CN110305225A - Sva-pcv2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和疫苗 - Google Patents

Sva-pcv2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种SVA‑PCV2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和疫苗，涉及生物技术领域。SVA‑PCV2融合蛋白由SVA区段和PCV2区段组成，其中SVA区段含有SVA的VP1多肽，PCV2区段含有PCV2的Cap蛋白。SVA‑PCV2融合蛋白兼具有SVA和PCV2的免疫原性，能够使机体同时对SVA和PCV2产生免疫反应。基于上述发明构思，本发明还提供了主要编码SVA‑PCV2融合蛋白的基因，包含他们的生物材料以及疫苗，其中本发明提供的疫苗具有SVA和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。

Description

SVA-PCV2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和 疫苗
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种SVA-PCV2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和疫苗。
背景技术
塞内卡谷病毒(Seneca valley virus A，SVA)属于小RNA病毒科，塞内卡谷病毒属、塞内卡谷病毒A种，基因组为单股正链RNA，约由7200个核苷酸组成，编码4个结构蛋白和7个非结构蛋白，病毒粒子呈典型的二十面体对称。
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)属于圆环病毒科，其基因组为单股环状DNA，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，是目前已知的最小病毒之一。PCV有I型和II型两种基因型，PCV1首先由Tischer于PK-15细胞中发现，基因组全长1759bp，无致病变性；PCV2基因组长1767bp或1768bp，基因组编码结构蛋白Cap蛋白和非结构蛋白Rep蛋白，病毒衣壳蛋白呈二十面体对称。
塞内卡谷病毒和II型猪圆环病毒能够引起多种疾病。SVA主要引起塞内卡谷病，是一种猪的以口蹄部出现水泡性损伤为特征的传染疾病，SVA还能够引起猪鼻吻、冠状带和新生仔猪死亡，偶见腹泻症状。PCV2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemic Wasting Syndrome，PMWS)的主要病原。除PMWS，猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道综合征、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、渗出性皮炎、先天震颤等疾病也与PCV2感染有关。并且PCV2是一种仔猪免疫抑制，高度感染猪只的病毒性传染病，可引起各年龄段猪感染，对养殖业造成巨大经济损失。因此一种能够同时具有防控塞内卡谷病毒和猪圆环病毒的产品是目前市场需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种SVA-PCV2融合蛋白，兼具有SVA和PCV2的免疫原性，能够使机体同时对SVA和PCV2产生免疫反应。
本发明的第二目的在于提供一种基因，该基因主要由编码SVA的VP1的序列和编码PCV2的Cap蛋白的序列组成。
本发明的第三目的在于提供一种生物材料，该生物材料为表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种，并且该生物材料能够表达上述SVA-PCV2融合蛋白，或至少包含上述基因。
本发明的第四目的在于提供一种上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因。
本发明的第五目的在于提供上述SVA-PCV2融合蛋白，上述基因，上述生物材料或上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法的应用。
本发明的第六目的在于提供一种疫苗，该疫苗包含免疫有效量的SVA-PCV2融合蛋白、基因或生物材料。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了SVA-PCV2融合蛋白，该SVA-PCV2融合蛋白由SVA区段和PCV2区段组成；所述SVA区段含有SVA的VP1多肽；所述PCV2区段含有PCV2的Cap蛋白；
所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列；所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述SVA-PCV2融合蛋白为病毒样颗粒。
优选地，SVA区段和PCV2区段由连接肽连接；
优选地，所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，SVA-PCV2融合蛋白由CHO-S细胞表达。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种基因，该基因主要由编码SVA的VP1多肽的序列和编码PCV2的Cap蛋白的序列组成；
所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列；所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，该生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达上述SVA-PCV2融合蛋白，或上述基因。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因；
优选地，以pcDNATM3.1-TOPO为载体构建编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因的重组载体；
优选地，所述宿主为CHO-S细胞；
优选地，将所述重组载体转染至CHO-S细胞，使CHO-S细胞表达SVA-PCV2融合蛋白。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(a)提供编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因；
(b)将所述编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因插入表达载体pcDNA TM3.1-TOPO中，得到重组载体；
(c)使用FreeStyleTM MAX Reagent将步骤(b)获得的重组载体转染至CHO-S细胞；
(d)筛选稳定表达SVA-PCV2融合蛋白的CHO-S细胞，单细胞克隆所述稳定表达SVA-PCV2融合蛋白的CHO-S细胞；
(e)收获SVA-PCV2融合蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述SVA-PCV2融合蛋白，上述基因，上述生物材料，或上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法的应用，包括如下(x1)～(x4)中的至少一种：
(x1)制备抗体；(x2)制备用于检测PCV2的试剂和/或试剂盒；(x3)制备用于检测SVA的试剂和/或试剂盒；(x4)制备疫苗。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含免疫有效量的上述SVA-PCV2融合蛋白、免疫有效量的上述基因，或免疫有效量的上述生物材料中的至少一种；
优选地，所述疫苗以所述SVA-PCV2融合蛋白自组装成的病毒样颗粒作为活性成分；
优选地，所述SVA-PCV2融合蛋白中的VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列；
优选地，所述疫苗以CpG-DNA作为免疫佐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的SVA-PCV2融合蛋白由SVA区段和PCV2区段组成，其中SVA区段含有SVA的VP1多肽，VP1蛋白的抗原性强、相对保守，可以刺激机体产生中和抗体；PCV2区段含有PCV2的Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，与病毒的免疫有关。SVA-PCV2融合蛋白兼具有SVA和PCV2的免疫原性，能够使机体同时对SVA和PCV2产生免疫反应。
基于上述发明构思，本发明还提供了主要编码SVA-PCV2融合蛋白的基因，包含他们的生物材料以及疫苗，其中本发明提供的疫苗具有SVA和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2提供的pcDNA3.1-SVA-PCV2-Cap的质粒图谱；
图2为SVA-PCV2融合蛋白形成的病毒样颗粒的3D拓扑结构的示意图；
图3为本发明实施例2提供的pcDNA3.1-SVA-PCV2-Cap的酶切鉴定结果；
图4为本发明实施例3表达的蛋白的SDS-PAGE检测结果；
图5为本发明实施例3表达的蛋白的免疫印迹检测结果。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种SVA-PCV2融合蛋白，该融合蛋白主要由SVA区段和PCV2区段组成；
所述SVA区段含有SVA的VP1多肽，SVA衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成，其中VP1和VP3是主要的抗原表位区域，而VP1蛋白的抗原性强、相对保守，可以刺激机体产生中和抗体，因此本发明选用VP1蛋白上的抗原表位与PCV2的Cap蛋白组合，所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列，如下表所示：
名称 编码序列 编号
SVA3 GTGAGGATTACACCCTACGTCTCC SEQ ID NO.1
SVA5 CCTACGTGTTCCACTCCA SEQ ID NO.2
PCV2区段含有PCV2的Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白，Cap基因由病毒DNA互补链转录合成，编码框位于34nt～736nt，编码234个氨基酸组成的衣壳蛋白Cap，该蛋白与病毒的致病性密切相关。Cap蛋白在病毒感染细胞后在各种宿主酶的参与下产生，与病毒的免疫有关。在一些优选的实施方式中，所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明提供的SVA-PCV2融合蛋白含有SVA的VP1多肽和PCV2的Cap蛋白，兼具有SVA和PCV2的免疫原性，能够使机体同时对SVA和PCV2产生免疫反应。
在一些优选的实施方式中，SVA区段和PCV2区段由连接肽连接，连接肽可以将SVA区段和PCV2区段间维持一个不影响各自高级结构的形成的距离；所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些优选的实施方式中，SVA-PCV2融合蛋白可在体外自组装成为病毒样颗粒，SVA-PCV2融合蛋白形成的病毒样颗粒的3D拓扑结构的示意图如图2所示。病毒样颗粒(virus-like particles，VLPSs)是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白颗粒，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，通常是二十面体或者是管状结构，具有很强的免疫原性和生物学活性。多种表达系统均可表达VLPs，包括但不限于为细菌、昆虫、酵母及哺乳动物，即使是使用如大肠杆菌系统、绿脓杆菌和乳杆菌系统等细菌表达系统，虽然对蛋白质进行转录后缺少糖基化修饰，但在大多数情况下，蛋白质缺少糖基化修饰并不影响保护性抗体的产生。
在一些优选的实施方式中，SVA-PCV2融合蛋白由CHO-S细胞表达。CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，CHO-S中国仓鼠卵巢悬浮传代细胞。CHO细胞表达系统(Chinese hamster ovary cell system，CHO)是目前重组蛋白生产的首选系统。因为它具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子，并且能够分泌表达，制备出的亚单位疫苗安全性高。
本发明还提供了一种基因，该基因主要由编码SVA的VP1多肽的序列和编码PCV2的Cap蛋白的序列组成；
所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列；所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。可以理解的是，可选地，所述基因可以由SEQ ID NO.1所示序列和SEQ ID NO.3所示序列组成；可选地，所述基因也可以由SEQ IDNO.2所示序列和SEQ ID NO.3所示序列组成；可选地，所述基因也可以由SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列和SEQ ID NO.3所示序列共同组成；可选地，所述基因中也可以包含编码其他功能部分的序列，包括但不限于为编码调控单元的序列，编码标记基因的序列和编码其他抗原的序列等。
本发明还提供了一种生物材料，该生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种。所述生物材料表达上述SVA-PCV2融合蛋白，或含有上述基因。
所述表达盒指的是由调控元件和至少编码上述基因的核酸序列组成的核酸构建体，其中调控元件包括但不限于为启动子、终止子、增强子、核糖体结合位点以及其他调控元件；“载体”指的是包含编码上述基因的括但不限于为质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组，并能使上述基因在宿主中进行复制或者表达，或者能够将上述基因整合进入宿主细胞中。重组微生物和细胞系指是经过修饰、改变或者工程化等操作后，与起始状态呈现不同基因型或者表型的，能够复制和/或表达所述基因的微生物和细胞系。
在一个具体的实施例中，所述生物材料是包含上述基因的表达盒；在一个具体的实施例中，所述生物材料是包含上述编码基因的质粒，该质粒能够在宿主复制，以增加上述基因在宿主中的拷贝量；在一个实施例中，所述生物材料是包含上述编码基因的质粒，该质粒能够在宿主中表达出所述SVA-PCV2融合蛋白；在一些实施例中，所述生物材料是重组微生物，例如大肠杆菌或者乳酸菌，该大肠杆菌或者乳酸菌转化有包含上述基因的质粒，这些质粒能够在大肠杆菌或者乳酸菌中克隆，以增加质粒以及所述基因的拷贝量，或者整合有上述基因，整合的基因在大肠杆菌或者乳酸菌中表达上述SVA-PCV2融合蛋白；在一些实施例中，所述生物材料为细胞系，例如CHO-S细胞系或者PK-15细胞系，其中含有SVA-PCV2融合蛋白自组装成的病毒样颗粒。
本发明还提供了上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法，该制备方法包括：在宿主中表达编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因；例如可以为但不限于为在大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、植物表达系统或者哺乳动物表达系统均可，优选在CHO-S细胞表达中表达。
在一些优选的实施方式中，按照如下方法制备SVA-PCV2融合蛋白：
(a)将SVA的VP1多肽与PCV2Cap蛋白通过柔性氨基酸相连，通过偏嗜性密码子优化后，人工合成编码该段融合蛋白的基因。
(b)将人工合成的基因插入真核表达载体pcDNATM3.1-TOPO中，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体，获得pcDNA3.1-SVA-PCV2-Cap质粒。
(c)pcDNA3.1-SVA-PCV2-Cap质粒，使用FreeStyleTM MAX Reagent转染至CHO-S细胞，命名为CHO-SVA-PCV2-Cap。通过CHO-SVA-PCV2-Cap细胞瞬时表达，纯化获得SVA-PCV2融合蛋白。
(d)将纯化获得SVA-PCV2融合蛋白，通过体外自我组装，获得病毒样颗粒。
采用该方法制备SVA-PCV2融合蛋白具有如下优点：①利用CHO表达系统，具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化等优点。②pcDNATM 3.1-TOPO为双顺反子克隆载体，可用于大部分哺乳动物细胞中，使重组蛋白达到非常高的表达水平。目的基因插入在TOPO克隆位点处，上游有CMV启动子促进目的基因转录，下游有TKpA终止子。该载体含有两个抗性标记基因，分别是用于筛选大肠杆菌阳性转化株的氨苄抗性基因和用于筛选稳定转染CHO-S细胞的细胞株的新霉素抗性基因。采用pcDNATM3.1-TOPO为双顺反子克隆载体，使得CHO-S细胞表达SVA-PCV2融合蛋白的产量显著提高，降低了生产成本。③采用FreeStyleTM MAX试剂，是一种新型阳离子脂质体转染试剂，通过表面的高正压电荷密度凝聚带负电的DNA分子，形成紧密的FreeStyleTM MAX-DNA复合物，并可黏附到带有负电荷的细胞表面残基，进入细胞，转染效率极高。
在一些优选的实施方式中，将筛选稳定转染CHO-S细胞的细胞株经单细胞克隆技术，获得高表达的融合蛋白。单细胞克隆指的是分离单个细胞，其增殖产生的后代都是来源于同一个细胞，即为单细胞克隆，单克隆增殖稳定转染CHO-S细胞的细胞株，能够获得高产SVA-PCV2融合蛋白的细胞株。
在一些优选的实施方式中，SVA-PCV2融合蛋白是按照以下方法进行：采用HyClone的无血清培养基Hycell培养CHO-S细胞，使其密度达到1.5×106活细胞/mL，按V转染试剂(FreeStyleTM MAX)/M质粒为1:1，采用50mLTPP管在振荡摇床培养箱中培养(37℃，8％CO2，125rpm)，培养96h，取培养液上清用检测目的蛋白表达量。
本发明还提供了上述SVA-PCV2融合蛋白，上述基因，上述生物材料或上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法的应用。所述应用包括制备抗体：在一些可选的实施方式中，所述抗体可以通过将上述SVA-PCV2融合蛋白，或者将表达上述SVA-PCV2融合蛋白的基因注入动物体内，再收集动物体内产生的抗体，或者收集能够产生抗体的B细胞，再通过制备杂交瘤细胞获得单克隆抗体。在一些可选的实施方式中，所述应用还可以为将上述SVA-PCV2融合蛋白，上述基因，上述生物材料或上述SVA-PCV2融合蛋白制备成试剂或者试剂盒，这些试剂或试剂盒可用于检测PCV2和/或检测SVA。在一些可选的实施方式中，上述SVA-PCV2融合蛋白，上述基因，上述生物材料或上述SVA-PCV2融合蛋白的制备方法还可以应用于制备疫苗。可选的，以SVA-PCV2融合蛋白作为亚单位疫苗的活性物质；可选的，以包含上述基因的载体作为DNA疫苗的活性物质或者辅助活性物质，以辅助主要免疫原增强免疫效果。所述活性物质指的是能够免疫机体使机体产生有效量的抗体的物质。
本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含免疫有效量的SVA-PCV2融合蛋白，免疫有效量的所述基因或者免疫有效量的生物材料中的至少一种。本发明提供的疫苗具有SVA和PCV2双免疫原性，能达到实现一针防两病的目的。可以理解的是，本发明提供的疫苗还可以包含任意的药学上可接受的辅料，所述辅料包括但不限于为疫苗佐剂、稳定剂、保护剂、赋形剂或溶剂。
在一些优选的实施方式中，所述疫苗以所述SVA-PCV2融合蛋白自组装成的VLPs作为活性成分。VLPs疫苗与传统疫苗类似，唯一不同的地方在于，VLPs不含病毒核酸，因此没有增殖能力。这也意味着VLPs疫苗不具有感染性，安全性较高。相比全病毒疫苗和亚单位疫苗，VLPs疫苗有更多的优点：它具有特异的免疫原性、安全性还能提供有效的，以及粒子性和天然的多价性；VLPs具有高度统一的、确定的几何结构，有序重复的表面结构，保存有天然的抗原构象，高度有序的结构构成了病原相关分子模式，哺乳动物的免疫系统可以产生免疫应答；VLPs安全，因为它没有感染性也不能复制，在极端环境条件下比可溶性蛋白更稳定，还可以区分感染毒还是疫苗毒。
在一些优选的实施方式中，疫苗中作为活性成分的SVA-PCV2融合蛋白中的VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列，通过实验发现，SEQ ID NO.1所示序列编码的VP1多肽免疫效果更佳。
在一些优选的实施方式中，所述辅料包括疫苗佐剂，所述疫苗佐剂包括但不限于为：氢氧化铝胶、弗氏完全或者不完全佐剂、白油佐剂、细胞因子类佐剂或者核酸类佐剂。
在一些优选的实施方式中，所述免疫佐剂包括CpG-DNA类疫苗佐剂，CpG-DNA为包含胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸，为TLR-9的激动剂，能被TLR-9特异性识别并触发免疫应答，会增加IFN-γ的表达，是一种强大的免疫激动剂，表现为能直接激活树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞等释放多种细胞因子，参与机体抗感染、抗过敏性疾病，诱导激活抗肿瘤免疫应答。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例1
根据登录GenBank获得的SVA和PCV2型基因组，通过序列比对分析，最终确定候选基因序列，SVAVP1的多肽基因序列来源于GenBank:KY747519.1，PCV2Cap蛋白的基因序列来源于GenBank:FJ158606。
本实施例采用了两条SVAVP1的多肽基因，一条命名为SVA3，SVA3的编码序列如SEQID NO.1所示；另一条命名为SVA5，SVA5的编码序列如SEQ ID NO.2所示。分别将SVA3和SVA5与PCV2Cap蛋白基因序列，通过连接肽的编码序列首尾相连，其中PCV2Cap蛋白基因序列如SEQ ID NO.3所示，连接肽的编码序列如SEQ ID NO.4所示，经偏嗜性密码子优化后，在基因两端插入酶切位点HindIII和BamHI，送往合成公司进行基因合成，获得SVA3-PCV2-Cap基因和SVA5-PCV2-Cap基因。
实施例2
构建pcDNA3.1-SVA-PCV2-Cap载体，构建步骤如下所示：
(a)连接：回收PCR产物与pcDNA3.1连接，连接体系(10μL/管)如下：pcDNA3.1载体1μL、回收酶切产物2μL、dH2O 2μL、Solution I 5μL、16℃连接仪上连接过夜。
(b)大肠杆菌感受态细胞的制备：从培养皿上挑取单个菌落接种于含有10mL LB液体培养基的试管中，37℃过夜培养。取100μL菌液转接到一个含有10mL液体LB培养基的离心管中，37℃震荡培养2h；将菌液分装到1.5mL离心管中，冰浴20min；4℃4000rpm离心5min，弃上清；加入1/5体积(200μL)预冷的CaCl2缓冲液，轻轻悬浮细胞；4℃4000rpm离心5min，弃上清；加入1mL预冷的CaCl2轻轻悬浮细胞，放置于冰上30min；4℃3000rpm离心5min，弃上清；加入预冷的CaCl2悬浮，置于-70℃保存备用，即为感受态细胞。
(c)转化：将连接产物全部转入100μL感受态菌中，用枪尖轻轻混匀。冰浴30min后，42℃水浴热休克90s，然后快速将其放入冰浴5min；加入800μL LB培养基液体培养基，37℃摇床中摇动培养1h；取出300μL将其涂于含氨苄青霉素(100μg/mL)，X-Gal(200μg/mL)，IPTG(100μg/mL)的LB固体平板，37℃培养过夜。
(d)阳性克隆筛选以及重组质粒的抽提：从平板上随机挑取单个白色菌落，分别接种到2mL LB(含Amp)中培养约12h。按照OMEGA质粒小量提取试剂盒说明要求提取重组质粒。
(e)重组质粒的酶切鉴定：将上述提取的重组质粒37℃酶切过夜，酶切鉴定的体系为：10×H buffer 2μL、重组质粒3μL、HindIII和BamHI各1μL、ddH2O 11μL、0.1％BSA 2μL。反应结束后取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。将酶切鉴定为阳性的重组质粒分别命名为：pcDNA3.1-SVA3-PCV2-Cap和pcDNA3.1-SVA5-PCV2-Cap。质粒图谱如图1所示，酶切鉴定结果如图3所示。其中泳道1～4分别：pcDNA3.1-SVA3-PCV2-Cap、pcDNA3.1-SVA5-PCV2-Cap、pcDNA3.1-PCV2-Cap和阴性对照。
(f)重组质粒的DNA序列测定与分析：将阳性重组质粒pcDNA3.1-SVA3-PCV2-Cap和pcDNA3.1-SVA5-PCV2-Cap送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。
实施例3
通过CHO表达系统制备SVA-PCV2-Cap融合蛋白，步骤如下所示：
(a)细胞培养：CHO-S细胞，培养条件为37℃，8％CO2，125rpm，培养基(Hycell+8mMGlutaMAX)购自HyClone公司。FreeStyleTM MAX试剂购自Invitrogen公司。CHO-S细胞密度和活力采用台盼蓝染色计数和观察。CHO-S细胞悬浮培养，细胞密度1.5×106/ml，细胞活力≧90％时进行转染，于振荡摇床培养箱中培养，培养参数：37℃，8％CO2，125rpm。
(b)质粒大提：通过PureLinkTM Hipure Plasmid Maxiprep Kit大提质粒(无内毒素)试剂盒说明书要求提取重组质粒，用于转染。
(c)转染：将质粒使用FreeStyleTM MAX Reagent转染至CHO-S细胞，14天收取细胞上清即为所需SVA-PCV2-Cap融合蛋白。
(d)SVA-PCV2-Cap融合蛋白的纯化：表达的蛋白样品(8000×g10min，4℃)，使用Ni+亲和层析柱进行纯化，纯化蛋白使用生理盐水进行透析，使用SDS-PAGE对其进行鉴定。鉴定结果表明：纯化产物经SDS-PAGE电泳后，目的蛋白片段与预期大小相符。SVA-PCV2-Cap融合蛋白含量为0.8mg/mL，纯化样品于-80℃冻存。
(e)SVA-PCV2-Cap融合蛋白鉴定：
蛋白质凝胶电泳：SDS-PAGE胶为上层5％浓缩胶和下层10％分离胶，以100V电压、400mA条件电泳10min，然后以150V电压、400mA电泳1h如图4所示，其中泳道1～4为标准品，浓度分别为：500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml；泳道5～6为样品：CHO-SVA3-PCV2-Cap，CHO-SVA5-PCV2-Cap。
免疫印迹：将样品经SDS-PAGE凝胶分离后在转膜缓冲液中转至PDVF膜中，转膜条件为100V电压、400mA电流1h，PDVF膜经封闭和孵育SVA-VP1/PCV2-VP1蛋白的单克隆抗体作用4h后，加入HRP标记羊抗鼠二抗稀释液，室温孵育2h，经PBST清洗三次，每次10min，最后利用DAB显色液进行显色检测如图5所示，其中泳道1～3依次为阳性对照、CHO-SVA5-PCV2-Cap和CHO-SVA3-PCV2-Cap。从图5可以看出，SVA3多肽和PCV2-Cap重组后的表达量优于SVA5多肽和PCV2-Cap重组，因此以SVA3多肽和PCV2-Cap重组的融合蛋白作为亚单位疫苗。
实施例4
SVA3-PCV2-Cap二联疫苗亚单位，按照如下步骤制备：
将实施例3制备的SVA3-PCV2-Cap融合蛋白使用PBS溶液稀释，将稀释后的蛋白溶液与CpG佐剂按1％比例混合在一起，以8000r/min的转速搅拌10min，在终止搅拌前加入0.01％(体积比)硫柳汞溶液，使其终浓度不超过万分之一，充分振荡混匀后，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于4℃备用。
效果例1
动物试验：筛选SVA、FMDV、PCV2抗原和抗体阴性的仔猪，隔离饲养观察3日。选择实施例4制备的二联亚单位疫苗，按照分组进行免疫，分组见表1。
表1仔猪免疫SVA3-PCV2-Cap二联亚单位疫苗分组情况
免后采血检测，评估抗体水平变化规律，首免后14日，进行二次免疫。首免后28日采血，分离血清，应用美国(Biostone)生产的猪塞内卡谷病毒抗体检测试剂盒进行SVA抗体检测。应用IFA检测技术进行PCV2抗体检测。
试验结果：
(1)IFA检测结果：应用间接免疫荧光试验检测可知，各免疫组抗体水平均转阳，CHO-SVA3-PCV2-Cap疫苗免疫组PCV2抗体平均效价均不低于1:1024；与参考疫苗组抗体水平差异不显著；对照组没有抗体产生。说明表达的SVA3-PCV2-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性，能够产生针对PCV2的特异性抗体，如表2所示。
表2 SVA3-PCV2二联亚单位疫组合物免后28日IFA检测结果
(2)ELISA检测结果：应用猪塞内卡谷病毒抗体检测试剂盒进行SVA抗体检测。疫苗免疫后28日，CHO-SVA 3-PCV2-Cap免疫组所有仔猪抗体水平均转阳，S/P值均不低于1.5；参考疫苗组和对照组均没有相应抗体产生。
表3 SVA3-PCV2-Cap二联亚单位疫组合物免后28日ELISA抗体检测
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康生物(上海)有限公司
天康生物股份有限公司
<120> SVA-PCV2融合蛋白及其制备方法、基因、生物材料、应用和疫苗
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 塞内卡谷病毒（Seneca valley virus A）
<400> 1
gtgaggatta caccctacgt ctcc 24
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 塞内卡谷病毒（Seneca valley virus A）
<400> 2
cctacgtgtt ccactcca 18
<210> 3
<211> 702
<212> DNA
<213> 猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type two）
<400> 3
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacc 180
acagtcaaaa cgccctcctg ggcggtggac atgatgagat tcaatattaa tgactttctt 240
cccccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccctttg aatactacag aataagaaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctccccg atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
agtgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca cagccctcac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccgctac 480
tttaccccca aacctgtcct agattccact attgattact tccaaccaaa caacaaaaga 540
aatcagctgt ggctgagact acaaactgct ggaaatgtag accacgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggaa tacaatatcc gtgtaaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaccctt ag 702
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctcccagcc ccagc 15

Claims (10)

1.SVA-PCV2融合蛋白，其特征在于，由SVA区段和PCV2区段组成；所述SVA区段含有SVA的VP1多肽；所述PCV2区段含有PCV2的Cap蛋白；
所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列；所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的SVA-PCV2融合蛋白，其特征在于，所述SVA-PCV2融合蛋白为病毒样颗粒。
3.根据权利要求1或2所述的SVA-PCV2融合蛋白，其特征在于，SVA区段和PCV2区段由连接肽连接；
优选地，所述连接肽的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1或2所述的SVA-PCV2融合蛋白，其特征在于，SVA-PCV2融合蛋白由CHO-S细胞表达。
5.基因，其特征在于，主要由编码SVA的VP1多肽的序列和编码PCV2的Cap蛋白的序列组成；
所述VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列和/或SEQ ID NO.2所示序列；所述Cap蛋白的编码序列如SEQ ID NO.3所示。
6.生物材料，其特征在于，包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；
所述生物材料表达权利要求1-4任一项所述的SVA-PCV2融合蛋白，或含有权利要求5所述的基因。
7.权利要求1-4任一项所述的SVA-PCV2融合蛋白的制备方法，其特征在于，在宿主中表达编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因；
优选地，以pcDNATM3.1-TOPO为载体构建编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因的重组载体；
优选地，所述宿主为CHO-S细胞；
优选地，将所述重组载体转染至CHO-S细胞，使CHO-S细胞表达SVA-PCV2融合蛋白。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(a)提供编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因；
(b)将所述编码所述SVA-PCV2融合蛋白的基因插入表达载体pcDNATM3.1-TOPO中，得到重组载体；
(c)使用FreeStyleTM MAX Reagent将步骤(b)获得的重组载体转染至CHO-S细胞；
(d)筛选稳定表达SVA-PCV2融合蛋白的CHO-S细胞，单细胞克隆所述稳定表达SVA-PCV2融合蛋白的CHO-S细胞；
(e)收获SVA-PCV2融合蛋白。
9.权利要求1-4任一项所述的SVA-PCV2融合蛋白，权利要求5所述的基因，权利要求6所述的生物材料，或权利要求7或8所述的SVA-PCV2融合蛋白的制备方法的应用，包括如下(x1)～(x4)中的至少一种：
(x1)制备抗体；(x2)制备用于检测PCV2的试剂和/或试剂盒；(x3)制备用于检测SVA的试剂和/或试剂盒；(x4)制备疫苗。
10.疫苗，其特征在于，包含免疫有效量的权利要求1-4任一项所述的SVA-PCV2融合蛋白、免疫有效量的权利要求5所述的基因，或免疫有效量的权利要求6所述的生物材料中的至少一种；
优选地，所述疫苗以所述SVA-PCV2融合蛋白自组装成的病毒样颗粒作为活性成分；
优选地，所述SVA-PCV2融合蛋白中的VP1多肽的编码序列选自如SEQ ID NO.1所示序列；
优选地，所述疫苗以CpG-DNA作为免疫佐剂。
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