CN103127497A - 猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法，含有灭活的猪圆环病毒2型和灭活的猪肺炎支原体、疫苗佐剂及赋形剂；其中，猪圆环病毒2型含量至少为10^5.5TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。本发明的二联灭活疫苗有以下优点，免疫效果都与市场上的商品单苗之和相当或更佳，两种抗原之间无相互干扰；免疫持续期长，效力持久；只需一次免疫，降低了成本，也减少了动物的应激反应。本发明的二联灭活疫苗可以用于同时预防猪圆环病毒病及猪支原体肺炎。

Description

猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗领域。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，缩写：PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒，直径平均为17nm。根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，PCV被划分为无致病性PCV-1和致病性PCV-2两个基因型。PCV-2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的主要病原。本病最早发现于加拿大(1991)，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS(猪皮炎与肾病综合征)、PNP(增生性坏死性肺炎)、PRDC(猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV-2感染有重要关联。PCV-2及其相关的猪病，死亡率10％～30％不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40％，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。PCV-2感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是圆环病毒与猪的许多疾病混合感染有关的原因。最常见的混合感染有PRRSV、PRV(伪狂犬病毒)、PPV(细小病毒)、猪肺炎支原体、肺炎支原体，有的呈二重感染或三重感染，其病猪的病死率也将大大提高，有的可达25％～40％。

猪气喘病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合症病毒和其它病原混合感染，使其感染的重要性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。

猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种。该疾病通过咳嗽产生的飞沫以及与感染或恢复期的病原携带猪直接接触而传播。感染动物和未感染动物混居导致早期和频繁的再感染.感染通常开始于携带病原的母猪产胎时感染小猪。由于猪群集中管理技术的影响，感染在生命后期才变得明显.当断乳后把猪集中起来时，通常还可发现其它感染。在六周龄或更大的猪中常常观察到明显的疾病.感染猪的生长速度和饲料转化率显著降低。使用抗生素治疗贵并且需要长期使用。再感染也是一个问题。目前疫苗是避免感染及其影响的最有效方法。

目前市场上主要有4种商品化的PCV-2疫苗，梅里亚动物保健公司研发的PCV-2疫苗(Circovac)为全病毒灭活苗，适用于母猪免疫，该产品于2007年9月首次在欧洲获得批准文号，已在法国、德国和丹麦等国家进行了多次的田间试验。由于PCV-2难培养生长慢，考虑到病毒培养成本高周期长，人们又摸索出了一些新的方法来制备PCV-2仔猪用疫苗，主要包括两种类型：一类是亚单位疫苗，如勃林格殷格翰动物保健公司的PCV-2疫苗(CircoFlex)和英特威/先灵葆雅动物保健公司的PCV-2疫苗(Circumvent)，原理是将PCV-2基因组中编码免疫原性蛋白的ORF2片段插入到杆状病毒中，通过转染昆虫细胞获得重组杆状病毒，即可快速大量获得具备免疫原性的PCV-2核衣壳蛋白，再将其制备成疫苗，大量田间试验表明该类疫苗可为仔猪提供良好的免疫保护；另一类是嵌合全病毒灭活苗，原理是用PCV-2的ORF2片段置换不致病的PCV-1中的ORF2片段，即获得了PCV-1-PCV-2嵌合病毒，具有与PCV-2类似的免疫原性。富道动物保健公司研制的PCV-2疫苗(Suvaxyn PCV-2)即是采用了这种技术，最先认为该嵌合病毒可作为活苗应用，但试验中发现活苗中的嵌合病毒易被母源抗体中和，遂将其灭活制得PCV-1-PCV-2嵌合灭活苗，并于2006年在美国第1个获得了完整的许可证迄今，多批试验表明，嵌合病毒灭活苗可为猪群提供较好的免疫保护，特别在抑制病毒减少病毒血症方面具有显著的优势。

目前还没有国产的商品化猪支原体肺炎灭活疫苗，国外注册的Mhp灭活疫苗产品主要有法国梅里亚的BQ14株(猪克喘)、美国先灵葆雅(英特威)的J株(安百克)、西班牙海博莱生物大药厂的J株(喜可舒)、美国辉瑞(富道)的瑞富特、哈药集团生物疫苗有限公司的P-5722-3株(瑞倍适/瑞倍适-旺)、美国普泰克的P株以及P株复合佐剂灭活苗(喘泰克)以及勃林格殷格翰的J株(茵格发)。而且，目前在国内外也没有猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体的二联组合疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗及其制备方法，用于同时预防猪圆环病毒病及猪支原体肺炎。

技术方案

一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗，含有灭活的猪圆环病毒2型和灭活的猪肺炎支原体、疫苗佐剂及赋形剂；其中，猪圆环病毒2型含量至少为10^5.5TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。

优选地，本发明所述的猪圆环病毒2型含量为10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份。

优选地，本发明所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)、Gel 01(法国SEPPIC)、蜂胶、ISA206、ISA760VG。

优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)、Gel01、ISA206、ISA760VG。

优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)。

最优选地，本发明所述的二联灭活疫苗为含有猪圆环病毒2型10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体3×10⁹MHDCE/头份，卡波姆(Carbomer)10％V/V。

本发明的另一目的在于提供一种制备猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗的方法，包含以下步骤：分别培养猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型，将获得的猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型进行灭活、浓缩，获得猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒2型抗原，将上述两种抗原成分按比例混合，辅以疫苗佐剂制备成二联灭活疫苗。

优选地，本发明所述的二联灭活疫苗的制备方法中，所述的猪圆环病毒2型浓缩至含量至少为10^5.5TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体浓缩至含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。

优选地，本发明所述的二联灭活疫苗的制备方法中，所述的猪圆环病毒2型浓缩至含量为10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体浓缩至含量为3×10⁹MHDCE/头份。

优选地，本发明所述的二联灭活疫苗的制备方法中，所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)，含量为疫苗总量的10％V/V。

由上述技术方案及本发明的后续实施例可以看出，

本发明的二联灭活疫苗，无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都与市场上的商品单苗之和相当或更佳，两种抗原之间无相互干扰；

其次，本发明的二联灭活疫苗的免疫持续期长，效力持久，Mhp部分至少为180d，PCV2部分至少为120d，因此，可以获得更长的免疫周期；

最后，本发明的二联灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，既降低了成本，也减少了动物的应激反应。

附图说明

图1为本发明的二联灭活疫苗制备方法流程图。

菌株来源说明

本发明所选用的猪圆环病毒2型毒株为PCV-2b毒株SH株，已公开于中国专利文献CN101240264A，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.23890。

本发明所选用的猪肺炎支原体菌株为CVCC355株，购自中国兽药监察所。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1、猪圆环、肺炎支原体二联灭活疫苗的制备

1.菌(毒)株的来源

所选用的猪圆环病毒毒株为PCV-2b毒株SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.23890。

所选用的猪肺炎支原体菌株为CVCC355株，购自中国兽药监察所。

2.疫苗半成品的制备及检验

2.1生产用种子的制备

2.1.1猪圆环病毒2型的制备：将毒种用乳汉液作适当稀释，按5％接种于PK15细胞(购自中国兽药监察所)培养，37℃吸附30分钟，加入含4％体积犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒。

2.1.2猪肺炎支原体的制备：

一级种子的繁殖

冻干菌种，用液体培养基稀释，划线接种于固体培养基平皿上，置37℃培养7-10d，选择生长良好的菌落，接种于固体培养基斜面上，37℃培养7-10d，作为一级种子。

二级种子的繁殖

取少量液体培养基洗一级种子的斜面培养物，接种于液体培养基大管中，置37℃培养4-7d，经检验纯粹后作为二级种子。

液体培养基的配方(按1065ml计)：牛心浸出液300ml，ddH2O360ml，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank’s平衡盐溶液(10×)40ml，0.25％酚红10ml马血清200ml，5％水解乳蛋白100ml，25％酵母浸出液20ml，10000IU/ml青霉素10ml，1％醋酸铊溶液25ml。

固体培养基的配方：在液体培养基中加入15g Noble Agar即可。

2.2制苗用病毒液和菌液的制备

2.2.1猪圆环病毒2型病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞(购自ATCC)，倒去细胞培养液，将毒种液按0.1～0.2TCID₅₀/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存，应不超过2个月。

2.2.2猪肺炎支原体菌液的制备：

将液体培养基培养的猪肺炎支原体种子液以1∶10(容积比)接种于液体培养基中。37℃下培养3-6日，培养物下降0.5个pH值以上，纯粹检验合格后，再以同样的方式扩大培养(继代次不超过6代)。培养结束后，取样，根据《中华人民共和国兽药典(2010版)》中细菌类活疫苗纯粹检验方法进行纯粹检验，猪肺炎支原体菌液为纯粹。

2.3病毒液的处理

将猪圆环病毒2型SH株病毒液用中空纤维滤柱(孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。

2.4含量测定

2.4.1猪圆环病毒SH株病毒含量测定：将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO₂的温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV-2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。每ml病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀。

2.4.2猪肺炎支原体菌体含量测定：用PCR方法对培养物进行计数。10倍比稀释所检培养物，然后做PCR，PCR检出的最低限量为3X10^-3μg(相当于1000左右个菌体)，按稀释的倍数算出菌体数(沈青春，谭青松，王琴，等.PCR方法测定Mhp培养物菌数[J].中国预防兽医学报，2006，28(1)：55-57)。培养物含量应为1-2×10⁹MHDCE/ml。(MHDCE＝猪肺炎支原体DNA细胞等同物，即1MHDCE相当于1个猪肺炎支原体)。

2.5灭活

2.5.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将检验合格的步骤2.3处理过的病毒液加入10％甲醛溶液灭活，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，随即充分摇匀升温，当温度升至37℃时开始计时，保持18小时灭活完毕，加入0.2％的焦亚硫酸钠终止灭活，取样进行灭活检验。

2.5.2猪肺炎支原体菌液的灭活：将检验合格的猪肺炎支原体菌液，按菌液体积总量缓慢加入终浓度为0.2％的甲醛溶液(V/V)，放37℃灭活，其间每隔4小时搅拌一次，24小时后取出，进行灭活检验。

2.6灭活检验

2.6.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验：取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15-B1细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无CPE，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用IFA法检测，结果无绿色PCV-2阳性细胞产生。

2.6.2猪肺炎支原体菌液灭活检验：取灭活后菌液10ml接种于100ml液体培养基中37℃培养4-7d，再按相同比例移植于上述培养基100ml中37℃培养4-7d；另外，取灭活后菌液0.5ml接种于固体培养基，37℃培养7-10d。上述两种方法培养的结果均无菌生长。

2.7无菌检验取灭活过的病毒液和菌液，按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录169～171页进行，结果无菌生长。

2.8浓缩

2.8.1将猪圆环病毒2型SH株用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda道尔顿)作10倍浓缩。浓缩后含量为10^7.0TCID₅₀/ml。

2.8.2将猪肺炎支原体培养液用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda道尔顿)作20倍浓缩。浓缩后含量为3×10¹⁰MHDCE/ml。

3.配苗

3.1防腐剂的配制

1％(w/v)的硫柳汞水溶液和7％(w/v)乙二胺四乙酸四钠(EDTA)

3.2代谢油混合物配制

在900mL纯化水内溶解10g氯化钠、0.25g氯化钾、2.72磷酸氢二钠、0.25磷酸二氢钾、20mL PluronicL121(BASF Corporation)、40mLSqualane(Kodak)，3.2mLTween80，然后定容到1000ml。混合后，对所述成分进行高压蒸汽灭菌。然后匀浆所述混合物，直到形成稳定的乳浊液。加福尔马林达到0.2％(v/v)的终浓度。

3.3稀释剂的配制

无菌的PBS缓冲溶液，pH为7.4

3.4佐剂的配制

无菌的Carbopol 2％w/v水溶液

3.5将上述成分按下表所示比例进行混合，即通过无菌操作，将含量合格的猪圆环病毒2型SH株浓缩物、猪肺炎支原体浓缩物与所述佐剂、防腐剂和稀释剂混合加入装备有搅拌器的无菌容器，37℃搅拌30分钟，生产二联灭活疫苗。

本实施例中猪圆环病毒2型SH株灭活浓缩前含量为10^6.0TCID₅₀/ml；猪肺炎支原体灭活浓缩前含量为1.5×10⁹MHDCE/ml。

4.分装

无菌条件下以100ml/瓶，或20ml/瓶分装，盖上瓶塞，并压铝盖，获得二联灭活疫苗。猪肺炎支原体含量为3×10⁹MHDCE/ml；猪圆环病毒2型含量为10^6.0TCID₅₀/ml。

上述制备二联灭活疫苗的步骤，可以参考说明书附图1。

实施例2、实施例1中试制的二联灭活疫苗产品与两种单价灭活疫苗(猪肺炎支原体灭活疫苗或猪圆环病毒2型灭活疫苗)的免疫保护效果比较以及血清学效果评价

1材料实施例1中猪圆环2型病毒、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗试制品；猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903)；美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)(批号为100806)。

2动物试验设计

选21～28日龄断奶仔猪70头，分为7组，每组10头(见下表)；第1、2组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环、肺炎支原体二联灭活疫苗1ml；第3组每头猪分别颈部肌肉注射猪圆环病毒2型灭活疫苗1ml，免疫后14d再次接种1ml；第4组每头猪分别颈部肌肉注射猪肺炎支原体灭活疫苗；第5组颈部肌肉注射无菌PBS 1ml，14d再次接种1ml PBS；第6组颈部肌肉注射无菌PBS 1ml；第7组为空白对照，既不接种，也不攻毒，在单独房间饲养。在首次免疫后35d，用PCV-2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)对第3、5组猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml，攻毒后第4、7日，分别在第1、3、5组每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检，根据体温、相对日增重和临床症状判定保护情况；用猪肺炎支原体强毒CVCC354株(购自中国兽药监察所)对第2、4、6组猪攻毒，观察25d，无痛苦处死所有猪，取出肺，由不了解试验组的人员统计肺病变，判断保护情况。第7组为空白对照组，猪在首免后35d、60d称重，在60d剖检。

分别于接种后14d、21d、35d、60d对每头猪采血，收集血清，保存在-20℃直到测试。

注：

a、疫苗1为实施例1中猪圆环、肺炎支原体二联灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903)；疫苗3为美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)(批号为100806)。

b、KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂(ICFA)乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH)(含KLH为0.5mg/ml)，KLH及ICFA均购自Sigma公司。

c、Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。

3.结果和讨论

免疫保护效果：

3.1猪圆环病毒2型部分：如下表

注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等

体重变化：分别在攻毒前及宰杀时对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSSl7.0进行统计分析，结果表明疫苗1免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.61＞0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组(P＝0.022＜0.05)；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.54＞0.05)，也明显高于非免疫攻毒对照组(P＝0.022＜0.05)，疫苗1(二联灭活疫苗)增重比疫苗2要高。(注：P值来自于试验组和空白对照组的比较)。

病变观察和体重变化证明疫苗1，疫苗2对PCV2均有较好的免疫保护作用，效力相当或更佳。

3.2猪肺炎支原体部分：

注：P值来自于接种组与对照组的比较

对照组的平均肺病变是14.6％，疫苗1接种组的平均肺病变是3.6％，疫苗3接种组的平均肺病变是4.2％。疫苗1接种组(组别2)和对照组之间差异显著(P＝0.0215)，疫苗3接种组(组别4)与对照组之间亦差异显著(P＝0.031)，两者相当。疫苗1(二联灭活疫苗)接种组的平均肺病变比例更低，这表明：实施例1试制疫苗能有效刺激抵抗猪肺炎支原体的保护性免疫，与国外进口猪支原体肺炎灭活疫苗效力相当或更佳，有较好免疫保护作用。

血清学评价：

3.1猪圆环病毒2型部分：

ELISA抗体检测：用大肠杆菌表达的PCV-2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μl的0.15％BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1∶10000倍稀释)，100μl/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB显色，最后用2mol/L的H₂SO₄终止反应。结果判定：待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性。

血清中和试验：采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1∶2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID₅₀PCV2病毒液混合，37℃1h，接种于含单层PK15细胞的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80％丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

首免后14d，免疫组均能检测到PCV2抗体，首免后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1∶3200；中和抗体效价达到1∶32以上，两种抗体水

平基本一致，并能持续到60d，与攻毒保护水平呈正相关，表明疫苗1，疫苗2免疫动物后能够刺激机体产生PCV2特异性抵抗力，效果确实。

3.2猪肺炎支原体部分：

使用竞争性ELISA试剂盒(由IDEXX制造)检测抗猪肺炎支原体的血清杭体。

使用猪肺炎支原体商业化竞争性ELISA试剂盒测试试验中所有猪体内抗猪肺炎支原体的血清杭体，其中所有测定使用1∶10的血清稀释度。所有猪在接种时都是血清学阴性，这表明所有猪都对猪肺炎支原体敏感。对照组的所有猪在攻毒前保持血清学阴性，免疫组在攻毒前70％保持血清学阳性，免疫组内所有的猪和攻击对照组内60％猪在攻击后都转化为对猪肺炎支原体呈血清学阳性，而所有未受攻击的猪保持血清学阴性。

这表明疫苗1、疫苗3能刺激动物体产生抗猪肺炎支原体特异性抗体，与攻毒保护水平呈正相关，效力肯定。

实施例3、实施例1中试制产品的免疫持续期研究

1材料实施例1中猪圆环2型病毒、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗试制品；猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903)；美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)(批号为100806)

2动物试验设计

选21～28日龄断奶仔猪70头，分为7组，每组10头，分组处理情况参见下表：

注：

a、疫苗1为实施例1中猪圆环、肺炎支原体二联灭活疫苗试制品；疫苗2为猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，普莱柯生物工程股份有限公司生产(批号为100903)；疫苗3为美国先灵葆雅猪支原体肺炎灭活疫苗(J株)(批号为100806)。

b、KLH/ICFA为弗氏不完全佐剂(ICFA)乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH)(含KLH为0.5mg/ml)，KLH及ICFA均购自Sigma公司。

c、Thio为巯基乙酸培养基，购自Sigma公司。

3.结果和讨论

3.1免疫保护效果：

3.1.1猪圆环病毒2型部分：如下表

注：病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等

体重变化：分别在攻毒前(免疫后120d)及宰杀时(免疫后150d)对1、3、5、7组猪进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗1(组别1)免疫组猪相对日增重与空白对照组(组别7)相似(P＝0.55＞0.05)，明显高于非免疫攻毒对照组日增重(P＝0.028＜0.05)；疫苗2免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.38＞0.05)，也高于非免疫攻毒对照组(P＝0.028＜0.05)(注：P值来自于试验组和空白对照组的比较)。

病变观察和体重变化证明实施例1试制二联灭活疫苗(组别1)在免疫120d后对PCV2的攻击保护率达到90％；疫苗2(组别3)在免疫120d后对PCV2的攻击保护率达到70％。试制二联灭活疫苗在120d对PCV2的免疫保护强于疫苗2。

3.1.2猪肺炎支原体部分：

注：P值来自于免疫组与攻毒对照组的比较

攻毒对照组的平均肺病变是14.1％，免疫组的平均肺病变是5.2％，疫苗1(组别2)免疫组和对照组之间差异显著(P＝0.039)；疫苗3(组别4)免疫组和对照组之间差异亦显著(P＝0.041)。这表明：实施例1试制二联灭活苗和疫苗3在免疫180d后都能抵抗猪肺炎支原体的攻击，保护效果相当。

3.2血清学评价：

3.2.1猪圆环病毒2型部分：

ELISA抗体检测验与血清中和试验按照实施例1进行，结果如下表：

试制二联灭活苗(组别1)免疫后14d，免疫组即能检测到PCV2抗体；免疫后35d，免疫组ELISA抗体效价达到1∶3200；中和抗体效价达到1∶32以上，两种抗体水平均达到峰值；免疫120d后抗体水平稍有下降，但仍能达到保护水平；而疫苗2(组别3)免疫120天后ELISA抗体效价下降到1∶2400，中和抗体效价降到1∶28，抗体水平低于二联灭活苗(组别1)。表明实施例1试制二联灭活疫苗免疫动物120d后仍能够刺激机体产生保护水平的PCV2抵抗力，抗体水平高于疫苗2。

3.2.2猪肺炎支原体部分：

使用竞争性ELISA试剂盒(由IDEXX制造)检测抗猪肺炎支原体的血清杭体。

对照组的所有猪在攻毒前保持血清学阴性，攻毒后60％呈阳性；疫苗1免疫组35d后70％猪呈血清学阳性，疫苗3免疫组阳性率60％；疫苗1免疫组180d后90％呈血清学阳性，疫苗3免疫组为80％；而所有未攻毒的猪保持血清学阴性。

这表明实施例1试制二联灭活苗和疫苗3在免疫180d后均能刺激动物体产生抗猪肺炎支原体特异性抗体，抗体水平二联灭活苗略高于疫苗3，保护效果相当。

4.小结与讨论

试验结果表明，实施例1中试制二联灭活疫苗无论是从攻毒保护效果上，还是从血清学抗体水平上来看，其免疫效果都与市场上的商品单苗之和相当，两种抗原之间无相互干扰；其次，该二联灭活疫苗的免疫持续期更长，效力持久，对Mhp的免疫保护至少为180天，对PCV2的免疫保护至少为120天；最后，本发明的二联灭活疫苗只需一次免疫，即可达到分别免疫单苗的效果，且省去PCV2单苗免疫的复杂程序，耗时少，费力少，即降低了成本，也减少了动物的应激反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗，其特征在于，含有灭活的猪圆环病毒2型和灭活的猪肺炎支原体、疫苗佐剂；其中，猪圆环病毒2型含量≥10^5.5TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体含量≥2×10⁹MHDCE/头份。

2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型含量为10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体含量为3×10⁹MHDCE/头份。

3.根据权利要求1或2所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)、Gel 01(法国SEPPIC)、蜂胶、ISA206、ISA760VG。

4.根据权利要求3所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)、Gel01、ISA206、ISA760VG。

5.根据权利要求4所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)。

6.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述的二联灭活疫苗含有：猪圆环病毒2型10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体3×10⁹MHDCE/头份，卡波姆(Carbomer)10％V/V。

7.一种制备猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联灭活疫苗的方法，其特征在于，包含以下步骤：分别培养猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型，将获得的猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型进行灭活、浓缩，获得猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒2型抗原，将上述两种抗原成分按比例混合，辅以疫苗佐剂制备成二联灭活疫苗。

8.根据权利要求7所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型浓缩至含量至少为10^5.5TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体浓缩至含量至少为2×10⁹MHDCE/头份。

9.根据权利要求7所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型浓缩至含量为10^6.0TCID₅₀/头份，猪肺炎支原体浓缩至含量为3×10⁹MHDCE/头份。

10.根据权利要求7所述的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)，含量为疫苗总量的10％V/V。