CN101884793A - 乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBcAg和OX40配体(OX40L)双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物(ISCOM)型疫苗，能够促进HBcAg特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制能力，在抗乙肝病毒感染领域具有良好的应用前景；本发明还涉及该疫苗的制备方法，操作简便，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术
乙肝病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗HBV药物一直是亟待解决的研究课题。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差，不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性HBV感染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内HBV复制的来源，长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。
CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。HBV感染的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。
乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击HBV感染细胞的主要靶抗原。因此，增强HBcAg特异性的CTL应答，有望终止慢性HBV感染。但是，HBV的慢性患者存在免疫应答低，特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受等问题，在设计治疗性疫苗时需增强免疫系统对HBV的识别能力以激发有力的特异性细胞免疫。
OX40配体(OX40L)属肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，为II型跨膜糖蛋白。OX40/OX40L作为一对重要的免疫共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的第二信号。它们的相互作用能促进CD4+T细胞的活化、增殖、迁移并延长其寿命，还能促进生发中心的形成和树突状细胞的分化成熟。
免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成的一种直径为30～40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从而有利于抗原递呈细胞的吞噬。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBcAg的免疫增强型基因疫苗；目的之二在于提供所述HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
1、HBcAg的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的ISCOM型疫苗。
进一步，所述HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点(IRES)的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和OX40L全长cDNA；
进一步，所述HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。
2、所述HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a、HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体的构建：将HBcAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将OX40L全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体；
b、ISCOM的制备：将HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM。
进一步，所述步骤a的具体方法为：
a1、HBcAg全长cDNA的克隆：提取HBV转基因小鼠肝脏细胞总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBcAg全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-HBcAg；
a2、OX40L全长cDNA的克隆：提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH I和Sal I酶切位点的B细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-OX40L；
a3、重组真核载体的构建：自步骤a1所得重组载体pT-HBcAg中用Pst I和EcoR I双酶切出HBcAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，得重组载体pStar-HBcAg；再自步骤a2所得重组载体pT-OX40L中用BamH I和Sal I双酶切出OX40L全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，即得HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES-OX40L。
本发明的有益效果在于：本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够促进HBcAg特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制能力，且制备方法简单、成本低廉，在抗病毒免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
图1为PCR扩增HBcAg全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
图2为PCR扩增OX40L全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；
图3为透射电镜检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗的结构；
图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗激发T细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的能力；
图5为HBV转基因小鼠血清ALT活性检测结果；
图6为HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测结果。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备
1、HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体的构建
(1)HBcAg全长cDNA的克隆
根据GenBank登录号为NC_003977.1的HBcAg基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的HBcAg全长cDNA：上游引物F1：5’-aatctgcagggcatggacatcgacccttat-3’(SEQ ID No.3)，下划线部分为Pst I酶切位点；下游引物R1：5’tacgaattcagttccccaccttatgagtc-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为EcoR I酶切位点；分离HBV转基因小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2×107个/mL，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为总cDNA，再以该总cDNA为模板、F1和R1为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了HBcAg全长cDNA序列(SEQ ID No.1)的阳性克隆质粒命名为pT-HBcAg；
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。
(2)OX40L全长cDNA的克隆
根据GenBank登录号为NM_003326的OX40L基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的OX40L全长cDNA：上游引物F2：5’-gatc-ggatccatggaaagggtccaaccc-3’(SEQ ID No.5)，下划线部分为BamH I酶切位点；下游引物R2：5’acgcgtcgactcaaaggacacagaattcacca-3’(SEQ ID No.6)，下划线部分为Sal I酶切位点；按Trizol试剂盒说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，采用上下游引物F2和R2进行PCR扩增，PCR总体系为50μL，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了OX40L全长cDNA序列(SEQ ID No.2)的阳性克隆质粒命名为pT-OX40L。
PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。
(3)HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体的构建
根据HBcAg和OX40L全长cDNA两端所设计的酶切位点，先将HBcAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将OX40L全长cDNA插入pStar载体的IRES下游。具体方法为：先将重组载体pT-HBcAg用PstI和EcoR I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为重组载体pStar-HBcAg；再将重组载体pT-OX40L用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I和Sal I双酶切鉴定，阳性克隆质粒即为HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体，将其命名为pStar-HBcAg-IRES-OX40L。
2、ISCOM的制备
将HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES-OX40L用PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM，也即HBcAg的免疫增强型基因疫苗。
3、透射电镜分析
将新鲜制备的ISCOM滴于200目铜网上，吸附3分钟，吸水纸吸干，晾干30秒，以浓度为1％(w/v)的水溶性醋酸铀负染30秒，吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。
二、HBcAg的免疫增强型基因疫苗的体内免疫及检测
将雄性BALB/c小鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组，每组10只；实验组以本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗为免疫原，对照组以HBcAg基因疫苗(HBcAg单基因重组表达载体的ISCOM)为免疫原，空白对照组以PBS为免疫原；三组小鼠按100μL的剂量行腹腔免疫，每隔2周免疫1次，连续免疫3次。
1、ELISPOT法检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗激发CTL分泌IFN-γ的能力
末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×106个/mL，作为效应细胞；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；各组斑点数以3个复孔的均值表示。
结果见图4，实验组的斑点数明显高于对照组和空白对照组，表明本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-γ。
2、HBV转基因小鼠血清ALT活性检测
末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清ALT活性。
结果见图5，实验组的血清ALT活性明显高于对照组和空白对照组，表明本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，从而导致血清ALT活性明显升高。
3、HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测
末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清HBV DNA抑制率。
结果见图6，实验组的血清HBV DNA抑制率明显高于对照组和空白对照组，表明本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够有效抑制HBV的复制，显著降低血清HBV DNA载量。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (5)
1.乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：该疫苗是由乙肝病毒核心抗原即HBcAg和OX40配体即OX40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物型疫苗。
2.根据权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：所述HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点即IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和T细胞激活因子全长cDNA。
3.根据权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于：所述HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为5∶10∶1∶1。
4.权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体的构建：将HBcAg全长cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将OX40L全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体；
b、免疫刺激复合物的制备：将HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免疫刺激复合物。
5.根据权利要求4所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤a的具体方法为：
a1、HBcAg全长cDNA的克隆：提取乙肝病毒转基因小鼠肝脏细胞总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBcAg全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-HBcAg；
a2、OX40L全长cDNA的克隆：提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带有BamH I和Sal I酶切位点的T细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT-OX40L；
a3、重组真核载体的构建：自步骤a1所得重组载体pT-HBcAg中用Pst I和EcoR I双酶切出HBcAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接，得重组载体pStar-HBcAg；再自步骤a2所得重组载体pT-OX40L中用BamH I和Sal I双酶切出OX40L全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和SalI双酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，即得HBcAg和OX40L双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES-OX40L。
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