CN104857508B

CN104857508B - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN104857508B
Application number: CN201410059935.7A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 田克恭
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2018-03-16
Anticipated expiration: 2034-02-21
Also published as: CN104857508A

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，其中，该疫苗组合物包括：免疫量的猪肺炎支原体抗原，免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及药学上可接受的载体。本发明疫苗组合物可以同时消除对多种疫苗和多剂量免疫的需求，两种抗原无免疫干扰，协同作用增强，该疫苗组合物免疫后可以消除母源抗体干扰，效果更稳定，另外该疫苗组合物单剂量免疫对动物应激和副反应小，这样既简化了免疫程序，又降低生产成本、运输成本以及预防成本，实用性强。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物，以及该组合物的制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种慢性、接触性传染病,是一种重要的免疫抑制性疾病,也是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)的重要病原之一。该病长期危害养猪业，并广泛分布于世界各国。该病主要危害育肥猪，尤其是14～20周龄的猪生长率降低，使其饲料转化率降低，还可出现食欲减退、发热、咳嗽、呼吸困难等症状。

副猪嗜血杆菌病是副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)引起的猪的多发性浆膜炎和关节炎,该病又称为猪革拉泽氏病(Glasser’s Disease)。副猪嗜血杆菌主要危害4到8周龄的断奶仔猪，也可感染10日龄左右仔猪和4月龄的生长育成猪。主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等。此外副猪嗜血杆菌还可引起败血症，并且在急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产、公猪慢性跛行。根据我国血清流行病学调查和分离菌株的鉴定，以4、5型最为流行。近年来，由于我国目前饲养技术的调整进行不当，以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。

单独试验当猪感染猪肺炎支原体后，仅出现咳嗽等症状的温和型慢性肺炎，对生产性能影响较轻微，容易被养殖者忽视；而当与副猪嗜血杆菌等病菌混合感染时，可以引起猪呼吸道综合征和地方性肺炎，使呼吸道疾病加重。

目前针对这两种病原的混合感染的疫苗仅有猪肺炎支原体单苗和副猪嗜血杆菌单苗。猪肺炎支原体单苗通常是在仔猪早期进行免疫，7日龄首免，2～3周后二免。对于副猪嗜血杆菌病防治，则使用副猪嗜血杆菌灭活疫苗分别在7日龄和21日龄免疫2次。尽管如此，由于猪场仔猪普遍存在母源抗体的影响，造成单苗免疫效果不尽理想，常常造成免疫失败的情况出现。

不仅如此，要预防Mhp和Hps混合感染，单苗至少需要免疫四针才能预防疾病，成本较高，操作程序繁琐，使感染的风险加大，引起猪群的应激反应加大，不同疫苗使用会造成免疫干扰导致部分猪群免疫失败等问题。

目前的技术无法实现一种疫苗免疫一针即可抵抗这两种病原引起的混合感染，不仅如此，联合疫苗不仅方便、多效、低成本，与单一疫苗相比，还可以减少疫苗接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、存贮、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下，而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种疫苗，含有猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌两种抗原，免疫一针即可有效预防和控制由这两种病原混合感染时造成的猪呼吸道综合征或地方性肺炎。

本发明的主要目的是提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括：免疫量的猪肺炎支原体抗原，免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及药学上可接受的载体。

本发明中的疫苗组合物在对约3～10日龄的猪单剂有效量免疫时，不仅两种抗原之间无免疫干扰，而且可以抵抗母源抗体的干扰，有效的治疗和预防两种病原导致的症状。

本发明所述的猪肺炎支原体抗原是指，包含至少一种在对猪给药后能诱导、刺激或增强抗猪肺炎支原体感染的免疫应答的抗原的任何组合物。该组合物可以包含猪肺炎支原体全细胞菌苗和一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质或者所述多肽或蛋白质的免疫原性片段，或编码所述多肽、蛋白质或免疫原性片段的一个或多个猪肺炎支原体基因，所述基因或核酸能在体内进行表达。猪肺炎支原体疫苗中提供的猪肺炎支原体多肽、蛋白质及其免疫原性片段和基因或核酸可以用本领域公知技术来合成或重组制备。

本发明所述的副猪嗜血杆菌抗原是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。副猪嗜血杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌，优选为灭活形式，更优选，所述副猪嗜血杆菌抗原是灭活的血清型为4型和5型的混合抗原；最优选为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株。

优选地，所述的猪肺炎支原体抗原包括灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体全支原体抗原，猪肺炎支原体亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原；以及所述的副猪嗜血杆菌抗原包括灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的副猪嗜血杆菌全菌抗原，副猪嗜血杆菌亚单位抗原、合成肽抗原或基因工程抗原。

优选地，所述猪肺炎支原体抗原是猪肺炎支原体全细胞菌苗，优选灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪肺炎支原体细菌，含有至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少猪肺炎支原体的免疫原性氨基酸序列的多肽或成分。优选地猪肺炎支原体抗原是灭活形式的J株或HN0613株全细胞菌体。最优选地，猪肺炎支原体抗原是灭活形式的HN0613株全细胞菌体。

所述的猪支原体肺炎抗原还可以包含以下疫苗组合物中的任一种抗原如勃林格殷格翰公司的M.hyo；哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne；美国先灵葆雅的Myco西班牙海博莱生物大药厂的J株（喜可舒）；美国普泰克公司的MycoGard;美国辉瑞公司的RespiFend MH；梅里亚动物保健公司的猪克喘；南京天邦生物科技有限公司的168株活疫苗。

所述的副猪嗜血杆菌抗原可以包含以下组合物的抗原，如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1；海博莱公司(Hipra）的Hiprasuis-Glasser；武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗（4型MD0322株+5型SH0165株）。

更优选地，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株全支原体抗原、所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株和血清5型ZJ株全菌抗原。

所述猪肺炎支原体HN0613株（Mycoplasma hyopneumoniae Strain HN0613），已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230，保藏地址：中国武汉·武汉大学。

所述的副猪嗜血杆菌血清4型JS株（Haemophilus Parasuis Serotype4StrainJS）保藏号为CCTCC No.M2011172；所述的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株（HaemophilusParasuis Serotype5Strain ZJ）保藏号为CCTCC No.M2011173，均已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期：2011年5月18日，保藏地址：中国武汉·武汉大学。

优选地，所述的猪肺炎支原体抗原含量为≥6×10⁸CCU/头份，所述的副猪嗜血杆菌抗原含量为5×10⁸～4×10⁹CFU/头份。

更优选地，所述的猪肺炎支原体抗原含量为7×10⁸CCU/头份，所述的副猪嗜血杆菌抗原含量为2×10⁹CFU/头份。

优选地，所述的药学上可接受的载体包括佐剂、防腐剂、溶剂、分散介质、稳定剂、等渗剂、稀释剂；其中，所述的佐剂包括ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种的组合。

其中，免疫佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、Gel01（法国SEPPIC）、蜂胶、ISA206（法国SEPPIC）、ISA760VG（法国SEPPIC），优选的矿物油、卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、Gel01（法国SEPPIC），更优选为Gel01（法国SEPPIC）。

优选地，所述疫苗组合物包括：所述的猪肺炎支原体抗原为7×10⁸CCU/头份灭活的猪肺炎支原体HN0613株全支原体抗原，所述的副猪嗜血杆菌抗原为2×10⁹CFU/头份灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株全菌抗原和2×10⁹CFU/头份灭活的血清5型ZJ株全菌抗原，以及体积百分比为10%Gel佐剂。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：（1）扩增培养所述猪肺炎支原体；（2）扩增培养所述副猪嗜血杆菌；（3）分别灭活所述步骤（1）和（2）中扩增培养的猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌；以及（4）按比例加入所述灭活的猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原，并加入佐剂，混匀。

本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备治疗和预防猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感染的药物中的应用。

优选地，所述应用包括对3～10日龄猪仔施以单次免疫注射权利要求1～8所述的疫苗组合物。

本发明所述的疫苗组合物可以同时消除对多种疫苗和多剂量免疫的需求，两种抗原无免疫干扰，该疫苗组合物免疫后可以消除母源抗体干扰，效果更稳定，该疫苗组合物单剂量免疫对动物应激和副反应小，这样既简化了免疫程序，又降低生产成本、运输成本以及预防成本，实用性强。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中分别猪肺炎支原体HN0613株、副猪嗜血杆菌血清4型JS株和血清5型ZJ株为例说明本发明。

本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0%时，记为0分，1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，大于75%为4分。

实施例1、猪支原体肺炎和副猪嗜血杆菌二联灭活疫苗制备

1、猪肺炎支原体抗原制备

冻干菌种启封后，按10%接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为一级生产种子。取一级种子按5%接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为二级生产种子。将猪肺炎支原体HN0613株的二级种子分别按5%（v/v）接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获。

2、副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的制备

将副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株划线接种于含5%新生牛血清和0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，美国BBI公司）的胰蛋白大豆琼脂（TSA，购自美国BD公司）平板（简称TSA/NAD平板），37℃培养24～48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子挑取单个菌落，接入含5%新生牛血清和0.005%烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，美国BBI公司）的胰蛋白大豆肉汤（TSA，购自美国BD公司）（简称TSB/NAD液体培养基），37℃摇床180rpm振荡培养12小时，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子。将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与副猪嗜血杆菌5型ZJ株的二级种子分别按1:100（v/v）接种于TSB/NAD液体培养基，置37℃摇床200rpm培养。培养至12～16小时，收获。

3、菌液处理与浓缩

副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的处理：将步骤2的两种菌液（副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株）分别以连续离心机（10000转/分钟）离心后再以PBS（pH值为7.2～7.4）复溶至离心前的体积。

猪肺炎支原体菌液的处理：将步骤1的猪肺炎支原体HN0613株抗原液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda）作10倍(体积比）浓缩。

4、灭活前抗原含量测定

4.1副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株菌液的活菌数测定

菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10^-6、10^-72个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种0.1ml，37℃培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数。

4.2猪肺炎支原体的菌液活菌计数测定

将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待检培养物接种至第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13管为对照管，置37℃摇振培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值。

表1灭活前各抗原含量

抗原	灭活前含量
		猪肺炎支原体HN0613株	1×10¹⁰CCU/ml
副猪嗜血杆菌4型JS株	1×10¹¹CFU/ml
		副猪嗜血杆菌5型ZJ株	1×10¹¹CFU/ml

5、菌液的灭活

5.1猪肺炎支原体菌液的灭活：将步骤3的猪肺炎支原体菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％（V/V），37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。

5.2副猪嗜血杆菌（4型JS株与5型ZJ株）菌液的灭活：将步骤3中二种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％（V/V），37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。

6、相关二联灭活苗的配制

6.1防腐剂的配制：1%(w/v)的硫柳汞水溶液。

6.2稀释剂的配制：无菌的PBS缓冲液，pH为7.2。

6.3二联灭活苗配制：

表2疫苗1配方及含量（每头份以2ml疫苗计）

疫苗2具体制备过程：向无菌烧杯中依次加入Mhp支原体HN0613株抗原3.5ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各1ml，然后加入pH为7.2的PBS液84.5ml，最后加入10ml Gel佐剂进行乳化，乳化时以500转/分钟，乳化10分钟即得疫苗1100ml。

表3疫苗2配方及含量（每头份以2ml疫苗计）

疫苗2具体制备过程：向无菌烧杯中依次加入Mhp支原体HN0613株抗原2ml，副猪嗜血杆菌抗原JS株和ZJ株抗原各1ml，然后加入pH为7.2的PBS液86ml，最后加入10ml Gel佐剂进行乳化，乳化时以500转/分钟，乳化10分钟即得100ml疫苗2。

7、安全检验

用3～10日龄Mhp抗体和Hps抗体均为阴性仔猪，颈部注射二联疫苗进行安全检验。各颈部肌肉注射二联灭活疫苗2ml，观察14日，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。结果表明各疫苗均合格，注射部位、全身、脏器均未见异常。

实施例2、本研究是为了评价试制的Mhp-Hps二联灭活疫苗在抵抗Mhp和Hps攻击的保护作用

1.试验材料

按照实施例1中的方法制备疫苗1（Mhp抗原含量为7×10⁸CCU/头份，Hps4型JS株抗原含量为2×10⁹CFU/头份，Hps5型ZJ株抗原含量为2×10⁹CFU/头份）和疫苗2（Mhp抗原含量为4×10⁸CCU/头份，Hps4型JS株抗原含量为2×10⁹CFU/头份，Hps5型ZJ株抗原含量为2×10⁹CFU/头份）。

2.动物试验设计

2.1疫苗免疫

选用0～3日龄健康易感仔猪110头，具体实施方案见表3，其中疫苗接种途径均为颈部肌肉注射。

表4Mhp-Hps二联苗免疫分组

2.2猪肺炎支原体攻毒：按照表4试验方案，分别在免疫后两个时间点进行攻毒，第一次攻毒在首免后70d，第二次攻毒在首免后180d，用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株）气管注射5ml/头（100MID），攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。

2.3副猪嗜血杆菌4、5型攻毒：按照表4试验方案，分别在两个时间点进行攻毒，第一次攻毒在首免后28d，第二次攻毒在首免后180d，分别用4型和5型副猪嗜血杆菌病毒进行攻毒，腹腔注射3ml，攻毒剂量为4型9.0×10⁹CFU/头、5型6.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。

本实施例中的20头空白对照组猪，作为既不免疫也不攻毒对照，分别在首免后42d，100d，194d和210d各杀5头。

3攻毒保护结果

3.1Mhp攻毒保护结果

表5猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著（P＜0.05）

表6猪肺炎支原体攻毒保护情况

由表5、表6结果可以看出，两个时间点攻毒，在攻毒对照组5/5发病的条件下，免疫组攻毒保护至少达4/5。在同一个时间点攻毒免疫猪平均肺病变指数和平均日增重与攻毒对照组仔猪比较，组间存在显著差异，疫苗组仔猪平均肺病变指数显著低于攻毒对照组，平均日增重显著的高于攻毒对照组。疫苗1和疫苗2结果对比发现，在首免后70d攻毒，疫苗1的平均肺病变指数较疫苗2低，但差异不显著，攻毒保护均能达到5/5保护，而在首免后180d攻毒，疫苗1仍能5/5保护，而疫苗2保护率为4/5,两者之间平均肺病变指数差异不显著。

由此结果表明本发明所述的二联疫苗1单剂量免疫对猪肺炎支原体攻毒保护效果与常规试制二联疫苗2重复免疫攻毒保护效果相当，甚至疫苗1较优于二联疫苗2；且这种保护效果可以持续至免疫后六个月。

3.2Hps攻毒保护结果

表7副猪嗜血杆菌攻毒保护情况

由表6结果可以看出，两个时间点攻毒，在攻毒对照组5/5发病的条件下，免疫组对Hps4型和5型攻毒保护均可以达4/5以上。在同一个时间点免疫攻毒猪平均日增重与攻毒对照组仔猪比较，组间存在显著差异，疫苗组仔猪平均日增重显著的高于攻毒对照组。疫苗1和疫苗2结果对比发现，在首免后70d攻毒，疫苗1攻毒保护可达5/5保护，而疫苗2保护率为4/5，在首免后180d攻毒，疫苗1与疫苗2保护率均为4/5。由此结果表明本发明所述的二联疫苗1单剂量免疫攻毒保护效果与常规试制二联疫苗2重复免疫对Hps4型和5型攻毒保护效果相当，甚至疫苗1较优于二联疫苗2；且这种保护效果可以持续至免疫后六个月。

4.小结与讨论

本发明中的二联疫苗单剂量免疫后，在免疫后六个月内对猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌均有抵抗力，且这种保护效果较优于常规试制二联疫苗2双针免疫效果。疫苗1中Mhp抗原量较常规Mhp疫苗抗原含量增加，Hps抗原量不变，单剂量免疫后对猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌的攻击均能产生较好的保护，可能是因为Mhp抗原量增加，Mhp和Hps之间不仅不存在免疫干扰，且两者之间的协同作用增强。

实施例3、本研究是为了评价母源抗体对试制Mhp-Hps二联组合疫苗1和市售的猪肺炎支原体单苗与副猪嗜血杆菌灭活疫苗联用的影响

1、试验材料

按照实施例1中的方法制备疫苗1（Mhp抗原含量为7×10⁸CCU/头份，Hps4型JS株抗原含量为2×10⁹CFU/头份，Hps5型ZJ株抗原含量为2×10⁹CFU/头份）、市售的猪肺炎支原体单苗（瑞倍适）和副猪嗜血杆菌灭活疫苗（由华中农业大学、武汉科前动物生物制品有限责任公司、中牧实业股份有限公司生产）。

2、动物试验设计

2.1疫苗免疫

选用0～3日龄健康易感仔猪55头，其中Mhp抗体与Hps抗体监测均为阳性，提示仔猪有母源抗体保护，具体实施方案见表3，其中疫苗接种途径均为颈部肌肉注射。

表8各疫苗免疫分组情况

2.2猪肺炎支原体攻毒：按照表8试验方案，在首免后70d，用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株）气管注射5ml/头（100MID），攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

2.3副猪嗜血杆菌4、5型攻毒：按照表8试验方案，在首免后28d，分别用4型和5型副猪嗜血杆菌病毒进行攻毒，腹腔注射3ml，攻毒剂量为4型9.0×10⁹CFU/头、5型6.0×10⁹CFU/头，攻毒后观察其临床表现，观察14天后剖杀试验猪，进行病理观察。

本实施例中的10头空白猪，作为既不免疫也不攻毒对照，分别在首免后42d，100d各杀5头。

3攻毒保护结果

3.1Mhp攻毒保护结果

表9猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

表10猪肺炎支原体攻毒保护情况

由表9、表10结果可以看出，在攻毒对照组5/5发病的条件下，疫苗1能5/5保护，而单苗联用保护率仅为3/5，而各攻毒试验组平均肺病变指数与平均日增重均存在显著差异，其中以疫苗1的平均肺病变指数最低和平均日增重最高。由此结果表明在有母源抗体存在的情况下本发明所试制疫苗1单剂量免疫0～3日龄仔猪，对猪肺炎支原体攻毒保护效果最好，而商品化Mhp单苗与Hps单苗联用，按照常规重复免疫0～3日龄仔猪攻毒保护效果不理想，保护率仅为3/5，这可能是由于母源抗体干扰所致。

3.2Hps攻毒保护结果

表11副猪嗜血杆菌攻毒保护情况

由表11结果可以看出，在攻毒对照组5/5发病的条件下，疫苗1能5/5保护，而单苗联用保护率为4/5，而各攻毒试验组平均日增重均存在显著差异，其中以疫苗1的平均日增重最高。由此结果表明在有母源抗体存在的情况下本发明所试制疫苗1单剂量免疫0～3日龄仔猪，对Hps4型和5型攻毒保护效果最好，优于商品化Mhp单苗与Hps单苗联用按照常规重复免疫0～3日龄仔猪攻毒保护效果，导致这种结果的原因很可能是由于母源抗体干扰。

4.小结与讨论

本发明中的二联疫苗1在有母源抗体存在情况下，单剂量免疫后仍对猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌有很好的抵抗力，且这种保护效果优于接种对象下商品化Mhp单苗与Hps单苗联用的攻毒保护效果。

实施例4、本研究是为了评价试制Mhp-Hps二联组合疫苗1、商品化Mhp单苗与Hps单苗联用在临床上的应用

1、试验材料

2、动物试验设计

田间试验某猪场选3～10日龄仔猪300头，其中100头仔猪每头仔猪颈部肌肉注射疫苗12ml；另100头仔猪每头仔猪分别颈部肌肉注射Mhp单苗和Hps单苗各2ml,14d后按照同样方式进行二免，100头仔猪作为空白对照组。在试验过程中，其他的疫苗免疫均按正常程序进行。待出栏时观察仔猪的生长情况，临床症状。

该猪场发病史情况：猪场仔猪大多出现呼吸道综合征和地方性肺炎症状，将严重的病猪随机进行剖检，发现疑似猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌混合感染症状，并取相应病料送往邻近兽医工作站进行病原检测，提示有Mhp和Hps病原存在，该猪场有Mhp和Hps感染的风险，建议对猪场按照常规免疫程序分别进行市售猪肺炎支原体单苗和副猪嗜血杆菌单苗的普免。

对刚出生的仔猪进行Mhp抗体和Hps抗体检测，结果均为阳性，提示有母源抗体存在。

3结果与讨论

表12仔猪生长情况及症状统计

组别	疫苗类型	免疫剂量	仔猪头数	发病头数	平均日增重
						1	疫苗1	2ml	100	3	1.243^a
2	单苗联用	8ml	100	18	0.924^a
						3	/	/	100	27	0.653^b

由表12田间试验结果可以看出，在猪场普免两种单苗仔猪存在母源抗体保护的情况下，未免疫Mhp-Hps二联苗的仔猪出现27头发病，免疫过Mhp-Hps二联疫苗1的仔猪仅有3头发病，Mhp单苗和Hps单苗联用的仔猪有18头发病，且免疫组的仔猪平均日增重显著高于未免疫组，而疫苗1和单苗联用间仔猪平均日增重差异不显著。由此对比结果可以看出，在母源抗体存在的情况下，二联疫苗1单剂量免疫仍有很好的预防Mhp和Hps混合感染，单苗联用按照常规免疫程序效果仍没有疫苗1好，随着仔猪日龄增大，母源抗体对疫苗干扰逐渐减少，最终本发明认为二联疫苗1单剂量免疫，省时省力，方便，更经济。

4.小结与讨论

本发明所述的二联疫苗1在田间试验单剂量免疫后至仔猪出栏，与未免疫且有母源抗体保护的仔猪和Mhp单苗与Hps单苗按照常规免疫程序联用的仔猪相比，在有母源抗体干扰的情况下，仔猪生长情况与发病情况方面均有优势，且母源抗体对该二联疫苗1的免疫效力未产生明显干扰。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括：免疫量的猪肺炎支原体抗原，免疫量的副猪嗜血杆菌抗原以及药学上可接受的载体，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株全支原体抗原、所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株和血清5型ZJ株全菌抗原；所述的猪肺炎支原体抗原含量为7×10⁸CCU/头份，所述的副猪嗜血杆菌抗原含量为2×10⁹CFU/头份。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述的药学上可接受的载体包括佐剂、防腐剂、溶剂、分散介质、稳定剂、等渗剂、稀释剂；

其中，所述的佐剂包括ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel 01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种的组合。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括：所述的猪肺炎支原体抗原为7×10⁸CCU/头份灭活的猪肺炎支原体HN0613株全支原体抗原，所述的副猪嗜血杆菌抗原为2×10⁹CFU/头份灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株全菌抗原和2×10⁹CFU/头份灭活的血清5型ZJ株全菌抗原，以及体积百分比为10％Gel佐剂。

4.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法，其中，所述方法包括：

(1)扩增培养所述猪肺炎支原体HN0613株；

(2)扩增培养所述副猪嗜血杆菌JS株和ZJ株；

(3)分别灭活所述步骤(1)和(2)中扩增培养的猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌；以及

(4)按比例加入所述灭活的猪肺炎支原体抗原和副猪嗜血杆菌抗原，并加入佐剂，混匀。

5.权利要求1～3所述的疫苗组合物在制备治疗和预防猪肺炎支原体和副猪嗜血杆菌感染的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述应用包括对3～10日龄猪仔施以单次免疫注射权利要求1～3所述的疫苗组合物。