルスを含有するガラスバイアル中
で凍結乾燥する。このクローンの試料はヨーロツ
パ特許条約の規定に従つて、1982年７月20日付で
パリのアンステイチユー・パスツールに受託番号
−199として寄託された。 実施例 ２ ワクチンの製法 該種ロツト（C.N.C.M.−199）の試料を再水
和し、NLBT1細胞培養中に接種し、ついで前記
維持培地で覆う。 該細胞を許容温度（35℃±0.5）で５日間イン
キユベートする。ついで、上澄液を新たに別の培
養系列に接種する。細胞変性効果が該単層細胞の
50％に現われた時、上澄液を集め、保存し、これ
にカシトン（casitone，６％Ｗ／Ｖ）を添加し、
該混合物を−70℃で保管する。このウイルス懸濁
液を解凍し、ガラスバイアルに分注し、凍結乾燥
して１バイアル当り104TCID50またはその複数倍
を含有させる。 投与する直前に、投与量当り2.0mlの食塩水
（滅菌蒸留水中NaCl0.9％）を用い、該ワクチン
を再水和する。該ワクチンは筋肉内経路により投
与され、好ましくは、２回、例えば３週間間隔で
投与する。 実施例 ３ 該変異株の温度感受性 種々の温度で培養した後、0.2ml当りの
log10PFU（plauque forming unit；プラツク形
成単位）として表示されるプラツク形成能
（EOP）をC.N.C.M.−198株および−199株の
各々について測定する。結果を第１表に示す。こ
の結果はEOPが野性株C.N.C.M.−198では104.5
〜105.0であるが、変異株C.N.C.M.−199株は35
〜37℃で最適なEOPを有し、これが39℃では
1.5log10、39.5℃では3.0log10減少し、感染性ウイ
ルスが接種培養物から回収されず、39.5℃におけ
るCPEが陽性でないことを示す。
イルスの変異株を含むワクチンに関する。 ウシのウイルス性下痢疾患は家畜の最も広範囲
に広まつた、経済上重大な疾患のひとつである。
該疾患は消化器粘膜の潰瘍化および下痢症を伴な
つた急性で致死率の高い牛疫様症候群の群の発生
が観察されて初めて米国で確認されたものであ
る。〔オラフソンら（OLAFSON et al.，
Cornell Vet.，Vol.36、205〜213、1946）参照〕
同時期、重度、慢性度および蔓延率の程度が異な
る類似の症例がラムセイ．エフ．ケイら
（RAMSEY，F.K.et al.，North.Am.Vet.，
Vol.34、629〜633、1953）によつて報告され、粘
膜病と命名された。暫くの間、数種の異なつた感
染が存在すると考えられていた。しかし、両方の
用語が文献中に浸透し、粘膜病症候群なる語が常
用されるようになつた後、結局、同じウイルスが
この２つの症候群の原因であると結論されるに至
つた。そこで、該疾患は優先性により、ウイルス
性下痢疾患と称されるようになつた。 BVDの病因因子は、トガビリダエ
（Togaviridae）科のペストウイルス
（pestivirus）として分類されるRNAウイルスで
ある〔アンドリユース・シイら（ANDREWES.
C.et al.，Viruses of the Vertebrates，4th
ed.，London；Bailliere Tindall、1978）参照〕。 飼育場における臨床症状の発現はかなり変化す
る。一般に、７〜11日の潜伏期間後、一相性また
は二相性の39.5〜41.5℃の発熱、食欲不振、下痢
が起こる。時々、該下痢症は激しいしぶりを伴な
つて、未消化食物、血液凝集粘液およびジフテリ
アストランドの排泄に進行する。多飲多渇症の併
発にもかかわらず、該動物は脱水状態となり、速
かに、衰弱する。 BVDは主に消化管の感染と関連するが、一連
の症状は、通常、呼吸器併発症、すなわち、呼吸
頻繁および咳と共に、後に化膿する漿液性または
粘液性の鼻漏から開始することが示唆されている
（エス・エフ・ロスナー（S.F.ROSNER，Iowa
Vet.Vol.35、11〜14、1964）参照〕。多くの著者
も鼻漏が漿液性から粘液化膿性に進行することを
報告している。 該疾患に関連する主な病理学的変化は消化器粘
膜の充血、出血、浮腫、びらんおよび潰瘍であ
る。肺性浮腫と共に気道粘膜表面の充血も観察さ
れる。通常、著しい白血球減少が特に感染の早期
においてみられる。総白血球数は実験的接種後約
14日で正常値に回復することが観察されている
〔スコツト・エフ・ダブリユウら（SCOTT F.W.
et al.，Cornell Vet.，Vol.63、536〜560、1973）
参照〕。 これらに基づいて、ミルズ・ジエイ・エイチ・
エルら（MILLS J.H.L.et al.，Am.J.Vet.Res.，
Vol.29、1367〜1375、1968）は、「呼吸経路によ
る伝播が１つの可能な拡散様式である」と示唆し
ている。 BVD感染に対する先天性免疫耐性がこの希に
みる致命症の潜在的原因とされており、またコル
チコイド処理によつて誘発される免疫抑制が
BVDの人工感染の発病力を増強させることが知
られている。該免疫抑制動物は、しばしば、全身
ウイルス性血症で死ぬことがある〔ローデ・ジイ
ら（ROHDE，G.et al.，Zbl.Vet.Med.，Vol.17、
Ｂ：686、1970）およびシヨーペ・アール・イー
（Shope，R.E.et al.，Can.J.Comp.Med.，
Vol.40、355〜359、1976）参照〕。 一旦、明白な臨床的徴候が群の中に観察される
と、通常、おかされている固体および群において
該感染が十分に確立していることとなる。これら
の臨床症例を治療するために用いる特異的な治療
方法はない。重度ならば通常は死亡するし、軽度
ならば抗生物質によつて二次感染を制御して回復
を早めることができる。 普通の飼育場条件下で「隔離群」を維持す試み
はBVDウイルスによる感染を防ぐには不十分で
あることが立証されている。そのため、予防法は
主にワクチンに基く。 不活性ワクチンについてはかなりの研究が行な
われてきた〔マツク・クラーキン・エイ・ダブリ
ユウら（McCLURKIN A.W.et al.，Pro.
USAnim.Health.Assoc.，Vol.79、114〜123、
1975）参照〕。しかし、今までのところまだ商業
上利用できるものではない。所望の抗原物質を経
済的に許容できる様式で投与するために許容され
る剤形を製造する技術を欠くため、その実用化が
妨げられている。 いくつかの商業用BVD生ワクチンが知られて
いる。アール・エム・フイリツプスら〔R.M.
PHILLIPS et al.，Am.J.Vet.Res.，Vol，36、
135〜140（1975）〕は「BVD抑制用生ワクチンの
早期開発は、ウサギまたはウシ腎細胞培養での連
続継代によるウイルスの弱毒化に基づいて行なわ
れた。これらのワクチンは家畜におけるBVDウ
イルス感染を防ぐのに有効であることが証明され
たが、一方では接種後の合併症についての報告が
みられた」と報告している。同じ報文においてフ
イリツプスらはまた、ブタ細胞系弱毒化BVD生
ウイルスワクチンの開発について記載している。 しかしながら、これらの入手可能な生BVDワ
クチンは以前から知られているワクチンの他の固
有の弊害をさけられない（TERPSTRA，C.
EIKELENBOOM，J.L.and GLAS，C.
Proceedings of the XII th world congress
on diseases of cattle，Vol.1、1773、1982）。 飼育場において種々の頻度で発生する重篤なワ
クチン接種後合併症を説明する試みにおいて、ワ
クチン株自体の発病力以外にいくつかのもつとも
らしい理由が仮定された。しかし、合併症の原因
は評価するのが難しく、該ワクチンは非常に疑問
視されてきた。 本発明は、BVDウイルスの温度感受性（ts）
変異株、すなわち、動物の体温にかなり制限され
る複製能を示すが、重篤な副作用なしでウシに免
疫を誘起させることのできる株を提供することに
よつて今日まで知られているBVD生ワクチンの
弊害を克服するものである。 本発明の変異株は、BVDウイルス株の突然変
異誘発、さらに詳しくは、感染動物から単離され
たBVDウイルス、例えば、単離され、ヨーロツ
パ特許条約（EPC）の規定に従つてパリのアン
ステイチユー・パスツール（Institute Pasteur，
Collection Nationale de Cultures de
Microorganisms）に1982年７月20日付で受託番
号−198として寄託されているBVD野性型株の
亜硝酸処理のごとく、化学変異誘発剤による
BVDウイルス株の処理によつて調製される。 化学的薬剤による突然変異は当該分野で公知の
技術であり、突然変異を誘発することが知られて
おり、かつ、本発明方法に使用することのできる
化学的薬剤は、前記の亜硝酸の他にＮ−メチル−
Ｎ−ニトロソ−Ｎ−ニトログアニジン、メタンス
ルホン酸メチル、メタンスルホン酸エチル、５−
ブロモウラシル、２−アミノプリン、ヒドロキシ
ルアミン、５−アミノアクリジンのようなアクリ
ジン系染料およびプロフラビンがある。さらに詳
述すると、米国特許第3907986号および第3962424
号は亜硝酸処理による温度感受性ウイルス変異株
の調製および家畜における呼吸器疾患を予防する
のに有用な生ワクチン調製での該変異株の使用に
ついて記載している。しかし、BVDウイルスの
温度感受性変異体は本発明以前には知られていな
い。 本発明によれば、野生型BVDウイルス株から
ワクチンを調製するために、該株を化学的突然変
異誘発剤、例えば亜硝酸と初期ウイルス力価を２
〜3log10減少させる操作条件下で反応させ、得ら
れた変異株を35℃および39.5℃で各々培養するこ
とによつて39.5℃（ウシの体内器管温度）におい
てその35℃における増殖能よりも約3log10小さい
増殖能を示す温度感受性（ts）変異株を単離す
る。該温度感受性変異株は、ウシのウイルス性下
痢症ウイルスの増殖用の公知の組織培養〔例え
ば、入手制限なしでアメリカン・タイプ・カルチ
ヤー・コレクシヨンに受託番号ATCC CC144と
して寄託されているウシ腎細胞系または、マツク
ラーキン・エイ・ダブリユウら（McCLURKIN
A.W.et al.，Arch.Gesam.Virusforsch.，
Vol.45、285〜289、1974）によつて記載されてい
るウシ鼻甲介単層細胞〕中で適当な希釈度でクロ
ーンし、終点希釈によりクローンの選択を行なう
ことにより単離される。 さらに詳述すると、ウシのウイルス性下痢症の
典型的な症状を示す動物から単離した野性型株、
例えばC.N.C.M.−198ウイルス株を、ウシ下痢
症ウイルスを増殖させる組織培養、例えばウシ腎
細胞系またはウシ鼻甲介細胞系のような細胞系で
増殖させ、該株を前記組織培養に順応させた後、
前記ウシ下痢症ウイルスの懸濁液を室温にて化学
的突然変異誘発剤、例えば、亜硝酸緩衝水溶液、
例えば、培養液中の亜硝酸および酢酸緩衝液の濃
度が各々4Nおよび1Nであるような酢酸緩衝液中
亜硝酸と、１〜15分間、例えば、６（±１）分間、
PH５〜６、例えば、PH5.7（±0.1）で反応させ、
その後、例えば、1N水酸化ナトリウムを滴下し
てPHを7.5に調整することにより反応を止める。
ついで、該懸濁液を好ましくは透析し、希釈した
各希釈物を前記に示すような組織培養中で増殖さ
せる。その後、陽性の培養を35℃および39.5℃で
比較培養し、力価を測定し、両温度間で約
3log10TCID50の力価差を示す培養を選択する。
ついで、かかる温度感受性変異株を前記に示すよ
うなウイルス増殖用の組織培養中で増殖させ、該
温度感受性変異株、例えばC.N.C.M.−199ウイ
ルス株を単離するために、少なくとも１回終点希
釈継代によりクローンする。 C.N.C.M.−199株含有ワクチンを用いて免疫
抑制動物で行なわれた実験は、本発明によるこの
ワクチンが従来存在しているワクチンより著しく
改善されていることの強力な証拠を示した。 C.N.C.M.−199株で観察される症候の低レベ
ルはビルレントまたは「弱毒化」BVD株を免疫
抑制動物に使用した研究に記載されている重い病
像とは実にきわだつて対照的である。ビルレント
株を用いた研究結果はシヨーペ・アール・イーら
（SHOPE R.E.et al.，Can.J.Vomp.Med.，Vol
40、355〜359、1976）によつて報告されており、
また「弱毒化」株を用いた研究結果はビトル・ジ
エイ・エスら（BITTLE J.S.and HOUSE J.
A.，J.A.V.M.A.，Vol.163、878〜879、1973）に
よりウシを実験動物にして報告されている。後者
の場合、ビトルらは２頭の仔ウシをデキサメタゾ
ンで11日間処理し、「弱毒化ウイルス（C24V）」
によるワクチン接種以前では該動物は正常なまま
であつたが免疫抑制処理を中止すると直ちに熱お
よび白血球減少を伴なう典型的な粘膜病の症状が
発現すると報告している。ワクチン接種後24時間
で１頭が死亡したが、もう１頭は最終的に回復し
た。 本発明のC.N.C.M.−199株含有ワクチンを免
疫抑制された仔ウシに使用した試験では、平穏に
おさまる種々な程度の下痢以外には典型的な粘膜
病の臨床滴徴候は何ら観察されなかつた。また、
消化上の問題が観察された期間、毎日、ウイルス
の回収を試みたが、ワクチン接種動物から該
BVDウイルスは回収されなかつた。すなわち、
該臨床所見はワクチン接種動物の糞便中または眼
鼻分泌物におけるワクチンウイルスの存在とは関
連がない。観察された症候はウイルス血病とも関
係ない。また、遺伝学的に変化したワクチンウイ
ルスの出現が観察されなかつたことも注目すべき
ことである。 さらに、活性成分が温度感受性変異株であつ
て、生体の低温部位に投与される従来のワクチン
とは対照的に、本発明のワクチンはこのような経
路で投与された場合は感染性ではなく、伝統的な
非経口的経路、すなわち、動物の皮下または筋肉
内のいずれかに投与されなければならない。但
し、前記非経口投与後、例えば２〜３週間後、何
らかのブースター（追加抗原刺激）を投与する。 本発明によるワクチンの好ましい投与量単位は
少なくとも103.5TCID50、より好ましくは、少な
くとも104TCID50の変異ウイルス株を含む。本発
明方法より得られるBVD変異ウイルス株および
非経口投与することのできるその他のウシ生呼吸
器ウイルスワクチン（すなわち、ウシ呼吸器シン
シチウム（BRS）ウイルスワクチン）を含む複
合ワクチンで行つた実験は、該変異BVDウイル
ス株がもう一方の接種ウイルスの免疫原性を干渉
しない（すなわち、影響を及ぼさない）ことを示
しており、それゆえ他の態様に従えば、本発明は
前記に示すような温度感受性BVDウイルス変異
株と、非経口的経路によつて投与することのでき
る他のウシ用生ウイルスワクチンからなる複合生
ウイルスワクチンに関する。 本発明を次の実施例によつてさらに詳しく説明
するが、これらに限定されるものではない。 実施例 １ 突然変異誘発および突然変異株の選択 該疾患の典型的な症状を発現する仔ウシの鼻粘
膜由来のウシ下痢症ウイルス株を、仔ウシ睾丸細
胞培養中で10継代して該組織培養中に順応させ、
ヨーロツパ特許条約の規定に従つて、パリのアン
ステイチユー・パスツール〔Institute Pasteur，
Collection Nationale de Culture de
Microorganisms（C.N.C.M）〕に受託番号−
198として1982年７月20日に寄託した。 該ウイルスを、ウシラクトアルブミン水解物
0.25％（Ｗ／Ｖ）で補足したイーグル（Eagle）
の基礎および最少培地の50／50（Ｖ／Ｖ）混合物
からなる培地を用い、本明細書ではNLBK4細胞
系と称するウシ腎細胞系中で６継代して増殖させ
る。 第16代継代から得られる104.0TCID50／0.1mlを
含有するウイルス懸濁液1.25ml容を、１モル酢
酸／酢酸ナトリウム緩衝液1.25mlおよび４モル亜
硝酸ナトリウム水溶液1.25mlと混合する。該混合
液の最終PHは5.7であつた。ついで、該混合液を
室温にて６分間反応させ、その後、PH7.5（±0.5）
まで1N水酸化ナトリウムを滴下して該反応を止
める。PH調整は、ウイルス懸濁液中に存在させた
フエノールレツド指示薬の変色に従う。 該処理ウイルス懸濁液を、NaCl8ｇ、KCl0.2
ｇ、Na2HPO41.15ｇ、KH2PH40.2ｇおよび蒸留
水（800mlまで）からなり、蒸留水100ml中
MgCl2・6H2O溶液、その後蒸留水100ml中
CaCl20.1ｇ溶液と混合し、最終溶液を滅菌過
し、最終PHを7.2〜7.4としたリン酸緩衝食塩水中
で５℃にて５時間透析する。透析後、該ウイルス
懸濁液を液体窒素中で保存する。 感染力価試験は、10倍希釈当り４本の試験管を
用い、37℃で行なう。得られたウイルス懸濁液の
残留感染力は、出発C.N.C.M.−198ウイルス懸
濁液の感染力101.7TCID50／0.1mlであつた。ウイ
ルス懸濁液の一部0.1mlづつをウシラクトアルブ
ミン水解物0.25％（Ｗ／Ｖ）を補足したイーグル
の基礎および最少培地の50／50（Ｖ／Ｖ）混合培
養液で１／９に希釈し、NLBK4ウシ腎細胞系の
試験官80本に接種し、ついで、37℃にて５日間イ
ンキユベートする。試験管80本のうち31本がウイ
ルス増殖による細胞変性効果を示した。 細胞変性効果を示した各試験管を35℃および
39.5℃で比較培養し、力価を測定する。これらの
インキユベーシヨン温度は、出発ウイルス（C.
N.C.M.−198）が両温度では同等に増殖するが
40℃では増殖困難であつたことから、各々許容温
度および制限温度として選択した。該単離物の１
つは35℃および39.5℃の力価差が3.0log10TCID50
（培養物の50％を感染させる組織培養感染用量）
であつて温度感受性を示す。先の継代と同じ操作
条件下でさらに継代して増殖（第19代）させ、こ
れを凍結乾燥する。 ついで、該ウイルスを前記と同様の培養液を用
い、本明細書ではNLBT1と称するウシ鼻甲介細
胞系で２継代して増殖し、第21代の継代の時点で
ウイルスのストツクを調製する。 このウイルス・ストツクから、10-4.5希釈で、
同様な操作条件において96培養物を用いてさらに
クローン継代を行ない、８個の陽性培養を得た。
このうちの１つを、同じ条件でさらに１代継代し
（第24代）、種ロツトを形成させ、各々、103.6
TCID50のウイルスを含有するガラスバイアル中
で凍結乾燥する。このクローンの試料はヨーロツ
パ特許条約の規定に従つて、1982年７月20日付で
パリのアンステイチユー・パスツールに受託番号
−199として寄託された。 実施例 ２ ワクチンの製法 該種ロツト（C.N.C.M.−199）の試料を再水
和し、NLBT1細胞培養中に接種し、ついで前記
維持培地で覆う。 該細胞を許容温度（35℃±0.5）で５日間イン
キユベートする。ついで、上澄液を新たに別の培
養系列に接種する。細胞変性効果が該単層細胞の
50％に現われた時、上澄液を集め、保存し、これ
にカシトン（casitone，６％Ｗ／Ｖ）を添加し、
該混合物を−70℃で保管する。このウイルス懸濁
液を解凍し、ガラスバイアルに分注し、凍結乾燥
して１バイアル当り104TCID50またはその複数倍
を含有させる。 投与する直前に、投与量当り2.0mlの食塩水
（滅菌蒸留水中NaCl0.9％）を用い、該ワクチン
を再水和する。該ワクチンは筋肉内経路により投
与され、好ましくは、２回、例えば３週間間隔で
投与する。 実施例 ３ 該変異株の温度感受性 種々の温度で培養した後、0.2ml当りの
log10PFU（plauque forming unit；プラツク形
成単位）として表示されるプラツク形成能
（EOP）をC.N.C.M.−198株および−199株の
各々について測定する。結果を第１表に示す。こ
の結果はEOPが野性株C.N.C.M.−198では104.5
〜105.0であるが、変異株C.N.C.M.−199株は35
〜37℃で最適なEOPを有し、これが39℃では
1.5log10、39.5℃では3.0log10減少し、感染性ウイ
ルスが接種培養物から回収されず、39.5℃におけ
るCPEが陽性でないことを示す。
【表】
また、35℃および39.5℃における力価を種々の
継代レベルのウイルスについて測定し、その結果
を第２表に示す。第２表は、35℃および39.5℃に
おける力価差がウイルスの種々の継代レベルにわ
たつて安定であることを示している。
継代レベルのウイルスについて測定し、その結果
を第２表に示す。第２表は、35℃および39.5℃に
おける力価差がウイルスの種々の継代レベルにわ
たつて安定であることを示している。
【表】
実施例 ４
正常な仔ウシ用の弱毒化
ワクチンの種ロツトを５頭の血清陰性動物で試
験する。まず、ワクチンの10投与量を1N食塩水
２mlで再水和し、各動物に筋肉内経路によつて接
種する。３週間後、同投与量のワクチンを同様に
投与する。 臨床検査、直腸温度記録および白血球測定を第
１回投与後14日間毎日行なう。 その結果、何らの症状も観察されず、また、第
３表に示すごとく、39.2℃以上の体温上昇は記録
されなかつた。
験する。まず、ワクチンの10投与量を1N食塩水
２mlで再水和し、各動物に筋肉内経路によつて接
種する。３週間後、同投与量のワクチンを同様に
投与する。 臨床検査、直腸温度記録および白血球測定を第
１回投与後14日間毎日行なう。 その結果、何らの症状も観察されず、また、第
３表に示すごとく、39.2℃以上の体温上昇は記録
されなかつた。
【表】
ことである。
白血球（WBC）数の平均値は、観察期間を通
じて正常値のままであつた。 BVDに対する血清転化によつて示されるよう
に、全動物が免疫付与された。 実施例 ５ 免疫抑制動物用の弱毒化 BVDおよびウシ呼吸器シンシチウム（BRS）
ウイルスの両方に対して血清陰性の９頭の仔ウシ
に、ワクチンの第１回接種を行なう５日前から連
続12日間、デキサメタゾン0.1mg／Kgで毎日処理
する。 ４頭の動物（番号：16、30、82および83）に０
日目の筋肉内経路によつて種ロツトを接種し、ま
た、21日目にも同様に同投与量を投与する。ここ
でいう０日目のワクチン接種とは第１回のワクチ
ン接種で、第１回ワクチン接種に用いるワクチン
の投与量は実施例２で得られたワクチンの
105TCID50である。 ０日目および21日目に３頭の動物（すなわち、
番号：13、14および19）には、BRSウイルス
105.7TCID50およびBVDウイルス105TCID50を含
有するBRS／BVD複合ウイルスでワクチン接種
する。２頭の動物（すなわち、番号：80および
81）には０日目および21日目に、投与量あたり
105.7TCID50のウイルスを含有する同様のBRSウ
イルスワクチンでワクチン接種する。 臨床検査、体温記録および白血球数測定を第１
回接種後14日間行なう。同期間中、接種された４
頭の仔ウシの血液試料、眼鼻ぬぐい液および糞便
についてウイルスの検出を毎日試みた。その結果
および説明を第４表および第５図に示す。
白血球（WBC）数の平均値は、観察期間を通
じて正常値のままであつた。 BVDに対する血清転化によつて示されるよう
に、全動物が免疫付与された。 実施例 ５ 免疫抑制動物用の弱毒化 BVDおよびウシ呼吸器シンシチウム（BRS）
ウイルスの両方に対して血清陰性の９頭の仔ウシ
に、ワクチンの第１回接種を行なう５日前から連
続12日間、デキサメタゾン0.1mg／Kgで毎日処理
する。 ４頭の動物（番号：16、30、82および83）に０
日目の筋肉内経路によつて種ロツトを接種し、ま
た、21日目にも同様に同投与量を投与する。ここ
でいう０日目のワクチン接種とは第１回のワクチ
ン接種で、第１回ワクチン接種に用いるワクチン
の投与量は実施例２で得られたワクチンの
105TCID50である。 ０日目および21日目に３頭の動物（すなわち、
番号：13、14および19）には、BRSウイルス
105.7TCID50およびBVDウイルス105TCID50を含
有するBRS／BVD複合ウイルスでワクチン接種
する。２頭の動物（すなわち、番号：80および
81）には０日目および21日目に、投与量あたり
105.7TCID50のウイルスを含有する同様のBRSウ
イルスワクチンでワクチン接種する。 臨床検査、体温記録および白血球数測定を第１
回接種後14日間行なう。同期間中、接種された４
頭の仔ウシの血液試料、眼鼻ぬぐい液および糞便
についてウイルスの検出を毎日試みた。その結果
および説明を第４表および第５図に示す。
【表】
−：陰性
【表】
種々な程度の食欲不振および下痢症がワクチン
接種された仔ウシのすべてに観察されたことがわ
かる。しかし、それらの仔ウシのうち高熱または
白血球減少症の両方を呈するものはなく、BVD
ウイルスは採集された試料から再検出されなかつ
た。また、BRSとBVDの併用による累積的病原
性、あるいは干渉も何ら観察されなかつた。 実施例 ６ 人工的攻撃に対するC.N.C.M.株−199の効果 免疫抑制処理の間にワクチン接種された動物
は、第２回の接種後に血清転換する。該動物を、
２頭の対照群（BRSのみでワクチン接種された
動物）と共に第１回接種後35日目に攻撃した。 攻撃に用いたBVDウイルスはオスロス
（Osloss）株である〔ローデ・ジイら（ROHDE，
G.and LIESS，B.，Zbl.Vet.Med.，Vol.17、
B.686、1970）参照〕。動物当り106.8TCID50を用
いて鼻内に投与した。 臨床症状、体温、白血球数を攻撃後の14日間観
察した。ウイルスの再検出は全動物の血液より試
みた。 その結果、臨床症状も高熱も何も観察されなか
つた。 ワクチンを２回接種した仔ウシでは、攻撃後の
白血球数の減少はみられないが、対照群（動物番
号：80および81）では白血球減少がみられた。 106.8TCID50／動物の高投与量においてもオス
ロス株は病原性を示さなかつた。BRSウイルス
ワクチンを単独でワクチン接種した対照の番号80
および81の動物でも、高熱や臨床症状が観察され
なかつた。しかし、これらの２頭の動物はBVD
ワクチンを２回接種した仔ウシよりも白血球数が
少なく、ウイルス血症の形跡がみられた。
BVD／BRS複合ワクチンでワクチン接種された
動物も同様に、十分に保護された（番号：19、13
および14）。 その結果を第６表にまとめる。
接種された仔ウシのすべてに観察されたことがわ
かる。しかし、それらの仔ウシのうち高熱または
白血球減少症の両方を呈するものはなく、BVD
ウイルスは採集された試料から再検出されなかつ
た。また、BRSとBVDの併用による累積的病原
性、あるいは干渉も何ら観察されなかつた。 実施例 ６ 人工的攻撃に対するC.N.C.M.株−199の効果 免疫抑制処理の間にワクチン接種された動物
は、第２回の接種後に血清転換する。該動物を、
２頭の対照群（BRSのみでワクチン接種された
動物）と共に第１回接種後35日目に攻撃した。 攻撃に用いたBVDウイルスはオスロス
（Osloss）株である〔ローデ・ジイら（ROHDE，
G.and LIESS，B.，Zbl.Vet.Med.，Vol.17、
B.686、1970）参照〕。動物当り106.8TCID50を用
いて鼻内に投与した。 臨床症状、体温、白血球数を攻撃後の14日間観
察した。ウイルスの再検出は全動物の血液より試
みた。 その結果、臨床症状も高熱も何も観察されなか
つた。 ワクチンを２回接種した仔ウシでは、攻撃後の
白血球数の減少はみられないが、対照群（動物番
号：80および81）では白血球減少がみられた。 106.8TCID50／動物の高投与量においてもオス
ロス株は病原性を示さなかつた。BRSウイルス
ワクチンを単独でワクチン接種した対照の番号80
および81の動物でも、高熱や臨床症状が観察され
なかつた。しかし、これらの２頭の動物はBVD
ワクチンを２回接種した仔ウシよりも白血球数が
少なく、ウイルス血症の形跡がみられた。
BVD／BRS複合ワクチンでワクチン接種された
動物も同様に、十分に保護された（番号：19、13
および14）。 その結果を第６表にまとめる。
【表】
【表】
野性型BVDウイルス株による実験的感染はめ
つたに重篤な臨床症状をもたらさないことが知ら
れているので、第６表の結果は文献の結果と著し
く相異するものではない（SAURAT，P.et al.，
La Maladie des Muqueuses，Ed.L′Expansion
Scientifique Francaise，Paris 1972、P.76参
照）。 該指数（すなわち、試験した試料数に対する陽
性の試料数の比率）は、BRSのみでワクチン接
種した動物群の指数（９／20）が、２頭の仔ウシ
が一時的に陽性であるその他の仔ウシ群よりも著
しく高い。 実施例 ７ 飼育場におけるC.N.C.M.−199株の効果 BVDに対する抗体価の低い（すなわち８）
15日〜18ケ月令の103頭の仔ウシに、実施例２の
ワクチンの104.0TCID50の投与量を筋肉内経路に
て３週間間隔で２回投与した。ワクチンに基く臨
床反応は何ら報告されず、飼育場条件下における
ワクチンの安全性が実証された。 結果を第７表にまとめる。
つたに重篤な臨床症状をもたらさないことが知ら
れているので、第６表の結果は文献の結果と著し
く相異するものではない（SAURAT，P.et al.，
La Maladie des Muqueuses，Ed.L′Expansion
Scientifique Francaise，Paris 1972、P.76参
照）。 該指数（すなわち、試験した試料数に対する陽
性の試料数の比率）は、BRSのみでワクチン接
種した動物群の指数（９／20）が、２頭の仔ウシ
が一時的に陽性であるその他の仔ウシ群よりも著
しく高い。 実施例 ７ 飼育場におけるC.N.C.M.−199株の効果 BVDに対する抗体価の低い（すなわち８）
15日〜18ケ月令の103頭の仔ウシに、実施例２の
ワクチンの104.0TCID50の投与量を筋肉内経路に
て３週間間隔で２回投与した。ワクチンに基く臨
床反応は何ら報告されず、飼育場条件下における
ワクチンの安全性が実証された。 結果を第７表にまとめる。
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 有効量のウシのウイルス性下痢症ウイルスの
温度感受性変異株からなることを特徴とするウシ
に免疫付与するウシのウイルス性下痢症生ウイル
スワクチン。 ２ 該変異株が35℃と39.5℃の間で約
3log10TCID50の感染力価の差を示す前記第１項
のワクチン。 ３ 有効量が、少なくとも、該温度感受性変異株
の103.5TCID50である前記第１項のワクチン。 ４ 該温度感受性変異株が化学的変異誘発剤によ
る変異誘発で得られる前記第１項、第２項または
第３項のワクチン。 ５ 該化学的変異誘発剤が亜硝酸である前記第４
項のワクチン。 ６ ウシのウイルス性下痢症ウイルス株を、PH５
〜６にて緩衝水性培地中で亜硝酸と１〜15分間接
触させて変異誘発を行なう前記第５項のワクチ
ン。 ７ 少なくとも、１つの他の生ワクチン呼吸器ウ
イルスワクチンと組合せた前記第１項、第２項ま
たは第３項のワクチン。 ８ 生ウシ呼吸器シンシチウムウイルスワクチン
と組合せた前記第１項、第２項または第３項のワ
クチン。 ９ 該温度感受性変異株がウシのウイルス性下痢
症ウイルスC.N.C.M.−199株である前記第１
項、第２項または第３項のワクチン。 １０ ウシのウイルス性下痢症ウイルス株を、当
初のウイルス力価を２〜3log10減少させる操作条
件で室温にて化学的変異誘発剤と接触させ、35℃
および39.5℃で、各々、培養および力価測定を行
ない、35℃および39.5℃における力価に約
3log10TCID50の差を示す温度感受性変異株を単
離し、得られた変異株を適当な細胞培養中で大量
に増殖させ、増殖した変異ウイルスを非経口投与
用の担体と合することを特徴とするウシのウイル
ス性下痢症ウイルスワクチンの製法。 １１ 単離した変異株がC.N.C.M.−199株であ
る前記第１０項の製法。 １２ 変異ウイルスをさらに他の生ウシ呼吸器ウ
イルスワクチンと混合する前記第１０項または第
１１項の製法。 １３ 他の生ウシ呼吸器ウイルスワクチンが生ウ
シ呼吸器シンシチウムウイルスワクチンである前
記第１２項の製法。
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