CN104203271B - 表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗 - Google Patents

表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN104203271B
CN104203271B CN201380015514.8A CN201380015514A CN104203271B CN 104203271 B CN104203271 B CN 104203271B CN 201380015514 A CN201380015514 A CN 201380015514A CN 104203271 B CN104203271 B CN 104203271B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
protein
seq
carrier
polypeptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201380015514.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104203271A (zh
Inventor
T·莫巴特逊
J·M·民克
F·戴维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Cimmeria Limited-Liability Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cimmeria Limited-Liability Co filed Critical Cimmeria Limited-Liability Co
Publication of CN104203271A publication Critical patent/CN104203271A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104203271B publication Critical patent/CN104203271B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/008—Leishmania antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C12N15/8633—Avian poxviral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
    • C12N2760/20134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了包含与OX40L多肽一起的免疫原性多肽或抗原并在体内或体外共表达的载体，所述载体用作基因佐剂。免疫原性多肽与OX40L多肽一起引发动物或人的免疫反应，所述免疫反应大于由免疫原性多肽单独引发的免疫反应。在一个具体的实例中，本发明提供了编码狂犬病病毒G免疫原性多肽和犬OX40L基因佐剂的载体，所述载体在犬中引发抗狂犬病病毒的强免疫反应。

Description

表达狂犬病病毒和OX40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的 疫苗
其它申请的交叉参考
本申请要求2012年2月14日提交的美国临时专利申请61/598,610的优先权，将所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明总地来说涉及病毒疫苗和使用所述疫苗的方法。更具体地，本发明涉及病毒载体，所述病毒载体可包含一种或多种基因佐剂，从而导致对由载体(有利地病毒载体)中的基因所表达的抗原的增强的免疫反应。
背景
狂犬病是可在所有温血动物物种中发生并且由狂犬病病毒引起的疾病。在几乎所有情况下狂犬病病毒感染后临床特征的爆发导致感染物种的死亡。狂犬病病毒是弹状病毒科的非分段型负链RNA病毒。狂犬病病毒病毒体由两个主要结构组分组成：核衣壳或核糖核蛋白(RNP)和以围绕RNP核心的双层膜形式存在的包膜。所有弹状病毒的感染性组分是RNP核心，其由与两个次要蛋白质即RNA依赖性RNA聚合酶(L)和磷蛋白(P)组合的核衣壳(N)蛋白包裹的RNA基因组组成。围绕RNP核心的膜由两种蛋白质：跨膜糖蛋白(G)和位于膜的内部位置的基质(M)蛋白组成。
也称为突起蛋白(spike protein)的G蛋白负责狂犬病病毒的细胞粘附和膜融合，并且还是宿主免疫系统的主要靶。已鉴定G蛋白的位置330至340上的氨基酸区域(称为抗原性位点III)负责该病毒的毒力，特别地位置333上的Arg残基。所有狂犬病病毒株都具有该毒力决定抗原位点III。
用于伴侣动物的常规狂犬病疫苗包含灭活的狂犬病病毒+佐剂，其在本领域是公知的，并且在性质上是多样的。佐剂可以例如包括不溶于水的无机盐、脂质体、胶束或乳剂，即弗氏佐剂。其它佐剂可见于Vogel和Powell,1995，上文中提及的。尽管不存在单一的佐剂作用机制，但基本特征是相比于由单独的疫苗抗原诱发的反应而言它们有显著增强对疫苗抗原的免疫反应的能力(Nossal,1999,同上；Vogel和Powell,1995,同上)。在这一点上，一些佐剂在增强体液免疫反应上更有效；其它佐剂在增强细胞介导的免疫反应上更有效(Vogel和Powell,1995,同上)；还有另一组的佐剂增强抗疫苗抗原的体液免疫反应和细胞介导的免疫反应二者(Vogel和Powell,1995,同上)。总之，佐剂通常似以5种方式中的至少一种方式发挥它们的作用：1)促进抗原在淋巴结中的摄取、运输和呈递，2)延长抗原呈递，3)先天免疫细胞上表达的信号病原体识别受体(signal pathogen-recognitionreceptors)(PRR)，4)对细胞引起损伤或应激，这为免疫反应发出信号，和5)诱导优先的Th1或Th2反应(Schijns VE等人2007)。抗原的免疫原性还可通过使用基因佐剂例如存在于免疫细胞膜上的受体的配体来增强。DNA疫苗的基因佐剂已进行了综述(参见，例如，Calarota&Weiner,Expert Rev Vaccines.2004Aug；3(4Suppl):S135-49,Calarota&Weiner,Immunol Rev.2004Jun；199:84-99and Kutzler&Weiner,J Clin Invest.2004Nov；l14(9):1241-4)，然而病毒疫苗(特别地基于痘病毒的病毒疫苗)的基因佐剂仍未获得详尽研究。
已显示肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)的几个成员及其对应受体(TNFRSF)提供了免疫反应的至关重要的共刺激信号(Watts TH.Annu Rev Immunol2005；23:23–68)。OX40Ligand(OX40L)，也称为gp34、CD252、CD134L或TNFSF4，为TNF超家族的成员。人OX40L与其小鼠对应物共有46％的氨基酸序列同一性。与其它TNA超家族成员类似，膜结合的OX40配体以同三聚体的形式存在。OX40L结合TNF受体超家族的成员OX40(CD134)。OX40在活化的T细胞上表达，而其配体OX40L在活化的抗原呈递细胞(APC)例如B细胞和树突细胞(DC)上被诱导[Watts TH.2005同上,Sugamura K,等人,Nat Rev Immunol2004；4(6):420–31]。OX40–OX40L相互作用可促进CD4+T细胞的增殖、分化和特别地存活(Rogers PR,等人,Immunity2001；15(3):445–55；Song J,等人,Nat Immunol2004；5(2):150–8)。已显示OX40的连接增强抗病毒的离体人CD8+T细胞记忆反应，所述病毒包括HIV-1、Epstein–Barr病毒(EBV)和流感病毒(Serghides L,等人,J Immunol.2005；175(10):6368–77；)。利用表达OX40L的金丝雀痘病毒和HIV-1金丝雀痘疫苗、vCP1452共免疫小鼠在频率和细胞因子表达方面增强了HIV-1特异性CD8+T细胞反应(Liu J.等人,Vaccine.2009；275077–5084)。然而，OX40L不增强由HIV-1金丝雀痘疫苗引发的抗体反应，这表明表达OX40L的金丝雀痘载体可增强HIV-1金丝雀痘疫苗的细胞但非体液免疫原性。(Liu J.等人,2009,同上)。
在本公开内容中，与先前Serghides L,等人,2005(同上)的工作(其中在体外研究中组合使用腺病毒表达的OX40L与流感病毒肽)或由Liu J.等人,2009描述的工作(其中共施用表达OX40L的金丝雀痘病毒和表达HIV-1的金丝雀痘病毒)相反，OX40L与狂犬病毒G蛋白一起通过相同重组体共表达。令人惊讶地，与由Liu J.等人,2009(同上)报导的工作中不存在体液免疫原性的增强相反，OX40L的该共表达导致峰值抗狂犬病病毒中和抗体滴度增加至2至3倍。
伴侣动物的有基因佐剂的狂犬病疫苗是高度期待的，因为其可避免或减小与有常规化学佐剂的疫苗相伴的负面结果(例如注射部位的反应、不适、疼痛、非特异性免疫反应、增加的癌症风险等)。例如，在猫中，已报导疫苗相关肉瘤的发展与一些有佐剂的疫苗的施用相关。因此，存在对有效并且安全的病毒疫苗(特别在以足以引发保护性反应的量表达靶抗原、表位、免疫原、目标肽或多肽方面)的需要。
发明概述
本发明的目的可以是提供重组载体或病毒以及用于产生这样的病毒的方法，和提供组合物和/或疫苗以及用于治疗和预防感染的方法之中的任一个或全部。
本发明提供了重组载体，例如重组病毒，例如重组痘病毒，所述重组载体包含并表达至少一个外源核酸分子，并且所述至少一个外源核酸分子可包含编码来自狂犬病病毒的目标免疫原或表位例如狂犬病病毒G蛋白的核酸分子。
本发明还包括许多种抗原，所述抗原已使用痘病毒或其它适当的病毒表达载体而在动物宿主中成功地进行体内表达，以诱发免疫和/或保护性免疫反应，所述适当的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、副粘液病毒、马立克氏病病毒(MDV)、新城疫病毒(NDV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)等。实例包括但不限于犬瘟热病毒、口蹄疫病毒(FMDV,属于Merial的US7527960)、流感病毒(各自属于Merial的US7384642,US7910112,US6713068和US7507416)、蓝舌病毒(BTV,属于Merial的US7862821)、猪环状病毒II型(PCV2,属于Merial的US6497883)、尼帕病毒(属于Merial的US7803612)、亨德拉病毒、西尼罗病毒(WNV,属于Merial的US7740863)、猫白血病病毒(FeLV,属于Merial的US7582302)、犬利什曼原虫(属于Merial的US7794736)、猫科动物杯状病毒(FCV,属于Merial的US691413)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV,属于Merial的US6096535)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、非洲马病病毒(AHSV,属于Merial的US2010/0119546A1)和水疱性口炎病毒(属于的Merial US8008268属于)，将本文中每一篇文献的公开内容通过引用整体并入本文。
具体地，本发明提供了重组载体，例如重组病毒，例如重组痘病毒，所述载体包含至少一个外源核酸分子并表达其，所述至少一个外源核酸分子可包含任何适当的抗原，包括狂犬病病毒G多肽和/或其变体或片段。
本发明提供了重组载体，例如重组痘病毒，其包含编码狂犬病病毒G多肽和/或其变体或片段的第一多核苷酸，和编码TNFα受体结合多肽和/或其变体或片段的第二多核苷酸。
本发明还提供了包含这样的表达载体或这样的表达载体的表达产物的组合物或疫苗。
本发明还提供了用于诱导抗狂犬病病毒的免疫(或免疫原性)或保护性反应的方法，以及用于预防或治疗狂犬病或由狂犬病引起的疾病状态的方法，包括施用所述表达载体或所述表达载体的表达产物，或包含该表达载体的组合物，或包含该表达载体的表达产物的组合物。
本发明还涉及来自病毒的表达产物以及从表达产物或其体内表达产生的抗体，和这样的产物和抗体用于例如诊断应用的用途。
还提供了包括至少一种狂犬病病毒多肽或其片段或变体以及使用说明书的试剂盒。
本发明还部分地基于如下预料之外的令人惊讶的结果：在动物宿主中体内共表达编码来自病原体(包括但不限于狂犬病病毒)的抗原的基因和TNFαR配体基因佐剂(包括但不限于OX40L)的痘病毒载体可在动物中引发抗狂犬病病毒的长效保护性免疫力。具体地，OX40L可与待接种的物种同源，例如，可将犬OX40L(cOX40L)与狂犬病病毒G蛋白有效地组合在抗狂犬病病毒的犬疫苗中。
这些和其它实施方案在下列详述中进行公开，或根据下列详述变得显然，并且包括在内。
附图概述
在本说明书的其余部分更具体地显示了本发明的完整、充分公开的内容，包括参考附图，其中：:
图1提供了用于构建供体质粒p397-Syn狂犬病病毒G蛋白的示意图。显示了用于验证侧翼C3臂以及合成狂犬病病毒G蛋白的序列的测序引物的位置；
图2提供了在C3位点具有合成狂犬病病毒G蛋白和在C5位点具有经典狂犬病病毒G蛋白的vCP3006的基因组组织的图示；
图3是从野生型ALVAC和vCP3006分离的基因组DNA的图像，所述基因组DNA已用HindIII、BamHI或XbaI消化，并且使用琼脂糖凝胶电泳分离；
图4显示图3中描述的凝胶的Southern印迹(来自wt ALVAC和vCP3006的基因组DNA)，所述印迹已用合成狂犬病病毒G蛋白特异性探针杂交；
图5显示vCP3006表达的Western印迹分析。仅可在vCP3006感染的细胞沉淀(左)中检测到对应于狂犬病病毒G蛋白的条带。加载不同量的来自以相似MOI的vCP3006或vCP65a感染的细胞的感染细胞样品以比较G蛋白表达(右)；
图6提供了vCP3006C3区域的示意图，显示引物位置；
图7提供了覆盖侧翼C3臂、I3L启动子以及合成狂犬病病毒G蛋白(完全序列示于SEQ ID NO:2中)的vCP3006的序列；
图8显示合成的密码子最优化狂犬病病毒糖蛋白G的预测的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)；
图9是供体质粒p397-cOX40L的示意性克隆图；
图10是在C5位点具有经典狂犬病病毒G蛋白和在C6位点具有cOX40L的vCP3015的基因组组织的示意图；
图11是显示NruI消化的基因组DNA在凝胶电泳(右)上的分离和使用cOX40L探针的Southern印迹杂交的琼脂糖凝胶图象；
图12是显示NruI消化的基因组DNA(左)的分离和使用经典狂犬病病毒G蛋白的Southern印迹杂交(右)的琼脂糖凝胶图像。该探针横跨经典狂犬病病毒G蛋白和389bp的C5右臂，由于该389bp探针的结合，因此存在与亲代ALVAC基因的弱杂交信号(泳道3)，但条带大小与vCP3015不同。
图13是vCP3015的Western印迹分析。可在被vCP3015感染的细胞的沉淀中检测到对应于狂犬病病毒G蛋白的条带；
图14是显示引物位置的vCP3015C6区域示意图；
图15是覆盖侧翼C6臂、42K启动子以及合成cOX40L的vCP3015的序列(总体上如SEQID NO:7中所示的)；
图16是合成cOX40L的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:12、63、64、65、66或67)；
图17是显示引物位置的vCP3015C5区域示意图；
图18是覆盖侧翼C5壁、H6启动子以及经典狂犬病病毒G蛋白的vCP3015的序列(整体上如SEQ ID NO:13所示的)；
图19是经典狂犬病病毒G蛋白的预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。经典G蛋白和密码子最优化的G蛋白(SEQ ID NO:1)的预测的氨基酸序列100％相同；
图20是在C5位点上具有经典狂犬病病毒G蛋白、在C3位点上具有密码子最优化的合成狂犬病病毒G蛋白以及在C6位点上具有cOX40L的vCP3012的基因组组织图示；
图21描述了PmeI消化的基因组DNA在凝胶电泳上的分离和使用经典狂犬病病毒G蛋白探针的Southern印迹杂交；
图22描述了BamHI消化的基因组DNA在凝胶电泳上的分离和使用合成狂犬病病毒G蛋白探针的Southern印迹杂交；
图23描述了NruI消化的基因组DNA在凝胶电泳上的分离和使用经典狂犬病病毒G蛋白探针的Southern印迹杂交；
图24为vCP3012的Western印迹分析。对应于狂犬病病毒G蛋白的条带在感染的细胞沉淀中可检测到：
图25为显示引物位置的vCP3012C6区域示意图；
图26显示覆盖侧翼C6臂、42K启动子以及合成cOX40L的vCP3012的序列(整体上如SEQ ID NO:17中所示)；
图27是显示引物位置的vCP3012C3区域示意图；
图28显示覆盖侧翼C3臂、I3L启动子以及合成狂犬病病毒G蛋白的vCP3012的序列(整体上如SEQ ID NO:20中所示)；
图29显示从C5R至C5L的vCP3012的片段(即狂犬病病毒G蛋白和侧翼区域)的示意图；
图30显示包含狂犬病病毒G蛋白基因、从C5R至C5L的vCP3012序列(整体上如SEQID NO:23中所示)。经典狂犬病病毒G蛋白(SEQ ID NO:1)和合成狂犬病病毒G蛋白(SEQ IDNO:1)的预测的氨基酸100％相同，并且与针对vCP3006或vCP3015所描述的相同；
图31是第14天的GMT和95％置信区间(CI)的图；
图32是第21天的GMT和95％置信区间(CI)的图；
图33是第28天的GMT和95％置信区间(CI)的图；
图34是第48天的GMT和95％置信区间(CI)的图；
图35是显示组滴度的图；
图36是SEQ ID NO:1-24,63-67的描述；
图37是SEQ ID NO:25-62的描述；
图38显示了SEQ ID NO:12、63-67(即选择的OX40L肽)的氨基酸序列比对。附表显示序列间的百分比同一性。
本发明的详述
提供了包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码引发动物中免疫原性反应的狂犬病病毒多肽及其片段和变体的多核苷酸。可将包含编码狂犬病病毒多肽或片段或变体的多核苷酸的表达载体配制成疫苗或药物组合物，并用于引发或刺激动物的保护性反应。在一个实施方案中，所述狂犬病病毒多肽是狂犬病病毒G多肽或其片段或变体。
提供了包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码狂犬病病毒G多肽或其活性片段或变体的多核苷酸以及编码OX40L多肽或其活性片段或变体的多核苷酸。具体地，所述OX40L为犬OX40L(cOX40L)。
已认识到本发明的多肽可以是全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“活性变体”意指所述片段或变体保留该多肽的抗原性性质。因此，本发明包括引发动物中免疫原性反应的任意狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原。所述狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原可以是任意狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原，包括但不限于在动物例如禽类中引发、诱发或刺激反应的蛋白质、肽或其片段或变体。
特定目标狂犬病病毒多肽是狂犬病病毒糖蛋白(G)。狂犬病病毒G蛋白是指在狂犬病病毒的表面上发现的一种糖蛋白类型。其为抗原性糖蛋白并且负责将病毒结合于正被感染的细胞。已认识到，可使用这些抗原中任一种的前体。
本发明的抗原性多肽能够保护免受狂犬病侵害。即，它们能够刺激动物的免疫反应。“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱发特异性免疫反应的物质。抗原可包含完整生物体、杀死的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物后诱发免疫反应的DNA部分或片段；多肽、表位、半抗原或其任意组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，意指具有任意长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性的或分枝的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且其可被除氨基酸外的化学部分间断。该术语还包括已被天然修饰或通过干预而被修饰(例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记或生物活性组分的缀合)的氨基酸聚合物。
术语“狂犬病病毒G多肽或多核苷酸”是指任何天然或最优化的狂犬病病毒G多肽或多核苷酸，以及它们的衍生物和变体。
术语“OX40L多肽或多核苷酸”是指任何天然或最优化的OX40L多肽或多核苷酸以及它们的衍生物和变体。
如本文中所用，术语“免疫原性或抗原性多肽”包括这样的多肽，所述多肽在给宿主施用后能够诱发针对该蛋白的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上具有免疫活性。优选地，蛋白质片段是这样的片段，其与总蛋白质具有大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由至少一个表位或抗原决定簇组成或由至少一个表位或抗原决定簇组成。"免疫原性"的蛋白质或多肽，如本文中所用，包括该蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。"免疫原性片段"意指包括一个或多个表位、从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。这样的片段可使用本领域公知的许多表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可通过例如在固体载体上同时合成大量肽(所述肽对应于该蛋白质分子的部分)，将肽与抗体反应(同时肽仍然连接于载体)来测定。这样的技术在本领域是已知的并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen等人,1984；Geysen等人,1986中。类似地，构象表位可通过例如经X射线晶体学和二维核磁共振测定氨基酸的空间构象来容易地鉴定。参见，例如，Epitope MappingProtocols,同上。特别适用于小泰勒虫(T.parva)的蛋白质的方法详尽地描述于PCT/US2004/022605(通过引用整体并入本文)中。
如本文中所述，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原性多肽”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要所述多肽能够产生本文中定义的免疫反应即可。术语"保守变异"意指用另一个生物学上相似的残基对氨基酸替代，或核酸序列中使得编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基的核苷酸替代。在这方面，特别优选的置换通常在性质上是保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括一个疏水性残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸为另一个疏水性残基置换、或一个极性残基为另一个极性残基置换，例如精氨酸被赖氨酸置换、谷氨酸被天冬氨酸置换，或谷氨酰胺被天冬酰胺置换等；或对生物活性将无重大影响的结构上相关的氨基酸对氨基酸的相似保守替代。因此，具有与参照分子大体上相同的氨基酸序列但具有少量不显著影响蛋白质的免疫原性的氨基酸置换的蛋白质，在参照多肽的定义内。本文中包括由这些修饰产生的所有多肽。术语"保守变异"还包括使用取代的氨基酸替代未被取代的亲代氨基酸，只要针对被取代的多肽产生的抗体也与未被取代的多肽发生免疫反应即可。
术语"表位"是指抗原或半抗原上特定B细胞和/或T细胞对其起反应的部位。该术语还可与"抗原决定簇"或"抗原性决定部位(antigenic determinant site)"互换使用。可在显示一种抗体阻断另一种抗体对靶抗原相结合的能力的简单免疫测定中鉴定识别相同表位的抗体。
对组合物或疫苗的"免疫反应"是宿主中细胞和/或抗体介导的针对目标组合物或疫苗的免疫反应的发展。通常地，"免疫反应"包括但不限于下列效应中的一个或多个效应：特异性针对目标组合物或疫苗中包含的抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性得以增强和/或疾病的临床严重度减轻。这样的保护作用可体现为感染的宿主通常显示的症状的减少或不存在、更快的恢复时间和/或感染的宿主中更低的病毒滴度。
“动物”是期望的哺乳动物、鸟类等。本文中使用的动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、山狗、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物和其它猫科动物包括猎豹和山猫)、羊(例如，绵羊)、牛族动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类动物(例如，狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)、白鼬、海豹和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育时期包括胚胎期和胎儿期的个体动物。
除非另外解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非上下文明确地另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。类似地，除非上下文明确地另有所指，否则单词“或”意欲包括“和”。
应指出，在本公开内容中，特别地在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“含有”、“包括”等可具有归于其在美国专利法中的含义；例如，它们可意指“包括”、“包含”、“含有”等；并且术语例如“基本上由……组成”和“大体上由.......组成”具有归于它们在美国专利法中的含义，例如，它们允许未明确引述的要素，但不包括在现有技术技术中发现的或影响本发明的基本或新型特征的要素。
组合物
本发明涉及狂犬病疫苗或组合物，所述疫苗或组合物可包含含有编码狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的重组或表达载体，和药学上或兽医学上可接受的载体、赋型剂或媒介物。狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原可以是任何狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原，例如，但不限于在动物中引发、诱发或刺激反应的蛋白质、肽或其片段。
本发明涉及狂犬病病毒疫苗或组合物，其可包含含有编码狂犬病病毒G多肽的多核苷酸的重组或表达载体，和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在一个实施方案中，该表达载体还可包含编码OX40L多肽的多核苷酸。
在另一个实施方案中，所述药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。在另一个实施方案中，油包水乳剂可以是水/油/水(W/O/W)三重乳剂。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是水包油乳剂。
在一个实施方案中，所述狂犬病病毒多肽、抗原或其片段或变体包括狂犬病病毒G多肽或其片段或变体。在该实施方案的一个方面，狂犬病病毒G多肽或其片段或变体是由狂犬病病毒G蛋白基因产生的重组多肽。在该实施方案的另一个方面，狂犬病病毒G蛋白基因与SEQ ID NO:5或16所示的序列具有至少70％的同一性。在该实施方案的另一个方面，狂犬病病毒G多肽或其片段或变体与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80％的同一性。
在另一个实施方案中，OX40L多肽、抗原或片段或变体是由OX40L基因产生的重组多肽。在该实施方案的另一个方面，OX40L基因与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少70％的同一性。在该实施方案的另一个方面，OX40L多肽或其片段或变体与SEQ ID NO:12、63、64、65、66或67中所示的序列具有至少80％的同一性.
在另一个实施方案中，本发明提供了非专用于伴侣动物例如猫、狗和白鼬中的新型的、有基因佐剂的狂犬病疫苗，所述疫苗包含含有狂犬病病毒G蛋白和OX40L并表达其的重组痘病毒载体。在另一个实施方案中，所述载体可包含重组金丝雀痘病毒。在另一个实施方案中，狂犬病病毒表面糖蛋白基因可编码狂犬病病毒糖蛋白G(具有SEQ ID NO:1所示的序列)，OX40L具有SEQ ID NO:12、63、64、65、66或67所示的序列。
合成抗原也包括在该定义内，例如多表位、侧翼表位和其它重组或合成来源的抗原。参见，例如，Bergmann等人,1993；Bergmann等人,1996；Suhrbier,1997；Gardner等人,1998。为了本发明的目的，免疫原性片段通常包括分子的至少约3个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10-15个氨基酸或约15-25个氨基酸或更多个氨基酸。对于片段的长度不存在临界上限，所述片段可包含几乎全长的蛋白质序列，或甚至包含该蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。
因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码狂犬病病毒多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。编码狂犬病病毒多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最小15个核苷酸、约30-45个核苷酸、约45-75个或至少57、87或150个连续或邻接核苷酸，或基本上由所述核苷酸组成或由所述核苷酸组成。表位测定方法例如产生重叠肽文库(Hemmer等人,1998),Pepscan(Geysen等人,1984；Geysen等人,1985；Van der Zee R.等人,1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.PeptideSynthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人,1999；PCT/US2004/022605)可用于本发明的实施。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指为线性或分枝的、单链或双链的或其杂交体的RNA或DNA。该术语还包括RNA/DNA杂交体。下列为多核苷酸的非限定性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分枝的多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离DNA、具有任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿苷(uracyl)、其它糖和连接基团例如氟代核糖和硫醇盐(thiolate)，以及核苷酸分枝。还可在聚合后通过例如缀合利用标记组分来进一步修饰核苷酸的序列。该定义中包括的其它类型的修饰为帽、利用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及引入用于将多核苷酸连接蛋白质、金属离子、标记组分、其它多核苷酸或固体载体的装置。多核苷酸可通过化学合成获得或来源于微生物。
术语“基因”广泛地用于指与生物功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中)，或仅包括编码序列(如在cDNA中)和/或它们表达所需的调控序列。例如，基因还指这样的核酸片段，所述核酸片段表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质，以及包含调控序列。
关于OX40L的变异，“OX40L的功能性片段或变体”在本文中定义为这样的肽，所述肽相较于本说明书的OX40L而言，通过相同机制，以相当的程度辅助/加强由免疫原性肽引发的免疫反应。例如，如果猫科动物OX40L与狂犬病病毒G蛋白在犬宿主中共表达时导致的抗狂犬病病毒的免疫反应比由单独的狂犬病病毒G蛋白表达载体引发的免疫反应更强，并 且猫科动物OX40L通过相同机制(例如结合TNF受体)发生作用时，则该猫科动物OX40L将被认为是本文中举例说明的犬科动物OX40L的“功能性片段或变体”。同样地，能够增强免疫反应的犬科动物OX40L的多态性形式也是cOX40L的“功能性片段或变体”。最后，如果OX40L的截短形式协助/增强免疫反应达到与对应的全长OX40L相当的程度，该截短形式被认为是“OX40L的功能性片段或变体”。
本发明还包括与编码狂犬病病毒抗原、表位或免疫原的多核苷酸或与编码OX40L抗原、表位或免疫原的多核苷酸互补的链。互补链可以是多聚的，具有任意长度，并且可以以任意组合包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。
“分离的”生物组合(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指这样的组分，所述组分已与所述组分天然存在于其中的生物体的细胞中的其它生物组分(例如其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器)大体上分离或从中纯化出来。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
如本文中所用，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反地，其旨在作为相对术语。因此，例如，部分纯化的多肽制剂为其中多肽比该多肽在其天然环境中更加富集的制剂。即多肽与细胞组分分离。“大体上纯化的”意指至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％或更多的细胞组分或材料已被去除。同样地，多肽可被部分纯化。“部分纯化的”意指少于60％的细胞组分或材料被除去。所述术语适用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何方法来纯化。
此外，狂犬病病毒G多肽的同源物和OX40L多肽的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能但分别在不相关生物体中进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种，但通过物种形成从共同祖先基因进化的两个多核苷酸或多肽。通常地，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的重复发生关系的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。例如，野生型狂犬病病毒多肽的类似物、直系同源物或旁系同源物可与野生型狂犬病病毒多肽在翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者方面不同。具体地，本发明的同源物通常显示与野生型狂犬病病毒多肽或多核苷酸序列的全部或部分有至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且显示相似的功能。
在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。在另一个方面，本发明提供了上文中鉴定的狂犬病病毒多肽或OX40L多肽的片段和变体(SEQ ID NO:1或12、63-67)，所述片段和变体可由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。
变体为具有与SEQ ID NO:1或12、63-67中所示的氨基酸序列有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的同源多肽。
变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒种或种类)中。这样的天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽中1-5％的变异。等位基因变体可通过测定许多不同物种中的目标核酸序列的序列来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定那些物种中相同基因的基因座来容易地进行。任何和所有这样的核酸变异以及因天然等位基因变异所致并且不改变目标基因的功能活性的氨基酸多态性或变异意欲在本发明的范围内。
如本文中所用，术语"衍生物"或“变体”是指多肽，或编码多肽的核酸，所述多肽具有一个或多个保守氨基酸变化或其它微小修饰，从而(1)当与野生型多肽相比较时，对应多肽具有大体上等同的功能或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽有免疫反应。这些变体或衍生物包括具有狂犬病病毒多肽或OX40L一级氨基酸序列的微小修饰的多肽，所述修饰可导致与未修饰的对应多肽相比具有大体上等同的活性的肽。这样的修饰可以是有意而为的，如通过定向诱变，或可以是自发的。术语“变体”还包括对序列的缺失、添加和置换，只要多肽能够产生本文中定义的免疫反应即可。
术语"保守变异"意指另一个生物学上相似的残基对氨基酸残基的替代，或核酸序列中核苷酸的替代从而使得编码的氨基酸不改变或为另一个生物学上相似的残基。在这方面，特别优选置换在性质上通常是保守的，如上文中描述的。
狂犬病病毒多肽或OX40L多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO:1中所示序列的狂犬病病毒G多肽或其变体、或具有SEQ ID NO:12、63、64、65、66或67所示序列的OX40L多肽或其变体的至少8、10、13、14、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了编码狂犬病病毒G多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ ID NO:5或16所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码与具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽或保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段(包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸)或这些多肽的组合的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了编码OX40L多肽的多核苷酸，例如编码具有SEQ IDNO:12、63、64、65、66或67所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码与具有SEQ ID NO:12、63、64、65、66或67所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段(包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸)或这些多肽的组合的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:5、10或16所示核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:5、10或16所示序列的多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸，或其变体。
本公开内容的多核苷酸包括因遗传密码(例如特定宿主的最优化密码子用法)而简并的序列。如本文中所用，“最优化的”是指经遗传工程化以增加其在给定的物种中的表达的多核苷酸。为了提供最优化的编码狂犬病病毒G多肽或OX40L多肽的多核苷酸，狂犬病病毒G蛋白基因或OX40L基因的DNA序列可被修饰来1)包含由在特定物种中高度表达的基因偏好的密码子；2)在核苷酸碱基组成上包含A+T或G+C含量至在所述物种中被大量发现的含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除引起RNA的去稳定化、不适当的多聚腺苷酸化、降解和终止，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。狂犬病病毒G蛋白或OX40L蛋白在所述物种中的增加的表达可通过利用真核生物和原核生物中或特定物种中的密码子用法的分布频率来实现。术语“优选密码子用法的频率”是指由特定宿主细胞显示的在指定给定氨基酸的核苷酸密码子用法上的偏好性。存在20种天然氨基酸，其大部分被超过一个密码子编码。因此，所有简并核苷酸序列包括在本公开内容中，只要由所述核苷酸序列编码狂犬病病毒G多肽或OX40L多肽的氨基酸序列在功能上未被改变即可。
两个氨基酸序列之间的序列同一性可通过使用标准参数，通过NCBI(美国国家生物技术信息中心)配对blast和blosum62矩阵来确定两个氨基酸序列之间的序列同源性(参见例如可在"美国国家生物技术信息中心"(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上以及Altschul等人中获得的BLAST或BLASTX算法；因此，该文献由术语“blasts”谈及使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。
关于序列的“同一性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列之较短者中的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)，例如使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和为4的缺口罚分来测定，可使用商购可得的程序(例如，IntelligeneticsTM Suite,IntelligeneticsInc.CA)来方便进行序列数据的计算机辅助分析和解释(包括比对)。当RNA序列被认为是相似的，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可通过将DNA序列中的胸苷(T)视为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)而从DNA序列衍生。
两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)来测定。
下列文献提供了用于比较序列的相对同一性或同源性的算法，并且针对上述内容额外地或可选择地，可将这些参考资料中的教导用于测定百分比同源性或同一性：Needleman SB和Wunsch CD；Smith TF和Waterman MS；Smith TF,Waterman MS和SadlerJR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和Sharp PM；Thompson JD,Higgins DG和GibsonTJ；以及，Devereux J,Haeberlie P和Smithies O。并且，无需过度实验，本领域普通技术人员可咨询许多用于测定百分比同源性的其它程序或参考资料。
可在不同“严格度”的条件下进行杂交反应。增加杂交反应的严格度的条件是公知的。参见例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第2版(Sambrook等人,1989)。
本发明还包括包含在载体分子或表达载体中并且有效地连接于启动子元件和任选地增强子的狂犬病病毒多核苷酸或OX40L多核苷酸或两者。
“载体”是指包含待体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包含用于预防或治疗的目标序列，可任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，载体不必能够在最终的靶细胞或受试者中复制。该术语包括克隆性载体和病毒载体。
术语“重组体”意指具有半合成或合成来源的多核苷酸，所述多核苷酸不是天然存在的或以非天然发现的排列方式连接于另一个多核苷酸。
“异源”意指来源于在遗传上与将与其比较的该实体其余部分不同的实体。例如，可通过基因工程技术将多核苷酸置于来源于不同来源的质粒或载体中，所述多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列取出并有效地连接于除天然序列外的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明的多核苷酸可包含另外的序列，例如在相同转录单位内的另外的编码序列，控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5’UTR、3’UTR、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的另外的转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞的转化的序列，以及任何这样的构建体(如对于提供本发明的实施方案是有利的)。
用于表达狂犬病病毒G多肽、抗原、表位或免疫原或者OX40L多肽的元件有利地存在于本发明的载体中。所述载体以最低限度的方式包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子，以及任选地对于某些载体(例如质粒)和某些病毒载体(例如除痘病毒外的病毒载体)的多聚腺苷酸化序列。当多核苷酸编码多肽片段例如狂犬病病毒G多肽时(有利地在载体中)，将ATG置于阅读框架的5'，将终止密码子置于3'。用于控制表达的其它元件可存在，例如增强子序列、稳定化序列例如内含子和允许蛋白质分泌的信号序列。
本发明还涉及包含载体例如表达载体的制剂，例如治疗性组合物。制剂可包含一种或多种载体，例如表达载体，例如体内表达载体，所述载体包含并表达一种或多种狂犬病病毒G蛋白或OX40L多肽、抗原、表位或免疫原。在一个实施方案中，载体在药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物中包含并表达这样的多核苷酸，所述多核苷酸包含编码和/或表达狂犬病病毒G抗原、表位或免疫原的多核苷酸。因此，根据本发明的一个实施方案，制剂中的其它载体包含这样的多核苷酸或基本上由所述多核苷酸组成或由所述多核苷酸组成，所述多核苷酸编码并且在适当的环境下表达狂犬病病毒G多肽、抗原、表位或免疫原(例如，血凝素、神经氨酸酶、核蛋白)中的一种或多种其它蛋白或其片段。
根据另一个实施方案，所述制剂中的载体包含编码狂犬病病毒G多肽、抗原、表位或免疫原或者OX40L多肽、抗原、表位或免疫原中的一种或多种蛋白或片段或其组合的多核苷酸，或基本上由所述多核苷酸组成或由所述多核苷酸组成。在另一个实施方案中，制剂包含1、2或更多种载体，所述载体包含编码并表达(有利地体内)狂犬病病毒G多肽、抗原、融合蛋白或其表位的多核苷酸。本发明还涉及载体混合物，所述载体混合物包含编码并表达不同狂犬病病毒G多肽、抗原、表位、融合蛋白或免疫原，例如来自不同物种(例如但不限于人、猪、母牛或牛、狗、猫和禽类)的狂犬病病毒G多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸。
根据本发明的又一实施方案，表达载体是质粒载体，特别地体内表达载体。在一个具体的非限定性实例中，pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke等人,1997；Hartikka等人,1996,参见，例如，美国专利No.5,846,946和6,451,769)可用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012并包含人tPA信号序列。在一个实施方案中，人tPA信号包含在Genbank中登录号HUMTPA14下的氨基酸M(1)至氨基酸S(23)。在另一个具体的非限定性实例中，用作用于插入多核苷酸序列的载体的质粒可包含在Genbank中登录号U28070下的从氨基酸M(24)至氨基酸A(48)的马科动物IGF1的信号肽序列。关于可被考虑或用于实践的DNA质粒的其它信息见于例如美国专利No.6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中。
术语质粒覆盖任何DNA转录单位，所述转录单位包含根据本发明的多核苷酸和其在期望宿主或靶的细胞中体内表达所必需的元件；并且，在这方面，应指出超螺旋或非超螺旋环状质粒以及线性形式意欲在本发明的范围内。
每一个质粒此外还包含或含有编码任选地与异源肽序列、变体、类似物或片段融合的狂犬病病毒G蛋白、抗原、表位或免疫原的多核苷酸(有效地连接于启动子或在启动子的控制之下或依靠启动子的)，或基本上由所述多核苷酸组成。一般地，有利地使用在真核细胞中具有功能的强启动子。强启动子可以是，但不限于人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选地具有另一种来源(例如大鼠或豚鼠)的所述启动子。
在更一般的术语中，启动子具有病毒或细胞来源。除CMV-IE外可有用地用于本发明的实践的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于本发明实践的强细胞启动子为细胞骨架基因的启动子例如结蛋白启动子(Kwissa等人,2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人,1989)。
关于质粒和除痘病毒外的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(polyA)，可使用牛生长激素(bGH)基因(参见U.S.5,122,458)的poly(A)信号或兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。
“宿主细胞”意指已被遗传改变或能够通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体而被遗传改变的原核或真核细胞。当提及遗传改变的细胞时，该术语指初始改变的细胞和其后代。
使用方法和制品
本发明包括下列方法实施方案。在一个实施方案中，公开了接种动物的方法，其包括给动物施用组合物，所述组合物包含含有编码狂犬病病毒G多肽或其片段或变体的多核苷酸的载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。在该实施方案的一个方面，动物为禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物、白鼬、海豹或猪。
在本发明的一个实施方案中，可使用初免-加强方案，所述方案由使用至少一种共同多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初免施用(primary administration)和至少一次加强施用。通常，用于初免施用的免疫组合物或疫苗在性质上与用作加强剂的免疫组合物或疫苗不同。然而，应指出，相同组合物可用作初免施用和加强施用。该施用方案称为“初免-加强”。
在本发明中，重组病毒载体用于表达狂犬病病毒编码序列或其编码狂犬病病毒多肽或其片段或变体的片段。具体地，病毒载体可表达狂犬病病毒序列，更具体地，狂犬病病毒G蛋白基因或其编码抗原性多肽的片段。本文中涉及的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如，痘苗病毒或减毒的痘苗病毒、鸟痘病毒或减毒的鸟痘病毒(例如，金丝雀痘病毒、鸡痘病毒、鸽痘病毒(dovepox)、鸽痘病毒、鹌鹑痘病毒、ALVAC、TROVAC；参见例如，US 5,505,941、US 5,494,8070)、浣熊痘病毒、猪痘病毒等]、腺病毒(例如，人腺病毒、犬腺病毒)、疱疹病毒(例如犬疱疹病毒、猫疱疹病毒、牛疱疹病毒、猪疱疹病毒)、杆状病毒、反转录病毒等。在另一个实施方案中，鸟痘病毒表达载体可以为金丝雀痘病毒载体例如ALVAC。在另一个实施方案中，鸟痘病毒表达载体可以为鸡痘病毒载体例如TROVAC。狂犬病病毒多肽、抗原、表位或免疫原可以为狂犬病病毒G蛋白。例如，包含狂犬病病毒G蛋白的痘病毒载体可以是如US 5,756,102中描述的载体。将待表达的本发明的狂犬病病毒G多肽或抗原插入在其中，处于特定痘病毒启动子例如牛痘病毒启动子7.5kDa(Cochran等人,1985)、痘病毒启动子I3L(Riviere等人,1992)、痘病毒启动子G(Shida,1986)、牛痘病毒启动子ATI(Funahashi等人,1988)、痘病毒启动子H6(Taylor等人,1988b；Guo等人,1989；Perkus等人,1989)的控制之下，出处同前。
初免-加强方案包括使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段的至少一次初免施用和至少一次加强施用。用于初免施用的疫苗在性质上可与用作随后的加强疫苗的疫苗不同。初免施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。
在本发明的初免-加强方案或方法的一个方面，初免-加强方案可包括体内施用包含重组病毒载体(所述载体包含并表达狂犬病病毒G多肽、抗原和/或其变体或片段)的组合物，随后施用本发明的重组狂犬病病毒G多肽或抗原。同样地，初免-加强方案可包括施用包含本发明的狂犬病病毒G抗原的组合物，随后体内施用包含并表达狂犬病病毒G多肽或抗原和/或其变体或片段的重组病毒载体。还应指出，初次和二次施用可包括含有本发明的狂犬病病毒G多肽并表达其的重组病毒载体。因此，可将本发明的重组狂犬病病毒载体与重组狂犬病病毒抗原以任意顺序施用，或可选择地可将本发明的重组狂犬病病毒载体作为初次和二次施用组合物单独使用。
在本发明的初免-加强方案的另一个方面，施用包含含有并且体内表达本发明的狂犬病病毒G多肽、抗原和/或其变体或片段的重组病毒载体的组合物，随后施用包含狂犬病病毒多肽或抗原的灭活的病毒组合物或疫苗。同样地，初免-加强方案可包括施用灭活的病毒组合物或疫苗，随后施用包含并在体内表达本发明的狂犬病病毒G多肽、抗原和/或其变体或片段的重组病毒载体。
在本发明的初免-加强方案的另一个方面，初免-加强方案包括本发明的基于重组病毒载体的组合物的至少一次初免施用，和本发明的基于质粒的组合物的至少一次加强施用。同样地，初免-加强可包括本发明的基于质粒的组合物的至少一次初免施用，和本发明的基于重组病毒载体的组合物的至少一次加强施用。
用于哺乳动物靶物种的组合物的剂量体积，例如基于病毒载体的狗组合物(例如基于非痘病毒的-病毒载体的组合物)的剂量体积通常为约0.1至约2.0ml，约0.1至约1.0ml和约0.5ml至约1.0ml。
可通过用狂犬病病毒的强毒株攻击动物例如狗来在最后一次免疫后测试疫苗的功效。一般地，麻醉动物，通过IM注射(0.5ml至每一个额肌和/或咬肌中)施用1.0ml攻击材料。靶剂量为3.8log10LD50/ml，进行小鼠中的攻击反滴定以验证实际接种剂量。在攻击前7天，使狗适应单独的笼子，在单独的笼子中喂养直至研究结束。给动物喂饲商购可得的食物，随意提供水。软件V9.1Enterprise Guide可用于产生用于关养的随机化表。在D0天，可通过在PBS+2％胎牛血清中以1:100稀释初始攻击悬浮原液来制备攻击株。可将稀释的攻击材料置于无菌、密封和加盖的小瓶，相应地标记和保持在冰上直至使用。在攻击前的早上，最好施用止痛剂/抗炎剂，例如非罗考昔5mg/kg(以半片增量的计算剂量)，如果动物是狗的话。应当每日观察动物的死亡率或表明狂犬病病毒感染的进行性神经学体征，进行至少攻击后30天。按照接受的方法人道地无痛致死具有进行性神经学体征的动物。在死亡或无痛致死后立即从所有动物收集核心脑样品。可在于麻醉下无痛致死时通过心内棒(intracardiac stick)进行攻击后采血。可加工血液获得血清，将其分入两个等分(2-3ml/每一个等分)，冷冻(～-20℃)贮存血清直至测试。可从在攻击后的期间死亡或无痛致死的所有动物和在研究结束时无痛致死的任何存活动物收集来自延髓的核心样品。可将样品新鲜地在冰上或在干冰上冷冻地运输至测试设备。血清狂犬病病毒抗体滴度可使用快速荧光斑点抑制实验(RFFIT)或荧光抗体病毒中和(FAVN)测定来定量，可将来自研究动物的脑组织经历抗狂犬病病毒单克隆抗体的直接免疫荧光染色。
本领域普通技术人员应当理解，本文中的公开内容是以举例形式提供，并且本发明不限定于其。根据本文中的公开内容和本领域的知识，本领域普通技术人员可确定施用次数、施用途径和用于每一个注射方案的剂量而无需过度实验。
本发明包括至少一次给动物施用有效量的根据本发明制造的治疗性组合物。动物可以为雄性、雌性、怀孕的雌性和新生儿。该施用可以是通过不同途径，包括但不限于肌内(IM)、真皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或口服施用。根据本发明的治疗性组合物还可通过无针装置(例如，利用Pigjet、Dermojet、Biojector、Avijet(Merial,GA,USA)、Vetjet或Vitajet装置(Bioject,Oregon,USA))来施用。施用质粒组合物的另一个方法是使用电穿孔(参见，例如Tollefsen等人,2002；Tollefsen等人,2003；Babiuk等人,2002；PCT申请No.WO99/01158)。在另一个实施方案中，通过基因枪或金颗粒轰击将治疗性组合物递送至动物。在一个有利的实施方案中，动物是狗、白鼬或海豹。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的制剂的施用，以用于将狂犬病病毒抗原或表位递送入靶细胞并进行表达。治疗有效量的测定对于本领域普通技术人员来说是常规实验。在一个实施方案中，制剂包含含有表达狂犬病病毒抗原或表位的多核苷酸的表达载体，和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂有利于转染或感染和/或改善载体或蛋白质在宿主中的保留。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中引发或诱发抗狂犬病病毒的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包括重组狂犬病病毒G蛋白免疫组合物或疫苗以及用于进行递送(以用于引发动物的免疫反应的有效量)方法的说明书。
在一个实施方案中，本文中公开的主题涉及用于进行引发或诱发免疫反应的试剂盒，其可包括重组狂犬病病毒组合物或疫苗、灭活的狂犬病病毒组合物或疫苗、重组狂犬病病毒组合物或疫苗、或基于质粒的狂犬病病毒组合物或疫苗中的任一种和用于进行所述方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中诱发抗狂犬病的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包括含有本发明的狂犬病病毒多肽或抗原的组合物或疫苗和重组狂犬病病毒组合物或疫苗，以及用于进行递送(以用于引发动物中免疫反应的有效量)的方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中诱发抗狂犬病病毒的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包括含有本发明的重组狂犬病病毒载体的组合物或疫苗和灭活的狂犬病免疫组合物或疫苗，以及用于进行递送(以用于引发动物中免疫反应的有效量)的方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于在动物中诱导抗狂犬病的免疫或保护性反应的方法的试剂盒，其包括含有本发明的重组狂犬病病毒载体的组合物或疫苗和基于质粒的狂犬病组合物或疫苗，以及用于进行递送(以用于引发动物中免疫反应的有效量)的方法的说明书。
本发明的另一个方面涉及用于进行上述根据本发明的初免-加强接种的试剂盒。该试剂盒可包括至少2个小瓶：包含用于根据本发明的初免接种的疫苗或组合物的第一小瓶，和包含用于根据本发明的加强接种的疫苗或组合物的第二小瓶。试剂盒可有利地包含用于另外的初免接种或另外的加强接种的另外的第一或第二小瓶。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗有效量的制剂的施用，以将狂犬病病毒G多肽或抗原或表位递送入靶细胞并在所述细胞中表达。治疗有效量的测定对于本领域普通技术人员来说是常规实验。在一个实施方案中，制剂包含表达载体和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂，所述表达载体包含表达狂犬病病毒G多肽或抗原或表位的多核苷酸。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂促进转染或感染和/或改善载体或蛋白质的保留。
药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂对于本领域普通技术人员来说是公知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可为0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸缓冲液。可用于本发明的方法的其它药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂包括、但不限于聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物或赋形剂可以是有利于载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用的任何化合物或化合物组合；有利地，载体、媒介物或赋形剂可促进所述载体(或蛋白质)的转染和/或改善其保留。在本文中在一般性描述中论述了剂量和剂量体积，其还可由本领域普通技术人员通过结合本领域的知识阅读本公开内容来确定，无需任何过度实验。
有利地但非唯一地适用于质粒的包含季铵盐的阳离子脂质有利地是具有下式的脂质：
其中R1是具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂肪烃基，R2是包含2或3个碳原子的另一种脂肪烃基，X为胺基或羟基，例如DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可与中性脂质例如DOPE结合。
在这些阳离子脂质中，优选的是DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷基铵；WO96/34109)，其有利地与中性脂质，有利地DOPE(-二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr,1994)结合而形成DMRIE-DOPE。
当DOPE存在时，DMRIE:DOPE的摩尔比有利地为约95:约5至约5:约95，更有利地约1:约1，例如1:1。
在(1)型佐剂聚合物中，优选的是交联的，特别地通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物。这些化合物被命名为卡波姆(Pharmeuropa,第8卷,no.1996年6月2日)。本领域普通技术人员还可参考U.S.2,909,462，其提供了通过多羟基化合物交联的这样的丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个这样的基团，至少3个羟基中的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪烃基取代。优选的基团是包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和基团还可包含其它取代基，例如甲基。在名称卡波姆下销售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。其中，可提及的有卡波姆974P、934P和971P。
关于马来酸酐-烯基衍生物共聚物，优选的是EMA(Monsanto)，其为直链或交联的乙烯-马来酸酐共聚物，它们例如通过二乙烯醚交联。也参考J.Fields等人,1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单位形成：
其中：
-R1和R2可以相同或不同，代表H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，x+y＝2。
对于EMA，x＝0并且y＝2，对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)，并且可通过苏打(NaOH)将pH调整至7.3至7.4，以提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。最终的免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可为约0.01至约1.5％w/v,、约0.05至约1％w/v和约0.1至约0.4％w/v。
可用于本发明的其它细胞因子包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNγ)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。应理解，可将细胞因子与本发明的免疫或疫苗组合物共施用和/或相继施用。因此，例如，本发明的疫苗还可包含外源核酸分子，所述外源核酸分子在体内表达适当的细胞因子，例如与待接种的或将在其中引发免疫反应的该宿主匹配的细胞因子(例如，用于待给犬类施用的制剂的犬类细胞因子)的外源核酸分子。
现通过下列非限定性实例进一步描述本发明。
实施例1-表达4个拷贝的狂犬病病毒糖蛋白的重组vCP3006的构建
产生ALVAC重组病毒，在所述重组病毒中，合成的狂犬病病毒G蛋白基因已被插入在C5基因座(2个拷贝)中具有狂犬病病毒G蛋白的vCP65a的背景中的C3基因座(2个拷贝)。
概述。将合成的密码子最优化狂犬病病毒G蛋白(SEQ ID NO:1)插入亲代金丝雀痘病毒的C3基因座(ALVAC CP65a[如属于Virogenetics的US 5843456中详尽描述的]，具有6.1x10E7pfu/mL的滴度，重悬浮于1mL Tris pH9缓冲液中)。用于产生CP65a的亲代ALVAC于1996年11月14日在布达佩斯协议的条款下由ATCC以登录号VR-2547保藏。因此，预期本领域普通技术人员完全能够制备和使用US5843456的CP65a或其适当的/功能性替代物。密码子最优化狂犬病病毒G蛋白的蛋白质序列与GenBank ACR15154.1(SEQ ID NO:1)100％同一。供体质粒在C3基因座质粒中包含合成狂犬病病毒G蛋白基因(SEQ ID NO:5)和I3L启动子(SEQ ID NO:4)(p397-SynRabies G,图1)。供体质粒通过获取具有I3L-合成狂犬病病毒G蛋白PCR片段的～1.6kb XhoI-XmaI，将其克隆入pHM606.1(pC3)，从而产生p397-SynRabies G(pC3I3Lp Syn Rabies G，图1)来制备。在原代鸡胚成纤维细胞(1°CEF)中进行体外重组。
重组vCP3006的产生。为了起始体外重组(IVR)，首先使用试剂(Roche)，用20μg的Not I-消化的质粒p397-Syn Rabies G转染第一代1°CEF细胞。随后以10的MOI利用ALVAC CP65a原液感染转染的细胞。24hr后，收集转染的感染细胞，进行超声处理，随后用于重组病毒筛选。使用标记了North2South Biotin Random Prime Labeling试剂盒(Thermo Scientific#17075)以及利用North2South ChemiluminescentHybridization and Detection试剂盒(Thermo Scientific#17097)检测的140个碱基对(bp)的独特I3L探针(图&)，基于噬菌斑转印杂交法筛选重组噬菌斑。在连续5轮噬菌斑纯化后，产生命名为vCP3066.4.1.3.1.1.3的重组体。从第6轮噬菌斑纯化选择单个噬菌斑，将所述噬菌斑扩展至P1(1xT25)、P2(6孔板中1个孔)、P3(6孔板中的1个孔)、P4(1xT75培养瓶)和P5。从P5转瓶收集感染的细胞，将其浓缩以产生vCP3006原液。vCP3006产生的示意图示于图2中。
vCP3006的分析。使用合成狂犬病病毒G蛋白和用于杂交的C3位点探针对P5原液进行遗传纯度的验证。对于Southern印迹杂交，从vCP3006P5提取基因组DNA，利用Xba I、HindIII和BamHI消化，通过琼脂糖电泳进行分离。将消化的基因组DNA转移至尼龙膜，通过用合成狂犬病病毒G蛋白特异性探针探测将其经历Southern印迹分析。将引物RabG.1F(SEQ IDNO:52)和RabG.1R(SEQ ID NO:53)用于扩增合成的狂犬病病毒G蛋白特异性探针。
Western印迹。以4.5的MOI利用P5原液感染原代CEF细胞，将细胞在37℃温育24hr。为了比较G蛋白表达水平，还使用相同感染复数利用亲代vCP65a感染细胞。随后收集细胞和培养上清液。将样品蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分离，转移至PVDF膜。以1:500的稀释度用小鼠抗-狂犬病毒病毒G蛋白MAb(Chemicon#MAB8727)温育膜，随后用缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠抗体温育膜。
序列分析。通过C3基因座的侧翼臂和合成狂犬病病毒G蛋白插入物的PCR扩增和序列分析来进行P5原液基因组DNA的更详细分析。将位于ALVAC基因组的C3基因座的臂中的引物C3R.3F(SEQ ID NO:44)和C3L.1R(SEQ ID NO:47)用于扩增整个C3L-Syn Rabies G-C3R片段(SEQ ID NO:2)，随后使用图37中所示的引物对片段进行测序。
结果。通过杂交将vCP3006的P5原液的同质性确认为对于合成狂犬病病毒G蛋白是100％阳性的并且对于C3位点是100％阴性的。vCP3006病毒P5原液的滴度为1.88x109pfu/ml。重组vCP3006的基因组完整性也在于凝胶电泳中分离限制性内切酶消化的基因组DNA后，通过Southern印迹分析来验证(图3)。使用合成狂犬病病毒G蛋白特异性探针的Southern印迹分析显示具有预期尺寸(14322bp和5248bp BamHI,17367bp HindIII和6293bp XbaI；图4)的条带，从而证明了合成狂犬病病毒G蛋白至C3基因座的正确插入。泳道5上的两个条带(图4)还确认了合成狂犬病病毒G蛋白至C3的两个位点的插入(14322bp，对于左C3位点；和5248bp，对于右C3位点)。
对于狂犬病病毒G蛋白的表达分析，以4.5的MOI利用vCP3006或vCP65a的P5原液感染原代CEF细胞。处理上清液以及感染的细胞样品，将其经历Western印迹分析。如图5中所示，可在感染的细胞沉淀中、但不在上清液样品中检测到狂犬病病毒G蛋白，表明G蛋白未以可检测的水平掺入ALVAC病毒体(图5左)。由于抗狂犬病病毒单克隆识别vCP3006中的经典G蛋白和另外的密码子最优化G蛋白，因此尝试比较vCP65a表达的G蛋白的量与vCP3006表达的G蛋白的量。为此目的，以相似的MOI感染细胞，将不同量的总细胞裂解物经历Western印迹分析(图5，右)。通过比较用2μl的细胞裂解物上样的相应泳道，来自vCP3006的G蛋白条带似乎比vCP65a的相应泳道更丰富。这表明，vCP3006比vCP65a表达更多的G蛋白。使用图6中显示的引物(其完全描述示于图37中)对覆盖C3基因座的侧翼臂和合成的狂犬病病毒G蛋白插入物的PCR产物进行测序。序列分析显示合成的狂犬病病毒G蛋白以及C3L及C3R区域的序列是如所预期的(图7)，并且整个C3L至C3R片段具有SEQ ID NO:2中所示的序列。预测的合成狂犬病病毒G肽序列示于图8(SEQ ID NO:1)中，并且与野生型狂犬病病毒G肽序列相同。
实施例2-共表达狂犬病病毒糖蛋白和OX40L的重组vCP3015的构建
概述。ALVAC重组体的产生和表征，其中犬类OX40配体(cOX40L)已被插入在C5基因座(2个拷贝)中具有经典狂犬病病毒G蛋白的vCP65a背景中的C6基因座(1个拷贝)。将密码子最优化的合成犬类OX40配体(cOX40L，肿瘤坏死因子配体超家族成员4-样)插入亲代病毒ALVAC CP65a(滴度6.1x10e7pfu/mL，重悬浮于1mL Tris pH9缓冲液中)的C6基因座。供体质粒为p397-cOX40L(pC6 42Kp cOX40L)(C6基因座中的具有42K启动子的合成cOX40L)，通过获得具有42K启动子的～0.6kb EcoRI–XmaI合成犬类OX40L片段，将其克隆入pC6L来产生所述质粒(图9)。按照实施例1中公开的方法，在原代1°CEF细胞中进行体外重组。基本上如实施例1中所述，使用551bp cOX40L特异性探针进行重组噬菌斑的筛选。在连续4轮噬菌斑纯化后，产生命名为vCP3015.9.2.1.2的重组体。从第4轮噬菌斑纯化选择单个噬菌斑，将其扩展以获得vCP3015.9.2.1.2的P1(T-25培养瓶)、P2(T-75培养瓶)和P3(4个转瓶)。收集P3，将感染的CEF沉淀，除去上清液。将感染的CEF重悬浮于1mM Tris,pH9.0中，进行超声处理，随后浓缩以产生vCP3015的病毒原液。vCP3015产生的示意图示于图10中。
vCP3015的分析。从vCP3015的P3提取基因组DNA，用NruI进行消化，随后以一式二份在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。将NruI消化的基因组DNA转移至尼龙膜，基本上如实施例1中所述，通过用cOX40L或经典狂犬病病毒G蛋白探针进行探测来进行Southern印迹分析。将PCR引物OX40L.1F(SEQ ID NO:61)和OX40L.1R(SEQ ID NO:62)用于扩增cOX40L探针，将引物CP65.2R(SEQ ID NO:39)和C5R.3F(SEQ ID NO:30)用于扩增经典狂犬病病毒G蛋白探针。
Western印迹。用vCP3015的P3原液以为10的MOI感染原代CEF细胞，将细胞在37℃温育26小时。随后收集细胞和培养上清液。将样品蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上进行分离，转移至PVDF膜，以1:500的稀释度用单克隆抗狂犬病病毒G蛋白抗体(Chemicon#MAB8727)进行探测，随后用缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠抗体进行探测。
序列分析。对于C5位点上的经典狂犬病病毒G蛋白，通过对包含经典狂犬病病毒G蛋白插入物的C5基因座进行PCR扩增和序列分析进行P3原液基因组DNA的详细分析。将位于C5基因座的臂的末端的引物7635CXL.R(SEQ ID NO:35)和7635CXL.F(SEQ ID NO:36)用于扩增整个C5R-Rabies G-C5L片段。随后使用图37中所列的引物对片段进行测序。对于C6上的cOX40L，通过对包含cOX40L插入物的C6基因座进行PCR扩增和序列分析来进行P3原液基因组DNA的详尽分析。将位于C6基因座的臂的末端的引物C6R.1F(SEQ ID NO:57)和C6L.1R(SEQ ID NO:60)用于扩增整个C6R-cOX40L-C6L片段。使用图37中所列的引物对片段进行测序。
结果。通过杂交将vCP3015的P3原液的同质性确认为对于cOX40L是100％阳性的并且对于空C6位点是100％阴性的。vCP3015病毒P3原液的滴度为8.5x10^9pfu/ml。重组vCP3015的基因组完整性通过Southern印迹分析来验证。对于cOX40L，该探针检测到151,858bp片段(图11)，对于经典狂犬病病毒G蛋白，该探针检测到72,175bp片段(对于左C5位点)、23,014bp片段(对于右C5位点)和806bp(对于两个C5位点)(图12)。
为了进行经典狂犬病病毒G蛋白的表达分析，以为10的MOI用vCP3015的P3原液感染原代CEF细胞。处理上清液以及感染的细胞样品，将其经历Western印迹分析。如图13中所示，可在感染的细胞沉淀中、但不在上清液样品中以预期的尺寸检测到狂犬病病毒G蛋白。使用图14中显示的引物对覆盖C6基因座的侧翼臂和cOX40L插入物的PCR产物进行测序。序列分析显示cOX40L以及C6L和C6R区域的序列是如所预期的(图15)。使用图17中显示的引物对覆盖C5基因座的臂和经典狂犬病病毒G蛋白插入物的PCR产物进行测序。所得的序列示于图18中(SEQ ID NO:13)。
实施例3-共表达经典狂犬病病毒G蛋白、密码子最优化狂犬病病毒G蛋白和OX40L 的重组vCP3012的构建
概述。产生和表征其中已将犬OX40配体(cOX40L)插入在C5基因座(2个拷贝)具有经典狂犬病病毒G蛋白和在C3基因座(2个拷贝)中具有密码子最优化经典狂犬病病毒G蛋白的vCP3006背景中的C6基因座(1个拷贝)的ALVAC重组体。将密码子最优化合成犬OX40L序列(由42K启动子引导的)插入亲代病毒ALVAC vCP3006P5(原液滴度为1.88x109pfu/ml)的C6基因座。供体质粒397-cOX40L(pC642Kp cOX40L)与图9中实施例2中使用的供体质粒相同，对于体外重组法亦如此。
基本上如实施例1中所述，使用551bp cOX40L特异性探针进行重组噬菌斑的筛选。在连续4轮噬菌斑纯化后，产生命名为vCP3012.9.2.1.3的重组体。从最后一轮噬菌斑纯化选择单个噬菌斑，将其扩增以获得P1(6孔板)、P2(T-75培养瓶)和P3(转瓶)原液来扩增vCP3012.9.2.1.3。从转瓶收集感染的细胞以及培养上清液，将其沉淀。在除去上清液后，超声处理沉淀，将其浓缩以产生vCP3012病毒原液。
vCP3012的分析。从vCP3012(P3)提取基因组DNA，利用PmeI、NruI和BamHI消化，随后通过琼脂糖电泳分离。将消化的基因组DNA转移至尼龙膜，基本上如实施例1中所述，通过用cOX40L、合成狂犬病病毒G蛋白和经典狂犬病病毒G蛋白探针探测来进行Southern印迹分析。将PCR引物OX40L.1F(SEQ ID NO:61)和OX40L.1R(SEQ ID NO:62)用于扩增cOX40L探针，将引物CP65.2R(SEQ ID NO:39)和C5R.3F(SEQ ID NO:30)用于扩增经典狂犬病病毒G蛋白探针，将引物RabG.1R(SEQ ID NO:53)和RabG.1F(SEQ ID NO:52)用于扩增合成狂犬病病毒。
Western印迹。利用vCP3012的P3原液以为10的MOI感染原代CEF细胞，将其在37℃温育24小时。随后收集细胞和培养上清液。在10％SDS-PAGE凝胶上分离样品蛋白质，将其转移至PVDF膜。以1:500的稀释度用单克隆抗狂犬病病毒G蛋白抗体(Chemicon#MAB8727)温育膜，随后用缀合有碱性磷酸酶的抗小鼠抗体温育膜。
序列分析。对于C6位点上的cOX40L，通过对包含cOX40L插入物的C6基因座进行PCR扩增和序列分析进行P3原液基因组DNA的分析。将位于C6基因座的臂的末端的引物C6R.1F(SEQ ID NO:57)和C6L.1R(SEQ ID NO:60)用于扩增整个C6R-cOX40L-C6L片段。随后使用图37中所列的引物对片段进行测序。对于C3上的合成狂犬病病毒G蛋白，通过对包含合成狂犬病病毒G蛋白插入物的C3基因座的侧翼臂进行PCR扩增和序列分析来进行P3原液基因组DNA的分析。将位于C3基因座的臂的引物C3R.2F(SEQ ID NO:43)和C3L.1R(SEQ ID NO:47)用于扩增整个C3R-合成狂犬病病毒G蛋白插入物-C3L片段。对于C5上的经典狂犬病病毒G蛋白，通过对包含合成狂犬病病毒G蛋白插入物的C5基因座进行PCR扩增和序列分析来进行P3原液基因组DNA的分析。将位于C5基因座的臂末端的引物7635CXL.R(SEQ ID NO:35)和7635CXL.F(SEQ ID NO:36)用于扩增整个C5R-经典狂犬病病毒G蛋白-C5L片段。使用图37中所列引物对片段进行测序。
结果。通过杂交将vCP3012的P3原液的同质性确认为对于cOX40L是100％阳性的并且对于空C6位点是100％阴性的。vCP3012病毒的P3原液的滴度为4x10^9pfu/ml。重组vCP3012的基因组完整性通过Southern印迹分析来验证。对于cOX40L，该探针检测到200.362bp片段(图21)；对于合成狂犬病病毒G蛋白，检测到14322bp(对于左C3位点)和5248bp(对于右C3位点)(图22)；对于经典狂犬病病毒G蛋白，检测到806bp(对于两位点)，72436bp(对于左C5位点)和23,275bp(对于右C5位点)(图23)。这些预期的尺寸表明cOX40L在C6基因座上、合成狂犬病病毒G蛋白在C3基因座上以及经典狂犬病病毒G蛋白在C5基因座上的正确插入。
为了进行经典以及合成狂犬病病毒G蛋白的表达分析，以为10的MOI用vCP3012的P3原液感染原代CEF细胞。处理上清液以及感染的细胞样品，将其经历Western印迹分析。如图24中所示，可在感染的细胞沉淀中在预期的尺寸上检测到狂犬病病毒G蛋白。
使用图25中显示的引物对覆盖C6基因座的侧翼臂和cOX40L插入物的PCR引物进行测序。序列分析显示cOX40L以及C6L和C6R区域的序列是如所预期的(图26)。使用图27中所示的引物对覆盖C3基因座的侧翼臂和合成狂犬病病毒G蛋白插入物的PCR产物进行测序。所得序列示于图28(SEQ ID NO:20)中。结果显示vCP3012中合成狂犬病病毒G蛋白插入物以及围绕合成狂犬病病毒G蛋白插入物的C3左右臂的序列是如预期的。使用图29中所示的引物对覆盖C5基因座的侧翼臂和经典狂犬病病毒G蛋白插入物的PCR产物进行测序。所得序列示于图30(SEQ ID NO:23)中。结果显示vCP3012的经典狂犬病病毒G蛋白插入物和围绕经典狂犬病病毒G蛋白插入物的C5左右臂的序列是如预期的。
实施例4-通过狗的接种和血清学进行3种新型重组金丝雀痘疫苗相较于vCP65A的 效力评价
为了进行该研究，将所有狗随机分配至5个不同的处理组(每组6条狗)，以窝ID作为因子。将来自不同疫苗组的狗随机分配至畜舍，将疫苗组混合在相同畜舍内。将狗分配至按性别隔离的畜舍。在攻击前时期中将对照组中的狗关养在与接种组不同的畜舍中。软件V9.1Enterprise Guide用于产生随机化表。在第0天利用候选疫苗接种狗(表1)。在第0、7、14、21、28、48、70和90天获取血液样品，通过RFFIT测定狂犬病病毒抗体滴度。
表1.处理组
对于每一个组(A、B、C和D)和天数计算几何平均RFFIT滴度和95％的置信区间。抗体峰值在第21天出现。结果示于表2中。在第14天，vCP3012接种组具有比所有其它组显著更高的滴度。在第21天，利用含cOX40L的金丝雀痘病毒载体接种的两个组都具有比其它接种组更大的中和反应。因此，在利用表达cOX40L的载体接种的组中明确地看到免疫的更早起始和更高的峰值滴度。在第21天后直至研究结束时，vCP3012接种组维持比所有其它组明显更高的滴度。在第90天，所有利用vCP3012接种的狗具有大于0.5IU/ml(在狂犬病病毒强毒攻击实验中通常被认为具有保护性的滴度)的滴度。因此，cOX40L表达延长了有金丝雀痘病毒载体的狂犬病疫苗的免疫力的持续时间。
结论。与亲代vCP65a相比较，cOX40L向vCP65a或vCP3006的骨架中的添加明确地增强了抗狂犬病免疫力的起始，如通过抗狂犬病中和抗体测量的；增加峰值抗狂犬病中和抗体滴度以及延长抗狂犬病免疫力的持续时间至少90天(血液取样的最后日期)。
表2:几何平均滴度和95％的置信区间
实施例5-通过狗中的强毒攻击进行3种新型重组金丝雀痘病毒疫苗的免疫原性评 价
三十条(30)2至3月龄的有目的繁殖的比格犬随机分配入5个处理组之一(n＝6)，使用窝ID作为主要随机化因子。在第0天，按照下表3接种所有狗。
表3.接种方案
*疫苗靶滴度105.9TCID50/ml.
接种后监控动物的实际全身性反应，进行1小时。检查注射部位，此后每日记录直肠温度，进行3天。在接种之前和在接种后定期收集血液以测定抗狂犬病病毒抗体滴度，如通过快速荧光斑点抑制实验(RFFIT)测量的。基于有利的血清学反应，在接种后约1年(第397天)将来自组C(vCP3015)的狗经历强毒狂犬病病毒攻击。在麻醉的情况下，通过肌内途径将攻击材料(纽约株142.90，以1:100的稀释度)施用入左额肌和右额肌(0.5ml，至每一个肌肉内)。按照QCD-CM-030进行攻击材料的反向滴定。攻击后，观察狗的死亡率或进行性神经学体征迹象，进行30天。在无痛致死后立即从所有狗获得血清以用于RFFIT测试。在尸检时收集两个脑半球，提交右半球用于通过直接免疫荧光检测狂犬病病毒。
使用SAS、Cary、NC(SAS9.1版,Enterprise Guide)进行所有统计分析。所有测试是双向的，P值为0.05或更小时宣布统计学显著性。主要变量为血清狂犬病病毒抗体滴度，如通过快速荧光斑点抑制实验(RFFIT)测量的。血清转化被定义为从阴性抗体滴度(在检测阈值下，即≤0.2IU/ml)至阳性狂犬病病毒抗体滴度(>0.2IU/ml)的变化。在接种之前，除组A(vCP3006)中的一条狗呈现0.3IU/ml的低狂犬病病毒滴度和在重新测试时为0.5IU/ml的值外，所有狗对于狂犬病病毒是血清阴性的。来自组E(阴性对照组)的3条狗在研究开始的30天内显示低抗体滴度。到第48天，组E中的所有狗是血清阴性的，并且在整个研究过程中保持阴性。低狂犬病病毒滴度几乎肯定归因于残留的母体抗体。组A、B、C和D中接种后的组几何平均RFFIT抗体滴度示于表4中。
表4.接种后每组的血清狂犬病病毒抗体几何平均滴度(IU/ml)
*GMT显著(p<0.05)不同于参照疫苗(组D vCP65A)
接种后7天，对于组B(vCP3012)中的所有狗和组A(vCP3006)、C(vCP3015)和D(vCP65A)内6条狗中的5条观察到血清转化。从第14天至第90天，利用vCP3012接种的狗相较于组A(vCP3006)和参照疫苗组D(vCP65A)显示预料之外的显著更高的狂犬病病毒滴度。在第21、48、70和90天，组C(vCP3015)的狂犬病病毒GMT显著高于参照疫苗组D(vCP65A)。除第90天外，利用vCP3006接种的狗相较于参照疫苗组D(vCP65A)未显示显著的狂犬病病毒滴度差异。
接种后约1年，将组C(vCP3015)的狗经历强毒狂犬病病毒攻击。来自组B和E的剩余的狗保持在当前研究下直至在更晚日期研究结束。施用的攻击病毒的计算50％小鼠致死剂量(MLD50)为0.03ml中2.2log10(158.5MLD50)。当给每条狗施用1ml时，狗剂量为3.96log10MLD50。攻击前和攻击后RFFIT滴度以及攻击后狂犬病病毒荧光抗体结果和发病/死亡数据示于下面的表5中。
表5.概括结果
*在攻击后第30天之前被无痛致死的所有狗显示狂犬病病毒感染的临床体征。
**CBCCTX、CBDCCE和CBDCCY攻击前日子为第752天。
组C的狗直至攻击后30天都未显示任何临床异常。阴性对照组中的所有狗都产生了与第12天和第17天之间的犬狂犬病病毒感染一致的临床体征，例如行为的变化、昏睡、流涎、颜面肌肉抽动、吞咽困难和肢体麻痹。直至攻击后17天被无痛致死的所有狗对于狂犬病病毒荧光抗体测试是阳性的，在研究结束时被无痛致死的其余狗在脑组织中对于狂犬病病毒荧光抗体测试是阴性的。此外，在接种后未观察到局部注射部位反应(弥漫性脓肿、硬块肿胀(firm swelling)、触诊时疼痛或瘙痒)也未观察到直肠温度的临床上显著升高。
讨论。基于接种前滴度结果，将每一个测试疫苗的终体积调整至达到约105.9TCID50/ml的靶滴度。因此，对于相较于其它测试疫苗具有更高的接种前滴度的vCP3012(组B)，在接种时施用更小的体积。在接种后1或2年经历狂犬病病毒攻击的动物受试者的选择基于在3个月的时期内相较于参照疫苗(组D vCP65A)的狂犬病病毒几何平均血清学滴度。组A(vCP3006)不满足攻击标准，从而在第151天从研究中释放该组内的狗。组B和C明显满足攻击标准。对于vCP3015和vCP3012分别选择持续1年和2年免疫力评价。选择哪个测试疫苗来首先评价基于的是血清学结果和具有最少数目的狂犬病病毒G蛋白基因拷贝的构建体。由于vCP3015构建体包含2个拷贝，vCP3012包含4个拷贝，因此选择vCP3015来首先进行评价。在利用vCP3012接种的狗中进行持续2年的免疫力评价，将其与参照组(vCP65A)相比较。
这些结果显示当通过皮下途径在狗中施用一次时，vCP构建体是安全的。利用单次剂量的105.87TCID50/ml的含有2个拷贝的狂犬病病毒G蛋白基因和免疫调节剂OX40L的构建体(vCP3015)通过皮下途径接种的狗在接种后1年被保护免受强毒狂犬病病毒攻击。vCP3012(包含4个拷贝的狂犬病病毒G蛋白基因和OX40L)相较于所有其vCP构建体诱导更早和更强的狂犬病病毒抗体反应，并且可在接种后2年通过狂犬病病毒攻击来进行评价。
实施例6–其它有效抗原/OX40L组合
本发明人预想抗原与OX40L的许多其它组合将导致相较于仅单独表达相同抗原的痘病毒具有增强的功效的痘病毒载体疫苗。表3提供了抗原与OX40L组合的非限定性列表，其中OX40L基于其可能在靶动物中用作有效基因佐剂的能力来进行选择。图38提供了来自多种不同物种的已知/假定的OX40L的比对。本领域普通技术人员将理解，OX40L蛋白还可在单个动物属或种(例如家犬)内发生少许变化。因此，与SEQ ID NO:12具有充分同源性的OX40L蛋白也应当能够在犬中充当有效的基因佐剂，并且被本发明包括在内。此外，本发明人预想相似的结果可能使用其它载体(包括病毒载体)在动物宿主中体内表达编码抗原和佐剂性OX40L的基因能够实现。例如，病毒载体包括但不限于：DNA病毒、RNA病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺样病毒、白血病病毒、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、立克氏病病毒(MDV、SB1和HVT)等。
表3–被预想可充当有基因佐剂的有效疫苗组合物的抗原与OX40L的组合
下列带编号的段落提供了非限性实施方案。
1.一种组合物，其包含：
a)包含编码如下两者的多核苷酸的表达载体：
i.选自下述的一种或多种多肽：狂犬病病毒G蛋白、流感病毒、FMDV、BTV、PCV2、PRRSV、WNV、尼帕病毒、白血病病毒、利什曼原虫病毒、FIV、FIPV、FCV、AHSV、VSV及其在免疫原性上有效的变体或片段；和
ii.OX40L多肽或其具有可比较的佐剂性的变体或片段；和
b)药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
2.段落1的组合物，其中所述载体包含编码来自靶动物(即将对其施用所述组合物的动物的类型)的OX40L多肽的多核苷酸。
3.段落2的组合物，其中所述OX40L多肽与SEQ ID NO:12(对于犬科动物靶)、SEQID NO:63(对于猫科动物靶)、SEQ ID NO:64(对于马科动物靶)、SEQ ID NO:65(对于牛靶)或SEQ ID NO:66(对于猪靶)、SEQ ID NO:70(对于禽类靶)、SEQ ID NO:71(对于绵羊靶)或SEQ ID NO:67(对于灵长类动物靶)中所示的序列具有至少90％的同一性。
4.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为狂犬病病毒G多肽，并且所述靶动物为犬科动物或猫科动物。
5.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为BTV多肽，并且所述靶动物为牛或绵羊。
6.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为FMDV多肽，并且所述靶动物为牛或猪。
7.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为PRRSV多肽，并且所述靶动物为猪。
8.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为PCV2多肽，并且所述靶动物为猪。
9.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为白血病病毒多肽，并且所述靶动物为猫科动物。
10.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为流感病毒多肽，并且所述靶动物为马科动物、犬科动物或猫科动物。
11.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽为WNV多肽，并且所述靶动物为犬科动物或马科动物。
12.段落3的组合物，其中所述一种或多种多肽能够引发禽类动物的免疫反应。.
13.段落12的组合物，其中所述多肽来自NDV、MDV、IBD或IBDV。
14.段落1-4的任一项的组合物，其中所述表达载体为MDV、NDV、IBD、IBDV、原病毒、腺样病毒或疱疹病毒。
15.段落4的组合物，其中所述狂犬病病毒G多肽由SEQ ID NO:5中所示的序列编码。
16.段落4的组合物，其中所述OX40L多肽与SEQ ID NO:12中所示的序列具有至少90％的同一性。
17.段落13的组合物，其中所述OX40L多肽具有SEQ ID NO:12中所示的序列。
18.段落1-4中任一项的组合物，其中所述表达载体为重组痘病毒载体。
19.段落15的组合物，其中所述载体为金丝雀痘病毒。
20.段落16的组合物，其中所述载体包含SEQ ID NO:23中所示的序列。
21.一种载体，其包含编码如下两者的多核苷酸：
(a)选自下述的一种或多种多肽：狂犬病病毒G蛋白、流感病毒、FMDV、BTV、PCV2、PRRSV、WNV、尼帕病毒、白血病病毒、利什曼原虫病毒、FIV、FIPV、FCV、AHSV、VSV及其在免疫原性上有效的变体或片段；和
(b)OX40L多肽或其具有可比较的佐剂性的变体或片段。
22.段落21的载体，其中所述OX40L多肽与SEQ ID NO:12(对于犬科动物靶)、SEQID NO:63(对于猫科动物靶)、SEQ ID NO:64(对于马科动物靶)、SEQ ID NO:65(对于牛靶)、SEQ ID NO:66(对于猪靶)或SEQ ID NO:71(对于绵羊靶)中所示的序列具有至少90％的同一性。
23.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为狂犬病病毒G多肽，并且所述靶动物为为犬科动物或猫科动物。
24.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为BTV多肽，并且所述靶动物为牛或绵羊。
25.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为FMDV多肽，并且所述靶动物为牛或猪。
26.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为PRRSV多肽，并且所述靶动物为猪。
27.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为PCV2多肽，并且所述靶动物为猪。
28.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为白血病病毒多肽，并且所述靶动物为猫科动物。
29.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为流感病毒多肽，并且所述靶动物为马科动物、犬科动物或猫科动物。
30.段落22的载体，其中所述一种或多种多肽为WNV多肽，并且所述靶动物为犬科动物或马科动物。
31.段落23的载体，其中所述狂犬病病毒G多肽由SEQ ID NO:5中所示的序列编码。
32.段落22的载体，其中所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO:1中所示序列的狂犬病病毒G多肽和与SEQ ID NO:12中所示序列具有至少90％的同一性的OX40L多肽。
33.段落21的载体，其中所述载体为痘病毒。
34.一种接种动物的方法，包括施用至少一个剂量的段落1-14中任一项的组合物。
* * * * * * * *
在已这样详尽地描述本发明的优选实施方案后，应理解通过上述段落定义的本发明不限定于上述描述中所示的具体细节，因为其许多明显变型是可能的，并且不背离本发明的精神或范围。

Claims (15)

1.一种疫苗组合物，其包含以下a)和b)、基本上由以下a)和b)组成、或者由以下a)和b)组成：
a)重组痘病毒载体，其包含四个狂犬病病毒G蛋白基因以及一个犬类OX40L基因，上述基因各自在需要其的动物中体内表达；和
b)药学上或兽医学上可接受的赋形剂；
其中所述狂犬病病毒G蛋白基因中的两个是经典的基因，且所述狂犬病病毒G蛋白基因中的两个是经密码子优化的基因，并且
其中所述经典的和经密码子优化的狂犬病病毒G蛋白基因均编码由SEQ ID NO:1中所示的序列组成的狂犬病病毒G多肽。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中所述动物为犬科动物。
3.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述经密码子优化的狂犬病病毒G蛋白基因中的至少一个由SEQ ID NO:5中所示的序列组成。
4.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述OX40L基因编码SEQ ID NO:12中所示的OX40L多肽。
5.权利要求1或2的疫苗组合物，其中所述重组痘病毒载体为金丝雀痘病毒。
6.权利要求5的疫苗组合物，其中所述载体为金丝雀痘病毒ALVAC。
7.权利要求6的疫苗组合物，其中所述载体包含SEQ ID NO:23中所示的序列。
8.一种重组痘病毒载体，其包含编码如下两者的多核苷酸：
(a)四个拷贝的狂犬病病毒G多肽；和
(b)犬类OX40L多肽，
其中所述狂犬病病毒G多肽中的两个由经典的狂犬病病毒G蛋白基因编码，且所述狂犬病病毒G多肽中的两个由经密码子优化的狂犬病病毒G蛋白基因编码，并且
其中所述经典的和经密码子优化的狂犬病病毒G蛋白基因均编码由SEQ ID NO:1中所示的序列组成的狂犬病病毒G多肽。
9.权利要求8的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:20中所示的序列。
10.权利要求8的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:7中所示的序列。
11.权利要求8的载体，其中所述多核苷酸包含两个拷贝的由SEQ ID NO:5中所示的序列组成的狂犬病病毒G蛋白基因以及两个拷贝的由SEQ ID NO:16中所示的序列组成的狂犬病病毒G蛋白基因。
12.权利要求1-7中任一项的疫苗组合物在制备用于在接种动物的方法中使用的疫苗之中的用途，其中所述方法包括施用至少一个剂量的权利要求1-7中任一项的疫苗组合物。
13.权利要求12的用途，其中向动物施用仅一个剂量的所述组合物。
14.权利要求12或13的用途，其中所述动物为犬类动物或猫类动物。
15.权利要求14的用途，其中所述动物为狗。
CN201380015514.8A 2012-02-14 2013-02-14 表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗 Expired - Fee Related CN104203271B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261598610P 2012-02-14 2012-02-14
US61/598,610 2012-02-14
PCT/US2013/026206 WO2013123242A1 (en) 2012-02-14 2013-02-14 Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and ox40 proteins, and vaccines made therefrom

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104203271A CN104203271A (zh) 2014-12-10
CN104203271B true CN104203271B (zh) 2017-08-25

Family

ID=47757705

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380015514.8A Expired - Fee Related CN104203271B (zh) 2012-02-14 2013-02-14 表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗

Country Status (13)

Country Link
US (2) US9567606B2 (zh)
EP (2) EP3466443B1 (zh)
JP (1) JP6260972B2 (zh)
CN (1) CN104203271B (zh)
AU (1) AU2013221502C1 (zh)
BR (1) BR112014020019A8 (zh)
CA (1) CA2864119C (zh)
EA (1) EA032389B1 (zh)
ES (2) ES2866108T3 (zh)
HK (1) HK1200327A1 (zh)
MX (1) MX360415B (zh)
NZ (2) NZ722700A (zh)
WO (1) WO2013123242A1 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10131921B2 (en) 2008-03-06 2018-11-20 Mayo Foundation For Medical Education And Research Single cycle replicating adenovirus vectors
US9567606B2 (en) * 2012-02-14 2017-02-14 Merial Inc. Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and OX40 proteins, and vaccines made therefrom
CA2897858A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of the pd-1 pathway
US10196435B2 (en) * 2013-11-18 2019-02-05 University Of Southern California OX40L fusion protein for the immunotherapy of tumors of veterinary animals
CA2930042C (en) * 2013-12-20 2022-06-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prrs virus variant, european prrs virus cdna clone, and uses thereof
CN103877570B (zh) * 2014-02-19 2016-01-20 北京中联康生物科技有限公司 狂犬病活疫苗和制备狂犬病口服活疫苗的方法
WO2015135558A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Curevac Gmbh Combination of vaccination and ox40 agonists
CA2966191A1 (en) * 2014-11-03 2016-05-12 Merial, Inc. Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus
ES2845727T3 (es) * 2015-02-06 2021-07-27 Heat Biologics Inc Vector que coexpresa una vacuna y moléculas coestimuladoras
CN109476718B (zh) 2016-05-18 2023-07-04 莫得纳特斯公司 编码免疫调节多肽的mrna的组合及其用途
CA3040123A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 University Of Miami Vectors and vaccine cells for immunity against zika virus
US11548930B2 (en) 2017-04-04 2023-01-10 Heat Biologics, Inc. Intratumoral vaccination
AU2019223768A1 (en) 2018-02-23 2020-08-27 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
CN111518776A (zh) * 2020-04-16 2020-08-11 大理大学 一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法
GB202012331D0 (en) * 2020-08-07 2020-09-23 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
US11149286B1 (en) * 2020-08-17 2021-10-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Adenovirus vectors and methods for using adenovirus vectors
WO2023152486A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Petmedix Ltd Therapeutic antibodies
CN116656730B (zh) * 2023-05-25 2024-03-19 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 一种表达狂犬病病毒g、m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309647B1 (en) * 1999-07-15 2001-10-30 Aventis Pasteur Poxvirus—canine dispemper virus (CDV) or measles virus recombinants and compositions and methods employing the recombinants
CN101884793A (zh) * 2010-06-29 2010-11-17 中国人民解放军第三军医大学 乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
CA1247080A (en) 1983-03-08 1988-12-20 Commonwealth Serum Laboratories Commission Antigenically active amino acid sequences
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5756102A (en) 1990-11-20 1998-05-26 Virogenetics Corporation Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods employing the recombinants
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
KR100242671B1 (ko) * 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
FR2724385B1 (fr) 1994-08-29 1996-12-13 Rhone Merieux Vaccin de la peritonite infectieuse feline.
JPH11504631A (ja) 1995-04-25 1999-04-27 バイカル インコーポレイテッド Ｄｎａ／脂質複合体の単一バイアル製剤
US5846946A (en) 1996-06-14 1998-12-08 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Compositions and methods for administering Borrelia DNA
FR2751228B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Vaccin polynucleotidique bovin pour voie intradermique
FR2751225B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
FR2751224B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
FR2751227B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives
FR2751226B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval
FR2751229B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins
WO2002036170A2 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system for transducing the positive neurons
IL133710A0 (en) 1997-06-30 2001-04-30 Rhone Poulence Rorer S A Improved method for transferring nucleic acid into the striped muscle and combination thereof
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6541458B1 (en) 1999-07-16 2003-04-01 Merial Feline calicivirus genes and vaccines in particular recombinant vaccines
US6852705B2 (en) 2000-01-21 2005-02-08 Merial DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines
US7740863B2 (en) 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
CA2570156C (en) 2004-06-04 2014-09-30 Merial Limited Needle-free administration of felv vaccines
BRPI0512421B8 (pt) 2004-06-25 2022-06-28 Merial Ltd Recombinantes de avipox expressando genes do vírus da doença febre aftosa
US8980280B2 (en) 2005-03-30 2015-03-17 Merial, Inc. Recombinant feline leukemia virus vaccine containing optimized feline leukemia virus envelope gene
WO2006115843A2 (en) 2005-04-25 2006-11-02 Merial Limited Nipah virus vaccines
US7384642B2 (en) 2005-08-25 2008-06-10 Merial Limited Canine influenza vaccines
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
US8008268B2 (en) 2006-07-25 2011-08-30 Merial Limited Vaccines against vesicular stomatitis
US7910112B2 (en) 2006-11-06 2011-03-22 Merial Limited Feline vaccines against avian influenza
WO2008064181A2 (en) 2006-11-21 2008-05-29 Merial Limited Prime boost canine leishmania vaccine
US8168200B2 (en) 2008-10-24 2012-05-01 Merial Limited Vaccine against african horse sickness virus
US9567606B2 (en) 2012-02-14 2017-02-14 Merial Inc. Recombinant poxviral vectors expressing both rabies and OX40 proteins, and vaccines made therefrom

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309647B1 (en) * 1999-07-15 2001-10-30 Aventis Pasteur Poxvirus—canine dispemper virus (CDV) or measles virus recombinants and compositions and methods employing the recombinants
CN101884793A (zh) * 2010-06-29 2010-11-17 中国人民解放军第三军医大学 乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2814506A1 (en) 2014-12-24
EA201400912A1 (ru) 2015-01-30
US20130209511A1 (en) 2013-08-15
CA2864119C (en) 2022-05-24
MX2014009845A (es) 2015-03-10
EA032389B1 (ru) 2019-05-31
ES2866108T3 (es) 2021-10-19
BR112014020019A2 (pt) 2017-07-04
BR112014020019A8 (pt) 2022-07-12
US10006050B2 (en) 2018-06-26
HK1200327A1 (zh) 2015-08-07
AU2013221502C1 (en) 2018-03-01
WO2013123242A1 (en) 2013-08-22
AU2013221502B2 (en) 2017-10-26
CN104203271A (zh) 2014-12-10
JP6260972B2 (ja) 2018-01-17
CA2864119A1 (en) 2013-08-22
AU2013221502A1 (en) 2014-08-28
NZ722700A (en) 2017-12-22
ES2723273T3 (es) 2019-08-23
EP3466443B1 (en) 2020-12-16
US9567606B2 (en) 2017-02-14
EP3466443A1 (en) 2019-04-10
MX360415B (es) 2018-10-31
US20170137843A1 (en) 2017-05-18
NZ628270A (en) 2016-09-30
EP2814506B1 (en) 2018-11-28
JP2015511948A (ja) 2015-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104203271B (zh) 表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗
CN102428099B (zh) 运载新城疫病毒的禽疫苗
US9446118B2 (en) Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines
CN107073100A (zh) Fmdv重组疫苗及其用途
CN102971010A (zh) 重组cdv组合物和其使用
KR102136437B1 (ko) 재조합체 ｂｔｖ 및 ａｈｓｖ 백신
US20170087244A1 (en) Canine Parvovirus (CPV) Virus-like Particle (VLP) Vaccines and uses thereof
CN108779474A (zh) 以重组腺病毒为载体的fmdv疫苗及其用途
US20140120133A1 (en) Vaccine Against African Horse Sickness Virus
CN104203274A (zh) 轮状病毒亚单位疫苗及其制备和使用的方法
AU2014218358B2 (en) Vaccine against african horse sickness virus
US20200206339A1 (en) Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
CN108135997A (zh) Fcv重组疫苗及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20160113

Address after: Georgia

Applicant after: MERIAL, Inc.

Address before: Georgia

Applicant before: Merial Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190717

Address after: Georgia

Patentee after: MERIAL, Inc.

Address before: Georgia

Patentee before: MERIAL, Inc.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20170825