CN102971010A

CN102971010A - 重组cdv组合物和其使用

Info

Publication number: CN102971010A
Application number: CN2011800165009A
Authority: CN
Inventors: J-C·奥堂奈特; J·明科
Original assignee: Merial Ltd
Current assignee: Merial Ltd
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2013-03-13
Also published as: CA2791787C; AR080313A1; JP5898632B2; LT2538972T; EP2538972A1; US9327137B2; PT2538972T; WO2011106743A1; PL2538972T3; US20160199483A1; DK2538972T3; EP2538972B1; AU2011220410B2; SI2538972T1; CA2791787A1; CY1120430T1; ZA201206209B; NZ602077A; BR112012021545A2; KR20130036209A

Abstract

本发明提供含有及体内或体外表达CDV多肽的载体，或在动物中引发针对CDV的免疫应答的抗原，包含所述载体和/或CDV多肽的组合物，及针对CDV疫苗接种的方法。本发明还提供诱导针对CDV和其他狗病毒的免疫原性或保护性应答的方法，以及预防或治疗由CDV和其他狗病毒导致的CDV和其他狗病毒或疾病状态的方法。

Description

重组CDV组合物和其使用

【相关申请的交叉引用】

本申请要求2010年2月26日提交的US临时申请系列No.61/308,620的权利。

【技术领域】

本发明涉及抵御动物中的狗瘟热病毒和其他狗病毒感染的制剂。特别是，本发明提供含有及体内或体外表达在动物中引发针对狗瘟热病毒的免疫应答的CDV HA的载体，包括包含所述载体的组合物，针对狗瘟热病毒疫苗接种的方法，及伴随该方法和组合物使用的试剂盒。本发明也提供含有及体内或体外表达在动物中引发针对狗瘟热病毒和其他狗病毒的免疫应答的CDV HA和GM-CSF的载体，及包含所述载体的组合物。

【背景技术】

狗瘟热（CD）是狗和其他食肉类动的高度感染性，发热疾病（Fenner,et al.,1987,Veterinary Virology,Academic Press,Inc.,pp.485-503）。死亡率是高，跨30和80%之间。生存的狗常常具有永久中枢神经系统损伤（Fenner,等人,1987）。CD的建立的病因学是被副粘病毒属（Paramyxovirus）家族，称之为CD病毒（CDV）的麻疹病毒属（Morbillivirus）的成员感染。一般而言，副粘病毒属（Paramyxovirus）是含有负极性的18～20kb单链RNA基因组的包裹的病毒。基因组编码包括融合（F）及血细胞凝集素-神经氨酸酶（HN）或血细胞凝集素（HA）糖蛋白的5～7种结构蛋白。膜糖蛋白血细胞凝集素（HA）负责血细胞凝集，和病毒与宿主细胞的附接，及融合糖蛋白（F）导致病毒和感染的细胞之间或感染的和相邻未感染的细胞之间的膜融合（Graves等人,1978,Virology 86:254-263）。对于CDV，F和HA糖蛋白被发现存在于病毒包膜及在感染的细胞表面。通过自用其他麻疹病毒属（Morbillivirus）成员分析的推理，CDV F和HA糖蛋白呈现对于CDV感染和其免疫生物学重要（Diallo A.,1990,Vet.Micro.23:155-163）。已开发基于痘病毒的重组CDV疫苗，以保护及治疗狗（US 5,756,102）。US专利申请USSN 09/587,964公开了表达CDV抗原的基于DNA质粒的疫苗。

粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF）首次发现于1977年（Burgess et al.,1977,J.Biol.Chem.252:1998-2003）。GM-CSF具有许多生理学作用。尤其是，GM-CSF刺激粒细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和巨核细胞集落的产生，发育和形成。（Dy M.,in“lesCytokines”Cavailon 1995 ed.Masson,Paris,France,43-56）。GM-CSF诱导尤其是巨噬细胞细胞毒性，刺激抗体-依赖性细胞毒性活性（ADCC）和在发炎位点水平的白细胞募集。

编码来自各种物种的知道的GM-CSF的核苷酸序列的尺寸于381～432个核苷酸的范围变动。人和鼠核苷酸序列具有69%的程度的同源性。在氨基酸序列水平的同源性的程度是54%（Cantrell et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6250-6254）。马GM-CSF被鉴定为具有144个氨基酸的尺寸（US 7,250,161）。在US 5,702,919和US5,606,024中鉴定了2种狗GM-CSF，它们分别具有127个氨基酸和174个氨基酸。

异源GM-CSF的施用不使获得最佳佐剂效应成为可能，尤其是造血细胞活性的刺激和免疫应答的实质性增加。

由此，有改善CDV疫苗的功效和安全性及在场地条件更有效保护的一般需求。

本发明提供用于优化caGM-CSF的免疫学效应而保留免疫接种的狗的高安全性的溶液。

【发明概述】

本发明的目的可为下列之任何一个或全部：提供重组载体或病毒以及制造该病毒的方法，及提供用于治疗和预防被CDV和其他狗病毒感染的组合物和/或疫苗以及方法。

本发明提供重组载体，诸如重组病毒，其含有及表达至少一种外源核酸分子及，至少一种外源核酸分子可包含编码来自CDV，诸如CDV HA的目的免疫原或表位的核酸分子。

本发明提供重组载体，诸如重组痘病毒，其含有编码CDV HA多肽和/或其变体或片段的第1多核苷酸及编码狗GM-CSF多肽和/或其变体或片段的第2多核苷酸。

本发明还提供包含该表达载体或该表达载体的表达产物的组合物或疫苗。

本发明还提供诱导针对CDV和其他狗病毒的免疫学（或免疫原性）或保护性应答的方法，以及预防或治疗CDV和其他狗病毒或由CDV和其他狗病毒导致的疾病状态的方法，包括施用表达载体或表达载体的表达产物，或包含表达载体的组合物，或包含表达载体的表达产物的组合物。

本发明也涉及自病毒的表达产物以及自表达产物或其体内表达产生的抗体和用于该产物和抗体，例如，在诊断性应用。

公开这些和其他实施方式或自下列详述明显及被下列详述包括。

【附图说明】

下列详述，通过例的方式提供，但不旨在限制本发明仅到描述的特定实施方式，可结合附图最佳明白，其中：

图1提供鉴定分配到多核苷酸和蛋白序列的SEQ ID NO的表。

图2提供SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5之间的序列比对。

图3描绘pCXL1557.1和pJSY2218.1的质粒图谱。

图4显示vCP2263的DNA印迹。

图5显示vCP2263的蛋白印迹。

图6显示vCP2263的免疫噬斑测定。

图7显示vCP2391的蛋白印迹。

图8显示vCP2392的蛋白印迹。

图9显示对于GM-CSF，vCP2391和vCP2392的蛋白印迹。

图10显示对于CDV HA蛋白，vCP2392的蛋白印迹。

图11提供使用异源SN测试的vCP2392和vCP2263的血清学结果。

图12提供使用同源SN测试的vCP2392和vCP2263的血清学结果。

图13a和13b提供CDV HA蛋白的序列比对和在氨基酸水平的序列同一性百分率。

图14提供密码子-优化的CDV HA DNA和野生型CDV HA DNA的序列比对。

图15a和15b提供CDV HA DNA的序列比对和在DNA水平的序列同一性百分率。

图16提供细胞免疫应答的结果。

图17提供CPV2 ELISA结果。

图18描绘CDV SN抗体的同源SN测试结果。

图19描绘CDV SN抗体的异源SN测试结果。

【发明详述】

提供组合物，其包含表达载体，其包含编码在动物中引发免疫原性应答的CDV多肽和其片段和变体的多核苷酸。包含编码CDV多肽或片段或变体的多核苷酸的表达载体可配制成疫苗或药物组合物，及用来在动物中引发或刺激保护性应答。在一实施方式中，CDV多肽是CDV血细胞凝集素（HA）多肽或其活性片段或变体。

提供组合物，其包含表达载体，其包含编码CDV HA多肽或其活性片段或变体的多核苷酸及编码GM-CSF多肽或其活性片段或变体的多核苷酸。

需知，本发明的多肽可为全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“有活性的变体”期望片段或变体保留多肽的抗原性性质。由此，本发明包括在动物中引发免疫原性应答的任何CDV多肽，抗原，表位或免疫原。CDV多肽，抗原，表位或免疫原可为任何CDV多肽，抗原，表位或免疫原，诸如但不限于在动物中引发，诱导或刺激应答的蛋白，肽或其片段或变体。

特定目的CDV多肽是CDV血细胞凝集素（HA）。CDV HA指称在CDV表面发现的一类血细胞凝集素。其是抗原性糖蛋白及负责使病毒结合待感染的细胞。有与在场地循环的不同CDV株关联的不同HA抗原，其中任何可在本发明的实践中使用。但是，有不同抗原，诸如融合（F）糖蛋白和核蛋白（NP），其中任何可在本发明的实践中使用。还需知，可使用这些抗原的任何前体。本发明的抗原性多肽能保护抵御CDV。即，它们能在动物中刺激免疫应答。

术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特定免疫应答的物质。抗原可包含全生物，杀死的，衰减的或活的；生物的亚单位或部分；含有具有免疫原性性质的插入子的重组载体；能在呈递给宿主动物后诱导免疫应答的DNA的碎片或片段；多肽，表位，半抗原，或其任何组合。交替地，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。

术语“蛋白”，“肽”，“多肽”和“多肽片段”在本文互换使用指称任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，及其可由非氨基酸的化学部分间断。术语也包括已天然地修饰或通过干预；例如二硫键形成，糖基化，脂质化，乙酰化，磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记或生物活性组分缀合修饰的氨基酸聚合物。

术语“CDV HA多肽或多核苷酸”指称任何天然或优化的CDV HA多肽或多核苷酸，及它们的衍生物和变体。

术语“GM-CSF多肽或多核苷酸”指称任何天然或优化的GM-CSF多肽或多核苷酸，及它们的衍生物和变体。

本文所用的术语“免疫原性或抗原性多肽”包括一旦向宿主施用时，其能引发针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫应答的意义上免疫学有活性的多肽。优选蛋白片段使得其具有与全蛋白基本上相同的免疫学活性。由此，本发明的蛋白片段包含至少1个表位或抗原决定簇，或基本上由其组成或由其组成。"免疫原性"蛋白或多肽，如本文所用，包括蛋白的全长序列，其类似物，或其免疫原性片段。"免疫原性片段"是指包括1个或更多表位由此引发上述免疫学应答的蛋白片段。该片段可使用本领域熟知的任意数的表位标位技术鉴定。见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)。例如，线性表位可通过例如，在固体支持物上同时合成大量的肽，肽对应于蛋白分子的部分，及使肽与抗体反应而肽仍附接于支持物来测定。该技术本领域知道及描述于，例如，美国专利No.4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986。类似地，构象表位通过测定氨基酸的空间构象容易鉴定，诸如通过，例如，x-射线晶体学和2-维核磁共振。见，例如，Epitope MappingProtocols，见上。

如本文所述，本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。由此，术语“免疫原性或抗原性多肽”还涵盖序列的缺失，添加和取代，只要多肽发挥功能产生本文定义的免疫学应答。

术语"保守性变异"表示氨基酸残基被另一生物学类似残基取代，或核酸序列中的核苷酸的取代，使得编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似残基。在这点上，特别优选的取代会通常是在性质上保守性的，即，在氨基酸家族之内发生的那些取代。例如，氨基酸是通常分为4个家族：（1）酸性--天冬氨酸和谷氨酸；（2）碱性--赖氨酸，精氨酸，组氨酸；（3）非-极性--丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；及（4）不带电的极性--甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是有时分类为芳族氨基酸。保守性变异的例包括一个疏水残基诸如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸被另一疏水残基取代，或一个极性残基被另一极性残基取代，诸如精氨酸被赖氨酸，谷氨酸被天冬氨酸，或谷氨酰胺被天冬酰胺取代，等；或氨基酸用对生物学活性不会具有主要效应的结构上相关的氨基酸的类似保守性取代。因此，与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列，但具有少数基本上不影响蛋白的免疫原性的氨基酸取代的蛋白在参照多肽的定义之内。由这些修饰产生的全部多肽包括在本文中。术语"保守性变异"也包括在未经取代的亲本氨基酸处使用取代的氨基酸，只要是针对取代的多肽产生的抗体也与未经取代的多肽免疫反应。

术语"表位"指称特定B细胞和/或T细胞对其应答的抗原或半抗原上的位点。术语也与"抗原决定簇"或"抗原决定簇位点"互换使用。认识相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。

在对目的组合物或疫苗的细胞和/或抗体-介导的免疫应答的宿主中发展对组合物或疫苗的"免疫学应答"。通常，"免疫学应答"包括但未限于一种或更多以下效应：特别针对在目的组合物或疫苗中包括的抗原的抗体，B细胞，辅助性T细胞，和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地，宿主会展示治疗或保护性免疫学应答，使得对新感染的抗性会增强，和/或疾病的临床严重性减少。该保护会由以下展示：由感染的宿主正常显示的症状的减小或缺乏，感染的宿主中更快恢复时间和/或降低的病毒滴度。

“动物”是指哺乳动物，鸟，等。本文所用的动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自：马（例如,马），狗（例如,狗,狼,狐,山狗,豺），猫（例如,狮,虎,家养猫,野生猫,其他大猫,及其他猫包括猎豹和山猫），绵羊（例如,绵羊），牛（例如,牛），猪（例如,猪），禽（例如,鸡,鸭,鹅,火鸡,鹌鹑,雉鸡,鹦鹉,雀,鹰,乌鸦，鸵鸟，鸸鹋和鹤鸵），灵长类动物（例如,狐猴,跗猴,猴,长臂猿,猿），雪貂，海豹和鱼。术语“动物”也包括发育的全部阶段（包括胚胎和胚胎阶段）的个体动物。

除非另外解释，本文所用的全部技术和科学术语具有与本公开所属于的领域普通技术人员通常明白的相同的含义。单数术语“a”，“an”和“the”包括复数个指示物，除非情景明显另外指示。类似地，词汇“或”旨在包括“和”，除非情景明显另外指示。

需知，在本公开和特别权利要求和/或段落中，术语诸如“包含（comprises）”，“包含（comprised）”，“包含（comprising）”等可具有美国专利法中规定的含义；例如，它们可指“包括（includes）”，“包括（included）”，“包括（including）”，等；及术语诸如“基本上由…组成（consisting essentially of）”和“基本上由…组成（consistsessentially of）”具有美国专利法中规定的含义，例如，它们允许未明确地叙述的要素，但排除见于现有技术或影响本发明的基本或新特征的要素。

【组合物】

本发明涉及CDV疫苗或组合物，其可包含重组或表达载体，其包含编码CDV多肽的多核苷酸，抗原，表位或免疫原和药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质。CDV多肽，抗原，表位或免疫原可为任何CDV多肽，抗原，表位或免疫原，诸如但不限于在动物中引发，诱导或刺激应答的蛋白，肽或其片段。

本发明涉及CDV疫苗或组合物，其可包含重组或表达载体，其包含编码CDV HA多肽的多核苷酸和药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质。在一实施方式中，表达载体可还包含编码GM-CSF多肽的多核苷酸。

在另一实施方式中，药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质可为油包水乳剂。在再一实施方式中，油包水乳剂可为水/油/水（W/O/W）三层乳剂。在再一实施方式中，药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质可为水包油乳剂。

在一实施方式中，CDV多肽，抗原或其片段或变体可为CDV HA多肽或其片段或变体。在此实施方式的一方面，CDV HA多肽或其片段或变体是由CDV HA基因产生的重组多肽。在此实施方式的另一方面，CDV HA基因与SEQ ID NO:1，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48或49所示序列具有至少70%同一性。在此实施方式的另一方面，CDV HA多肽或其片段或变体与SEQ IDNO:2，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示序列具有至少80%同一性。

在另一实施方式中，GM-CSF多肽，抗原或片段或变体是由GM-CSF基因产生的重组多肽。在此实施方式的另一方面，GM-CSF基因与SEQ ID NO:3所示序列具有至少70%同一性。在此实施方式的另一方面，GM-CSF多肽或其片段或变体与SEQ ID NO:4所示序列具有至少80%同一性。

合成抗原也包括在定义之内，例如，多表位，侧接表位，及其他重组或合成来源的抗原。见，例如，Bergmann等人，1993；Bergmann等人，1996；Suhrbier，1997；Gardner等人，1998。免疫原性片段，对于本发明的目的，会通常包括分子的至少约3个氨基酸，至少约5个氨基酸，至少约10～15个氨基酸，或约15～25个氨基酸或更多氨基酸。无片段长度的临界上限，其可包含几乎蛋白序列的全长，或甚至包含蛋白的至少1个表位的融合蛋白。

因此，表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码CDV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。编码CDV多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最小15个核苷酸，约30～45个核苷酸，约45～75或至少75，87或150个连续或连续的核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。表位确定过程，诸如，产生重叠肽库（Hemmer等人,1998），Pepscan（Geysen等人,1984;Geysen等人,1985;Van der Zee R.等人,1989;Geysen,1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron）和算法（De Groot等人,1999;PCT/US2004/022605）可在本发明的实践中使用。

术语“核酸”和“多核苷酸”指称线性或分支的，单或双链的RNA或DNA，或其杂交体。术语也包括RNA/DNA杂交体。下列是多核苷酸的非限制性例：基因或基因片段，外显子，内含子，mRNA，tRNA，rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支的多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的DNA，任何序列的分离的RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基，诸如氟核糖和硫醇酯，及核苷酸枝。核苷酸的序列可在聚合之后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。此定义中包括的其他类型的修饰是封头，一个或更多天然存在的核苷酸用类似物取代，及将多核苷酸附接到蛋白的手段，金属离子，标记组分，其他多核苷酸或固体支持物的导入。多核苷酸可通过化学合成获得或源于微生物。

术语“基因”广泛地用来指称任何与生物学功能关联的多核苷酸段。由此，基因包括：内含子和外显子，如在基因组序列中，或仅包含编码序列，如在cDNA中，和/或用于它们的表达需要的调控序列。例如，基因也指称表达mRNA或功能RNA，或编码特异性蛋白，及包括调控序列的核酸片段。

本发明还包含编码CDV抗原，表位或免疫原的多核苷酸或编码GM-CSF抗原，表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合物及任何长度，及可含有脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和以任何组合的类似物。

“分离的”生物学组分（诸如核酸或蛋白或细胞器）指称已基本上自组分天然地存在的生物细胞中的其他生物学组分，例如，其他染色体和额外-染色体DNA和RNA，蛋白和细胞器分离的或纯化的组分。已“分离的”的核酸和蛋白包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。术语也包含由重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白。

本文所用的术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，其标识相对术语。由此，例如，部分纯化的多肽制备物是多肽相比天然的环境中的多肽更富集的制备物。即多肽从细胞组分分离。“基本上纯化的”期望已移出至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或至少98%，或更多的细胞组分或物质。同样，多肽可为部分纯化的。“部分纯化的”期望移出小于60%的细胞组分或物质。同样应用于多核苷酸。本文公开的多肽可由本领域知道的任何手段纯化。

而且，CDV HA多肽的同源物和GM-CSF多肽的同源物旨在在本发明的范围之内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同原物，类似物和旁系同原物。术语“类似物”指称具有相同的或类似功能，但在不相关的生物中独立地进化了的2个多核苷酸或多肽。术语“直系同原物”指称来自不同物种，但由物种形成自共同祖先基因进化了的2个多核苷酸或多肽。正常情况下，直系同原物编码具有相同的或类似功能的多肽。术语“旁系同原物”指称由基因组之内的复制相关的2个多核苷酸或多肽。旁系同原物通常具有不同功能，但这些功能可相关。例如，野生型CDV多肽的类似物，直系同原物和旁系同原物可由翻译后修饰，由氨基酸序列差异，或由两者不同于野生型CDV多肽。尤其是，本发明的同源物会通常与野生型CDV多肽或多核苷酸序列的全部或部分呈现至少80～85%，85～90%，90～95%或95%，96%，97%，98%，99%序列同一性，且会呈现类似功能。

在一实施方式中，本发明提供表达载体包含编码一种或更多与具有SEQ ID NO:2，4，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽的一种或更多多核苷酸。在另一实施方式中，本发明提供以上鉴定的CDV多肽或GM-CSF的片段和变体（SEQ ID NO:2,4,5,20,21,22,23,24,25,26,27，28，29，30，31，32，33或34），其可由本领域技术人员使用熟知的分子生物学技术容易制备。变体是具有与SEQ ID NO:2，4，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示氨基酸序列具有至少75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%，98%或99%同一性的氨基酸序列的同源多肽。

变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"指称含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群中存在的多态性的多核苷酸或多肽（例如,病毒物种或变种）。该天然的等位基因变异可一般在多核苷酸或多肽中导致1～5%变异。等位基因变体可通过测序在许多不同物种中的目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的基因遗传座位的杂交探针容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或变异（其为天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性）旨在本发明的范围之内。

如本文所用，术语"衍生物"或“变体”指称具有一个或更多保守性氨基酸变异或其他少数修饰而使得（1）对应多肽与野生型多肽相比具有基本上相当的功能或（2）针对多肽产生的抗体与野生型多肽是免疫反应性的多肽，或编码多肽的核酸。这些变体或衍生物包括具有可导致相比未修饰的对应物多肽具有基本上相当的活性的肽的CDV多肽或GM-CSF一级氨基酸序列的少数修饰的多肽。该修饰可为有意的，如通过定点诱变，或可为自发的。术语“变体”还涵盖对序列的缺失，添加和取代，只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。

CDV多肽或GM-CSF多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO:2，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示序列的CDV HA多肽或其变体，或具有SEQ ID NO:4所示序列的GM-CSF多肽或其变体的至少8，10，13，14，15或20个连续氨基酸，至少21个氨基酸，至少23个氨基酸，至少25个氨基酸，或至少30个氨基酸。

在另一方面，本发明提供表达载体，其包含编码CDV HA多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ ID NO:2，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供表达载体，其包含编码与具有SEQ IDNO:2，5，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33或34所示序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽，或保守性变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合的多核苷酸。

在再一方面，本发明提供表达载体，其包含编码GM-CSF多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ ID NO:4所示序列的多肽的多核苷酸。在再一方面，本发明提供表达载体，其包含编码与具有SEQ ID NO:4所示序列的多肽具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多肽，或保守性变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合的多核苷酸。

在一实施方式中，本发明的多核苷酸包括具有SEQ ID NO:1，3，6，7，8，9，14，19，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48或49所示核苷酸序列的多核苷酸，或其变体。在另一实施方式中，本发明的多核苷酸包括与具有SEQ ID NO:1，3，6，7，8，9，14，19，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48或49所示序列的多核苷酸之一具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的多核苷酸，或其变体。

本公开的多核苷酸包括作为遗传密码简并的结果的序列，例如，对于特定宿主的优化的密码子利用。如本文所用，“优化的”指称被遗传加工为增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为了提供优化的编码CDV HA多肽或GM-CSF多肽的多核苷酸，可将CDV HA基因或GM-CSF基因的DNA序列修饰为（1）包含由在特定物种中高度表达的基因优选的密码子；（2）包含在核苷酸碱基组成中基本上见于所述物种的A+T或G+C含量；（3）形成所述物种的起始序列；或（4）消除导致去稳定，不适当的多聚腺苷酸化，RNA的降解和终止，或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。CDV HA蛋白或GM-CSF蛋白在所述物种中增加的表达可通过利用在真核生物和原核生物，或在特定物种中密码子利用的分布频度来达到。术语“优选的密码子利用频度”指称在核苷酸密码子利用中由特定宿主细胞呈现的偏好以特定给定氨基酸。有20种天然的氨基酸，多数由多于一种密码子特定。因此，全部简并核苷酸序列包括在公开中，只要由核苷酸序列编码的CDV HA多肽或GM-CSF多肽的氨基酸序列是功能性地未变化的。

2个氨基酸序列之间的序列同一性可由NCBI（National Centerfor Biotechnology Information）配对blast和blosum62矩阵，使用标准参数建立（见,例如,BLAST or BLASTX algorithm available on the"National Center for Biotechnology Information"(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器,以及Altschul等人）。

关于序列的“同一性”可指称具有同一核苷酸或氨基酸的位置数除以2个序列中的较短者中的核苷酸或氨基酸数，其中2个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法测定（Wilbur和Lipman），例如，使用20个核苷酸的窗口大小，4个核苷酸的字长，及4的空位罚分，及包括比对的序列数据的计算机-辅助的分析和解析可使用可商购的程序（例如,Intelligenetics^TM套件,Intelligenetics Inc.CA）便利地进行。当RNA序列被说成与DNA序列类似，或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷（T）被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶（U）。由此，RNA序列在本发明的范围之内和可源于DNA序列，通过DNA序列中的胸苷（T）被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶（U）。

2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包（Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA）测定。

下列文献提供比较序列的相对同一性或同源性的算法，及额外地或替代性地关于上述，这些参考文献中的教导可用于测定百分率同源性或同一性：Needleman SB和Wunsch CD；Smith TF和WatermanMS；Smith TF，Waterman MS和Sadler JR；Feng DF和Dolittle RF；Higgins DG和锐PM；Thompson JD，Higgins DG和Gibson TJ；及，Devereux J，Haeberlie P和Smithies O.。且无需过度实验，本领域技术人员可谘询用于测定百分率同源性的许多其他程序或参考文献。

杂交反应可在不同“严格度”条件下进行。增加杂交反应的严格度的条件是熟知的。见例如，“分子克隆：实验室手册”，第2版（Sambrook等人,1989）。

本发明包括CDV多核苷酸或GM-CSF多核苷酸或二者，其含于载体分子或表达载体，且可操作地连接到启动子元件和任选地到增强子。

本发明还包括狗疫苗或组合物，其可包含上述的重组载体，其包含编码CDV HA多肽或抗原的多核苷酸和编码GM-CSF多肽或抗原的多核苷酸，药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质，及额外地一种或更多来自狗的抗原。本发明还涉及狗疫苗或组合物，其可包含上述的重组或表达载体，其包含编码GM-CSF多肽的多核苷酸，药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质，及额外地一种或更多来自狗的抗原。抗原可为选自下列的狗抗原：狂犬病，狗细小病毒，狗冠状病毒，狗流感，狗瘟热，感染性狗肝炎，狗疱疹病毒，假性狂犬病，狗细小病毒，钩端螺旋体属（Leptospira），犬新孢子虫（Neospora caninum），博氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），犬埃里希体（Ehrlichia canis），立氏立克次体（Rickettsia rickettsii），支气管炎博德特菌（Bordetella bronchiseptica），皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis），荚膜组织胞浆菌（Histoplasmacapsulatum），粗球孢子菌（Coccidioides immitis），新型隐球菌（Cryptococcus neoformans），犬小孢子菌（Microsporum canis），申克孢子丝菌（Sporothrix schenckii），烟曲霉（Aspergillus fumigatus），及隐袭腐霉（P.insidiosum）。抗原可包含全生物，杀死的，衰减的或活的；生物的亚单位或部分；含有具有免疫原性性质的插入子的重组载体；能在呈递给宿主动物后诱导免疫应答的DNA的碎片或片段；多肽，表位，半抗原，或其任何组合。

“载体”指称包含待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包含旨在防止或治疗的目的序列，且可任选地为表达盒形式。如本文所用，载体无需能在最终靶细胞或受试者中复制。术语包括克隆载体和病毒载体。

术语“重组体”是指天然不存在或以天然不存在的排列被连接到另一多核苷酸的半合成或合成来源的多核苷酸。

“异源”是指源于与所比较的其余实体遗传上不同的实体。例如，多核苷酸可由遗传加工技术放进源于不同来源的质粒或载体，且为异源多核苷酸。自其天然编码序列移出的和可操作地连接到非天然序列的编码序列的启动子是异源启动子。

本发明的多核苷酸可包含附加序列，诸如相同的转录单元之内的另外的编码序列，控制元件诸如启动子，核糖体结合位点，5’UTR，3’UTR，转录终止子，多聚腺苷酸化位点，在相同的或不同启动子控制下的另外的转录单元，允许克隆，表达，同源重组，及宿主细胞转化的序列，及任何该构建体，如提供本发明的实施方式可为期望的。

CDV HA多肽，抗原，表位或免疫原或GM-CSF多肽表达元件存在于发明的载体中。以最小方式，此包含用于特定载体诸如质粒和特定病毒载体，例如，非痘病毒的病毒载体的起始密码子（ATG），终止密码子和启动子，及任选地也多聚腺苷酸化序列。当多核苷酸编码多肽片段，例如CDV HA多肽时，在载体中，ATG放置在阅读框的5’和终止密码子放置在3'。可存在其他控制表达的元件，诸如增强子序列，稳定化序列，诸如内含子和允许蛋白分泌的信号序列。

本发明也涉及包含载体的组合物或疫苗。组合物或疫苗可包含一种或更多载体，例如，表达载体，诸如体内表达载体，包含及表达一种或更多CDV HA或GM-CSF多肽，抗原，表位或免疫原。在一实施方式中，载体，在药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，佐剂或媒质中，含有及表达包含编码和/或表达CDV HA抗原，表位或免疫原的多核苷酸的多核苷酸。由此，根据本发明的一实施方式，制备物中的其他载体包含编码的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成，及在适当的环境下载体表达一种或更多CDV HA多肽，抗原，表位或其免疫原的其他蛋白（例如,血细胞凝集素,神经氨酸酶,核蛋白）或片段。

根据另一实施方式，在组合物或疫苗中的载体包含编码CDV HA多肽，抗原，表位或免疫原，或GM-CSF多肽，抗原，表位或免疫原的一种或更多蛋白或片段，或其组合的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。在另一实施方式中，组合物或疫苗包含1，2或更多载体，其包含编码及表达，有利地体内，CDV HA多肽，抗原，融合蛋白或其表位的多核苷酸。本发明也针对包含编码及表达不同CDV HA多肽，抗原，表位，融合蛋白，或免疫原，例如，来自不同物种诸如但不限于人，猪，牛或牛，狗，猫和禽的CDV HA多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸的载体的混合物。

在本发明中重组病毒载体用于表达编码CDV多肽或其片段或变体的CDV编码序列或其片段。特别是，病毒载体可表达CDV序列，更特别是编码抗原性多肽的CDV HA基因或其片段。本文涵盖的病毒载体包括但不限于痘病毒［例如，痘苗病毒或衰减的痘苗病毒，禽痘病毒或衰减的禽痘病毒（例如,金丝雀痘,鸡痘,鸽痘,鸽痘,鹌鹑痘,ALVAC,TROVAC;见例如,US 5,505,941,US 5,494,8070），浣熊痘病毒，猪痘病毒，等］，腺病毒（例如,人腺病毒,狗腺病毒），疱疹病毒（例如狗疱疹病毒,猫疱疹病毒,牛疱疹病毒,猪疱疹病毒），杆状病毒，反转录病毒，等。在另一实施方式中，禽痘表达载体可为金丝雀痘载体，诸如，ALVAC。在再一实施方式中，禽痘表达载体可为鸡痘载体，诸如，TROVAC。CDV多肽，抗原，表位或免疫原可为CDV HA。例如，包含CDV HA的痘病毒载体可为如描述于US5,756,102的载体。本发明的待表达的CDV HA多肽或抗原被插入到在特定痘病毒启动子，例如，尤其，痘苗启动子7.5kDa（Cochran等人,1985），痘苗启动子I3L（Riviere等人,1992），痘苗启动子HA（Shida,1986），牛痘启动子ATI（Funahashi等人,1988），痘苗启动子H6（Taylor等人,1988b;Guo等人,1989;Perkus等人,1989）控制下。

根据本发明的仍进一步实施方式，表达载体是质粒载体，尤其是体内表达载体。在特定，非限制性例中，可将pVR1020或1012质粒（VICAL Inc.;Luke等人,1997;Hartikka等人,1996,见,例如,美国专利No.5,846,946和6,451,769）用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒源于pVR1012及含有人tPA信号序列。在一实施方式中，人tPA信号包含GenBank登录号No.HUMTPA14的自氨基酸M(1)到氨基酸S(23)。在另一特定，非限制性例中，作为用于插入多核苷酸序列的载体利用的质粒可含有GenBank登录号No.U28070的自氨基酸M(24)到氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。可在实践中谘询或采用的DNA质粒的附加信息见于，例如，美国专利No.6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362。表达CDV抗原的基于DNA质粒的疫苗可见于US专利申请USSN 09/587,964。

术语质粒含盖包含本发明的多核苷酸和对于在期望的宿主或靶细胞内体内表达必需的元件的任何DNA转录单元；及，在这点上，需知，超螺旋的或非-超螺旋的，环状质粒，以及线性形式，旨在本发明的范围之内。

各质粒包含或含有，或基本上由以下组成，除了编码CDV HA多肽，抗原，表位或免疫原的多核苷酸之外，任选地与异源肽序列，变体，类似物或片段融合，可操作地连接到启动子或在启动子控制下或依赖于启动子。一般而言，在真核细胞中采用强启动子功能是有利的。强启动子可为但不限于，人或鼠来源，或任选地具有另一来源诸如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子（CMV-IE）。

更总而言之，启动子具有病毒，或细胞来源。可在本发明的实践中有用地采用的非CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或Rous肉瘤病毒的LTR启动子。可在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子，诸如例如结蛋白启动子（Kwissa等人,2000），或肌动蛋白启动子（Miyazaki等人,1989）。

至于用于质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号（多聚A），可使用牛生长激素（bGH）基因的聚(A)信号（见US 5,122,458），或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。

“宿主细胞”表示已被遗传改变，或能通过施用外源多核苷酸，诸如重组质粒或载体遗传改变的原核生物或真核生物细胞。当指称遗传改变的细胞时，术语指称原本改变的细胞及其后代。

【使用方法和生产的物品】

本发明包括下列方法实施方式。在一实施方式中，公开了免疫接种动物的方法，其包括给动物施用组合物，其包含载体，所述载体包含编码CDV HA多肽或其片段或变体的多核苷酸及药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，媒质或佐剂。在此实施方式的一方面，动物是禽，马，狗，猫，雪貂，海豹，或猪。

在另一实施方式中，公开了免疫接种动物的方法，其包括施用组合物，所述组合物包含载体，其包含编码CDV HA多肽的多核苷酸和编码GM-CSF多肽的多核苷酸和药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，媒质或佐剂及一种或更多包含狗抗原的组合物。

在再一实施方式中，公开了免疫接种动物的方法，其包括施用组合物，所述组合物包含载体，所述载体包含编码GM-CSF多肽的多核苷酸和药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，媒质或佐剂及一种或更多包含狗抗原的组合物。

在本发明的一实施方式中，可采用初施-追施方案，其包含使用至少一种共同的多肽，抗原，表位或免疫原的至少一次初次施用和至少一次追加施用。施用可包含1，2或更多包含相同的或不同抗原的疫苗或组合物。一般而言，初次施用中使用的免疫学组合物或疫苗在性质上不同于作为追加使用的那些。但是，需知，可将相同的组合物用作初次施用和追加施用。此施用流程被称为“初施-追施”。

初施-追施方案包含使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段的至少一次初次施用和至少一次追加施用。初次施用可包含一次或更多施用。类似地，追加施用可包含一次或更多施用。初次施用可包含一种或更多抗原和追加施用可包含一种或更多抗原。

在本发明的初施-追施流程或方案的一方面，初施-追施流程可包含施用包含含有及体内表达CDV HA多肽，抗原和/或其变体或片段的重组病毒载体的组合物，之后是施用重组CDV HA多肽或抗原，或包含CDV HA多肽或抗原的灭活的病毒组合物或疫苗，或表达CDVHA多肽或抗原的基于DNA质粒的组合物或疫苗。同样，初施-追施流程可包括施用包含重组CDV HA抗原的组合物，或包含CDV HA多肽或抗原的灭活的病毒组合物或疫苗，或表达CDV HA多肽或抗原的基于DNA质粒的组合物或疫苗，之后是施用含有及体内表达CDVHA多肽或其抗原和/或变体或片段的重组病毒载体。还需注意，首次和二次施用可包含含有及表达本发明的CDV HA多肽的重组病毒载体。由此，本发明的重组CDV病毒载体可与重组CDV抗原，包含CDV抗原的灭活的病毒组合物或疫苗，或表达CDV抗原的基于DNA质粒的组合物或疫苗以任何顺序施用，或替代性地可作为一次和二次组合物单独使用。

用于是哺乳动物的靶物种的组合物的剂量体积，例如，狗组合物的剂量体积，基于病毒载体的，例如，基于非-痘病毒-载体的组合物，通常在约0.1～约2.0ml之间，约0.1～约1.0ml之间，及约0.5ml～约1.0ml之间。

疫苗的功效可在通过用CDV的强毒株攻击动物，诸如狗来最后免疫之后约2～4周测试。将同源和异源株用于攻击，以测试疫苗的功效。动物可经口，由IV注射或由IC接种攻击。对于使用的各种不同攻击株和各施用途径，病毒处于对于在未疫苗接种的动物中诱导临床症状来说足够高滴度。攻击病毒的体积是约0.5～2.0ml。动物可在攻击后，就临床体征诸如结膜炎，鼻炎，腹泻，呕吐，抑郁，脱水，过热，肺炎，共济失调，肌阵挛，感觉过敏，麻痹，轻瘫，发作，眼症状（诸如角膜结膜炎,脉络膜视网膜炎）和视神经炎观察21～42天。攻击期间，可对动物血采样，用于完全血计数和血清学研究（CDV特异性抗体的存在）。此外，可对尿，撕裂，唾液，粪便和血样品进行PCR。

在初施-追施流程中使用的包含本发明的重组体抗原性多肽的组合物含于药学或兽医学可接受的媒质，佐剂，稀释剂或赋形剂中。本发明的流程保护动物免于CDV和/或预防感染的动物中的疾病进展。

各施用优选隔1～6周进行。优选的时间间隔是3～5周，及最佳4周。根据一实施方式，也考虑每年追加。动物，例如狗，在第1次施用时可为至少8周龄。

由本领域技术人员应明白，本公开由例的方式提供，本发明不限于此。自本公开及本领域知识，本领域技术人员可确定对于各注射流程使用的施用数，施用途径，及剂量，无需任何过度实验。

本发明涵盖至少一次给动物施用有效量的本发明制备的治疗组合物。动物可为雄性，雌性，怀孕的雌性和新生儿。此施用可经各种途径，包括但不限于肌内（IM），真皮内（ID）或皮下（SC）注射或经鼻内或口服施用。本发明的治疗组合物也可通过无针设备（例如用Pigjet,Dermojet,Biojector,Avijet（Merial,GA,USA），Vetjet或Vitajet设备（Bioject,Oregon,USA））施用。施用质粒组合物的另一方法是使用电穿孔（见,例如Tollefsen等人,2002;Tollefsen等人,2003;Babiuk等人,2002;PCT申请No.WO99/01158）。在另一实施方式中，将治疗组合物由基因枪或金粒子轰击递送到动物。在有利的实施方式中，动物是狗，雪貂或海豹。

在一实施方式中，本发明提供施用治疗有效量的用于在靶细胞中递送和表达CDV抗原或表位的制剂。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员是常规实验。在一实施方式中，制剂包含表达载体，其包含表达CDV抗原或表位的多核苷酸和药学或兽医学地可接受的载体，媒质，佐剂或赋形剂。在另一实施方式中，药学或兽医学地可接受的载体，媒质，佐剂或赋形剂辅助在宿主中载体或蛋白转染或感染和/或改善保存。

在一实施方式中，本发明提供施用治疗有效量的用于在靶细胞中递送和表达CDV HA多肽或抗原或表位的组合物。治疗有效量的确定对于本领域普通技术人员是常规实验。在一实施方式中，组合物包含表达载体，其包含表达CDV HA多肽或抗原或表位的多核苷酸和药学或兽医学地可接受的载体，佐剂，媒质或赋形剂。在另一实施方式中，药学或兽医学地可接受的载体，媒质，佐剂或赋形剂辅助载体或蛋白的转染或感染和/或改善保存。

药学或兽医学地可接受的载体或媒质或赋形剂或佐剂是本领域技术人员熟知的。例如，药学或兽医学地可接受的载体或媒质或赋形剂或佐剂可为0.9%NaCl（例如,盐水）溶液或磷酸缓冲剂。可在本发明的方法使用的其他药学或兽医学地可接受的载体或媒质或赋形剂或佐剂包括，但未限于，聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学地可接受的载体或媒质或赋形剂或佐剂可为辅助载体（或自发明的载体体外表达的蛋白）的施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体，媒质或赋形剂或佐剂可辅助载体（或蛋白）的转染和/或改善保存。本文在概述中讨论剂量和剂量体积，也可由本领域技术人员自本公开内容结合本领域知识，无需任何过度实验就确定。

有利地但不完全适合用于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质是具有下式的那些：

其中R1是具有12～18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族自由基，R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族自由基和X是胺或羟基，例如DMRIE。在另一实施方式中，阳离子脂质可相关于中性脂质，例如DOPE。

这些阳离子脂质中，优选DMRIE（N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙烷铵;WO96/34109），有利地结合中性脂质，有利地DOPE（二油酰-磷脂酰-乙醇胺;Behr,1994），而形成DMRIE-DOPE。

当DOPE存在时，DMRIE:DOPE摩尔比有利地是约95:约5～约5:约95，更有利地约1:约1，例如，1:1。

在另一实施方式中，药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，媒质或佐剂可为油包水乳剂。适合的油包水乳剂的例包括基于油的油包水疫苗乳剂，其于4℃稳定且是流体，含有：6～50v/v%的含有抗原的水相，优选12～25v/v%，50～94v/v%的含有总共或部分非-可代谢的油（例如,矿物油诸如石蜡油）和/或可代谢的油（例如,植物油或脂肪酸,多元醇或醇酯）的油相，0.2～20p/v%的表面活性剂，优选3～8p/v%，后者总共或部分，或在混合物中是聚甘油酯，所述聚甘油酯优选是聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氢化的聚氧乙烯蓖麻毒素油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的例包括乙氧基化的山梨糖醇酐酯（例如,聚氧乙烯（20）山梨糖醇酐单油酸酯（吐温

），可获自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT）和山梨糖醇酐酯（例如,山梨糖醇酐单油酸酯（Span

），可获自Sigma Aldrich,St.Louis,MO）。此外，关于油包水乳剂，也见US 6,919,084。在一些实施方式中，含有抗原的水相包含包含一种或更多缓冲剂的盐溶液。适合的缓冲溶液的一例是磷酸盐缓冲液。在一实施方式中，油包水乳剂可为水/油/水（W/O/W）三层乳剂（美国6,358,500）。其他适合的乳剂的例描述于US 7,371,395。

本发明的免疫学组合物和疫苗可包含一种或更多药学或兽医学地可接受的载体，赋形剂，媒质或佐剂，或基本上由其组成。在本发明的实践中使用的适合的佐剂是（1）丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，马来酸酐和烯基衍生聚合物，（2）免疫刺激序列（ISS），诸如具有1个或更多非-甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列（Klinman等人,1996;WO98/16247），（3）水包油乳剂，诸如由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”第147页描述的SPT乳剂，及在相同的文章的第183页描述的乳剂MF59，（4）含有季铵盐的阳离子脂质，例如，DDA（5）细胞因子，（6）氢氧化铝或磷酸铝，（7）皂苷或（8）引用的及通过引用合并到本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或其（9）任何组合或混合物。

水包油乳剂（3），其对于病毒载体尤其适当，可基于：轻液体石蜡油（欧洲药典类型），类异戊二烯油诸如角鲨烷，角鲨烯，自烯，例如异丁烯或癸烯的寡聚化得到的油，具有直链烷基的酸或醇的酯，诸如植物油，油酸乙酯，丙二醇，二(辛酸/癸酸酯)，甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或分支的，脂肪醇或酸的酯，尤其异硬脂酸酯。

油用于与乳化剂组合而形成乳剂。乳化剂可为非离子表面活性剂，诸如：一方面是山梨糖醇酐，二缩甘露糖醇（例如无水甘露糖醇油酸酯），甘油，聚甘油或丙二醇的酯，及另一方面是油酸，异硬脂酸，蓖麻油酸或羟基硬脂酸，所述酯任选地被乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物块，诸如普流尼克，例如，L121。

在类型（1）佐剂聚合物之中，优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其由糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物以名称卡波姆被知（Pharmeuropa,vol.8,No.2,1996年6月）。本领域技术人员也可参考US 2,909,462，其提供该通过具有至少3个羟基，优选不多于8个该基团，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和的，脂肪族自由基取代的聚羟基化合物交联的丙烯酸聚合物。优选的自由基是含有2～4个碳原子的那些，例如乙烯基，烯丙基和其他乙烯键合地不饱和基团。不饱和的自由基也可含有其他取代基，诸如甲基。以名称卡波泊尔（BF Goodrich,Ohio,USA）售的产品是尤其适合的。它们由烯丙基蔗糖或由烯丙基季戊四醇交联。它们之中，参考卡波泊尔974P，934P和971P。

至于马来酸酐-烯基衍生共聚物，优选EMA（Monsanto），其是直链或交联的亚乙基-马来酸酐共聚物，且它们是，例如，由二乙烯基醚交联的。

关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA是优选由具有下式的基本单元形成的：

其中：

●R1和R2，其可相同或不同，代表H或CH3

●x=0或1，优选x=1

●y=1或2，x+y=2。

对于EMA，x=0及y=2，而对于卡波姆x=y=1。

这些聚合物在水或生理学盐溶液（20g/l NaCl）中是可溶性的，且可将pH例如，由苏打（NaOH）调至7.3～7.4，以提供可掺入表达载体的佐剂溶液。聚合物浓度在最终免疫学或疫苗组合物中可在约0.01～约1.5%w/v之间，约0.05～约1%w/v，及约0.1～约0.4%w/v范围内。

细胞因子（5）可在免疫学或疫苗组合物中为蛋白形式，或可在宿主中与免疫原或其表位共表达。优选细胞因子由表达免疫原或其表位的相同的载体，或由其分离的载体的共表达。

本发明包含制备该组合组合物；例如通过，有利地一起及与佐剂，载体，细胞因子和/或稀释剂混合有活性的组分。

可在本发明中使用的细胞因子包括，但未限于，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），干扰素

干扰素干扰素γ，

白细胞介素

白细胞介素

白细胞介素-2（IL-2），白细胞介素-3（IL-3），白细胞介素-4（IL-4），白细胞介素-5（IL-5），白细胞介素-6（IL-6），白细胞介素-7（IL-7），白细胞介素-8（IL-8），白细胞介素-9（IL-9），白细胞介素-10（IL-10），白细胞介素-11（IL-11），白细胞介素-12（IL-12），肿瘤坏死因子α（TNFα），肿瘤坏死因子及转化生长因子需知，细胞因子可与本发明的免疫学或疫苗组合物共施用和/或依次施用。由此，例如，本发明的疫苗也可含有体内表达适合的细胞因子，例如，与待免疫接种的或待引发免疫学应答的此宿主匹配的细胞因子（例如,用于待施用给狗的制备物的狗细胞因子）的外源核酸分子。

现在通过下列非限制性例进一步描述本发明。

【实施例】

无需进一步明细，认为，本领域技术人员可，使用在前描述，实施本发明至其最完全的程度。以下详细实施例应被解释为仅例证性的，及不以任何方式限制在前公开。本领域技术人员会立即认识来自作为反应物及作为反应条件和技术的过程的适当的改良。

使用描述于J.Sambrook et al.（Molecular Cloning:A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York,1989）的标准分子生物学技术进行DNA插入子，质粒和重组病毒或植物载体的构建。

【实施例1：含有CDV HA的质粒-pC5 H6 CDV HA，pCXL1557.1的构建】

将含有密码子-优化的CDV HA基因（SEQ ID NO:1）的质粒（自Danish CDV株）用EcoRV和XhoI消化。将含有痘苗H6启动子的3’序列和全长密码子-优化的CDV HA基因的1849bp片段凝胶纯化。将质粒pCXL148.2（pC5供体质粒,Merial专利物质）用EcoRV和XhoI消化，以产生含有H6启动子的5’序列的49851bp载体。将1849bp插入子连接到49851bp载体而产生pC5 H6 CDV HA（pCXL1557.1）。对构建体测序，以确认正确序列。图3显示质粒pCXL1557.1图谱。

【实施例2：含有狗GM-CSF的质粒-pC3 H6p，狗GM-CSF，pJSY2218.1的构建】

将含有密码子-优化的狗GM-CSF基因的质粒用NruI/XhoI消化。将得到的狗GM-CSF DNA片段分离及连接到NruI/XhoI消化的pJY19131.1（Merial专利物质），以创建C3供体质粒pJSY2218.1，其含有与C3臂相反方向的表达盒H6p(痘苗H6启动子)-狗GM-CSF。对质粒pJSY2218.1测序，及确认具有正确序列。图3显示质粒pJSY2218.1图谱。

【实施例3：含有ALVAC的C5座位中的CDV合成HA基因的ALVAC重组体的产生和表征（vCP2263）】

【A．vCP2263的产生】

供体质粒pCXL1557.1含有密码子-优化的狗CDV HA基因（SEQID NO:1）。将原代鸡胚胎成纤维细胞（1°CEF）细胞用于体外重组。使1°CEF细胞在1×抗生素/抗真菌药（P/S/A/A,BRL/Gibco#15240-062）的存在下生长在补充有4mM谷氨酰胺（BRL/Gibco#25030-081）和1mM丙酮酸钠（BRL/Gibco#11360-070）的10%FBS（JRH：

照射的#12107-500M），DMEM（BRL/Gibco#11960-051或11960-044）。将用辣根过氧化物酶(HRP)-标记的CDV合成HA特异性探针的噬斑杂交用于重组选择。

通过1°CEF细胞用12μg的Not I-线性化的供体质粒pCXL1557.1，使用

试剂（Roche）的转染来进行IVR（体外重组）。将转染的细胞随后用ALVAC感染，以10的MOI（感染复数）（ALVAC浓储物,6.3×10⁹pfu/ml）拯救病毒。24小时之后，收获转染的-感染的细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。基于噬斑转印杂交方法，使用用辣根过氧化物酶（HRP）标记的1232bp合成HA特异性探针，根据生产商的流程（Amersham Cat# RPN3001,）筛选重组噬斑。在4连续轮的噬斑纯化之后，产生命名为vCP2263.1.2.1.1和vCP2263.6.1.1.1的重组体及通过对于HA插入子100%阳性和对于空C5位点100%阴性的杂交来确认。单噬斑选自第4轮的噬斑纯化，及扩展以获得P1（1×T25瓶每姐妹），P2（1xT75瓶每姐妹）和P3（对于vCP2263.1.2.1.1.是4×滚瓶）浓储物，以扩增vCP2263。将来自滚瓶的感染的细胞培养液收获及浓缩，以产生病毒浓储物。

【B．基因组分析】

提取来自vCP2263.1.2.1.1和vCP2263.6.1.1.1的基因组DNA，用BamHI，HindIII或Pst I消化和在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。结果揭示CDV合成HA序列的正确插入。

DNA印迹：将具有BamHI，HindIII或PstI消化的基因组DNA的凝胶转移到尼龙膜，和通过用合成CDV HA特异性探针探查来进行DNA 印迹分析。观察到来自全部3次消化的单或双条带为预期的尺寸：1984bp BamHI，12294bp HindIII和6465和12119bp PstI（见图4），指示CDV合成HA向C5座位的正确插入。

用于扩增合成CDV HA探针的引物：

13220CXL：5’AGGTGTCCACCTCCAACATGGAGT 3’（SEQID NO:10）

13225CXL：5’GAACTGGTCGCCCCTGGAGGCCTT 3’（SEQID NO:11）

【C．表达分析】

蛋白印迹：将1°CEF细胞用P2浓储物以10的MOI感染，及于37℃温育25小时。然后收获细胞及培养上清液。在10%SDS-PAGE凝胶上分离样品蛋白，转移到Immobilon尼龙膜，及探查用兔抗-CDV多克隆抗体（以1/100稀释的来自兔A151,及152的合并血清）。将缀合了过氧化物酶的驴抗-兔抗血清用作第二抗体，并将条带使用鲁米诺试剂可视化。vCP2263.1211在细胞上清液级分中在73kDa显示非常弱的单条带，但在细胞沉淀级分中无CDV特异性条带被检测到（见图5）。

免疫噬斑：对于vCP2263.1.2.1.1，群的同质性是100%，如通过免疫噬斑测定，使用兔抗-CDV抗体证明（见图6）。

【D．序列分析】

通过C5座位侧接臂和CDV合成HA插入子的PCR扩增和序列分析来进行P3浓储物基因组DNA的更详细分析。引物7931DC和7932DC，位于ALVAC基因组中C5座位的臂之外，用于扩增整个C5L-CDV合成HA-C5R片段。结果显示，ALVAC的CDV合成HA和C5L和C5R的序列是正确的。

用于PCR扩增的引物：

7931DC：5’GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT 3’（SEQ IDNO:12）

7932DC：5’TGATTATAGCTATTATCACAGACTC 3’（SEQ IDNO:13）

含有C5臂，H6启动子和CDV合成HA的侧接引物7931DC和7932DC的DNA序列指定为SEQ ID NO:14。

【实施例4：含有插入ALVAC-vCP2391的C3座位的H6p合成密码子优化的狗GM-CSF基因的ALVAC重组体的产生和表征】

【A．vCP2391的产生】

供体质粒pJSY2218.1含有密码子-优化的狗GM-CSF基因（SEQID NO:3）。将原代鸡胚胎成纤维细胞（1°CEF）用于体外重组。将用辣根过氧化物酶(HRP)-标记的狗GM-CSF特异性探针的噬斑杂交用于重组选择。

通过1°CEF细胞用10μg的Not I-线性化的供体质粒pJSY2218.1，使用

试剂（Roche）的转染进行IVR。转染的细胞随后感染ALVAC，以10的MOI拯救病毒。24小时之后，收获转染的-感染的细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。基于噬斑转印杂交方法使用用辣根过氧化物酶（HRP）标记的382个碱基的狗GM-CSF特异性探针，根据生产商的流程（Amersham Cat# RPN3001）筛选重组噬斑。2个连续轮的噬斑纯化之后，产生命名为vCP2391.4.4的重组体及通过如对于狗GM-CSF插入子100%阳性和对于C3 ORF是100%阴性的杂交来确认。自第2轮的噬斑纯化选择单噬斑，及扩展以获得P1（1×T25瓶），P2（1xT75瓶）和P3（6×滚瓶）。

【B．基因组分析-DNA印迹】

提取来自vCP2391的基因组DNA，用BamHI，HindIII或Pst I消化和在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。将具有BamHI，HindIII或PstI消化的基因组DNA的凝胶转移到尼龙膜和通过用382个碱基caGM-CSF探针探查来进行DNA印迹分析。多条带观察为预期的尺寸，指示caGM-CSF基因向C3座位的正确插入。

限制酶	片段(bp)
		Bam HI	759816674
Hind III	16344
		Pst I	219169611293

用于扩增狗GM-CSF探针的引物

18071BK：5’GATGTTGAACAGGAAGTCCTTCAGGT 3’（SEQID NO:15）

18073BK：5’GTTCCTGGGCACCGTGGTGTGCAGCA 3’（SEQID NO:16）

【C.表达分析】

蛋白印迹：将原代CEF细胞用vCP2391.4.4的P3浓储物以10的MOI感染，及于37℃温育24小时。然后收获全部培养上清液和细胞。将细胞沉淀用生产自Roche的报告基因测定裂解缓冲剂（Cat.1897675）裂解。用

系统，通过添加抗氧化剂来制备上清液和细胞裂解物。蛋白在

10%Bis-Tris预浇铸的凝胶上分离，然后转移到PVDF膜。将纯化的山羊抗-狗GM-CSF IgG（R&D系统,CatAF1546）用作第一抗体。蛋白印迹检测了自vCP2391.4.4的上清液分泌的~20kDa的主要蛋白和~17kDa的少数蛋白（见图7和9）。图9显示粗产物和上清液中GM-CSF的良好表达。

【D．序列分析】

通过C3座位的侧接臂和狗GM-CSF插入子的PCR扩增和序列分析来进行vCP2391.4.4的P3浓储物基因组DNA的更详细分析。将引物8103JY和8104JY，位于ALVAC基因组中C3座位的臂之外，用于扩增整个C3L-caGM-CSF-C3R片段。结果显示，ALVAC的狗GM-CSF插入子和C3L和C3R的序列是正确的（SEQ ID NO:19）。

用于C3L-狗GM-CSF-C3R盒的PCR扩增的引物：

8103JY：5’GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG 3’（SEQ ID NO:17）

8104JY：5’TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG 3’（SEQID NO:18）

【实施例5：含有插入vCP2263-vCP2392的C3座位的H6p合成密码子优化的狗GM-CSF基因的ALVAC重组体的产生和表征】

将ALVAC C5 H6p CDV（vCP2263.1.2.1.1）用作亲本病毒。将含有密码子-优化的狗GM-CSF基因的pJSY2218.1用作供体质粒。将原代鸡胚胎成纤维细胞（1°CEF）用于体外重组。将用辣根过氧化物酶(HRP)-标记的狗GM-CSF特异性探针的噬斑杂交用于重组选择。

通过1°CEF细胞用10μg的Not I-线性化的供体质粒pJSY2218.1，使用

试剂（Roche）的转染来进行IVR。转染的细胞随后感染vCP2263.1.2.1.1，以10的MOI拯救病毒。24小时之后，收获转染的-感染的细胞，超声处理及用于重组病毒筛选。基于噬斑转印杂交方法，使用用辣根过氧化物酶（HRP）标记的382个碱基的狗GM-CSF特异性探针（实施例4），根据生产商的流程（Amersham Cat#RPN3001）筛选重组噬斑。4个连续轮的噬斑纯化之后，产生命名为vCP2392.5.3.1.1的重组体，及通过如对于狗GM-CSF插入子是100%阳性和对于C3 ORF是100%阴性的杂交来确认。自第4轮的噬斑纯化选择单噬斑，及扩展以获得P1（1×T25瓶），P2（1xT75瓶）和P3（6×滚瓶）。

【A．基因组分析-DNA印迹】

提取来自vCP2392的基因组DNA，用BamHI，HindIII或Pst I消化和在0.8%琼脂糖凝胶上电泳。将具有BamHI，HindIII或PstI消化的基因组DNA的凝胶转移到尼龙膜和通过用382个碱基的狗GM-CSF探针探查来进行DNA印迹分析（实施例4）。多条带观察为预期的尺寸，指示狗GM-CSF基因向C3座位的正确插入。

限制酶	片段(bp)
		Bam HI	759816674
Hind III	16344
		Pst I	219169611293

【B．表达分析】

蛋白印迹：将原代CEF细胞用vCP2392.5.3.1.1的P3浓储物，以10的MOI感染，及于37℃温育24小时。然后收获全部培养上清液和细胞。将细胞沉淀用生产自Roche的报告基因测定裂解缓冲剂（Cat.1897675）裂解。用

系统，添加抗氧化剂来制备上清液和细胞裂解物。蛋白在

10%Bis-Tris预浇铸的凝胶上分离，然后转移到PVDF膜。将纯化的山羊抗-狗GM-CSF IgG（R&D系统,CatAF1546）用作第一抗体。蛋白印迹检测了自vCP2392.5.3.1.1的上清液分泌的~20kDa的主要蛋白和~17kDa的少数蛋白（见图8和9）。CDV HA表达的结果显示于图10。结果显示CDV HA蛋白用vCP2392的良好表达。

【C．序列分析】

通过C3座位的侧接臂和狗GM-CSF插入子的PCR扩增和序列分析来进行vCP2392.5.3.1.1的P3浓储物基因组DNA的更详细的分析。引物8103JY和8104JY（见实施例4），位于ALVAC基因组中C3座位的臂之外，用于扩增整个C3L-caGM-CSF-C3R片段。结果显示，ALVAC的狗GM-CSF插入子和C3L和C3R的序列是正确的。

【实施例6：在狗中通过攻击比较重组金丝雀痘-狗CDV HA和狗GM-CSF（vCP2392）和重组金丝雀痘-狗CDV HA（vCP2263）的功效】

使用18只无CDV特异性病原体的狗。将4月龄雄性和雌性狗分组进3组，及如显示于下表1免疫接种及采样。

表1

-SN：血清中和测试

●SLAM：信号传导淋巴细胞-活化分子

●CMI：细胞介导的免疫

在下列天进行临床检查：（V1）0，0+4/5h，1，2，（V2）28，28+4/5h，29，30或直到全部症状消失。临床监控包括监控狗的一般的状态，诸如直肠温度，注射位点的触诊疼痛，局部膨胀，局部热，瘙痒症和局部脱发。

在平管中采样用于在下列天进行血清学分析：0，13，27，35，42，56和70。进行2种类型的SN。使用异源于vCP2392和vCP2263中的CDV HA插入子的CDV株（BA5）。结果显示于图11。结果显示，组A中的滴度高于组B中的滴度（1log 10），在D35，D42和D70分别为p=0.009，p=0.019和p=0.03。在D42的组B中，有3只狗的滴度<0.8log10PD50。进行使用同源于vCP2392和vCP2263中的CDVHA插入子的vero SLAM细胞和CDV株5804-GFP的第2类型的SN。结果显示于图12。结果显示，组A滴度高于组B滴度。结果也显示，组B中有2只狗在D70具有0.48的滴度，而在组A中全部狗具有0.72或更大的血清学滴度。

在肝素化的管中采样用于在下列天进行CMI监控：13，42和70。在用核转染的PBMC的PBMC（外周血单核细胞）再刺激后，使用ELIspot测定监控IFNγ的产生。计算抗原特异性IFNγ产生细胞的频度。数据显示于图16。

总结：相比vCP2263（CDV HA），vCP2392（CDV HA+狗GM-CSF）诱导显著更高血清学应答。

【实施例7：vCP2392对其他疫苗抗原的免疫原性的影响】

此研究设计为研究是否vCP2392（共表达CDV HA和狗GM-CSF）具有对其他疫苗抗原的免疫原性的正面影响。

以大大低于正常商业剂量的剂量（2.6log₁₀ TCID50）使用修饰的活狗细小病毒疫苗。将12只SPF（无特定病原体）雄性和雌性小猎犬（2～3月龄）随机分配进2组，及如显示于下表2免疫接种。

表2

*通过SC途径对右肩（D0）然后对左肩（D28）2ml（PBS中vCP+MLV-CPV2）

＊＊修饰的活病毒-狗细小病毒2型（MLV-CPV2）

临床监控包括一般的状态，直肠温度，注射位点的触诊疼痛，局部膨胀，局部热和瘙痒症。接收的疫苗被组A和B中的狗良好耐受。基于临床研究结果，vCP2392（CDV HA+GM-CSF）和vCP2263（CDVHA）与MLV-CPV2组合被认为安全。

滴定血清的针对CPV2和CDV的抗体（在血清中和测试中使用同源和异源CDV）。

图17显示CVP2 ELISA结果。在研究起始，组A和B中无动物具有针对CPV2的抗体。在组B中，仅1只狗在疫苗接种之后产生抗体应答。自D28往后检测到此应答。在组A中，6只狗中的4只显示高抗体应答和在一些狗中早至D7就检测到应答。无狗在D28的第2注射之后显示追加应答。对应答者的发病率的统计学分析显示，组显著不同（p=0.046）。结果指示，vCP2392中包括的GM-CSF插入子对CPV2血清学具有正面效应。

图18显示CDV同源SN（血清中和）测试的结果。在疫苗接种之前，无动物具有针对CDV的抗体。在D35和D56组A和B滴度类似。但是，来自组A的5/6只狗在D28具有抗体，而在组B中无狗在D28具有抗体。在D42，组A中血清学滴度显著更高（Student氏t检验,p=0.01）。

图19显示CDV异源SN测试的结果。在疫苗接种之前，无动物具有针对CDV的抗体。在第35，42和56天，组A中的抗体滴度趋向高于组B滴度。在D56，组A中的抗体滴度显著高于组B（Wilcoxon,p=0.016）。

研究结果显示，2.6log₁₀ TCID50的MLV-CPV2每狗的剂量在最小剂量下，可赋予血清转化，如显示于组B的结果。有趣的是和意外地，金丝雀痘载体（vCP2392）中包括GM-CSF诱导了不同抗体应答，如显示于组A的结果。结果展示，金丝雀痘载体中caGM-CSF的存在可对注射进相同的位点的另一疫苗组分的免疫原性具有效应。

*****

由此描述了本发明的详细优选的实施方式，需知，由以上段落定义的发明不限于以上说明书中描述的特定细节，许多其明显的改变是可能的，而不离开本发明的精神或范围。

本申请引用的文献中引用的或参考的全部文献，及本文引用的或参考的全部文献（“本文引用的文献”），及本文引用的文献中引用的或参考的全部文献，连同对于本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何生产商的使用说明，描述，产物说明书，及产品书页通过引用并入本文，且可在本发明的实践中采用。