CN105327344B

CN105327344B - 含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN105327344B
Application number: CN201510767363.2A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2012-06-04
Publication date: 2019-03-05
Anticipated expiration: 2032-06-04
Also published as: CN102988978A; CN102988978B; CN105327344A

Abstract

本发明涉及一种猪用多联疫苗组合物，具体涉及一种同时抵抗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPS)感染的疫苗组合物。疫苗组合物包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种副猪嗜血杆菌抗原及兽医学领域可得的载体、赋形剂及佐剂。所述疫苗组合物可用于预防和治疗猪圆环病毒2型相关疾病和副猪嗜血杆菌病。

Description

含有猪圆环病毒2型抗原与副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物及其制备方法与应用

本申请为专利申请201210180842.0的分案申请

技术领域

本发明涉及一种猪用疫苗组合物，具体涉及一种同时抵抗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌(HPS)感染的疫苗组合物及其制备方法与应用。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PMWS的临床特征有消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻、黄疽等。病理变化可见全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大可达5～10倍；肺主要呈弥散性、间质性肺炎变化，质地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑驳状外观；肾的变化较多，可见皮质和髓质散在大小不一的白色坏死灶，由于水肿而导致其呈现蜡样外观；脾轻度肿大；大多病猪的肝有不同程度的萎缩、纤维化。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2相关的猪病，死亡率达10％～30％不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达40％，给养猪业造成严重的经济损失。

副猪嗜血杆菌病又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称Glasser氏病。该病是由副猪嗜血杆菌引起。副猪嗜血杆菌只感染猪，可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶前后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％临床症状取决于炎症部位，包括发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。母猪发病可流产，公猪有跛行。哺乳母猪的跛行可能导致母性的极端弱化。死亡时体表发紫，肚子大，有大量黄色腹水，肠系膜上有大量纤维素渗出，尤其肝脏整个被包住，肺的间质水肿。

大量文献报道，猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌混合感染非常普遍(鲁杏华等,中国兽医杂志,2010,(03):46～48；贾松涛等,中国畜牧兽医,2008,(08):99～100；等等)。因此，需要能同时抵抗PCV2感染以及副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物。

鲍春兴等"浅析疫苗免疫失败的原因及对策"(畜牧兽医科技信息2010，(02)8～12)，报道两种疫苗接种的间隔时间不够，或有些养殖户因防疫任务繁琐，为了省事，把两种疫苗同时接种，疫苗进入机体后，疫苗抗原之间可能产生竞争性抑制，造成免疫失败。为了避免免疫失败，猪场一般采取PCV2疫苗和副猪嗜血杆菌疫苗的分别免疫的策略，二种疫苗免疫的时间间隔15天以上，以避免两种抗原之间的干扰，这就造成多次重复注射，加大了动物应激并且提高了防疫成本，防疫效果也不确切。

发明内容

本发明通过大量的筛选研究，意外发现猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌的抗原制备的疫苗组合物，二种抗原相互并不会相互干扰或影响；相反地，猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌的抗原组合物和疫苗组合物不仅能够产生更佳的保护性免疫应答的同时，还意外发现副猪嗜血杆菌增强了猪圆环病毒2型抗原(PCV2)的免疫效果，特别是与副猪嗜血杆菌组合的情况下，即使PCV2抗原量减半仍能维持PCV2的免疫效果。因此本发明的第一方面在于提供预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)抗原和副猪嗜血杆菌抗原感染的疫苗组合物。

为了实现上述目的，本发明预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌感染的抗原组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种副猪嗜血杆菌抗原。

本发明的猪圆环病毒2型抗原是指含有至少一种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如ORF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如梅里亚公司(Merial)的辉瑞公司(Pfizer)的PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-Ingelheim)的Ingelvac)

优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为灭活的PCV2全病毒抗原，其中优选使用PCV2 SH株，保藏号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN101240264A。

因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90％以上，因此PCV2 SH株(GenBank登录号为AY686763)、PCV2 LG株(GenBank登录号为HM038034)、PCV2 DBN-SX07-2(GenBank登录号为HM641752)的抗原组合物或疫苗组合物均在本发明保护范围之内。

优选地，本发明的疫苗中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量至少为10^5.5TCID₅₀更优选4.5×10^5.0TCID_50～10^6.0TCID₅₀；再优选每剂量或每头份(2ml)含PCV2病毒9×10^5.0TCID₅₀。

优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白。其中，本发明PCV2 ORF2蛋白，优选序列表SEQNO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75％以上的、优选80％以上的、更优选90％以上的氨基酸序列的蛋白，为能达到本发明目的的蛋白序列。本发明对PCV2ORF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 ORF2蛋白都可用作本文所述PCV2 ORF2 DNA和/或多肽的来源。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述PCV2 ORF2蛋白生物的含量为0.5～20μg/头份，更优选5～10μg/头份

副猪嗜血杆菌抗原是指含有至少一种副猪嗜血杆菌抗原形式的任何组合物，所述副猪嗜血杆菌抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。副猪嗜血杆菌为包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，包含目前已鉴定的1～15个血清型。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌，优选为灭活形式，更优选，所述副猪嗜血杆菌抗原是灭活的血清型为4型和5型的混合抗原；最优选为灭活的副猪嗜血杆菌血清4型JS株，和灭活的副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株。其中，副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4,Strain JS)保藏号为：CCTCC NO:M 2011172；副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus parasuis Serotype 5,Strain ZJ)的保藏号为：CCTCCNO:M 2011173；保藏日期均为2011年5月18日，保藏地址为：中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；保藏单位均为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。

本发明的副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如勃林格殷格翰公司的Ingelvac HP-1；海博莱公司(Hipra)的Hiprasuis-Glasser；武汉科前动物生物制品有限责任公司的副猪嗜血杆菌灭活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。因此，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以，在16S rRNA具有同源性的前提下，本发明所使用的副猪嗜血杆菌抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，

16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)

因此，本发明包括与副猪嗜血杆菌两株菌株(JS株、ZJ株)16S rRNA的同源性在80％上以上的菌株，更优选与JS株或ZJ株16S rRNA同源性在至少90％以上，优选地至少95％以上，更优选地至少95％～99％以上的副猪嗜血杆菌菌株，即不改变副猪嗜血杆菌两株菌株(JS株、ZJ株)16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的副猪嗜血杆菌，获得与本发明副猪嗜血杆菌16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌为JS株，保藏号为CCTCC No.M2011172。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前前含量为1×10⁹CFU/头份～8×10⁹CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为2×10⁹CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量1×10⁹CFU/头份。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌为ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份～8×10⁹CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量2×10⁹CFU/头份。

本发明的优选方式涉及疫苗组合物的佐剂，优选为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Montanide^TM Gel、蜂胶、ISA206、ISA760VG、氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种的一种或几种组合物。

优选地，本发明提供的预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，含有PCV2 10^6.0TCID₅₀/头份，血清4型副猪嗜血杆菌4×10⁹CFU/头份，含血清5型副猪嗜血杆菌4×10⁹CFU/头份，疫苗佐剂为10％(V/V)Montanide^TM Gel佐剂。

疫苗组合物还可以包含其它猪的病原体的附加抗原。附加抗原优选猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、猪流感病毒(SIV)抗原及它们的组合。

由上可见，本发明中预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，不仅未产生两种抗原成份的相互免疫干扰，而且还意外发现副猪嗜血杆菌增强了猪圆环病毒2型抗原的免疫效果。作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中，所述PCV2抗原为PCV2 ORF2蛋白。所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的全菌抗原。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述PCV2 ORF2蛋白生物的含量为0.5～20μg/头份，更优选5～10μg/头份。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌灭活抗原为副猪嗜血杆菌JS株的灭活抗原和副猪嗜血杆菌ZJ株的灭活抗原。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活抗原的含量为1×10⁹～8×10⁹CFU/头份和副猪嗜血杆菌ZJ株灭活抗原的含量为1×10⁹～8×10⁹CFU/头份。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗佐剂为氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯、二油酸丙二醇酯、异硬脂酸酯、山梨聚糖、二缩甘露醇、甘油、聚甘油、丙二醇、油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸、羟基硬脂酸酯、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一种或几种。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述疫苗佐剂为卡波姆、壳聚糖的一种或两种。

作为本发明的另外一种实施方式在于提供另一种预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，其中，含有灭活的PCV2全病毒和灭活的血清4型及5型副猪嗜血杆菌，疫苗佐剂和其它赋形剂。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述PCV2病毒为PCV2 SH株。

优选地，本发明的疫苗中每剂量或每头份(2ml)含PCV2全病毒抗原灭活前病毒含量2.2×10^5.0TCID_50～10^6.0TCID₅₀；更优地为每剂量或每头份(2ml)含PCV2病毒4.5×10^5.0TCID₅₀

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份～4×10⁹CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份，再优选所述血清4型副猪嗜血杆菌JS株灭活前含量2×10⁹CFU/头份。优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌为ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173。

优选地，本发明的疫苗组合物中所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份～4×10⁹CFU/头份；更优地，所述副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量为1×10⁹CFU/头份，再优选所述血清5型副猪嗜血杆菌ZJ株灭活前含量2×10⁹CFU/头份。

本发明的优选方式涉及疫苗组合物的佐剂，优选为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、GEL、蜂胶、ISA206、ISA760VG的一种或几种组合物。

优选地，本发明提供的预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，含有PCV2 9×10^5.0TCID₅₀/头份，血清4型副猪嗜血杆菌2×10⁹CFU/头份，含血清5型副猪嗜血杆菌2×10⁹CFU/头份，疫苗佐剂为10％V/V GEL佐剂。

本发明赋形剂是指补充疫苗体积的液体，包括但不限于生理盐水、PBS液。

本发明第二方面的疫苗组合物的制备方法，包括以下步骤：

培养副猪嗜血杆菌4型和5型菌株，并灭活、浓缩；

培养PCV2，并灭活、浓缩；

将三种抗原成分按比例混合，辅以佐剂制备成疫苗。

优选地，本发明的疫苗组合物的制备方法，所述浓缩方法为超滤法，浓缩3倍。

优选地，本发明所述制备方法中，灭活方法为甲醛灭活法；更优地，本发明的甲醛溶液的终浓度为0.1～0.3％(v/v)，灭活时间为24～48h。

优选地，本发明所述制备方法中，三种抗原的混合比例为等量体积混合。

本发明的菌株信息如下：

分类命名：副猪嗜血杆菌血清4型JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4,Strain JS),

保藏号为：CCTCC NO:M 2011172；

保藏日期：2011年5月18日，

保藏地址：中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心；

保藏单位：中国典型培养物中心(简称CCTCC)。

副猪嗜血杆菌病血清5型ZJ株：

分类命名：副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株(Haemophilus parasuis Serotype 5,Strain ZJ),

保藏号为：CCTCC NO:M 2011173；

保藏日期：2011年5月18日，

保藏地址：中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)。

由上可见，本发明至少有以下优点：

1)发明人解决了现有技术的困难，改变了对联苗的认识偏见首次将猪圆环病毒2型抗原和副猪嗜血杆菌抗原联合使用，而在本发明之前，一直被认为这两种抗原会相互干扰；

2)发明人发现本发明的猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰，而且还意外发现副猪嗜血杆菌抗原增强了猪圆环病毒2型抗原的免疫效果，而且如本发明后续实施例所证明的，在存在副猪嗜血杆菌抗原的情况下，即使PCV2抗原量减半仍能维持PCV2的免疫效果，而这出乎兽药领域普通技术人员预料的。

3)发明人意外地发现上述预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物与猪圆环病毒2型或副猪嗜血杆菌的单价疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的疫苗组合物安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。

4)发明人意外地发现上述预防和治疗猪圆环病毒2型和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物不仅可以是灭活的PCV2病毒抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物，还可以是PCV2亚单位蛋白为抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物，即PCV2ORF2蛋白为抗原与灭活的副猪嗜血杆菌抗原组成的疫苗组合物；

4)此外，本发明预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的分次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠并被用户接受，具有商业上成功的基础。

附图说明

图1为本发明的PCV2-ORF2目的片段大小；

图2为本发明的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明的的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白Western blotting图；

图4为本发明的实施例1所述的疫苗组合物的制备流程图。

具体实施方式

本发明的实施例中所选用的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)毒株为PCV2 SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.23890。此毒株在中国专利公开CN101240264公开。

本发明的实施例中所选用的血清4型副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)菌株为副猪嗜血杆菌JS株(Haemophilus parasuis Serotype 4,Strain JS),已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011172。

本发明的实施例中所选用的血清5型副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)菌株为副猪嗜血杆菌ZJ株(Haemophilus parasuis Serotype 5,Strain ZJ)，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2011年5月18日，保藏号为CCTCC No.M2011173。

本发明的实施例中，PCV2 SH株的生产用毒的制备简便，效价较高为10^6.0TCID₅₀/ml以上，PCV2SH株的含量为10^6.0TCID₅₀/头份疫苗(1ml)。本发明还试验了含量低于10^6.0TCID₅₀/头份的疫苗组合物，但试验证明至少需要达到10^5.5TCID₅₀/头份才能具有较佳的免疫效果。

本发明的灭活剂为甲醛溶液，其使用的终浓度为0.1～0.3％(v/v)，灭活时间为24～48h。优选地，本发明实施例中使用了终浓度0.2％体积的甲醛灭活PCV2SH株，灭活时间为18小时；使用了终浓度为0.3％体积的甲醛溶液灭活副猪嗜血杆菌菌株JS株、ZJ株，灭活时间为24小时。

本发明的实施例中使用了密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作3倍浓缩，如后续实施例证明，该方法和浓度可以使最后获得疫苗组合物获得较佳的疫苗效果；本发明还可以使用其他的超滤方法，如纤维素超滤法和多次超滤等方法。

发明的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量，与“剂量”是等同的。

优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2的免疫原性氨基酸序列，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白。其中，本发明PCV2 ORF2蛋白，优选序列表SEQNO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQNO2.氨基酸序列的蛋白或与其同源75％以上的蛋白。本发明对PCV2 ORF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 ORF2蛋白都可用作本文所述PCV2ORF2 DNA和/或多肽的来源。本发明实施例中使用的其他优选的PCV2 ORF2蛋白的优选例可以举出W02006-072065公开的SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.9，其教导和内容全部引入本文作参考。本领域技术人员知晓可以在上述序列进行多达6-10％的序列同源性的变动，但仍保留其蛋白的抗原性，因而可用于本发明的组合抗原与疫苗组合物中表达出抗原性。经修饰的抗原与多核苷酸序列SEQID NO：3或SEQ ID NO：4编码的PCV2 ORF2蛋白相比，能赋予至少70％、优选80％、更优选90％的保护性免疫力，就认为该经修饰的抗原仍保留了抗原性。

本发明实施例中猪圆环病毒2型抗原成分量PCV2 ORF2蛋白为0.1～60微克/头份、优选0.5～20微克头份；更优选5～10微克/剂量、最优选8微克/头份

本发明实施例中“副猪嗜血杆菌抗原”是指含有至少一种副猪嗜血杆菌的抗原形式的任何抗原组合物，所述抗原当对猪给药时，可诱导、刺激或增强抵抗副猪嗜血杆菌感染的免疫应答。优选地，所述副猪嗜血杆菌抗原是完整的副猪嗜血杆菌病毒，优选为灭活形式，更优选，血清型为4型和5型的混合抗原，最优选为副猪嗜血杆菌4型菌株为JS株，副猪嗜血杆菌5型菌株为ZJ株。

本发明实施例中的副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株，通过试验发现和后续实施例试验例证明，这两株副猪嗜血杆菌灭活抗原与PCV2 ORF2相互配合可以对我国目前流行的副猪嗜血杆菌病和猪圆环病的联合发病有很好的预防和治疗效果，特别是可以解决现有疫苗治疗效果不佳，多次注射成本太高、程序繁复的问题。

本发明实施例中的副猪嗜血杆菌抗原量为：副猪嗜血杆菌4型含量至少为2×10⁹CFU/头份，更优选至少4×10⁹CFU/头份；最优选8×10⁹CFU/头份；副猪嗜血杆菌5型含量至少为2×10⁹CFU/头份，更优选至少4×10⁹CFU/头份；最优选8×10⁹CFU/头份。

本发明实施例中的所用“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、Q；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支链脂肪酸或醇的酯，具体是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活性剂，具体是山梨聚糖、二缩甘露醇(如油酸脱水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选乙氧基化)，以及聚氧丙烯.聚氧乙烯嵌段共聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。

本发明实施例还使用了佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆(carbomer)。

其它合适佐剂包括但不限于：RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryville CA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质.胺佐剂、大肠杆菌(E.coli)的热不稳定性肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰二肽等等。

本发明实施例的佐剂优选每剂量(头份)加入约100微克～10毫克量的佐剂。更优选每剂量加入约500微克-5毫克量的佐剂。更优选每剂量加入约750微克-2.5毫克量的佐剂。最优选每剂量加入约1毫克量的佐剂

在另一个技术方案中，二联物佐剂还可以加入是多糖，多糖包括但不限于：黄芪多糖、刺五加多糖、香菇多糖、壳聚糖、环糊精、糊精以及SL-糊精，优选壳聚糖其中壳聚糖加入量，优选0.1--10mg/剂量(头份),更优选0.1～5mg/剂量，最优选1mg/剂量。

下面以具体的实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物的制备和检验

1.1生产用菌(毒)种的制备

猪圆环病毒2型SH的制备：将毒种PCV2 SH株用MEM液体培养基(用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制)作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5％接种于PK15(ATCC，保藏号为CCL-33)单层细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(MEM液体培养基中添加4％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/ml。

副猪嗜血杆菌菌种的制备：将副猪嗜血杆菌4型JS株和副猪嗜血杆菌5型ZJ株划线接种于含5％新生牛血清和0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆琼脂(TSA，购自美国BD公司)平板(简称TSA/NAD平板)，37℃培养24～48小时，各挑选5个以上典型菌落，纯粹检验合格后，作为一级种子。一级种子挑取单个菌落，接入含5％新生牛血清和0.005％烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，美国BBI公司)的胰蛋白大豆肉汤(TSA，购自美国BD公司)(简称TSB/NAD液体培养基)，37℃摇床180rpm振荡培养12小时，同时取样革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态均匀，符合副猪嗜血杆菌的形态特征，无任何杂菌生长，作为二级种子

其中：含5％血清的TSA/NAD平板的制备方法：胰蛋白大豆琼脂(Tryptic SoyAgar，TSA，BD Difico产品)40克加入945ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，温度降至60℃左右,加入50ml过滤除菌的牛血清，5ml过滤除菌的1％NAD，充分摇匀后倒平皿。

含5％新生牛血清的TSB/NAD液体培养基：胰大豆蛋白肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB，BD Difico产品)30克加入940ml蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121℃高压蒸汽灭菌15min，加入50ml过滤除菌的牛血清，10ml过滤除菌的0.01％NAD即成。

1.2病毒液或菌液的培养制备

猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液体积比按0.1～0.2TCID₅₀/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(步骤1.1所述)，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。

副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的制备：将鉴定合格的副猪嗜血杆菌4型JS株与副猪嗜血杆菌5型ZJ株的二级种子分别按1:100(v/v)接种于TSB/NAD液体培养基(步骤1.1所述)，置37℃摇床200rpm培养。培养至12～16小时，收获。

1.3病毒液或菌液的处理

猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理：将步骤1.2的病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。

副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的处理：将将步骤1.2的两种菌液(副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株)分别以连续离心机(10000转/分钟)离心后再以PBS(pH值为7.2～7.4)复溶至离心前的体积。

1.4浓缩将猪圆环病毒2型SH、副猪嗜血杆菌4型JS株、副猪嗜血杆菌5型ZJ株分别用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作3倍(体积比)浓缩。

1.5含量测定

1.5.1猪圆环病毒SH株病毒含量测定

将病毒液用MEM液体培养基(步骤1.1所述)按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO₂的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。

1.5.2副猪嗜血杆菌ZJ株与JS株活菌数测定

菌液取样，按本领域技术人员熟知的方法作10倍系列稀释，取10^-6、10^-72个稀释度接种于前述TSA/NAD固体培养基，每个平板接种0.1ml，37℃培养24小时后，选择菌落数在30和300之间的平板进行菌落计数。

1.6病毒液或菌液含量测定结果：

猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株及副猪嗜血杆菌5型ZJ株分别培养三批病毒液或菌液，分别为K001、K002和K003批。病毒液或菌液含量见表1。

表1 含量测定

1.7病毒液或菌液的灭活

猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将检验合格的步骤1.3处理的病毒液加入甲醛溶液(洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37％～40％)，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2～8℃保存。

副猪嗜血杆菌(4型JS株与5型ZJ株)菌液的灭活：将步骤3中二种不同血清型的菌液，加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％(V/V)，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2～8℃保存。

1.8灭活效果测定

1.8.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验：取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无细胞病变(CPE)，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用间接免疫荧光法(IFA)检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。

1.8.2副猪嗜血杆菌灭活检验：制备6个平皿的TSA/NAD固体培养基，无菌操作将灭活的菌液在其中3个TSA/NAD固体培养基平皿上滴加1滴，用接种环划线，置37℃普通温箱培养，同时设立3个不接菌的TSA/NAD固体培养基作对照。24小时后观察，平皿必须无任何细菌生长,同时对照未接菌的2个培养基也应无细菌生长,继续观察结果至48小时6个平皿中都无细菌生长。

1.8.3灭活结果

3批猪圆环病毒2型SH株、副猪嗜血杆菌4型JS株及副猪嗜血杆菌5型JS株的灭活检验结果见表，灭活是彻底的，见表2。

表2 3批抗原的灭活检验效果

1.9配苗配方如表3，将浓缩后的三种抗原液按1：1：1(V/V)混合，然后混合液与GEL佐剂(法国赛比克SEPPIC公司生产)按90:10(V/V)混合，以300转/分钟搅拌30分钟即可。

表3 疫苗的配方及含量

以下为制备获得疫苗组合物的检验方法：

1.10性状检验

灰白色混悬液，长时间静置底部有少量沉淀。振荡后呈均匀混悬液。

1.11无菌检验

按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录169～171页进行，应无菌生长。

性状和无菌检验结果见下

结果见表4，三批疫苗批号为Y001、Y002、Y003，由上述批号K001、K002、K003的毒(菌)株抗原制备获得，分别经过无菌检验及性状检验，结果三批疫苗成品均是合格。

表4 3批疫苗的性状及无菌检验结果

1.12安全检验

用28～35日龄副猪嗜血杆菌病抗体及猪圆环病毒2型抗体阴性仔猪5头，各颈部肌肉注射疫苗组合物4ml，观察14日，注苗局部无严重反应，且全部健活为合格。

结果见下：

批号为Y001、Y002、Y003的三批疫苗，分别经过安全检验，结果三批疫苗成品均是合格，注射部位、全身、脏器均未见异常，结果见表5。

表5 3批疫苗的安全检验

以下为疫苗组合物的效力检验

1.13效力检验

1.13.1猪圆环病毒2型效力检验部分

用14～21日龄健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗1ml，疫苗使用上述批号为Y001、Y002、Y003的三批疫苗，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种，第2组作非免疫攻毒对照，第3组作空白对照(非免疫、非攻毒)，均隔离饲养观察。首免后5周对所有猪称重，第1、2组各用PCV2 SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组应至少4头保护。

1.13.2副猪嗜血杆菌效力检验部分：用28～35日龄副猪嗜血杆菌病抗体阴性仔猪10头，分2组，每组5头，每头颈部肌肉注射疫苗1ml，2周后二免每头颈部肌肉注射疫苗1ml。每组2免后14日连同对照猪5头，分别腹腔内注射1个致死剂量的血清4型JS株和5型ZJ株菌液各3ml，观察14日。每组免疫猪至少保护4头；对照猪至少3头死亡或者4头发病为合格。

效力检验结果见下：

上述批号为Y001、Y002、Y003三批疫苗，，分别经过效力检验，结果三批疫苗均对猪圆环病毒2型SH、血清4型JS株和5型ZJ株菌株免疫攻毒保护，结果三批疫苗均表现良好的免疫效果，结果见表6。

表6 3批疫苗的效力检验结果

实施例2：猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌二价(血清4型+血清5型)抗原疫苗组合物的制备

采用实施例1制备(即K001批抗原，见表2)猪圆环病毒2型灭活病毒液及副猪嗜血杆菌(血清4型JS株和血清5型ZJ株)的灭活菌液，按下列配方制备疫苗：

灭活的PCV2病毒液(灭活前病毒含量为10^6.0TCID₅₀/ml) 45ml

灭活的副猪嗜血杆菌4型菌液(灭活前病菌液含量为4.5×10^9.0cfu/ml) 22.5ml

灭活的副猪嗜血杆菌5型菌液(灭活前病菌液含量为4.5×10^9.0cfu/ml) 22.5ml

Montanide^TMGel 10ml

将灭活病毒液及灭活的菌液(实施例1制备)按上述比例放入容器，再放入Montanide^TMGel，然后用IKA数显欧洲之星搅拌器(500～800r/min)搅拌混匀5～10min即成。

实施例3：PCV2灭活全病毒抗原疫苗对PCV2攻毒免疫效果与PCV2灭活病毒抗原和副猪嗜血杆菌灭活抗原的疫苗组合物的对PCV2攻毒免疫效果比较

用实施例1制备抗原(即K001批抗原，见表2)分别制备猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌(血清4型+血清5型)疫苗组合物(V1)和(V2)、猪圆环病毒疫苗(V3)和(V4)，具体配方如下。

(1)猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌(血清4型+血清5型)疫苗组合物(V1)

(2)猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌(血清4型+血清5型)疫苗组合物(V2)总体积100ml

灭活的PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 22.5ml

灭活的副猪嗜血杆菌4型菌液(含4.5×10^9.0cfu/ml) 11.25ml

灭活的副猪嗜血杆菌5型菌液(含4.5×10^9.0cfu/ml) 11.25ml

0.85％的生理盐水 45ml

Montanide^TMGel 10ml

(3)猪圆环病毒2型灭活疫苗(V3)总体积100ml：

灭活的PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 45ml

0.85％的生理盐水 45ml

Montanide^TMGel 10ml

(4)猪圆环病毒2型灭活疫苗(V4)总体积100ml

灭活的PCV2病毒液(含10^6.0TCID₅₀/ml) 22.5ml

0.85％的生理盐水 67.5ml

Montanide^TMGel 10ml

选21～28日龄断奶仔猪30头，分为6组，每组5头(见表7)；第1组每头猪分别颈部肌肉疫苗(V1)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第2组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V2)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V3)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V4)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第5作为攻毒对照组，第6组作为空白对照组。在首次免疫后35d，第1、2、3、4、5组各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第4组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第1、2、3、4、5、6组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基(Thio)，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、组织损伤和免疫组织化学(IHC)检测PCV2病毒抗原结果进行判定。

表7 试验分组及处理

体温产生情况见表8，可见疫苗组合物(V1)和抗原含量减半的疫苗组合物(V2)免疫的猪只PCV2攻毒后几乎无体温升高，而猪圆环病毒2型灭活疫苗(V3)及PCV2抗原含量减半的V4疫苗免疫的猪只PCV2攻毒后大多有1～2天短暂的体温升高40.5℃以上，其中1头已达3天。

表8 PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较

组织损伤及免疫组化检测抗原情况见表9，可见疫苗组合物(V1)免疫的猪只PCV2攻毒后无病理损伤且未检测到PCV2抗原，而猪圆环病毒2型灭活疫苗(V2)免疫的猪5头猪有1头检测到了PCV2抗原且其有病理圆环病毒特征性的病理损伤(间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等)。

表9 PCV2攻毒后各组试验猪组织损伤及IHC检测

本研究的结果令人意外:使用猪圆环病毒2型(PCV2)与副猪嗜血杆菌抗原组合时，不仅能够用于免疫猪以提供良好的免疫效果，而且保留了原PCV2抗原成份的良好的免疫效力，其效果也优于单独的猪圆环病毒2型灭活疫苗，尤其在抗原含量减半的情况下依然具有了单用PCV抗原而无法达到的效果持了猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的免疫效果，两种抗原对PCV2免疫起到了协同作用，同时由于佐剂品种和量均相同，显然这种协同作用是两种抗原在一起引起的。即本发明疫苗组合物的对抗PCV2的免疫效果优于单独使用PCV2抗原的免疫效果。尤其在PCV2抗原量减半的情况下依然保持了猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的免疫效果，上述结果出乎本领域技术人员的意料。

实施例4：副猪嗜血杆菌灭活抗原疫苗组合物及PCV2灭活病毒抗原、副猪嗜血杆菌灭活抗原的疫苗组合物对副猪嗜血杆菌攻毒保护效果的比较

本项研究设计是为了证实组合产物与单独的副猪嗜血杆菌灭活疫苗没有干扰。

用实施例1制备的抗原K001批抗原按实施例2方法分别制备猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌(血清4型+血清5型)疫苗组合物(V1)、副猪嗜血杆菌灭活疫苗(血清4型+血清5型)(V2)，具体配方如下。

(1)猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌(血清4型+血清5型)疫苗组合物(V1)：

(2)副猪嗜血杆菌灭活疫苗(血清4型+血清5型)灭活疫苗(V2)：

选21～28日龄断奶仔猪35头，分为7组，每组5头(见表10)；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌(4型+5型)、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗(V1)2ml，免疫后21日再次接种2ml；第3、4组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型+5型)2ml，免疫后21日再次接种2ml；第5、6、7组不接种。在首次免疫后35日，第1、3、5组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清4型JS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第2、4、6组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清5型ZJ株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第7组不攻毒作空白对照。

表10 试验分组及处理程序

组别	D0	D21	D35	D45
					1	V 1，2ml/头	V 1，2ml/头	JS株3ml(含7×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
2	V 1，2ml/头	V 1，2ml/头	ZJ株3ml(含6×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
					3	V 2，2ml/头	V 2，2ml/头	JS株3ml(含7×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
4	V 2，2ml/头	V 2，2ml/头	ZJ株3ml(含6×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
					5	不免疫	不免疫	JS株3ml(含7×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
6	不免疫	不免疫	ZJ株3ml(含6×10<sup>9</sup>CFU)攻击	扑杀
					7	不免疫	不免疫	不攻毒	扑杀

试验结果如表11，疫苗组合物(V1)对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护分别为4/5(80％)、5/5(100％)，副猪嗜血杆菌疫苗(血清4型+血清5型)对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护为4/5(80％)、5/5(100％)。

表11 副猪嗜血杆菌攻毒后各组比较结果

组别	动物数量	发病数量	死亡数量	保护率(发病数/动物数)
					V1	5	1	0	4/5
V1	5	0	0	5/5
					V2	5	1	0	4/5
V2	5	0	0	5/5
					4型攻毒对照组	5	5	3	/
5型攻毒对照组	5	5	4	/
					空白对照组	5	0	0	/

本研究的结果令人意外:使用本发明猪圆环病毒2型(PCV2)与副猪嗜血杆菌抗原组合做成疫苗混合使用时可以保留原副猪嗜血杆菌抗原成份的良好的免疫效力，这与本领域技术人员的认识和理解区别很大。

实施例3和实施例4证明，本发明本发明猪圆环病毒2型(PCV2)与副猪嗜血杆菌抗原组合做成联合疫苗，副猪嗜血杆菌抗原对猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的免疫效果，而且副猪嗜血杆菌抗原本身不受影响，取得了有益的效果，具有显著的进步。

实施例5：副猪嗜血杆菌(4型+5型)、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗与单独使用两种疫苗(副猪嗜血杆菌灭活疫苗或猪圆环病毒2型灭活疫苗)的免疫效果和免疫副作用比较

1材料

副猪嗜血杆菌(4型+5型)抗原、猪圆环病毒2型抗原疫苗组合物，选用实施例3中的实验室制品(V1)(每ml疫苗含灭活前PCV2为5×10⁵TCID₅₀，副猪嗜血杆菌4型和5型抗原含量为10⁹cfu，每头份用量为1ml，免疫两次)；猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)(V2)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903，每ml疫苗含灭活前PCV2为5×10⁵TCID₅₀；每头份用量为1ml，免疫两次)；副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)(V3)，武汉科前生物制品有限公司(批号为100306，每ml疫苗含灭活前PCV2为5×10⁵TCID₅₀，副猪嗜血杆菌4型和5型抗原含量为2×10⁹cfu；每头份用量为1ml，免疫两次)。

2动物试验设计

选21～28日龄断奶仔猪50头，分为10组，每组5头(见表12)；第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌(4型+5型)、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗(批号001)1ml，免疫后14d再次接种1ml；第4、5、6组每头猪分别左侧颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)1ml，右侧颈部肌肉注射猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)1ml，免疫后14d再次接种各1ml；第7、8、9、10组不接种。在首次免疫后35d，第1、4、7组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清4型JS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第2、5、8组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清5型ZJ株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第3、6、9组各用PCV2 SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第10组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第3、6、9、10组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。

KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂(ICFA)乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH)(含KLH为0.5mg/ml)，KLH及ICFA均购自Sigma公司；Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。

表12 试验分组及处理

试验结果如表13，疫苗组合物对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护为4/5(80％)、5/5(100％)，对PCV2 SH株的攻毒保护为4/5(80％)，两种单苗联用对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护为4/5(80％)、4/5(80％)，对PCV2 SH株的攻毒保护为4/5(80％)。

表13 疫苗组合物与单价疫苗的对照试验

注：不良反应表现为注射局部红肿，体温升高，厌食，精神不振。

由表13可见显示出良好的免疫保护效果，表明本发明的疫苗组合物与单苗的免疫效果基本相当；从接种剂量比较而言，疫苗组合物打2针，共2ml，两种单苗联用需打4针，共4ml，显而易见的效果是疫苗组合物使用更为方便，省时省力；从安全角度来讲，疫苗组合物的安全性相对安全，单苗联用有1/5的试验猪有不良反应，因为注射的剂量相对比疫苗组合物要增加1倍；综合述之，疫苗组合物不仅要使用方便，应激小。

实施例6猪圆环病毒2型ORF2蛋白及其制备方法

(1)克隆猪圆环病毒2型ORF2基因到毕赤酵母表达载体pPIC9K中，获得重组酵母表达载体pPIC9K-ORF2。

①引物的设计

以PCV2-ORF2基因序列为参考，应用Oligo6.0引物设计软件设计引物，

P1上游：5'-AGGGGATCCGGCATCTTCAACACC-3'

P2下游：5'-CCGAATTCTTAGGGGTTAAGTGGGG-3'

在上下游引物5'端分别加上核酸限制性内切酶BamH I和EcoRI识别序列(倾斜下划线部分)，目的片段长约702bp。

②PCV2病毒核酸的提取

1mlDNAzol Reagent加入含有0.1ml的PCV2-SH病毒液的离心管中上下颠倒3次摇匀；室温下静置5min；4℃离心(10,000rpm、10min)后，将上清液移至新离心管；向其中加入0.5ml无水乙醇，上下颠倒混匀后室温下静置5min，4℃离心(4000rpm、2min)后，静置1min，然后吸去管内液体；向试管中加入1ml75％乙醇，上下颠倒混匀5次后，静置1min，吸去乙醇，此步骤重复两次后，让样品在空气中自然干燥(5min)；于离心管中缓慢加入30μl8mmol/LNaOH溶解DNA，然后在-20℃下贮存备用。

③PCV2-ORF2基因的PCR扩增并连接入克隆载体pMD18-T(购自Takara公司，货号：D101A)

以步骤②中制备的PCV2的基因组DNA为模板，用步骤①中设计的引物P1、P2将目的基因ORF2进行PCR扩增。将PCV2-ORF2基因连接到pMD18-T载体中，命名为pMD18-T-ORF2质粒。用核酸限制性内切酶BamH I与EcoRI双酶切鉴定及测序鉴定。PCR结果见图1。第1孔为PCV2-ORF2目的片段，大小为702bp，第2孔为DL2000 Marker。由电泳图谱与测序结果可知，重组连接载体中PCV2-ORF2蛋白基因含序列表中的SEQ ID NO1序列。

④表达载体pPIC9K-ORF2质粒构建

用核酸限制性内切酶BamH I与EcoRI双酶切pMD18-T-ORF2质粒，用胶回收试剂盒回收PCV2-ORF2基因片段。与同样经过BamH I与EcoRI双酶切pPIC9K质粒(购自Pharmacia公司)的胶回收目的片段进行连接，构建表达载体pPIC9K-ORF2。用BamH I与EcoRI双酶切及PCR鉴定，采用PCR方法分析，用煮-冻-煮制备模板，以通用引物5’AOX1和3’AOX1为引物，其序列为5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’进行PCR鉴定为阳性重组质粒。

(2)重组阳性质粒pPIC9K-ORF2转化酵母GS115菌株(购自Life Technologies公司，货号：C18100)

将鉴定后的阳性重组表达质粒pPIC9K-ORF2线性化后，电转化毕赤酵母GS115，获得阳性基因工程菌GS115/pPIC9K-ORF2。该基因工程菌经过G418抗性平板、PCR与Southern-blot鉴定为含3个拷贝表达盒的重组酵母菌株，用15％甘油进行菌种保存。

(3)毕赤酵母表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白

①阳性菌株的诱导表达及重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的鉴定

以pPIC9k质粒转化GS115酵母菌的阳性重组酵母菌为阴性对照，同时挑取重组酵母菌株于BMGY(Buffered glycerol-complex medium油缓冲复合诱导培养基)培养基中，培养至OD600为3时，5000rpm离心15min收集菌体，转至三角锥瓶，加BMMY培养基稀释至OD600为1，以8层无菌纱布封口，30℃250rpm摇床培养72h。为了维持诱导表达，每隔24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，分别于24h、48h、72h取1.5ml培养物于灭菌离心管中，于12000rpm离心15min，分别收集上清，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳，结果见图2。第1孔为蛋白质Marker；第2孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母24h后收获的培养上清；第3孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母48h后收获的培养上清；第4孔为pPIC9K-ORF2重组毕赤酵母72h后收获的培养上清；第5孔为细胞阴性对照。由图可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白大小与预测蛋白一致。经测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列为序列表中的SEQID NO.2序列。

②重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的免疫原性鉴定

SDS-PAGE电泳后，再进行转膜，将凝胶上的收获的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，加上针对猪圆环病毒2型ORF2蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白的表达。结果见附图3，其中，第1孔为蓝色预染低分子量蛋白质Marker；第2孔为24h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果；第3孔为48h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第4孔为72h后收获的培养上清与猪圆环病毒2型阳性血清反应结果，第5孔为与阴性血清反应结果。用Western blotting分析表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白。用猪的抗猪圆环病毒2型高免血清对重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白进行检测。结果显示，在硝酸纤维素膜上仅观察到一条分子量大小与预期大小一致的特异性条带，说明表达的重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白能够同猪圆环病毒2型抗体特异性结合，证明重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。

③收获和纯化重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白

将72h诱导表达的培养物经10000rpm离心20min，分离沉淀和上清液，沉淀弃去，上清液通过1μm的滤膜进行过滤，然后通过密理博(Millipore公司)超滤浓缩纯化，纯化后的样品溶液通过本领域人员熟知的紫外分光光度计进行蛋白含量测定，表达量为55mg/L。纯化后加入二乙烯亚胺使最终浓度为7mmol/L二乙烯亚胺(BEI)灭活重组表达产物，48h后加入终浓度为7mmol/L的硫代硫酸钠中和。

实施例7、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物的制备

抗原：采用实施例6制备的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白抗原和实施例1的副猪嗜血杆菌抗原(k001批进行3倍浓缩，副猪嗜血杆菌4型灭活抗原和副猪嗜血杆菌5型灭活抗原菌液浓度为灭活前13.5×10⁹CFU/ml)，

卡波姆溶液制备:将卡波姆Carbomer 934P(青岛天力源生物科技有限公司)溶解在去离子水中，制成25mg/ml的储备溶液12℃30min高压灭菌，4℃保存

2％W/V的壳聚糖溶液的制备：0.5M乙酸钠溶液用4.lg乙酸钠(购自SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)溶于50ml去离子水，用约7ml冰乙酸将pH调至4.5，再加入1.5ml冰乙酸补偿聚氨基葡萄糖的加入对溶液pH的影响。溶液总体积用去离子水调至l00ml,2g壳聚糖(上海其胜生物制品有限公司产品，聚合度88.5％)缓慢加入上述乙酸钠溶液并不断搅拌2-3小时直到壳聚糖溶解。0.22μm滤膜过滤除去杂质，112℃30min高压灭菌，4℃保存。

表14、猪圆环病毒病、副猪嗜血杆菌病的疫苗组合物试验例主要组成(每头份疫苗为2ml)

制备方法:

按照表14的配比，在无菌容器中依次加入上述含量比例的猪圆环病毒2型ORF2蛋白、副猪嗜血杆菌4型JS菌株灭活抗原、副猪嗜血杆菌5型ZJ菌株灭活抗原，卡波姆溶液和壳聚糖溶液，用PBS液(pH值为7.2～7.4)混合搅拌30分钟既得猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物。

实施例8猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物免疫学试验和攻毒试验

疫苗免疫25日龄PCV2抗体阴性仔猪(普莱柯生物工程股份有限公司的动物房饲养)，每组8头，同时设未接种疫苗不攻毒阴性对照猪8头及未接种疫苗攻毒对照猪8头。免疫组进行一次免疫，免疫二联物采用实施例3制备的疫苗组合物。免疫后21天对免疫组和攻毒对照进行病毒攻击，毒株选用强毒(PCV2-SH株强毒10^6.0TCID50/ml)，每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml,0.5ml)和腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。不接种疫苗不攻毒阴性对照组单独隔离饲养。攻毒后28天进行剖杀。

在第1免疫前、攻毒前和剖杀前，对所有猪只收集血样，通过ELISA法进行PCV2血清抗体分析。试验结果见表3。攻毒后28天剖检全部猪只，观察各组织器官病理变化、拍照记录。符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。

A.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；

B..病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；

C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。表14中各个试验组的免疫结果见表15。

表15各组试验猪PCV2血清抗体分析结果

表16.各组试验动物发病判定结果

结果分析：根据试验动物临床症状、剖检病理变化检测和病原的PCR检测判断结果，其中不免疫攻毒对照组仔猪全部发病，所有试验组均不发病。

实施例9、猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原疫苗组合物与现有技术疫苗的免疫副作用比较

1材料

副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型疫苗组合物，选用实施例7中的实验室制品试验例3制品(V1)及试验例1制品(V2)；猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903)(V3)；副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)，武汉科前生物制品有限公司(批号为100306)(V4)。

2动物试验设计

选21～28日龄断奶仔猪60头，分为12组，每组5头；第1、2、3组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒2型抗原、副猪嗜血杆菌抗原疫苗组合物实施例7试验例5)1ml，第4、5、6组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒2型疫苗组合物实施例7试验例8)1ml，7、8、9组每头猪分别左侧颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌病疫苗(4型MD0322株+5型SH0165株)1ml，右侧颈部肌肉注射猪圆环病毒2型疫苗(SH株)1ml，免疫后14d再次接种各1ml；第10、11、12、13组不接种。在首次免疫后35d，第1、4、7、10组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清4型JS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第2、5、8、11组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清5型ZJ株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后第14日扑杀剖检；第3、6、9、12组各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第13组不攻毒，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。

表17、疫苗组合物与单价疫苗的对照试验

由表17可见显示出良好的免疫保护效果，表明本发明的疫苗组合物与单苗的免疫效果基本相当；从接种剂量比较而言，疫苗组合物打1针，共1ml，两种单苗联用需打4针，共4ml，显而易见的效果是疫苗组合物使用更为方便，省时省力；从安全角度来讲，疫苗组合物的安全性相对安全，单苗联用有1/5的试验猪有不良反应，因为注射的剂量相对比疫苗组合物要增加4倍；综合述之，疫苗组合物不仅要使用方便，更为安全。

实施例10：PCV2 ORF2重组蛋白抗原、副猪嗜血杆菌抗原疫苗组合物免疫仔猪后PCV2攻毒保护效果比较

本项研究设计是为了证实佐剂相同的情况下疫苗组合物(PCV2重组蛋白亚单位抗原+副猪嗜血杆菌)与单独的猪圆环病毒2型重组蛋白亚单位疫苗在相同佐剂情况下的免疫效果

如前述实施例1制备副猪嗜血杆菌灭活抗原，实施例6制备的达PCV2 ORF2蛋白，按照表18制备猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物，在无菌容器中依次加入猪圆环病毒ORF2蛋白、副猪嗜血杆菌5型抗原、副猪嗜血杆菌4型抗原，加入疫苗佐剂，用PBS(磷酸盐缓冲液pH为7.2～7.4)液调整体积。

表18 各试验疫苗的配方(每头份疫苗为2ml)

选21～28日龄断奶仔猪30头，分为6组，每组5头(见表19)；第1组每头猪分别颈部肌肉疫苗(V1)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第2组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V2)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V3)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射疫苗(V4)2ml，免疫后21d再次接种2ml；第5作为攻毒对照组，第6组作为空白对照组。在首次免疫后35d，第1、2、3、4、5组各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，第4组不攻毒，攻毒后第4、7日，分别在第1、2、3、4、5、6组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基(Thio)，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据微观病理组织变化及免疫组织化学(IHC)检测PCV2病毒抗原结果进行免疫效果比较。

表19 试验分组及处理

组织损伤及免疫组化检测抗原情况见表20，可见疫苗组合物(V1)免疫的猪只PCV2攻毒后无病理损伤且未检测到PCV2抗原，而猪圆环病毒2型灭活疫苗(V2)免疫的猪5头猪有1头检测到了pcv2抗原且其有病理圆环病毒特征性的病理损伤(间质性肺炎、淋巴结淋巴细胞损伤和多核巨细胞的出现及单核巨噬细胞浸润等)。

表20 PCV2攻毒后各组试验猪组织损伤及IHC检测

本领域一直认为亚单位ORF2疫苗与其他抗原的疫苗组合物，由于蛋白容易变性或与其他抗原相结合，可能会效果变差。但本研究的结果令人意外:在使用猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白作为PCV2抗原时，其与副猪嗜血杆菌抗原的组合抗原制备的疫苗组合物，表现出了灭活PCV2全病毒抗原与副猪嗜血杆菌抗原的组合抗原制备的疫苗组合物相同或基本相同的免疫效果。

此外，本发明的疫苗组合物不仅能够用于免疫猪以提供良好的免疫效果，而且保留了原PCV2抗原成份的良好的免疫效力，其效果也优于单独的猪圆环病毒2型ORF2蛋白亚单位疫苗，即本发明疫苗组合物的对抗PCV2的免疫效果优于单独使用PCV2 ORF2蛋白亚单位疫苗的免疫效果。尤其在PCV2抗原量减半的情况下依然保持了猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的免疫效果，上述结果也出乎本领域技术人员的意料。

实施例11：PCV2 ORF2重组蛋白抗原、副猪嗜血杆菌抗原疫苗组合物、与副猪嗜血杆菌灭活疫苗免疫后副猪嗜血杆菌攻毒保护效果比较

按实施例1制备副猪嗜血杆菌抗原，按实施例6中制备猪圆环病毒2型ORF2蛋白，按照表21制备猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原的疫苗组合物，在无菌容器中依次加入猪圆环病毒ORF2蛋白、副猪嗜血杆菌5型抗原、副猪嗜血杆菌4型抗原，加入疫苗佐剂，用PBS液(pH值7.2～7.4)调整体积。

表21 各试验疫苗的配方(每头份疫苗为2ml)

选21～28日龄断奶仔猪35头，分为7组，每组5头(见表22)；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌(4型+5型)、猪圆环病毒2型二联灭活疫苗(V1)2ml，免疫后21日再次接种2ml；第3、4组每头猪分别颈部肌肉注射副猪嗜血杆菌病灭活疫苗(4型+5型)2ml，免疫后21日再次接种2ml；第5、6、7组不接种。在首次免疫后35日，第1、3、5组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清4型JS株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第2、4、6组每头猪分别经腹腔内注射1个致死剂量的血清5型ZJ株菌液3ml，逐日观察，观察至攻毒后10日扑杀剖检；第7组不攻毒作空白对照。

表22 试验分组及处理程序

试验结果如表23，疫苗组合物(V1)对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护均为5/5(100％)，副猪嗜血杆菌疫苗(血清4型+血清5型)(V2)对4型JS株及5型ZJ株的攻毒保护为5/5(100％)。

表23 副猪嗜血杆菌攻毒后各组比较结果

组别	动物数量	发病数量	死亡数量	保护率(发病数/动物数)
					V1	5	0	0	5/5
V1	5	0	0	5/5
					V2	5	0	0	5/5
V2	5	0	0	5/5

4型攻毒对照组	5	5	3	/
					5型攻毒对照组	5	5	4	/
空白对照组	5	0	0	/

本研究的结果同样令人意外:通常认为亚单位ORF2疫苗与其他抗原的疫苗组合物，由于蛋白容易与其他抗原相结合，可能会导致其他疫苗的效果变差。但本研究的结果令人意外:在使用副猪嗜血杆菌灭活抗原与猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2蛋白制备的疫苗组合物，依然保留了副猪嗜血杆菌成份的良好的免疫效力，并能同时为抗猪圆环病毒2型(PCV2)与副猪嗜血杆菌感染提供良好的免疫效果。而现有技术则认为蛋白成分通常会干扰副猪嗜血杆菌抗原的效果，联合使用通常会部分抵消副猪嗜血杆菌疫苗的免疫原性。

实施例12：副猪嗜血杆菌的鉴定

(1)PCR鉴定

将备检JS株菌液ZJ株菌液和10,000r/min离心5min，弃上清液用无菌水悬浮或将分离纯化的菌株用接种环刮取2个菌落洗脱于含100μl无菌水的离心管中，涡旋，于沸水中水浴10min后，再放置－20℃冻结。冻融后10,000r/min离心5min，取上清液作模板。

参照文献(Oliveira S,Galina L,Pijoan C.Development of a PCR test todiagnose Haemophilus parasuis infections.Vet Diagn Invest.一种用于诊断副猪嗜血杆菌感染的PCR方法建立)由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，序列分别为上游引物：5’－GGC TTC GTC ACC CTC TGT－3’；下游引物：5’－GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT－3’。该引物扩增片段为编码16S rRNA的DNA片段，长度约为822bp。

反应体系(25μl)∶10×PCR Buffer 2.5μl，25mmol/L MgCl₂1.5μl，2.5mmol/LdNTPs 2.0μl，10μmol/L上游和下游引物各0.8μl，5U/μl Ex－Taq 0.1μl，无菌水15.3μl，模板2μl。

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，共30个循环，最后72℃延伸l0min。扩增后的PCR样品于1.0％琼脂糖凝胶电泳。凝胶用GelRed染色，紫外线透射观察分析。副猪嗜血杆菌标准菌株购自华中农业大学，根据副猪嗜血杆菌16S rRNA序列设计引物经PCR扩增的产物为822bp大小的片段。产物经琼脂糖凝胶电泳证实其大小均与阳性对照一致。

(2)血清型鉴定

参照Kielstein-Rapp-Gabrielson(KRG)(KIELSTEIN P,RAPP-GABR IELSON V J,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Apr.1992,30:862-865)中的方法，4型和5型副猪嗜血杆菌标准抗原及标准阳性血清购自武汉科前动物生物制品有限公司，结果JS株为血清4型，ZJ株为血清5型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换例如换用其它基因相似的毒株或者两种商业化的疫苗临用前稀释合并等以及其它改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)和副猪嗜血杆菌感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括猪圆环病毒2型抗原和副猪嗜血杆菌抗原，所述的猪圆环病毒2型抗原为亚单位抗原；所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的全菌抗原，所述疫苗组合物还包括佐剂；所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白；所述的副猪嗜血杆菌抗原为灭活的副猪嗜血杆菌JS株和灭活的副猪嗜血杆菌ZJ株；所述PCV2 ORF2蛋白的含量为5～10μg/头份；所述灭活的副猪嗜血杆菌JS株抗原的含量为1×10⁹～2×10⁹CFU/头份，所述灭活的副猪嗜血杆菌ZJ株抗原的含量为1×10⁹～2×10⁹CFU/头份；所述副猪嗜血杆菌JS株保藏号为CCTCC NO:M 2011172，所述副猪嗜血杆菌血清ZJ株保藏号为CCTCC NO:M 2011173。

2.根据权利1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂选自：氢氧化铝、磷酸铝、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、卡波姆、Montanide^TMGel。

3.根据权利2所述的疫苗组合物，其特征在于，皂苷为Quil A或QS-21。

4.根据权利2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为Montanide^TMGel。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和副猪嗜血杆菌病药物中的应用。

6.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌血清4型JS株，保藏号为CCTCC No.M2011172。

7.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌为副猪嗜血杆菌血清5型ZJ株，保藏号为CCTCC No.M2011173。