CN112852852B

CN112852852B - 一种ox40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112852852B
Application number: CN201911178497.5A
Authority: CN
Inventors: 马雁冰; 袁明翠; 李维冉; 华良群; 张启书; 黄惟巍
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2039-11-27
Also published as: CN112852852A

Abstract

本发明提供了一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用，利用编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸，进行重组质粒的构建以及诱导表达，培养后收集菌体，进行重组蛋白的纯化，从而获得所述OX40抗原表位重组病毒样颗粒。经鉴定，得到的7种病毒样颗粒免疫后的小鼠抗血清与OX40蛋白发生B不同程度的特异性反应。并且，所述病毒样颗粒属于靶向检查点分子的免疫治疗药物，该类型免疫治疗药物并不直接作用于癌细胞，而是通过作用于免疫细胞，促进对癌细胞的杀伤效应，能对包括肉瘤，黑色素瘤，乳腺癌等肿瘤免疫原性模型刺激激起抗肿瘤作用。

Description

一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

OX40(也被称作CD134/TNFRSF4)是有希望的第二代免疫检查点疗法代表分子之一。相比于CTLA-4与PD-1等共抑制分子，OX40属于T细胞表面的共刺激分子，其广泛表达于炎症和肿瘤部位。OX40是一种I型跨膜糖蛋白，包括膜外区，跨膜区和膜内区三部分，其胞外段含有4个NGFR样结构，为半胱氨酸富集区，通过二硫键形成便于与配体结合的三维结构域。小鼠和人OX40主要在活化的T细胞上表达，也包括自然杀伤细胞，自然杀伤T细胞以及中性粒细胞，它的配体OX40L(也被称作CD252)则表达于活化的抗原呈递细胞，血管内皮细胞等。通过传递协同刺激信号，OX40使得活化的效应T细胞增殖及存活，同时有助于记忆T细胞的生成。另外，OX40在肿瘤中可降低Treg细胞的活性，进而维持效应T细胞的功能。在一些小鼠模型中，激动型OX40特异性单克隆抗体可以消耗Treg细胞。联合使用OX40特异性激动型抗体和抑制信号通路的阻断剂可活化CD8⁺T细胞并分泌高水平γ-IFN和颗粒酶B，而抑制Treg细胞。OX40激动型抗体对Treg细胞和效应T细胞的不同调节作用，有助于机体免疫系统发挥抗肿瘤效应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用，旨在利用主动免疫策略激发特异抗体应答，为靶向调控OX40提供有效手段。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组质粒的构建：

取编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸，用TE Buffer将所述的寡核苷酸溶解后，将正负链等量混合，将混合物置于热水中，使其缓慢冷却至室温，形成编码抗原肽的双链DNA片段，并有BamH I和EcoR I的粘性末端暴露于两端；质粒pHBcAg用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切，胶回收载体片段，将回收的载体与所述编码抗原肽的双链DNA片段混合，在连接酶作用下连接过夜，形成重组质粒；

(2)重组质粒的诱导表达

将重组质粒转化至感受态细胞，培养后收集菌体；

(3)重组蛋白的纯化

将步骤(2)收集得到的菌体进行超声破碎处理，超声完成后，离心分别得到超声裂解物上清和超声裂解物沉淀，经纯化，制得OX40抗原表位重组病毒样颗粒。

进一步的，步骤(1)中所述编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸的序列如SEQ IDNO:1～SEQ ID NO:7所示。

进一步的，步骤(1)中所述感受态细胞为E.coliDH5α感受态细胞。

进一步的，步骤(2)所述重组质粒的诱导表达的具体步骤为：

测序正确的重组质粒转化至感受态细胞，涂布于氨苄西林LB平板，于37℃培养，挑取单菌落并接种至LB Amp+液体培养基中，37℃180rpm/min过夜培养；次日以1:50的比例转接于新鲜的LB Amp+培养基中，于恒温摇床中，37℃220rpm/min，培养4h至OD₆₀₀约为0.6后，调节摇床温度至28℃，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4～5h；4℃8000g离心10min，收集菌体。

进一步的，步骤(3)中所述超声裂解物上清和超声裂解物沉淀的纯化方法分别为：

收集所述超声裂解物上清，加入硫酸铵至饱和度为40％，室温放置30min后，12000rpm、20℃离心20min，弃上清；沉淀用饱和度为20％的硫酸铵溶液洗涤5次，每次均经12000rpm、20℃离心10min，弃上清；沉淀用PBS重悬，蔗糖密度梯度离心后以Sepharose4Fast Flow凝胶层析分离，收集的样品经SDS-PAGE分析，以Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃；

收集所述超声裂解物沉淀，用低浓度的变性剂洗涤3次，尿素溶解，PBS稀释，室温20℃静置2h后15000rpm离心20min，收集上清样品经0.45μm滤器过滤后用Sephadex G25凝胶层析柱脱盐，Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃。

本发明的另一方面：

所述的OX40抗原表位重组病毒样颗粒的应用，其中，所述病毒样颗粒可用于制备预防和/或诊断和/或治疗肿瘤或自身免疫病的疫苗药物中。

进一步的，所述肿瘤包括肉瘤，黑色素瘤，乳腺癌，所述自身免疫病包括实验性自身免疫性脑膜炎、类风湿关节炎和炎症性肠病。

本发明的另一方面：

一种具有免疫原性的多肽，其选自SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13和14的氨基酸序列。

进一步的，所述多肽可用于制备预防和/或诊断和/或治疗肿瘤或自身免疫病的疫苗药物中，所述肿瘤包括肉瘤，黑色素瘤和乳腺癌，所述自身免疫病包括实验性自身免疫性脑膜炎、类风湿关节炎和炎症性肠病。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明采用线性B细胞表位预测方法得到的OX40抗原表位插入至HBcAg VLPs，节约了大量的实验室工作，避免了传统表位研究的盲目性，为免疫诊断和免疫治疗提供了便利，并且该预测方法基于氨基酸在抗原中出现频率的分析进行预测，其准确率可达60-70％，结合肽段的亲水性、疏水性分析以及蛋白三维结构数据，可以达到更高的效率；

2、现有技术中的单克隆抗体、可溶性受体等被动免疫制剂由于半衰期短，需要反复给药，且价格昂贵等，在实验研究及临床应用中具有局限性；而本发明利用重组乙肝病毒核心抗原HBcAg病毒样颗粒作为疫苗载体，具有独特的优势：1)可在大肠杆菌中高效表达，并自我组装成VLPs；2)易于纯化、制备；3)纳米颗粒结构及抗原表位在颗粒表面的高度有序重复排列，高效刺激了抗原递呈细胞对抗原肽的摄取、加工及呈递，从而赋予了肽表位强免疫原性，即使不用常规佐剂也能激发强烈的免疫应答；

3、本发明所制备得到的OX40抗原表位重组病毒样颗粒属于靶向检查点分子的免疫治疗药物，该类型免疫治疗药物并不直接作用于癌细胞，而是通过作用于免疫细胞，促进对癌细胞的杀伤效应；而且，免疫治疗药物并不是针对癌细胞表面的某些特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫应答；OX40是极有希望的新一代检查点疗法靶向分子，其是表达于细胞毒性T细胞和Treg细胞的活化受体，激动型的OX40抗体为CD8+T杀伤细胞和CD4+T辅助细胞的增殖与扩增提供了刺激信号，同时也对Treg产生抑制；OX40主要在CD8+T细胞、NK细胞、NKT细胞或中性粒细胞中表达，而OX40L在树突细胞、B细胞、巨噬细胞表达；早期临床前研究显示OX40能对包括肉瘤，黑色素瘤，乳腺癌等肿瘤免疫原性模型刺激激起抗肿瘤作用；另外，抑制型病毒样颗粒可以用在自身免疫病的治疗中，例如实验性自身免疫性脑膜炎、类风湿关节炎和炎症性肠病。

附图说明

图1为重组质粒的酶切鉴定及蛋白表达示意图；

图2为超声裂解物上清中目的蛋白的纯化示意图；

图3为超声裂解物沉淀中目的蛋白的纯化示意图；

图4为病毒样颗粒的透射电子显微镜图；

图5为ELISA检测小鼠血清OX40特异抗体应答结果图。

具体实施方式

实施例中所使用的质粒及菌株分别为：

大肠杆菌E.coliDH5α及表达修饰的HBcAg的质粒pHBcAg为中国医学科学院医学生物学研究所分子免疫室保存。pHBcAg在对应HBcAg第78位与79位氨基酸的核苷酸序列之间引入了BamH I与EcoR I位点，允许编码抗原的寡核苷酸片段插入。

实施例中所使用的实验动物：

SPF级BALB/c雌性小鼠，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCK(京)2016-0006，实验动物使用许可证：SYXK(京)2017-0033。饲养于清洁级动物房。

实施例中所使用的主要试剂：

质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒及纯化试剂盒购自天根；EcoR I、BamH I、Nde I、Pst I及T₄DNA连接酶购自大连宝生物有限公司(Takara)；Sephadex G25填料购自GE公司；改良型Bradford蛋白浓度测试试剂盒购自上海生工。丙烯酰胺，考马斯亮蓝-R250和蛋白Marker,DNA Marker购自宝生物有限公司。

实施例1——小鼠OX40胞外段抗原表位预测

按GenBank中登录的小鼠氨基酸序列(登录号：P47741)，利用网站进行抗原表位分析。其原理是基于对已知抗原表位统计获得的各种氨基酸出现的频率数据对待测蛋白进行分析，根据肽段中氨基酸频率大小预测出具有抗原性潜能的肽段，分析网站(http：//imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)。主要靶向的区域是OX40胞外区结构域，经预测共获得7个潜在的抗原表位(P1-P7)，7个潜在抗原表位的氨基酸序列分别对应SEQ ID NO:8～SEQ ID NO:14所示，共编码7条抗原肽的寡核苷酸序列由上海生工公司合成。所述编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:7所示。

实施例2

本实施例提供了一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组质粒的构建

用TE Buffer将实施例1所述合成编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸溶解后，将正负链(50μmol/L)等量混合，将混合物置于95℃热水中，使其缓慢冷却至室温，形成编码抗原肽的双链DNA片段，并有BamH I和EcoR I的粘性末端暴露于两端。质粒pHBcAg用限制性内切酶BamH I和EcoR I进行双酶切，胶回收载体片段，将回收的载体与编码抗原肽的双链DNA片段混合，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜；连接产物转化至E.coliDH5α感受态细胞。0.1％氨苄青霉素筛选阳性克隆，质粒小提试剂盒提取质粒，进行Nde I和Pst I双酶切初步鉴定后送上海生工公司测序。

(2)重组质粒的诱导表达

测序正确的重组表达质粒转化DH5α感受态细胞，涂布于0.1％氨苄西林LB平板，于37℃培养，挑取单菌落并接种至5ml(Amp+)LB液体培养基中，37℃180rpm/min过夜培养；次日以1:50的比例转接于新鲜的LB(Amp+)培养基中，于恒温摇床中，37℃220rpm/min，培养4h至OD₆₀₀约为0.6后，调节摇床温度至28℃，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4～5h；4℃8000g离心10min，收集菌体，进行15％SDS-PAGE分析。

如图1所示，其中图1A为质粒构件图，将载体质粒与重组质粒分别应用NdeI和PstI进行双酶切鉴定(图1B中，M：DNA Marker；NP：载体质粒；P6：重组质粒)，1％琼脂糖电泳分析显示，所获得的重组质粒目的条带略大于载体质粒对应条带，与预期相符，代表性电泳图显示于图1B。重组质粒送至上海生工公司测序分析表明构建正确。转化了重组质粒的DH5α菌经IPTG诱导，SDS-PAGE分析显示重组菌都有效表达了目的蛋白(P1-P7)，其分子量由于抗原肽的插入略大于载体质粒编码的蛋白HBcAg(以NP代表)(图1C)。

(3)重组蛋白的纯化及鉴定

每一升菌液收集的菌体用10mlPBS(20mM PB,150mM NaCl，pH7.2)缓冲液重悬，然后在冰水浴下进行超声破碎，超声总时间10min，每次5s、间隔10s。超声完成后，12000rpm、4℃离心15min分别取超声裂解物上清和超声裂解物沉淀，进行SDS-PAGE分析。A.所述超声裂解物上清中目的蛋白的纯化：

收集上清加入硫酸铵至饱和度为40％，室温放置30min后，12000rpm、20℃离心20min，弃上清。沉淀用饱和度为20％的硫酸铵溶液洗涤5次，每次均经12000rpm、20℃离心10min，弃上清。沉淀用PBS重悬，蔗糖密度梯度离心(蔗糖梯度溶液从上到下依次为10％、20％、30％、40％、50％)后以Sepharose4 Fast Flow凝胶层析分离(2.5cm×100cm，流速为0.5ml/min，缓冲液为PBS),收集的样品经SDS-PAGE分析，以Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃。

重组蛋白P3、P6与P7存在于超声破碎菌体的可溶性上清中，上清经硫酸铵沉淀及洗涤步骤可去除部分杂蛋白。超声裂解上清中重组蛋白经硫酸铵盐析法初步纯化后进行蔗糖密度梯度离心，离心管从上到下逐层收集的组分以SDS-PAGE分析(M:蛋白Marker；1～12：蔗糖密度梯度离心后从上往下取12层溶液，每层1ml)，结果表明目的蛋白得到进一步纯化并主要存在于8-10层(P6代表性图见图2A)，与天然形式的HBcAg行为一致，提示可能以HBcAg病毒样颗粒(VLPs)形式存在，取蔗糖密度梯度离心7-11层蛋白通过Sepharose4FastFlow凝胶层析纯化(P6代表性图见图2B)后，取峰2进行SDS-PAGE分析，得到与目的蛋白大小相符、进一步获得纯化的条带(P6代表性图见图2C)。

B.所述超声裂解物沉淀中目的蛋白的纯化：

收集沉淀用低浓度的变性剂洗涤3次，尿素溶解，PBS稀释，室温20℃静置2h后15000rpm离心20min，收集上清样品经0.45μm滤器过滤后用Sephadex G25凝胶层析柱脱盐，Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃。

重组蛋白P1、P2、P4、P5存在于沉淀中，经低浓度的变性剂洗涤后可去除部分杂蛋白(SDS-PAGE分析，如图3A所示)。但以尿素洗涤沉淀，目的蛋白损失较大，而以2％TritonX-100洗涤则杂蛋白去除较明显且目的蛋白损失少，故选择其进行后续实验：经2％Triton X-100洗涤的沉淀可被4M以上尿素溶解，且以PBS 2倍、4倍、8倍稀释后未出现明显沉淀，离心上清经SDS-PAGE分析可看到与目的蛋白大小相符的条带(图3B)。进一步的电镜观察显示4M尿素溶解沉淀获得的样品有大量病毒样颗粒存在。

电镜观察鉴定上述病毒样颗粒：纯化的嵌合蛋白样品经2％磷钨酸染色后，透射电镜观察VLPs的形态。如图4所示，重组蛋白都形成了直径约30nm的病毒样颗粒，且形态、大小与原始HBcAg VLPs相似。代表性图显示如下：载体蛋白HBcAg(图4A)、超声破碎上清中纯化的重组蛋白P6(图4B)及超声破碎沉淀中纯化的重组蛋白P5(图4C)；图中标尺大小为50nm。

小鼠血清OX40特异性抗体应答分析：

ELISA分析结果显示，上述得到的7种病毒样颗粒免疫后的小鼠抗血清与OX40蛋白发生B不同程度的特异性反应(图5A)，代表性的P6抗体三次免疫血清特异抗体动态应答见图5B，抗体滴度可达128000(图5C)。

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒及其制备方法和应用

<160> 14

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

GTGAC AGCTA GAAGG CTGAA CTGCG TGAAG CACAC ATACC CC

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

TCTGG CCACA AGTGC TGCAG AGAGT GTCAG CCTGG ACAC

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

AGAGA CACCC TGTGT CACCC TTGCG AGACA

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GTGAA CTACG ACACA TGCAA GCAGT GCACC CAGTG CAACC AC

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

CCTAC ACAGG ACACC GTGTG CAGAT GCAGA CCT

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

TACAA GCTGG GCGTT GACTG CGTGC CATGT CCTCC AGGAC AT

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

GCCAG CGATT CTCTG GATGC CGTGT GTGAA

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

VTARRLNCVKHTYP

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

SGHKCCRECQPGH

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

RDTLCHPCET

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

VNYDTCKQCTQCNH

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

PTQDTVCRCRP

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

YKLGVDCVPCPPGH

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

ASDSLDAVCE

Claims

1.一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）重组质粒的构建：

取编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸，用TE Buffer将所述的寡核苷酸溶解后，将正负链等量混合，将混合物置于热水中，使其缓慢冷却至室温，形成编码抗原肽的双链DNA片段，并有BamH I 和EcoR I的粘性末端暴露于两端；质粒pHBcAg用限制性内切酶BamH I 和EcoRI进行双酶切，胶回收载体片段，将回收的载体与所述编码抗原肽的双链DNA片段混合，在连接酶作用下连接过夜，形成重组质粒；

所述编码OX40胞外区结构域的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO:6所示；

（2）重组质粒的诱导表达

将重组质粒转化至感受态细胞，培养后收集菌体；

（3）重组蛋白的纯化

将步骤（2）收集得到的菌体进行超声破碎处理，超声完成后，离心分别得到超声裂解物上清和超声裂解物沉淀，经纯化，制得OX40抗原表位重组病毒样颗粒；

所述超声裂解物上清和超声裂解物沉淀的纯化方法分别为：

收集所述超声裂解物上清，加入硫酸铵至饱和度为40%，室温放置30min后，12000rpm、20℃离心20min，弃上清；沉淀用饱和度为20%的硫酸铵溶液洗涤5次，每次均经12000rpm、20℃离心10min，弃上清；沉淀用PBS重悬，蔗糖密度梯度离心后以Sepharose4 Fast Flow凝胶层析分离，收集的样品经SDS-PAGE分析，以Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃；

收集所述超声裂解物沉淀，用2% TritonX-100洗涤3次，尿素溶解，PBS稀释，室温20℃静置2h后15000rpm离心20min，收集上清样品经0.45μm滤器过滤后用Sephadex G25凝胶层析柱脱盐，Bradford法测定蛋白浓度，0.22μm滤器过滤除菌后，即得到所述病毒样颗粒，保存于-80℃。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述感受态细胞为E.coliDH5α感受态细胞。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述重组质粒的诱导表达的具体步骤为：

测序正确的重组质粒转化至感受态细胞，涂布于氨苄西林LB平板，于37℃培养，挑取单菌落并接种至LB Amp+ 液体培养基中，37℃180rpm/min过夜培养；次日以1:50的比例转接于新鲜的LB Amp+ 培养基中，于恒温摇床中，37℃ 220rpm/min，培养4h至OD₆₀₀为0.6后，调节摇床温度至28℃，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4~5h；4℃ 8000g离心10min，收集菌体。

4.一种OX40抗原表位重组病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒由权利要求1-3任一项所述的方法制备得到。

5.如权利要求4所述的OX40抗原表位重组病毒样颗粒的应用，其特征在于，所述病毒样颗粒用于制备预防肿瘤或自身免疫病的疫苗药物中；所述肿瘤包括肉瘤，黑色素瘤和乳腺癌，所述自身免疫病包括实验性自身免疫性脑膜炎、类风湿关节炎和炎症性肠病。