CN116041448A - 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒免疫原性物质，其包含源自免疫优势毒株的第一抗原和源自流行优势毒株的第二抗原，所述抗原分别包含S蛋白的受体结合区或受体结合区的一部分，其中，所述免疫优势毒株选自新型冠状病毒WH01株和贝塔(Beta)株中的至少一种，所述流行优势毒株选自新型冠状病毒德尔塔(Delta)株和奥密克戎(Omicron)株中的至少一种。本发明的新型冠状病毒免疫原性物质具有较高的免疫原性，对于不同的毒株均能够表现出显著提高的免疫效果。

Description

新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用
发明领域
本发明属于生物医药工程技术领域，涉及新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致冠状病毒疾病(COVID-19)，常见体征有发热、咳嗽、咽痛等，在较严重病例中，感染可导致呼吸困难、低氧血症、急性呼吸窘迫综合征，甚至死亡。新型冠状病毒可以通过呼吸道和飞沫途径在人与人之间传播，也存在通过空气和消化道传播的可能。
SARS-CoV-2病毒颗粒包含4个结构蛋白，即刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)。研究发现，只有针对S蛋白的抗体有中和活性，因此目前研发中的疫苗均包含S蛋白或其组分。其中，S蛋白的受体结合区被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。受体结合区作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2通过其受体结合区与宿主细胞受体hACE2结合而进入细胞。
新型冠状病毒在传播过程中不断进化，目前已检测到多个代表性突变株。目前已开发或开发中的新型冠状病毒抗原大多只能针对一种毒株，无法产生针对不同毒株的中和抗体。CN114369172A中分别设计了原型毒株RBD二聚体疫苗，Beta株RBD二聚体疫苗以及原型株+Beta株嵌合RBD二聚体疫苗。结果表明，相对于原型毒株RBD二聚体疫苗和Beta株RBD二聚体疫苗，原型株+Beta株嵌合RBD二聚体疫苗诱导了较为均衡的抗体反应。但是从其结果来看，与原型毒株和其它变异株相比，原型株+Beta株嵌合RBD二聚体疫苗对Omicron变异株S蛋白假病毒的中和抗体滴度明显下降，这说明该疫苗对当前流行的Omicron变异株的保护能力欠佳，因此，有必要开发对不同毒株具有更均衡的保护效果的疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒免疫原性物质，其包含不同毒株S蛋白S1亚基的受体结合区，该新型冠状病毒免疫原性物质具有更高的免疫原性，能够激发针对不同毒株的中和抗体的产生，因而能够显著提高免疫效果。
为实现本发明目的，本发明提供了以下技术方案：
一种新型冠状病毒免疫原性物质，其包含源自免疫优势毒株的第一抗原和源自流行优势毒株的第二抗原，各抗原分别包含S蛋白的受体结合区或受体结合区的一部分。
在一些实施方式中，所述免疫优势毒株选自新型冠状病毒WH01株和贝塔(Beta)株中的至少一种。
在一些实施方式中，所述流行优势毒株选自新型冠状病毒德尔塔(Delta)株和奥密克戎(Omicron)株中的至少一种。
在一些实施方式中，所述奥密克戎(Omicron)株包括BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5变异株。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含源自所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株的第三抗原。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含源自所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株的第四抗原。
在一些实施方式中，所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株选自以下毒株：阿尔法(Alpha)株、伽马(Gamma)株、艾普希龙(Epsilon)、截塔(Zeta)株、伊塔(Eta)株、西塔(Theta)株、艾欧塔(Iota)株、喀帕(Kappa)株、拉姆达(Lambda)株、缪(Mu)株等。
在一些实施方式中，各抗原构成组合物，或者各抗原直接相连或通过氨基酸接头连接，例如所述氨基酸接头可以为GGS或多个串联的GGS(G和S分别表示甘氨酸和丝氨酸)。
例如，在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原和第二抗原，第一抗原与第二抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原和第二抗原，第一抗原与第二抗原混合构成组合物。在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒WH01株S蛋白的受体结合区和德尔塔(Delta)株的受体结合区直接相连而形成；在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒WH01株S蛋白的受体结合区和奥密克戎(Omicron)株的受体结合区直接相连而形成；在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒贝塔(Beta)株S蛋白的受体结合区和德尔塔(Delta)株的受体结合区直接相连而形成；在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质由新型冠状病毒贝塔(Beta)株S蛋白的受体结合区和奥密克戎(Omicron)株的受体结合区直接相连而形成。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原和第三抗原，第一抗原、第二抗原和第三抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原和第三抗原，第一抗原与第二抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原，该融合抗原与第三抗原混合构成组合物。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原和第三抗原，第一抗原、第二抗原和第三抗原混合构成组合物。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原。在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，第一抗原与第二抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原，第三抗原与第四抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原，两种融合抗原混合构成组合物。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，第一抗原、第二抗原和第三抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原，该融合抗原与第四抗原混合构成组合物。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，第一抗原与第二抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接形成融合抗原，该融合抗原与第三抗原和第四抗原混合构成组合物。在另一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原，第一抗原、第二抗原、第三抗原和第四抗原混合构成组合物。
在本发明中，第一、第二、第三和第四仅用于表示抗原的不同种类，并不表示各抗原之间存在任何顺序。本发明中抗原的种类和数量也没有限制，本领域技术人员可以根据广泛传播的毒株以及抗原抗体的交叉反应确定合适的抗原种类和数量。
在一些实施方式中，所述抗原各自包含至少8个半胱氨酸，且半胱氨酸的数量为偶数。
在一些实施方式中，源自WH01株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自贝塔(Beta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自德尔塔(Delta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ IDNO:62所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQ ID NO:19,20,28,29,47,48,51-55中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗原还包含S蛋白的S1亚基中的N端结构域(NTD)。
在一些实施方式中，所述N端结构域位于所述第一抗原和/或所述第二抗原的氨基酸序列的N端。
在一些实施方式中，源自WH01株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自贝塔(Beta)株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自德尔塔(Delta)株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，源自奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.2变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQ ID NO:22,23,30,49,50,56-59中任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含免疫球蛋白的Fc结构域，优选地，所述免疫球蛋白为人源IgG。
在一些实施方式中，所述Fc结构域位于所述新型冠状病毒免疫原性物质的氨基酸序列的C端，优选地，人源IgG Fc结构域包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含Foldon结构域。Foldon结构域/蛋白来源于T4噬菌体纤维蛋白的C-端，由27个氨基酸组成，具有促使目标蛋白发生非共价寡聚以形成三聚体的功能。
在一些实施方式中，所述Foldon结构域位于所述新型冠状病毒免疫原性物质的氨基酸序列的C端，优选地，Foldon结构域包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQ ID NO:26,27,60,61中任一项所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种制备所述新型冠状病毒免疫原性物质的方法，包括以下步骤：
利用编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的核苷酸序列构建重组表达质粒；
将构建的重组表达质粒转化宿主菌，筛选正确的重组表达质粒；
利用筛选的重组表达质粒转染表达系统的细胞，表达后收集上清并纯化得到新型冠状病毒免疫原性物质。
在一些实施方式中，所述表达系统的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地，所述哺乳动物细胞包括293T细胞或CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
本发明还提供了一种编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的核苷酸序列、一种包含上述核苷酸序列的重组载体、一种携带有上述重组载体的表达系统细胞。
本发明还提供了一种所述新型冠状病毒免疫原性物质、编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的重组载体、携带有所述重组载体的表达系统细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明还提供了一种新型冠状病毒蛋白疫苗，包括所述新型冠状病毒免疫原性物质和佐剂。
在一些实施方式中，所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂、MPL佐剂、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种，优选为AS03佐剂或MF59佐剂。
本发明还提供了一种新型冠状病毒DNA疫苗，其包含编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的DNA序列。
本发明还提供了一种新型冠状病毒mRNA疫苗，其包含编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的mRNA序列。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明的新型冠状病毒免疫原性物质，其包含来自免疫优势毒株和流行优势毒株的至少两种抗原，能够诱导产生针对不同毒株的中和抗体，实验表明，本发明的新型冠状病毒免疫原性物质具有较高的免疫原性和良好的交叉保护效果，对于不同的毒株均能够诱导产生均衡的中和抗体水平。
发明人惊奇地发现，以新型冠状病毒的WH01株或贝塔(Beta)株作为基础的免疫优势株，再通过与目前流行的突变株组合，能够产生突出的免疫效果，WH01株或贝塔(Beta)株作为免疫组合的基石，能够针对不同突变株产生抗体，保证免疫的稳定性。特别是在实施例中组合使用WH01株和奥密克戎(Omicron)株、贝塔(Beta)株与德尔塔(Delta)株构建的重组蛋白能够对不同突变株保持均衡的中和抗体GMT水平，同时克服突变株的免疫逃逸，产生突出的免疫效果。本发明的研究还表明，利用编码本发明所述免疫原性物质的mRNA制备的mRNA疫苗对不同毒株同样具有很好的免疫效果。
本发明还研究了不同佐剂与免疫原性物质的组合免疫效果，结果表明当使用水包油乳剂佐剂(尤其是AS03佐剂)时，可以产生较高的中和抗体滴度。
附图说明
图1为S蛋白结构域示意图。
图2为抗原SEQ ID NO:18的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图3为抗原SEQ ID NO:19的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图4为抗原SEQ ID NO:20的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图5为抗原SEQ ID NO:21的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图6为抗原SEQ ID NO:22的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图7为抗原SEQ ID NO:23的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图8为抗原SEQ ID NO:26的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图9为抗原SEQ ID NO:27的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图10为抗原SEQ ID NO:28的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图11为抗原SEQ ID NO:30的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图12为抗原SEQ ID NO:44的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图13为抗原SEQ ID NO:60的SDS-PAGE和Western Blot结果。
图14为抗原SEQ ID NO:61的SDS-PAGE和Western Blot结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中的“免疫优势毒株”是指相对于非免疫优势变异株，其抗原的免疫原性较高并且能够对其他变异株提供较好的交叉保护作用的变异株。
本发明中的“流行优势毒株”是指当前流行的主要变异株，通常可以理解为当前流行的“需要关注的变异株”(Variants of concern，VOC)。VOC的定义可参考世界卫生组织(WHO)的工作定义，即：符合“需要留意的变异株”(Variants of interest(VOI))定义，并且通过比较评估，已被证明与下列一种或多种具有一定全球公共卫生意义的变化相关的SARS-CoV-2变异株：
·传播性增加或COVID-19流行病学方面的有害变化；或者
·毒性增加或临床疾病表现的变化；或者
·公共卫生和社会措施或可用的诊断方法、疫苗和治疗方法的有效性降低。
本发明中的“需要留意的变异株”(Variants of interest(VOI))的定义可参考世界卫生组织(WHO)的工作定义，即：具有以下特征的SARS-CoV-2变异株：
·具有预测或已知会影响病毒特征的基因变化，例如可传播性、疾病严重程度、免疫逃逸、诊断或治疗逃逸；以及
·确认导致多个国家出现重大社区传播或多个COVID-19聚集性病例，且相对流行率上升，病例数不断增加，或其他表明全球公共卫生正面临新风险的明显流行病学影响。
SARS-CoV-2S蛋白的结构如图1所示，其中，1-13为信号肽，14-685为S1亚基，686-1273为S2亚基。其中S1亚基又可以分为NTD(14-303)和CTD(334-527)。319-541为受体结合区，788-806为融合蛋白。13-1213为细胞外结构域，1214-1234为跨膜结构域，1235-1273为细胞内结构域。
实施例1新型冠状病毒免疫原性物质的氨基酸序列
在本发明的实施例中，本发明人利用新型冠状病毒WH01株、贝塔(Beta)株、德尔塔(Delta)株和奥密克戎(Omicron)变异株的受体结合区设计了多种新型冠状病毒免疫原性物质。
其中，源自WH01株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4中的任一项所示的氨基酸序列。其中，SEQ ID NO:1含有8个半胱氨酸，SEQ ID NO:2包含自SEQ ID NO:1的N端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQ IDNO:3包含自SEQ ID NO:1的C端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQ ID NO:4包含分别自SEQ ID NO:1的N端和C端向外延伸的额外序列，含有12个半胱氨酸。
源自贝塔(Beta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8中的任一项所示的氨基酸序列。其中，SEQ ID NO:5含有8个半胱氨酸，SEQ ID NO:6包含自SEQ ID NO:5的N端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQ IDNO:7包含自SEQ ID NO:5的C端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQ ID NO:8包含分别自SEQ ID NO:5的N端和C端向外延伸的额外序列，含有12个半胱氨酸。
源自德尔塔(Delta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任一项所示的氨基酸序列。其中，SEQ ID NO:9含有8个半胱氨酸，SEQ ID NO:10包含自SEQ ID NO:9的N端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQ ID NO:11包含自SEQ ID NO:9的C端向外延伸的额外序列，含有10个半胱氨酸，SEQID NO:12包含分别自SEQ ID NO:9的N端和C端向外延伸的额外序列，含有12个半胱氨酸。
源自奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，源自BA.2变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ IDNO:64所示的氨基酸序列。
在该实施例中，一些免疫原性物质还包括S蛋白的S1亚基中的N端结构域(NTD)。其中，WH01株S蛋白的S1亚基中的N端结构域包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，贝塔(Beta)株S蛋白的S1亚基中的N端结构域包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，德尔塔(Delta)株的S1亚基中的N端结构域包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S1亚基中的N端结构域包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.2变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:65所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列，奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的N端结构域包含SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
在该实施例中，一些免疫原性物质还包括人源IgG Fc结构域以形成二聚体结构，或者一些免疫原性物质还包括Foldon结构域以形成三聚体结构，人源IgG Fc结构域包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，Foldon结构域包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
基于以上序列，本发明人设计了以下抗原的氨基酸序列，按照宿主CHO细胞进行密码子优化获得了相应的DNA序列：
(1)源自WH01株的抗原，由两个SEQ ID NO:1串联构成，其氨基酸序列为SEQ IDNO:18(5’端添加了信号肽SEQ ID NO:41，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ IDNO:31；
(2)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原，由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:19(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:32；
(3)源自贝塔(Beta)株与德尔塔(Delta)株的抗原，由SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:20(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:33；
(4)源自德尔塔(Delta)株的抗原，由两个SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:21(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:34；
(5)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原，其包含WH01株的N端结构域，由SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:22(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:35；
(6)源自贝塔(Beta)株与德尔塔(Delta)株的抗原，其包含贝塔(Beta)株的N端结构域，由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:23(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:36；
(7)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原的Fc二聚体，由SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:16串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:24(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)；
(8)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原的Fc二聚体，其包含WH01株的N端结构域，由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:16串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:25(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)；
(9)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原的Foldon三聚体，由SEQ ID NO:1、SEQID NO:9和SEQ ID NO:17串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:26(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:37；
(10)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原的Foldon三聚体，其包含WH01株的N端结构域，由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:17串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:27(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQID NO:38；
(11)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原，由SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:10串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:28(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:39；
(12)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原，由SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:12串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:29(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)；
(13)源自WH01株与德尔塔(Delta)株的抗原，由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1、SEQID NO:15与SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:30(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)，相应的DNA序列为SEQ ID NO:40。
(14)源自WH01株的抗原，由两个SEQ ID NO:2串联构成，其氨基酸序列为SEQ IDNO:44(5’端添加了信号肽，3’端添加了6个组氨酸)；
(15)源自WH01株的抗原，其包含WH01株的N端结构域，由SEQ ID NO:13和两个SEQID NO:1串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:45；
(16)源自Delta株的抗原，其包含Delta株的N端结构域，由SEQ ID NO:15和两个SEQ ID NO:9串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:46；
(17)源自WH01株与奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的抗原，由SEQ ID NO:1和SEQID NO:42串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:47；
(18)源自贝塔(Beta)株与奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的抗原，由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:42串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:48；
(19)源自WH01株与奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的抗原，其包含WH01株的N端结构域，由SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:42串联构成，其氨基酸序列为SEQ IDNO:49；
(20)源自贝塔(Beta)株与奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的抗原，其包含贝塔(Beta)株的N端结构域，由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:42串联构成，其氨基酸序列为SEQ ID NO:50；
(21)根据主要变异株，进一步设计了源自2-4种变异株的抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO:51-61所示。
以上抗原汇总于表1中：
表1
Figure BDA0003817562530000111
Figure BDA0003817562530000121
实施例2表达载体的构建
将编码以上抗原的DNA序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化后外送合成并克隆至表达载体pWX039中，得到表达载体pWX039-PR-Z，经目标基因测序验证后交付。
以pWX039-PR-Z载体为模板，经PCR扩增、凝胶纯化得到目的基因DNA片段。将纯化后的目的基因DNA片段通过SalI和NotI位点克隆到载体pWX4.1中，得到瞬转表达载体pWX4.1-PR。表达载体pWX4.1-PR通过Sanger测序验证，序列100％正确。
将表达载体pWX4.1-PR转化大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞。挑取转化子液体培养后划LB琼脂平板(含100μg/mL氨苄青霉素)。从平板上挑取一个单克隆接种至300ml LB培养基中扩大培养，采用NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒进行质粒大量制备，并测序验证目的基因。pWX4.1-PR质粒DNA通过测序验证后可用于转染。
实施例3蛋白表达与纯化
蛋白表达
在所有细胞操作过程中，通过温和的旋转混合细胞；避免剧烈的混合/移液。细胞健康是实现最大性能的关键。采用ExpiCHO Expression Medium继代培养和扩增CHO细胞(来自Thermo公司的EXPICHO)，细胞密度达到4×106–6×106个/mL时进行传代。
第-1天：细胞扩增，扩增培养细胞到3×106–4×106个/mL，并允许细胞过夜生长。第0天：转染细胞，测定活细胞密度和存活率，细胞的密度应该达7×106–10×106个/mL,存活率到95-99％进行转染，新鲜的细胞表达培养基，预热至37℃，将细胞稀释至最终密度为5×106个/mL，50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。使用OPti-PRO SFM培养基制备转染试剂和质粒DNA复合物(4℃)，例：1ml细胞准备40μl OPti-PRO SFM添加1ug质粒混匀放置5min；准备40μl OPti-PRO SFM添加6μg PEI试剂混匀放置5min，将质粒与转染试剂等体积混合，室温下孵育1–5分钟，然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃，在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后18-22小时，添加补料，执行标准实验方案。例：1ml细胞添加0.2ml
Figure BDA0003817562530000131
Advanced CHO Feed 1，将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养，8％CO2。转染后6天收集，进行后续纯化。
蛋白纯化
培养基离心，上清添加Ni柱，振荡孵育2h，经过重力空柱管柱进行亲和层析纯化。平衡缓冲液：“PBS”,pH7.4，清洗10CV；清洗缓冲液：“PBS”,pH7.4，包含20mM咪唑，清洗10CV；洗脱缓冲液：“PBS”,pH7.4，包含500mM咪唑，洗脱1CV，重复5次。不同候选抗原的SDS-PAGE&Western Blot图谱如图2-14所示。
实施例4重组蛋白疫苗的制备
将实施例3获得的各重组蛋白用1×PBS缓冲液稀释至80μg/ml，并与等体积AS03佐剂充分混合制得疫苗产品，其中AS03佐剂成分为每0.5ml包括10.69mg的角鲨烯、11.86mg的α-生育酚、4.86mg的聚山梨酯80、3.53mg的氯化钠、0.09mg的氯化钾、0.51mg的磷酸氢二钠、0.09mg的磷酸二氢钾和注射用水。
实施例5重组蛋白疫苗的制备
将实施例3获得的各重组蛋白用1×PBS缓冲液稀释至80μg/ml，并与等体积MF59佐剂充分混合制得疫苗产品，其中MF59佐剂为包含1％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85的柠檬酸缓冲溶液。
实施例6重组蛋白疫苗的制备
将实施例3获得的各重组蛋白用1×PBS缓冲液稀释至80μg/ml，并与等体积铝佐剂充分混合制得疫苗产品，其中铝佐剂为2mg/ml的Al(OH)3。
实施例7重组蛋白疫苗的制备
将实施例3获得的各重组蛋白用1×PBS缓冲液稀释至40μg/ml，并与等体积AS01佐剂充分混合制得疫苗产品，其中AS01佐剂成分为每0.5ml包括50μg的MPL、50μg的QS21、1mgDOPC和0.25mg胆固醇。
实施例8重组蛋白疫苗小鼠免疫实验
利用实施例4-7中制备的疫苗对8～10周龄的BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物技术有限公司)进行分组免疫，每组5只小鼠。分别于0天及21天进行小鼠免疫，每只每次肌肉注射100μl的免疫样品(包含8μg抗原)，并于0天、21天以及第二次免疫后14天采血。采集的血液样品37℃放置1小时，4℃放置1小时，8000r/min离心10分钟，收集血清，-20℃保存，用于假病毒中和检测。
实施例9相同毒株RBD组合对不同类型假病毒的中和实验
采用包含各毒株突变位点的新冠病毒S蛋白构建假病毒，使用基于VSV系统的新冠假病毒中和抗体检测方法(化学发光法)对免疫后分离得到血清进行检测。
在佐剂方面，本发明以RBD(Beta)-RBD(Beta)为抗原并联合不同佐剂免疫小鼠时测得的假病毒中和抗体滴度如表2所示。
表2
Figure BDA0003817562530000151
结果表明，当使用AS03佐剂时，针对D614G、Beta和Omicron BA.1毒株的假病毒中和抗体滴度均显著高于使用Al(OH)3佐剂时的中和抗体滴度。另外的实验表明，当使用MF59佐剂时，抗体滴度与使用AS03佐剂时的抗体滴度相似。在后续的实验中，本发明均采用AS03佐剂。
在抗原方面，本发明首先考察了相同毒株RBD组成的候选抗原针对不同毒株的中和抗体滴度，每组的5个血清样品的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT如表3所示。
表3
Figure BDA0003817562530000152
结果表明，WH01株的RBD组合形成的候选抗原(SEQ ID NO:18)针对WH01株和D614G株假病毒的几何平均滴度较高，但针对Delta株的几何平均滴度有所下降，而针对OmicronBA.1株假病毒的几何平均滴度则显著下降，与之相对，Delta株的RBD组合形成的候选抗原(SEQ ID NO:21)仅针对Delta株假病毒的几何平均滴度较高，针对WH01株、D614G株和Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度则明显下降。这说明当RBD来自同一毒株时，候选抗原对不同毒株的交叉保护能力较差，这一结果与已公开的研究一致。
本发明在进一步的研究中筛选了特定毒株的RBD作为优选抗原组分，其能够提高对非自身毒株的抗体滴度，以获得更均衡的保护效果，该毒株即为本发明所述的免疫优势毒株。
实施例10不同毒株RBD组合对不同类型假病毒的中和实验
该实施例中采用实施例9的方法检测了不同毒株RBD组合针对不同类型假病毒的中和抗体滴度。
(1)免疫优势毒株RBD筛选
当把RBD(Delta)-RBD(Delta)(SEQ ID NO:21)中的一个来源于Delta变异株的RBD替换为来源于Beta变异株或WH01株的RBD时，每组的5个血清样品的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT变化如表4所示。
表4
Figure BDA0003817562530000161
可见，SEQ ID NO:21针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值达到46948，且针对Delta株假病毒的几何平均滴度最大，达到101399，约为平均值的2.2倍，针对Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度仅为22267，约为平均值的47％。
与SEQ ID NO:21相比，Beta株与Delta株的RBD组合形成的候选抗原(SEQ ID NO:20)针对Delta株假病毒的几何平均滴度稍有下降，但针对D614G株和Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度分别提高了2倍和1倍，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值达到65462，且针对D614G株假病毒的几何平均滴度最大，达到92502，约为平均值的1.4倍，针对Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度达到50785，约为平均值的78％。
与SEQ ID NO:21相比，WH01株与Delta株的RBD组合形成的候选抗原(SEQ ID NO:19)针对WH01和D614G株假病毒的几何平均滴度变化不大，但针对Delta株和Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度均降低50％以上，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值仅为29505，且针对Delta株假病毒的几何平均滴度最大，达到42932，约为平均值的1.5倍，针对Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度仅为10520，约为平均值的36％。
因此，总体上看，SEQ ID NO:20针对WH01株、D614G株、Delta株和Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度更为均衡，Beta株的RBD可以提高抗原对非Beta株变异株的中和抗体滴度，因此Beta株可认为是一种免疫优势毒株。
本发明进一步研究了在形成Foldon三聚体时不同毒株RBD的组合对中和抗体滴度的影响。NTD-RBD(BA.2)-RBD(BA.1)-Foldon(SEQ ID NO:60)和NTD-RBD(BA.2)-RBD(WH01)-Foldon(SEQ ID NO:61)的5个血清样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT如表5所示。
表5
Figure BDA0003817562530000171
可见，NTD-RBD(BA.2)-RBD(BA.1)-Foldon针对BA.2假病毒具有很高的中和滴度，达到19802，针对BA.4假病毒也具有一定的抗体滴度，但针对D614G和BA.1的抗体滴度则很低。
而把其中来源于Omicron-BA.1变异株的RBD替换为来源于WH01株的RBD时，不仅针对BA.2假病毒的中和滴度提高，针对D614G和BA.4假病毒的抗体滴度也显著提高，只是针对BA.1的抗体滴度较低，这可能是因为BA.1与BA.2和BA.4的差异较大所致。已公开的文献也已证明，BA.1与BA.2的抗原性有着显著差别(参见Antigenic cartography of SARS-CoV-2reveals that Omicron BA.1and BA.2are antigenically distinct，ANNA Z.MYKYTYNet al.SCIENCE IMMUNOLOGY,23Jun2022)。
上述结果表明，在形成Foldon三聚体的情况下，WH01株的RBD可以提高抗原对不同变异株的中和抗体滴度，因此，在这种情况下WH01株也可认为是一种免疫优势毒株。
与之不同的是，本发明的进一步研究表明，当从阿尔法(Alpha)株、伽马(Gamma)株、艾普希龙(epsilon)、截塔(zeta)株、伊塔(Eta)株、西塔(theta)株、艾欧塔(Iota)株、喀帕(Kappa)株、拉姆达(Lambda)株、缪(Mu)株的受体结合区中选择抗原组分时，所得免疫原性物质仅针对相应毒株假病毒的滴度有所提高，而对于其他突变毒株假病毒的滴度没有明显的提高作用，这表明上述毒株的受体结合区针对其他毒株诱导抗体反应的较弱，不是本发明所述的免疫优势毒株。但这些可作为抗原的额外组分，以进一步提高疫苗对不同毒株的保护效果的均衡性。
已有的研究表明，当免疫原性物质中存在某毒株的受体结合区时，免疫原性物质针对该毒株假病毒的滴度会明显提高。结合新型冠状病毒的流行趋势，本发明将德尔塔(Delta)株或奥密克戎(Omicron)株作为流行优势毒株。本发明的试验研究表明，当免疫原性物质同时包含源自免疫优势毒株和流行优势毒株的受体结合区时，可以针对不同毒株假病毒均表现出较高的滴度，说明其可以对不同毒株均能够产生优异的免疫效果。
(2)添加NTD的影响
本发明进一步考察了在候选抗原中添加NTD的影响。在添加NTD后，各组的5个血清样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT如表6所示。
表6
Figure BDA0003817562530000181
Figure BDA0003817562530000191
如表6所示，当RBD来自同一毒株时，与SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21相比，WH01株的NTD和RBD组合形成的候选抗原SEQ ID NO:45和Delta株的NTD和RBD组合形成的候选抗原SEQ ID NO:46针对不同假病毒的几何平均滴度均不同程度地提高，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值分别由38492和46948上升到53563和55471。
当RBD来自不同毒株时，与SEQ ID NO:19相比，WH01株的NTD和RBD以及Delta株的RBD组合形成的候选抗原SEQ ID NO:22针对不同假病毒的几何平均滴度明显提高，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值由29505上升到67293；与SEQ ID NO:20相比，Beta株的NTD和RBD以及Delta株的RBD组合形成的候选抗原SEQ ID NO:23针对D614G株和Delta株假病毒的几何平均滴度有所降低，但仍维持在较高水平，同时针对WH01株和Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度则有所提高，尤其是针对Omicron BA.1株假病毒的几何平均滴度达到这几种组合中的最高值。因此，总体上来看，在加入NTD可以提高交叉保护能力。
(3)添加Foldon结构域的影响
本发明进一步考察了在候选蛋白中添加Foldon结构域形成三聚体的影响，在添加Foldon结构域后，各组的5个血清样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT如表7所示。
表7
Figure BDA0003817562530000201
如表7所示，与SEQ ID NO:19相比，WH01株和Delta株的RBD组合中进一步加入Foldon结构域(SEQ ID NO:26)或同时加入NTD和Foldon结构域(SEQ ID NO:27)以形成三聚体后，针对不同假病毒的几何平均滴度均明显提高，针对四种假病毒的几何平均滴度的平均值由29505分别上升到63178和53995，说明形成三聚体可以提高交叉保护能力。
可见，本发明所述由免疫优势毒株和流行优势毒株的RBD组合形成的抗原对不同毒株具有更为均衡的免疫效果，在进一步添加NTD或Foldon结构域后，免疫效果能够进一步提高。
实施例11mRNA的制备
该实施例制备了表8所示抗原的mRNA。
表8
Figure BDA0003817562530000211
在以上抗原的C端添加标签DYKDDDDKHHHHHHHH，将编码所述抗原的DNA序列按照人作为宿主进行密码子优化，并在5’端依次添加T7 RNA聚合酶结合序列、5’UTR(人β珠蛋白的5’UTR)、kozak序列和信号肽，在3’端依次添加3’UTR(人β珠蛋白的5’UTR)和PloyA(120)及酶切位点，得到DNA序列。
合成DNA序列并克隆至表达载体pUC57-kan中，测序验证目标基因。
将表达载体转化大肠杆菌E.coli感受态细胞，扩大培养后提取质粒，酶切得到线性化质粒样品，使用T7 High Yield RNA Transcription Kit(Novoprotein，CAT：E131-01A)按照说明书进行体外转录，使用Cap1 Capping System(Novoprotein，CAT:M082)按照说明书操作进行mRNA加帽，最后采用氯化锂沉淀纯化法进行纯化得到mRNA。
制备的mRNA序列为SEQ ID NO:68-73，其中，
SEQ ID NO:68的第123-2750位为抗原编码区，
SEQ ID NO:69的第123-1436位为抗原编码区，
SEQ ID NO:70的第123-1436位为抗原编码区，
SEQ ID NO:71的第123-1436位为抗原编码区，
SEQ ID NO:72的第123-2093位为抗原编码区，
SEQ ID NO:73的第123-1436位为抗原编码区。
实施例12mRNA疫苗的制备
将实施例11获得的各mRNA与脂质纳米颗粒混合得到核酸-脂质纳米颗粒复合物，其中脂质纳米颗粒包含摩尔比为1:1的DOTMA和DOPE；复合物中mRNA的含量为100μg/ml，脂质纳米颗粒与mRNA的质量比为10:1。
实施例13mRNA疫苗小鼠免疫实验
利用实施例12获得的各mRNA疫苗对8～10周龄的BALB/c小鼠(购自北京华阜康生物技术有限公司)进行分组免疫，每组5只小鼠。分别于0天及21天进行小鼠免疫，每只每次肌肉注射50μl的免疫样品(包含5μg mRNA)，并于0天、21天以及第二次免疫后14天采血。采集的血液样品37℃放置1小时，4℃放置1小时，8000r/min离心10分钟，收集血清，-20℃保存，用于假病毒中和检测。各组的5个血清样品针对不同假病毒的中和抗体滴度和几何平均滴度GMT结果如表9所示。
表9
Figure BDA0003817562530000221
可以看出，由编码RBD(Beta)-RBD(Beta)的mRNA(SEQ ID NO:73)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值为31133，且针对Omicron毒株的中和抗体滴度明显低于其他毒株，与之相比，由编码RBD(WH01)-RBD(Beta)-RBD(Delta)-RBD(BA.1)的mRNA(SEQ ID NO:68)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值达到99781，由编码RBD(WH01)-RBD(BA.1)的mRNA(SEQ ID NO:69)和编码RBD(Beta)-RBD(Delta)的mRNA(SEQID NO:70)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值达到58513，由编码RBD(Beta)-RBD(BA.1)的mRNA(SEQ ID NO:71)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值达到44561，由编码RBD(Beta)-RBD(WH01)-RBD(Delta)的mRNA(SEQ ID NO:72)制备的疫苗针对不同假病毒的中和抗体滴度GMT的平均值达到67155，并且这些疫苗针对Omicron毒株的中和抗体滴度均有数倍的增长。
可见，利用编码本发明所述免疫原性物质的mRNA制备的mRNA疫苗对不同毒株同样具有很好的免疫效果。可以预期，由本发明的免疫原性物质和编码所述免疫原性物质的核酸制备的疫苗针对新冠病毒将来可能出现的突变株仍会具有较好的预防效果。因此，在新型冠状病毒不断发生突变的情况下，本发明具有重要的指导意义。
以上所述的具体实施例对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.一种新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含源自免疫优势毒株的第一抗原和源自流行优势毒株的第二抗原，各抗原分别包含S蛋白的受体结合区或受体结合区的一部分，其中，所述免疫优势毒株选自新型冠状病毒WH01株和贝塔(Beta)株中的至少一种，所述流行优势毒株选自新型冠状病毒德尔塔(Delta)株、奥密克戎(Omicron)BA.1、BA.2、BA.3、BA.4和BA.5变异株中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，源自WH01株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的任一项所示的氨基酸序列；
源自贝塔(Beta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的任一项所示的氨基酸序列；
源自德尔塔(Delta)株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12中的任一项所示的氨基酸序列；
源自奥密克戎(Omicron)BA.1变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.2变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:62所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.3变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ IDNO:63所示的氨基酸序列，源自奥密克戎(Omicron)BA.4和BA.5变异株的S蛋白的受体结合区包含SEQ ID NO:64所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，所述新型冠状病毒免疫原性物质包含SEQ ID NO:19,20,28,29,47,48,51-55中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，所述新型冠状病毒免疫原性物质还包含源自所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株的一个或多个抗原。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，所述免疫优势毒株和所述流行优势毒株以外毒株选自以下毒株：阿尔法(Alpha)株、伽马(Gamma)株、艾普希龙(Epsilon)、截塔(Zeta)株、伊塔(Eta)株、西塔(Theta)株、艾欧塔(Iota)株、喀帕(Kappa)株、拉姆达(Lambda)株和缪(Mu)株。
6.根据权利要求1-5任一项所述的新型冠状病毒免疫原性物质，其特征在于，各抗原构成组合物，或者各抗原直接相连或者通过氨基酸接头连接。
7.一种制备权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用编码所述新型冠状病毒免疫原性物质的核苷酸序列构建重组表达质粒；
将构建的重组表达质粒转化宿主菌，筛选正确的重组表达质粒，
利用筛选的重组表达质粒转染表达系统的细胞，表达后收集上清并纯化得到新型冠状病毒免疫原性物质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达系统的细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞，可选地；所述哺乳动物细胞包括293T细胞或CHO细胞，所述细菌细胞包括大肠杆菌细胞。
9.一种编码权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的核苷酸序列。
10.一种包含权利要求9所述核苷酸序列的重组载体。
11.一种携带有权利要求10所述重组载体的表达系统细胞。
12.权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质、权利要求9所述核苷酸序列、权利要求10所述重组载体或权利要求11所述表达系统细胞在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
13.一种新型冠状病毒蛋白疫苗，其特征在于，包括权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质和佐剂，所述佐剂选自铝佐剂、MF59佐剂、MPL佐剂、QS-21、GLA、CpG、AS01、AS02、AS03、AS04佐剂中的一种或多种，优选为AS03或MF59佐剂。
14.一种新型冠状病毒DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗包含编码权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的DNA序列。
15.一种新型冠状病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗包含编码权利要求1-6中任一项所述新型冠状病毒免疫原性物质的mRNA序列。
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