JPH0773493B2 - ウシのウイルス性下痢症ウイルス変異株 - Google Patents

ウシのウイルス性下痢症ウイルス変異株

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JPH0773493B2
JPH0773493B2 JP3121335A JP12133591A JPH0773493B2 JP H0773493 B2 JPH0773493 B2 JP H0773493B2 JP 3121335 A JP3121335 A JP 3121335A JP 12133591 A JP12133591 A JP 12133591A JP H0773493 B2 JPH0773493 B2 JP H0773493B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウシのウイルス性下痢症
（ＢＶＤ）ウイルスの変異株に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】ウシのウイルス性下痢疾患は
家畜の最も広範囲に広まった、経済上重大な疾患のひと
つである。該疾患は消化器粘膜の潰瘍化および下痢症を
伴った急性で致死率の高い牛疫様症候群の群の発生が観
察されて初めて米国で確認されたものである。［オラフ
ソンら（ＯＬＡＦＳＯＮ et al.,Ｃornell Ｖet.,Ｖol.
３６,２０５〜２１３,１９４６）参照］同時期、重度、
慢性度および蔓延率の程度が異なる類似の症例がラムセ
イ.エフ.ケイら（ＲＡＭＳＥＹ,Ｆ.Ｋ.et al.,Ｎorth.
Ａm.Ｖet.,Ｖol.３４,６２９〜６３３,１９５３）によ
って報告され、粘膜病と命名された。暫くの間、数種の
異なった感染が存在すると考えられていた。しかし、両
方の用語が文献中に浸透し、粘膜病症候群なる語が常用
されるようになった後、結局、同じウイルスがこの２つ
の症候群の原因であると結論されるに至った。そこで、
該疾患は優先性により、ウイルス性下痢疾患と称される
ようになった。
【０００３】ＢＶＤの病因因子は、トガビリダエ（Ｔog
aviridae）科のペストウイルス（pestivirus）として分
類されるＲＮＡウイルスである［アンドリュース・シイ
ら（ＡＮＤＲＥＷＥＳ,Ｃ.et al.,Ｖiruses of the Ｖe
rtebrates,４th ed.,Ｌondon;Ｂailliere Ｔindall,１
９７８）参照］。
【０００４】飼育場における臨床症状の発現はかなり変
化する。一般に、７〜１１日の潜伏期間後、一相性また
は二相性の３９.５〜４１.５℃の発熱、食欲不振、下痢
が起こる。時々、該下痢症は激しいしぶりを伴って、未
消化食物、血液凝集粘液およびジフテリアストランドの
排泄に進行する。多飲多渇症の併発にもかかわらず、該
動物は脱水状態となり、速やかに、衰弱する。
【０００５】ＢＶＤは主に消化管の感染と関連するが、
一連の症状は、通常、呼吸器併発症、すなわち、呼吸頻
繁および咳と共に、後に化膿する漿液性または粘液性の
鼻漏から開始することが示唆されている（エス・エフ・
ロスナー（Ｓ.Ｆ.ＲＯＳＮＥＲ,lowa Ｖet.,Ｖol.３５,
１１〜１４,１９６４）参照］。多くの著者も鼻漏が漿
液性から粘液化膿性に進行することを報告している。
【０００６】該疾患に関連する主な病理学的変化は消化
器粘膜の充血、出血、浮腫、びらんおよび潰瘍である。
肺性浮腫と共に気道粘膜表面の充血も観察される。通
常、著しい白血球減少が特に感染の早期においてみられ
る。総白血球数は実験的接種後約１４日で正常値に回復
することが観察されている［スコット・エフ・ダブリュ
ウら（ＳＣＯＴＴ Ｆ.Ｗ.et al.,Ｃornell Ｖet.,Ｖol.
６３,５３６〜５６０,１９７３）参照］。
【０００７】これらに基づいて、ミルズ・ジェイ・エイ
チ・エルら（ＭＩＬＬＳ Ｊ.Ｈ.Ｌ.et al.,Ａm.Ｊ.Ｖe
t.Ｒes.,Ｖol.２９,１３６７〜１３７５,１９６８）
は、「呼吸経路による伝播が１つの可能な拡散様式であ
る」と示唆している。
【０００８】ＢＶＤ感染に対する先天性免疫耐性がこの
希にみる致命症の潜在的原因とされており、またコルチ
コイド処理によって誘発される免疫抑制がＢＶＤの人工
感染の発病力を増強させることが知られている。該免疫
抑制動物は、しばしば、全身ウイルス性血症で死ぬこと
がある［ローデ・ジイら（ＲＯＨＤＥ,Ｇ.et al.,Ｚbl.
Ｖet.Ｍed.,Ｖol.１７,Ｂ:６８６,１９７０）およびシ
ョーペ・アール・イー（Ｓhope,Ｒ.Ｅ.et al.,Ｃan.Ｊ.
Ｃomp.Ｍed.,Ｖol.４０,３５５〜３５９,１９７６）参
照］。
【０００９】一旦、明白な臨床的徴候が群の中に観察さ
れると、通常、おかされている個体および群において該
感染が十分に確立していることとなる。これらの臨床症
例を治療するために用いる特異的な治療方法はない。重
度ならば通常は死亡するし、軽度ならば抗生物質によっ
て二次感染を制御して回復を早めることができる。
【００１０】普通の飼育場条件下で「隔離群」を維持す
る試みはＢＶＤウイルスによる感染を防ぐには不十分で
あることが立証されている。そのため、予防法は主にワ
クチンに基づく。
【００１１】不活化ワクチンについてはかなりの研究が
行なわれてきた［マック・クラーキン・エイ・ダブリュ
ウら（ＭcＣＬＵＲＫＩＮ Ａ.Ｗ.et al.,Ｐro.ＵＳ Ａn
im.Ｈealth.Ａssoc.,Ｖol.７９,１１４〜１２３,１９７
５）参照］。しかし、今までのところまだ商業上利用で
きるものではない。所望の抗原物質を経済的に許容でき
る様式で投与するために許容される剤形を製造する技術
を欠くため、その実用化が妨げられている。
【００１２】いくつかの商業用ＢＶＤ生ワクチンが知ら
れている。アール・エム・フィリップスら［Ｒ.Ｍ.ＰＨ
ＩＬＬＩＰＳ et al.,Ａm.Ｊ.Ｖet.Ｒes.,Ｖol,３６,１
３５〜１４０（１９７５）］は「ＢＶＤ抑制用生ワクチ
ンの早期開発は、ウサギまたはウシ腎細胞培養での連続
継代によるウイルスの弱毒化に基づいて行なわれた。こ
れらのワクチンは家畜におけるＢＶＤウイルス感染を防
ぐのに有効であることが証明されたが、一方では接種後
の合併症についての報告がみられた」と報告している。
同じ報文においてフィリップスらはまた、ブタ細胞系弱
毒化ＢＶＤ生ウイルスワクチンの開発について記載して
いる。
【００１３】しかしながら、これらの入手可能な生ＢＶ
Ｄワクチンは以前から知られているワクチンの他の固有
の弊害をさけられない（ＴＥＲＰＳＴＲＡ,Ｃ.ＥＩＫＥ
ＬＥＮＢＯＯＭ,Ｊ.Ｌ.and ＧＬＡＳ,Ｃ.Ｐroceedings
of the ＸＩＩ th world congress on diseases of cat
tle,Ｖol.１,１７７,１９８２）。
【００１４】飼育場において種々の頻度で発生する重篤
なワクチン接種後合併症を説明する試みにおいて、ワク
チン株自体の発病力以外にいくつかのもっともらしい理
由が仮定された。しかし、合併症の原因は評価するのが
難しく、該ワクチンは非常に疑問視されてきた。
【００１５】本発明は、ＢＶＤウイルスの温度感受性
（ts）変異株、すなわち、動物の体温にかなり制限され
る複製能を示すが、重篤な副作用なしでウシに免疫を誘
起させることのできる株を提供することによって今日ま
で知られているＢＶＤ生ワクチンの弊害を克服するもの
である。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明の変異株は、ＢＶ
Ｄウイルス株の突然変異誘発、さらに詳しくは、感染動
物から単離されたＢＶＤウイルス、例えば、単離され、
ヨーロッパ特許条約（ＥＰＣ）の規定に従ってパリのア
ンスティチュー・パスツール（Ｉnstitute Ｐasteur,Ｃ
ollection Ｎationale de Ｃultures de Ｍicroorganis
ms）に１９８２年７月２０日付で受託番号Ｉ−１９８と
して寄託されているＢＶＤ野性型株の亜硝酸処理のごと
く、化学変異誘発剤によるＢＶＤウイルス株の処理によ
って調製される。
【００１７】化学的薬剤による突然変異は当該分野での
公知の技術であり、突然変異を誘発することが知られて
おり、かつ、本発明方法に使用することのできる化学的
薬剤は、前記の亜硝酸の他にＮ−メチル−Ｎ−ニトロソ
−Ｎ−ニトログアニジン、メタンスルホン酸メチル、メ
タンスルホン酸エチル、５−ブロモウラシル、２−アミ
ノプリン、ヒドロキシルアミン、５−アミノアクリジン
のようなアクリジン系染料およびプロフラビンがある。
さらに詳述すると、米国特許第３９０７９８６号および
第３９６２４２４号は亜硝酸処理による温度感受性ウイ
ルス変異株の調製および家畜における呼吸器疾患を予防
するのに有用な生ワクチン調製での該変異株の使用につ
いて記載している。しかし、ＢＶＤウイルスの温度感受
性変異体は本発明以前には知られていない。
【００１８】本発明によれば、野性型ＢＶＤウイルス株
からワクチン株を調製するために、該株を化学的突然変
異誘発剤、例えば亜硝酸と初期ウイルス力価を２〜３lo
g10減少させる操作条件下で反応させ、得られた変異株
を３５℃および３９.５℃で各々培養することによって
３９.５℃（ウシの体内器管温度）においてその３５℃
における増殖能よりも約３log10小さい増殖能を示す温
度感受性（ts）変異株を単離する。該温度感受性変異株
は、ウシのウイルス性下痢症ウイルスの増殖用の公知の
組織培養［例えば、入手制限なしでアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクションに受託番号ＡＴＣＣ ＣＣ
１４４として寄託されているウシ腎細胞系または、マッ
クラーキン・エイ・ダブリュウら（ＭcＣＬＵＲＫＩＮ
Ａ.Ｗ.etal.,Ａrch.Ｇesam.Ｖirusforsch.,Ｖol.４５,
２８５〜２８９,１９７４）によって記載されているウ
シ鼻甲介単層細胞］中で適当な希釈度でクローンし、終
点希釈によりクローンの選択を行なうことにより単離さ
れる。
【００１９】さらに詳述すると、ウシのウイルス性下痢
症の典型的な症状を示す動物から単離した野性型株、例
えばＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９８ウイルス株を、ウシ下痢
症ウイルスを増殖させる組織培養、例えばウシ腎細胞系
またはウシ鼻甲介細胞系のような細胞系で増殖させ、該
株を前記組織培養に順応させた後、前記ウシ下痢症ウイ
ルスの懸濁液を室温にて化学的突然変異誘発剤、例え
ば、亜硝酸緩衝水溶液、例えば、培養液中の亜硝酸およ
び酢酸緩衝液の濃度が各々４Ｎおよび１Ｎであるような
酢酸緩衝液中亜硝酸と、１〜１５分間、例えば、６（±
１）分間、pＨ５〜６、例えば、pＨ５.７（±０.１）で
反応させ、その後、例えば、１Ｎ水酸化ナトリウムを滴
下してpＨを７.５に調整することにより反応を止める。
ついで、該懸濁液を好ましくは透析し、希釈した各希釈
物を前記に示すような組織培養中で増殖させる。その
後、陽性の培養を３５℃および３９.５℃で比較培養
し、力価を測定し、両温度間で約３log10ＴＣＩＤ50の
力価差を示す培養を選択する。ついで、かかる温度感受
性変異株を前記に示すようなウイルス増殖用の組織培養
中で増殖させ、該温度感受性変異株、例えばＣ.Ｎ.Ｃ.
Ｍ．Ｉ−１９９ウイルス株を単離するために、少なくと
も１回終点希釈継代によりクローンする。
【００２０】Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株含有ワクチン
を用いて免疫制御動物で行なわれた実験は、本発明によ
るこのワクチンが従来存在しているワクチンより著しく
改善されていることの強力な証拠を示した。
【００２１】Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株で観察される
症候の低レベルはビルレントまたは「弱毒化」ＢＶＤ株
を免疫抑制動物に使用した研究に記載されている重い病
像とは実にきわだって対照的である。ビルレント株を用
いた研究結果はショーペ・アール・イーら（ＳＨＯＰＥ
Ｒ.Ｅ.et al.,Ｃan.Ｊ.Ｖomp.Ｍed.,Ｖol ４０,３５５
〜３５９,１９７６）によって報告されており、また
「弱毒化」株を用いた研究結果はビトル・ジェイ・エス
ら（ＢＩＴＴＬＥ Ｊ.Ｓ.and ＨＯＵＳＥ Ｊ.Ａ.,Ｊ.
Ａ.Ｖ.Ｍ.Ａ.,Ｖol.１６３,８７８〜８７９,１９７３）
によりウシを実験動物にして報告されている。後者の場
合、ビトルらは２頭の仔ウシをデキサメタゾンで１１日
間処理し、「弱毒化ウイルス（Ｃ２４Ｖ）」によるワク
チン接種以前では該動物は正常なままであったが免疫抑
制処理を中止すると直ちに熱および白血球減少を伴う典
型的な粘膜病の症状が発現すると報告している。ワクチ
ン接種後２４時間で１頭が死亡したが、もう１頭は最終
的に回復した。
【００２２】該Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株含有ワクチ
ンを免疫抑制された仔ウシに使用した試験では、平穏に
おさまる種々な程度の下痢以外には典型的な粘膜病の臨
床的徴候は何ら観察されなかった。また、消化上の問題
が観察された期間、毎日、ウイルスの回収を試みたが、
ワクチン接種動物から該ＢＶＤウイルスは回収されなか
った。すなわち、該臨床所見はワクチン接種動物の糞便
中または眼鼻分泌物におけるワクチンウイルスの存在と
は関連がない。観察された症候はウイルス血病とも関係
ない。また、遺伝学的に変化したワクチンウイルスの出
現が観察されなかったことも注目すべきことである。さ
らに、活性成分が温度感受性変異株であって、生体の低
温部位に投与される従来のワクチンとは対照的に、本発
明についてのワクチンはこのような経路で投与された場
合は感染性ではなく、伝統的な非経口的経路、すなわ
ち、動物の皮下または筋肉内のいずれかに投与されなけ
ればならない。但し、前記非経口投与後、例えば２〜３
週間後、何らかのブースター（追加抗原刺激）を投与す
る。
【００２３】該ワクチンの好ましい投与量単位は少なく
とも１０3.5ＴＣＩＤ50、より好ましくは、少なくとも
１０4ＴＣＩＤ50の変異ウイルス株を含む。本発明方法
より得られるＢＶＤ変異ウイルス株および非経口投与す
ることのできるその他のウシ生呼吸器ウイルスワクチン
（すなわち、ウシ呼吸器シンシチウム（ＢＲＳ）ウイル
スワクチン）を含む複合ワクチンで行った実験は、該変
異ＢＶＤウイルス株がもう一方の接種ウイルスの免疫原
性を干渉しない（すなわち、影響を及ぼさない）ことを
示しており、それゆえ他の態様に従えば、本発明は前記
に示すような温度感受性ＢＶＤウイルス変異株と、非経
口的経路によって投与することのできる他のウシ用生ウ
イルスワクチンからなる複合生ウイルスワクチンに関す
る。
【００２４】
【実施例】本発明を次の実施例によってさらに詳しく説
明するが、これらに限定されるものではない。 実施例１ 突然変異誘発および突然変異株の選択 該疾患の典型的な症状を発現する仔ウシの鼻粘膜由来の
ウシ下痢症ウイルス株を、仔ウシ睾丸細胞培養中で１０
継代して該組織培養中に順応させ、ヨーロッパ特許条約
の規定に従って、パリのアンスティチュー・パスツール
［ＩnstituteＰasteur,Ｃollection Ｎationale de Ｃu
lture de Ｍicroorganisms （Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ.）］に受託
番号Ｉ−１９８として１９８２年７月２０日に寄託し
た。
【００２５】該ウイルスを、ウシラクトアルブミン水解
物０.２５％（Ｗ／Ｖ）で補足したイーグル（Ｅagle）
の基礎および最少培地の５０／５０（Ｖ／Ｖ）混合物か
らなる培地を用い、本明細書ではＮＬＢＫ4細胞系と称
するウシ腎細胞系中で６継代して増殖させる。
【００２６】第１６代継代から得られる１０4.0ＴＣＩ
Ｄ50／０.１mlを含有するウイルス懸濁液１.２５ml容
を、１モル酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液１.２５mlおよ
び４モル亜硝酸ナトリウム水溶液１.２５mlと混合す
る。該混合液の最終pＨは５.７であった。ついで、該混
合液を室温にて６分間反応させ、その後、pＨ７.５（±
０.５）まで１Ｎ水酸化ナトリウムを滴下して該反応を
止める。pＨ調整は、ウイルス懸濁液中に存在させたフ
ェノールレッド指示薬の変色に従う。
【００２７】該処理ウイルス懸濁液を、ＮaＣl８g、Ｋ
Ｃl０.２g、Ｎa2ＨＰＯ4１.１５g、ＫＨ2ＰＯ4０.２gお
よび蒸留水（８００mlまで）からなり、蒸留水１００ml
中ＭgＣl2・６Ｈ2Ｏ溶液、その後蒸留水１００ml中Ｃa
Ｃl2０.１g溶液と混合し、最終溶液を滅菌濾過し、最終
pＨを７.２〜７.４としたリン酸緩衝食塩水中で５℃に
て５時間透析する。透析後、該ウイルス懸濁液を液体窒
素中で保存する。
【００２８】感染力価試験は、１０倍希釈当り４本の試
験管を用い、３７℃で行なう。得られたウイルス懸濁液
の残留感染力は、出発Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９８ウイル
ス懸濁液の感染力の１０1.7ＴＣＩＤ50／０.１mlであっ
た。ウイルス懸濁液の一部０.１mlづつをウシラクトア
ルブミン水解物０.２５％（Ｗ／Ｖ）を補足したイーグ
ルの基礎および最少培地の５０／５０（Ｖ／Ｖ）混合培
養液で１／９に希釈し、ＮＬＢＫ4ウシ腎細胞系の試験
管８０本に接種し、ついで、３７℃にて５日間インキュ
ベートする。試験管８０本のうち３１本がウイルス増殖
による細胞変性効果を示した。
【００２９】細胞変性効果を示した各試験管を３５℃お
よび３９.５℃で比較培養し、力価を測定する。これら
のインキュベーション温度は、出発ウイルス（Ｃ.Ｎ.
Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９８）が、両温度では同等に増殖する
が、４０℃では増殖困難であったところから、各々許容
温度および制限温度として選択した。該単離物の１つは
３９.５℃の力価が３５℃の力価から３.０log10ＴＣＩ
Ｄ50（ＴＣＩＤ50：５０％組織培養感染用量、すなわ
ち、培養物に５０％感染率を与える野生ウイルスの量）
であって、温度感受性を示す。先の継代と同じ操作条件
下でさらに継代して増殖（第１９代）させ、これを凍結
乾燥する。
【００３０】ついで、該ウイルスを前記と同様の培養液
を用い、本明細書ではＮＬＮＴ1と称するウシ鼻甲介細
胞系で２継代して増殖し、第２１代の継代の時点でウイ
ルスのストックを調製する。
【００３１】このウイルス・ストックから、１０-4.5希
釈で、同様な操作条件において９６培養物を用いてさら
にクローン継代を行ない、８個の陽性培養を得た。この
うちの１つを、同じ条件でさらに１代継代し（第２４
代）、種ロットを形成させ、各々、１０3.6ＴＣＩＤ50
のウイルスを含有するガラスバイアル中で凍結乾燥す
る。このクローンの試料はヨーロッパ特許条約の規定に
従って、１９８２年７月２０日付でパリのアンスティチ
ュー・パースツールに受託番号Ｉ−１９９として寄託さ
れた。
【００３２】実施例２ ワクチンの製法 該種ロット（Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９）の試料を再水
和し、ＮＬＢＴ1細胞培養中に接種し、ついで前記維持
培地で覆う。
【００３３】該細胞を許容温度（３５℃±０.５）で５
日間インキュベートする。ついで、上澄液を新たに別の
培養系列に接種する。細胞変性効果が該単層細胞の５０
％に現れた時、上澄液を集め、保存し、これにカシトン
（casitone,６％Ｗ／Ｖ）を添加し、該混合液を−７０
℃で保管する。このウイルス懸濁液を解凍し、ガラスバ
イアルに分注し、凍結乾燥して１バイアル当り１０4Ｔ
ＣＩＤ50またはその複数倍を含有させる。
【００３４】投与する直前に、投与量当り２.０mlの食
塩水（滅菌蒸留水中、ＮaＣl０.９％）を用い、該ワク
チンを再水和する。該ワクチンは筋肉内経路により投与
され、好ましくは、２回、例えば３週間間隔で投与す
る。
【００３５】実施例３ 該変異株の温度感受性 種々の温度で培養した後、０.２ml当りのlog10ＰＦＵ
（plauque forming unit;プラック形成単位）として表
示されるプラック形成能（ＥＯＰ）をＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ
−１９８株およびＩ−１９９株の各々について測定す
る。結果を表１に示す。
【００３６】この結果はＥＯＰが野性株Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．
Ｉ−１９８では１０4.5〜１０5.0であるが、変異株Ｃ.
Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株は３５〜３７℃で最適なＥＯＰ
を有し、これが３９℃では１.５log10、３９.５℃では
３.０log10減少し、感染症ウイルスが接種培養物から回
収されず、３９.５℃におけるＣＰＥが陽性でないこと
を示す。
【表１】
【００３７】また、３５℃および３９.５℃における力
価を種々の継代レベルのウイルスについて測定し、その
結果を表２に示す。表２は、３５℃および３９.５℃に
おける力価差がウイルスの種々の継代レベルにわたって
安定であることを示している。
【表２】
【００３８】実施例４ 正常な仔ウシ用の弱毒化 ワクチンの種ロットを５頭の血清陰性動物で試験する。
まず、ワクチンの１０投与量を１Ｎ食塩水２mlで再水和
し、各動物に筋肉内経路によって接種する。３週間後、
同投与量のワクチンを同様に投与する。
【００３９】臨床検査、直腸温度記録および白血球測定
を第１回投与後１４日間毎日行なう。その結果、何らの
症状も観察されず、また、表３に示すごとく、３９.２
℃以上の体温上昇は記録されなかった。
【表３】
【００４０】白血球（ＷＢＣ）数の平均値は、観察期間
を通じて正常値のままであった。ＢＶＤに対する血清転
化によって示されるように、全動物が免疫付与された。
【００４１】実施例５ 免疫抑制動物用の弱毒化 ＢＶＤおよびウシ呼吸器シンシチウム（ＢＲＳ）ウイル
スの両方に対して血清陰性の９頭の仔ウシに、ワクチン
の第１回接種を行なう５日前から連続１２日間、デキサ
メタゾン０.１mg／kgで毎日処理する。
【００４２】４頭の動物（番号:１６,３０,８２および
８３）に０日目に筋肉内経路によって種ロットを接種
し、また、２１日目にも同様に同投与量を投与する。こ
こでいう０日目のワクチン接種とは第１回のワクチン接
種で、第１回ワクチン接種に用いるワクチンの投与量は
実施例２で得られたワクチンの１０5ＴＣＩＤ50であ
る。
【００４３】０日目および２１日目に３頭の動物（すな
わち、番号:１３、１４および１９）には、ＢＲＳウイ
ルス１０5.7ＴＣＩＤ50およびＢＶＤウイルス１０5ＴＣ
ＩＤ50を含有するＢＲＳ／ＢＶＤ複合ウイルスでワクチ
ン接種する。２頭の動物（すなわち、番号:８０および
８１）には０日目および２１日目に、投与量あたり１０
5.7ＴＣＩＤ50のウイルスを含有する同様のＢＲＳウイ
ルスワクチンでワクチン接種する。
【００４４】臨床検査、体温記録および白血球数測定を
第１回接種後１４日間行なう。同期間中、接種された４
頭の仔ウシの血液試料、眼鼻ぬぐい液および糞便につい
てウシの検出を毎日試みた。その結果および説明を表４
および表５に示す。
【表４】
【表５】
【００４５】種々な程度の食欲不振および下痢症がワク
チン接種された仔ウシのすべてに観察されたことがわか
る。しかし、それらの仔ウシのうち高熱または白血球減
少症の両方を呈するものはなく、ＢＶＤウイルスは採集
された試料から再検出されなかった。また、ＢＲＳとＢ
ＶＤの併用による累積的病原性、あるいは干渉も何ら観
察されなかった。
【００４６】実施例６ 人工的攻撃に対するＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．株Ｉ−１９９の効果 免疫抑制処理の間にワクチン接種された動物は、第２回
の接種後に血清転換する。該動物を、２頭の対照群（Ｂ
ＲＳのみでワクチン接種された動物）と共に第１回接種
後３５日目に攻撃した。
【００４７】攻撃に用いたＢＶＤウイルスはオスロス
（Ｏsloss）株である［ローデ・ジイら（ＲＯＨＤＥ,
Ｇ.and ＬＩＥＳＳ,Ｂ.,Ｚbl.Ｖet.Ｍed.,Ｖol.１７,
Ｂ.６８６,１９７０）参照］。動物当り１０6.8ＴＣＩ
Ｄ50を用いて鼻内に投与した。
【００４８】臨床症状、体温、白血球数を攻撃後１４日
間観察した。ウイルスの再検出は全動物の血液より試み
た。その結果、臨床症状も高熱も何も観察されなかっ
た。ワクチンを２回接種した仔ウシでは、攻撃後の白血
球数の減少はみられないが、対照群（動物番号:８０お
よび８１）では白血球減少がみられた。
【００４９】１０6.8ＴＣＩＤ50／動物の高投与量にお
いてもオスロス株は病原性を示さなかった。ＢＲＳウイ
ルスワクチンを単独でワクチン接種した対照の番号８０
および８１の動物でも、高熱や臨床症状が観察されなか
った。しかし、これらの２頭の動物はＢＶＤワクチンを
２回接種した仔ウシよりも白血球数が少なく、ウイルス
血症の形跡がみられた。ＢＶＤ／ＢＲＳ複合ワクチンで
ワクチン接種された動物も同様に、十分に保護された
（番号:１９、１３および１４）。その結果を表６にま
とめる。
【表６】
【００５０】野性型ＢＶＤウイルス株による実験的感染
はめったに重篤な臨床症状をもたらさないことが知られ
ているので、表６の結果は文献の結果と著しく相異する
ものではない（ＳＡＵＲＡＴ,Ｐ.et al.,Ｌa Ｍaladie
des Ｍuqueuses,Ｅd.Ｌ'Ｅxpansion Ｓcientique Ｆran
caise,Ｐaris １９７２,Ｐ.７６参照）。
【００５１】該指数（すなわち、試験した試料数に対す
る陽性の試料数の比率）は、ＢＲＳのみでワクチン接種
した動物群の指数（９／２０）が、２頭の仔ウシが一時
的に陽性であるその他の仔ウシ群よりも著しく高い。
【００５２】実施例７ 飼育場におけるＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株の効果 ＢＶＤに対する抗体価の低い（すなわち≪８）１５日〜
１８ケ月令の１０３頭の仔ウシに、実施例２のワクチン
の１０4.0ＴＣＩＤ50投与量を筋肉内経路にて３週間間
隔で２回投与した。ワクチンに基づく臨床反応は何ら報
告されず、飼育場条件下におけるワクチンの安全性が実
証された。結果を表７にまとめる。
【表７】
【００５３】表７から明らかなように、全体として、７
３％の動物はワクチン接種後顕著な抗体力価の上昇を示
す。しかし、ワクチン接種時に血清陰性の仔ウシだけを
考慮すると、より若い動物（４５％）に比較して２ケ月
令以上の動物（９０％）では血清転換率に明確な差（Ｐ
＜０.００１）がある。血清陽性動物も同じ傾向を示
す。高令動物の方がより良好な応答が観察された。
【００５４】２ケ月令以上の血清陰性動物において、温
度感受性株Ｃ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９は１０4ＴＣＩＤ50
を２回投与後９０％の血清転換を誘発する。この所見
は、商業上入手できるワクチンを用いて至適条件下で得
られる９５〜９８％の比率と相違はない［ランベルト・
ジイら（ＬＡＭＢＥＲＴ,Ｇ.et al.,Ｍodern Ｖet.Ｐra
ctice,Ｐ.３４,Ａpril １９７０）参照］。
【００５５】２ケ月令以下の仔牛に観察される５０％の
血清転換率はスミス・ピイ・イーら（ＳＭＩＴＨ Ｐ.
Ｅ.et al.Ｖet.Ｍed.Ｓmall Ａnim.Ｖol ６３,４５７,
１９６８）の結果と一致している。彼らは、６０日令の
動物では５／１０、ワクチン接種時に同様な免疫条件を
有するより高令の動物では４２／４８の割合で陽性反応
を報告している。本実験では、低い母性抗体力価を有す
る１６頭の血清陽性動物にワクチン接種し、５０％の血
清転換が得られた。数は少ないけれども、これらの結果
は、ワクチン接種時に低い抗体力価を有する２ケ月令以
上の動物において免疫付与がうまく達成されたことを示
している。
【００５６】
【発明の効果】本発明によれば、動物の体温にかなり制
限される複製能を示すが、重篤な副作用を示すことなく
ウシに免疫を誘起させる、ＢＶＤウイルスの温度感受性
（ｔｓ）変異株であるＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−１９９株を得
ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ナサン・ジグライヒ ベルギー国ベー−1180ブリュッセル、アブ ニュー・エイチ・ブーランジェ49番

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ３９.５℃の力価が３５℃の力価から約
    ３log10ＴＣＩＤ50減少している温度感受性変異株であ
    るウシのウイルス性下痢症ウイルスＣ.Ｎ.Ｃ.Ｍ．Ｉ−
    １９９株。
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