PT88591B - Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica substancialmente livre de virus ou bacterias - Google Patents

Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica substancialmente livre de virus ou bacterias Download PDF

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Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA SUBSTANCIALMENTE LIVRE DE VIRUS OU BACTÉRIAS
I
Este invento relaciona-se com um processo para a preparação de uma composição farmacêutica que se apresente substancialmente livre de vírus ou bactérias vivos. 0 invento também se relaciona com composições farmacêuticas produzidas pelo processo, e com a sua utilização em terapêutica. 0 invento é particularmente importante no campo das vacinas inactivadas para utilização em profilaxia.
No campo da medicina, é frequentemente necessário ou desejável tornar composições farmacêuticas para administração a animais incluindo o ser humano livres de quaisquer vírus ou bactérias vivos potencialmente prejudiciais. Esse passo de inactivação pode ser particularmente importante quando é requerida uma vacina inacti&da (ou ‘morta’ ).
São conhecidos vários métodos para a inactivação de vírus ou de bactérias, tais como tratamento com ρ-propiolactona, formaldeído ou etilenoimina. Esses reagentes são contudo, de manipulação potencialmente perigosos e são desejáveis técnicas mais seguras.
A inactivação de certos antigénios diagnósticos virais pelo ácido ascérbico sofrendo auto-oxidação catalisada por sulfato cúprico foi referida (L.A. White et al.. J. Clinicai Microbiology. 1986, 24, 527-531). Surpreendeifeemente, verificamos que os vírus e as bactérias podem ser inactivados em composições farmacêuticas por meio de um tratamento semelhante.
presente invento proporciona uma composição farmacêutica que se apresenta substancialmente livre de vírus ou bactérias vivos e que contém um virus ou bactérias inactivados juntamente com um veiculo farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo facto do virus ou bactéria inactivados serem preparados inactivando um virus ou bactéria vivos com ácido ascérbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e de uma fonte de iões de metal pesado.
invento também proporciona uma substância ou composição que ss apresenta substancialmente livre de vírus ou bactérias vivos e que é preparada por um método que compreende a inactivação de um virus ou bactéria vivos com ácido ascorbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões metálicos, para utilização em terapêutica.
Tal como é aqui usada a expressão 'terapêutica’ inclui profilaxia.
Num outro aspecto o invento proporciona um processo para a preparação de uma composição farmacêutica, processo esse que compreende a mistura de um vírus ou bactéria inactivados com um veiculo farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo facto do vírus ou bactéria inactivados serem preparados inactivando um vírus ou bactéria vivos com ácido ascérbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões de metal pesado.
Ainda num outro aspecto o invento proporciona um processo para preparar uma composição farmacêutica que se apresenta substancialmente livre de virus ou de bactérias, processo esse que consiste em inactivar um vírus ou bactéria vivos com ácido ascorbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões de metal pesado.
Ainda num outro aspecto do invento, proporciona-se um método para evitar doença em animais, incluindo os seres humanos, método esse que consiste em administrar a um animal que dela necessite uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de acordo com o invento.
A vantagem do invento consiste no facto de reagentes carcinogénicos ou de qualquer outro modo prejudiciais conhecidos na técnica para inactivação virai, tais como jB-propiolactona, formaldeido e etilenoimina, já não serem necessários, tornando desse modo mais seguro o processo de inactivação,
A composição farmacêutica de acordo com o invento pode ser qualquer medicamento formulado para administração por qualquer via apropriada por exemplo por aplicação parentérica ou tópica.
Num aspecto preferido a composição farmacêutica é uma vacina inactivada contra infecções a virus ou bacterianas, por exemplo uma vacina inactivada contra virus da gastroenterite transmissível dos suínos (TGEV), parvovirus, membros do grupo do virus Herpes, por exemplo virus da pseudo raiva (PRV) e virus da rinotraqueite bovina infecciosa (iBR), vírus paramixo, parainfluenza-3, coronavírus bovino e vírus sincicial respiratório bovino.
Consequentemente ainda num outro aspecto do invento proporciona a utilização de uma substância ou composição que se apresenta substancialmente livre de vírus ou de bactérias e que é preparada por um método que consiste em inactivar um vírus ou bactéria vivos com ácido ascórbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões de metal pesado, na produção de uma composição vacina inactivada para a profilaxia de infecções a vírus ou bacterianas.
Num aspecto preferido a vacina inactivada ó uma vacina contra o vírus da gastroenterite transmissível dos suinos.
Num outro aspecto preferido a vacina inactivada ó uma vacina de combinação contra mais de um virus, por exemplo até 5, de preferência até 3 vírus. Uma vacina preferida deste tipo é a vacina contra a infecção bovina rinotraqueite-diarreia a virus-parainfluenza-3.
Deve ser compreendido que podem estar presentes outros agentes activos na composição farmacêutica de acordo com o invento.
A vacina inactivada pode conter facultativamente adjuvantes incluindo, por exemplo, hidróxido de alumínio (por exemplo 2-25$, de preferencia 5-25$ em peso), saponina (por exemplo O,5-l}3 mg/dose) e adjuvante incompleto de Freund (água tipica em emulsão em óleo).
A vacina pode ser administrada numa dose de pelo menos 1,9 logs de partículas de vírus inactivadas por dose, de preferência pelo menos 1,000 partículas de virus (3 logs de partículas de virus) por dose. Normalmente a vacina inactivada será administrada em pelo menos 4 logs de partículas de vírus inactivados por dose.
Formas apropriadas de ácido ascórbico incluem os sais de metal alcalino ou alcalino terro so, por exemplo os sais de sódio, potássio ou cálcio, ou o próprio ácido ascórbico.
Um sal preferido ó o sal de sódio.
TJma concentração de ascorbato apropriada para utilização no passo de inactivação varia entre 1-10 mM, de preferência entre 2,0 mM-6,0 mM; por exemplo 2,5 mM.
Fontes apropriadas de iões de metal pesado incluem sais de cobre, ferro e zinco e compostos contendo mercúrio.
Um ião de metal pesado preferido é o ião cúprico (Cu ) cuja fonte conveniente é sulfa to cúprico.
Um outro ião de metal pesado é mercúrio, cujas fontes convenientes são compostos organo-mercúrios, especialmente ácido etilmercuritiosalicílico sal de sódio (thimerosal).
ião de metal pesado está presente numa quantidade catalítica variando a concentração apropriada para utilização no passo de inactivação entre 0,01 mM e 0,1 mM, de preferência entre 0,015 mM e 0,05 mM, por exemplo 0,022 mM.
A presença de oxigénio é essencial e é proporcionada convenientemente por arejamento adequado.
Normalmente o passo de inactiva ção é deixado realizar-se entre 1 e 549C, de preferência a cerca de 372C, até um teste de inactivação se revelar satisfatório. 0 perido de inactivação requerido varia tipicamente entre 10-100 horas, geralmente cerca de 48-72 horas.
Para a inactivação de certos
virus, por exemplo parvovirus e rotavirus, pode ser necessária uma segunda adição de ácido ascórbico a fim de completar o processo de inactivação.
Além disso, podem ser adicionados facultativamente outros agentes conhecidos por inactivarem vírus a fim de completar o processo de inactivação. Um desses reagentes é a saponina tal como é descrita em, por exemplo, Vet. Med. Nauki, 1980, 17 (3), 45-55 (A. Motovski et al.,) a qual pode, por exemplo, ser adicionada a uma concentração de 0,5 mg/ml cerca de 72 horas após a adição de ácido ascórbico. Um tal processo provou ser especialmente útil para a inactivação de vírus com invólucros tais como os vírus do grupo Herpes incluindo PKV e IBR.
progresso de processo de inacti vação pode ser convenientemente monitorizado medindo a vhbilidade do vírus em determinados intervalos usando qualquer método conveniente, por exemplo por meio de um teste de anticorpos fluorescente indirecto no coelho para determihar o título residual do vírus.
Na produção das vacinas inactivadas os agentes estabilizadores podem vantajosamente ser adicionados antes, durante ou depois do processo de inactivação para aumentar a estabilidade do antigénio. Os agentes de estabilização apropriados incluem albumina do soro bovino ou outros tipos de soro.
Um agente estabilizador preferido é soro bovino de vitelo (fetal).
De preferencia o agente estabili zador ó adicionado antes ou durante o processo de inactivação.
agente estabilizador está apropriadamente presente numa concentração de 0,5 a 5% v/v de preferência de 1 a 3%, com maior preferência cerca de 2% v/v.
Os Exemplos que se seguem ilustram o invento.
EXEMPLOS
Nos Exemplos que se seguem as soluções dos lotes de ácido L-ascárbico e de sulfato cúpri co foram preparados como se segue.
PREPARAÇÃO 1
A solução utilizada de ácido
L-ascórbico (Aà) é preparada dissolvendo 100 gramas de AA por 1 litro de água destilada (100 mg/ml). 0 reagente é esterilizado, usando um dispositivo de filtração de 0,20 φ. Micron, e armazenado congelado.
PREPARAÇÃO 2
A solução utilizada de sulfato cúprico (θ,5 mg/ml) é preparada dissolvendo 0,5 g de sulfa to cúprico em 1 litro de água destilada e submetendo-a a autoclave a 1219C durante 10-15 minutos. A solução á armazenada a 49C.
EXEMPLO 1
Inactivação do Vírus da Rinotraqueite Bovina Infecciosa (IBR)
Sob agitação constante, ácido L-ascôrbico, sal de sódio, (lOO mg/ml) foram adicionados lentamente aos fluidos do vírus ate uma concentração final de 1 mg/ml, seguindo-se imediatamente a adição de sulfato cúprico (lote de 0,5 mg/ml) até uma concentração final de θ,55 qg/ml. Os fluidos foram mantidos a 375C sob agitação constante e arejamento durante 72 a 80 horas.
A seguir à primeira fase de inac tivação, os fluidos foram colocados num frigorifico (l,5-72C) e deixados regressar a uma temperatura de l,5-í7aC. 0 pH foi ajustado para 7,2-7,4 e adicionou-se lentamente saponina (20 mg/ml) aos fluidos do virus sob agitação constante até uma concentração final de 0,5 mg/ml seguindo-se thimerosal (2,5$) até uma concentração final de 0,01$. Os fluidos foram mantidos a 1,5-79C sob agitação constante durante três dias. Os fluidos inactivados foram armazenados
EXEMPLO 2
Inactivação do Virus de Parainfluença-3 (PI-3)
Adicionou-se thimerosal (2,5#) até uma concentração final de 0,01#, e o pH dos fluidos foi ajustado para 7,2-7,¾ com NaOH 10N. Sob agitação constante, adicionou-se lentamente ácido L-ascérbico (lOO mg/ /ml) aos fluidos de virus até uma concentração final de 1 mg/ml. Os fluidos foram mantidos a 372C sob agitação constante e arejamento durante 40-48 horas,
A seguir à primeira fase de inactivação, os fluidos foram colocados num frigorifico (ΐ,5-72θ) ® deixados regressar a uma temperatura de 1,5-72C. 0 pH foi ajustado para 7,2-7,¾ e adicionou-se lentamente saponina (20 mg/ml) aos fluidos do virus sob agitação constante até uma concentração final de 0,5 mg/ml. Os fluidos foram mantidos a 1,5-72θ sob agitação constante durante três dias. Os fluidos inactivados foram armazenados a 1,5-72C.
EXEMPLO 3
Eficácia da vacina inactivada IBR/BVD/PI-3
1. Materiais e Métodos
A. Animais
Foram usadas vinte e quatro cabeças de gado com 300-500 libras, alojadas conjuntamente, sem qualquer história de vacinação em relação aos componentes contidos na vacina. As cabeças de gado eram susceptiveis ao IBR, BVD e PI-3 com neutralização do soro ou titulo de redução em placa de^l:2 exceptuando quando indicado.
Duas vacinas experimentais IBR/BVD/ /PI-3 foram reunidas de acordo com o Quadro 1,
As fracções IBR e PI-3 foram inacti vadas tal como foi descrito nos Exemplos 1 e 2.
Quadro 1
Formulação de IBR/BVD/PI-3 Serie A e B (log^Q ΊΌΙΏ^θιηΐ)
Componente Titulação do Lote Pré-INAC Titulo Calculado/Dose
Serie A Serie B
IBR 7,7 7,9 7,6
BVD ^,9 7,1 7,1
PI-3 7,3 7,5 7,3
Foram utilizados neste estudo vinte e quatro vitelos. Dez vitelos foram vacinados intramuscularmente com uma dose de 5 ml da Série A; 9 vitelos foram vacinados de um modo semelhante com a Série B; 5 vitelos foram mantidos tal como os contatíLos (testemunhas) susceptiveis não-vacinados. Todos os vitelos vacinados foram revacinados do mesmo modo 21 dias apos a primeira vacinação. Os vitelos foram monitorizados diáriamente em relação a quiasquer sinais de vacinação.
-13B. Serologia
Os títulos de anticorpos dos vitelos foram determinados na altura da vacinação, teste de imunidade, e 14 dias a seguir ao teste de imunidade.
0. Teste de Imunidade
Os vitelos foram submetidos a teste de imunidade intranasalmente com IBS. seguindo-se 3 semanas mais tarde com PI-3.
Os vitelos foram monitorizados diariamente durante três dias antes do teste de imunidade (um dia para PI-3) © durante l4 dias a seguir a cada teste de imunidade em relação a sinais clínicos grosseiros e tem peraturas rectais. A eliminação do vírus foi monitorizado durante 10 dias a seguir ao teste de imunidade. Espátulas nasais foram passadas 2 vezes sucessivas sobre células EBK para isolamento do vírus. Dois vitelos foram eliminados do estudo antes do teste de imunidade com PI-3; nm vitelo desenvolveu dificuldade respiratória nas vias superiores a seguir ao tratamento com um bolus sulfa e 1 vitelo ficou comprometido com um caso avançado de decomposição da pata. Foi utilizado o seguinte sistema de classificação para ava liar os sintomas clínicos após o teste de imunidade.
Sinais
Descarga nasal clara, espirros, inflamação da mucosa nasal, tosse, derramamento de lágrimas, salivação excessiva, lesões nasais.
Descarga nasal mucopurulenta.
-14Registo ponto pontos
2. RESULTADOS
Todos os vitelos permaneceram saudáveis durante o periodo de observação.
A. Respostas Serológicas
Os resultados serológicos são resumidos no Quadro 2.
Quatro vitelos vacinados com série B revelaram ter títulos de anticorpos IBR pré-existentes. Estes vitelos foram incluídos no estudo devido à sua susceptibilidade ao PI-3. Os controlos de contacto perma neceram seronegativos ao IBR ao longo do estudo, indicando a ausência de infecção por IBR. Nove de entre 10 vitelos vacinados com a Série A foram seronegativos em relação ao IBR na altura da segunda vacinação, tendo os restantes vite los um titulo de 1:3· Os vitelos tinham desenvolvido um titulo de anticorpos médio geométrico (GMAT) de^ljlé em três semanas a seguir à segunda vacinação (variação 1:7 a 1:32). Os vitelos vacinados demonstraram uma resposta anamnéstica a seguir ao teste de imunidade.
Em geral, os vitelos vacinados com ambas as séries A e B demonstraram pouca ou nenhuma resposta de anticorpos PI-3 na altura da segunda vacinação. Na altura do teste de imunidade com PI-3, seis semanas após a segunda vacinação, vitelos vacinados com a Série A tinham um GMAT de 3 1:273,5 e os vitelos vacinados com a Serie B tinham um GMAT de 356 (variação 1:21 a ^1:512).
Os vitelos demonstraram GMATs
-16QUADRO 2
Títulos de Anticorpos Médios Geométricos Recíprocos IBR/BVD/PI-3 (KV) Estudo da Resposta Imunitária
Fracção Vacina Serranas a 0 Lpós vacina 3 6 após teste Imunidade
IBR A <2 <2 >16 >196
IBR B N.A. N.A. >62 >.153
IBR Control <2 <2 £4 14
BVD A <2 N.A. >5106 N.A.
BVD B <2 N.A. >18023 N.A.
BVD Control <2 N.A. <4 N.A.
PI-3 A <2 <3r5 >273,5 >2048
PI-3 B <2.3 <2,5 >356 >2048
PI-3 Control <2 <2 <2 >16
N.A. = Não analisado
-πΒ. Avaliações após Teste de Imunidade com IBR
Titulações duplicadas do virus IBR do teste de imunidade realizadas imediatamente após o teste de imunidade, indicaram que os vitelos foram testados quanto à imunidade com 10 .0 ΤΟΙϋ^θ.
Os vitelos vacinados com a
Serie A demonstraram uma redução significativa ( p<0,05) nas temperaturas rectais nos dias 3 θ após o teste de imunidade em comparação com o grupo de controlo (testemunha).
Os isolamentos do virus IBR foram monitorizados durante 10 dias a seguir ao teste de imunidade. Todos os vitelos se apresentavam livres de virus IBR antes do teste de imunidade. 0 vírus IBR foi recuperado a partir de todos os controlos não-vacinados (100# de recuperação) ao longo do periodo de 10 dias. Verificou-se uma redução significativa na recuperação do virus entre os vacinados no dia $ (p <(0,05) e no dia 10 (ρ^Ο,Οΐ) em compara ção com os controlos (testemunhas) não vacinados.
Os sinais clinicos entre os
Grupos A e B de vacina e os controlos a seguir ao teste de imunidade com IBR foram mais moderados do que se esperava; não foram demonstradas diferenças significativas entre os grupos de vacina e os grupos de controlo. Contudo, verificaram-se reduções em pontos clinicos nos animais vacinados.
C. Avaliação Após Teste de Imunidade com PI-3
Resultados de titulações duplicadas, produzidas imediatamente após o teste de imunidade indicaram que os vitelos eram submetidos ao teste de imunidade com IO7’8 ΤΟΙϋ^θ de PI-3.
Os sinais clinicos de infecção com PI-3 variaram entre moderados a inaparentes.
Todos os vitelos se apresentavam livres do vírus PI-3 antes do teste de imunidade. 0 vírus PI-3 foi isolado numa média de 7,4 dias/vaca a partir dos controlos (testemunhas) não vacinados, enquanto que o virus foi isolado numa média de 2,9 e 4,3 dias/vaca a partir dos vitelos vacinados com as Series A e B respectivamente.
É evidente uma resposta à dose quando se comparam os resultados obtidos com a Série A com os obtidos com a Série B,
A redução da eliminação dos virus entre os vitelos vacinados com ambas as Séries A e B foi significativa em comparação com os controlos não vacinados (p<O,Ol).
EXEMPLO 4
Inactivação do Vírus Sincidal Respiratório Bovino (BRSV)
A inactivação foi realizada pelo método descrito no Exemplo 1.
EXEMPLO 5
Vacinas com Virus da Gastroenterite Transmissível Inactiva· do dos Suinos (TGEV) vírus da estirpe Purdue (ATCC VR-763) foi feita passar 4 vezes sobre células de rim de porco (designadas PKO8O9) para produzir um vírus de sementeira dominante o qual foi então feito passar 3 vezes em células de rim de porco e duas vezes em células de rim felino de Crandell (ATCC CCL 94). 0 vírus foi propagado a 35-38sC sobre a linhagem das células de rim felino de Crandell (ATCC CCL 94) em MEM de Eagle contendo não mais do que 10$ de soro bovino.
Duas garrafas cilíndricas pequenas contendo monocamadas confluentes células de rim felino de Crandell (ATCC CCL 94) foram inoculadas com 1 ml de virus de sementeira dominantes TGE não diluídos. Apés um periodo de adsorção de 1-2 horas o meio de crescimento do vírus (MEM de Eagle contendo não mais do que 2$ de soro bovino) foi adicionado e o vírus foi feito crescer a 35-382C.
Uma garrafa cilíndrica contendo virus TGE preparado tal como foi atrás descrito foi congelada e descongelada (colhidas amostras do titulo) e inacti^ vada como se segue (o virus da massa deve ter um titulo de pré-inactivação de pelo menos l(rpor dose):
virus da massa foi colocado numa garrafa de vidro de 1 litro e levado até 379C. Solução de lote de ascorbato de sódio (1$ p/v) e solução de lote de sulfato cúprico (1,1$ p/v) foram então adicionadas
para levar a concentração final do ascorbato até 5,05 mM e a concentração final dos iões cúpricos até 0,022 mM. Os conteúdos da garrafa foram misturados com arejamento adequado durante 72 horas a 372C sendo então arrefecidos até MC.
Apos prova de inactivação, o virus da massa foi dividido e ligado a adjuvantes para dar origem a duas vacinas inactivadas como se segue:
Vacina A
Metade dos virus da massa inactivada foi tratada com 10% de hidróxido de aluminio agitando durante 15-20 horas a 43(3.
Vacina B
A outra metade dos virus da massa inactivada foi ligada a adjuvantes como se segue:
A solução 1 consiste em 5 ml de emulsificador adicionados a 95 ml de Drakoil 6 VR.
A solução 2 consiste em 2,5 ml de Tween 80 adicionados a
47,5 ml de virus TGE mortos.
A solução 1 (21 ml) é adicionada à solução 2 (7 ml) e realiza-se a mistura utilizando uma agulha (seringa) de emulsificação Perfektum antes da vacinação.

Claims (8)

15, - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, cujo processo compreende a mistura de um vírus ou bactéria inactivados com um veiculo farmaceuticamente aceitável, caracterizado por o vírus ou bactéria inactivada serem preparados inactivando um virus ou bactéria vivos com ácido ascórbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões de metal pesado.
25, - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a composição farmacêutica compreender uma quantidade profiláticamente eficaz de um virus inactivado e ser uma vacina virai inactivada.
3&. - Processo de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a vacina inactivada ser uma vacina contra vírus seleccionados entre o grupo que consiste em vírus da gastroentrite transmissível dos suinos, parvovirus, membros do grupo do vírus Herpes, paramixo, parainf luenç a-3, coronavirus bovino, e virus sinsical respiratório bovino.
4&. - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a vacina Inactivada ser uma vacina combinada contra a rinotraqueite bovina infecciosa - vírus da diarreia - parainfluença-3.
5^. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a composição farmacêutica compreender uma quantidade profiláticamente eficaz de uma bactéria inactivada e ser uma vacina contra bactérias.
6a, - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 a 5 caracterizado por o virus ou bactéria inactivados serem preparados por um método em que a fonte de iões metálicos foi seleccionada a partir do grupo consistindo em sais de compostos contendo cobre, ferro, zinco e mercúrio.
7â. - Processo de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a fonte de iões metálicos compreender o composto timerosal que contém mercúrio.
89. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por o virus ou bactéria vivos serem inactivados num meio compreendendo adicionalmente saponina.
9a. - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por o virus ou bactéria vivos serem inactivados na presença de um agente de estabilização capaz: de aumentar a estabilidade do antigénio.
109. _ Processo de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o agente de estabilização ser soro bovino de vitelo (fetal).
11&. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica que se encontre substancialmente livre de virus ou de bactérias vivos, caracterizado por compreender a inactivação de um vírus ou bactéria vivos com ácido ascórbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e de uma fonte de iões de metal pesado.
129. - Método para a profilaxia “23- .> ' <· ,·
3 ‘ ,.--··’ de infecções virais ou bacterianas caracterizado por se administrar, a um paciente uma substância ou composição que se encontre substancialmente livre de vírus ou de bactérias vivos e preparada por um método que compreende a inacti vação de um virus ou bactéria vivos com ácido ascérbico e/ou um seu sal na presença de oxigénio e uma fonte de iões de metal pesado, como referido nas reivindicações anteriores, sendo a gama de dosagem de 1,9 log de partículas virus inactivados por dose, de preferência pelo menos 1000 virus por dose (ou seja 3 log de partículas virus) por dose.
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