KR101056622B1 - 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한개선된 배합 백신 - Google Patents

미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한개선된 배합 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR101056622B1
KR101056622B1 KR1020047018602A KR20047018602A KR101056622B1 KR 101056622 B1 KR101056622 B1 KR 101056622B1 KR 1020047018602 A KR1020047018602 A KR 1020047018602A KR 20047018602 A KR20047018602 A KR 20047018602A KR 101056622 B1 KR101056622 B1 KR 101056622B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mycoplasma hyopneumoniae
pigs
vaccine
vaccine composition
mixture
Prior art date
Application number
KR1020047018602A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20050007402A (ko
Inventor
추시엔-줴
리우민
쉬즈창
Original Assignee
와이어쓰 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=32680190&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101056622(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 와이어쓰 엘엘씨 filed Critical 와이어쓰 엘엘씨
Publication of KR20050007402A publication Critical patent/KR20050007402A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101056622B1 publication Critical patent/KR101056622B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 유리하게도 1회 투여 후에 감염으로부터의 면역을 제공하는 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 하나 이상의 바이러스 항원을 포함하는 배합 백신을 제공한다. 본 조성물은 배합되어 1회 투여 후에 미코플라스마 하이오뉴모니애 감염으로부터의 면역을 제공하고 세포 매개성 면역 및 국소(분비 IgA) 면역을 포함하여 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린에 특이적인 면역반응을 유도하는 보조제 혼합물을 또한 포함한다. 바람직한 양태에서, 보조제 혼합물은 아크릴산 중합체, 가장 바람직하게는 카보폴, 및 대사가능한 오일(예: 하나 이상의 불포화 테르펜 탄화수소, 바람직하게는 스쿠알렌 또는 스쿠알란)과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(예: 플루로닉R)의 혼합물을 포함한다. 백신 조성물은 임의로 방부제, 바람직하게는 티메로솔 및/또는 EDTA를 함유할 수 있다.
미코플라스마 하이오뉴모니애, 박테린, 백신, 대사가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체

Description

미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한 개선된 배합 백신{Improved combine vaccine against mycoplasma hyopneumoniae and porcine viruses}
본 발명은 특히, 수용 동물을 1회 투여로 미코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 감염에 대해 면역화시키에 유효한 양의 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 사용하여, 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도하는 개선된 방법에 관한 것이다.
미코플라스마 하이오뉴모니애는 돼지 미코플라스마성 폐렴의 병원체이다. 상기 질환은 체중 증가를 감소시키고 사료 공급 효율성을 저하시켜 양돈 산업에 있어 경제적 손실의 주요 원인이다. 상기 질환은 만성 감기, 빛바랜 모피, 성장의 지연 및 수주 동안 지속되는 무기력을 야기시킨다. 특히, 복부 첨엽 및 심엽에서 심홍색 내지 회색 경화 부위의 특징적 병변이 감염된 동물에서 관찰된다. 상기 질환의 치사율은 낮지만 감염된 돼지는 흔히 기회감염 병원체에 의해 2차 감염되는 경향이 있어 결국 사망하거나 스트레스가 된다. 경제적 손실만 해도 연간 2억 내지 2억 5천만 달러인 것으로 추정되고 있다.
미코플라스마 하이오뉴모니애는 증식이 느리고 세포벽이 결여된 배양하기 어려운 세균이다. 이는 흔히, 기도에 위치하는 공통된 2차 인자인 미코플라스마 히오리니스(Mycoplasma hyorhinis)로 인해 기도로부터 분리하기가 어렵다. 상기 질환은 기침에 의해 생성된 에어로졸 및 감염된 또는 회복기의 보균돈과의 직접적인 접촉에 의해 전염된다. 감염된 동물과 비감염된 동물의 동반수용은 조기에 흔히 재감염을 야기한다. 감염은 흔히 분만시 보균 모돈에 의한 자돈의 감염으로 시작한다. 가축 관리 기술로 인해 생존 후반때까지 감염이 명백하지 않을 수 있다. 추가 감염은 일반적으로 돼지가 무리지어 있는 경우 이유 후에 관찰된다. 명백한 질환은 보통 6주령 이상이 되었을 때 돼지에서 관찰된다. 성장 속도 및 사료 전환율은 감염된 동물에서 현저히 감소된다. 항생제를 이용한 처리는 고비용이며 연장된 사용을 요한다. 재감염도 문제가 된다. 현재 감염 및 이로 인한 결과를 회피하기 위해 가장 효과적인 방법은 백신이다.
포트 다지 애니멀 헬쓰[Fort Dodge Animal Health(FDAH)]는 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의해 유발되는 임상적 징후로부터 건강한 돼지를 보호하기 위한 백신으로서 사용하기 위해, SuvaxynR RespifendR MH란 상표명하에 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 시판하고 있다. 백신은 보조제로서 카보폴을 함유하고 1주령 이상의 돼지에게 2회 투여용 백신으로서 권장되고 있으며, 두번째 투여는 첫번째 백신처리 후 2주 내지 3주째에 수행한다. 그러나, 2회 투여용 백신은 질환에 대해 완전한 보호를 제공하기 위해서 동물에게 2회 투여해야 하는 명백한 단점을 갖고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 1회 투여량의 백신을 투여하여 보호성 면역을 유도하고 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의해 유발된 질환을 예방하는, 당해 유기체에 대한 효과적인 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의해 유발된 감염 및 질환에 대해 돼지에서 사용하기에 적합하고 기타 박테린(bacterin) 및/또는 독소(toxoid)와 배합하여 사용할 수 있는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 박테린의 면역원성을 증진시켜 백신의 1회 투여 후에 보호성 면역을 유도하는 보조 제형을 사용함으로써, 원인 유기체가 미코플라스마 하이오뉴모니애인 질환을 예방하거나 개선시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적 및 특징은 하기에 제시하는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
발명의 요약
본 발명은 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량; 아크릴산 중합체, 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키기 위한 백신 조성물에 관한 것으로서, 당해 백신 조성물은 1회 투여 후에 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 보조제 혼합물 및 약제학적으로 허용되는 안정화제, 담체 또는 희석제와 배합된 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 포함하는, 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화하기 위한 면역원성 조성물을 제공하는 것이다. 보조제는 일반적으로 본 백신 조성물중에 약 1 내지 25%(v/v), 바람직하게는 약 5 내지 12%(v/v)의 최종 농도로 존재한다. 본 조성물은 또한 해모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 악티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 에리시펠로트릭스 류시오파티애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 렙토스피라(leptospira)와 같은 하나 이상의 병원체(이러한 병원체의 하나 이상의 균주, 유형, 혈청형 등을 포함함), 및 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 및 돼지 서코바이러스(PCV)와 같은 바이러스 항원을 포함하는 기타 백신 성분을 포함할 수 있으며, 근육내, 피하, 경구, 에어로졸 또는 비내 경로로 투여될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 기타 백신 성분은 SIV; 해모필러스 파라수이스; PRRSV 및 PCV로 이루어진 그룹; SIV 및 에리시펠로트릭스 류시오파티애로 이루어진 그룹; 및 파스튜렐라 멀토시다 및 보르데텔라 브론키셉티카로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항원을 포함할 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 기타 백신 성분은 SIV로부터 선택되는 경우, SIV-H1N1 균주, SIV-H1N2 및 SIV-H3N2 균주로부터 선택되는 것들을 포함할 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 및 보조제 혼합물을 포함하는 상기 백신의 1회 투여량을 투여함으로써, 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의해 유발되는 질환으로부터 동물을 보호하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명은 본 조성물 또는 백신에 대한 세포 매개성 및 국소(분비 IgA) 면역반응을 제공하는, 단독으로 또는 혼합물로서의 보조제 또는 보조제 혼합물과 배합된 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린; 하나 이상의 추가 세균 항원 및/또는 바이러스 항원을 포함하는 기타 백신 성분; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 미코플라스마 하이오뉴모니애에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키기 위한 면역원성 조성물 또는 백신을 제공하며, 본 백신 조성물은 1회 투여 후 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도한다. 상기 조성물 또는 백신에서, 기타 백신 성분은 해모필러스 파라수이스, 파스튜렐라 멀토시다, 스트렙토코커스 수이스, 악티노바실러스 플레우로뉴모니애, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 에리시펠로트릭스 류시오파티애, 렙토스피라와 같은 하나 이상의 병원체(이러한 병원체의 하나 이상의 균주, 유형, 혈청형 등을 포함함)로부터의 불활성화된 박테린 또는 정제된 독소, 및 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 및 돼지 서코바이러스(PCV)와 같은 바이러스 항원(이러한 바이러스 항원의 하나 이상의 균주, 유형, 혈청형 등을 포함함)을 포함할 수 있으며 근육내, 피하, 경구, 에어로졸 또는 비내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 바이러스 병원체에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키기 위한 백신 조성물로서, 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량; 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRSV) 및 돼지 서코바이러스(PCV)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 바이러스 항원의 면역화량; 및 아크릴산 중합체, 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함하는 수중유 에멀젼 형태인 보조제 시스템을 포함하고, 1회 투여 후 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명은 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 하나 이상의 바이러스 병원체, 및 임의로 추가의 바이러스 병원체 및/또는 세균 병원체에 의한 감염에 대해 동물을 면역화시키기 위한 백신 조성물 및 방법으로서, 1회 투여 후 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도하는 백신 조성물 및 방법을 제공한다.
본원에서 인용된 모든 특허, 특허원 및 기타 문헌은 이의 전체 내용이 본원에 참조로서 인용된다. 일치하지 않는 경우에, 본원의 기재가 우세할 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "박테린"은 불활성화되고 특정 보조제와 배합되어 동물에게 투여되는 경우 질환 또는 감염으로부터 보호하는 보호성 면역을 유도할 수 있는 세균 수거물이다.
"보조제"는 면역원성을 증가시키고 백신 조성물중의 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 효능을 증가시키는 하나 이상의 물질로 이루어진 조성물을 의미한다.
본원 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이, MHDCE (Mycoplasma Hyopneumoniae DNA cell equivalent)란 용어는 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물을 나타낸다.
"면역화량"은 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 면역을 제공할 박테린의 양이다. "면역화량"은 종, 품종, 연령, 크기, 건강 상태 및 동물이 이전에 동일한 유기체에 대한 백신을 투여받았는지의 여부에 따라 좌우될 것이다.
본 발명은 1회 투여 면역화에 적합한 미코플라스마 뉴모니애에 대한 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 박테린의 면역원성을 증강시켜 1회 투여로도 보호성 면역을 유도하는 보조제 혼합물을 포함한다.
백신은 당해 기술 분야의 표준[참조: 미국 특허 제5,338,543호 또는 미국 특허 제5,565,205호 및 하기 실시예 2]인 방법에 의해 새로이 수거된 배양물로부터 제조할 수 있다. 즉, 유기체는 PPLO(플레우로뉴모니애-유사 유기체) 완전 배지(제조원: Difco. Laboratories)와 같은 배양 배지에서 증식시킬 수 있다. 유기체의 성장은 색상 변화 단위(CCU)를 측정하는 바와 같은 표준 기술로 모니터링하고 충분히 높은 역가가 달성된 경우 수거한다. 스톡은 제형화를 위해 백신에 포함되기 전에 통상의 방법으로 추가로 농축시키거나 동결건조시킬 수 있다. 문헌[참조: Thomas, et al., Agri-Practice, Vol. 7 No. 5, pp.26-30]에 기재된 기타 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 백신은 보조제 혼합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 포함한다. 사용하기에 적합한 담체는 수성 매질, 예를 들어, 염수, 포스페이트 완충 염수, 최소 필수 배지(MEM) 또는 HEPES 완충액과의 MEM을 포함한다.
본 발명의 백신 조성물에서 사용하기 위한 보조제 혼합물은 면역반응을 증강시키고 아크릴산 중합체와, 대사가능한 오일, 예를 들어, 불포화 테르펜 탄화수소 또는 이의 수소화 생성물, 바람직하게는 스쿠알란(2,3,10,15,19,23-헥사메틸테트라코산) 또는 스쿠알렌 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물의 혼합물을 포함한다. 이러한 아크릴산 및 중합체는 단독중합체 또는 공중합체일 수 있다. 아크릴산 중합체는 바람직하게는 카보머이다. 카보머는 카보폴(CarbopolR)이란 상표명하에 시판되고 있다. 아크릴산 중합체는 예를 들어, 본원에서 참조로 인용되는 미국 특허 제2,909,462호 및 제3,790,665호에 기재되어 있다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체는 계면활성제, 바람직하게는, 고체 및 액체 성분의 현탁을 보조하는 액체 계면활성제이다. 계면활성제는 플루로닉(PluronicR)이란 상표명하에 중합체로서 시판되고 있다. 바람직한 계면활성제는 플루로닉 L121이란 상표명하에 시판되고 있는 폴록사머 401이다.
면역학적 자극성 보조제 혼합물은 본 발명의 백신 조성물중에 약 1% 내지 25%, 바람직하게는 약 2% 내지 15%, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 12% v/v의 양으 로 존재한다. 사용되는 보조제 혼합물의 양과 보조제의 두 성분의 비는 기타 박테린 또는 정제된 독소가 첨가되었는지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 보조제 혼합물은 일반적으로 수성 매질중에 에멀젼으로서 제형화된 대사가능한 오일, 아크릴산 중합체 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함한다
당해 보조제 혼합물에서, 대사가능한 오일 및 아크릴산 중합체는 각각 약 10 내지 150ml/L 및 약 0.5 내지 10g/L 범위의 양으로 존재할 수 있다. 보조제 혼합물의 바람직한 양태에서, 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 성분의 혼합물은 스쿠알란과 플루로닉 L121(폴록사머 401)의 혼합물(이것은 약 50 내지 100ml/L의 양으로 존재할 수 있다)이고 카복시메틸렌 중합체는 약 2ml/L의 양으로 존재할 수 있는 카보폴 934P(카보머 934P)이다. 통상적으로, 보조제 혼합물은 약 1:25 내지 1:50의 비의 아크릴산 중합체 대 대사가능한 오일/폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 혼합물을 포함한다.
바람직한 아크릴산 중합체는 폴리알릴슈크로스와 가교결합된 아크릴산의 중합체이고 화학식이 (CH2CHOOOH)n인 카보폴 934 P NF 및 941 NF로서 비.에프.굿리치[B.F. Goodrich]에 의해 시판되는 중합체이다. 이들 중합체는 수성 담체와 함께 적합하게 제형화하는 수성 겔을 형성한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체는 플루로닉 L121, L61, L81 또는 L101로서 BASF에 의해 시판되는 비이온성 계면활성제이다
1회 투여 후 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도하는, 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량; 세균 및/또는 바이러스 항원으로부터 선택되는 기타 백신 성분; 및 약제학적으로 허용되는 담체의 배합물로 의도된 본 발명의 백신 조성물에서, 당해 백신 조성물은 세포 매개성 및 국소(분비 IgA) 면역을 제공하는 보조제 또는 보조제 혼합물을 단독으로 또는 배합물로서 추가로 포함한다. 이들 보조제 또는 보조제는 QUILR과 같은 사포닌; IL-12 및 IL-18과 같은 사이토킨 및 국소(분비 IgA) 면역; 수산화알루미늄, 수중유 에멀젼 형태인 대사가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체과 아크릴산 중합체, 에틸렌 말레산 공중합체; 또 다른 보조제와의 아크릴산 중합체, DEAE 덱스트란, 미코박테리아 세포 벽 유래의 보조제 등과 같은 보조제로부터 추가로 선택될 수 있다. 이러한 본 발명의 조성물 중의 기타 백신 성분은 해모필러스 파라수이스, 파스튜렐라 멀토시다, 스트렙토코커스 수이스, 악티노바실러스 플레우로뉴모니애, 보르데텔라 브론키셉티카, 살모넬라 콜레라수이스, 에리시펠로트릭스 류시오파티애, 렙토스피라와 같은 하나 이상의 병원체(이러한 병원체의 하나 이상의 균주, 유형, 혈청형 등을 포함함)로부터의 불활성화된 박테린 또는 정제된 독소를 포함하는 세균 항원 및 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 및 돼지 서코바이러스(PCV)와 같은 바이러스 항원(이러한 바이러스 항원의 하나 이상의 균주, 유형, 혈청형 등을 포함함)을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 기타 백신 성분은 SIV; 해모필러스 파라수이스; PRRSV 및 PCV로 이루어진 그룹; SIV 및 에리시펠로트릭스 류시오파티애로 이루어진 그룹; 및 파스튜렐라 멀토시다 및 보르데텔라 브론키셉티카로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항원을 포함할 것이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 기타 백신 성분은 SIV로부터 선택되는 경우 SIV-H1N1 균주, H1N2 및 SIV-N3N2 균주로부터 선택되는 것들을 포함할 것이다.
본 발명의 백신은 근육내, 피하, 비내, 복강내 또는 경구 경로로 투여될 수 있고 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 백신은 일반적으로 불활성화된 미코플라스마 하이오뉴모니애, 대사가능한 오일, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및 아크릴산 중합체를 수중유 에멀젼 형태로서 포함한다. 백신은 바람직하게 0.5 내지 10g/L 범위의 농도로 아크릴산 중합체를 함유한다. 백신은 바람직하게 2 내지 6ml/L 범위의 농도로 대사가능한 오일을 함유한다. 백신은 바람직하게 1 내지 3ml/L 범위의 농도로 폴리옥시에틸렌-프로필렌 블록 공중합체를 함유한다.
1회 투여량 투여를 위해, 백신은 바람직하게 약 1 x 108 내지 3 x 1011 MHDCE/ml, 바람직하게는 약 1 x 109 내지 3 x 109 MHDCE/ml에 상응하는 양의 미코플라스마 뉴모니애 박테린을 함유해야만 한다. 약 1 내지 5ml, 바람직하게는 2ml가 동물마다 근육내, 피하 또는 복강내로 투여될 수 있다. 1 내지 10ml, 바람직하게는 2 내지 5ml가 경구 또는 비내로 투여될 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하기 위함이며 이의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린
백신 조성물의 제조
바이러스 스톡의 설명. 미코플라스마 하이오뉴모니애는 용이하게 입수가능한 다수의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 하나의 양태에서, 미코플라스마 하이오뉴모니애 균주 P-5722-3을 사용할 수 있다. 배양물은 씨 암스트롱(C. Armstrong)(Purdue University, West Lafayette, Indiana)으로부터 입수하였다. 미코플라스마 하이오뉴모니애 배양물을 입수한 후 미코플라스마 하이오뉴모니애 브로쓰 중에서 7회 계대배양하여 마스터 씨드(Master Seed)를 확립하였다.
세포 배양. 미코플라스마 하이오뉴모니애를, 박토 PPLO 분말, 효모 추출물, 글루코스, L-시스테인 하이드로클로라이드, 암피실린, 탈륨 아세테이트, 페놀 레드, 소포제, 표준의 멸균 돼지 혈청 및 물을 포함하는 배지에서 18 내지 144시간에 걸쳐 성장시켰다. 불활성화를 위해, 이원 에틸렌이민(BEI)을 발효 용기내의 생산 배양물에 직접 첨가하였다. pH를 7.4로 조정한 다음, 통상적인 방법에 따라 수거하여 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린을 수득하였다.
백신 조성물의 제조
방부제의 조성 및 사용되는 비율. 수거된 박테린은 티메로살 및 에틸렌 디아미네테 테트라아세트산, 사나트륨염(EDTA)을 각각 0.01% 및 0.07% 이하로 첨가하여 보존시킨다. 암피실린 U.S.P.는 성장 배지중에 0.250g/l로 존재한다. 잔류 암피실린의 농도는 수거된 유체의 용적에 따라 최종 생성물중에서 다를 것이고, 완료된 생성물중의 잔류 암피실린 농도는 30㎍/ml을 초과하지 않는다.
생성물의 표준화. 미코플라스마 농축물을 DNA 형광측정 검정으로 정량한다.
하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물, 예를 들어, 스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물을, 900mL의 정제수 속에 염화나트륨 10g, 염화칼륨 0.25g, 이염기성 인산나트륨 2.72g, 일염기성 인산칼륨 0.25g, 플루로닉 L121(제조원: BASF Corporation) 20ml, 스쿠알란(Kodak) 40ml, 트윈 80 3.2ml을 용해시켜 1000ml가 되도록 제조한다. 혼합 후, 성분들을 오토클레이빙한다. 이어서 혼합물을 안정한 에멀젼이 형성될 때까지 균질화시킨다. 최종 농도가 0.2%가 되도록 포르말린을 첨가하거나 최종 농도가 1:10,000이 되도록 티메로살을 첨가할 수 있다.
연속물을 제조하기 위한 단위의 어셈블리. 만족스러운 미코플라스마 하이오뉴모니애 농축물을 무균적으로 보조제, 방부제 및 희석제와 배합하여 교반기가 장착된 멸균 용기에 첨가하고 30분 이상 동안 혼합한다.
1,000,000 용량(각각 2mL)에 대한 양: %vol/vol
미코플라스마 농축물(> 1.0 x 1010 MHDCE/mL 400,000 mL 20.0
스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물 100,000 mL 5.0
카보폴(수중 2% w/v) 200,000 ml 10.0
수중 티메로살 용액 1% w/v 및 EDTA(사나트륨 염) 7 w/v% 18,000 ml 0.9
멸균 염수 1,282,000 ml 64.1
연속물의 pH는 7.0 ±0.2로 조정한다.
MHDCE = 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물

최종 용기의 충전 및 밀봉 방법 및 기술.
생성물 전체를 200 내지 500㎛의 멸균 필터 장치를 통해 여과하고 9 CFR 114.6에 명시된 조건하에 충전 작업용으로 지정된 방에서 멸균 최종 용기내로 충전한다. 유리 또는 플라스틱 용기를 고무 마개로 폐쇄시키고 알루미늄 밀봉재로 주름지게 하여 밀봉한다. 각각 2.0ml 용량은 2 x 109개 이상의 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물을 함유한다.
효능 시험. 완제품의 벌크 또는 최종 용기 샘플은 다음과 같이 효능 시험할 수 있다:
효능 시험을 위한 검정 방법: 하를란 슈프라그 다울리[Harlan Sprague Dawley] 또는 기타 허가된 공급원으로부터 하나로 위탁된 6주령 내지 7주령의 ICR 암컷 마우스를 사용한다. 미지의 박테린 및 표준 박테린 각각으로 면역화하기 위해 최소 20마리의 마우스가 요구된다. 최소 5마리의 마우스를 비-접종 대조군으로서 유지시킨다. 시험 박테린 및 표준 박테린을 각각 철저히 혼합한다. 5/8인치의 바늘이 장착된 25-게이지의 멸균된 1회용 주사기를 사용하여 마우스의 서혜부에 숙주 동물 용량의 10분의 1(0.2ml)을 피하로 접종시킨다. 각각의 마우스 그룹을 개개의 단위로서 사육하고 14일 동안 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 한다. 이어서 각각의 마우스를 마취시킨다. 마취된 마우스를 뒤집어 위치시킨다. 한 손을 사용하여 머리를 누르고 한쪽 앞다리를 몸으로부터 잡아당긴다. 외과용 메스를 사용하여, 잡아당긴 앞다리와 흉부 사이에 약 1/2 인치의 길이로 피부를 절개하여 상완 동맥을 절단한다. 바늘이 없는 3.0ml 주사기를 사용하여 절개 부위에 모인 혈액을 수집한다. 혈액을 표지된 시험관내로 배출시켜 응고시킨다. 응고된 시험관을 1,000 x g에서 원심분리하여 응혈로부터 혈청을 분리한다. 각각의 혈청을 시험할 때까지 -20℃ 이하로 냉각시켜 저장한다.
혈청학적 검사: ELISA 방법을 사용하여 표준 박테린 및/또는 미지의 박테린에 대한 마우스의 항체 반응을 측정한다. ELISA 방법은 다이나테크(Dynatech)의 1회용 임뮬론 II 평저(Disposable Immulon II Flat-Bottom) 미세역가 플레이트 또는 동등한 플레이트 및 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 수행한다.
시험 시약:
포스페이트 완충 염수-트윈(PBST)(pH는 5N NaOH 또는 5N HCl을 사용하여 7.2 내지 7.4로 조정함)
리터당 양
성분 리터
NaCl 8.50g
NaH2PO4 0.22g
Na2HPO4 1.19g
트윈-20 0.50ml
탈이온수 1,000.00ml가 되도록 하는 양

글리신 완충 염수(GBS)(pH는 5N NaOH 또는 5N HCl을 사용하여 9.5 내지 9.7로 조정됨)
성분 리터당 양
글리신 0.75g
NaCl 8.50g
탈이온수 1,000.00ml가 되도록 하는 양

양성 대조군 혈청: 양성 대조군 혈청은 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린으로 백신처리된 마우스 유래의 혈청 풀이다.
접합체 및 기질:
친화도-정제된 항-마우스 IgG 퍼옥시다제-표지된 접합체를 키르케가드 앤드 페리 래보러터리즈[Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc]로부터 입수한다(카탈로그 번호. 074-1802). 접합체의 최적의 희석액을 결정하기 위한 과정은 하기에 상세히 설명한다. 퍼옥시다제 기질 용액(ABTS)은 키르케가드 앤드 페리사[Kirkegaard and Perry, Inc.]로부터 입수한다.
접합체의 적정: 임뮬론 II 평저 플레이트를 10mM GBS 속에 mL당 20㎍로 희석된 미코플라스마 하이오뉴모니애로 웰당 100㎕씩 피복시킨다. 상기 플레이트를 1시간 이상 동안 37℃±2℃에서 항온처리하고 18시간 내지 1주일 동안 2 내지 7℃로 변경한다. 사용 전에, 플레이트를 각 세척 사이에 1분 동안 침지시키면서 PBST로 3회 세척하고 털어서 건조시킨다. PBST중의 양성 대조군 혈청의 1:40 희석액을 제조하고 희석된 양성 혈청(웰당 100㎕)을 플레이트내의 절반의 웰에 첨가한다. PBST를 나머지 절반의 웰에 첨가한다. 플레이트를 1시간 동안 실온에서 항온처리한 후에 3회 세척한다. 접합된 혈청을 1:100 희석으로 시작하여 최종적으로 1:10,240까지 희석하여 PBST로 2배씩 연속적으로 희석시킨다. 각각의 접합체 희석액 100㎕를 양성 혈청의 4개의 웰 및 PBST의 4개의 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시킨다. 플레이트를 4회 세척하고, 웰당 퍼옥시다제 기질 용액(abts) 100㎕를 첨가한다. 플레이트를 Tλ=450으로 설정된 이중 파장에서 판독한다. PBST 대조군의 값을 양성 대조군 혈청 값으로부터 공제하는 경우 양성 대조군 혈청에 대해 0.850 내지 1.050로 판독되는 접합체의 희석액을 선택한다.
시험 항원:
미코플라스마 하이오뉴모니애 항원은 전세포 제제이고, 포트 다지 애니멀 헬쓰에 의해 공급된다.
ELISA는 다음과 같이 수행한다: 다이나테크의 임뮬론 II 평저 미세역가 플레이트를 사용한다. 동결건조된 미코플라스마 하이오뉴모니애 전세포 항원의 하나의 바이알에 글리신 완충 식염수(GBS)로 10ml까지 재구성한다. 재구성된 미코플라스마 단백질의 농도는 20㎍/ml이다. 이어서, 희석된 항원 100㎕(2㎍)를 플레이트의 모든 웰에 첨가한다. 플레이트를 1시간 이상 동안 37℃ ±2℃에서 항온처리한 다음, 최소 18시간 내지 최대 1주일 동안 2 내지 7℃로 변경한다. 플레이트를 각 세척 사이에 1분 동안 침지시키면서 PBST로 3회 세척한 다음, 털어서 건조시킨다. 혈청을 PBST 속에 1:40으로 희석시킨다. 양성 대조군 혈청은 플레이트 마다 4배로 포함될 것이다. 웰당 샘플 용적은 100㎕이다. 일련의 시험 혈청 샘플 및 표준 혈청 샘플을 동일한 플레이트상에서 이중으로 시험한다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 PBST로 3회 세척한다. PBST속에 희석된 항-마우스 IgG 퍼옥시다제-표지된 접합체(제조원: Kirkegaard and Perry) 100㎕를 모든 웰에 첨가하고 웰을 실온에서 30분 동안 항온처리한다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한다. 퍼옥시다제 기질 용액(ABTS) 100㎕를 모든 웰에 첨가하고, 기기가 PBST 대조군 웰에 대해 블랭크될 경우 양성 혈청 대조군이 0.850 내지 1.050의 OD405(450)에 도달할 때까지 상기 플레이트를 항온처리한다. 플레이트를 판독하고 PBST 웰에 대해 블랭크한다. 유효 시험이 되기 위해, 표준 박테린으로 접종된 마우스 혈청은 0.500의 최소 평균값을 나타내야만 하고, 백신처리되지 않은 대조군 마우스의 혈청은 0.100의 최대 평균값을 초과하지 않아야 한다. 또는, 표준 박테린으로 접종된 마우스 혈청의 평균값과 백신처리되지 않은 대조군 마우의 혈청의 평균값 사이의 차이는 0.400 이상이어야 한다.
일련의 백신, 표준 백신 및 대조군에 대한 평균값을 다음과 같이 계산하고 평가한다: 만족스러운 것으로 고려되기 위해, 시험 박테린은 표준 이상의 평균 광학 밀도 값을 나타내야 한다. 또는, 단측 스튜던트 T-검정(one-Tailed Student's T-Test)을 사용할 경우, 시험 박테린은 표준 박테린보다 유의적으로(p ≤0.05 신뢰수준) 낮지 않아야 한다. 임의의 계산된 T-값이 1.686 이상인 경우는 표준 박테린과 시험 박테린 사이에 유의차가 있음을 나타내고 당해 시험 박테린은 기각된다. 임의의 계산된 T-값이 1.686 미만인 경우는 만족스러운 연속물임을 나타낸다. 생성물 효능과 관련이 없는 모든 이유로 인해 당해 검정에 의해 만족스럽지 못한 것으로 결정된 임의의 시험 박테린은 재시험하고 초기 시험은 무효인 것으로 간주한 다.
실시예 2
시험 백신:
시험용 백신은 실시예 1에 명시된 과정에 따라서, 보조제로서 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물(스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물) 및 0.2% 아크릴산 중합체(카보폴) 및 투여당 2 x 109개의 엠. 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물(MHDCE)을 사용하여 제조하였다.
실시예 3
본 시험은 3주령에서 실시예 2의 백신을 1회 투여하는 백신처리된 돼지에서의 면역 지속기간(DOI)이 4개월임을 입증하기 위해 디자인하였다.
2회의 개별적 동물 시험을 본 연구 동안 수행하였다. 두 시험 모두에서의 모든 돼지는 백신처리시에 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었으며, 이는 동물이 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대해 감수성이었음을 나타낸다. 대조군의 모든 돼지는 시험감염 전에 혈청-음성인 상태를 유지하였다. 이는 백신처리된 돼지에서의 면역반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다.
제1 시험에서, 고수준의 병독성 엠. 하이오뉴모니애(유기체 0.4 x 106개) 시험감염물을 사용하여 실시예 2의 백신을 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim; BI)에 의해 제조되고 시판되는 제품인 인겔벡 엠. 하이오(Ingelvac M. hyoR)와 함께 평가하였다. 18일령 내지 21일령의 돼지 22마리를 실시예 2의 백신으로 근육내(IM)로 백신처리하고, 8마리의 돼지를 인겔벡 엠. 하이오[연속물 271 032]로 백신처리한다. 22마리 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 10마리 돼지는 비-시험감염 대조군으로서 사용한다. 백신처리된 대조군 및 시험감염 대조군의 돼지를 백신처리한 후 4개월째에 병독성 엠. 하이오뉴모니애로 시험감염시켰다. 실시예 2의 백신으로 백신처리된 돼지는 평균 폐 병변율이 15.9%이었고, 시험감염된 대조군 돼지는 평균 폐 병변율이 19.6%이었다. 실시예 2의 백신으로 백신처리된 그룹의 평균 폐 병변율은, 돼지를 아이오와 주립대(ISU)가 추천하는 투여량보다 높은 투여량으로 시험감염시켰음에도 불구하고 대조군에 비해 낮았으나, 차이는 유의적이지 않았다(p=0.19). 마찬가지로, 시판품인 인겔벡 엠. 하이오를 동일한 투여량의 시험감염물로 동일한 동물 그룹에 대해서 평가한 경우, 유사한 수준의 폐 병변율이 또한 관찰되었다(14.6%). 인겔벡 엠. 하이오 백신처리 그룹 및 대조군(p=0.27) 사이 및 인겔벡 엠. 하이오 백신처리 그룹 및 실시예 2의 백신으로 백신처리된 그룹 사이에도 유의차는 없었다.
제2 시험에서, 실시예 2의 백신을 백신처리 후 4개월째에 ISU가 제안한 수준(유기체 1.0 x 106개)에서 병독성 엠. 하이오뉴모니애를 시험감염시켜 평가하였다. 23마리의 돼지를 21일령에서 1회 투여량의 백신으로 백신처리하였고, 25마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 7마리의 돼지는 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 백신처리된 대조군 및 시험감염 대조군의 돼지에게 백신처리 후 4개월째에 병독성 엠. 하이오뉴모니애를 시험감염시켰다. 대조군은 평균 폐 병변율이 10.4%이었고 백신처리 그룹은 평균 폐 병변율이 5.5%이었다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 유의차(p = 0.031)가 있었다. 이는 실시예 2의 백신이 보호성 면역을 자극하는데 효능적이고 이러한 효능이 3주령의 돼지를 1회 투여량으로 백신처리한 후 4개월 이상 지속될 수 있음을 나타낸다.
2회의 시험에서 실시예 2의 백신과 관련된 데이터를 종합 분석한 경우, 백신처리 그룹의 평균 폐 병변율은 대조군의 폐 병변율 보다 유의적으로 낮았다.
결론적으로, 실시예 2의 백신은 3주령의 돼지에게 1회 투여량으로 백신처리한후 4개월째에 병독성 엠. 하이오뉴모니애 시험감염에 대해 보호 면역을 유도한다.
실험 데이터
2회의 개별적 시험을 본 연구에서 수행하였다. 하나의 시험에서, 67마리의 돼지를 마이크로소프트 엑셀 무작위화 프로그램을 사용하여 4개의 그룹으로 분류하였다. 24마리의 돼지를 실시예 2에 따라 제조된 1회 투여량의 백신으로 18일령 내지 21일령에서 근육내(IM)로 백신처리하였다. 24마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지는 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 9마리의 돼지를 시판품인 인겔벡 엠. 하이오[연속물 271 032, 제조원: 베링거 잉겔하임(BI)]를 사용하여 표지의 지침에 따라 근육내(IM)로 백신처리하였다. 5마리의 돼지(이중에서 2마리는 실시예 2의 백신으로 백신처리하고 1마리는 BI 백신으로 백신처리하고 2마리는 대조군이다)는 백신처리 기간 동안에 백신처리와는 관계없는 이유로 사망하였다. 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군의 나머지 돼지들에게 백신처리한 후 4개월째에 병독성 엠. 하이오뉴모니애 14ml(유기체 1.4 x 106개)를 시험감염시켰다. 모든 네 그룹의 돼지는 시험감염시킨지 30일 후에 안락사시키고 본 시험에서 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 스코어를 매겼다.
제2 시험에서, 25마리의 돼지를 21일령에서 실시예 2에 따라 제조된 1회 투여량의 백신으로 근육내(IM)로 백신처리하였다. 25마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지는 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 2마리의 돼지는 백신처리와 관련이 없는 이유로 사명하였고 1마리의 돼지는 백신처리 기간 동안 실수로 판매되었다. 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군의 나머지 돼지에게 백신처리 후 4개월째에 병독성 엠. 하이오뉴모니애 10ml(유기체 1.0 x 106개)를 시험감염시켰다. 2마리의 돼지는 시험감염 후 관찰 기간 동안에 백신처리/시험감염과 관련이 없는 이유로 사망하였다. 모든 세 그룹의 나머지 돼지는 시험감염한지 30일 후에 안락사시키고 본 시험에서 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 스코어를 매겼다.
백신처리
백신처리 그룹에서 각각의 돼지에게 목의 측면에 시험 백신 2ml의 투여량을 근육내(IM)로 투여한다.
투여 및 부검
병독성 엠. 하이오뉴모니애 시험감염 스톡인 동결된(-70℃) 폐 균질물은 아이오와 주립대(ISU)의 에일린 택커 박사가 제조하였다. 시험감염 스톡은 순수한 것으로 확인되었고 1mL당 107개의 엠. 하이오뉴모니애 유기체를 함유하였다. 추천된 시험감염 용량은 1:100으로 희석된 스톡 10ml(유기체 즉, 1.0 x 106개)이다.
제1 시험에서 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군 그룹의 돼지에게는 1:100 으로 희석된 스톡 14ml(즉, 유기체 1.4 x 106개)를 시험감염시켰다. 제2 시험에서 돼지에게는 추천된 바와 같은 1:100으로 희석된 스톡 10ml(즉, 유기체1.0 x 106개)를 시험감염시켰다.
시험감염 당일에, 균질물을 온수하에 급속 해동시키고 멸균 엠. 하이오뉴모니애 성장 배지를 사용하여 ISU가 추천한 바에 따라 희석시켰다. 돼지를 크실라진 50mg/ml, 케타민 50mg/ml 및 텔라졸 100mg/ml로 이루어진 크실라진-케타민-텔라졸(Xylazine-Ketamine-TelazolTM)의 혼합물로 진정시켰다. 마취 혼합물은 체중 ℓb당 0.01 내지 0.02mL로 근육내(IM)로 투여하였다. 각각의 돼지에게 시험감염 물질 14ml(제1 실험) 또는 10ml의 투여량(제2 실험)을 기관지내에 1회 투여하였다. 바늘 위치가 올바르다는 것을 확인하기 위해, 시험감염 용량을 투여하기 전에 주사기에 공기를 흡입하였다. 비백신처리된 비-시험감염 대조군 돼지를 별도의 방에서 유지시키고 시험감염시키지 않았다.
시험감염 후(DPC) 30일째에 모든 돼지를 안락사시켰다. 폐를 떼어내어 시험 그룹을 알지 못하는 개인이 총 폐 병변에 대해 스코어를 매겼다.
샘플 수집 및 시험:
백신처리 당일(0 DPV), 백신처리 후 1개월째(1 MPV), 4 MPV/0 DPC 및 30 DPC에 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수집하고 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체를 경쟁 ELISA 키트(제조원: DAKO Co.)로 검출하였다. 혈청 샘플을 시험하기 전에 -20℃에서 저장하였다.
데이타 분석:
폐 병변 스코어를 분산분석(ANOVA)에 의해 백신처리 그룹과 비백신처리 그룹 간에 비교하였다. 폐 스코어는 아크사인으로 전환시켜 잔차의 분포를 개선시켰다.
결과 및 검토
혈청학: 시험 둘다의 모든 돼지는 모든 시험에 대해 1:10의 혈청 희석액을 사용하여 시판되는 경쟁 ELISA 키트에 의해 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체에 대해 시험하였다. 모든 돼지는 백신처리시에 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었고, 이는 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성이었음을 나타낸다. 대조군의 모든 돼지는 투여 전에 혈청-음성인 상태를 유지하였다. 이는 백신처리된 돼지에서 면역반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다. 백신처리 그룹의 모든 돼지 및 시험감염 대조군의 대부분의 돼지(제1 시험에서 22마리의 돼지중 18마리 및 제2 시험에서 25마리의 돼지중 15마리)가 시험감염 후 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청-전환된 반면, 시험감염되지 않은 모든 동물은 혈청 음성인 상태를 유지하였다. 이는 시험감염이 엠. 하이오뉴모니애에 특이적이었음을 의미한다. 시험 동물의 혈청 상태는 표 1에 요약되어 있다.
제1 시험에서의 면역원성 시험:
실시예 2의 백신이 백신처리 후 4개월째에 ISU가 추천한 것 보다 고수준의 시험감염으로부터 보호할 수 있는 강한 면역을 자극할 수 있는지를 결정하기 위해 제1 시험을 수행하였다. 또한, 본 시험으로 백신처리 후 4개월째에 보호성 면역을 자극하는 능력에 대해 실시예 2의 백신과 시판되는 인겔벡 엠. 하이오를 비교하였다.
FDAH Suvaxyn MH-One으로 백신처리된 22마리의 돼지와 허가된 제품인 인겔벡 엠. 하이오 연속물 271,032로 백신처리된 8마리의 돼지에게 시험감염 물질을 돼지당 1.4 x 106개의 유기체(ISU는 돼지당 1.0 x 106개 유기체를 추천한다. 섹션 5.5. 참조)로 시험감염시켰다. 22마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 10마리의 돼지는 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 폐 병변율(%)은 표 2에 요약되어 있다. 실시예 2의 백신으로 백신처리된 돼지는 평균 폐 병변율이 15.9%이었고, 시험감염된 대조군 돼지는 평균 폐 병변율이 19.6%이었다. 실시예 2의 백신으로 백신처리된 그룹의 폐 병변율은 돼지에게 보다 높은 용량의 엠. 하이오뉴모니애를 시험감염시킨 경우에도 대조군보다 낮았다. 그러나, 차이는 유의적이지 않았다(p=0.19). 마찬가지로, 시판 제품 인겔벡 엠. 하이오를 동일한 용량의 시험감염물로 동일 동물 그룹에 대해서 평가한 경우에도 유사한 수준의 폐 병변율이 관찰되었다(14.6%). 인겔벡 엠. 하이오 백신처리된 그룹과 대조군 사이(p = 0.27) 및 인겔벡 엠. 하이오 백신처리된 그룹과 실시예 2의 백신으로 백신처리된 그룹 사이(p = 0.88)에 유의차는 없었다.
병변율에서 수치의 감소가 실시예 2의 백신을 투여받은 그룹에서 유의적이지 않은 것으로 기록되었지만, 본 시험에서 수득된 데이타는 본 시험에서 사용된 보다 높은 시험감염 용량(유기체 1.4 x 106)이 아마도 시판되는 인겔벡 제품에 의해 자극되는 돼지의 면역보다 압도적이었음을 제안한다. 이러한 시험감염 수준은 아마도 20 내지 25마리 동물의 그룹 크기를 사용한 백신처리/시험감염 연구 평가에 적당하지 않지만 보다 큰 크기의 그룹을 사용하는 경우 유의성이 입증될 수 있다.
제2 시험에서의 면역원성 시험:
4개월 DOI를 입증하기 위해, 2회의 시험에서 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군의 돼지를 백신처리 후 4개월째에 ISU가 추천한 바와 같은 시험감염 용량(유기체 1.0 x 106개)으로 평가하였다. 폐 병변율(%)은 표 3에 요약되어 있다. 대조군은 평균 폐 병변율이 10.4%이었다. 백신처리 그룹은 평균 폐 병변율이 5.5%이었다. 백신처리 그룹과 대조군 그룹 사이에는 유의차(p = 0.031)가 있었다. 이는 실시예 2의 백신이 보호 면역을 자극하는데 효능적이며 이러한 효능이 3주령의 돼지에게 1회 투여량으로 백신처리한 후 4개월 이상 동안 지속될 수 있음을 나타낸다.
시험 둘다의 종합된 결과에 대한 평가:
두 시험이 유의적으로 상이한 반면에, 그룹에 미치는 시험의 효과는 유의적이지 않았다. 그룹의 효과 정도는 두 시험간에 유사하였다. 따라서, 그룹의 효과를 시험과 무관하게 평가할 수 있었다. 전체모형의 분석이, 그룹과 시간 사이의 상호작용이 유의적이지 않았음을 보여주었기 때문에, 이는 그룹의 효과가 시험 둘다에서 동일하다는 개념을 지지해주고 두 시험으로부터의 데이타를 단일 분석으로 종합시킴을 정당화한다. 이와 같이 두 시험으로부터 실시예 2의 백신과 관련된 데이타를 종합하고, 폐 병변율에 대해 아크사인 전환된 변수를, 독립 변수(축소모형)로서 그룹 및 실험을 사용하여 분석한 경우 그룹은 통계적으로 유의적이다(p = 0.013).
대조군 및 백신처리 돼지에서 엠. 하이포뉴모니애에 대한 혈청 상태의 요약
제1 시험
양성/음성(1:10)
그룹 돼지 마리수 ODPV -1DPC 30DPC
FDAH 백신 22 0/22 0/22 22/22
BI 백신 8 0/8 4/8 8/8
시험감염 대조군 22 0/22 0/22 18/22
비-시험감염 대조군 10 0/10 0/10 0/10
제2 시험
양성/음성(1:10)
그룹 돼지 마리수 ODPV -3DPC 30DPC
FDAH 백신 23 0/23 6/23 23/23
대조군 25 0/25 0/25 14/25
비-시험감염 대조군 7 0/7 0/7 0/7

제1 시험(과투여량)*에서 폐 병변율(%)에 대한 요약
그룹 돼지 마리수 폐 병변율(%)-
평균값		 P 값
FDAH 백신 22 15.90% 0.19**
BI 백신 8 14.60% 0.27***
대조군 22 19.60%
비-시험감염 대조군 10 0% 0.88****
* 돼지에게 돼지당 1.4 x 106개의 유기체를 시험감염시켰다(ISU는 돼지당 1.0 x 106개의 유기체의 용량을 추천하였다)
** FDAH 백신 그룹과 대조군 간의 비교
*** BI 백신 그룹과 대조군 간의 비교
**** BI 백신 그룹과 FDAH 백신 그룹간의 비교
제2 시험에서 폐 병변율(%)에 대한 요약(추천된 용량)
그룹 돼지 마리수 폐 병변율(%)-
평균값		 P값
FDAH 백신 23 5.50% 0.031**
대조군 25 10.40%
비-시험감염 대조군 7 0.77%
* 돼지에게 ISU 추천된 투여량(돼지당 1.0 x 106개의 유기체)를 시험감염시켰다.
** FDAH 백신 그룹과 대조군 그룹간의 비교
실시예 4
1회 투여량을 투여한지 6개월 후 본 발명의 백신 조성물에 의해 유도된 병독성 시험감염에 대한 장기 면역의 평가
실시예 1 및 실시예 2에 기재된 바와 본질적으로 동일한 방법 및 하기에 제시한 양을 사용하여 시험 백신 A를 제조하였다.
시험 백신 A
1,000,000 용량에 대한 양(각각 2ml): % 용량/용량
미코플라스마 농도(> 1.0 x 1010 MHDCE/ml) 1200,000 mL 60.0
스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물 200,000mL 10.0
카보폴(수중 2% w/v) 200,000mL 10.0
수중 티메로살 용액 1% w/v 및 EDTA(사나트륨 염)7 w/v%) 18,000ml 0.9
멸균 식염수 382,000mL 19.1
연속물의 pH를 7.0 ± 0.2로 조정한다.
MHDCE = 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물

요약
33마리의 21일령 돼지를 본 평가에 참가시켰다. 22마리의 돼지를 3주령에서 1회 투여량의 백신 A로 근육내(IM)로 백신처리하였다. 10마리의 돼지는 비-백신처리된 대조군으로서 사용하고 3마리의 돼지는 비-시험감염 환경적 대조군으로서 사용하였다.
모든 돼지는 백신처리시에 혈청 음성(항체 역가 < 10)이었고, 이는 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성이었음을 나타낸다. 대조군의 모든 돼지는 시험감염 전에 혈청 음성이었다. 이는 백신처리된 돼지에서의 면역반응이 백신에 의한 것이지 임의의 환경 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다.
백신처리한지 6개월 후에, 20마리의 백신처리된 돼지 및 10마리의 비백신처리된 대조군 돼지에게 병독성 엠. 하이오뉴모니애(돼지당 1.0 x 106개의 유기체)를 시험감염시켰다. 3마리의 돼지를 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 백신처리된 돼지는 평균 폐 병변 스코어가 3.6%이었고, 시험감염된 대조군 돼지는 평균 폐 병변 스코어가 14.6%이었다. 백신처리 그룹의 폐 병변은 대조군보다 유의적으로 낮았다(p= 0.0215).
본 평가에서 수득된 데이타는 시험 백신 A가 1회 투여량으로 백신처리한지 6개월 후에 병독성 엠. 하이오뉴모니애 시험감염에 대한 장기간의 보호성 면역을 유도하였음을 입증한다.
실험 디자인
리터(litter)에 의해 마이크로소프트 엑셀 무작위 프로그램을 사용하여 33마리의 21일령 돼지를 3개의 그룹(백신처리 그룹, 시험감염 대조군 및 비시험감염 환경 대조군)으로 무작위로 분류하였다. 20마리의 돼지를 3주령에서 1회 투여량의 시험 백신 A로 근육내로 백신처리하였다. 10마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 3마리의 돼지는 비-시험감염 환경 대조군으로서 사용하였다. 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군의 돼지에게 백신처리후 6개월째에 돼지당 병독성 엠. 하이오뉴모니애 10ml(유기체 1.0 x 106개) 배양물을 시험감염시켰다. 3마리의 비백신처리된 돼지를 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 시험감염된 돼지 및 시험감염되지 않은 대조군을 시험감염한지 26일 후에 안락사시키고 각각의 돼지의 폐 병변의 스코어를 매겼다.
백신처리 그룹의 각 돼지에게 목의 측면에 1회 투여량(2ml)의 시험 백신을 IM으로 투여하였다.
시험감염 및 부검
병독성 엠. 하이오뉴모니애 시험감염 스톡인 동결된(≤-70℃) 폐 균질물은 이이오와 주립대(ISU)의 에일린 택커 박사가 제조하였다. 시험감염 스톡은 순수한 것으로 확인되었고 1mL당 107개의 엠. 하이오뉴모니애 유기체를 함유하였다.
돼지에게 1:100으로 희석된 스톡 10mL(즉, 유기체 약 1.0 x 106개)를 시험감염시켰다.
시험감염 당일에, 균질물을 온수하에 급속 해동시키고 멸균 엠. 하이오뉴모니애 성장 배지를 사용하여 ISU가 추천한 바에 따라 희석시켰다. 돼지를 크실라진 50mg/ml, 케타민 50mg/ml 및 텔라졸 100mg/ml로 이루어진 크실라진-케타민-텔라졸의 혼합물로 진정시켰다. 마취 혼합물을 체중 ℓb당 0.01 내지 0.02mL로 근육내(IM)로 투여하였다. 각각의 돼지에게 시험감염 물질 1회 투여량 10mL(유기체 1.0 x 106개)를 기관지내에 투여하였다. 바늘 위치가 올바르다는 것을 확인하기 위해, 시험감염 용량을 투여하기 전에 주사기에 공기를 흡입한다. 비백신처리된 비시험감염 대조군 돼지를 별도의 방에서 유지시키고 시험감염시키지 않았다.
투여 후 26일째(DPC)에 모든 돼지를 안락사시켰다. 폐를 떼어내어 실시예 3에 기재된 바와 같이 전체 폐 병변의 스코어를 매겼다.
샘플 수집 및 시험:
백신처리 당일(0 DPV), 35 DPV, -1DPC 및 26DPC에 모든 돼지로부터 혈액 샘플을 수집하고 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체를 측정하기 위해 경쟁 ELISA 키트(제조원: DAKO Co.)로 검출하였다. 혈청 샘플을 시험하기 전에 -20℃ 이하에서 저장하였다.
데이타 분석:
일원 ANOVA에 의해, 백신처리된 그룹과 대조군 그룹 사이의 폐 병변 스코어를 비교하였다. 폐 병변 스코어는 아크사인으로 전환시켜 잉여분의 분포를 개선시켰다. 폐 병변 스코어에 대한 정규성 가정이 의문시될 수 있었기 때문에 폐 병변 스코어 및 아크사인 전환된 폐 병변 스코어를 윌콕슨 순위합 검정(Wilcoxon Rank Sum test)으로 분석하였다. 유의 수준은 p < 0.05로 설정하였다. 비계수 윌콕슨 순위합 검정으로부터의 결과를 보고 목적으로 사용하였다.
결과 및 검토
혈청학: 모든 돼지는 모든 시험에 대해 1:10의 혈청 희석액을 사용하여 시판되는 경쟁 ELISA 키트에 의해 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체에 대해 시험하였다. 키트 지침마다 시험 결과가 의심스러운 샘플을 데이타 분석시 양성으로서 간주하였다. 모든 돼지는 백신처리시에 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었고, 이는 동물이 엠. 하이오뉴모니애에 대해 감수성이었음을 나타낸다. 대조군의 모든 돼지는 시험감염 전에 혈청-음성이었다. 백신처리 후, 백신처리된 20마리중 15마리(15/20)는 적어도 한번은 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청-양성이 되었다(샘플은 35DPV 및 -1DPC에서 수집하였다). 이는 백신처리된 돼지에서의 면역반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다. 모든 백신처리된 돼지 및 시험감염 대조군의 10마리 돼지 중 4마리는 시험감염 후 엠. 하이오뉴모니애에 대해 혈청-양성인 반면, 모든 비-시험감염 동물은 혈청-음성인 상태를 유지하였다. 시험 동물의 혈청 상태는 표 4에 요약되어 있다.
폐 병변 스코어
시험 백신 A로 백신처리된 20마리의 돼지 및 10마리의 비백신처리된 대조군 돼지에게 백신처리 후 6개월째에 독성 엠. 하이오뉴모니애(돼지당 유기체 1.0 x 106개)를 시험감염시켰다. 3마리의 돼지를 비-시험감염 대조군으로서 사용하였다. 20마리의 백신처리된 돼지중 8마리(40%)에서는 시험감염 후 폐 병변이 발생하지 않는 반면, 대조군 그룹에서는 10마리의 돼지당 1마리(10%)에서만 폐 병변이 발생하였다. 폐 병변율(%)은 표 5에 요약되어 있다. 백신처리된 돼지는 평균 폐 병변 스코어가 3.6%이었고, 시험감염된 대조군 돼지는 평균 폐 병변 스코어가 14.6%이었다. 백신처리 그룹의 폐 병변은 대조군보다 유의적으로 낮았다(p = 0.0215).
본 연구에서 돼지의 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 상태*
전체중 양성(1:10)의 수
그룹 처리 돼지 마리수 0 DPV** 35 DPV -1 DPC*** 26 DPC
1 백신/시험감염 20 0/20 9/20 12/20 20/20
2 대조군/시험감염 10 0/10 0/10 0/10 4/10
3 대조군/비시험감염 3 0/3 0/3 0/3 0/3
* 혈청 샘플을, 시판 키트를 사용한 ELISA에 의해 엠. 하이오뉴모니애에 대한 혈청 항체에 대해 시험하였다.
모든 샘플은 혈청 희석액 1:10에서 시험하였다. 결과는 키트 지침에 따라 해석한다.
1:10에서 의심되는 샘플은 양성으로서 고려하였다.
** DPV = 백신처리 후 경과일
***DPC = 시험감염 후 경과일
엠. 하이오뉴모니애로 시험감염한 돼지 및 시험감염되지 않은 대조군에서 폐 병변 스코어(%)의 요약
그룹 처리 돼지 수 폐 병변 스코어(%)- 평균값 표준 편차 평균 보다 낮은 95% CL* 평균 보다 높은 95% CL P값**
1 백신/시험감염 20 3.6 7.6 0.07 7.19 0.0215
2 대조군/시험감염 10 14.6 20.0 0.33 28.94
3 대조군/비시험감염 3 1.8 1.8 -2.67 6.27
* CL = 신뢰 수준
** P 값은 그룹 1과 2를 비교한 것이다.
표 4 및 5에서 제시한 데이타로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험 백신 A는 3주령에서 백신처리된 돼지에게 1회 투여량으로 투여된 후 6개월 동안 병독성 엠. 하이오뉴모니애에 대해 보호 면역을 유도한다.
실시예 5
돼지 인플루엔자 바이러스는 당해 분야에 익히 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 또한, H1N1 및 H3N2와 같은 SIV 균주도 또한 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, NVSL 아이오와주 아메스 USDA 및 다른 곳으로부터 용이하게 입수가능하다. 이들 균주는 통상적으로, 예를 들어, 필요에 따라 태아 송아지 혈청, 소 혈청 알부민, 락트알부민, 가수분해물 및 중탄산나트륨 중 하나 이상이 보충된 Opti-MemR 성장 배지를 사용하여 원위세뇨관(Madin-Darby Canine Kidney; MDCK) 세포주에서 증식시킬 수 있다. 하나의 예로서, 최적의 바이러스 성장을 촉진하기 위해 H1N1 균주 증식용 성장 배지에 적당량의 트립토스 포스페이트 브로쓰, 나트륨 부티레이트 및 트립신을 추가로 보충시킬 수 있으며, H3N2 균주 증식용 성장 배지에 적당량의 트립신을 추가로 보충시킬 수 있다. 수거시, 수거된 바이러스액을 포르말린으로 불활성화시킬 수 있다. 이러한 백신 균주를 함유하는 SIV 백신 조성물은 통상적으로 다음과 같이 제형화할 수 있다:
SIV H1N1 (≥1ml당 400 HA 단위) 20,000ml
SIV H3N2(≥1ml당 200 HA 단위) 20,000ml
카보폴 (2% 용액) 5,000ml
티메로솔 (5% 용액) 50ml
MEM 또는 평형 염 용액 4,950ml
전체 50,000ml
본 발명에 따른 SIV와의 배합 백신은 통상적으로 다음과 같이 제조할 수 있다:
미코플라스마 농축액(≥ 1×1010 MHDCE/ml) 100,000ml
SIV H1N1(≥1ml당 5120 HA 단위)≥ 1067 HA 단위/ml 75,000ml
SIV H3N2(≥1ml당 2560 HA 단위)≥ 1533 HA 단위/ml 56,000ml
스쿠알란/플루로닉 L121 혼합물 200,000ml
카보폴 (2% 용액) 100,000ml
티메로솔 (5% 용액) 7690ml
MEM 또는 평형 염 용액 611,310ml
전체 1,000,000ml
3가지의 상이한 연구를 사용하여 배합물 중의 다양한 분획의 효능을 입증하였다. 각각의 연구에서 무작위적으로 분류된 적절한 연령의 돼지는 백신처리 그룹, 시험되는 분획에 대한 시험감염 대조군 및 환경 대조군의 세 그룹으로 분류하였다.
세 연구의 결과는 다음과 같았다:
연구 요약- 엠. 하이오뉴모니애 분획
본 동물 시험은 돼지 인플루엔자 백신인 H1N1 및 H3N2, 사멸된 바이러스- 본 발명에 따른 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 엠. 하이오뉴모니애 분획의 효능 및 SIV 분획에 의한 항원 차단(antigen blockage)의 결여를 입증하기 위해 디자인하였다.
모든 돼지는 백신처리시에 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었으며, 이는 동물이 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대해 감수성이었음을 나타낸다. 대조군의 모든 돼지는 시험감염 전에 혈청-음성인 상태를 유지하였다. 이는 백신처리된 돼지에서의 면역반응이 백신에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다.
22마리의 돼지를 1주령에서 SIV 백신(백신 A)으로 백신처리하고 제1 백신처리 후 3주째에 MH/SIV 백신(백신 B)으로 재백신처리하였다. 22마리의 돼지는 엠. 하이오뉴모니애 시험감염 대조군으로서 사용하고 3마리의 돼지는 환경적 대조군으로서 사용하였다. 제2 백신처리 후 4주째에, 백신처리 그룹 및 시험감염 대조군의 돼지에게 병독성 엠. 하이오뉴모니애를 시험감염시켰다. 돼지를 시험감염한지 28일 후에 안락사시키고 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 스코어를 매겼다.
대조군의 20마리의 돼지 중 18마리(90%)는 5%를 초과하는 폐 병변 스코어를 나타낸 반면에, 백신처리 그룹에서는 21마리의 돼지 중 8마리(38%)만이 5%를 초과하는 폐 병변 스코어를 나타냈다. 백신처리 그룹은 평균 폐 병변율이 10.2%이었으며, 시험감염된 대조군 돼지는 평균 폐 병변율이 16.9%이었다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 유의차가 있었다(p=0.02). 이는 1주령에서 SIV 백신으로 백신처리되고 3주 후에 MH/SIV로 백신처리된 돼지에서 병독성 엠. 하이오뉴모니애 시험감염에 대한 보호성 면역이 전개되었음을 나타낸다. 이는 또한 MH/SIV 배합 백신에서 SIV 분획에 의한 엠. 하이오뉴모니애 분획에 대한 항원 차단 효과가 없음을 나타낸다.
연구 요약-SIV H1N1 분획
본 동물 시험은 돼지 인플루엔자 백신인 H1N1 및 H3N2, 사멸된 바이러스-본 발명의 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) H1N1 분획의 효능을 입증하기 위해 디자인하였다.
모든 돼지는 백신처리시에 SIV H1N1에 대해 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었다. 모든 대조군이 시험감염 전에 혈청-음성인 상태를 유지한 반면 모든 백신처리된 돼지는 SIV H1N1에 대해 혈청-전환되었다. 이는 시험감염으로 입증되는 바와 같이 백신처리된 돼지에서의 보호성 면역반응이 백신처리에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다.
25마리의 돼지를 1주령에서 SIV 백신(백신 A)으로 백신처리하고 제1 백신처리한지 2주 후에 SIV-MHP 백신(백신 B)로 재백신처리하였다. 24마리의 돼지는 시험감염 대조군으로서 사용하고 5마리의 돼지는 환경적 대조군으로서 사용하였다. 돼지를 제2 백신처리 후 3주째에 시험감염시켰다. 돼지를 임상 징후에 대해 관찰하고 직장온도를 시험감염 2일전에 시작하여 시험감염 후(DPC) 5일째까지 매일 기록하였다. 5 DPC에 돼지를 안락사시키고 각각의 돼지에 대한 폐 병변의 스코어를 매겼다. 바이러스 분리를 0 DPC, 3 DPC 및 5DPC에서 수집한 비강 면봉 및 부검시에 수집한 폐 조직 샘플로 시도하였다.
시험감염 전(0 DPC)에 돼지로부터 수집한 비강 면봉으로부터는 바이러스가 분리되지 않았다. 시험감염 후(3 DPC 및 5 DPC)에 수집한 비강 면봉으로부터 25마리의 백신처리된 돼지 중 1마리에서 바이러스가 분리된 것에 비해서 대조군에서는 24마리의 돼지 중 10마리에서 바이러스가 분리되었다. 시험감염 후 비강 바이러스 방출(virus shedding)에 있어 백신처리 그룹과 대조군 사이에 유의차가 있었다(p=0.0011). 바이러스는 24마리의 대조군 돼지 중 14마리 및 25마리의 백신처리된 돼지 중 1마리로부터 부검시 수집한 폐 조직 샘플로부터도 분리되었다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 유의차가 있었다(p<0.0001). 종합하면, 바이러스는 시험감염 후 24마리의 대조군 중 19마리(79%) 및 25마리의 백신처리된 돼지 중 단지 2마리(8%)로부터 분리되었다. 또한, SIV H1N1 시험감염은 발열 반응을 유도하였다. 전반적 발열 반응이 백신처리 그룹과 대조군 사이에 유의적이지 않은 반면(p=0.07), 대조군은 2 DPC에서 온도 평가가 백신처리 그룹에 비해서 유의적으로 높았다(p=0.0355). 시험감염에 의해 유도된 임상 징후는 매우 경미했으며 각 징후의 발생률은 시험감염 평가 동안 이러한 데이터를 사용하기에 부적절할 정도로 낮았다. 백신처리 그룹은 평균 폐 병변 스코어가 6.9%이었으며 시험감염된 대조군은 평균 폐 병변 스코어가 9.2%이었다.
요약하면, 비강의 바이러스 방출의 발생 및 빈도와 폐 조직으로부터의 바이러스 분리의 우세함은 대조군에 비해서 백신처리 그룹에서 유의적으로 낮았다. 백신처리된 돼지는 또한 시험감염 후에 보다 덜한 발열 반응을 경험하였고 대조군 돼지에 비해서 폐 병변이 덜하였다. 이는 백신처리된 돼지가 SIV H1N1 시험감염으로부터 보호되었음을 나타낸다.
연구 요약-SIV H3N2 분획
본 동물 시험은 돼지 인플루엔자 백신인 H1N1 및 H3N2, 사멸된 바이러스-본 발명에 따른 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) H3N2 분획의 효능을 입증하기 위해 디자인하였다.
모든 돼지는 제1 백신처리 당일(0 DPV1)에 혈청-음성(항체 역가 < 10)이었거나 SIV H3N2에 대한 모체이행 항체가 낮았다. 상기 돼지의 낮은 모체이행 항체 역가는 시험감염시까지 혈청-음성으로 감소되었다. 대조군의 모든 돼지는 시험감염 전에 혈청-음성인 상태를 유지하였다. 이는 시험감염으로 입증되는 바와 같이 백신처리 돼지에서의 보호성 면역반응이 백신처리에 의한 것이지 어떠한 환경적 노출에 의한 것이 아님을 나타낸다.
22마리의 돼지는 1주령에서 SIV 백신(백신 A)으로 백신처리하고 제1 백신처리한지 3주 후에 SIV-MHP 백신(백신 B)으로 재백신처리하였다. 18마리의 돼지를 시험감염 대조군으로서 사용하고 5마리의 돼지를 환경적 대조군으로서 사용하였다. 돼지를 임상 징후에 대해 관찰하고 직장온도를 시험감염 3일 전 및 시험감염 후(DPC) 5일째에 기록하였다. 5 DPC에서 돼지를 안락사시키고 각 돼지에 대한 폐 병변의 스코어를 매겼다. 바이러스 분리를 0 DPC, 3 DPC 및 5DPC에서 수집한 비강 면봉 및폐 조직 샘플로 시도하였다.
SIV H3N2 병독성 시험감염물은 대조군 돼지에서 발열 반응을 유도하였다. 대조군 중 78%에서 발열이 일어난 반면에, 백신처리된 돼지 중 18%에서만 발열이 일어났다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 발열 반응의 유의차가 있었다(p=0.0002). 시험감염으로 유도된 임상 징후는 경미하였으며 각 임상 징후의 발병률은 낮았다. 시험감염된 대조군의 6마리의 돼지(33%)가 1일 내지 2일 동안 기침을 한 반면, 백신처리 그룹에서는 2마리의 돼지(9.1%)만이 기침을 하였다. 유사하게, 백신처리 그룹과 대조군 사이에 기타 임상 징후의 유의차는 없었다. 대조군의 18마리의 돼지 중 15마리가 5%를 초과하는 폐 병변 스코어를 나타낸 반면, 백신처리 그룹에서는 22마리의 돼지 중 5마리(23%)만이 5%를 초과하는 폐 병변 스코어를 나타냈다. 백신처리 그룹은 평균 폐 병변 스코어가 4.9%이었으며 시험감염된 대조군은 평균 폐 병변 스코어가 23.2%이었다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 페 병변 스코어의 유의차는 없었다(p=0.0003). 시험감염 전(0 DPC)에 돼지로부터 수집한 비강 면봉으로부터 바이러스가 분리되지 않았다. 3 DPC에서 수집한 비강 면봉으로부터 22마리의 백신처리 돼지 중 5마리에서 바이러스가 분리된 것에 비해서 대조군에서는 18마리의 돼지 중 12마리(67%)에서 바이러스가 분리되었다. 대조군의 18마리 중 3마리에서는 5 DPC에 수집한 비강 면봉으로부터 바이러스가 분리되었으나, 어떠한 백신처리된 돼지로부터도 바이러스가 분리되지 않았다. 바이러스는 대조군의 18마리 중 5마리에서 부검(5 DPC)으로부터 수집한 폐 조직 샘플로부터도 수집되었으나, 어떠한 백신처리된 돼지로부터도 바이러스가 분리되지 않았다. 백신처리 그룹과 대조군 사이에 시험감염 후의 비강 면봉으로부터의 바이러스 분리(각 일에 대해 p=0.0035, 3 DPC 및 5 DPC에서 바이러스 방출에 대해 p=0.0008) 및 폐 조직으로부터의 바이러스 분리(p=0.013)에 있어 유의차가 있었다.
요약하면, 백신처리된 돼지는 시험감염 후 유의적으로 낮은 발열 반응을 보였고, 또한 대조군 돼지에 비해서 폐 병변 스코어가 낮았다. 백신처리 그룹 및 대조군 사이에 비강의 바이러스 방출 및 폐 조직 샘플로부터의 바이러스 회수율에 있어 유의차가 있었다. 이는 1주령에서 SIV 백신으로 백신처리되고 3주 후에 SIV-MHP 백신으로 추가접종(boost)된 돼지에서 병독성 SIV H3N2 시험감에 대한 보호성 면역이 전개되었음을 나타낸다.

Claims (22)

  1. 미코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 박테린의 면역화량;
    돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 항원의 면역화량;
    아크릴산 중합체, 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물 및
    약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고,
    1회 투여 후에 미코플라스마 하이오뉴모니애에 대한 보호성 면역을 유도하는,
    미코플라스마 하이오뉴모니애 및 바이러스 병원체에 의한 감염에 대해 돼지를 면역화시키기 위한 백신 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 보조제 혼합물이 아크릴산 중합체, 및 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물로 이루어지고, 희석되지 않은 아크릴산 중합체 대 희석되지 않은 대사가능한 오일/폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 혼합물의 용적비가 1:25 내지 1:50인 백신 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 1 내지 25% v/v를 차지하는 백신 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 아크릴산 중합체가 1% v/v의 최종 농도로 존재하고 테르펜 탄화수소/폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 혼합물이 5 내지 10% v/v의 최종 농도로 존재하는 백신 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 2 내지 15% v/v를 차지하는 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 보조제 혼합물이 백신 조성물의 5 내지 12% v/v를 차지하는 백신 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 대사가능한 오일이 스쿠알란 또는 스쿠알렌인 백신 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 아크릴산 중합체가 카보머인 백신 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량;
    돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 항원의 면역화량;
    아크릴산 중합체, 및 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물을 포함하는 보조제 혼합물 및
    약제학적으로 허용되는 담체를 포함하고,
    1회 투여 후에 미코플라스마 하이오뉴모니애 감염으로부터 보호성 면역을 유도하는 백신 조성물을 돼지에게 투여하는 단계를 포함하여,
    미코플라스마 하이오뉴모니애 및 바이러스 항원에 의해 유발되는 질환으로부터 돼지를 보호하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량이 1×108 내지 3×1011 MHDCE (Mycoplasma Hyopneumoniae DNA cell equivalent: 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물)/mL인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량이 1×109 내지 3×109 MHDCE (Mycoplasma Hyopneumoniae DNA cell equivalent: 미코플라스마 하이오뉴모니애 DNA 세포 등가물)/mL인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 투여 단계의 투여 방식이 근육내, 피하, 복강내, 에어로졸, 경구 또는 비내 투여인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 보조제 혼합물이 아크릴산 중합체, 및 하나 이상의 테르펜 탄화수소를 포함하는 대사가능한 오일과 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 혼합물로 이루어지고, 1 내지 25% v/v의 최종 농도로 존재하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 보조제 혼합물의 아크릴산 중합체가 카보머인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 보조제 혼합물의 대사가능한 오일이 스쿠알렌 및 스쿠알란으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 테르펜 탄화수소인 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 미코플라스마 하이오뉴모니애 박테린의 면역화량;
    돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 항원의 면역화량 및
    아크릴산 중합체, 대사가능한 오일 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체를 포함하는 수중유 에멀젼 형태인 보조제 시스템을 포함하고,
    1회 투여 후에 미코플라스마 하이오뉴모니애로부터의 보호성 면역을 유도하는,
    미코플라스마 하이오뉴모니애 및 바이러스 병원체에 의한 감염에 대해 돼지를 면역화시키기 위한 백신 조성물.
KR1020047018602A 2002-05-17 2003-05-14 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한개선된 배합 백신 KR101056622B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/150,597 US7018638B2 (en) 2000-12-19 2002-05-17 Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US10/150,597 2002-05-17
PCT/US2003/015115 WO2004058142A2 (en) 2002-05-17 2003-05-14 Improved combine vaccine against mycoplasma hyopneumoniae and porcine viruses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050007402A KR20050007402A (ko) 2005-01-17
KR101056622B1 true KR101056622B1 (ko) 2011-08-16

Family

ID=32680190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047018602A KR101056622B1 (ko) 2002-05-17 2003-05-14 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한개선된 배합 백신

Country Status (20)

Country Link
US (4) US7018638B2 (ko)
EP (2) EP1506006B1 (ko)
JP (2) JP2006515304A (ko)
KR (1) KR101056622B1 (ko)
CN (1) CN1305524C (ko)
AR (1) AR039545A1 (ko)
AU (1) AU2003303129B2 (ko)
BR (1) BR0310082A (ko)
CL (1) CL2010000397A1 (ko)
DK (1) DK1870109T3 (ko)
ES (2) ES2431988T3 (ko)
HK (1) HK1111103A1 (ko)
HR (1) HRP20041068B1 (ko)
ME (1) ME00569B (ko)
MX (1) MXPA04011218A (ko)
NZ (1) NZ537014A (ko)
RS (1) RS54390B1 (ko)
TW (1) TWI320715B (ko)
WO (1) WO2004058142A2 (ko)
ZA (1) ZA200410153B (ko)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39494E1 (en) * 1992-02-27 2007-02-27 Intervet Inc. Inactivated mycoplasma hyopneumoniae and uses therefor
CA2187535C (en) * 1994-04-11 2011-09-13 Jon B. Korshus Borrelia burgdorferi bacterin
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
JP3961222B2 (ja) * 1999-03-08 2007-08-22 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲーエムベーハー Ｐｒｒｓｖワクチン
DK1183332T3 (da) * 1999-04-22 2010-09-06 Us Agriculture Porcint Reproduktions- og Respirations Syndrom-vaccine baseret på isolere JA-142
MY128159A (en) * 2000-06-30 2007-01-31 Wyeth Corp Methods and composition for oral vaccination
MY129765A (en) * 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
US7264810B2 (en) * 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
TWI238721B (en) * 2003-06-20 2005-09-01 Animal Technology Inst Taiwan Swine enzootic vaccine, its producing method and usage
KR20070028547A (ko) * 2004-06-18 2007-03-12 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
UA95602C2 (ru) 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US8834891B2 (en) 2005-03-14 2014-09-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions comprising Lawsonia intracellularis
US20060251827A1 (en) * 2005-05-09 2006-11-09 Applied Materials, Inc. Tandem uv chamber for curing dielectric materials
CA2611820C (en) 2005-06-24 2015-10-06 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
WO2007052061A2 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Emulsions with free aqueous-phase surfactant as adjuvants for split influenza vaccines
DK2368572T3 (da) 2005-11-04 2020-05-25 Seqirus Uk Ltd Adjuvansvacciner med ikke-virionantigener fremstillet fra influenza-virusser dyrket i cellekultur
PT2371383E (pt) * 2005-12-29 2015-11-24 Boehringer Ingelheim Vetmed Utilização de uma composição imunogénica de pcv2 para atenuar os sintomas clínicos em porcos
EP3868400A1 (en) 2005-12-29 2021-08-25 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
BRPI0710550A2 (pt) * 2006-04-10 2011-08-16 Intervet Int Bv uso de uma dose imunogênica de material imunogênico de mycoplasma hyopneumoniae e uma dose imunogênica de vìrus de prrs atenuado vivo, kit de vacina, e, método para a vacinação de porcos
EP2101815A4 (en) * 2006-12-11 2010-10-06 Boehringer Ingelheim Vetmed EFFICIENT PROCESS FOR THE TREATMENT OF PORCINE CIRCOVIRUS AND LAWSONIA INTRACELLULARIS INFECTIONS
US8865183B2 (en) * 2006-12-15 2014-10-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Treatment of pigs with PCV2 antigent
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
CL2008001806A1 (es) * 2007-06-20 2008-09-05 Wyeth Corp Composicion de vacuna en emulsion agua en aceite que comprende un antigeno y un adyuvante en la fase acuosa; y metodo de elaboracion.
US20090017064A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Wyeth Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus
US7829274B2 (en) * 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
RU2489164C9 (ru) * 2007-11-06 2014-01-20 ВАЙЕТ ЭлЭлСи АВИРУЛЕНТНАЯ АДЪЮВАНТНАЯ ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ Mycoplasma hyopneumoniae
AU2012261741B2 (en) * 2007-11-06 2016-02-25 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae avirulent-adjuvanted live vaccine
BRPI0821456A2 (pt) * 2007-12-31 2015-06-16 Boehring Ingelheim Vetmedica Inc Partícula similar à pcv2 orf2 com inserção de aminoácido estranho
EP2242511A4 (en) 2008-01-23 2012-10-24 Boehringer Ingelheim Vetmed IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE PCV2, AND METHODS FOR PRODUCING SUCH COMPOSITIONS
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
US8444989B1 (en) * 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
CN101363865B (zh) * 2008-05-26 2013-03-06 北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司 一种猪蓝耳病毒胶体金检测试纸条、其制备方法及其应用
BRPI0914300B8 (pt) * 2008-06-25 2021-05-25 Braasch Biotech Llc vacina para tratamento de obesidade
US20100003278A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof
CN102316895A (zh) * 2008-08-25 2012-01-11 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 抗高致病性猪生殖与呼吸综合征(hp prrs)的疫苗
PL2396032T3 (pl) 2009-02-10 2017-05-31 Seqirus UK Limited Szczepionki przeciw grypie o obniżonych zawartościach skwalenu
AR078253A1 (es) 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
CA2793959C (en) 2010-03-25 2019-06-04 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
US8546149B2 (en) 2010-08-27 2013-10-01 Intervet Inc. Potency test for vaccine formulations
BR112013004594B1 (pt) * 2010-08-27 2020-07-28 Intervet International B. V. método para a determinação de um conteúdo de antígeno
CN101954079B (zh) * 2010-09-21 2012-11-28 江苏省农业科学院 猪支原体肺炎活疫苗的疫苗佐剂及其制备方法和应用
SG192821A1 (en) 2011-02-17 2013-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Commercial scale process for production of prrsv
WO2012110489A2 (en) 2011-02-17 2012-08-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel european prrsv strain
CA2832109C (en) 2011-06-10 2021-07-06 Oregon Health & Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
US9315781B2 (en) 2011-07-29 2016-04-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
CN103157100B (zh) * 2011-12-08 2014-09-24 普莱柯生物工程股份有限公司 副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病二联灭活疫苗及其制备方法
US9474692B2 (en) 2012-01-13 2016-10-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Kit for the preparation of a vaccinating agent
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
CN104968365B (zh) 2012-12-28 2018-04-03 勃林格殷格翰动物保健有限公司 支原体疫苗的制备方法
KR102355614B1 (ko) 2012-12-28 2022-01-27 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 마이코플라스마 항원을 포함하는 면역원성 조성물
CN103908665B (zh) * 2013-01-05 2016-05-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN103071151B (zh) * 2013-01-17 2014-07-23 江苏省农业科学院 猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法
CN103961695B (zh) * 2013-02-06 2016-09-07 普莱柯生物工程股份有限公司 一种预防和治疗猪呼吸道综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用
US9579373B2 (en) 2013-03-15 2017-02-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
CN104096222B (zh) * 2013-04-08 2016-09-14 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
DK2994162T3 (en) 2013-05-08 2021-06-21 Pharmgate Biologics Inc Vaccine for pcv2 og mycoplasma
KR102319843B1 (ko) 2013-09-25 2021-10-29 조에티스 서비시즈 엘엘씨 Pcv2b 분지형 백신 조성물 및 사용 방법
KR20220083861A (ko) 2013-10-02 2022-06-20 베링거 인겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인크. Ｐｃｖ2 ｏｒｆ2 단백질 변이체 및 이로 이루어진 바이러스 유사 입자
CN104248759B (zh) * 2013-11-19 2017-05-10 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104857508B (zh) * 2014-02-21 2018-03-16 普莱柯生物工程股份有限公司 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
US10064930B2 (en) * 2015-01-16 2018-09-04 Boehringer-Ingelheim Vermedica, Inc. Immunogenic compositions and methods for pigeon fever
IL283300B2 (en) * 2015-11-13 2024-04-01 Applied Lifesciences And Systems Llc Automatic system for injecting a substance into an animal
CN112618710B (zh) * 2019-09-24 2023-09-29 华南理工大学 一种植物糖原猪口服接种疫苗纳米佐剂及其制备方法与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016330A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Merial Prevention of affections associated with porcine circovirus-2

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3790665A (en) * 1968-02-23 1974-02-05 Haver Lockhart Labor Inc Injectable adjuvant,method of preparing same and compositions including such adjuvant
US4606918A (en) * 1983-08-22 1986-08-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
CA1267087A (en) * 1985-02-14 1990-03-27 Nicolaas Visser Synthetic immunogen
EP0283085B1 (en) 1987-03-17 1992-11-11 Akzo N.V. Adjuvant mixture
AU626271B2 (en) 1987-11-03 1992-07-30 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
ZA906806B (en) * 1989-08-31 1991-06-26 Ici Australia Operations Plants
CA2082155C (en) * 1990-05-29 2008-04-15 Krishnaswamy I. Dayalu Swine pneumonia vaccine and method of preparation
US5565205A (en) * 1990-08-16 1996-10-15 Solvay Animal Health, Inc. Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof
US5338543A (en) * 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
ZA953703B (en) * 1994-05-10 1996-01-10 American Home Prod Modified live BRSV vaccine
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6632439B2 (en) * 1999-09-29 2003-10-14 Novartis Animal Health, Inc. Fusobacterium necrophorum vaccine and method for making such vaccine
US6585981B1 (en) * 2000-07-27 2003-07-01 Regents Of The University Of Minnesota Temperature-sensitive live vaccine for Mycoplasma hyopneumoniae
MY129765A (en) * 2000-12-19 2007-04-30 Wyeth Corp Improved mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001016330A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Merial Prevention of affections associated with porcine circovirus-2

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004058142A2 (en) 2004-07-15
HK1111103A1 (zh) 2008-08-01
KR20050007402A (ko) 2005-01-17
US7622124B2 (en) 2009-11-24
US20060228373A1 (en) 2006-10-12
RS99704A (en) 2006-12-15
US20070134269A1 (en) 2007-06-14
TW200306854A (en) 2003-12-01
US20030017171A1 (en) 2003-01-23
BR0310082A (pt) 2007-04-10
AU2003303129B2 (en) 2009-10-08
ZA200410153B (en) 2014-07-30
ME00569A (en) 2011-12-20
EP1870109A1 (en) 2007-12-26
JP2006515304A (ja) 2006-05-25
CN1305524C (zh) 2007-03-21
HRP20041068A2 (en) 2004-12-31
AU2003303129A1 (en) 2004-07-22
TWI320715B (en) 2010-02-21
AR039545A1 (es) 2005-02-23
US7018638B2 (en) 2006-03-28
US7169394B2 (en) 2007-01-30
WO2004058142A3 (en) 2004-11-04
EP1506006B1 (en) 2013-07-31
EP1870109B1 (en) 2016-03-16
JP5700861B2 (ja) 2015-04-15
CN1652817A (zh) 2005-08-10
ES2569063T3 (es) 2016-05-06
MXPA04011218A (es) 2005-02-14
EP1506006A2 (en) 2005-02-16
US20100062018A1 (en) 2010-03-11
JP2013189438A (ja) 2013-09-26
NZ537014A (en) 2009-09-25
CL2010000397A1 (es) 2010-10-15
US7959927B2 (en) 2011-06-14
RS54390B1 (sr) 2016-04-28
DK1870109T3 (en) 2016-04-25
HRP20041068B1 (hr) 2018-10-05
ME00569B (me) 2011-12-20
ES2431988T3 (es) 2013-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101056622B1 (ko) 미코플라스마 하이오뉴모니애 및 돼지 바이러스에 대한개선된 배합 백신
KR100874119B1 (ko) 개선된 마이코플라스마 하이오뉴모니애 박테린 백신
US20060251674A1 (en) Formulations and process for production of Bordetella bronchiseptica P68 antigen and vaccines
JP2008546637A (ja) ルデテラ・ブロンキセプチカｐ６８抗原及びワクチン製造のための製剤及び製法プロセス

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140730

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160629

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170629

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180628

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190624

Year of fee payment: 9