CN114480441B - 一段核苷酸序列及其表达重组蛋白纳米颗粒在犬瘟热病毒疫苗的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于犬瘟热病毒蛋白疫苗开发领域，公开了一段核苷酸序列(ΔH)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。SEQ ID NO.1与相应载体基因连接，例如，铁蛋白基因(ΔF)，形成基因片段ΔH‑F，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.2与原核蛋白表达载体系统重组后，表达可溶性rH‑F纳米颗粒，可应用于预防犬瘟热病毒的疫苗。

Description

一段核苷酸序列及其表达重组蛋白纳米颗粒在犬瘟热病毒疫 苗的应用

技术领域

本发明属于犬瘟热病毒蛋白疫苗开发领域，尤其涉及一段核苷酸序列、及其与载体基因重组表达蛋白纳米颗粒，以及在犬瘟热病毒疫苗的应用。

背景技术

目前，犬瘟热是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)，引起的一种接触式传染病，该病不受地区范围限制，在世界各地均有被发现。CDV的传统宿主主要包括一些食肉类动物，如：犬科、猫科、鼬科和浣熊科等。但是随着病毒自身的不断传播和进化以及商用疫苗的广泛应用，CDV已经在近几年感染至海豹、野猪以及非人类灵长类动物等野生动物的身上。感染CDV的初期临床表现主要为严重脱水、进食困难、精神低迷等状态。随着感染的持续加重，后期往往会伴随着痉挛和抽搐等病症。由于CDV展现出了极高的病死率，犬类在感染后，如果不接受合理且有效的治疗，病死率可达30％～80％，更有貂的感染致死率甚至达到100％。因此，CDV对于全球的无论是犬类养殖，毛皮动物经济，还是野生动物都是危害极为严重的传染病之一。鉴于犬瘟热治疗的局限性以及后期的不确定性，应对CDV最有效的方法依旧是在早期接种针对犬瘟热的疫苗以达到主动免疫，所以接种疫苗依旧是应对CDV最有效的方式。目前市面上销售的商用犬瘟热疫苗以减毒活疫苗的形式进行免疫，虽然能为所接种的动物提供针对目前存在的CDV野生毒株有效的保护，但仍然有大量的地区爆发犬瘟热的案例，其中不乏已经接种的动物，并且传播物种仍在不断扩大。考虑到犬瘟热的高致死率和强传播性，亟需一种高效、无害、易大规模制备的疫苗以及全新的免疫方式。

CDV基因组全长15690nt，是由6个非分段基因组成的负链RNA基因组，均含有开放阅读框，分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和聚合酶蛋白(L)。其中H蛋白是CDV致病的最关键蛋白，直接影响CDV的感染能力，也基于此对于H蛋白的亚单位疫苗是新型CDV疫苗的研究热点。H蛋白编码605个氨基酸，为囊膜表面Ⅱ型糖蛋白。H蛋白也是所有蛋白中分子量差异最大的蛋白，目前市面上最常用的Onderstepoort株减毒活疫苗的H蛋白分子量就偏低，与新分离出的野生毒株的H蛋白存在明显差异，这也使得对于传统减毒活疫苗所能提供的保护产生担忧。H蛋白的序列中单个氨基酸的突变或者是移码就有可能造成CDV进行跨物种传播。

铁蛋白(Ferritin)是一个含有24个亚基，大小为450kDa的储铁蛋白，因此它也广泛存在于所有细胞中。其主要作用是包裹在铁和一些磷酸盐外部形成铁核参与到血红蛋白的合成、体内酶的合成和一些代谢免疫等功能。

不同来源的铁蛋白虽然从一级结构来看差距很大，但其所组成的空间结构都是大致相同的，Ferritin所展现出的非常适合抗原呈递和免疫刺激的纳米颗粒的原因就在于它有着极强的组装能力，可以自发的组成为24聚体，以此形成高度重复和有序的对称结构。将目标抗原插入后并不影响Ferritin的自组装能力并且可以很好的将目标抗原展示在它的球体表面，从而可以更好的呈递目标抗原。此外自组装的Ferritin可以形成8个三重对称或者六个四重对称的亚基，这对天然构象为三聚体或者四聚体的抗原提呈也有着自身的优势。同时考虑到表位抗原序列过短，可能存在免疫原性差的特点，利用24聚体的形式进行免疫，在自身低免疫原性的同时可以更为有效的诱导针对抗原表位的免疫反应，提高疫苗的效力。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有的商用犬瘟热疫苗以减毒活疫苗的形式进行免疫，但仍有大量地区爆发犬瘟热的案例，其中不乏已经接种的动物，并且传播物种仍在不断扩大。

(2)目前市面上最常用的Onderstepoort株减毒活疫苗的H蛋白分子量偏低，与新分离出的野生毒株的H蛋白存在明显差异。

解决以上问题及缺陷的难度为：

CDV为负链RNA病毒，因此其编码的RNA聚合酶的保真程度较低，导致CDV H基因组易发生突变，然而此类突变往往不可预测且无法通过减毒疫苗提供真正有效的广谱型保护。

解决以上问题及缺陷的意义为：

针对CDV高致死率和强传播性，对经济动物具有的巨大危害，需要储备长期广谱疫苗进行防控。目前CDV疫苗多为减毒活疫苗形式，但由于病毒变异、疫苗生产涉及感染性风险等因素，急需研制开发广谱、无危害、易大规模制备的新型CDV疫苗。项目拟研制一种安全、易于大规模制备，且成本低廉的新型纳米CDV候选疫苗，并可诱导长效的广谱保护，为经济动物饲养和生产提供重要防疫手段。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一段核苷酸序列(ΔH)、串联铁蛋白基因(ΔF)，重组表达载体后，制备纳米颗粒蛋白疫苗rH-F，并应用于CDV预防。

本发明是这样实现的，一段核苷酸序列(ΔH)，所述ΔH的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述ΔH串联载体基因(ΔF)，得到目标基因片段ΔH-F，所述ΔH-F的构建方法包括：

将所述ΔH与ΔF串联，得到目标基因片段ΔH-F，所述ΔF的核苷酸序列为SEQ IDNO.2。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述ΔH-F构建得到的重组质粒(pΔH-F)，所述pΔH-F的构建方法包括：

将所述ΔH-F插入到表达载体中，分别经限制性内切酶酶切后经酶切产物胶回收和T4连接酶连接，得到pΔH-F；

其中，所述表达载体包括pET-20b。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述pΔH-F转化得到的重组细菌，所述重组菌的构建方法包括：将所述pΔH-F转化入BL21细胞中，得到重组细菌。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述重组细菌可溶性表达重组蛋白rH-F的方法，所述可溶性表达rH-F的方法包括：

(1)将所述重组细菌接种于含有氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中培养，得到培养物；

(2)当步骤(1)得到的培养物的OD600值为0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷混合后诱导14～18h，经4000rpm，30分钟离心收取菌体；

(3)将步骤(2)得到的菌体经离心后与TBS缓冲液混合进行冰浴超声破碎，将得到的超声物离心，得到包含所表达的可溶性rH-F的上清溶液。

进一步，所述液体培养基中异丙基硫代半乳糖苷的浓度为0.5mmol/L，所述诱导温度为18℃。

进一步，所述缓冲液的组分包括50mM Tris和150mM NaCl，所述缓冲液的pH值为8.0。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述rH-F纳米颗粒的获得方法，所述rH-F纳米颗粒的获得方法包括：

(1)将所述rH-F进行镍柱纯化，收集洗脱液含300mM咪唑时的蛋白样品；

(2)将步骤(1)得到的蛋白溶液置于透析袋中，于4℃的条件下搅拌透析12～14h，得到无咪唑的rH-F纳米颗粒。

(3)将步骤(2)得到的rH-F纳米颗粒加入至浓缩超滤管中，于4℃，3000rpm的条件下离心，得到高浓度的rH-F纳米颗粒。

进一步，所述洗脱液组分包括50mM Tris和150mM NaCl和500mM咪唑，所述洗脱液的pH值为8.0。

本发明的另一目的在于提供一种所述rH-F纳米颗粒，并在CDV疫苗中应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的一段核苷酸序列，可表达蛋白纳米颗粒，并应用于CDV新型疫苗。

本发明涉及一种新型CDV纳米颗粒疫苗，公开了一段核苷酸序列，串联铁蛋白基因后，可自组装形成重组蛋白纳米颗粒，可应用于CDV疫苗，为新型CDV疫苗提供新的思路和基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的可溶性表达rH-F的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的pET-20b载体图谱。

图3是本发明实施例提供的目标蛋白表达和纯化效果示意图；

图中：M为蛋白质分子量标志物；Y是超声破碎后的菌液，1和2是50mM咪唑洗脱产物；3和4是150mM咪唑洗脱产物；5是300mM咪唑洗脱产物。

图4是本发明实施例提供的目标蛋白非变性鉴定结果示意图；

图中：M为蛋白质分子量标志物；1是铁蛋白；2是rH-F。

图5是本发明实施例提供的rH-F纳米颗粒的动态光散射检测结果示意图。

图6是本发明实施例提供的rH-F纳米颗粒的透射电镜观察结果图。

图7是本发明实施例提供的抗体微中和检测中细胞的形态示意图。

图7A是本发明实施例提供的正常形态的Vero示意图。

图7B是本发明实施例提供的细胞病变效应(cpe)的Vero示意图。

图8是本发明实施例提供的半数抑制剂量的中和抗体效价示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一段核苷酸序列搭载铁蛋白基因后，通过表达载体形成蛋白纳米颗粒疫苗，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的可溶性表达rH-F的方法包括以下步骤：

S101，将所述重组细菌接种于LB液体培养基中培养，得到培养物；

S102，当S101得到的培养物的OD600值为0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷混合后诱导14～18h，收取菌体；

S103，将S102得到的菌体经离心后与缓冲液混合进行冰浴超声破碎，将得到的超声物离心，得到包含所表达的可溶性rH-F的上清溶液。

图2为pET-20b载体图谱；

图3为目标蛋白表达和纯化效果；其中，M为蛋白分子量标记物；1和2为50mM咪唑洗脱产物；3和4为150mM咪唑洗脱产物；5为300mM咪唑洗脱产物；

图4为目标蛋白非变性鉴定，其中M为蛋白分子量标记物；1为空载Ferritin；2为目标rH-F；

图5为rH-F纳米颗粒的动态光散射检测；

图6为rH-F纳米颗粒的透射电镜观察；

图7为抗体微中和检测细胞的形态；

图8为半数抑制剂量的中和抗体效价。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1：大肠杆菌制备rH-F纳米颗粒

本发明涉及利用大肠杆菌系统重组表达rH-F。因表位序列长度过短，存在表征困难，免疫原性较差的缺点。本发明采用将目标核酸序列(ΔH)串联Ferritin基因(ΔF)，利用Ferritin自身高效自组装的特性形成可以在表面展示目标抗原的纳米颗粒，进而提高抗原表位的免疫原性。经纯化、透析、浓缩后的蛋白在常规条件下便能形成稳定的24聚体，形态良好，颗粒均一，大小略大于天然铁蛋白颗粒，为研究新型CDV疫苗提供基础，进一步解决宠物犬及毛皮类经济动物养殖所面临的问题。

设计目的：通过将设计的重组蛋白构建至原核表达载体，利用大肠杆菌表达高效自组装的目标蛋白，形成展示目标抗原表位的纳米颗粒，从而为CDV新型疫苗提供可靠的思路和方法。

设计方案：为实现上述设计目的。本发明：(1)依据大肠杆菌的密码子偏爱性，设计一段核酸序列ΔH。(2)将所设计的ΔH串联Ferritin载体基因(ΔF)序列，得到ΔH-F，将所述ΔH-F与pET-20b载体分别经限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切后，经T4连接酶连接，得到重组表达载体质粒pΔH-F。(3)将pΔH-F转化入BL21(DE3)细胞中，得到重组细菌。(4)将重组细菌进行培养，并诱导表达重组蛋白，菌株培养基中均加入终浓度为0.5mmol/L IPTG的诱导剂，18℃下诱导14h后收集菌体。(5)将得到的菌体与缓冲液混合后进行冰浴超声破碎，将得到的超声物离心，得到的上清包含重组蛋白rH-F。(6)经过亲和层析纯化方法得到的重组蛋白rH-F置于透析袋中透析，终获得展示ΔH蛋白的纳米颗粒，此纳米颗粒直径略大于空载Ferritin，且具有良好的免疫原性，可诱导产生中和抗体，抗体效价能达到2^9.86。

本发明所述ΔH具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体如下所示：

ATGCCCGCCCTAGTTTCTGAGAAGCAGGAGGAACAGAAAAACTGCCTGGAAAGCGCCTGCCAGAGAAAGTCTTACCCTATGTGCAACCAGACATCCTGGGAGCCTTTCGGAGGCGGACAGCTGCCTAGCTATGGCAGACTGACCCTG本发明中，所述ΔF序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：

CTGAGCAAGGACATCATCAAGGACATCATCAAGCTGCTGAACGAGCAAGTGAATAAGGAGATGAACAGCTCCAATCTGTACATGTCTATGTCTAGCTGGTGCTATACACACAGTCTGGACGGAGCAGGCCTGTTCCTGTTTGATCACGCCGCCGAGGAGTATGAGCACGCCAAGAAGCTGATCATCTTTCTGAATGAGAACAATGTGCCTGTGCAGCTGACCTCTATCAGCGCCCCAGAGCACAAGTTCGAGGGCCTGACACAGATCTTTCAGAAGGCCTACGAGCACGAGCAGCACATCTCCGAGTCTATCAACAATATCGTGGACCACGCCATCAAGTCCAAGGATCACGCCACCTTCAACTTTCTGCAGTGGTACGTGGCCGAGCAGCACGAGGAGGAGGTGCTGTTTAAGGACATCCTGGATAAGATCGAGCTGATCGGCAATGAGAACCACGGGCTGTATCTGGCTGACCAGTATGTCAAGGGCATCGCAAAATCACGCAAATCAGGCGGAGGAGGAAGCGGAGGGGGAGGCTCTGGAGGCGGCGGATCTCATCATCACCATCACCAT

应用序列表达的rH-F可形成纳米颗粒且具有良好的免疫活性。

实施例2：原核表达rH-F的方法

本发明实施例提供了一种原核表达rH-F蛋白的方法，将ΔH与ΔF基因串联得到目标基因片段ΔH-F，ΔH-F搭载表达载体pET-20b，可以获得pΔH-F，经过转化，可获得能够自组装成rH-F纳米颗粒，且具有高度有序和重复的对称结构，以及拥有良好免疫原性。其具体步骤如下：

1、pΔH-F的构建

1.1ΔH-F的构建

参考ΔH的基因序列，设计上下游引物，串联Ferrritin基因ΔF，构建ΔH-F。

表1.PCR体系

1.2pΔH-F构建

将ΔH-F和载体pET-20b分别经限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，反应条件为37℃反应1h，分别回收pET-20b和ΔH-F基因的双酶切产物，再用T4连接酶25℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体过程详见试剂盒说明书(购自北京全式金生物技术有限公司)。

表2双酶切体系

表3pΔH-F连接体系

pET-20b载体携带氨苄青霉素抗性基因，转化后涂布于含50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB琼脂平板，37℃培养过夜。随机挑取平板上的单菌落，接种于具有卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃培养过夜，经酶切鉴定获得阳性克隆，阳性质粒命名为pΔH-F。

2、rH-F在大肠杆菌中的表达

2.1目的重组蛋白rH-F的表达

pΔH-F转化的大肠杆菌涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取阳性菌落接种于含50μg/mL氨苄青霉素的2mL LB液体培养基中，37℃下220rpm/min过夜，将其以1:200的比例接种于1L LB液体培养基(50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm/min培养至吸光度OD600值达到0.6～0.8时加入终浓度为0.5mmol/mL的IPTG，18℃过夜诱导表达目的蛋白rH-F。6000rpm/min离心30min收集菌体。按照1:10向菌体中加缓冲液(50mMTris，150mM NaCl，pH 8.0)悬浮后，进行冰浴超声破碎，有效时间为30min，间歇5s，破碎后16000rpm/min离心20min。分离上清液和沉淀，收集上清，进行纯化。

2.2rH-F的纯化、透析和浓缩

将上述获得的上清溶液经0.45μm滤膜过滤后，镍柱吸附后，梯度洗脱，收集60％比例时的洗脱样品置于透析袋内与平衡液置换透析，通过改变透析液的盐离子浓度，4℃搅拌过夜。将透析后的样品置于100kDa规格的超滤管中，4000rpm/min离心30分钟，收集离心管内的蛋白样品，获得rH-F纳米颗粒。

实施例3：rH-F纳米颗粒的验证

1、rH-F纳米颗粒的表征

1.1rH-F的表达验证

SDS-PAGE分析表达产物，重组蛋白纯化后进行高温变性处理，在25kDa有清晰条带，与预期大小相符，说明rH-F的表达，非变性SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白，在250kDa之上有清晰条带，说明所表达的目的蛋白已经完成了自组装，形成多聚体。

1.2rH-F纳米颗粒的形态验证

动态光散射(DLS)检测：将上述纯化获得的rH-F通过纳米粒度仪进行检测，根据DLS结果显示，本发明中所获得的rH-F纳米颗粒纯度高，大小均一，结构完整。

透射电镜(TEM)检测：将上述纯化获得的rH-F，经2％磷钨酸负染，利用TEM观察形态，rH-F纳米颗粒直径约为20nm，大小均匀，呈现为中空形态，结果显示，rH-F自发组装成直径约为25nm的粒子，且界限清晰，颗粒均一度较高，与Ferritin的天然颗粒形态相似。

2、rH-F纳米颗粒的免疫活性

中和活性(Na)检测：取96孔微型板，Vero细胞铺板，待细胞长至80％时更换为、50μL/孔病毒培养基。rH-F纳米颗粒免疫后的小鼠血清在Eppendorf管内用病毒培养基进行5倍稀释，向后连续2倍比稀释至640倍，向每管内加入等体积的100TCID₅₀的CDV-11，混合后37℃感作2h，将混合物50μL/孔加入准备好的96孔微型板，做8个复孔，37℃培养48h并每隔12h进行观察细胞状态，最终记录出现细胞病变效应(cpe)的孔，计算得出血清中中和抗体效价。

经rH-F纳米颗粒免疫后的小鼠产生具有针对CDV的中和抗体，以PBS为阴性对照，病毒为阳性对照，检测血清中的抗体中和效价。结果显示免疫rH-F后可诱导小鼠产生针对CDV的中和抗体，效价可达2^9.86，阴性对照无cpe效应，阳性对照产生cpe效应。这说明了此rH-F纳米颗粒具有良好的免疫活性，能够对CDV感染提供保护作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长春维石检测技术服务有限公司

<120> 一段核苷酸序列及其表达重组蛋白纳米颗粒在犬瘟热病毒疫苗的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcccgccc tagtttctga gaagcaggag gaacagaaaa actgcctgga aagcgcctgc 60

cagagaaagt cttaccctat gtgcaaccag acatcctggg agcctttcgg aggcggacag 120

ctgcctagct atggcagact gaccctg 147

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgagcaagg acatcatcaa ggacatcatc aagctgctga acgagcaagt gaataaggag 60

atgaacagct ccaatctgta catgtctatg tctagctggt gctatacaca cagtctggac 120

ggagcaggcc tgttcctgtt tgatcacgcc gccgaggagt atgagcacgc caagaagctg 180

atcatctttc tgaatgagaa caatgtgcct gtgcagctga cctctatcag cgccccagag 240

cacaagttcg agggcctgac acagatcttt cagaaggcct acgagcacga gcagcacatc 300

tccgagtcta tcaacaatat cgtggaccac gccatcaagt ccaaggatca cgccaccttc 360

aactttctgc agtggtacgt ggccgagcag cacgaggagg aggtgctgtt taaggacatc 420

ctggataaga tcgagctgat cggcaatgag aaccacgggc tgtatctggc tgaccagtat 480

gtcaagggca tcgcaaaatc acgcaaatca ggcggaggag gaagcggagg gggaggctct 540

ggaggcggcg gatctcatca tcaccatcac cat 573

Claims (1)

1.一段核苷酸序列△H在制备犬瘟热病毒疫苗中的应用，其特征在于，所述△H的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，并且所述△H用于串联转铁蛋白(Ferritin)构建△H蛋白的纳米颗粒。

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