CN104338125A - 一种猪肺炎支原体抗原在预防和治疗猪呼吸道疾病综合征方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪肺炎支原体抗原或含该抗原的免疫原性组合物在预防及治疗猪PRDC以及有与PRDC相关的临床迹象的疾病中的应用，其中，该应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原或含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物免疫猪。利用该含猪肺炎支原体抗原的疫苗对动物进行疫苗接种可显著减轻和降低PRDC相关临床迹象的严重性和持续时间。

Description

一种猪肺炎支原体抗原在预防和治疗猪呼吸道疾病综合征方面的应用

技术领域

本发明涉及一种猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）抗原或包含该猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物在预防及治疗猪的猪呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）方面的应用。

背景技术

PRDC主要见于生长至肥育猪（通常约为16至22周龄）中。发病率在30%-70%范围内，其中平均死亡率为4%-6%（Kim等人，VeterinaryJ.,2003;166:251-256)。PRDC的临床迹象有十多种，包括难以用抗生素疗法治愈的长期且异常严重的咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食及在肥育中期至后期死亡率显著增加等。这些临床迹象与多种不同病原体有关,常见的病原体包括猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体（Mhp）、猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、多杀性巴氏杆菌（PM）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、支气管败血性博德特氏菌、猪鼻支原体和多杀巴斯德氏菌等。

一般来说，一种病原体对PRDC等多因素疾病的影响难以预测，可以没有影响，但是也可以发生转移、抑制、替代、覆盖或加强其它病原体对多因素疾病的临床迹象的表现、严重性及延长的影响。例如，如果多因素疾病（如PRDC）存在两种以上的病原体，则其中之一病原体的减少或消除可能对该多因素疾病的临床症状无影响，但也可能显著减少该多因素疾病的临床症状。多因素疾病所涉及的病原体种类愈多，则其中仅一种病原体的减少或消除对该疾病的临床症状的持续时间、严重性等正面影响的期望愈低。

猪肺炎支原体是一种引起猪支原体肺炎（Mycoplasma pneumonia ofswine，MPS）的细菌性病原体，存在于病猪的呼吸道（咽喉、气管、肺组织）、肺门淋巴结和纵膈淋巴结中，具有多形性，其中常见的有球状、环状或椭圆形。猪肺炎支原体很容易通过呼吸道分泌物以及通过母猪-猪仔传递而进行传播，并在猪场中大规模流行。

如前所述，PRDC是一种多因素疾病，猪肺炎支原体作为PRDC的常见病原体之一，其减少或消除对PRDC的临床迹象的影响是难以预期的。

现有技术中有关猪肺炎支原体疫苗的专利大多涉及疫苗的制备方法或使用方法，如公开号为CN1551781A的专利公开了一种单剂量猪肺炎支原体疫苗、公开号为CN101420975A的专利公开了一种抗支原体和PRRSV的疫苗、公开号为CN102872456A的专利公开了一种用于约3-10日龄动物的单剂量猪肺炎支原体疫苗，但均未见到有关含猪肺炎支原体疫苗应用于预防和治疗患有PRDC的猪只（群）以及相关预防和治疗功效的报导，尤其是应用于PRDC流行的Mhp阳性猪。

发明内容

本发明人意外发现，用猪肺炎支原体抗原免疫预防或治疗受威胁或受感染的PRDC的猪，猪的PRDC的临床迹象的严重性及持续时间可显著减轻及降低。换言之，用猪肺炎支原体抗原来免疫预防及治疗PRDC的猪对猪的整体健康、肥育期间的体重增加及猪肥育中期至晚期的死亡率具有明显的正面影响。而患PRDC的猪的所述健康状况（如整体健康、体重增加、死亡率等）受猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流感病毒、支气管败血性博德特氏菌、猪鼻支原体和/或多杀巴斯德氏菌等其他多种病原体的负面影响是众所周知的。

因此，本发明的主要目的在于提供一种猪肺炎支原体抗原或含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物在预防和治疗猪PRDC以及有与PRDC相关的临床迹象的疾病中的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原或含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物免疫所述猪。

本发明中术语“免疫原性组合物”或“疫苗”（两种术语系同义使用）系指含有猪肺炎支原体抗原的任何药物组合物，涵盖全灭活、减毒和/或失活等任何类型的含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物。该免疫原性组合物可诱发、刺激或增强猪只针对猪肺炎支原体的免疫反应。

“免疫反应”意谓（但不限于）含有抗原的免疫原性组合物或疫苗施用于动物后在宿主中引发的抗目标抗原、免疫原性组合物或疫苗的致敏T细胞介导的细胞免疫反应和抗体介导的体液免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下一种或多种免疫效应：特异性针对目标组合物或疫苗中所包括之一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒T细胞的产生或活化。由此，宿主将显示治疗性或保护性免疫学（记忆）反应以实现宿主对新感染之抗性的增强和/或疾病之临床迹象严重性的降低。此免疫保护作用将由猪肺炎支原体感染的数目、临床迹象严重性的降低或者一种或多种与猪肺炎支原体感染相关之临床迹象的缺乏及肺部病变得分来证实。

优选地，所述免疫包括一次免疫或二次免疫，二次免疫包括首次免疫和二免。

更优选地，所述猪一次免疫或首次免疫时为2～3周龄，所述二免与所述首次免疫时间间隔2周。

优选地，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体全病原抗原、减毒的猪肺炎支原体全病原抗原或猪肺炎支原体亚单位抗原。所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫反应。

优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体，优选为灭活形式。

更优选地，所述猪肺炎支原体为灭活的猪肺炎支原体HN0613株。猪肺炎支原体HN0613株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230。

所述猪肺炎支原体还可以为本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。正如本领域技术人员所知，同种微生物不同的野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使与此野外分离株的基因序列非百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变，即满足一定同源性的不同来源的野外分离株的生理功能基本相同。目前国际上常使用16S Ribosomal RNA（16S rRNA）来进行细菌型的分辨和同源性比较，通常认为16S rRNA序列同源性大于97%的两株细菌即可确定为同一种，其生理功能等主要性状相同或相似。所以本发明可使用的支原体抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株。

优选地，所述免疫原性组合物包含佐剂，所述佐剂为Gel 01（法国SCIPPIC）、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆（Carbomer）、蜂胶、ISA206（法国SCIPPIC）、ISA760VG（法国SCIPPIC）中的一种或几种的组合物。所述佐剂能够增强猪肺炎支原体的免疫原性和功效。

更优选地，所述佐剂为卡波姆（Carbomer）（商品名Carbopol）、Gel01（法国SCIPPIC）、铝胶中的一种或几种的组合物。

最优选地，所述佐剂为Gel01（法国SCIPPIC）。

优选地，所述猪肺炎支原体抗原的含量为2×10⁸CCU/头份。

优选地，所述猪为猪肺炎支原体阳性的猪。

优选地，所述与PRDC相关的临床迹象包括自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食或在肥育中期至后期死亡率显著增加。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明。这些实施例仅是举例说明，不应被视为对本发明总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中以猪肺炎支原体HN0613株为例说明本发明。

菌株的来源：本发明所选用的猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp）菌株为HN0613株，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期：2012年6月25日，保藏号为CCTCC No.M2012230。

本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0%时，记为0分，1%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，大于75%为4分。

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

本发明中所用的pH7.2的PBS液配方为：1000ml蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O 6g和NaH₂PO₄.2H₂O 0.4g。本发明中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

实施例1 猪肺炎支原体抗原的制备

1、猪肺炎支原体种子的制备

冻干菌种启封后，按10%（V/V）接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检验，作为一级种子。取一级种子按5%（V/V）接种量接种于液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检验，作为二级种子。

液体培养基的配方：牛心浸出液（BD公司）300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4，121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份：Hank′s平衡盐溶液（10×）40m1，0.25%（W/V）酚红10m1，马血清200m1，5%（W/V）水解乳蛋白100m1,25%（W/V）酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。

2、猪肺炎支原体菌液的制备

将猪肺炎支原体HN0613株的二级种子按5%（v/v）接种于液体培养基（配方同上述步骤1所述）中，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获。

3、猪肺炎支原体菌液的浓缩

将猪肺炎支原体HN0613株菌液用密理博（Millipore公司）膜包（分子截留量为300Kda道尔顿）作5倍（体积比）浓缩，然后用同样的方式对其进行10倍（体积比）浓缩。

4、猪肺炎支原体的菌液活菌计数测定

将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待检培养物接种至第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13支小试管为对照管，置37℃摇振培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值。浓缩后的测定含量为1×10⁹CCU/ml。

5、猪肺炎支原体菌液灭活和检验

向上述制备的猪肺炎支原体菌液中按0.3％（V/V）的比例加入甲醛溶液，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。

取1ml灭活菌液接种于50ml液体培养基中，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察11日，培养基pH值不降低，培养基着色不发生变化。结果表明猪肺炎支原体菌液完全灭活。

实施例2 猪肺炎支原体疫苗的配制

疫苗具体配方如表1。

表1 疫苗具体配方

具体配置过程如下：

按照表1的配方在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原液10ml、pH为7.2的无菌PBS缓冲溶液80ml以及Gel 01佐剂10ml（法国赛比克SEPPIC公司生产），37℃下以500转/分钟的速度搅拌10分钟，即得疫苗100ml。

取2ml为1头份/瓶，分装，盖上瓶盖，并压铝盖。猪肺炎支原体含量为2×10⁸CCU/头份。

在本实施例中，猪肺炎支原体并不局限于HN0613菌株，还可以采用其他致病性的猪肺炎支原体菌株（比如与HN0613的16SrRNA序列同源性大于97%的其他猪肺炎支原体菌株）。佐剂也可以选择氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆（Carbomer）、蜂胶、ISA206（法国SCIPPIC）、ISA760VG（法国SCIPPIC）中的一种或几种的组合物。

实施例3 本发明疫苗在PRDC猪中的治疗功效试验

此试验中包括536头商品猪，将这些猪按照体重、以及是否一窝所生区分开，随机分为2组，即疫苗接种组（276头猪）A、对照组（260头猪）B。

A组:在试验开始当天（第0天），对约14日龄的猪进行单次肌肉接种实施例2制备的疫苗，剂量为2ml/头，间隔2周后用同样的疫苗和剂量进行二免。

B组:对照组为未经治疗的猪。

在肥育结束时（试验第24周）终止试验。

所记录的参数

参数记录如下:

（1）个体体重（所有动物）

（2）僵猪率（所有动物）

（3）临床表现（所有动物）

（4）死亡率（所有动物）

（6）尸检（若可能，每一只死亡或处死动物）

（7）宰杀猪只肺部评分。

根据饲养及肥育农场的发病史，动物自肥育中期开始经历与猪呼吸道疾病综合征（PRDC）相关的呼吸道症状。这些症状伴有肥育期间的体重增加程度降低（ADWG720-750g）及死亡率增加（7.5-8.6%）。此时被认为涉及PRDC的病原体为PRRSV、PCV2、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、多杀巴斯德氏菌、支气管败血性波氏菌，有时还涉及SIV。此试验中还发现，猪鼻支原体与此疾病综合征有关。有趣的是，此试验的结果表明，PRRSV和猪肺炎支原体的感染在呼吸道综合征症状出现前约4-6周被检测到，可能是猪群中存在早期潜伏感染造成的。

结果

体重、体重增加、平均每日体重增加(ADWG)

在试验起始时疫苗接种组和对照组体重相当。在试验至第17周及第24周时，疫苗接种组之体重显著高于对照组的体重（分别为p=0.0005及p<0.0001）。自试验起始至第24周，疫苗接种组动物比对照组动物多增重4.73kg。此对应于，从试验起始至第17周时，疫苗接种组动物的ADWG较对照组高16.2g/d，至第24周时疫苗接种组动物的ADWG较对照组高24.2g/d。对于整个肥育期（第10-24周）而言，ADWG可从对照组动物的750.8g/d增加至疫苗接种组动物的783.2g/d，具体情况见表2。

表2 疫苗接种组和对照组体重增长情况

^*表示组间比较t检验之p值，ns表示差异不显著，^***表示差异显著，p≤0.001表示差异极显著。

僵猪率

在任一称重时间点，未在疫苗接种组与对照组之间观测到僵猪率的显著差异。免疫组和对照组的僵猪率都较低（2.5%-4.2%）。

临床表现

对照组和疫苗接种组有类似的临床表现，跛行、腹泻（在5%-7%的动物中）。这些表现在对照组和疫苗接种组中出现频率相等。对死亡动物进行尸检且随后进行微生物学检验发现，猪链球菌可能是引起跛行的感染性病原体，溶血性大肠杆菌可能是腹泻的原因。此外，对照组在12-24周呼吸道症状明显（在15-20%的动物中），咳嗽、呼吸困难，严重的猪只呈犬坐呼吸。与对照组相比，疫苗接种组猪只中咳嗽及呼吸困难的频率分别降低30%及33.6%。表明疫苗接种组对呼吸道综合症有较好防治效果。

死亡率

整个试验过程中，对照组猪只具有比疫苗接种组猪只显著较高的死亡率（疫苗接种组动物：2.01%，安慰剂处理组动物：4.55%，p=0.0114）。疫苗接种组猪只的死亡率比对照组猪只下降55.8%。

肺部病变

整个试验过程中，对照组猪只具有比疫苗接种组猪只显著较高的肺病变得分（疫苗接种组动物：3.4，安慰剂处理组动物：9.3,p=0.0008）。疫苗接种组猪只的肺炎病变平均得分比对照组猪只下降5.9分。具体见表3。

表3 疫苗接种组和对照组肺炎病变情况

注：^***表示差异显著。

本实施例在肥育后期有典型PRDC症状的农场进行。猪在12-19周龄时发展出呼吸道症状、死亡率增加且体重增加幅度减小，24周出栏时肺炎病变严重。通过血清学及微生物学筛查发现，PCV2、PRRSV、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、猪鼻支原体及多杀巴斯德氏菌都可能参与此种疾病综合征。

与对照组相比，疫苗接种组的以下统计学显著表现值得注意:

-增重损失减小

-死亡率降低

-咳嗽及呼吸困难减少

-肺炎病变减少

如所预期，僵猪率未观测到统计学显著差异，因为僵猪的出现并非PRDC的典型表现。

将这些表现汇总，得出以下结论:

1.本试验在肥育中受PRDC影响的畜群中进行。PRRSV、PCV2、SIV、猪肺炎支原体以及副猪嗜血杆菌参与此种疾病综合征，观测到呼吸道症状、增重损失及死亡率增加，宰杀时肺炎病变明显。

2.用本发明制备的疫苗对动物进行疫苗接种可降低或甚至防止与猪肺炎支原体关联性PRDC有关的临床相关表现。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换例如换用其它基因相似的毒株或者两种商业化的疫苗临用前稀释合并以及其它改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体抗原或含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物在预防和治疗猪PRDC以及有与PRDC相关的临床迹象的疾病中的应用，其中，所述应用包括用免疫量的猪肺炎支原体抗原或含猪肺炎支原体抗原的免疫原性组合物免疫所述猪。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫包括一次免疫或二次免疫，所述二次免疫包括首次免疫和二免。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述猪一次免疫或首次免疫时为2～3周龄，所述二免与所述首次免疫时间间隔2周。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体全病原抗原、减毒的猪肺炎支原体全病原抗原或猪肺炎支原体亚单位抗原。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫原性组合物包含佐剂，所述佐剂为Gel 01（法国SCIPPIC）、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆（Carbomer）、蜂胶、ISA206（法国SCIPPIC）、ISA760VG（法国SCIPPIC）中的一种或几种的组合物。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述佐剂为Gel 01（法国SCIPPIC）。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述猪肺炎支原体抗原的含量为2×10⁸CCU/头份。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述猪为猪肺炎支原体阳性的猪。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与PRDC相关的临床迹象包括自由咳嗽及呼吸困难、生长缓慢、饲料效率降低、昏睡、厌食或在肥育中期至后期死亡率显著增加。