CN109055412A

CN109055412A - 一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN109055412A
Application number: CN201810897977.6A
Authority: CN
Inventors: 卢强; 徐高原; 周明光; 陈波; 张华伟; 郝根喜; 王凤
Original assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Current assignee: WUHAN KEQIAN BIOLOGICAL Co Ltd
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2018-12-21
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN109055412B

Abstract

本发明属于疫苗生产技术领域，具体公开了一种猪圆环病毒‑肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法。所述制备方法包括如下步骤：(1)将编码猪肺炎支原体膜蛋白P36、P46、P65、P97，Lppt、P146的6个编码基因分为2组，构建2种嵌合基因分别含有上述2组编码基因，分别构建入表达载体中；(2)将猪圆环病毒Cap蛋白的编码基因构建入表达载体中；(3)将上述含有不同基因的表达载体构建到工程菌中，表达2种嵌合基因得到2种融合蛋白，以及表达猪圆环病毒Cap蛋白；(4)利用表达的蛋白制备猪圆环病毒‑肺炎支原体二联亚单位疫苗。本发明通过将猪肺炎支原体的多个蛋白进行融合，大大缩短生长周期和降低生产成本。

Description

一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗生产技术领域，具体地说，涉及猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(PCV2)感染可以引起仔猪断奶后多系统衰竭综合症(PMWS)，此病主要发生于6～15周龄的断奶仔猪，病理特征是淋巴组织中淋巴细胞缺失、炎性粒细胞浸润等。此外，猪圆环病毒2型感染也可以导致猪皮炎与肾病综合症、母猪繁殖障碍、增生性坏死性肺炎、仔猪先天性震颤等。PCV2还可与猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)等病原体混合感染，引起猪呼吸道疾病综合征，增加了疾病诊断、预防和控制的难度。因此，如何有效控制猪圆环病毒病意义重大。

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)可引起猪支原体肺炎，又称地方流行性肺炎，是猪的一种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。其主要症状为咳嗽和气喘，以高发病率和低死亡率为特点。猪群一旦感染Mhp，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV、PCV等，从而导致多种疫苗接种失败。猪肺炎支原体作为猪呼吸道病综合征的重要病原之一，多呈地方性流行，直接或间接对养猪业造成了巨大的经济损失。因此，在临床上控制猪肺炎支原体病不仅对该病本身而且对其它疾病的控制都十分重要，为提高猪群整体健康水平提供了保障。

目前世界范围内预防猪支原体肺炎的商用猪肺炎支原体疫苗均为肺炎支原体全菌灭活苗，预防猪圆环病毒的疫苗主要有灭活苗和亚单位疫苗，大部分亚单位疫苗抗原蛋白由杆状病毒表达。

由于猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种，并且培养周期长，培养过程中极易污染猪鼻支原体，猪絮状支原体等，使得肺炎支原体全菌灭活苗生产成本居高不下。虽然杆状病毒表达系统表达蛋白具有翻译后修饰系统，利用杆状病毒在昆虫细胞中表达外源基因，能进行翻译后的修饰、蛋白质的正确折叠和糖基化，对表达的真核基因产物能更好地进行磷酸化、脂肪酶化、酞胺化、切割信号肽以及形成三级或四级结构等优点，但其存在生产成本高，步骤多，周期长，生产质量不易控制等缺点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将编码猪肺炎支原体(J株，NCBI登录号：NC_007295.1)膜蛋白P36、P46、P65、P97，Lppt、P146的6个编码基因分为2组，每组3个；

构建2种嵌合基因，所述嵌合基因分别含有上述2组编码基因；

将所述2种嵌合基因，分别构建入表达载体中；

(2)将猪圆环病毒Cap蛋白的编码基因构建入表达载体中；

(3)将上述含有不同基因的表达载体构建到工程菌中，表达相应蛋白，即表达2种嵌合基因得到2种融合蛋白，以及表达猪圆环病毒Cap蛋白；

(4)利用表达的蛋白制备猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗。

所述疫苗以上述工程菌表达得到的3种蛋白(2种融合蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白)为免疫抗原。

作为优选，步骤(1)中，将P36、P46、P65分为一组，将P97、Lppt、P146分为另一组。

本发明所述方法中，所述工程菌为大肠杆菌或毕赤酵母，优选为大肠杆菌。

在本发明的具体实施方式中，以大肠杆菌为例进行示例性说明。本发明使用大肠杆菌表达系统来代替现有技术中的杆状病毒表达系统，提高表达量，缩短生产中细胞培养周期，降低培养做成中易污染的风险。

进一步优选，步骤(1)中所述的2种嵌合基因中还包含大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因。即，嵌合基因表达的融合蛋白中，既包括大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB，又包括猪肺炎支原体的3种膜蛋白。

进一步地，所述嵌合基因表达的融合蛋白中，大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB、P36、P46、P65之间，和/或大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB、P97、Lppt、P146之间以柔性linker相连。

本发明经实验研究发现，P65为脂蛋白可溶性较差，P46可溶性最好，P36的次之。因此，作为优选，将P65夹在中间，可提高整个融合蛋白的可溶性，即LTB-P36-P65-P46或LTB-P46-P65-P36。

P97蛋白较小，为了避免其在融合蛋白的中间导致其抗原表位被屏蔽，故将P97放置在N端。经实验对比P97-Lppt-P146和P97-P146-Lppt，发现P97-P146-Lppt结构下P146的抗体水平比P97-Lppt-P146结构下P146的抗体水平弱，而P97和Lppt抗体水平无差别，故优选融合蛋白为LTB-P97-Lppt-P146结构。

其中，所述柔性linker优选为(Gly4Ser)3。

更为优选地，所述2种嵌合基因表达的融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，表达的猪圆环病毒Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，将工程菌表达的蛋白，经过纯化，与本领域常规疫苗佐剂，按照制备相应疫苗的常规方法完成后续步骤即可。

本发明通过将猪肺炎支原体的多个蛋白用较长且柔软的柔性Linker(Gly4Ser)3连接，在复性时能够降低融合蛋白的两组份间的空间位阻，从而更有利于融合蛋白各个结构域的正确折叠，并使得各个蛋白互不影响，均能保留各自的免疫原性。

本发明还利用基因工程手段，在基因水平上将猪肺炎支原体的3个抗原基因进行密码子优化，并进行融合，在大肠杆菌中取得有效的可溶性表达，使一个融合蛋白可以起到原来3个抗原蛋白的作用，大大缩短生长周期和降低生产成本。

不仅如此，本发明还通过给融合蛋白添加小分子大肠杆菌肠毒素粘膜免疫佐剂LTB(De HL et al.,2010)，大大增强疫苗的粘膜免疫保护效果。

最终，猪肺炎支原体的抗原蛋白和猪圆环病毒Cap蛋白混合配苗免疫动物时相互之间的抗体反应不相互影响。

因此，由本发明所述方法制备得到的猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗，也属于本发明的保护范围。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

附图说明

图1为本发明的工作流程图。

图2为重组质粒pET28a-Fusion1、pET28a-Fusion2、pET28a-ORF2的PCR鉴定；其中，M1：15000DNA marker；M2：2000Plus DNA marker；1：P36；2：P46；3：P65；4：Fusion1；5：LTB；6：P97；7：Lppt；8：P146-Tr；9：Fusion2。

图3为Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白SDS-PAGE和Western blot检测；其中，M：Protein stander；1：Fusion1蛋白SDS-PAGE检测；2：Fusion2蛋白SDS-PAGE检测；3：Fusion1蛋白anti-his Western blot检测；4：Fusion2蛋白anti-his Western blot检测；5：Cap蛋白SDS-PAGE检测；6：Cap蛋白anti-his Western blot检测。

图4为E.coli BL21(DE3)表达Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白稳定性检测；其中，M：蛋白质Marker；F1、F7、F15:分别为F1、F7和F15代表达产物；A：Fusion1蛋白(140kDa)；B：Fusion2蛋白(117kDa)；C：Cap蛋白(28kDa)。

图5为Cap蛋白病毒样粒子的电镜观察。

图6为ELISA法检测融合蛋白Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗对小鼠的免疫原性试验。

图7为ELISA法检测融合蛋白中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对神经节苷脂GM1的结合作用。

图8为融合蛋白Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗猪中消长规律试验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 一种基于大肠杆菌表达系统的支原体抗原融合蛋白及猪圆环病毒Cap蛋白表达载体的构建

一、表达载体构建和鉴定

1、大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因的获得

参照大肠杆菌LTB基因序列(WP_012846869.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性人工合成390bp的LTB基因序列。

2、支原体主要免疫原性基因P36、P46、P65、P97、P146、Lppt的获得及载体构建。

参照Mhp(J株NC_007295.1)的基因组序列，分别设计P36、P46、P65、P97、P146、Lppt等免疫原性蛋白的全基因序列或者部分基因序列的引物扩出相应的序列，并依据Over-lapping PCR方法，加上大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因，将LTB(LTB-F：GCGGATCCATGgagatataccggatccatgccccagtctattacagaacta；LTB-R：tctaagcatttttttgttttccatactgattgccgcaatt)、P36(P36-F：gataatcctgatgccaaacctattaaaatagctctaattg；P36-R：GGAAGCTTTCAttctcttttaccttcaatatttttaattgcatcctgataa)、P46(P46-F：atcagtatggaaaacaaaaaaatgcttagaaaaaaatttt；P46-R：tattttaataggtttggcatcaggattatcaacattagct)、P65(P65-F：acaaatcttgataatttaattaaagaa；P65-R：gtttgatttagaatcggtacttgattgctc)融合为一个嵌合基因LTB-P46-P65-P36，将LTB(LTB-F：GCGGATCCATGctttaagaaggagatataccatgaataaagtaaaatgttatgttt；LTB-R：ttcaggcttagctgcaactggctttgccgcgttttccatactgattgccgca)、P146(P146-F：acaacaaaaccagtagcggctaaacctgtagctaagaataataagaattcat；P146-R：GGAAGCTTTCAaactggctttgccgctactggtttggttgtagctgacacacttgctttaa)、P97(P97-F：ccgggccagcccccagcagcaaaaccagaa；P97-R：gtcaggaaggtaattagttaattcggtagttgggctttgt)、Lppt(Lppt-F：gcagctaagcctgaagcagcaaaaccagtatttattcaaaaatcagtgccaaa；Lppt-R：tactggttttgttgtttcaggcttagctgcatcaaggaataaatcggtatttg)融合为一个嵌合基因LTB-P97--P146-Lppt，通过引物在基因片段的上下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，同时在C端引物6×His标签序列，将上述序列克隆入载体pET28a中获得重组质粒分别命名为pET28a-Fusion1、pET28a-Fusion2。

Fusion1[LTB-P46-P65-P36]和Fusion2[LTB-P97-Lppt-P146]的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3、猪圆环病毒ORF2基因序列的获得

参照圆环病毒ORF2基因序列(AGQ51994.1)，根据大肠杆菌密码子的偏好性人工合成699bp的ORF2基因序列。

4、猪圆环病毒ORF2基因Cap蛋白表达载体构建

根据大肠杆菌密码子的偏好性人工合成699bp的ORF2基因序列，设计引物(ORF-F：GCGGATCCATGacctacccgcgtcgtcgtttccgtcgt；ORF-R：GGAAGCTTTCAgtgatggtggtgatgatgtttcgggttcagcggcgggtctttca)通过引物在基因片段的上下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，同时在C端引物6×His标签序列，将上述序列克隆入载体pET28a中获得重组质粒pET28a-ORF2，猪圆环病毒PCV2的Cap蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

5、重组质粒pET28a-Fusion1、pET28a-Fusion2、pET28a-ORF2的PCR鉴定

将获得的载体通过首位引物进行PCR鉴定，结果如图2所示。

表1 PCR反应体系

相关的正向引物和反向引物为融合基因的首位引物。模板为重组质粒。

PCR反应条件为：98℃预变性5min；98℃变性15Sec，58℃退火15Sec，72℃延伸25Sec，25个循环；4℃∞。

PCR结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR电泳结果显示，PCR得到预期的嵌合基因LTB-P46-P65-P36(3858bp)片段和嵌合基因LTB-P97-Lppt-P146(3021bp)片段，大小与预期大小一致，表明嵌合基因LTB-P46-P65-P36，LTB-P97-Lppt-P146已经成功插入pET28a中。

二、目的蛋白的表达、纯化及检测

1、转化表达菌株BL21(DE3)

重组质粒pET28a-Fusion1、pET28a-Fusion2、pET28a-ORF2转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。

在上述冰上放置5min的EP管内加Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞50μL，轻柔混匀，冰浴30min。42℃热击45s，迅速冰浴2-3min。加入200μL NZY液体培养基，37℃，250rpm摇床培养1h。取菌液涂于添加了卡那抗生素的LB平板，37℃倒置培养。

2、嵌合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白的表达

新鲜活化的平板上挑单菌落接于5ml/25ml LB+Kan50μg/mL，37℃180rpm震荡培养15h，此为一级种子。取一级种子4mL接种于200mL LB加卡那抗生素的培养基(1000mL锥形瓶，卡那抗生素终浓度为50μg/mL)，37摄氏度，180rpm培养1.5-2h至菌体OD＝0.5-0.6.加IPTG至终浓度为0.2mM，37摄氏度，160rpm诱导培养5h。

3、嵌合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白的纯化和检测

6000rpm离心5min收集菌体，10倍体积浓缩的生理盐水重悬菌体。压力破碎后12000rpm离心2min，离心取上清经Ni柱纯化后用Bradford法进行蛋白浓度测定并进行SDS-PAGE和anti-his Western blot检测。检测结果如图3。

4、重组大肠杆菌表达Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白稳定性检测

采用同步接种法在LB固体培养基上将每种重组菌株连续传15代，分别挑取第1、7和15代单菌落于LB液体培养基，置37℃培养，在培养基中加入适量的IPTG诱导蛋白，诱导12h后，采用压力破碎的方法将菌体裂解，14000rpm/min离心，取上清液进行SDS-PAGE，检测蛋白表达情况。结果表明(图4)，菌种连续传代15代，仍能稳定的表达目的蛋白。

实施例2本发明的融合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白制备的亚单位疫苗与动物实验

1、本发明的融合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白制备的亚单位疫苗

将纯化的Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白测定浓度后与MontanideTM Gel o1佐剂(购置SEPPIC)乳化制备成亚单位疫苗，使其每毫升中各蛋白浓度均为150微克，用于以下实施例，放置4℃存储。

2、本发明的融合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白制备的亚单位疫苗技术指标的检验

(1)物理性状

外观本品为乳白色均匀乳剂。剂型为单向剂型(水包油)，取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，水面和水内都有。粘度用出口径为1.2mm吸管吸取疫苗1ml在25℃左右的室温下，令其垂直流出，在8秒钟内流出0.5ml，是合格的。

(2)无菌检验

按照《中国兽药典》附录169-171页进行，结果表明没有细菌生长。

(3)安全检验

接种16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3ml，观察14天，结果表明该疫苗对小鼠是安全的。

接种1.5-2.0kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5ml，观察14天，结果显示该疫苗对家兔是安全的，无不良反应。

3、Cap蛋白病毒样粒子的电镜观察

将纯化的Cap目的蛋白进行透析去咪唑，透析液成分(150mM NaCl、50mM Tris、pH8.0)。然后放入VLP组装液里面进一步透析组装，组装液的成分(0.1M NaH₂PO₄、0.1MNa₂HPO₄、10mM Tris、500mM NaCl、500mM KCl、2mM MgCl₂、0.1mM柠檬酸铵、5％甘油、pH6.5)。组装12h左右，中间3-4h换一次组装液。将目的蛋白铺于40％的蔗糖溶液上，35，000rpm/min，超速离心6h后，将沉淀重悬于双蒸水中，然后通过磷钨酸负性染色，利用H7000透射电子显微镜进行观察。在电子显微镜下可以看到病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)的存在，呈典型的二十面体，无囊膜，直径为17nm左右，其形态大小均与全病毒粒子相似，如图5所示。

4、融合蛋白Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗对小鼠的免疫原性试验

为了检测Fusion1、Fusion2融合蛋白是否仍然具有其各自的P36、P46、P65、P97、P146、Lppt蛋白所具有的的免疫原性，购买6-8周龄的雌性小鼠20只，随机分成9组，每组2只。P36、P46、P65、P97、P146、Lppt、Cap等9个抗原蛋白各2只，PBS负对照2只。每只小鼠背部皮下注射200微升，2周后加强免疫一次。加强免疫2周后，断尾采血。用P36、P46、P65、P97、P146、Lppt、Cap蛋白进行包被做ELISA，用Fusion1、Fusion2抗原蛋白及负对照PBS免疫的血清100稀释后作为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:5000稀释)作为二抗，检测小鼠体内的抗体反应，结果如图6所示。

4、ELISA验证融合蛋白中大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对神经节苷脂GM1的结合作用

LTB通过其上的神经节苷脂(Gan4ioside，GMl)结合受体而使全毒素黏附于真核细胞上，产生强烈的免疫反应，从而发挥其佐剂功能。参考Grassmann AA，S R，dosSantos C X，et al.2012.的方法。首先用100ng/孔的牛神经节苷脂GM1包板，BSA封闭后，100ng/孔的Fusion1、Fusion2融合蛋白孵育，然后用Fusion1、Fusion2蛋白的鼠血清(1:100)孵育，后用羊抗鼠IgG-HRP(1:5000)孵育，最后进行显色反应，结果如图7所示。

6、融合蛋白Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗对猪的抗体反应及攻毒保护试验

为了进一步评价上述制备亚单位疫苗对本动物猪的免疫效力，选取约2月龄支原体-圆环阴性猪40头，随机分成8组，每组5头。如表2所示。分别为Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗组1，Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗组2，Fusion1、Fusion2亚单位疫苗组3，Cap亚单位疫苗组2，商品化普泰克圆环-支原体正对照组5，商品化普泰克圆环-支原体正对照组6，空白对照组7，空白对照组8。每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次。首免后14，28，42天进行前腔静脉采血，评价其免疫效果。首免42d，分别进行猪支原体和圆环病毒攻毒试验。并对该亚单位疫苗对猪的抗体反应及攻毒保护进行评价。

7、融合蛋白Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗对猪的抗体消长规律试验

为了进一步评价上述制备亚单位疫苗对本动物猪的抗体消长规律，选取约2月龄支原体-圆环阴性猪10头，随机分成2组，每组5头。分别为Fusion1、Fusion2、Cap亚单位疫苗组，空白对照组疫苗。每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次。首免后14，28，42，56，70，84天进行前腔静脉采血，ELISA测其每个抗原蛋白引起的抗体水平，评价其抗体持续期及消长规律(图8)。

(1)ELISA法评价抗体反应

首免后14、28、42、56、70、84天进行前腔静脉采血，37℃放置2h，后4℃静置2h，5000rpm离心5min取上清置于-20℃保存备用。P36、P46、P65、P97、P146、Lppt、Cap等7个抗原蛋白包板子，猪血清(1:100)作为一抗37℃孵育2h，PBST洗3遍后，羊抗猪IgG-HRP(1:5000)作为二抗37℃孵育2h，PBST洗3遍后进行显色反应。

(2)猪支原体攻毒试验

采血完成后，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

(3)猪支原体肺炎判定标准

攻毒后，全部猪每天都要监测和检查疾病的临床症状。在攻毒第1天后的特定时间，无痛处死全部猪并作尸检。取出肺并进行评测。尸检测定包括评估支原体呼吸系统疾病相关的病理程度。每一片肺叶都要检测，并画出病灶的草图以评估其占每片肺叶的百分比。并记录总的病灶程度。根据猪肺炎支原体感染的典型肺病灶百分比来评估功效。每片肺叶的百分数用下面的单个肺叶与肺总质量的比例来加权平均：左头叶10％，左中叶10％，左尾叶25％。右头叶10％，右中叶10％，右尾叶25％，其他为10％。然后将加权的肺叶值相加即可得出总病变肺百分率(Pointon等，1992)。

(4)猪圆环病毒攻毒试验

采血完成后，以第8组为空白对照组(非免疫非攻毒)，对免疫攻毒组(第2组、第4组、第6组)分别进行攻毒，每头猪均经滴鼻和肌肉接种各2.5ml猪圆环病毒2型WH株(病毒含量为1.0×107TCID50/ml)。于攻毒当日，称量所有仔猪体重。并于攻毒前3日(即二免后11日)和攻毒后3日、6日，所有攻毒组仔猪均注射免疫刺激材料(弗氏不完全佐剂制备的多孔血蓝蛋白乳剂)，每次每头肌肉注射4.0ml。攻毒后28日，再次称量所有仔猪体重；采集所有仔猪血液，分离血清，用PCR检测法检测PCV2病毒血症；剖杀所有仔猪，取腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结，进行免疫组织化学检测。记录各项试验结果并统计各组发病情况。

(5)猪圆环病毒病判定标准

PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。

A.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；

B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；

C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。

实施例3本发明的融合蛋白Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白制备的亚单位攻毒保护效果

1、Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白亚单位疫苗制备和免疫

在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的Fusion1、Fusion2以及Cap蛋白。然后加入pH为7.2的PBS液38ml，最后加入Gel01佐剂10ml(法国赛比克SEPPIC公司生产)，使三种抗原蛋白的含量分别为150微克/ml，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。

免疫及攻毒情况如表2。

表2疫苗免疫及攻毒分组

2、猪肺炎支原体攻毒结果

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表3。结果表明，疫苗1、疫苗3、疫苗5平均肺病变指数分别为4.0、4.2和4.1，疫苗7对照组攻毒后仔猪肺病变比疫苗1、疫苗3和疫苗5免疫组仔猪肺病变明显；攻毒后到观察结束时疫苗1、疫苗3和疫苗5免疫仔猪的平均日增重显著高于疫苗7空白组仔猪(表4)。疫苗1、疫苗3和疫苗5免疫后攻毒达5/5和4/5的免疫保护效果，疫苗7空白组免疫后攻毒保护效果均为0/5。

本发明所使用的猪肺炎支原体Fusion1、Fusion2亚单位疫苗3，无论制备成单苗还是与PCV抗原一起制备成联苗1，均表现出良好的免疫原性，与普泰克商品化猪圆环支原体疫苗5比较试验结果表明，猪肺炎支原体Fusion1、Fusion2亚单位疫苗以及和PCV2抗原一起制备成联苗的对猪肺炎支原体CVCC354的免疫攻毒保护效果均优于普泰克商品化猪圆环支原体疫苗5。

表3 猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

疫苗组别	仔猪头数	平均肺病变指数±标准差
			1	5	4.00±0.54<sup>Bb</sup>
3	5	4.20±0.49<sup>Bb</sup>
			5	5	4.10±0.53<sup>Bb</sup>
7	5	16.00±0.69<sup>Aa</sup>

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)

表4 猪肺炎支原体攻毒保护情况

2、猪圆环病毒攻毒结果

(1)体温情况

PCV攻毒后，体温变化情况见表5，疫苗2、疫苗4、疫苗6免疫组仔猪仅有个别猪只出现一过性体温升高现象，体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；对照组8猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。

本发明所使用的猪圆环病毒Cap蛋白亚单位疫苗4，无论制备成单苗还是与猪肺炎支原体Fusion1、Fusion2抗原一起制备成联苗2，均表现出良好的免疫原性，与普泰克商品化猪圆环支原体疫苗6比较试验结果表明，猪肺炎支原体Fusion1、Fusion2亚单位疫苗1以及和PCV2抗原一起制备成联苗的对猪肺炎支原体CVCC354的免疫攻毒保护效果和普泰克商品化猪圆环支原体疫苗8无显著差异。

表5 PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较

(2)攻毒后发病及保护情况

攻毒后发病及保护情况见表6、7。疫苗2、疫苗4和疫苗6免疫仔猪攻毒后无明显临床症状，未观察到特异性病理变化，抗原PCR检测均为阴性，保护效果达5/5；而对照组8仔猪全部发病，临床症状，病理变化明显，病原PCR检测均为阳性。至攻毒观察结束，疫苗2、疫苗4和疫苗6免疫仔猪平均日增重无显著差异，与对照组8相比，疫苗2、疫苗4和疫苗6免疫仔猪平均日增重均极显著高于对照组8。表明亚单位疫苗单苗4亚单位疫苗联苗2和商品化疫苗疫苗6一样，对PCV的攻毒保护效果良好。

表6 PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果

表7 免疫仔猪PCV攻毒后保护情况

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05).

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗及其制备方法

<141> 2018-07-30

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims

1.一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

(1)将编码猪肺炎支原体膜蛋白P36、P46、P65、P97，Lppt、P146的6个编码基因分为2组，每组3个；

将所述2种嵌合基因，分别构建入表达载体中；

(2)将猪圆环病毒Cap蛋白的编码基因构建入表达载体中；

(3)将上述含有不同基因的表达载体构建到工程菌中，表达相应蛋白；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将P36、P46、P65分为一组，将P97、Lppt、P146分为另一组。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌或毕赤酵母。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的所述嵌合基因还包含大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB基因。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述嵌合基因表达的融合蛋白中，大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB、P36、P46、P65之间，和/或大肠杆菌不耐热性肠毒素LTB、P97、Lppt、P146之间以柔性linker相连。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述柔性linker为(Gly4Ser)3。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，2种嵌合基因表达的融合蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，将工程菌表达的蛋白纯化后，与疫苗佐剂混合。

9.一种猪圆环病毒-肺炎支原体二联亚单位疫苗，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到。