JPH01230532A - 新規なワクチン及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はワクチン、特にイヌコロナウィルスに対してイ
ヌ全保護するのに有用なワクチンに関する。

〔従来の技術〕

コロナウィルスはタイレル（Ｔｙｒｒｅｌｌ　）及び共
同研究者により先ず確認されそして群として形態学的に
規定された。コロナウィルスの生物学及び病原論の包括
的な論説は、…ウエジ（ｗｅｇｅ　）ら「カレントｅト
ピックス・イン・マイクロバイアル０イムノロジー（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂ−ｉ
ａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ７　）　Ｊ　１９８２　、９
９　、１６５〜２００により発表されている。

イヌコロナウィルス（α■）は１９７１年に初めて単離
され、そして特に子犬及びケンネルで育てているイヌの
間で次第に問題になってきている。

それは軽い下痢から中程度の下痢を生じさせ、それはし
ばしば嗜眼、無気力及び食欲の減退が先に生ずる。脱水
及びそれにともなう体重減少を一般にともなう。疾患は
一般に致命的ではないがほとんどの小太は感染後その充
分な活力を得ることができ々いと考えられる。

α■感染の作用を克服するのに使用することのできる一
つの処置は、失われたものを置換するために大量の液体
を与え、さらに抗生物５ｉを与えて弱った状態のイヌを
攻ツするすべての日和見的細菌性感染をコントロールす
るのを助けることを含む。このよう々処置は高価であり
さらにそれは予防的ではなくその上それが生じた後に感
染を治療するのに有用にすぎないという不利益を生ずる
。

α■に対してイヌを保顧することを目的としたアイオワ
のフォート・ドック・ラボラトリーズ（Ｆｏｒｔ　Ｄｏ
ｄｇｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）により１９８３
年に導入された生ワクチンは、安全でないことが直ちに
立証されそして同じ年に市場から自発的に回収されたＣ
　Ｍ、Ｌ、−ｒ−チン（Ｍａｒｔｉｎ　）　、　ｒザＱ
コムペンジウム・オン・コンテイニュイング・エデュケ
ーション（Ｔｈｅ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｎ　Ｃｏ
ｎｔｉｎｕｉｎｇＥｄｕｃａｔｉｏｎ　）　Ｊ　１９８
５．１２　、１０１２〜１０１７参照〕。

α■からイヌを守る不活性ワクチンは、商標名デュラミ
ニーン（Ｄｕｒａｍｕｎｅ　）　Ｃｖ　−Ｋでフォート
・ダツツ・ラボラトリーズから現在導入されている。

この製品に関する米国特許は、米国特許第４．５６７，
０４２及び４，５６７，０４３号明細書である。

ＣＣ￥の伝染しやすい性質及び疾患の経済的な面から考
えて、新しいしかも改善されたワクチンかまて°゛至急
要求されている。

イヌコロナウィルス（ＣＣＶ　）　、ブタの伝染性胃腸
炎ウィルス（ＴＧＦＶ　）　、ネコ感染性腹膜炎ウィル
ス（ＦＩＰｖ〕及び２２９Ｅ群のヒト呼吸器コロナウィ
ルスは、コロナビリデエ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ
　）科内のウィルスの抗原の集団を構成していることが
知られている（　Ｎ、Ｃ，ベダーセン（Ｐｅｄｅｒｓｅ
ｎ　）ら「アルカ・ウイロロ、　（Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏ
ｌ、　）　Ｊ　１９７８　、５８　。

４５〜５３及びＳ、シデル（５ｉｄｄｅｌｌ　）ら「Ｊ
、ゼネ、ウイロロ、　　（Ｇｅｎ、ＶｉｒｏＬ　　）　
Ｊ　１９８３．８４．７６１〜７６　参照〕。

しかしこれらのウィルスとの交差保護の研究は＃１とん
ど又は全く成功しなかった。例えば一つの研究では、毒
性のｃｃｖ　を与えられたブタはＴＧＥＶ九対する中和
抗体を生じなかったが（Ｌ、Ｎ、ビン（Ｂｉｎｎ　）ら
「プロシーデインゲス・オン・ジ・アヌユアル・ミーテ
ィンクＵ、Ｓ、７ニマル・ヘルス・アソシエーション（
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｎｎｕａｌ
Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ｕ、Ｓ、Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ
　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　）　Ｊ１９７４　、７８　
、３５９〜３６６　）、一方他の研究ではＣＣＶ　Ｏ有
毒なフィールド単離物を接種されたネコはＦＩＰＶの攻
撃的な投与に対して保護されなかった（　Ｊ、Ｅ、バー
ロウ（Ｂａｒｌｏｕｇｈ　）ら「ラボラトリ−・アニマ
ル・サイエンス（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌ
Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　４１９８４　、３４　、５９２〜
５９７　）。

他の研究では、有毒なＴＧＥＶ　ｆ：接種され次に有毒
なＦＩＰＶにより攻専されたネコはＦＩＰＶ感染に対し
て保護されないことを示している〔例えばり、Ｊ、レイ
ノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　）及びり、Ｊ、ガーウエス
（Ｇａｒｗｅｓ　）　ｒアルカ・ビａ口Ｊ　１９７９　
、６０　、１６１〜１６６：及びＲｌＤ、ウツズ（Ｗｏ
ｏｄｓ　）及びＮ、Ｃ，ベデルセン「ヘト・マイクロバ
イｏ　（Ｖｅｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１月１９７９　、４
　、１１〜１６参照〕。

〔発明の概要〕

驚くべきことにＴＧＥＶに基づくワクチンがα■感染に
対してイヌを保護することが見い出された。

従って本発明はイヌにおいてイヌコロナウィルス感染を
防止する方法を提供し、それはブタの伝染性胃腸炎ウィ
ルスから製造されたワクチン（ＴＧＥＶワクチン）をイ
ヌに投与することよりなる。

本発明は又イヌにおけるイヌコロナウィルス感染防止用
のワクチンの製造のためにブタの伝染性胃腸炎ウィルス
を用いる方法を提供する。

ＴＧＥＶワクチンは生でも不活性化されていてもよい。

不活性化ＴＧＥＶを含むワクチン組成物は本発明の他の
面を形成する。

本発明は又不活性ワクチン組成物の製法を提供し、それ
はブタの不活性化伝染性胃腸炎ウィルスと製薬上許容し
うる担体とより々る。

本発明の方法に用いられるＴＧＥＶワクチンは、例えば
アメリカン・タイプ書カルチュア・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅ
ｃｉｏｎ　）に寄託されそしてＡＴＣＣ寄託ｆｍ　ＶＲ
−７６３号であるパードウ（Ｐｕｒｄｕｅ　）株ＴＧＥ
ウィルスとして知られている細胞培養に適合し九弱毒化
ＴＧＥクイルスからのＴＧＥウィルスの単離物から製造
できる。

イし 本発明に用いるのに適した弱毒性ＴＧＥＶは、１　：　
１〜１　：　１０．０００好ましくは約１：１００ノウ
イルス対細胞の比で数回例えば２〜９回ＴＧＥウィルス
の単離物をブタ起源及び／又はネコ起源の細胞に移すこ
と釦より製造できる。

好ましくはブタ起源の細胞はブタ腎臓（ＰＫ）細胞例え
ばＰＫＴＣ／１１５　及びＰＫ１５　　（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ３３）細胞系よりなる。

好ましくはネコ起源の細胞はネコ腎臓細胞特にクランデ
ル（Ｃｒａｎｄｅｌｌ　）ネコ腎臓（ＣＲＦＫ　）細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ　９４　）よりなる。

弱毒化生ＴＧＥウィルス＃ｉ補乳動物の細胞を用いて適
当な培地中で細胞培養することにより増殖できる。方法
は、ＴＧＥＶを哺乳動物の組織培養細胞に接種しく細胞
は通常は接種前に８０〜１００チの集密的な単層に培養
されている）、接種、大体１〜７日好ましくは２〜５８
．後細胞を採取しそして採取した細胞から増殖したウィ
ルスを集める工程を含む。

前述の方法で用いられる適当な培地は当業者圧とり周知
のものを含む。ＴＧＥウィルスが増殖できる好ましい培
地は、血清を含むか含まないイーグルの最低必須培地（
■瓦）である。

細胞及びウィルスの成長は標準の条件通常はお〜３９℃
好ましくは３５〜３８℃に保たれる。

ウィルス液体は適当には１：１〜１　：　１０．０００
好ましくは約１　：　１００のウィルス対細胞の比で哺
乳動物の細胞に接種される。好ましくはウィルス培地は
１〜２時間後に加えられる。

哺乳動物の細胞は適当にはブタ又はネコの起源のもの例
えばブタ腎臓（ＰＫ）細胞特にＰＫ　１５細胞系（ＡＴ
ＣＣＣＣＬ　３３　）又はネコ腎臓細胞特にクランデル
ネコ腎臓（ＣＲＦＫ　）細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　９４　
）である。

好ましくは哺乳動物の細胞はネコの起源のものさらに好
ましくはＣＲＦＫ細胞である。

ウィルス液体は好ましくは接種約３日後に凍結融解又は
酵素作用により採取される。採取されたウィルス液体は
好都合には冷凍して保存される。

通常は前述のように採取されたウィルス液体は１耐当り
少くとも１０３・Ｓ感染ウィルス単位を含む。

生のＴＧＥＶワクチンが必要なときウィルス液体はさら
に加工されることなく用いられるか、又はそれらは適当
な安定剤例えばＮ−Ｚアミン・ゼラチン、シュクロース
ホスフェートグルタメート（ＳＰＧ　）　又はシュクロ
ースホスフエートクルタメートアルブミン（５ＰＧＡ　
）とともに混合される。

通常はワクチンは脱水される。好ましくは脱水後の力価
は１投与物当り少くとも１０４　　である。

不活性化（又は「殺された」）ワクチンが必要なとき採
取されたウィルス液体は当業者にとり周知の方法により
不活性化される。適当な方法は例えばβ−プロピオラク
トンホルムアルデヒド、又はエチレンイミンによる処理
を含む。不活性化及びイン中ユベーション後、ウィルス
液体は周知の方法例えばブタ腎臓細胞への多数回の移植
により完全な不活性化についてテストできる。

不活性工程を行う他の好ましい方法は、採取したウィル
ス液体を酸素及び重金属イオンの源の存適当な形のアス
コルビン酸は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩
例えばナトリウム、カリウム又はカルシウムの塩又はア
スコルビン酸自体を含む。

好ましい塩はナトリウム塩である。

不活性化工程に用いられる適当なアスコルビン酸基の濃
度は、１〜１０ｒｎＭ好ましくは２．ＯｒｒＭ　〜６．
ＯｍＭ例えば２，５ｒｒＭの範囲内である。

重金属イオンの適当な源は、銅、鉄及び亜鉛の塩そして
水銀含有化合物を含む◇ 一つの好ましい重金属イオンは、第二銅イオン（Ｃｕ”
）であり、その好都合な源は硫酸第二銅である。

他の好ましい重金属イオンは水銀であり、その都訃のよ
い源は有機水銀化合物特にエチルメルキュリチオサルチ
ル酸ナトリウム埴〔チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａ
ｌ　）　）である。

重金属イオンは触媒量で存在し、不活性化工程に用いら
れる適当な濃度は０．０１ｍＭ〜０．１ｍＭ好ましくは
０．０１５ｍＭ　〜０．０５ｍＭ例えば０．０２２ｍＭ
の範囲内である。

酸素の源は必須でありそれは好都合には適当な通気によ
りもたらされる。

通常は不活性化工程は、不活性化テストが満足であるこ
とが示されるまで、１〜５４℃好ましくは約３７℃で行
われる。必要な不活性化時間は大体１０〜１００時間一
般に約４８〜７２時間の範囲である。

成るウィルス例えばバルボウイルス及びロタウィルスの
不活性化のため、アスコルビン酸の第二の添加が不活注
法を完全にするなめに必要とされるＯ さらにウィルスを不活性化することが知られている他の
剤が任意に加えられて不活性化法を完全にしてもよい。

このような剤の一つは例えば「ベト・メディ・ナウキ＊
　（Ｙｅｔ、Ｍｅｄ、ＮａｕｋＬ）　Ｊ１９８０　、１
７　（３）　、　４５〜５５　（Ａ、モトベスキー（Ｍ
ｏｔｏ−ｖｓｋｉ　）ら〕に記載されているようなサポ
ニンであり、それは例えばアスコルビン酸添加約７２時
間後０．５〜／ＩＬｔの濃度で加えることができる。こ
のような方法は、外被ウィルス例えばＰＲＶ及びＩＢＲ
を含むヘルペス群のウィルスの不活性化に特に有用であ
ることが示された。

不活性化法の進行に好都合には、任意の都合のよい方法
例えば残存ウィルスの力価を求める間接螢光抗体テスト
により１間隔をおいてウィルスの活性を測定すること九
よりモニターされる。

不活性化ＴＧＥＶワクチンの製造に当っては不活性化工
程は、通常は原料ウィルスにアスコルビン酸ナトリウム
及び硫酸第二鋼の溶液を適切な量加え、そして得九溶液
を３７℃で約７２時間空気の存在下混合することにより
行われる。４℃に冷却後不活性化のテストを適切な細胞
の培養例えばＰＫ又ＦｉＣＲＦＫを用いて好都合に行う
ことができる。

本発明の方法に用いられるＴＧＥＶワクチンは。

任意に追加の弱毒化修飾生ウィルス又は殺されたウィル
ス例えばイヌジステンパーウィルス、イヌパラインフル
エンザウィルス、イヌアデノウィルス（ｌ及゛びＩＩ）
、イヌパルボウィルスを含有してもよくセして種々の不
活性化細菌性ワクチン例えばレプトスピラ−カニコーラ
−黄胆（１ｃｔａｒｏ　）細菌ワクチン又はイヌポルダ
テラ細菌ワクチンと組み合わされてもよい。

本発明の不活性化ＴＧＥＶワクチン組成物は又任意に水
酸化アルミニウム（例えば２〜２５重量％好ましくｆ′
ｉ５〜５重量％）、サポニン（例えば０．５〜１．５　
＃／投与物）セしてフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ　）の不
完全助剤（代表的な油中水エマルション）を含む助剤を
含有してもよい。

イヌにおけるイヌコロナウィルス感染を予防するために
、　ＴＧＥＶワクチンは非経口的（皮下又は筋肉内）に
投与物当り少くとも１．９　ｌｏｇのウィルス粒子好ま
しくは投与物当り少くとも１．０００個のウィルス粒子
（３１ｏ＆のウィルス粒子）の投与量で投与される。有
利にはワクチンは投与物当り少くとも４　ｌｏｇのウィ
ルス粒子で投与される。

〔実施例〕

次の実施例は本発明を説明する。

実、怖例 下記の実施例において下記の材料及び方法が用いられた
。

Ａ　　ＴＧＥウィルス 製造Ａ、１ パードウ株ＴＧＥ　ｆｙ　（ｔｂ、＜　（ＡＴＣＣＶＲ
−７６３）　ｋ４回ブタ腎臓細胞（ＰＫ　０８０９　）
に移植してマスターシードウィルスを作った。実験的ワ
クチンをブタ腎ｉ４細胞における追加の５回の移植後マ
スターシードウィルスから誘導した。

製造Ａ、２ 製造１からのマスターシードウィルスをブタ腎臓細胞に
３回そしてクランデルネコ腎臓細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　
９４　）に２回移植したＯＢ、細胞培養 製造Ｂ、１ マスターシードウィルス１ｆｔ１０　％以下のウシ血清
を含むイーグルの■Ｍ中でブタ腎臓細胞ＰＫ１５細胞系
（ＡＴＣＣＣＣＬ　３３　）で３５〜３８℃で増殖した
。

製造Ｂ、２ 製造Ａ、２からのウィルスを１０％以下のウシ血清を含
むイーグルの■Ｍ中でクランデルネコ腎臓細胞系（ＡＴ
ＣＣＣＣＬ　９４　）で３５〜３８℃で増殖した。

Ｃ，ウィルス成長 製造Ｃ０１ 集密的なＰＫ　８０９単層を含む２本の小さいローラー
瓶にＩＲｔの未希釈ＴＧＥマスターシードウィルスを接
種した。１〜２時間の吸着期間後ウィルス成長培地（２
Ｉ％以下のウシ血清を含むイーグルのＭＥＭ　）　を加
えそしてウィルスを３５〜３８℃で成長させた。

製造Ｃ，２ 集密的なりランゾルネコ腎＠細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９４
）単層を含む２本の小さいローラー瓶に、１ｍｊの未希
釈ＴＧＥマスターシードウィルスを接種した。

１〜２時間の吸着期間後ウィルス成長培地（２％以下の
ウシ血清を含むイーグルの■Ｘ）を加えそしてウィルス
を３５〜３８℃で成長させた。

実施例１ 修飾生ＴＧＥＶワクチン 上記の製造Ｃ０１で製造されたＴＧＥウィルスを含む１
本のローラー瓶に１７％Ｎ−Ｚアミン・ゼラチン安定剤
を加える。１回の凍結融解サイクルを行い得られた材料
１に１　ａｔの容量で脱水し要求のあるまで４℃に保つ
。脱水後の力価は投与物当り少くとも１０４　　なけれ
ばならない。

実施例２ 修飾生ＴＧＥＶワクチン 修飾生ＴＧＥＶワクチンを実施例１と同じやり方で製造
したが、ただし製造Ｃ，２で製造したＴＧＥウィルスを
用いた。

実施例３ 不活性化ＴＧＥＶワクチン 上記製造Ｃ，１で製造したＴＧＥウィルスを含む１本の
ローラー瓶を凍結し融解しｃ力価サンプルを取る）そし
て下記のように不活性化した（原料ウィルスは投与物当
り少くとも１０（Ｓの不活注化前力価を有すべきである
）。

原料ウィルスｔ″１１容ガラス瓶に入れそして３７℃と
した。アスコルビン酸ナトリウム原液（１チｗ／ｖ　）
及び硫酸第二銅原液（１，ｌチｗ／ｖ）を次に加えてア
スコルビン酸塩の最終濃度を５．０５　ｍＭそして第二
鋼イオンの最終濃度を０．０２２ｍＭとし喪。

瓶の内容物を３７℃で７２時間適切な通気により混合し
次に４℃に冷却した。不活性化のテストはブタ腎臓細胞
で行われた。

不活性化の証明の後原料ウィルスを分けそしてアジュバ
ントして下記の２種の不活性化ワクチンを得た。

ワクチンＡ 不活性化原料ウィルスの半分を４℃で１５〜２０時間攪
拌することＫより１０％水酸化アルミニウムにより処理
した。

ワクチンＢ 不活性原料ウィルスの他の半分を下記のようにアジュバ
ントした。

溶液１は９５　ｌ＋Ｉｔのドラコイル（Ｄｒａｋｏｉｌ
　）　６ＶＲに加えられた５　ｍｔの乳化剤よりなる。

溶液２は４７．５ｍｌの殺されたＴＧＥウィルスに加え
られた２、５ｍｔのツウイーン（Ｔｗｅｅｎ　）　８０
よりなる。

溶液１（２１＃Ｉｌｔ溶０２（１７）に加えそして接種
前にパーツエフタム（Ｐｅｒｆｅｋｔｕｒｎ　）乳化針
を用いて混合した。

実施例４ 修飾生ＴＧＥＶワクチン投与物の力価及びイヌにおける
α■免疫ｙｉｔ注の評価 （ａ）　　実験のデザイン ４種のワクチンの組合せを評価し：２槌の抗原上のレベ
ル〔それぞれは筋肉内（ＩＭ）又は皮下（ＳＣ）　）に
ついて行った。５頭のイヌをそれぞれのＩＭ群に割当て
そして４頭のイヌをそれぞれのＳＣ群に割当てた。５頭
のイヌを未接種のコントロールとして用いた。

それぞれのワクチン群のイヌは、４週間の間隔でＩＭ又
はＳＣで投与される修飾生ＴＧＥＶワクチンの２回の２
１の投与を受けた。第２の接種３週間後にすべてのイヌ
はα■を経口的にそして扁桃内に投与された。３種のパ
ラメーターを評価して各ワクチンの組合わせの有効性：
血清学上のレスポンス、肛門内ＣＣＶ発散及び小腸上皮
細胞のＣＣＶ感染（α■投与５日後）を求めた。

（ｂ）　　材料及び方法 １）　動物 α■に対する接種の経歴のない１６〜２０週令のｎ頭の
雑種イヌを用いた。イヌはく１：２のＣＣＶ　−ＩＦＡ
力価により示されるようにＣＣＶにかかり易かった。

１１）　　ワクチン及び接種 ＴＧＥＶマスターシードウィルスをブタ腎臓細胞に３回
そしてクランデルネコ腎臓（ＣＲＦＫ　）細胞に２回、
製造Ａ、２に記載されているように移植した。ウィルス
採取材料を使用前に一７０℃に保った。

ｆｉｌ　）血清学 抗体の力価を間接螢光抗体テストを用いて接種、α■投
与そして投与空日後の時点で求めた。

＋Ｖ）　　ＣＣＶ投与 α■−６と名付けられそして１回ＣＲＦ’Ｋに移植され
たフィールド単離物を用いた。イヌは投与前２４時間に
わたって絶食させた。４　ａｔのウィルス採の 取材料を下記のやり方でそれぞバ９ヌに与えた。

１７４カツプのアルボ（１Ｊｐｏ　）と混ぜた２　＃ｌ
Ｉ！のウィルス材料を経口投与し念。イヌを指示書に従
ってブロム・エース（Ｐｒｏｍ　Ａｃｅ　）　にニーヨ
ーク州ニューヨーク市エヤースト・ラボラトリーズで（
Ａｙｅｒｓｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　］によ
り麻酔したＯそしてｌ　ａｔのＣＣＶを次に各扁桃に注
射し九。イスを全体の臨床上の徴候及び肛門内ウィルス
発散にりいて投与し九日及び投与後５日間モニターした
。

■）投与後の肛門内ウィルス回収 肛門内の綿を毎日集めセしてＣＲＦＫ細胞における移植
によりウィルスの単離について処理した。

Ｖｉ）　　ＣＣＶ投与後の小腸の評価 ＣＣＶ投与５日後、すべてのイヌを剖検しそして全小腸
を得た。間隔の等しい小腸セグメントからスライド小腸
圧痕を作りた。ＣＣＶ抗原の存在を間接螢光抗体テスト
を用いて求めた。圧痕スライドは観察される特異的α■
螢光のチに従って計数された。

（ｃ）　　結果 接種又をｊ　ＣＣＶＣ再投与後の中に臨床上の徴候は認
められなかった。

１）　ワクチンウィルス力価 この研究に用いられる抗原性のレベルは１０＆３及び１
０”　ＴＣＩＤｓｏ／投与物であった。

１１）　血清学上のレスポンス 血清学上の結果を第１表に要約する。

第１表 回帰α■幾何学的平均抗体力価 ＴＧＥワクチン　　第１回の接種後の週　　　５Ｄ３７
ＰＣ １０３−”　ＩＭ　　　　＜２　　４０　　１３９　　
４２２１０’−’　ＳＣ＜２　　２４　　１１３　　３
２ｏ）１０Ｌ”ＩＭ　　　　＜２　　４６　　　５３　
　４８５１０ｊ３　ＳＣ（２３４２４１９０ 非接種　　　＜２　　（１０＜１０　　　＜１０すべて
のイヌは接種時には測定可能な抗体力価を有しなかつ次
。非接種コントロールは研究全体を通して１以下＝１０
に止り、外因性のＣＣＶ感染がないことを示した。

すべての４種のワクチン群（１０嶌’ＩＭ、１０λ３Ｓ
Ｃ。

１０”　ＩＭ　及ヒＩＯ”　ＳＣ）　（７）ｆ　５Ｒｉ
第１回の接種３週間以内に同様なＣＣＶ幾何学的平均抗
体力価（ＧＭＡＴ　）　ｆ：示しく１：２４〜ｌ　：　
４６　）、ウィルス複製からの一次レスポンスを表示し
ている。第２回の接種３週間後では投与レスポンスが１
０３−”　ＩＭ及びＳＣ・”ヰ（ＧＭＡＴ　１　：　１
３９及び１　：　１１３　）並に１０λ３ＩＭ及びＳＣ
群（ＧＭＡＴ　１　：　５３及び１：２４）のイヌの間
に示された。すべての接種されたイヌはＣＣＶ投与投与
性既往レスポンスし：　１０＆ＪＩＭ及びＳＣの群のイ
ヌのレスポンスＦｉ３倍であり、１０１”　ＩＭ及びＳ
Ｃの群のイヌの間のレスポンスはそれぞれ９倍及び８倍
であった。血清学の結果は、異種の生のＴＧＥＶワクチ
ンにより生じたイヌの免疫系は、既往的に同種の有毒な
ＣＣＶ投与に反応したことを示す。

非接種のイスはＣＣＶ投与５日後１１１１１定可能な抗
体レスポンスを有しなかった。

ｎｉ　）ｃｃｖ　投４　後ｔｖ　評価 ＣＣＶ投与ウィルスの２回の力価測定は、イヌに１０”
　ＴＣＩＤｓｏ　／　ｌＬｔ　（１０”　ＴＣＩＤｓｏ
　／投与物）を投与したことを示した。

α■ウィルス単離はＣＣＶ投与投与口５日間たりモニタ
ーされた。すべてのイヌはＣＣＶ投与前にはα■とは無
関係であったｏ　ＣＲＦＫ細胞質内へのＣＣＶウィルス
封入が、５日間にわたってすべての非接種コントロール
から認められた（　１００％回収）接種されたイ×の間
では、α■封入は認められずウィルスの回収がないこと
を示した。材料の移植はウィルスの回収を増大させなか
った。

第２表は群及び非接種コントロール中の平均の特異的Ｃ
ＣＶ小腸螢光を要約している。

ブライトアップルグリーン螢光により示されるＣＣＶに
関する特異的な螢光が、小腸の全長にわたって認められ
た。すべてのイヌは成る穆度のα■感染を示した。小腸
の螢光の有意な低下が、コントロールに比べて、すべて
の接種したイヌについて認められた。

Ｃ（”／投与５日後の接種群の間の平均の合計数は等し
く　（３０，６、５６，３、４６，２、４２，５）、そ
して非接種コントロールのイヌの平均合計数は接種群よ
りも高い（３２７）。

（ｄ）　　結論 すべての接種群のイヌＶｉ、第１回の接種３週間られた
。

α■投与後、ウィルスはすべての非接種イヌから回収さ
れそしてＣＣＶ小腸感染は活性であり拡がっていた。し
かしすべての接種群のワクチン接種イヌは、肛門内ウィ
ルス発散なしに活性な細胞免疫レスポンスを示し、そし
て明らかにＴＧＥワクチン誘導抗体又は細胞仲介免疫に
よりＣＣＶ投与から保護されていた。

代理人　弁理士　　秋　沢　政　光 信１名 ”　　　”’　　　　　　　　　　　　　　　　昭和１
３年１０月２を日特許庁　−＆を殿　　　　　　　　　
５翳１、事件の表示 羽願昭に３−第２幻７３ｑ号 ３、補正をする者 １１１件との関係チ、ガ中人

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）イヌのイヌコロナウィルス感染の予防用ワクチン
   を製造するためのブタ伝染性胃腸炎ウィルスの用途
2. （２）ワクチンが不活性である請求項１記載の用途。
3. （３）ワクチンがパードウ株ＴＧＥウィルス（ＡＴＣＣ
   第ＶＲ−７６３号）から製造される請求項１又は２記載
   の用途。
4. （４）ワクチンがイヌジステンパーウイルス、イヌパラ
   インフルエンザウイルス、イヌアデノウィルス（ I 及
   びII）、イヌパルボウイルス及びイヌコロナウィルスか
   らなる群から選ばれる弱毒化変性生ワクチン又は不活性
   化ウィルスをさらに含むか又はレプトスピラ・カニコラ
   −黄胆細菌ワクチン及びイヌポルダテラ細菌ワクチンか
   らなる群から選ばれる不活性化細菌ワクチンと組み合わ
   されている請求項１〜３の何れか一つの項記載の用途。
5. （５）ブタの不活性化伝染性胃腸炎ウィルス（ＴＧＥＶ
   ）を含むワクチン組成物。
6. （６）（ａ）ブタ及び／又はネコ起源の細胞中にＴＧＥ
   ウィルスの単離物を１：１〜１：１０，０００のウィル
   ス対細胞の比で移して弱毒化生ＴＧＥウィルスを得； （ｂ）哺乳動物の細胞中の細胞培養により生ＴＧＥウィ
   ルスを増殖させ； （ｃ）生成したウィルス液体を採取し； そして（ｄ）ウィルス不活性化剤により該ウィルス液体
   を不活性する ことからなるブタ伝染性胃腸炎ウィルスから製造される
   不活性ワクチン（ＴＧＥＶワクチン）を製造する方法。
7. （７）該ウィルス液体を酸素及び重金属イオン源の存在
   下アスコルビン酸及び／又はその塩により不活性化する
   請求項６記載の方法。
8. （８）金属イオン源を銅、鉄、亜鉛及び水銀含有化合物
   からなる群から選らばれる請求項７記載の方法。
9. （９）水銀含有化合物がチメロサールである請求項８記
   載の方法。
10. （１０）予防療法で用いられるブタの不活性化伝染性胃
    腸炎ウィルスを含むワクチン組成物。