CN115010815B - 一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于疫苗研制技术领域，提供了一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，具体为串联表达猪传染性胃肠炎病毒刺突蛋白抗原表位的乙肝核心病毒样颗粒(VLPs)的制备方法，该VLPs是由重组猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白A、D抗原表位的乙型肝炎病毒衣壳蛋白自行组装形成的空心化结构蛋白颗粒，其不仅拥有天然病毒的形状、大小，可以同时诱导特异性细胞和体液免疫应答，而且拥有成本低、生产周期短、理化性质稳定的特点，运用大肠杆菌表达系统即可大量生产。面对抗原多样性和高度变异性的挑战和传统疫苗的不足，该VLPs为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供了技术支持，为猪传染性胃肠炎的防控提供了可行的备选策略。

Description

一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法
技术领域
本发明属于疫苗研制技术领域，尤其涉及一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法。
背景技术
猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritisvirus，TGEV）感染猪引起的、以呕吐、严重急性腹泻、脱水和2周龄内仔猪高致死率（可达100%）为特征的一种高度接触性肠道传染病，不同品种和年龄的猪均易感染。该病于1946年在美国首次报道，常在每年冬季和早春季节呈暴发性流行，严重影响了我国养猪业的发展。目前，该病尚无有效治疗方法，因此疫苗免疫是控制该病流行与发展的主要措施。现在国内主要应用传统疫苗（灭活疫苗、弱毒疫苗）预防该病，但由于冠状病毒易于突变，且传统疫苗存在散毒、毒力反强等风险，使疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战。因此，应用基因工程技术研发新型疫苗对该病的防控具有重大意义。
利用重组技术研发亚单位疫苗是现代疫苗学的一个新方向。这类疫苗不含病毒的基因组，是一类相对安全的疫苗，而且易于生产、理化性质稳定。然而，亚单位疫苗免疫原性弱，需要用纳米尺度的抗原载体来递送才能增强免疫应答的强度和广度。当前，基于病毒样颗粒和亚病毒颗粒的纳米颗粒疫苗是亚单位疫苗的研究热点。乙型肝炎病毒核心衣壳蛋白抗原（hepatitis B virus core protein antigen，HBcAg）已被证实在体外表达后仍可自我组装成与原病毒形状、大小相似的空心化结构蛋白颗粒，且该蛋白的免疫显性区（majorimmunodominant region，MIR）可兼容最大138个氨基酸的外源基因而不影响其组装，因此HBcAg被认为是一种良好的纳米颗粒载体。基于HBcAg的病毒样颗粒可以在其表面“高丰度”地展示外源抗原，且颗粒本身有多个T细胞和B细胞表位，可以诱导极强的特异性细胞和体液免疫应答，在保持了亚单位疫苗生产周期短、安全性高且理化性质稳定等优点的同时，实现了对亚单位疫苗免疫原性较弱这一缺点的突破。利用大肠杆菌表达系统即可大规模生产乙肝核心病毒样颗粒，其便利性、快速性和高效性为TGEV疫苗研发中由抗原多样性和高度变异性带来的挑战提供了优秀的备选策略和先进的研发平台。
本发明为了提高HBcAg插入外源基因的耐受性，将HBcAg全长单体（1~183aa）与截短单体（1~144aa）基因串联，并在截短单体的MIR中插入TGEV高度保守的中和表位A、D，各部分之间以柔性连接肽—GS linker相接。这样的构建方法能够消除HBc二聚体组装时的随机性，减少对TGEV刺突区域外源蛋白结构的影响，获得更加规则、稳定的病毒样颗粒，为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供技术支持。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：设计并合成重组猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白A、D抗原表位的乙型肝炎病毒衣壳蛋白基因，即HBT/AD。以乙型肝炎病毒流行毒株CAPSD_HBVD1（UniProtKB：P03147）为参考株，选取其衣壳蛋白，即乙型肝炎病毒核心衣壳蛋白抗原（hepatitis Bvirus core protein antigen，HBcAg）作为骨架，将截短单体（1~144aa）与全长单体（1~183aa）串联，并在截短单体的MIR区中插入串联的TGEV WH_1株（GenBank：HQ462571.1）的A、D表位，各部分之间用GS linker连接。在所构建基因的N端加SacⅠ，C端加HindⅢ酶切位点。
步骤2：基因工程构建重组质粒。将HBT/AD基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)，PCR、双酶切鉴定正确后的重组质粒命名pET-28b-HBT/AD(+)。
步骤3：重组蛋白的诱导表达及鉴定。将pET-28b-HBT/AD(+)转化入表达宿主Escherichia coliBL21 DE3（Rosetta）感受态细胞，IPTG诱导并取诱导前和诱导后菌液进行SDS-PAGE分析。鉴定表达的菌液经超声破碎细胞分离上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白表达形式。
步骤4：重组蛋白的大量表达及纯化。活化工程菌并大量诱导，离心后菌体用含6M尿素的缓冲液重悬并超声，以镍柱纯化蛋白。
步骤5：包涵体蛋白的复性。BCA法测定纯化后的蛋白浓度，以相同组分的缓冲液稀释蛋白至0.4mg/mL，装入截留分子量8~14kDa的透析袋中，按4M、2M、1M，以及0M的尿素浓度进行梯度透析复性。
步骤6：VLP-HBT/AD的获得。复性后的HBT/AD蛋白能自发组装成乙肝核心病毒样颗粒。将步骤5中的透析袋包埋在PEG-4000粉末中，待蛋白浓缩至稀释前体积即可获得纯化的VLP-HBT/AD。
进一步的技术方案，A表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的技术方案，HBT/AD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。且HBT/AD基因的引物序列为：
上游引物HBT/AD-F：5′-cgagctcgatggatataga-3′；
下游引物HBT/AD-R：5′-ccaagcttttaacattggc-3′。
进一步的技术方案，所述步骤2的具体步骤如下：
按照现有技术，分别用SacI和HindIII对步骤（1）中合成获得的HBT/AD基因进行双酶切并回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶将上述酶切产物与pET-28b(+)（SacI和Hind III双酶切）质粒进行连接，连接体系为：基因酶切产物4μL；pET-28b(+)载体酶切产物1μL；5×Buffer 2μL；T4 DNA连接酶0.5μL；ddH2O 2.5μL。25℃连接2h后，16℃过夜连接。将连接产物通过热激法转化至Escherichia coliBL21 DE3（Rosetta）感受态细胞中，转化过程为：将10μL连接产物加入50μL感受态细胞中，冰浴3min，42℃热激45s，再冰浴5min后加入1mL无抗LB培养基中，37℃、200rpm培养40min，随后涂布于卡那抗性（卡那霉素终浓度50μg/mL）选择培养基并筛选阳性菌落。
对所筛选的阳性菌落进行扩增并提取质粒，采用PCR鉴定及酶切验证，以检测HBT/AD基因是否正确重组至pET-28b(+)载体中。
本发明实施例提供的一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其有益效果如下：
（1）VLPs自行组装，拥有更接近天然病毒的形态和大小，更容易激发机体的免疫反应，且乙肝核心VLPs在大肠杆菌表达系统中即可生产，成本低、生产周期短且性质稳定；
（2）由于VLPs不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内不会发生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程中不接触活的有感染力的病毒，因此非常安全；
（3）该VLPs以HBcAg作为纳米载体，可以于HBcAg所形成的VLPs表面“高丰度”地展示外源抗原，能够同时诱导特异性细胞和体液免疫应答。
附图说明
图1为pET-28b-HBT/AD(+)的PCR鉴定结果；
图2为pET-28b-HBT/AD(+)的酶切鉴定结果；
图3为在表达宿主Escherichia coliBL21 DE3（Rosetta）中HBT/AD蛋白表达情况的SDS-PAGE鉴定结果；
图4为包涵体蛋白HBT/AD的镍柱纯化情况；
图5为纯化后HBT/AD蛋白的浓度测定结果；
图6为VLP-HBT/AD的透射电镜图；
图7为VLP-HBT/AD免疫小鼠后血清中抗体的ELISA检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
实施例1
一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，就猪传染性胃肠炎的串联乙肝核心VLPs制备过程中表达HBT/AD重组蛋白的过程简要介绍如下：
（1）设计并合成HBT/AD基因
以乙型肝炎病毒流行毒株CAPSD_HBVD1（UniProtKB：P03147）为参考株，选取其衣壳蛋白，即乙型肝炎病毒核心衣壳蛋白抗原（hepatitis B virus core protein antigen，HBcAg）作为骨架，将截短单体（1~144aa）与全长单体（1~183aa）串联，并在截短单体的免疫显性区（major immunodominant region，MIR）中插入串联的TGEV WH_1株（GenBank：HQ462571.1）的A、D表位，各部分之间用GS linker连接。在所构建基因的N端加Sac Ⅰ，C端加HindⅢ酶切位点。A、D表位的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所合成的目的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
（2）基因工程构建重组质粒
按照现有技术，分别用SacI和HindIII对步骤（1）中合成获得的HBT/AD基因进行双酶切并回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶将上述酶切产物与pET-28b(+)（SacI和Hind III双酶切）质粒进行连接，连接体系为：基因酶切产物4μL；pET-28b(+)载体酶切产物1μL；5×Buffer 2μL；T4 DNA连接酶0.5μL；ddH2O 2.5μL。25℃连接2h后，16℃过夜连接。将连接产物通过热激法转化至Escherichia coliBL21 DE3（Rosetta）感受态细胞中，转化过程为：将10μL连接产物加入50μL感受态细胞中，冰浴3min，42℃热激45s，再冰浴5min后加入1mL无抗LB培养基中，37℃、200rpm培养40min，随后涂布于卡那抗性（卡那霉素终浓度50μg/mL）选择培养基并筛选阳性菌落。
对所筛选的阳性菌落进行扩增并提取质粒，采用PCR鉴定及酶切验证，以检测HBT/AD基因是否正确重组至pET-28b(+)载体中，如图1（其中M为Trans2K DNA marker；泳道1为目的基因HBT/AD采用引物HBT/AD-F和HBT/AD-R的PCR扩增结果，片段大小约为1,400bp）、图2（其中M为Trans5K DNA marker；泳道1为pET-28b-HBT/AD(+)采用SacI和HindIII酶切的结果，片段大小约为1,400bp）所示，成功构建重组质粒pET-28b-HBT/AD(+)。
（3）重组蛋白HBT/AD的诱导表达
在5mL卡那抗性液体LB培养基中活化步骤（2）中鉴定正确的重组大肠杆菌，待OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，置于37℃、200rpm摇床上诱导4h。
收取诱导后菌液，4℃，8,000g离心15min，弃去上清，沉淀用5mL PBS重悬后进行超声至液体澄清，再次4℃，8,000g离心15min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用与上清等体积的PBS重悬，对上清液和沉淀进行Western blot鉴定。
分别取40μL上清样品与沉淀样品，与蛋白上样缓冲液按4:1的比例混匀后，煮沸10min，12,000g离心3min，然后将样品加入上样孔，采用半干式转移，80V恒压跑完上层浓缩胶，120V跑完下层分离胶。将胶条割至合适大小，并将PVDF膜、滤纸剪至与胶条等大，其中PVDF膜在甲醇中敏化15s后，与胶条、滤纸一同转移至转膜缓冲液中浸泡15min。转膜时，从下至上依次按阳极碳板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸和阴极碳板的顺序放置对齐，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源，恒压20V，转移20min。转移结束后，断开电源将膜取出，做免疫印迹。将膜放入含5%脱脂奶粉的PBS中，室温摇床封闭1h。弃封闭液，用PBST洗膜3次，每次15min。加入1:500稀释的猪传染性胃肠炎病毒猪血清作为一抗，4℃过夜后弃一抗，用PBST洗膜3次，每次15min。然后加入1:5,000稀释的兔抗猪IgG二抗，室温孵育1h后弃二抗，用PBST洗膜3次，每次15min。用ECL发光液进行显影，查看结果。结果如图3（其中M为Thermo蛋白marker #26616；泳道1为蛋白诱导并破碎离心后的上清液样品；泳道2为蛋白诱导并破碎离心后的沉淀样品）所示，Western blot检测到蛋白大小约为54.3kDa，蛋白以包涵体形式大量存在于沉淀中。
实施例2
本实施例就猪传染性胃肠炎病毒的串联乙肝核心VLPs中HBT/AD蛋白的纯化、组装和鉴定过程简要介绍如下：
（1）重组蛋白HBT/AD的纯化
将实施例1中所获得的重组大肠杆菌活化后加至500mL卡那抗性的液体LB培养基中进行扩增培养，待OD600达到0.6~0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG，置于37℃、200rpm摇床上诱导4h。
收取诱导后菌液，4℃，8,000g离心15min，弃去上清，沉淀用40mL含6M尿素的Tris-HCl缓冲液重悬后置于50mL玻璃烧杯中，烧杯周围填满冰水混合物以保证低温环境，将超声探头插入烧杯液面以下但不触碰杯底，35%功率超5s，停5s，直至液体澄清透亮。超声后菌液于4℃，12,000g离心20min，弃去沉淀并用过滤膜去除细胞碎片和杂质。
取出准备好的重力预装柱，加入1~2mL填料，打开阀门使乙醇流出，也可加入10mLddH2O确保乙醇完全流出。镍柱再生处理后，用10倍柱体积的Binding Buffer平衡树脂pH值，加入过滤膜后的上清液与平衡好的树脂4℃结合1h、或重复过柱，分别用5倍柱体积的Binding buffer和Wash buffer洗杂，注意添加缓冲液时要贴壁、轻柔，不要将压平的填料重悬。洗杂后，用5mL Elution buffer洗脱。将未纯化蛋白、上样液、洗杂液和洗脱液分别制样进行SDS-PAGE，分析蛋白纯化情况，结果如图4（其中M为Thermo蛋白marker #26616；泳道1为未纯化蛋白液；泳道2为流穿液；泳道3为洗杂液；泳道4为洗脱液）所示。
用BCA试剂盒（SIGMA-ALDRICH）对纯化后的蛋白进行浓度测定。将标准品蛋白按终浓度0、25、50、100、200、500μg/mL稀释，分别按顺序加20μL至96孔酶标板中，另作一组平行对照；BCA与sulfate solution以50:1的比例配制成工作液，每孔加200μL与蛋白样品混合；添加完蛋白样品和工作液的酶标板在微量震荡仪上振荡30s混匀，放入37℃反应30~60min，待液体明显变成紫色后取出，置于酶标仪上进行读数，波长为562nm；将每个稀释度的读数取平均值作为y轴，稀释度作为x轴，用Excel作标准曲线，R2值＞0.99为好。根据蛋白纯化SDS-PAGE图预估蛋白浓度，用Elution buffer将其稀释到浓度能够落在0~2000μg/mL的测量区间；在96孔酶标板中加入200μL配制好的工作液，加入20μL待测样品蛋白，每个样品作3个重复对照；添加完蛋白样品和工作液的酶标板在微量震荡仪上振荡30s混匀，37℃反应30~60min，于酶标仪562nm处读数。读数取平均值作为y值，代入标准曲线，所得x值即为稀释后的蛋白浓度，如图5（其中图（a）为标准曲线的制备图，从左到右标准蛋白的终浓度为0、25、50、100、200、500μg/mL；上下两排为平行对照。图（b）为HBT/AD蛋白与BCA试剂反应后的显色结果，四孔皆为平行对照。图（b）的读数结果带入由图（a）得到的标准曲线，可知本次纯化的HBT/AD蛋白浓度为2.235mg/mL）所示。
（2）VLP-HBT/AD的组装
运用蛋白质的透析复性法使HBT/AD蛋白恢复空间结构，自组装成病毒样颗粒。将样品蛋白浓度稀释至0~1mg/mL，小心装至处理好的透析袋中，两头用封口夹夹紧；配制4M尿素透析液：20mM Tris-HCl、500mM NaCl、4M Urea，pH8.0，将透析袋小心放入透析液中，确保蛋白样品完全浸没在透析液里，尽量保证透析袋与透析液的接触面积最大，置于4℃透析6~8h；按相同操作配制2M、1M和0M的尿素透析液，分别对样品进行梯度透析。
从透析液中小心取出透析袋，置于洁净托盘上，直接将PEG4000颗粒覆盖透析袋表面；或配制50% PEG4000溶液，将透析袋浸没其中，4℃浓缩4h。浓缩到预期体积后，小心从透析袋中吸出蛋白样品置于2mL离心管中，4℃ 12,000g离心3min，弃沉淀，上清为复性后目的蛋白自组装成的VLP-HBT/AD。
（3）VLP-HBT/AD的鉴定
将VLP-HBT/AD滴加到400目铜网上，静置5min，用1%的磷钨酸对铜网进行负染，作用3min，用滤纸吸掉多余的染液。在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态。如图6所示，观察到与天然乙型肝炎病毒形状、大小相似的VLP-HBT/AD。
实施例3
本实施例就实施例2所制备的VLP-HBT/AD作为疫苗使用时的免疫效果进行简要评价。
（1）免疫程序及攻毒方案
将6周龄SPF级BALB/c小鼠分为高（75μg）、中（50μg）、低（25μg）三个免疫剂量组，并设置PBS阴性对照组。将制备好的VLPs与等体积的弗式不完全佐剂于冰上震荡混合，乳化至混合液滴于PBS液面不散开，三个剂量组的疫苗制备方法相同。小鼠适应两天后，采用背部皮下多点注射法进行首免，各组小鼠按剂量注射，PBS对照组注射等量无菌PBS溶液。一共免疫3次，每隔一周免疫一次，后两次的疫苗用弗式完全佐剂制备，方法同上。
分别于首免后7d、14d、28d、42d后进行小鼠尾尖采血，分离血清用于ELISA抗体检测。
（2）免疫程序及攻毒方案
使用间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清抗体，具体步骤如下：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将实验室保存的TGEV病毒液进行1:5稀释后加入酶标板中，100µL/孔，4℃包被过夜。用含0.05%吐温的PBST溶液洗涤4次，3min/次。拍干后加入8% BSA，200µL/孔，37℃封闭1h。弃液，PBST洗涤4次，3min/次，拍干。每孔加入2% BSA稀释的鼠血清100µL，稀释度依次为：1:200、1:400、1:800、1:1,600、1:3,200、1:6,400、1:12,800、1:25,600，37℃孵育1h。PBST洗涤4次，3min/次，洗3次后再洗5min，拍干后加入1:1000倍稀释的HPR标记羊抗鼠IgG酶标抗体，100µL/孔，37℃孵育1h。同上步骤洗板，拍干后每孔加入100µL的TMB显色液，37℃避光显色15min。15min后立即加入100µL 0.5M H2SO4终止反应，然后测定OD450值。
结果如图7所示。高、中、低剂量的VLP-HBT/AD分别免疫小鼠，用TGEV全病毒包被抗原检测小鼠免疫后的血清抗体效价，发现免疫剂量与抗体效价呈正相关，首免后直至第28d后，各VLP-HBT/AD免疫组的ELISA抗体效价持续升高，表明VLP-HBT/AD具有良好的免疫原性。
综上所述，本发明专利设计和制备的重组蛋白HBT/AD在纯化复性后可自组装形成VLP-HBT/AD，免疫小鼠后能诱导机体产生特异性抗体，为猪传染性胃肠炎的疫苗研发提供了技术支持。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcgtagtg gttatggtca acccatagcc tcaacattaa gtaacatcac actaccaatg 60
caggatcaca acaccgatgt gtactgtatt cgttctgacc aattttcagt ttatgttcat 120
tctacttgca aaagtgcttt atgggacaat atttttaagc ga 162
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttatacag tgagtgactc gagctttttc agttacggtg aaattccgtt cggcgtaact 60
gatggaccac ggtactgt 78
<210> 3
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggatatag acccctataa agaatttgga gcgaccgtgg aattgctgtc ctttttgccg 60
tctgactttt tcccgtccgt cagagacctg ctggataccg cggcggctct gtaccgcgat 120
gccttggaga gcccggagca ctgcagcccg caccacaccg ctctgcgtca agcgattctg 180
tgctggggtg agttaatgac cctagcgact tgggttggca ccaacttgga aggtagcggc 240
ggtagcggga agcgcagcgg ttatggtcag ccgatcgcgt ccaccctgag caatatcacc 300
ctgccgatgc aggatcataa tacggatgtt tactgcatcc gctcagatca gttttctgtt 360
tacgttcata gcacctgtaa aagcgcactt tgggataaca tttttaagcg cggttctagc 420
gactgttata ccgttagcga cagctcgttc tttagctacg gcgagatccc gtttggcgtc 480
accgatggtc cgcgttattg cggttccggc ggtagcggcg atccggcctc ccgcgacctg 540
gtggtgagct acgtgaatac taacatgggc ctgaagttcc gtcaactgct gtggttccac 600
atcagctgcc tgacctttgg ccgtgagacg gtcctggaat acctcgtttc gttcggcgtg 660
tggattcgta ccccgccagc gtatcgtccg cccaacgcac cgatcctcag cacgttaccg 720
gaaaccaccg ttgtgggtgg ctccagcggt ggctctggcg gcagtggcgg ctctggtgga 780
tctggtggct ccggaggctc taccatggat attgatccgt ataaagaatt cggcgcaacc 840
gtggaacttt tgagcttcct gccgtccgac ttcttcccgt ccgttcgtga cctgttggac 900
accgctgctg cgctgtaccg cgacgcgttg gagagcccgg agcactgcag cccacaccat 960
accgcgctgc gtcaggcaat tctgtgctgg ggtgagctga tgaccctggc aacttgggtt 1020
ggtacgaatc tggagtttgc aggtgcgagc gacccggctt cacgtgactt ggttgttagc 1080
tatgtgaaca cgaacatggg tctgaaattc cgccaactgc tctggtttca tattagctgt 1140
ctgacctttg gtcgtgaaac ggtactggag tacttggtgt cgttcggtgt gtggatccgt 1200
accccgcctg cctaccgtcc gccgaacgcc ccaatcctgt ctacgttgcc tgaaaccacc 1260
gtcgtgcgtc gtcgcggtag gtctccgcgt cgtcgtacac cgagtccgcg gcgccgacgc 1320
agccagagcc cgcgtcgtag acgttcccag agccgcgaaa gccaatgtta a 1371

Claims (5)

1.一种猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：设计并合成重组猪传染性胃肠炎病毒表面刺突蛋白A、D抗原表位的乙型肝炎病毒衣壳蛋白基因，即HBT/AD，以乙型肝炎病毒流行毒株CAPSD_HBVD1为参考株，选取其衣壳蛋白作为骨架，将截短单体与全长单体串联，并在截短单体的MIR区中插入串联的猪传染性胃肠炎病毒WH_1株的A、D表位，各部分之间用GS linker连接，在所构建基因的N端加Sac Ⅰ，C端加Hind Ⅲ酶切位点；
步骤2：基因工程构建重组质粒，将HBT/AD基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)，PCR、双酶切鉴定正确后的重组质粒命名pET-28b-HBT/AD(+)；
步骤3：重组蛋白的诱导表达及鉴定，将pET-28b-HBT/AD(+)转化入表达宿主Escherichia coli BL21 DE3（Rosetta）感受态细胞，IPTG诱导并取诱导前和诱导后菌液进行SDS-PAGE分析，鉴定表达的菌液经超声破碎细胞分离上清和沉淀，SDS-PAGE分析蛋白表达形式；
步骤4：重组蛋白的大量表达及纯化，活化工程菌并大量诱导，离心后菌体用含6M尿素的缓冲液重悬并超声，以镍柱纯化蛋白；
步骤5：包涵体蛋白的复性，BCA法测定纯化后的蛋白浓度，以相同组分的缓冲液稀释蛋白至0.4mg/mL，装入截留分子量8~14kDa的透析袋中，按4M、2M、1M以及0M的尿素浓度进行梯度透析复性；
步骤6：VLP-HBT/AD的获得，复性后的HBT/AD蛋白能自发组装成乙肝核心病毒样颗粒，将步骤5中的透析袋包埋在PEG-4000粉末中，待蛋白浓缩至稀释前体积即可获得纯化的VLP-HBT/AD；
A表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，D表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
HBT/AD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，HBT/AD基因的引物序列为：
上游引物HBT/AD-F：5′-cgagctcgatggatataga-3′；
下游引物HBT/AD-R：5′-ccaagcttttaacattggc-3′。
3.根据权利要求1所述的猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2的具体步骤如下：
步骤2.1：按照现有技术，分别用Sac I和Hind III对步骤1中合成获得的HBT/AD基因进行双酶切并回收酶切产物，利用T4 DNA连接酶将上述酶切产物与pET-28b(+)质粒进行连接，将连接产物通过热激法转化至Escherichia coli BL21 DE3（Rosetta）感受态细胞中；
步骤2.2：对所筛选的阳性菌落进行扩增并提取质粒，采用PCR鉴定及酶切验证，以检测HBT/AD基因是否正确重组至pET-28b(+)载体中。
4.根据权利要求3所述的猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤2.1中，利用T4 DNA连接酶将上述酶切产物与pET-28b(+)质粒进行连接的连接体系为：基因酶切产物4μL；pET-28b(+)载体酶切产物1μL；5×Buffer 2μL；T4 DNA连接酶0.5μL；ddH2O 2.5μL；25℃连接2h后，16℃过夜连接。
5.根据权利要求3所述的猪用串联乙肝核心病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，在所述步骤2.1中，将连接产物通过热激法转化至Escherichia coli BL21 DE3（Rosetta）感受态细胞中的转化过程为：将10μL连接产物加入50μL感受态细胞中，冰浴3min，42℃热激45s，再冰浴5min后加入1mL无抗LB培养基中，37℃、200rpm培养40min，随后涂布于卡那抗性选择培养基并筛选阳性菌落。
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