CN101851631B

CN101851631B - 一种密码子优化的ev71 vp1基因及其核酸疫苗

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Publication number: CN101851631B
Application number: CN 201010126145
Authority: CN
Inventors: 徐娟; 王世霞; 黄祖瑚; 卢山
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2030-03-16
Also published as: CN101851631A

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗。该EV71 VP1基因兼顾了哺乳动物细胞和大肠杆菌密码子使用偏好，序列为SEQ IDNO.1。在此基础上，将该基因插入到真核表达载体中，构建了核酸疫苗Vector/VP1、Vector/tPA-VP1及Vector/VP1-tandem，三种VP1 DNA疫苗经真核细胞表达和动物免疫验证，均能够较好的表达VP1蛋白，并刺激产生了特异性抗体，体现了良好的免疫原性。

Description

一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，涉及一种密码子优化的EV71 VP1基因及其核酸疫苗。

背景技术

肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引起手足口病的主要病原体，其感染性强且致病率高，感染引起重症病例的比例偏高，尤其是神经系统方面的并发症，患儿可出现中枢神经和呼吸系统的损害，引发脑炎、急性弛缓性麻痹、肺水肿和心肌炎等。重症病例病情发展很快，易死亡或致残。该病已成为许多国家和地区儿童中常见、多发的一种传染病，严重影响儿童的身体健康。

EV71的感染流行呈逐年上升趋势，传播途径复杂，在短时间内可发生大流行，预防控制难度大，缺乏特异的治疗方法和有效的预防措施，而只能对症治疗。国内外资料显示，重症病例病死率可达10％～25％。但因EV71高度的变异性等原因，至今仍没有有效的疫苗产生。因此，研制有效的疫苗是预防和消除EV71感染的必要措施和亟待解决的问题。

EV71外壳是由结构蛋白VP1-VP4形成的相同单位所组合成六十个蛋白次单位而造成对称的二十面体。除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上。VP1蛋白是EV71主要的病毒中和决定因子，抗体中和反应的抗原表位(neutralization epitope)多集中于此，它直接决定病毒的抗原性；而且VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性。因此，VP1是EV71疫苗研究的主要靶目标。

核酸疫苗(nucleic vaccine)又名基因疫苗(gene vaccine)或DNA疫苗(DNAvaccine)，其本质是含有病原体抗原基因的真核表达载体，当它被导入动物机体后，可被动物细胞所摄取并表达病原体的抗原蛋白，从而诱导机体对该蛋白的免疫反应。作为近几年来新兴的一种疫苗，它以其独特的优点吸引着人们：(1)抗原合成和递呈过程与病原的自然感染相似，通过MHC I类和II类分子直接递呈免疫系统。特别是特异性CD⁸ ⁺淋巴细胞(CTL)的免疫反应，这是灭活疫苗和亚单位疫苗不能比拟的；(2)免疫原的单一性，只有编码所需抗原基因导入细胞得到表达，载体本身没有抗原性。而重组的病毒活载体疫苗除了目的基因表达外，还有庞大而复杂的免疫蛋白；(3)易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，适于规模化生产。但DNA疫苗的局限在于抗原表达水平较低、免疫原性较弱。如何优化抗原基因序列，促进疫苗的表达和分泌，提高免疫原性，已成为构建和设计DNA疫苗的关键所在。

抗原的表达量是影响DNA疫苗免疫原性的一个重要因素。DNA疫苗利用宿主的转录和翻译体系，由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的基因克隆在异源宿主体内可能难以有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用，这是导致目前核酸疫苗免疫原性较低的主要原因。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种经密码子优化的EV71 VP1基因。

本发明的另一目的是提供三种含有该EV71 VP1基因的核酸疫苗。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种密码子优化的EV71 VP1基因，序列为SEQ ID NO.1。该序列是根据真核生物密码子使用偏好对编码EV71 VP1蛋白的基因序列进行调整得到的，但编码蛋白质氨基酸序列与原有VP1氨基酸序列保持一致。如优化前序列中编码甘氨酸的碱基为GGA，优化后则为GGC；又如，编码天冬氨酸的序列，优化前为GAT，而优化后为GAC；编码精氨酸的序列，优化前为AGG，优化后则为CGG。

一种EV71 VP1核酸疫苗Vector/VP1，该疫苗由序列为SEQ ID NO.1的EV71 VP1基因与真核表达载体组成。

其中，所述的真核表达载体为经内切酶PstI和BamHI切割真核表达载体pJW4303得到的线性大片段。核酸疫苗pJW4303/VP1的质粒物理图谱见图2。

一种EV71 VP1核酸疫苗Vector/tPA-VP1，该疫苗是所述的EV71 VP1基因与一端含有人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的真核表达载体组成。

其中，所述的EV71 VP1基因是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR扩增得到的在5’端包含NheI内切酶位点，在3’端包含BamHI位点的VP1基因序列，该片段的5’端与真核表达载体含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连。

所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割真核表达载体pJW4303得到的线性大片段。该载体的PstI和NheI内切酶位点之间的基因序列为人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因(human tissue plasminogen activator，tPA)，其序列为SEQ ID NO.2。

核酸疫苗pJW4303/tPA-VP1中tPA-VP1基因序列为SEQ ID NO.3。该核酸疫苗的质粒物理图谱见图4。

一种EV71 VP1核酸疫苗Vector/VP1-tandem，该疫苗是由来自于所述的EV71 VP1基因的片段1和片段2串联与一端含有人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的真核表达载体组成。

其中，所述的片段1是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR反应扩增得到的在5’端含有NheI内切酶位点，在3’端含有KpnI位点的EV71 VP1基因片段，其5’端与真核表达载体含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连，3’端与所述的片段2的5’端相连；所述的片段2是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR反应扩增得到的在5’端含有KpnI内切酶位点，在3’端含有BamHI酶切位点的EV71 VP1基因片段，其5’端与片段1的3’端相连，其3’端与真核表达载体不含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连。

所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割pJW4303得到的载体片段。该载体的PstI和NheI内切酶位点之间的基因序列为人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因(human tissue plasminogen activator，tPA)，其序列为SEQ ID NO.2。

核酸疫苗pJW4303 VP1-tandem中tPA-VP1片段1-VP1片段2基因序列为SEQ IDNO.4。该核酸疫苗的质粒物理图谱见图6。

密码子优化的VP1基因的设计和合成：

首先用基因软件MacVector 7.2分析编码野生型EV71 VP1/BJ的基因序列，找出其密码子使用偏好，并找出野生型EV71 VP1/BJ的基因序列中与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点。对于哺乳动物使用偏好相同的密码子，用哺乳动物偏好的密码子替代野生型EV71 VP1/BJ基因中使用偏好不同的密码子位点，然后设计出密码子优化的VP1基因，序列SEQ ID NO.1。密码子优化的VP1基因由德国Geneart公司合成，装入载体pGA4，构建成重组质粒pGA4/VP1。经测序证实合成的序列正确。

用Mac Vector软件比较野生型VP1基因和经密码子优化的VP1基因密码子使用差异，结果见图1。从图可见，优化后的基因序列中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，从而使其更适于在哺乳动物细胞蛋白表达。

本发明的有益效果：

1、与野生型基因相比，密码子优化的基因中哺乳动物细胞偏好的密码子出现频率增加，但是其编码的VP1蛋白氨基酸序列不变，从而使其更适于在哺乳动物细胞中的蛋白表达。

虽然由基因的核苷酸序列可以准确的推断出其编码的氨基酸序列，但根据蛋白质的氨基酸序列而推断的核苷酸序列并不唯一，这是由于遗传密码子的简并性(绝大多数氨基酸均对应于二个以上的密码子，例如与亮氨酸、丝氨酸对应的密码子分别有6个)所致。因此编码某一小肽的核苷酸序列可以有成千上万种。越来越多的研究结果表明，特定的蛋白多肽在细胞内的表达水平通常不是取决于其氨基酸序列，而是取决于相对应的核苷酸编码序列在宿主细胞内的复制、转录、翻译效率及其在宿主细胞内的稳定性等因素。因此，不同的核苷酸编码序列(虽然它们编码的氨基酸序列相同)在各种宿主细胞中的表达效率往往存在显著差异。

通过对野生型EV71 VP1的基因序列分析，发明人认为由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的EV71 VP1基因克隆在异源宿主体内难以有效表达，因此就不能有效的刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的免疫保护作用。为了提高异源基因在哺乳动物中的表达效率，往往需要对核苷酸编码序列进行优化。由于目前对核苷酸序列的优化尚没有统一的标准或原则，因此针对同一氨基酸序列，不同的研究人员完全会设计出不同的核苷酸序列用于目标多肽的表达和制造，相应地表达效率也可能存在差异。根据我们优化的核苷酸编码序列，克服了上述缺陷，提高了VP1蛋白表达水平，以及由该基因构建的核酸疫苗的免疫原性。

2、发明人将经过密码子优化的VP1基因克隆入真核表达载体，构建了核酸疫苗Vector/VP1。经ELISA和Western blot检测证实，该疫苗能够在真核细胞293T细胞中有效表达，免疫动物能刺激产生特异性VP1抗体。

3、发明人在构建pJW4303/VP1的基础上设计了带有tPA信号肽的VP1核酸疫苗pJW4303/tPA-VP1。ELISA结果显示：在tPA信号肽的引导下，抗原蛋白能够分泌至细胞外而更能有效的刺激机体免疫系统。

4、由于在自然状态下，EV71 VP1蛋白能够发生自联而形成双聚体，所以本发明又设计了双聚体形式的VP1核酸疫苗pJW4303/tPA-VP1-tandem，以模拟天然VP1蛋白的构象。实验证实，pJW4303/tPA-VP1-tandem核酸疫苗能够在真核细胞表达双聚体形式的VP1蛋白，并能刺激机体产生针对VP1蛋白的特异性抗体。经ELISA和western blot证实，该特异性抗体能够识别pJW4303/VP1、pJW4303/tPA-VP1和pJW4303/tPA-VP1-tandem转染293T细胞表达的VP1蛋白。

附图说明

图1野生型和密码子优化VP1基因在哺乳动物细胞表达的偏好的比较(指数＞1为哺乳动物细胞所偏好)，纵坐标表示偏好指数，横坐标表示核苷酸序列位置。左图为野生型VP1基因，右图为密码子优化的VP1基因。

图2pJW4303/VP1核酸疫苗质粒物理图谱。

位于PstI和BamHI内切酶位点之间的短片段为密码子优化的VP1基因。

图3pJW4303/VP1核酸疫苗的构建和鉴定。

a pJW4303/VP1质粒酶切电泳鉴定。

Lane1：1kb DNA marker，Lane2：pJW4303/VP1，Lane3：pJW4303/VP1经PstI+BamHI双酶切，Lane4：pJW4303/VP1经Pvu II单酶切。

b p pJW4303/VP1质粒免疫兔血清特异性抗体ELISA检测(兔免疫血清1∶200稀释)

A——pJW4303-S，B——pJW4303-L，C——pJW4303/VP1-S，D——pJW4303/VP1-L；S表示质粒转染细胞的培养上清，L表示质粒转染细胞的裂解。

c pJW4303/VP1质粒免疫兔血清特异性抗体western blot检测(兔免疫血清1∶500稀释)。

d pJW4303/VP1质粒免疫兔血清特异性抗体应答时间曲线(兔免疫血清1∶200稀释，箭头表示免疫时间)。

图4pJW4303/tPA-VP1核酸疫苗质粒物理图谱。

位于NheI和BamHI内切酶位点之间的短片段为VP1基因。位于PstI和NheI内切酶位点之间的短片段为tPA基因。

图5pJW4303/tPA-VP1核酸疫苗的构建和鉴定。

a pJW4303/tPA-VP1质粒酶切电泳鉴定。

LaneM：1kb DNA marker，Lane2：pJW4303/tPA-VP1质粒，Lane2：pJW4303/tPA-VP1NheI+BamHI双酶切。

b pJW4303/tPA-VP1质粒免疫兔血清特异性抗体ELISA检测(兔免疫血清1∶200稀释)。

A——pJW4303-S，B——pJW4303-L，C——pJW4303/tPA-VP1-S，D——pJW4303/tPA-VP1-L；S表示质粒转染细胞的培养上清，L表示质粒转染细胞的裂解。

c pJW4303/tPA-VP1质粒免疫兔血清特异性抗体western blot检测(兔免疫血清1∶500稀释)。

d pJW4303/tPA-VP1质粒免疫兔血清特异性抗体应答时间曲线(兔免疫血清1∶200稀释，箭头表示免疫时间)。

e pJW4303/tPA-VP1转染293T细胞免疫荧光。(1)：为转染pJW4303/tPA-VP1；(2)为转染pJW4303(一抗为pJW4303/tPA-VP1兔免疫血清，1∶200稀释)。

图6pJW4303/tPA-VP1-tandem核酸疫苗质粒物理图谱。

位于PstI和NheI内切酶位点之间的短片段为tPA基因；位于NheI和KpnI内切酶位点之间的短片段为VP1基因片段1；位于KpnI和BamHI内切酶位点之间的短片段为VP1基因片段2。

图7pJW4303/tPA-VP1-tandem核酸疫苗的构建和鉴定。

a pJW4303/tPA-VP1-tandem质粒酶切电泳鉴定。

LaneM：1Kb DNA Marker，Lane1：pJW4303/tPA-VP1-tandem，

Lane2：pJW4303/tPA-VP1-tandem经KpnI单酶切，Lane3：pJW4303/tPA-VP1-tandem经Kpn I+Bgl II双酶切(1003bp)，Lane4：pJW4303/tPA-VP1-tandem经Kpn I+HindIII双酶切(973bp)，Lane5：pJW4303/tPA-VP1-tandem经NheI+BamHI双酶切(1795bp)。

b pJW4303/tPA-VP1-tandem质粒免疫兔血清特异性抗体ELISA检测(兔免疫血清1∶200稀释)。

A——pJW4303-S，B——pJW4303-L，C——pJW4303/tPA-VP1-tandem-S，D——pJW4303/tPA-VP1-tandem-L；S表示质粒转染细胞的培养上清，L表示质粒转染细胞的裂解。

c pJW4303/tPA-VP1-tandem质粒免疫兔血清特异性抗体western blot检测(兔免疫血清1∶250稀释)。

图8Western blot检测EV71患者阳性血清与三种核酸疫苗的的交叉反应(EV71患者阳性血清来自于南京医科大学第二附属医院儿科，1∶500稀释)。

具体实施方式

实施例1.核酸疫苗pJW4303/VP1的构建及鉴定

1.1制备感受态大肠杆菌HB101

1.1.1将甘油保存的大肠杆菌HB101冰上融化，取5ul接种于5ml LB培养基中，置于恒温培养箱中37℃，180rpm，摇菌过夜。

1.1.2无菌条件下，取过夜培养液1ml，接种于新鲜的200ml LB培养基中，置于恒温培养箱中37℃，180rpm，摇菌2小时。

1.1.3将上步细菌置冰上冷却15min。

1.1.4无菌分装至50ml离心管(已高压灭菌)，4℃，2500rpm，离心15min。

1.1.5加入冷的0.1M Cacl₂ 100ml(Cacl₂已高压灭菌)，重悬细菌，冰上孵育30min。

1.1.6无菌分装至50ml离心管(已高压灭菌)，4℃，2500rpm，离心15min。

1.1.7加入冷的、含20％甘油的0.1M Cacl₂ 2ml，重悬细菌。

1.1.8 100ul/管，分装至1.5ml灭菌EP离心管，-70℃冻存备用。

1.2用基因公司提供的含有目标序列的重组载体pGA4/VP1转化感受态大肠杆菌HB101，挑取单克隆小量提取质粒鉴定，步骤按试剂盒说明书进行(TaKaRa miniBESTPlasmid Purification Kit ver 2.0，大连宝生物)。质粒用PstI和BamHI双酶切，酶切体系为：

10x buffer(with BSA) 5.0ul

质粒(0.5ug/ul) 20.0ul

PstI(10u/ul) 1.5ul

BamHI(10u/ul) 1.5ul

ddH₂O 22ul

总体积40ul，37℃孵育2小时

1.3pJW4303载体质粒同样用PstI和BamHI双酶切，酶切体系同上。

1.41.2和1.3酶切产物均用1％凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.^TM GelExtraction Kit(50)，OMEGA BIO-Tek公司)回收纯化900bp左右的VP1基因片段，和5.0Kbp左右的pJW4303载体片段。胶回收具体步骤如下：

1.4.1将电泳后琼脂糖凝胶置于紫外检测仪下，切下含目的DNA的凝胶，放入已称量过的1.5ml EP管中。

1.4.2分析天平称含胶块的EP管的质量，减去EP管本身的质量，获得胶块的质量。按1g＝1ml计算胶块的体积。加入等体积的Binding buffer，置于55～65℃水浴中7min，加热融化胶块，每隔2min混匀一次，直至胶块完全融化。

1.4.3将融化的液体全部取出，加入HinbindingDNA Mini Spin Colomn中(每次700ul，多余部分离心后再取出加入管中，继续离心)10000g，离心1min。

1.4.4弃去滤液，加入300ul Binding buffer，10000g，离心1min。

1.4.5弃去滤液，加入700ul SPW wash buffer，室温静置2-3min，10000g，离心1min。

1.4.6重复1.4.5步骤。

1.4.7弃去滤液，10000g，离心1min。此步骤很关键。

1.4.8将内管取出放入干净的1.5ml EP管中，根据实验需要加入20-50ul Elution buffer或灭菌水或TE，10000g，离心1min，洗脱DNA。收获的DNA可以用来做下游的实验。

1.5将步骤1.4得到的VP1基因片段和pJW4303载体片段按3∶1比例混合，用T4 DNA连接酶(Promega公司)连接过夜，反应条件如下：

Ligase buffer 1ul

T4 DNA ligase 1ul

pJW4303(PstI和BamHI双酶切后纯化片段) 2ul

VP1基因(PstI和BamHI双酶切后纯化片段) 6ul

总体积10ul，4℃连接过夜

1.6连接产物转化感受态大肠杆菌HB101，具体步骤如下：

1.6.1感受态大肠杆菌HB101于冰上融化。

1.6.2取5ul过夜连接产物加入感受态HB101，弹动管壁以混匀质粒。冰上孵育30min。

1.6.3反应管移至42℃水箱，热休克90s。立即转移至冰上。

1.6.4加入800ul灭菌LB培养基，于37℃恒温培养箱，70-80rpm，摇菌45min。

1.6.5取100ul培养菌加入含固体LB培养基的细菌皿中央，菌液用无菌涂布棒均匀涂布，铺满整个培养皿。待菌液稍微干燥，倒扣置于37℃恒温培养箱，培养过夜。

1.6.6第二天挑取单克隆小提质粒，步骤按试剂盒说明书进行(TaKaRa miniBESTPlasmid Purification kit ver 2.0，大连宝生物)。

1.6.7对挑取的质粒进行电泳、酶切鉴定，结果见图3a，经鉴定正确的克隆，连续三次划板，进行菌种保存。

1.6.8正确的质粒进行大量制备，步骤按试剂盒说明书进行(QIAGEN Plasmid MegaKit(5)，QIAGEN公司)。

实施例2.核酸疫苗pJW4303/tPA-VP1的构建及鉴定

2.1设计PCR引物，分别为：上游引物SEQ ID NO.5，下游引物SEQ ID NO.6；以重组质粒pGA4/VP1为模板，扩增含有GCTAGC(NheI)和GGATCC(BamHI)酶切位点的VP1基因片段。反应条件是：94℃4min，94℃1min、56℃1min、72℃1.5min共25个循环，72℃7min。

2.2PCR产物取2ul跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.3鉴定正确的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.^TM Gel Extraction Kit(50)，OMEGA BIO-Tek公司)回收纯化914bp的VP1基因片段。胶回收具体步骤如1.4操作流程。

2.4纯化的PCR产物和载体pJW4303分别经NheI和BamHI双酶切；酶切体系：

10x buffer(with BSA) 5.0ul

质粒(0.5ug/ul) 20.0ul

NheI(10u/ul) 1.5ul

BamHI(10u/ul) 1.5ul

ddH₂O 22ul

总体积40ul，37℃孵育2小时

2.5pJW4303载体片段和VP1 PCR酶切产物分别进一步纯化(BioSpin PCRPurification Kit，BioFlux公司)，具体步骤如下：

2.5.1将酶切产物全部转移至1.5ml EP管中。

2.5.2加入反应物2倍体积的Binding buffer，混匀。

2.5.3将混合物全部转移至Spin Colomn中，6000g离心1min。

2.5.4弃滤液，加入650ul wash buffer，室温静置2-3min，12000g离心1min。

2.5.5重复上步。

2.5.6 12000g 1min再离心一次(很关键)。

2.5.7将Spin Colomn转移至干净的1.5ml EP管中，根据需要加入20-50ul Elutionbuffer或灭菌水或TE，室温静置1min。

2.5.8 12000g离心1min，收集DNA。

2.6将2.5步得到的pJW4303载体片段和VP1 PCR酶切产物按1∶3比例混合，用T4DNA连接酶(Promega公司)连接过夜，反应条件如下：

Ligase buffer 1ul

T4 DNA ligase 1ul

pJW4303(NheI和BamHI双酶切后纯化片段) 2ul

VP1基因(NheI和BamHI双酶切后纯化片段) 6ul

总体积10ul，4℃连接过夜

2.7连接产物转化感受态大肠杆菌HB101，步骤同1.6。

2.8挑取单克隆小提质粒，步骤按试剂盒说明书进行(TaKaRa miniBEST PlasmidPurification kit ver 2.0，大连宝生物)。

2.9对挑取的质粒进行电泳、酶切鉴定，结果见图5a，经鉴定正确的克隆，连续三次划板，进行菌种保存。

2.10正确的质粒进行大量制备，步骤按试剂盒说明书进行(QIAGEN Plasmid MegaKit(5)，QIAGEN公司)。

实施例3.pJW4303/tPA-VP1-tandem核酸疫苗的构建及鉴定

3.1设计两对PCR引物，均以重组质粒pGA4/VP1为模板，用上游引物SEQ ID NO.5，下游引物SEQ ID NO.7，扩增扩增含有GCTAGC(NheI)和GGTACC(KpnI)酶切位点的VP1基因片段1；用上游引物SEQ ID NO.8和下游引物SEQ ID NO.7，扩增含有GGTACC(KpnI)和GGATCC(BamHI)酶切位点的VP1基因片段2。PCR反应条件同2.1操作步骤。

3.2PCR产物取2ul跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

3.3鉴定正确的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(E.Z.N.A.^TM Gel Extraction Kit(50)，OMEGABIO-Tek公司)回收纯化914bp的VP1基因片段1和918bp的VP1基因片段2。胶回收具体步骤如1.4操作流程。

3.4纯化的VP1基因片段1用NheI和KpnI双酶切，VP1基因片段2用KpnI和BamHI双酶切，载体pJW4303用NheI和BamHI双酶切。酶切体系和反应条件同1.2操作步骤。

3.5酶切产物分别进一步纯化(BioSpin PCR Purification Kit，BioFlux公司)，具体步骤同2.5。

3.6载体和插入片段酶切纯化产物按约1∶3.5∶3.5的比例混合，T4连接酶连接过夜。反应体系如下：

Ligase buffer 1ul

T4 DNA ligase 1ul

pJW4303(NheI和BamHI双酶切后纯化片段) 1ul

VP1基因片段1(NheI和KpnI双酶切后纯化片段) 3.5ul

VP1基因片段2(KpnI和BamHI双酶切后纯化片段) 3.5ul

总体积10ul，4℃连接过夜

3.7连接产物转化感受态大肠杆菌HB101，步骤同1.6。

3.8挑取单克隆小提质粒，步骤按试剂盒说明书进行(TaKaRa miniBEST PlasmidPurification kit ver 2.0，大连宝生物)。

3.9对挑取的质粒进行电泳、酶切鉴定，结果见图7a，鉴定正确的克隆，连续三次划板，进行菌种保存。

3.10正确的质粒进行大量制备，步骤按试剂盒说明书进行(QIAGEN Plasmid MegaKit(5)，QIAGEN公司)。

实施例4.重组质粒动物免疫和转染

4.1动物免疫：本研究所用动物为新西兰白兔(2.0kg左右)。免疫兔可以产生大量的免疫血清，足够进行抗体检测和抗体被动保护作用的研究。大量提取的重组质粒用生理盐水稀释至1.0ug/ul用于免疫(200ug/兔)。免疫方案是动物第0、2、4、8周共免疫4次；免疫方法是肌肉注射加电转录(WJ-2002活体基因导入仪，技术参数：电压100V，脉冲次数正反各3次，波宽20ms；以兔子腿部肌肉发生抖动视为电转染有效)。动物免疫分pJW4303空载体对照组(1只)，疫苗实验组(pJW4303/VP1、pJW4303/tPA-VP1、pJW4303/tPA-VP1-tandem，每个疫苗免疫2只兔子)。

4.2免疫血清制备：动物第三次免疫后两周或第四次免疫后两周，耳动脉采集动物血液，室温放置1小时，2500rpm离心10min，吸取上清再用8000rpm离心10min。分离获得免疫血清，分装并标记清楚，冻存于-70℃，用于特异性抗体的检测。

4.3重组质粒的转染(采用阳离子聚合物PEI转染法，Invitrogen公司)，步骤如下：

4.3.1转染前24小时293T细胞(为本室保存)传代至100mm细胞培养板，5x10⁶个/ml。37℃，5％CO₂培养。所用培养基为含10％胎牛血清(Hyclone)和青霉素(100U/ml)、链霉素(0.1mg/ml)的DMEM(Hyclone)。

4.3.2第二天细胞密度约50％～70％。取100ul PEI加入1ml无血清DMEM培养液(含青、链霉素)，充分混匀，加入20ug质粒(质粒与PEI比例为1∶5，此比例适用于任何尺寸大小的培养皿)。充分混匀，室温静置15min。

4.3.3将上述混合物多点滴入细胞培养板。轻微晃动以混匀。继续放入温箱培养。

4.3.48-10小时后，轻轻倒去培养上清，加入6ml无胎牛血清的DMEM(提前于37℃预温，加入时小心避免冲起细胞)，继续培养至48-72小时。

4.3.4转染细胞收获：吸取转染细胞的培养上清(supernatant，S)至10ml离心管，2500rpm离心10min，分装、标记，-70℃冻存备用。转染细胞加入5ml 1xPBS(细胞用)，轻轻冲洗培养板，吸取细胞悬液至10ml离心管，2500rpm离心10min，弃去上清，加入200ul裂解液，充分吸打混匀，冰上孵育15min，12000rpm，4℃离心1小时，吸取上清液为细胞裂解(lysis，L)，分装、标记，-70℃冻存备用。

实施例5.重组质粒的抗原表达和免疫应答检测

5.1酶联免疫吸附试验(ELISA)，步骤如下：

5.1.1抗原包被：转染细胞的上清(S)和裂解(L)用1xPBS(ELISA用)按1∶5稀释，100ul/孔，加入ELISA板，4℃包被过夜。每个抗原均为双复孔包被。

5.1.2取出ELISA板，1xPBST洗5次。(PBST构成为10mMPBS和0.05％Tween-20)。

5.1.35％脱脂奶粉(用1xPBST配)每孔200μl。37℃，封闭1小时。

5.1.4弃封闭液，用1XPBST洗板5次。

5.1.5一抗为待检免疫血清，1∶200稀释(一抗稀释液：4％whey，0.5％Tween-20，PBS)，100ul/孔，37℃，孵育1小时。

5.1.6弃一抗，用1XPBST洗板5次。

5.1.7二抗：为羊抗兔IgG(H+L)-HRP(联科生物，进口分装)，1∶10000稀释(二抗稀释液：4％whey，0.5％Tween-20，PBS)。100ul/孔，37℃，孵育1小时。

5.1.8TMB显色。(TMB溶液配方：TMB片剂1片，0.1M磷酸枸橼酸缓冲液5ml，双蒸水5ml，30％双氧水2μl)，每孔加入100μl，室温，3.5min；每孔加入50μl 1M的H₂SO₄终止显色。

5.1.9检测。酶标仪测定并记录各孔A450值，计算复孔平均值，以免疫前血清OD值的2.1倍作为cut-off值，而且免疫后孔OD值小于0.05也去除。

ELISA检测结果见图3d、5b、5d及7b，结果显示，在第三次免疫后两周，pJW4303/VP1、pJW4303/tPA-VP1和pJW4303/tPA-VP1-tandem三种核酸疫苗免疫动物均在外周血中产生了特异性抗体；并且，加有tPA信号肽的核酸疫苗，其OD值(图5b)不仅明显高于未加tPA信号肽的核酸疫苗的OD值(图3b)，还在转染细胞的培养上清(pJW4303/tPA-VP1-S)中也检测到了分泌的VP1蛋白。在空载体pJW4303的裂解和上清中反应则均为阴性。

5.2Western blot检测血清中特异性抗体。步骤如下：

5.2.1首先制备10％的分离胶(5ml ddH₂O，5ml 30％丙烯酰胺溶液，5.7ml 1MTris/ClpH8.8，150μl 10％SDS，150μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，灌胶，液面顶端加入水，室温下凝聚20～30min。

5.2.2弃倒水，滤纸吸干，再制备5％的积层胶(4.1ml ddH₂O，1ml 30％丙烯酰胺溶液，0.75ml 1MTris/Cl pH6.8，60μl 10％SDS，60μl 10％过硫酸氨，6μl TEMED)，在积层胶上插入梳齿，待胶完全凝聚后，拔下梳齿。

5.2.3样品制备：质粒转染细胞的裂解和上清各20ul，加入5x蛋白上样缓冲液5μl，100℃，煮沸5min。

5.2.4将上述处理好的样品进行电泳，条件为20mA 1小时，40mA，1.5小时。

5.2.5转膜。采用湿转法。将胶上的蛋白转到PVDF膜上，100v，65min。

5.2.6转好的膜用5％脱脂奶粉封闭，4℃，过夜。

5.2.7用1xPBST洗膜两次。将膜浸在1∶500稀释的免疫血清或EV71患者阳性血清(一抗，用1％脱脂奶粉PBST稀释)中，室温，水平摇床25rpm，1小时。

5.2.81xPBST洗膜，水平摇床80rpm，6min/次，1小时。

5.2.9二抗孵育，为羊抗兔IgG(H+L)-HRP(联科生物，进口分装)，1∶10000稀释(用1％脱脂奶粉PBST稀释)。室温，水平摇床25rpm，1小时。

5.2.101xPBST洗膜，水平摇床80rpm，6min/次，1小时。

5.2.11发光剂(Pierce ECL Western Blotting KIT)加到膜上，暗室显影。

三种疫苗转染293T细胞，获得的转染细胞裂解和上清用western blot检测蛋白的表达和免疫血清中特异性抗体的产生。结果发现，三种核酸疫苗转染293T细胞均检测到了特异性VP1蛋白的表达，其中pJW4303/VP1的裂解提取液中(pJW4303/VP1-L，图3c)可见分子量约33kDa的VP1蛋白；pJW4303/tPA-VP1由于有tPA信号肽的修饰，可见在其转染细胞裂解提取液中(pJW4303/tPA-VP1-L，图5c)有一分子量约35kDa的VP1蛋白；pJW4303/tPA-VP1-tandem(图7c)则在细胞上清中分泌了一个约68kDa的VP1双聚体蛋白(pJW4303/tPA-VP1-tandem-S)，而且免疫动物产生的特异性抗体还能够识别前两种核酸疫苗表达的VP1蛋白。同时，三种形式的核酸疫苗在真核细胞中表达的VP1蛋白均能被天然EV71患者阳性血清所识别，并且pJW4303/tPA-VP1-L表达最强(图8)。上述图中均显示，空载体pJW4303转染产物中则没有表达特异性VP1蛋白。

5.3间接免疫荧光(IFA)，步骤如下：

5.3.1 293T细胞转染，方法同4.3.

5.3.2 48～72小时后弃培养液，1xPBS(细胞用)洗3次，室温晾干。

5.3.3固定：采用100％冷甲醇固定，-20℃30min。

5.3.4通透：采用-0.1％Triton X-100(用1xPBS配)处理细胞5分钟。1xPBS(细胞用)洗3次，室温晾干。

5.3.5封闭：封闭液为1％BSA，0.1％Tween-20的PBS，室温1h。1xPBS(细胞用)洗3次，室温晾干。

5.3.6一抗孵育：待检免疫血清1∶200稀释(用封闭液稀释)，室温1h。1xPBS(细胞用)洗3次，室温晾干。

5.3.7二抗孵育：羊抗兔-DyLight^TM488(联科生物，进口分装)，1∶200稀释(用封闭液稀释)，室温暗盒反应1小时。1xPBS(细胞用)洗3次(避光)，室温晾干。双蒸水洗1次。

5.3.8荧光显微镜下观察、拍照。如图5e-1，用pJW4303/tPA-VP1兔免疫血清检测pJW4303/tPA-VP1转染的293T细胞，能够识别细胞胞浆中表达的VP1特异性蛋白，而在pJW4303转染细胞中(图5e-2)则没有。

Claims

1.一种密码子优化的EV71 VP1基因，序列为SEQ ID NO.1。

2.一种含有EV71 VP1基因的重组载体，其特征在于该重组载体由序列为权利要求1所述的密码子优化的EV71 VP1基因与真核表达载体组成。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于所述的真核表达载体为经内切酶PstI和BamHI切割真核表达载体pJW4303得到的线性大片段。

4.一种含有EV71 VP1和人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的重组载体，其特征在于该重组载体是由权利要求1所述的EV71 VP1基因与一端含有人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的真核表达载体组成。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述的EV71 VP1基因是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR扩增得到的在5’端包含NheI内切酶位点，在3’端包含BamHI位点的VP1基因序列，该片段的5’端与真核表达载体含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连；所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割真核表达载体pJW4303得到的线性大片段。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述的pJW4303中的人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽与所述的EV71 VP1基因序列为SEQ ID NO.3。

7.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是由来自于权利要求1所述的EV71 VP1基因的片段1和片段2串联与一端含有人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的真核表达载体组成；所述的片段1是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR反应扩增得到的在5’端含有NheI内切酶位点，在3’端含有KpnI位点的EV71 VP1基因片段，其5’端与真核表达载体含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连，3’端与所述的片段2的5’端相连；所述的片段2是以SEQ ID NO.1为模板通过PCR反应扩增得到的在5’端含有KpnI内切酶位点，在3’端含有BamHI酶切位点的EV71 VP1基因片段，其5’端与片段1的3’端相连，其3’端与真核表达载体不含人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽基因的一端相连；所述的真核表达载体中的人组织纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽与所述的片段1和片段2基因序列为SEQ ID NO.4。

8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于所述的真核表达载体为经内切酶NheI和BamHI切割真核表达载体pJW4303得到的线性大片段。