CN105462937A

CN105462937A - 一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

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Publication number: CN105462937A
Application number: CN201610040285.0A
Authority: CN
Inventors: 潘兹书; 霍春玲; 杨洁
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Henan Jerry Biotechnology Research Institute Co.,Ltd.
Priority date: 2016-01-21
Filing date: 2016-01-21
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2036-01-21
Also published as: CN105462937B

Abstract

本发明公开了一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明的嵌合病毒样颗粒为基于乙型肝炎病毒核心蛋白的重组肠道病毒多表位嵌合抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；编码该病毒样颗粒的DNA片段的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。将SEQ？ID？NO.2所示DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体中构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化大肠杆菌，获得工程菌；培养工程菌，经诱导表达和蛋白纯化等操作得到肠道病毒嵌合病毒样颗粒。本发明的病毒样颗粒能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，可用于人和易感动物肠道病毒EV71和CA16感染的免疫预防，用于制备肠道病毒疫苗。

Description

一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病(Hand,footandmouthdisease,HFMD)是由肠道病毒感染引起的一种病毒性传染病，主要感染婴幼儿。表现为发热，手、足、口腔等部位出现皮疹和溃疡等临床特征。少数患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等重症并发症，导致死亡(Leeetal.,2009；Liuetal.,2014)。手足口病的主要病原体为肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇A16型(CoxsackieA16，CA16)。EV71感染常引发严重的中枢神经系统疾病及并发症，CA16主要引起心肌炎和心包炎等疾病(Leeetal.,2009)。近年来，我国HFMD的暴发流行呈增加态势，重症病例增多，并发症的发生率与病死率增高。目前有效治疗HFMD的药物缺乏，疫苗免疫接种成为预防HFMD暴发流行、减少重症病例和降低死亡率的最有效手段之一。因此，研发安全有效、能够预防EV71和CA16感染的疫苗用于易感人群免疫接种，是防控HFMD爆发流行、保障儿童健康和生命安全的关键(Caietal.,2014)。

EV71和CA16均属于小RNA病毒科、肠道病毒属成员，两者具有类似的结构和生物学特性。病毒基因组为单股正链RNA，由7400多个核苷酸组成(Xuetal.,2010)，基因组包含一个大的开放阅读框(ORF)，编码由2194个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白经水解产生P1、P2、P3三个前体蛋白，其中P1进一步加工成VP1、VP2、VP3和VP4等四个衣壳蛋白。在病毒粒子中，VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧，与病毒核心紧密连接，VP1、VP2和VP3嵌在病毒颗粒表面。VP1、VP2和VP3蛋白中的一些保守氨基酸构成的表位能够诱导与多种亚型EV71发生反应的中和抗体，产生交叉保护免疫；或通过诱导EV71特异性CD4⁺T细胞应答增强体液免疫应答(Fooetal.,2007b；Weietal.,2012)；同样，由CA16VP1的保守氨基酸表位能够诱导中和抗体，保护机体抵抗CA16感染(Shietal.,2013)。这些VP蛋白中的保守氨基酸抗原表位是研制手足口病亚单位疫苗预防EV71和CA16感染的重要靶标。

目前，由于缺少治疗儿童EV71和CA16感染引起手足口病的有效手段，研发安全有效的疫苗是HFMD疾病防控研究的重点领域。手足口病疫苗研制的难点在于肠道病毒类别多样和毒株变异等。近年来，在开发EV71疫苗方面已经进行了广泛探索，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、表位多肽疫苗和病毒样颗粒疫苗等。其中，一些单位研制EV71全病毒灭活疫苗已经进入临床。这类疫苗免疫接种能诱导机体产生抵抗同型病毒感染的中和抗体和抗感染免疫保护，但对于异型病毒感染没有保护作用。Arita等制备了一株EV71减毒EV71毒株(S1-3')，该毒株神经毒性和传染能力有所降低。免疫接种可有效诱导抗病毒免疫，但静脉注射接种引起轻微的神经疾病症状。亚单位疫苗通常包含病原体的若干抗原蛋白，不存在减毒活疫苗潜在的毒力回复的风险，更为安全(Aritaetal.,2008；Aritaetal.,2005)。Wu等采用大肠杆菌表达重组蛋白VP1，结合佐剂免疫接种，可有效诱导中和抗体和T细胞应答(Wuetal.,2001)，表明VP1蛋白是EV71的保护性抗原。尽管已有EV71的DNA疫苗研究的报道，但与病毒颗粒相比，DNA疫苗只诱导较弱的免疫应答。此外，有研究表明，EV71的CD4⁺T细胞抗原表位和B细胞抗原表位主要由VP1蛋白的氨基酸序列的66-77、145-159和247-261区域构成，这些表位能诱导产生中和抗体、CD4⁺T细胞应答，以及细胞因子IL-2和IFN-γ产生(Fooetal.,2007a；Fooetal.,2007b)。

病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)是不含遗传物质的病毒颗粒，由含有结构蛋白和膜结构组成，也可由具有自组装能力的蛋白质组装形成。病毒样颗粒中的蛋白质具有天然构像，能有效诱导机体产生中和抗体和细胞免疫应答，具有发展成安全有效新型疫苗的潜在优势，VLPs疫苗是近年来新疫苗研发的重点方向之一。目前，人们将VLPs用于发展EV71新疫苗方面进行了许多探索。Hu等利用重组杆状病毒表达系统同时表达EV71的3CD和P1前体蛋白，3CD蛋白将P1前体蛋白切割为VP1、VP3和VP0，并组装形成VLPs。小鼠免疫接种证实，该VLPs能诱导体液和细胞免疫应答。通过昆虫细胞的大规模培养，能够规模化生产VLPs疫苗(Huetal.,2003)。

乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBc)是病毒感染过程中编码的一种抗原蛋白，能自组装成病毒样颗粒，包裹病毒核酸。HBc病毒样颗粒有两种大小，分别由180个和240个单体核心抗原蛋白组成的二十面体(Wynneetal.,1999)。HBc全长为183氨基酸(AA)，其中AA75-82为抗原区，位于病毒样粒子表面，构成中间穗状区。HBc的C末端39个AA富含精氨酸，具有结合病毒核酸的功能。该区域去除后不影响HBc形成病毒样颗粒。截短的HBc能在大肠杆菌中高效表达，并自主装配成病毒样颗粒。HBc的中间穗状区和截断后的C末段位于病毒粒子表面，可融合表达外源抗原表位(Birkettetal.,2002)。融合外源抗原表位的HBc仍可组装成嵌合VLPs，免疫接种可诱导动物产生有效的免疫应答(PumpensandGrens,2001)。HBc作为载体蛋白可在大肠杆菌表达外源抗原片段并组装成VLPs，用于制备VLPs疫苗。这种新型的抗原表位递呈系统已应用于流感病毒、艾滋病毒和结核分枝杆菌等病原体VLPs疫苗研制(DeFiletteetal.,2006；Gonzalezetal.,2009；Yinetal.,2011)。

本发明通过优化设计、实验筛选，发明了基于HBc为载体蛋白，融合表达展示包含有EV71和CA16VP1蛋白抗原表位和EV71VP2蛋白抗原表位的病毒样颗粒疫苗，建立了评价该病毒样颗粒疫苗效力的小鼠模型。本发明为预防易感人群的EV71和CA16感染提供疫苗制品，为基于大肠杆菌表达系统构建VLPs疫苗提供技术方法，具有重要的科学和应用价值。

主要参考文献：

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发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的肠道病毒嵌合病毒样颗粒(VLPs)疫苗及其制备方法和应用。该病毒样颗粒疫苗不含病毒核酸，抗原纯度高，模拟抗原蛋白的天然结构，安全高效。免疫接种能诱导机体产生抗肠道病毒EV71和CA16感染的保护性免疫应答。用于肠道病毒EV71和CA16感染引起的手足口病的免疫预防。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒，为基于乙型肝炎病毒核心蛋白的重组肠道病毒多表位嵌合抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。该嵌合病毒样颗粒以截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc1-144aa)为载体蛋白，将EV71编码的VP1蛋白第208-222位氨基酸残基和CA16编码的VP1蛋白第271-285位氨基酸残基经接头肽段连接的融合片段替换HBc肽段的Asn75与Ser81之间残基，同时将EV71编码VP2蛋白第248-263位氨基酸残基融合在截短蛋白HBc1-144aa的C端。这些氨基酸残疾与与截短的乙肝病毒核心抗原融合表达，能自主装配成病毒样颗粒。

所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答，可用于人和易感动物肠道病毒EV71和CA16感染的免疫预防，用于制备肠道病毒疫苗。如将嵌合病毒样颗粒用无菌PBS稀释至适当浓度，制成肠道病毒病毒样颗粒疫苗。

一种肠道病毒疫苗，包含所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒。

所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒还可用于制备肠道病毒感染的血清学诊断试剂或诊断试剂盒。

编码所述肠道病毒嵌合病毒样颗粒的DNA片段，其核苷酸序列优选如SEQIDNO.2所示。

所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：将经密码子优化设计、实验筛选获得的序列如SEQIDNO.2所示DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体中，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化大肠杆菌，获得工程菌；培养工程菌，经诱导表达、亲和层析纯化和体外复性等操作得到肠道病毒嵌合病毒样颗粒。

本发明具有如下有益效果：

本发明的肠道病毒嵌合病毒颗粒疫苗比传统的EV71更安全；该病毒颗粒疫苗免疫接种小鼠能诱导机体产生特异性体液和细胞免疫应答；免疫母鼠产生的乳鼠获得抗致死剂量EV71攻击感染的完全保护，以及抗CA16致死感染的部分保护。

附图说明

图1是用于表达肠道病毒嵌合病毒样颗粒的重组表达质粒的结构示意图，E1、E2、E3分别为EV71VP1蛋白208-222aa、CA16VP1蛋白271-285aa、EV71VP2蛋白248-263aa。这些序列也可是经实验筛选的其它保护性抗原表位序列。

图2是重组嵌合蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE、Westernblot鉴定结果图。(A)为SDS-PAGE鉴定结果；(B)、(C)为Westernblot鉴定结果，图(B)、(C)检测的一抗分别为抗His单克隆抗体、抗HBc单克隆抗体；泳道1和2为表达的tHBc-SPA和tHBc，M为分子量Marker。

图3是重组嵌合蛋白纯化组分SDS-PAGE鉴定和形成的病毒样颗粒透射电镜图。(A)为SDS-PAGE鉴定结果，泳道1和2为纯化的tHBc-SPA和tHBc，M为分子量Marker；(B)、(C)分别为tHBc-SPA和tHBc形成的病毒样颗粒透射电镜图。

图4是重组嵌合病毒样颗粒免疫小鼠诱导的特异性体液免疫应答结果图。(A)为血清中EV71特异性IgG浓度，(B)为血清中EV71中和抗体滴度；(C)为血清中CA16交叉反应IgG浓度，(D)为血清中CA16交叉中和抗体滴度。

图5是重组嵌合病毒样颗粒免疫小鼠诱导的细胞免疫应答结果图。(A)为Th1类细胞因子，(B)为Th2类细胞因子。

图6是重组嵌合病毒样颗粒免疫小鼠诱导的抵抗EV71和CA16致死攻毒感染免疫保护效率结果图。(A)为致死剂量EV71感染乳鼠存活情况，(B)为致死剂量CA16感染乳鼠存活情况。

具体实施方式

现结合以下实施例来更加详细地描述本发明。提供这些实施例的目的仅在于示例性地说明本发明，不能将其理解为是对本发明范围和实质的限制。

下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南等书中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

实施例1肠道病毒嵌合病毒样颗粒(VLPs)疫苗的构建

1、融合片段tHBc-SPA的合成

本发明经过密码子优化、实验筛选获得了融合片段tHBc-SPA。融合片段tHBc-SPA是由编码HBc的1-144aa(1-74aa和82-144aa)与EV71VP1蛋白的208-222aa、CA16VP1的271-285aa和EV71VP2蛋白的248-263aa的核苷酸组成。其中，EV71VP1蛋白的208-222aa和CA16VP1蛋白的271-285aa用9个氨基酸(GGGGSGGGG)连接并在该肽段两端各引入同样的9个氨基酸后替换HBc的75-81aa，EV71VP2蛋白的248-263aa在HBc1-144aa的C端。融合片段tHBc-SPA的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；融合片段tHBc-SPA编码的氨基酸能自组装形成病毒样颗粒，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

委托商业公司合成融合片段tHBc-SPA并克隆到质粒pUC57上，得到重组质粒pUC57(tHBc-SPA)。

2、重组嵌合蛋白表达质粒ptHBc-SPA的构建

1)重组表达质粒ptHBc-SPA的构建

(1)质粒pUC57(tHBc-SPA)和载体质粒pET28a分别用NcoI和XhoI进行双酶切消化，获得目的基因片段tHBc-SPA和线性化的pET28a载体。双酶切消化反应按照下述体系(共20μL)依次加入各组分：质粒pUC57(tHBc-SPA)或pET28a载体10μL，10×Tangobuffer4μL，NcoⅠ1μL，XhoⅠ1μL，无菌ddH₂O4μL。混均，置于37℃水浴中酶切消化8-12小时。

(2)酶切消化目的基因或载体DNA后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，目的基因片段大小应为630bp，载体DNA大小应为5223bp，电泳结果与预期一致。按胶回收试剂盒说明切胶回收DNA。

(3)将胶回收的酶切消化目的基因与载体DNA连接，按照下述连接体系(共10μL)依次加入各组分：tHBc-SPA酶切片段1.5μL，pET28a酶切片段1.0μL，T4buffer(10×)1.0μL，T4DNA连接酶1.0μL，无菌ddH₂O5.5μL。混均，置于22℃连接反应20min或4℃过夜。

(4)上述连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

①将冻存的大肠杆菌DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置室温或冰浴缓慢解冻。取5-10μL连接产物加入到感受态细胞(EP管)中，轻轻混匀，于冰上放置30分钟。

②将上述含连接产物的感受态细胞EP管从冰浴中取出，放入42℃的水浴中静置精确反应90秒。

③迅速将上述EP管转移至冰浴中，放置2分钟。

④无菌操作向EP管中加入800μL预热至37℃不含抗生素的LB培养基，置于37℃、80-90rpm培养45分钟。

⑤取上述培养液50-100μL加到含卡那霉素LB琼脂平板上，用无菌玻棒将菌液涂布均匀，平板正置于37℃培养箱30分钟待培养液被完全吸收，然后将平板倒置培养过夜。

(5)菌落PCR鉴定转化了重组表达质粒ptHBc-SPA的阳性菌落。

挑取过夜培养在卡那霉素抗性的LB平板上长出的单菌落5-10个，分别接种于装有400μL卡那霉素抗性LB培养基的EP管中，37℃、220rpm培养4-5h。

取2μL菌液为模板，以引物P1和P2为引物，按下述体系依次加入各组分：无菌ddH₂O15.1μL，引物P10.2μL，引物P20.2μL，待检测菌液2.0μL，dNTPs0.3μL，TaqplusDNA聚合酶，按如下反应程序进行PCR扩增：94℃预变性5分钟；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸5分钟。

P1(上游引物)：5’-CATGCCATGGATGGACATCGACCCTTAC-3’(SEQIDNO.3)，下划线标注序列为NcoⅠ酶切位点；

P2(下游引物)：5’-CCGCTCGAGAGGCAGAGTAGACAGAATC-3’(SEQIDNO.4)，下划线标注序列为XhoⅠ酶切位点。

扩增完成后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，有目的基因片段扩增的菌液即为含有重组表达质粒ptHBc-SPA的阳性克隆。

(6)重组表达质粒ptHBc-SPA的小量提取及鉴定。

按质粒小量提取试剂盒操作说明书描述的方法提取重组质粒。

①将阳性克隆培养菌液按1:100比例接种于6mL含卡那霉素的LB培养基中，于恒温摇床中在37℃、220rpm振荡培养过夜。

②将过夜培养物转至EP管中，10000rpm离心1分钟，弃上清，收集菌体。依次加入250μL溶液Ⅰ(4℃保存、含RNaseA)，用微量移液器反复吹打混匀，完全重悬菌体；加入250μL溶液Ⅱ，盖紧管盖，轻柔反复颠倒EP管5-6次，室温静置2分钟；加入350μL溶液Ⅲ，盖紧管盖，缓慢颠倒摇晃几次，观察到白色絮状沉淀产生。

③上述EP管于12000rpm室温离心10分钟，小心吸取上清转移至套有收集管的DNA吸附柱中，10000rpm室温离心1分钟；将收集管中的液体再次加至吸附柱中，10000rpm室温离心1分钟；弃去收集管中液体，向吸附柱内加入500μLBufferHB，10000rpm室温离心1分钟；弃去收集管中液体，向吸附柱内加入700μLDNAWashBuffer，10000rpm室温离心1分钟，重复1次；弃去收集管中的液体后，将吸附柱重新放回收集管中，10000rpm离心2分钟以完全除去柱膜上的残余液体。

④将吸附柱放入另一个无菌EP管中，加入50μL试剂盒中的ElutionBuffer或同样体积的无菌ddH₂O，溶解吸附柱上的DNA，室温静置2分钟；10000rpm室温离心1分钟，EP管中收集的液体即为质粒DNA溶液。取1μL质粒DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA含量。

⑤于250μLEP管中按下述体系依次加入各组分：质粒溶液10μL、10×Tangobuffer4μL、NcoⅠ1μL、XhoⅠ1μL、无菌ddH₂O4μL，酶切消化鉴定重组表达质粒。混均，置于37℃水浴中酶切消化反应8-12小时，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察分析条带是否与预期相符。

⑥对酶切产物符合预期的重组质粒ptHBc-SPA进行测序，确认插入片段tHBc-SPA序列、插入方向和开放阅读框的正确性，重组质粒ptHBc-SPA的结构见图1。

2)重组表达质粒ptHBc的构建

(1)以质粒ptHBc-SPA为模板，以P1和P3为引物，PCR扩增目的基因片段tHBc-N(1-225bp)；以P4和P2为引物，PCR扩增目的基因片段tHBc-C(226-421bp)。引物由上海生物工程有限公司合成，序列具体如下：

P3(下游引物)：

5’-CGTAAGAAACAACCAGTTCACGAGAACCAACCCAAGTCGCCAGG-3’(SEQIDNO.5)；

P4(上游引物)：

5’-CCTGGCGACTTGGGTTGGTTCTCGTGAACTGGTTGTTTCTTACG-3’(SEQIDNO.6)。

(2)按照下述PCR扩增体系组成依次加入各组分：无菌ddH₂O33μL，引物P1/P3或引物P4/P2各1μL，模板pUC57(tHBc-SPA)1μL，dNTPs5μL，KODplusDNA聚合酶1μL，KODplusDNA聚合酶10×Buffer5μL，Mg²⁺3μL。

(3)按照下述PCR扩增程序进行PCR扩增，扩增目的基因片段：94℃预变性2分钟；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸10s，32个循环；68℃延伸2分钟。

(4)PCR扩增完成后，2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。PCR扩增片段大小与预期一致(约225bp和196bp)。采用DNA胶回收试剂盒纯化扩增基因片段(PCR产物回收步骤按DNA胶回收试剂盒说明书所述方法完成)。

(5)以胶回收的基因片段tHBc-N(1-225bp)和基因片段tHBc-C(226-421bp)混合组分为模板，以P1和P2为扩增引物，PCR扩增目的基因片段tHBc(序列见SEQIDNO.7)。基因片段tHBc编码的氨基酸(序列见SEQIDNO.8)能自组装形成病毒样颗粒。按如下体系和程序扩增目的基因片段tHBc：

PCR扩增反应体系：无菌ddH₂O33μL，引物P1/P2各1μL，模板tHBc-N(1-225bp)和tHBc-C(226-421bp)1μL，dNTPs5μL，KODplusDNA聚合酶1μL，KODplusDNA聚合酶10×Buffer5μL，Mg²⁺3μL。

PCR扩增反应程序：94℃预变性2分钟；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸20s，32个循环；68℃延伸5分钟。

(6)PCR扩增完成后，2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，片段大小与预期一致(约421bp)。按胶回收试剂盒说明切胶回收DNA。

(7)将胶回收的目的基因片段tHBc和载体质粒pET28a分别用NcoI和XhoI双酶切消化，按照下述体系(共20μL)依次加入各组分：tHBc基因片段或pET28a载体10μL，2×Tangobuffer4μL，NcoⅠ1μL，XhoⅠ1μL，无菌ddH₂O4μL。混均，置于37℃水浴中酶切反应8-12小时。

(8)分别将上述双酶切消化目的基因片段或载体DNA片段进行凝胶电泳，按胶回收试剂盒说明书切胶回收DNA。

(9)将胶回收的双酶切消化目的基因片段与载体DNA片段连接，按照下述连接体系(共10μL)依次加入各组分：tHBc酶切片段2μL，pET28a酶切片段3μL，T4buffer(10×)1μL，T4DNA连接酶1μL，无菌ddH₂O3μL。混均，置于22℃连接反应20min或4℃过夜。

(10)连接产物转化、质粒DNA提取、菌落PCR鉴定阳性克隆，提取重组表达质粒ptHBc，酶切分析及测序鉴定等具体方法均参照下述重组表达质粒ptHBc-SPA操作步骤进行，重组表达质粒ptHBc结构见图1。

3)工程菌的制备

将测序鉴定序列正确的重组表达质粒ptHBc-SPA和ptHBc分别转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL感受态细胞，筛选获得含ptHBc-SPA和ptHBc的基因工程菌。具体操作如下：

(1)将冻存的感受态细胞从-80℃冰箱中取出，室温或冰浴缓慢解冻。取1μL重组表达质粒加入感受态细胞EP管中，轻轻拍打EP管底部使其混匀，置冰浴30分钟。

(2)将上述EP管从冰浴快速转入42℃的水浴中，静置精确反应90秒。

(3)迅速将EP管转移至冰浴放置2分钟。

(4)无菌操作向EP管中加入800μL预先加热至37℃的不含抗生素的LB培养基，转至37℃、80-90rpm转速摇床培养45分钟，使细菌表达抗性标记。

(5)取50-100μL培养液滴于卡那霉素、氯霉素抗性LB平板上，用无菌玻棒将菌液涂布均匀，正置放于37℃培养30分钟待培养液被吸收后，将平板倒置培养过夜，次日从平板上挑起5-10个单菌落接种到LB培养基中培养，菌落PCR鉴定、筛选含重组表达质粒的工程菌。

菌落PCR按下述体系依次加入各组分：无菌ddH₂O15.1μL，引物P10.2μL，引物P20.2μL，待检测菌液2.0μL，dNTPs0.3μL，TaqplusDNA聚合酶10×Buffer(Mg²⁺plus)2.0μL，TaqplusDNA聚合酶0.2μL。

按如下反应程序进行PCR扩增：94℃预变性5分钟；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸5分钟。

扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测筛选出含重组表达质粒ptHBc-SPA或ptHBc的阳性克隆。按下述方法保藏基因工程菌种。

(1)将PCR鉴定出的阳性克隆菌液按1:100转接至装有5mL含卡那霉素、氯霉素LB培养基试管中，37℃、220rpm旋转培养。

(2)待菌种生长进入对数期时，检测OD₆₀₀值达到0.6时，取出菌液。

(3)转移适量菌液于1.5mLEP管中，按1:1比例向菌液加入4℃预冷的30％甘油溶液，吹打混匀。

(4)将保存工程菌的EP管转至冻存盒中，冻存于-80℃至少6小时，然后将工程菌在液氮中长期保存。

3、工程菌小量表达tHBc-SPA或tHBc蛋白与鉴定

1)IPTG诱导目的蛋白表达

(1)将含重组表达质粒的工程菌涂布含卡那霉素、氯霉素抗性LB平板上，37℃培养过夜；次日挑起单菌落接种于含卡那霉素、氯霉素LB培养基中，37℃、220rpm旋转培养过夜。

(2)按1:100比例将培养菌液转接至含卡那霉素、氯霉素抗性LB培养基中，37℃、220rpm旋转培养，至工程菌生长进入对数期(OD₆₀₀值达到0.6-0.8之间)。

(3)将处于对数生长期的培养物从摇床中取出，加入IPTG使其终浓度为0.2mmol/L，于37℃、220rpm继续培养5小时。

(4)将诱导培养物转移至10mL离心管中，12000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体。

(5)用500μLPBS重悬菌体，12000rpm、4℃离心10分钟，弃上清，收集菌体，PBS重复洗涤1次。

(6)用200μL菌体裂解液(TritonX-100(v/v)1％，Tris-Cl(pH8.0)0.01M，NaH₂PO₄0.1M)重悬菌体，将EP管置冰浴中超声波破碎菌体。条件为输出功率为300W，超声3s，间歇8s，共30-50次。破碎后菌体裂解液进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定重组蛋白表达。

2)目的蛋白tHBc-SPA或tHBc鉴定

SDS-PAGE分析

(1)凝胶灌制

取洁净玻璃板和胶条固定在灌胶支架上，将新配制的15％的分离胶溶液小心灌加入灌胶槽中，避免产生气泡，分离胶溶液加至距上凹面2.5cm处即可。用移液器缓慢向分离胶溶液上加1mL无水乙醇，水平静置，室温下聚合约20分钟，待胶聚合后倒去覆盖层液体，倒置1分钟去除残留液体。将新配制的5％的积层胶溶液加至分离胶上，插入样品梳子，室温水平静置，待凝胶充分聚合。

15％分离胶溶液配制：ddH₂O2.3mL，30％丙烯酰胺溶液7mL，1.5mol/LTris(pH8.8)2.5mL，10％SDS溶液0.1mL，10％AP溶液0.1mL，TEMED0.004mL。

5％积层胶溶液配制：ddH₂O4.1mL，30％丙烯酰胺溶液1.0mL，1.0mol/LTris(pH6.8)0.75mL，10％SDS溶液0.06mL，10％AP溶液0.06mL，TEMED0.006mL。

(2)制样

将等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液与菌体样品液混匀，100℃煮沸5-10分钟，立即冰浴5分钟，室温12000rpm离心5-10分钟，收集上清样品保存备用。

2×SDS凝胶加样缓冲液配制：Tris-HCl(pH6.8)100mmol/L，甘油20％(v/v)，SDS4％(m/v)，溴酚蓝0.2％，二硫苏糖醇(DTT)200mmol/L。

(3)电泳

凝胶制备好后，向电泳槽中加入电泳缓冲液。取样品上清10-30μL加入凝聚槽样品孔内，进行电泳。调电压至60V让样品在积层胶中迁移，当样品进入分离胶后，将电压调至120V继续电泳。观察蛋白分子量Marker迁移情况，达到最佳分辨时停止电泳。

5×蛋白电泳缓冲液配制：甘氨酸94g，Tris碱15.1g，10％SDS50mL，ddH₂O定容至1L。

(4)染色

电泳结束后取下凝胶，用自来水洗涤后将凝胶完全浸入考马斯亮蓝R-250染色液中，室温下在水平摇床上慢速摇动染色过夜。

考马斯蓝R-250染色液配制：冰乙酸10mL，甲醇40mL，ddH₂O50mL，考马司亮蓝R-2500.5g。磁力搅拌1小时使染料溶解，用Whatman滤纸过滤，室温保存。

(5)脱色

染色后，回收染色液，将凝胶完全浸入脱色液中，室温慢速摇动脱色4-8小时，期间更换脱色液4-5次，待蛋白条带变清晰，弃去脱色液，把凝胶用自来水清洗并浸入清水中，可进行拍照保存。

脱色液配制：冰乙酸100mL，甲醇400mL，ddH₂O500mL。

结果显示，本发明制备的工程菌成功表达了约24KDa大小的tHBc-SPA融合蛋白或16KDa大小的tHBc蛋白(图2A)。

Westernblot检测工程菌表达目的蛋白

(1)按照前述的方法进行样品处理和蛋白质组分SDS-PAGE电泳分离。具体操作按《分子克隆，实验手册》进行。为便于比较，电泳加样时使用相同体积的各样品。

(2)转膜与抗体反应

待电泳结束，取出凝胶并用自来水洗涤。用转膜缓冲液浸泡PVDF膜和滤纸5分钟，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和PVDF膜，放入电泳槽，88V电压低温条件下电泳2-3小时。取出PVDF膜用1×PBST(0.05％Tween-20的PBS)洗涤5分钟，加入含5％脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液(blockingbuffer)，37℃孵育2小时或4℃封闭过夜。PBST洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。加入His标签单克隆抗体(Abbkine公司产品，用PBST进行1:10000稀释)或抗HBc单克隆抗体(Abnova公司产品，用PBST进行1:10000稀释)，37℃孵育2小时。PBST充分洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体(Abbkine公司产品，用PBST进行1:5000稀释)，37℃孵育1小时，PBST充分洗涤PVDF膜3-5次，每次10分钟。加入DAB显色液，室温避光显色5-10分钟，暗室中X光片曝光、记录结果。

转膜缓冲液配制：Tris碱15.15g，甘氨酸14.41g，甲醇200mL，ddH₂O定容至1L。

PBS缓冲液(PBS)配制：NaCl8g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na2HPO₄3.58g，ddH₂O溶解，用HCl调pH至7.4，ddH₂O定容至1L，室温保存。

每1LPBS缓冲液加500μL吐温-20即为PBST缓冲液。

3,3’-二氨基联苯胺(DAB)显色液配制：DAB5mg，0.05mol/LTris-HCl(pH7.6)2mL，30％双氧水(H₂O₂)25μL，ddH₂O8mL。

结果显示，本发明制备的工程菌在加入IPTG诱导后，所表达的tHBc-SPA或tHBc蛋白能与抗His单克隆抗体或抗HBc单克隆抗体反应(图2B、2C)。

实施例2肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗的规模化制备及鉴定

1、肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗的规模化制备

1)重组抗原蛋白tHBc-SPA或tHBc的大量诱导表达

(1)将冻存的工程菌从-80℃冰箱中取出、解冻，取0.1mL菌液转接至5mLLB培养基中(含卡那霉素、氯霉素)，37℃、220rpm旋转培养过夜。

(2)将过夜培养物按1:100比例接种至含卡那霉素、氯霉素的1LLB培养基中，37℃、220rpm振荡培养。待培养至对数生长期(菌液OD₆₀₀值达到0.6)，加IPTG至终浓度为0.2mM，37℃、220rpm旋转培养5小时，诱导蛋白表达。

(3)将诱导培养物转移至250mL离心管，4℃、12000rpm离心30分钟，弃上清，收集菌体。菌体加100mLPBS悬浮，4℃、12000rpm离心30分钟，弃上清，收集菌体。重复加PBS洗涤2次，收集菌体用于蛋白纯化或保存-80℃备用。

2)重组抗原蛋白tHBc-SPA或tHBc的纯化

(1)菌体裂解处理

按4mL/g比例向菌体中加裂解缓冲液，加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM，室温裂解30分钟，期间多次搅拌混均。裂解处理后，菌体管置于冰浴中超声波破碎，条件为输出功率为300W，超声3s，间歇8s，共30-50次。经超声波破碎样品于4℃、12000rpm离心30分钟。收集上清，向沉淀中加适量结合缓冲液，混匀，置冰浴60分钟溶解沉淀，4℃、12000rpm离心30分钟，收集上清，合并备用。

裂解缓冲液配制：TritonX-100(v/v)1％，Tris-Cl(pH8.0)0.01M，NaH₂PO₄0.1M。

结合缓冲液配制：Tris-Cl(pH8.0)0.01M，NaH₂PO₄0.1M，尿素8M。

(2)亲和层析纯化

亲和层析介质Ni-NTAHis-Bind树脂用2倍体积结合缓冲液洗涤，按50％加入缓冲液制备树脂悬液，按每4mL样品溶液加入1mLNi-NTAHis-Bind树脂悬液比例将两者混匀，4℃、200rpm旋转60分钟；将结合蛋白的树脂装入层析柱中，依次用结合缓冲液(约5mL)、变性漂洗缓冲液(约20mL)洗涤树脂，然后用变性洗脱缓冲液(约2-5mL)洗脱，分步收集层析柱流出液(0.5mL/管)，检测各组分蛋白质浓度，SDS-PAGE电泳检测各组分蛋白质纯度；收集合并纯化目的蛋白的组分，用于后续制备VLPs。

变性漂洗缓冲液配制：Tris-Cl(pH6.3)0.01M，NaH₂PO₄0.1M，尿素8M。

变性洗脱缓冲液配制：Tris-Cl(pH4.5)0.01M，NaH₂PO₄0.1M，尿素8M。

3)纯化抗原蛋白tHBc-SPA和tHBc的复性及VLPs制备

(1)样品透析袋处理：剪取长10-20cm的透析袋，放在透析袋处理液Ⅰ中煮沸10分钟，去离子水冲洗，放入透析袋处理液Ⅱ煮沸10分钟，去离子水冲洗，浸没于复性溶液中。

透析袋处理液Ⅰ配制：NaHCO₃2g，EDTA(pH8.0)0.029g，ddH₂O100mL。

透析袋处理液Ⅱ配制：EDTA(pH8.0)0.029g，ddH₂O100mL。

(2)重组蛋白复性与VLPs体外自组装：扎紧处理好的透析袋一端，将纯化的目的蛋白组分转移至透析袋中，扎紧透析袋另一端。将透析袋依次在按尿素浓度递减的复性缓冲液中、4℃条件下进行透析。复性缓冲液所含尿素浓度梯度依次为6M、5M、4M、3M、2M和1M，每间隔3-4小时换复性缓冲液1次，最后换成500mLPBS溶液透析2次。

复性缓冲液配制：Tris-Cl(pH8.0)0.01M，Na₂HPO₄0.1M，尿素6M、5M、4M、3M、2M、1M，氧化性谷胱甘肽1mM，还原型谷胱甘肽0.25mM。

2、肠道病毒嵌合病毒样颗粒疫苗的鉴定

1)SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度

具体操作参照实施例1中电泳方法进行。

2)Westernblot检测重组蛋白抗原特异性

具体操作参照实施例1中鉴定方法进行。

3)电镜观察VLPs形态

取上述纯化复性蛋白(已形成VLPs)样品50μL，用PBS(pH7.4)将蛋白质浓度稀释至100μg/mL，将样品滴加至铜网上，静止1分钟，用滤纸沿铜网边缘吸去多余溶液，向铜网滴加1-2滴2％醋酸铀溶液(蒸馏水配制，pH6.8)，染色1分钟，用滤纸沿铜网边缘吸去多余染色液，室温静止待铜网干燥，将铜网(负染样品)置透射电子显微镜下，于200kV、25000倍下观察颗粒形状，记录结果。

结果显示：本发明制备得到高纯度tHBc-SPA和tHBc的疫苗组分蛋白(图3A)；所制备的疫苗组分蛋白具有与特异性抗体反应的特性；所制备的疫苗组分tHBc-SPA和tHBc经纯化、复性后，分别组装形成直径约35nm的tHBc-SPA病毒样颗粒(图3B)或同样大小的tHBc病毒样颗粒(图3C)。

实施例3肠道病毒嵌合病毒样颗粒(VLPs)疫苗的功能检测

试验方案

取6-8周龄雌性BALB/c小鼠78只，随机分成A、B、C、D4组，每组13只，疫苗接种前小鼠断尾采血，分离血清用于抗体检测。分别按下列设计免疫接种：A组注射紫外灭活的EV71(10μg/只)；B组注射tHBc-SPA(VLPs)，剂量10μg/只；C组注射tHBc(VLPs)，剂量10μg/只；D组为PBS对照；采取腹腔注射途径免疫，各种疫苗均免疫三次，间隔二周；第三次免疫两周后，断尾采血，分离血清。各组小鼠接种疫苗后每日观察小鼠状态和称量体重，与注射PBS对照组小鼠比较，tHBc-SPA疫苗注射组小鼠未出现任何异常，体重增加与PBS组一致。

1、疫苗接种小鼠血清特异性抗体检测

1)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗体IgG总量

纯化后的EV71或CA16为包被抗原。具体步骤包括：

(1)包被：用包被缓冲液(0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液)将纯化并经紫外线灭活的EV71或CA16稀释至5μg/mL作为被包抗原溶液，加入到96孔ELISA酶标板(Corning公司产品，下同)每孔100μL，4℃包被过夜。

包被缓冲液配制：Na₂CO₃0.159g，NaHCO₃0.293g，加ddH₂O溶解，调节pH为9.6，再用ddH₂O定容至100mL，4℃保存。

(2)封闭：将包被灭活EV71或CA16抗原的ELISA酶标板用PBST(含0.05％Tween-20的PBS，pH7.5，下同)洗涤3次，每次10分钟；加入封闭液(含3％BSA的PBST)到酶标板各孔中(100μL/孔)，37℃封闭60分钟；PBST洗涤5次。

PBS配制：KCl0.2g，NaCl8g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，用ddH₂O定容至1L。

(3)加待检血清：小鼠血清用含1％BSA的PBST作1:10梯度稀释，将稀释血清加入ELISA酶标板各孔中(100μL/孔)，37℃孵育60分钟；PBST洗涤5次。

(4)加酶标二抗：二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体(Pierce公司产品)，羊抗鼠IgG用含1％BSA的PBST作1:2500稀释，加入ELISA板各孔中(100μL/孔)，37℃作用60分钟；PBST洗涤5次。

(5)加入显示底物溶液：向酶标板各孔中加入显色底溶液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，100μL/孔)，37℃避光显色30分钟；每孔加入100μL2MH₂SO₄终止反应。

(6)OD₄₅₀值测定：在酶标仪上波长450nm处测定每孔内光密度吸收值(OD₄₅₀)，血清样品OD₄₅₀值大于或等于阴性数值的2.1倍判定为阳性。

2)血清中和抗体检测

采用噬斑减少法，具体操作如下：

(1)细胞单层：将Vero细胞悬液接种至24孔细胞培养板各孔中，次日待Vero细胞长至95％单层备用.

(2)病毒吸附：无血清DMEM培养液稀释EV71或CA16至浓度为80-100PFU/100μL，与等体积倍比稀释的小鼠血清混匀，37℃孵育60分钟；吸去单层细胞孔中的培养液，无菌PBS洗涤细胞单层2次，加入病毒-血清混合液(200μL/孔)，37℃、5％CO₂培养箱中吸附2小时；另以EV71或CA16与非免疫阴性血清混合液作为阳性对照。

(3)细胞培养：吸附后，吸去病毒-血清混合液，加入含1％甲基纤维素的覆盖液(0.5-1mL/孔)，37℃、5％CO₂培养箱中培养3-5天，吸去覆盖液。

(4)细胞固定：细胞用PBS洗涤3次，加入预冷的固定液(4％多聚甲醛)固定20分钟，吸弃固定液，向细胞孔中加入含0.5％结晶紫染液，室温作用5-8h，吸去染色液，蒸馏水冲洗，干燥，计数免疫蚀斑数量。以比阳性对照孔减少60％蚀斑数量的最高血清稀释度记为中和抗体滴度。

结果显示：本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能有效诱导机体产生EV71的特异性IgG和病毒中和抗体。EV71特异性IgG抗体水平为10^5.1，EV71中和抗体效价为2⁹；灭活EV71病毒诱导的IgG为10^5.4，中和抗体效价为2⁷(图4A、4B)；表明VLPs免疫诱导高水平体液免疫应答。tHBc-SPA病毒样颗粒疫苗诱导机体产生CA16特异性IgG抗体水平为10^3.5，CA16的中和抗体效价为2⁴，表明VLPs诱导抗CA16部分交叉体液免疫应答(图4C、4D)。

2、疫苗接种小鼠细胞免疫应答检测

具体操作步骤包括：

1)小鼠脾淋巴细胞分离

取上述各组疫苗免疫接种实验小鼠乙醚麻醉处死，浸泡于75％乙醇中3-5分钟，在超净工作台中无菌操作，取小鼠脾脏，在35mm细胞培养皿中放入4-5mL的1×淋巴细胞分离液(达科为生物技术有限公司产品；4℃保存、用前温度恢复至室温、摇匀)，剪碎脾组织，用5mL注射器胶头轻轻研磨使组织破碎，收集脾细胞悬液，立即转移到15mL离心管中，沿管壁缓慢加入200-500μL的RPMI-1640培养基保持液面分界明显；室温1500rpm离心30分钟，离心后细胞分层；吸出淋巴细胞层，加入10mLRPMI-1640培养基，颠倒混匀，室温1000rpm离心10分钟，吸去上清，收集细胞，用无血清RPMI-1640或DMEM培养基重悬细胞，用于后续实验。取适量细胞悬液适当稀释后滴入细胞计数板显微镜下观察或采用细胞自动计数仪进行细胞计数。

2)刺激细胞因子分泌

制备的小鼠脾细胞悬液用含10％胎牛血清的DMEM稀释至1×10⁷/mL浓度，接种至24孔细胞培养板各孔中，100μL/孔(1×10⁶细胞/孔)，每孔加入10μg热灭活EV71刺激物，另设不加EV71刺激物为阴性对照孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养72小时，收集细胞培养上清液，4℃、2000rpm离心20分钟，收集上清分装至1.5mLEP管中，冻存于-80℃，用于各种细胞因子浓度测定。

3)细胞因子浓度测定

酶标板和各种检测试剂均为美国BioLegend公司检测试剂盒所提供的组分。分别检测IFN-γ、IL-2两种Th1类和IL-4、IL-10两种Th2类细胞因子。具体参照细胞因子检测试剂盒(BioLegend)说明书介绍的方法步骤。

(1)包被：用1×包被液稀释捕获抗体(1:200)，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜(16-18小时)；将包被液弃去，每孔加入300μL洗涤液，振摇酶标板，弃去洗涤液，用力拍干，重复洗涤4次；向酶标板各孔中加入1×AssayDiluentA(200μL/孔)，200rpm、室温振摇孵育1小时；洗涤液洗涤酶标板4次。

(2)加待检样本：用1×AssayDiluentA将标准品细胞因子进行2倍系列倍比稀释，将倍比稀释的标准品及样品加入上述酶标板各孔中，100μL/孔，每份样品重复2个孔。200rpm、室温振摇孵育2小时。

(3)加检测抗体：酶标板用洗涤液洗涤4次，向各孔中加入检测抗体(1:200稀释)，100μL/孔，200rpm、室温振摇孵育1小时；酶标板用洗涤液洗涤4次，向各孔中加入Avidin-HRP溶液，100μL/孔，200rpm、室温振摇孵育30分钟。

(4)显色：酶标板用洗涤液洗涤5次，向各孔中加入TMB显色液，100μL/孔，置于暗处，室温显色20分钟，呈蓝色为阳性反应；向各孔中加2MH₂SO₄终止液终止反应，100μL/孔。终止反应的30分钟内读取450nm吸光值OD₄₅₀；根据标准品浓度和OD₄₅₀值绘制标准曲线；读取各样品OD₄₅₀值，根据各细胞因子标准曲线计算样品中相应细胞因子浓度。

结果显示：本发明制备的VLPs疫苗免疫小鼠能诱导机体产生特异性细胞免疫应答；tHBc-SPA免疫接种小鼠产生的IFN-γ浓度为2.68×10⁴pg/mL，IL-2浓度为188pg/mL，IL-4浓度为31pg/mL，IL-10浓度为7.86×10³pg/mL；UV-EV71免疫接种小鼠的IFN-γ浓度为7.36×10⁴pg/mL，IL-2浓度为16pg/mL；IL-4浓度为2pg/mL，IL-10浓度为6.21×10²pg/mL；与UV灭活的EV71相比，VLPs疫苗诱导显著增强IL-2的产生和降低IL-4及IL-10等Th2类细胞因子的产生(图5A、5B)。

3、疫苗免疫诱导的抗EV71和CA16致死攻毒感染的保护效力(乳鼠被动免疫保护实验)

从上述每组免疫雌性小鼠中随机选取7只，第三次免疫一周后，分别将其与雄鼠配对、受孕。每组10只以上乳鼠，待乳鼠出生24小时后，分别用10⁶TCID₅₀EV71/小鼠或400TCID₅₀CA16/小鼠的剂量腹腔注射感染，观察乳鼠发病情况，每日称量体重。根据临床症状进行等级打分。

结果显示：本发明制备的VLPs疫苗免疫雌鼠后，母源抗体使乳鼠获得抗EV71致死感染的完全免疫保护；母源抗体使乳鼠获得抗CA16致死感染的部分免疫保护(图6A、6B)。

本发明获得的嵌合病毒样颗粒抗原还可用于肠道病毒感染的血清学诊断试剂或诊断试剂盒。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种肠道病毒嵌合病毒样颗粒，其特征在于：氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.权利要求1所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒在制备肠道病毒疫苗中的应用。

3.一种肠道病毒疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒。

4.权利要求1所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒在制备肠道病毒感染的血清学诊断试剂或诊断试剂盒中的应用。

5.编码权利要求1所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒的DNA片段，其特征在于：核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

6.权利要求1所述的肠道病毒嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将权利要求5所述的DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体中，构建重组表达质粒；再用重组表达质粒转化大肠杆菌，构建重组表达工程菌；培养重组表达工程菌，经诱导表达、亲和层析纯化和体外复性得到肠道病毒嵌合病毒样颗粒。