CN105770887A

CN105770887A - 一种用于hbv疫苗的佐剂及其制备方法

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Publication number: CN105770887A
Application number: CN201610139195.7A
Authority: CN
Inventors: 邓招红
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-03-04
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明提供了一种用于HBV疫苗的佐剂及其制备方法，该佐剂创新性的引入了ISCOM基质成分，可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有更好的免疫促进作用，延长疫苗免疫保护期。当本发明佐剂用于HBV疫苗制备时，剂型为油包水型，由于成分配方的合理化设计使得利用该佐剂制备的HBV疫苗具有较好的稳定性，在2～8℃条件下保存18个月仍保持性状稳定。此外，实际应用发现，以该佐剂制备的HBV疫苗接种后无局部或全身性不良反应，安全性可靠，而且较现有技术佐剂制备的HBV疫苗具有更好的免疫效果。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低，易于实现，因此具有突出的推广前景。

Description

一种用于HBV疫苗的佐剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种用于HBV疫苗的佐剂及其制备方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒科，在人类间具有较强的传染性和潜伏性，因此该疾病对人类健康和经济发展具有严重危害。HBV抗原易变，因此防控工作具有较大难度，除了保证适当的卫生条件和隔离措施之外，接种疫苗是控制乙肝流行的关键性措施。现有技术中，尽管乙肝疫苗早已形成产品，但仍存在着诸如保护效力不足、需多次免疫才能起效、成本较高等技术缺陷，从而难以满足使用需求。

为了提升疫苗的免疫效果，现有技术的研究者从多方面进行了努力，例如开发免疫效果更好的抗原物质、在接种疫苗的同时服用免疫促进剂等。佐剂(adjuvant)是与抗原混合后注射于生物体内、能非特异性改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答的物质，因此开发适宜的疫苗佐剂将有助于提升疫苗质量，增强免疫效果。

现有技术中，免疫佐剂多选用白油佐剂、氢氧化铝佐剂、类脂佐剂和蜂胶佐剂等，其中白油佐剂被认为有助于强化疫苗免疫效力，目前应用较为广泛。白油佐剂常用剂型包括水包油、水包油包水、油包水三种，其中油包水型应用最为普遍，但也存在一定的技术缺陷，例如其粘度较高、注射困难；同时由于疫苗中白油含量相对较高，常常导致严重的接种副反应，形成无菌性化脓损害和接种部位周围的肉芽肿，可产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死；此外有研究认为该剂型的佐剂接种后可能在接种部位形成残留，从而带来安全隐患。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种用于HBV疫苗的佐剂及其制备方法，以解决现有技术的佐剂对HBV疫苗免疫效力促进作用较低的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术的油包水型佐剂易使得疫苗注射后产生副作用。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术的佐剂不稳定、易随时间推移发生性质改变。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于HBV疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相包括以下成分：注射级白油80～85％(w/w)，span806～8％(w/w)，吐温806～8％(w/w)；所述ISCOM基质中包括以下成分：QuilA0.2～5mg/ml，胆固醇0.2～5mg/ml，左旋咪唑3～8mg/ml。

优选地，所述QuilA的含量是1～5mg/ml。

优选地，所述胆固醇的含量是1～5mg/ml。

本发明同时还提供了上述佐剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)取配方量的QuilA、左旋咪唑、胆固醇溶于PBS缓冲液中得到ISCOM基质；

2)取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80和吐温80，乳化后即得到油相。

在此方法基础上优选地，步骤2)是：取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80，以60～100r/min的转速搅拌4～6min，而后在搅拌状态下向其中加入吐温80，以60～100r/min的转速搅拌4～6min，即得到油相；更优的，上述两次搅拌转速均为80r/min、搅拌时间均为5min。

本发明的佐剂在疫苗的制备过程中可以是通过以下方法使用的：将疫苗抗原溶液与本发明佐剂的ISCOM基质混合作为水相，将该水相与本发明佐剂的油相按(1∶1)～(1∶3)(v/v)比例混合，即得到疫苗。

在以上技术方案中，ISCOM(immunostimulatingcomplex)基质是一种含有抗原成分的免疫刺激复合物，称为免疫刺激复合物基质，由QuilA(皂苷活性成分)、胆固醇等制备得到，其特点在于能有效地活化辅助型T细胞和细胞毒性T细胞，促进细胞免疫应答，尤其是Thl型细胞免疫应答，其次，ISCOM基质通常人们将其应用到活疫苗中，本发明创造性地将其应用到疫苗中，实验证实，能更有效地激活免疫，显著提高了全病毒的抗原呈递及疫苗的持续性。左旋咪唑是一种广谱驱虫药，同时研究发现其具有明显的免疫调节作用。

本发明用于HBV疫苗的佐剂创新性的引入了ISCOM基质成分，提升了免疫促进效果，可刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫，具有更好的保护作用，延长疫苗免疫保护期。当本发明佐剂用于HBV疫苗制备时，剂型为油包水型，由于成分配方的合理化设计使得利用该佐剂制备的HBV疫苗具有较好的稳定性，在2-8℃条件下保存18个月仍保持性状稳定。此外，实际应用发现，以该佐剂制备的HBV疫苗接种后无局部或全身性不良反应，安全性可靠，而且较现有技术佐剂制备的HBV疫苗具有更好的免疫效果。本发明以创新性的技术改进实现了突出的技术效果，同时成本较低，易于实现，因此具有突出的推广前景。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

实施例1

(1)佐剂油相的制备

油相是向按照百分比(白油∶span80＝17∶1)组成的混合液中加入硬脂酸铝，其加入量为每100ml混合液加入2g硬脂酸铝。120℃、20min高温蒸汽灭菌，室温保存备用。

(2)佐剂ISCOM基质的制备

分别称取QuilA100mg、胆固醇100mg、左旋咪唑500mg，用10mlPBS溶解混匀得10倍浓度的ISCOM基质。

(3)HBVC基因型灭活病毒液的制备

制备灭活的HBVC基因型抗原水溶液，灭活前每0.2ml病毒液病毒含量应≥10^7.0LD₅₀。

(4)HBVC基因型疫苗的制备

在无菌操作情况下，将上述(2)中制备的ISCOM3ml与(3)中制备的HBVC基因型灭活病毒液15g放入50ml的烧杯中，混匀；另取(1)中制备的油相加热至30℃，取13g也放入该烧杯中，同时加入磁力转子置磁力搅拌器(含加热功能)上进行搅拌乳化，转速为2000转/min，温度为30℃，搅拌30min，即成，命名为HBVC基因型疫苗A。

同法不加ISCOM基质制作白油对照疫苗，命名为对照疫苗B

同法用法国SEPPIC公司生产的ISA206佐剂替代本发明的复方油佐剂，制备对照疫苗，命名对照疫苗M。

(5)疫苗物理性状和免疫活性的比较见表1.

表1疫苗HBVC基因型和对照疫苗M的比较

通过表1可以看出，采用本发明复合佐剂制备的疫苗，稳定性为18个月，比对照疫苗M稳定，同时，其免疫效果比对照疫苗M好，副反应比对照疫苗M少，具有非常好的实际使用价值。

表2：接种不同HBV疫苗后的HBV血凝抑制抗体水平(log2平均值)

依据表2的分组情况，每组重复3批制得HBVC基因型亚型乙肝复合佐剂疫苗，注射本发明的疫苗和对照疫苗后，机体血凝抑制抗体水平上升速度比对照组更快，随着注射天数的增加，HBVC基因型疫苗抗体水平持续性较好，白油对照组和对照疫苗M组抗体水平持续性均比HBVC基因型疫苗组低。

实施例2

一种用于HBV疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相由以下成分组成：注射级白油85％(w/w)，span807％(w/w)，吐温808％(w/w)；所述ISCOM基质中包括以下成分：QuilA0.2mg/ml，胆固醇0.2mg/ml，左旋咪唑3mg/ml。

所述佐剂是通过以下方法制备的：

2)取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80，以60r/min的转速搅拌4min，而后在搅拌状态下向其中加入吐温80，以60r/min的转速搅拌4min，即得到油相。

实施例3

一种用于HBV疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相由以下成分组成：注射级白油84％(w/w)，span808％(w/w)，吐温808％(w/w)；所述ISCOM基质中包括以下成分：QuilA5mg/ml，胆固醇5mg/ml，左旋咪唑8mg/ml。

所述佐剂是通过以下方法制备的：

2)取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80，以100r/min的转速搅拌6min，而后在搅拌状态下向其中加入吐温80，以100r/min的转速搅拌6min，即得到油相。

实施例4

一种用于HBV疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相由以下成分组成：注射级白油84.5％(w/w)，span808％(w/w)，吐温807.5％(w/w)；所述ISCOM基质中包括以下成分：QuilA2.2mg/ml，胆固醇1mg/ml，左旋咪唑6mg/ml。

所述佐剂是通过以下方法制备的：

实施例5

一种用于HBV疫苗的佐剂，该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相由以下成分组成：注射级白油85％(w/w)，span808％(w/w)，吐温807％(w/w)；所述ISCOM基质中包括以下成分：QuilA1mg/ml，胆固醇2.3mg/ml，左旋咪唑5mg/ml。

所述佐剂是通过以下方法制备的：

2)取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80，以80r/min的转速搅拌5min，而后在搅拌状态下向其中加入吐温80，以80r/min的转速搅拌5min，即得到油相。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于HBV疫苗的佐剂，其特征在于该佐剂分为油相和ISCOM基质两部分，其中所述油相包括以下成分：注射级白油80～85％(w/w)，span806～8％(w/w)，吐温806～8％(w/w)；所述ISCOM基质包括以下成分：QuilA0.2～5mg/ml，胆固醇0.2～5mg/ml，左旋咪唑3～8mg/ml。

2.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于所述QuilA的含量是1～5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的佐剂，其特征在于所述胆固醇的含量是1～5mg/ml。

4.一种权利要求1所述佐剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于步骤2)是：取配方量的注射级白油，灭菌后向其中加入配方量的span80，以60～100r/min的转速搅拌4～6min，而后在搅拌状态下向其中加入吐温80，以60～100r/min的转速搅拌4～6min，即得到油相。