CN112552413B - 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种多肽，及其与幽门螺杆菌铁蛋白的融合蛋白，以及利用其制备的预防新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染的亚单位疫苗。具体而言，所述多肽包含S1蛋白或其片段(SS0、SS1、SS2或SS3蛋白)，它们的氨基酸序列来自新型冠状病毒S蛋白的序列并进行了优化。所述多肽能够通过铰链与进行了密码子优化的幽门螺杆菌属铁蛋白进行融合而作为融合蛋白表达。上述多肽与幽门螺杆菌属铁蛋白的融合蛋白具有在CHO细胞中表达量高同时易于纯化的优点，在免疫动物后能够产生高滴度的针对新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的中和抗体。

Description

新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的重组蛋白亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒(Nidovirales)冠状病毒(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点，冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。迄今为止，共有7种冠状病毒可感染人类：包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒 (MERSr-CoV)、严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)和新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)。目前，提供一种有效引起机体免疫应答的针对新型冠状病毒的疫苗，阻断病毒在人群中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，对防御新型冠状病毒具有重大意义。

新型冠状病毒(2019-nCoV)引发的疾病为2019冠状病毒病COVID-19(CoronaVirusDisease 2019)。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，基因组为27～32Kb，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的。

冠状病毒的基因组依次编码为棘突蛋白，包膜蛋白，膜蛋白和核衣壳蛋白，其人传人的特性是由其衣壳表面棘突蛋白-S蛋白(spike glycoprotein)与宿主细胞表面受体的相互作用实现的，S蛋白以单一多肽形式产生，并被切割形成S1和S2亚基，这两个亚基负责受体结合(S1)和与宿主细胞膜融合(S2)。

其中，S1亚基结合的受体是血管紧张素转换酶2(ACE2)，ACE2是人类的一个重要的细胞表面受体，广泛分布于人的心脏、肾脏、睾丸、胃肠道大脑和肺内，主要参与心功能、血压调节、血管保护和部分肾脏功能的调节。重要的是，新冠肺炎病患者已经被证明能够引发针对新型冠状病毒棘突蛋白的强有力的中和抗体反应，这表明这种抗原在保护性疫苗的环境中可能是有希望的。因此冠状病毒的棘突蛋白(S1)是开发新型疫苗、治疗性抗体和诊断技术的关键靶点。

但是S1蛋白总长度为75kd，不容易表达出来且产量很低，对S1蛋白进行修改使其易于表达的同时保留其受体结合活性，从而提高其产量便成为了研究的重中之重。

发明内容

现在，幽门螺杆菌铁蛋白多聚化平台已被用于展示流感、HIV-1、和EB病毒等的抗原。其原理为幽门螺杆菌铁蛋白自组装，构成具有八个三重对称轴的24亚基颗粒。通过将病毒糖蛋白的单个原体融合到幽门螺杆菌铁蛋白亚单位的N-末端区域，有助于在表面3倍轴处显示8个拷贝的三聚体抗原的蛋白质纳米颗粒的组装。与仅用抗原免疫相比，在铁蛋白上展示抗原通常能够引发针对靶病原体的更强烈的中和抗体应答。重要的是，两种流感功能化铁蛋白疫苗已经在临床试验中被证明是安全和免疫原性的 (NCT03186781和NCT03814720)，并且已经基于此建立了用于大规模制造铁蛋白基疫苗的稳定基础。

发明人针对通用的原始铁蛋白氨基酸序列，通过从原始铁蛋白氨基酸序列中去除了序列前4个氨基酸，并将第19位N氨基酸突变为Q氨基酸，并根据CHO表达系统进行了密码子优化，而建立了改良的幽门螺杆菌铁蛋白多聚化平台。

为解决现有技术中存在的问题，发明人针对SARS-CoV-2的天然S蛋白核苷酸序列对其S1区域与S2区域进行分析，根据资料获得了S1蛋白氨基酸片段。进而通过将S1核苷酸序列中的一个碱基进行突变，得到了本发明的S1蛋白序列，并从该S1 蛋白序列出发，通过截短得到了SS0、SS1、SS2、SS3蛋白。需要说明的是，在这些蛋白中同样具有上述突变。随后利用上述改良的幽门螺杆菌铁蛋白多聚化平台进行了融合蛋白的表达。为方便起见，下文中有时使用术语“S蛋白”统称本发明的S1蛋白及其片段(SS0、SS1、SS2或SS3蛋白)。

本发明通过将编码S蛋白与铁蛋白亚单位融合蛋白的单个质粒转染到哺乳动物细胞中来产生功能化纳米颗粒，这与需要在纯化后将抗原接合到载体或支架上的纳米颗粒平台不同。

进而，本发明通过S蛋白-Ferritin融合蛋白免疫Balb/c小鼠，证实了产生的抗体具有可强力阻挡SARS-CoV-2假病毒入侵靶细胞的能力。验证了本发明的融合蛋白在生物体内能产生高滴度的中和抗体。

本发明提供了如下技术方案。

1.融合蛋白，其为多肽-接头-幽门螺杆菌铁蛋白(Ferritin)，包含：

多肽，其含有经优化的新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的片段；接头，其为连接臂；和幽门螺杆菌铁蛋白片段，其中，

所述经优化的新型冠状病毒S蛋白的片段为S1蛋白及其片段(SS0蛋白、SS1蛋白、SS2蛋白或SS3蛋白)，

所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述SS0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述SS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；

所述SS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；

所述SS3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。

2.如项1所述的融合蛋白，其中：

所述S1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述SS0蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述SS1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示；

所述SS2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示；

所述SS3蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示。

3.如项1或2所述的融合蛋白，其中，所述幽门螺杆菌铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

4.如项1～3中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接臂选自：[A(EAAAK)nA]、(GGGGS)3、(G)n、(XP)n，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

5.如项1～4中任一项所述的融合蛋白，进一步包含纯化标签，如His、Fc、HA、 GST、Flag、MBP或FLAG标签。

6.基因，其编码如项1-5中任一项所述的融合蛋白。

7.载体，其包含项6所述的基因。

8.宿主细胞，其表达项1～5中任一项所述的融合蛋白、和/或包含项6所述的融合基因，和/或包含项7所述的载体。

9.疫苗组合物，其包含项1～5中任一项所述的融合蛋白，还任选包含免疫学和药学上接受的载体或佐剂，其中，所述佐剂例如为铝佐剂、ISCOM、CpG。

10.如项1～5中任一项所述的融合蛋白，项6所述的基因，项7所述的载体，项8 所述的宿主细胞，项9所述的疫苗组合物在制备治疗和/或预防新型冠状病毒 SARS-CoV-2感染，或新型冠状病毒疾病COVID-19的药物中的用途。

11.新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建如项6所述的基因，

(2)表达如项1～5中任一项所述的融合蛋白，

(3)进行纯化，得到疫苗。

12.诱导生物体产生中和抗原特异性免疫应答的方法，包括向个体施加如项1～5中任一项所述的融合蛋白，项6所述的基因，项7所述的载体，项8所述的宿主细胞，项9所述的疫苗组合物。

本发明的一种实施方案包括高效表达优化的新型冠状病毒S蛋白(S1蛋白或其片段SS0、SS1、SS2或SS3)的方法，其包括将所述多肽或融合蛋白的核苷酸编码序列引入到CHO细胞中以表达该多肽。

本发明的一种实施方案中，所述多肽或融合蛋白的核苷酸编码序列存在于重组质粒中，优选地所述引入采用电穿孔法。

本发明的一种实施方案包括所述多肽或融合蛋白在制备S蛋白(S1蛋白或其片段SS0、SS1、SS2或SS3)抗原制品中的应用。

本发明的一种实施方案包括所述多肽或融合蛋白在制备诊断新型冠状病毒的制品中的应用。

本发明的一种实施方案包括所述多肽或融合蛋白在制备新型冠状病毒亚单位疫苗中的应用。

除了CHO细胞以外，还可以使用293、Vero等宿主细胞。

本发明的一种实施方案中，所述纯化通过分子筛层析进行，也能够通过亲和层析进行，例如包括将表达所述抗原的细胞上清液过滤除去细胞碎片，通过10K超滤管(Millipore)进行初步提纯与浓缩，最后通过使用Siperose6 Increase10/300GL柱子(GE)进行分子筛层析进行纯化，获取高纯度的目的蛋白。

并且，本发明提供一种高效表达优化的新型冠状病毒抗原与铁蛋白融合表达的方法，其包括将前述S蛋白(S1蛋白或其片段SS0、SS1、SS2或SS3)-铁蛋白的核苷酸编码序列引入到CHO细胞中，并通过基于电穿孔法使用上述重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选而构建了CHO细胞株。

本发明的优点

较天然新型冠状病毒S1蛋白全长段，截短后的新型冠状病毒S1或其片段(SS0、SS1、SS2或SS3蛋白)降低了全序列非受体结合区引起非特异性免疫的风险。上述优化的新型冠状病毒S蛋白(S1、SS0、SS1、SS2或SS3)及其融合蛋白不仅保留了S蛋白结合人体细胞表面的ACE2受体，更易在CHO细胞中进行表达，得到的产物易于纯化，融合蛋白表现为纳米颗粒，非常容易与单一抗原小分子分开，在SEC柱上表现为第一个单一的峰，纯度更高，更好分离。并且在保证抗体中和活性的同时极大的提升了产量 (例如从14.23mg/L提升至346.16mg/L)。

通过与幽门螺杆菌铁蛋白表达得到的纳米结构，实现了抗原的重复排列(抗原排列在铁蛋白形成的球状结构的表面)。而抗原重复排列比单一抗原能驱动更强的体液免疫反应，能够通过抗原驱动的B细胞受体(BCR)交联，引起更强的B细胞活化，对抗原的运输和定位也可能起潜在影响作用。

本发明在现有工作的基础上，利用铁蛋白纳米粒子设计并成功展示了新型冠状病毒棘突蛋白的纳米粒子。重要的是，发明人设计的基于铁蛋白的抗原(S蛋白-Ferritin)，由于铁蛋白是由8个三聚体组成的24面球体，S蛋白也是三聚体，所以在哺乳动物细胞中的表达与尖峰三聚体(S)相似，这为棘突蛋白或本发明所用的其截断片段与铁蛋白的融合不会对蛋白质生产产生负面影响提供了保证。

并且，糖基化可以影响病毒抗原的正确折叠，而本发明在哺乳动物细胞(CHO)中实现表达，说明本发明以天然样糖基化产生了与新型冠状病毒(SARS-CoV-2)棘突蛋白具有相似抗原性的抗原片段，更利于引起哺乳动物如人的机体免疫应答而产生针对其的中和抗体。

附图说明

图1肌肉注射低剂量组免疫3次后2周时的假病毒抑制率-稀释倍数曲线。

图2产量换算中使用的ELISA标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。本发明所应用的方法可以采用基因工程技术领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。

实施例1：构建S蛋白-Ferritin融合基因的表达载体及筛选

1.1 S蛋白基因序列的获得与优化

天然S蛋白核苷酸序列获得自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/YP_00972 4390.1？feature＝any)。分析了其S1区域与S2区域(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/ C-I-TASSER/2019-nCov/)，获得原始S1蛋白氨基酸片段。针对原始S1核苷酸序列突变了其中的一个碱基，得到本发明的S1序列(氨基酸序列：如SEQID No.1所示，核苷酸序列：如SEQ ID No.8所示)，并在此基础上以截短的方式分别设计了SS0、SS1、 SS2、SS3蛋白序列。SS0、SS1、SS2、SS3蛋白的氨基酸序列分别依次示于SEQ IDNo.2～5，核苷酸序列依次示于SEQ ID No.9～12。

原始铁蛋白氨基酸序列获得自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/WP_0009 49190.1？)，从原始铁蛋白氨基酸序列中去除了序列前4个氨基酸，并将第19位N氨基酸突变为Q氨基酸，得到如SEQ ID No.7所示的幽门螺杆菌Ferritin氨基酸序列。进一步根据CHO表达系统进行了密码子优化，得到相应的Ferritin核苷酸序列(如SE Q ID No.18所示)。

S1、SS0、SS1、SS2或SS3与铁蛋白以GGGSGGGS铰链序列相连接后的核苷酸序列分别为：SEQ ID No.13：S1-Ferritin核苷酸序列；SEQ ID No.14：SS0-Ferritin核苷酸序列；SEQID No.15：SS1-Ferritin核苷酸序列；SEQ ID No.16：SS2-Ferritin核苷酸序列；SEQ IDNo.17：SS3-Ferritin核苷酸序列。

1.2 S蛋白重组质粒的构建

将本实施例1.1中设计的核苷酸序列SEQ.ID.NO.13～17交由金斯瑞合成，并由该公司分别连接至PMV通用载体上，得到对应的PMV-S蛋白Ferritin质粒。再使用 pcDNA3.1载体(购自Addgene)，分别重组构建了对应的五种pcDNA3.1-S蛋白-铁蛋白质粒。具体步骤在下文详细阐述。

1.2.1 PMV-S蛋白-Ferritin质粒的酶切

(1)酶XhoI、EcoRⅠ购自NEB公司。在1.5mL的EP管中按照下表进行加样、混匀：双酶切反应体系为10μL，加样如下表1所示：

表1酶切体系

加样成分	加样量
		PMV-S蛋白Ferritin质粒	5μg
酶XhoI(20,000units/ml)	0.5μL
		酶EcoRⅠ(20,000units/ml)	0.5μL
10×buffer cutsmart	1μL
		ddH2O	补至10μL

(2)上述1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。

1.2.2双酶切胶回收。

取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，胶回收试剂盒购自天根公司。

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管)加入500μL平衡液， 12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量，并记录数值。

(3)向步骤(2)中的1.5mL离心管中加入等体积溶液PC buffer，50℃水浴放置10min 左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

(4)将步骤(3)所得溶液加入吸附柱CB2中，静置2min，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(5)向吸附柱中CB2中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。

(6)重复步骤(5)。

(7)将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm，离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。

(8)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLddH2O，静置10min，12,000rpm，离心2min，收集DNA溶液。

(9)将步骤(8)中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶，分别回收了针对SEQ.ID.NO.13～17的DNA片段。

1.2.3连接反应

将1.2.2中回收得到的DNA片段插入pcDNA3.1载体(购自Addgene公司)。

(1)标记需要用到的200μL离心管。

(2)在标记完的离心200μL管中按照下表2的20μL反应体系进行加样：

表2连接反应体系

(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。

(4)将200μL离心管置于PCR仪中16℃连接3h，得到连接反应产物，其含有分别连接有SEQ.ID.NO.13～17的DNA的pcDNA3.1载体，称为pcDNA3.1-S1质粒， pcDNA3.1-SS0质粒，pcDNA3.1-SS1质粒，pcDNA3.1-SS2质粒，pcDNA3.1-SS3质粒。

(5)步骤(4)的连接反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。

1.2.4转化反应

(1)将10μL得到的连接反应产物快速加入含有100μL感受态细胞DH5α(购自康体生命)的样品管中，并吹打混匀，冰浴30min。

(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴45s，然后立即冰浴90s，进行转化。

(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入200μL LB液体培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养45min。

(4)制备转化平板，依据pcDNA3.1-S1-铁蛋白质粒的抗性制备转化用LB氨苄抗性平板。

(5)涂板：吸取已转化的感受态细胞加到LB氨苄抗性平板中，均匀涂开。

(6)将步骤(5)平板倒置于生化恒温培养箱中，37℃培养15h。

(7)观察记录转化结果，得到生长有单克隆的转化平板。

1.2.5质粒抽提与酶切鉴定

1.2.5.1质粒抽提

小提质粒试剂盒购自天根生化科技有限公司。具体操作如下：

(1)用10μL移液枪头从上述转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。

(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(3)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm，离心1min，尽量吸取上清。

(4)向步骤(3)中的离心管中每管加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体。

(5)向步骤(4)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管6-8次混匀。室温静置2-4min。

(6)向步骤(5)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12,000rpm，离心10min。

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱CP3中心，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)向吸附柱中心加入600μL漂洗液PW，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm，室温离心2min。

(11)将吸附柱CP3放入干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入50μL ddH2O，室温静置10min，12,000rpm，离心2min，4℃保存管中质粒溶液，分别得到纯化的 pcDNA3.1-S1-Ferritin质粒，pcDNA3.1-SS0-Ferritin质粒pcDNA3.1-SS1-Ferritin质粒， pcDNA3.1-SS2-Ferritin质粒，pcDNA3.1-SS3-Ferritin质粒。

1.2.5.2对本实施例1.2.5.1中得到的各质粒分别进行酶切鉴定

通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。具体操作如下：

(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表3进行加样、混匀：反应体系为20μL：

表3酶切鉴定体系

加样成分名称	加样量
		质粒	5μg
酶XhoI(20,000units/ml)	0.5μL
		酶EcoRⅠ(20,000units/ml)	0.5μL
10×buffer cutsmart	2μL
		ddH2O	补至20μL

(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。

(3)电泳验证。取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳验证，并由生工生物工程有限公司测序并返回测序结果，鉴定确认了pcDNA3.1-S1-Ferritin质粒， pcDNA3.1-SS0-Ferritin质粒pcDNA3.1-SS1-Ferritin质粒，pcDNA3.1-SS2-Ferritin质粒，pcDNA3.1-SS3-Ferritin质粒的酶切产物分别对应核苷酸序列SEQ ID NO.13～17。

实施例2：将pcDNA3.1-S蛋白质粒转入CHO细胞。

2.1 pcDNA3.1-S蛋白Ferritin质粒大提

将实施例1最终鉴定得到的五种pcDNA3.1-S1蛋白Ferritin质粒进行质粒大提。质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司。

2.3基于电穿孔法进行质粒转染

A、培养基准备：将FBS(购自美国Gibco公司)用3500的透析袋透析，然后配置含10％dFBS的CSC-03培养基1L，配置完毕后至于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。

B、宿主细胞准备：接种初始细胞浓度为0.5×10⁶cells/ml的CHO细胞株(由北京鼎持生物技术有限公司从ATCC引进，引进时间：2018年5月1日，ATCC编号：CCL61。本细胞经在北京鼎持生物技术有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为： BJDC-201800010)于125ml三角摇瓶中，悬浮培养3天；用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照1.0×10⁷cells总量取细胞，离心去上清，离心条件为800r/m，离心5min；再使用5mL CD-Pro培养基清洗两次去除上清液的细胞，第二次清洗后使用600μL CD-Pro培养基将细胞进行重悬，待用；

C、对于各种pcDNA3.1-S蛋白Ferritin质粒分别量取200μg(溶于电转培养基 CD-Pro(购自壹生科(深圳)有限公司)中)加入到使用CD-Pro培养基重悬的CHO细胞液中，室温下孵育5分钟；

D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；

E、将已溶有质粒的CD-Pro培养基重悬细胞液转入到电转杯中，静置2min开始电转，记录电转的时长和电压；

F、电转完成后将电转杯中的细胞液加入到已配置好的含10％dFBS的CSC-03培养基中，吹吸混匀。

G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养。

2.4进行细胞株筛选

将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)进行处理，加入量为30～50μm；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基CSC-03(购自壹生科(深圳)有限公司)；

培养3天后扩增得到一副24孔板的细胞，在37℃，5％CO₂条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用ELISA方法筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1+15um MSX培养基，培养三天，其中CHO-K1培养基购自壹生科(深圳)有限公司；此培养过程同时完成了细胞株的筛选和细胞株对无血清培养基的适应培养过程，此过程如表4所示。

表4无血清适应过程日程

对筛选出的细胞株进行扩增，第4天开始加NF604培养基(购自深圳壹生科)，细胞活率60％左右时，12,000rmp，离心15min，收集细胞上清液，取1ml上清液进行检测，使用ELISA检测方式(一抗为anti-S-RBD,义翘神州；二抗为羊抗兔IgG-HRP,索莱宝)筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株。对表达量高的细胞株再进行两轮单克隆筛选。分别得到了多个稳定表达S1-Ferritin，SS0-Ferritin、SS1-Ferritin、 SS2-Ferritin、SS3-Ferritin的CHO细胞株。

使用以下标准曲线(表5，图2)，基于ELISA的吸光度对各个细胞株的产量进行换算。

表5产量换算中使用的ELISA标准曲线对照表

经测定，在表达S1-Ferritin、SS0-Ferritin、SS1-Ferritin、SS2-Ferritin、SS3-Ferritin 的产量最高的克隆中，获得的产量分别为14.23mg/L、142.26mg/L、346.16mg/L、51.17mg/L、47.81mg/L，相应地，基于细胞计算的产量分别为2.37×10^-9mg/细胞、 23.71×10^-9mg/细胞、57.69×10^-9mg/细胞、8.53×10^-9mg/细胞、7.97×10^-9mg/细胞，将这些克隆进行扩大培养及保存，用于后续试验。

实施例3：蛋白纯化

融合蛋白的层析纯化

(1)将实施例2得到的分别含有五组优化的S蛋白-Ferritin的细胞上清液，用GE的core 400进行层析纯化。具体步骤为，将实施例2得到的五组对应细胞上清液分别 10000×g离心30min，收集上清液，0.22um过滤，过滤后的上清液30kDa膜包超滤浓缩10-20倍，作为上样液。

(2)用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。

(3)用5倍柱体积的平衡缓冲液(PBS，pH7.4)清洗介质。

(4)每次上样1/3CV。

(5)收集外水体积峰。

(6)用1M NaOH+30％异丙醇清洗层析柱，然后用PBS平衡至pH中性，20％乙醇保存层析柱。

得到了纯化的S1-Ferritin、SS0-Ferritin、SS1-Ferritin、SS2-Ferritin、SS3-Ferritin 抗原，其氨基酸序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、 SEQ ID NO.17，可做为新型冠状病毒的亚单位疫苗备选。

讨论：由于S蛋白和铁蛋白融合后形成了直径30nm左右的颗粒，在SEC柱上分离中更具备优势，颗粒在柱上基本无吸附，存在于第一个色谱分离峰中，纯度高，回收效果好，而单一抗原在过柱时会多次进入到柱上孔隙中，按照分子量实现分离，与其他杂蛋白分子量较为接近则不易完全分离，回收率低且回收纯度低。

实施例4：亚单位疫苗的制备

在实施例3得到的SS1-Ferritin抗原中加入重量比万分之一的硫柳汞，之后按照实验浓度与铝佐剂(购自Thermo)1:1混合而制备了SS1-Ferritin亚单位疫苗。

实施例5：SS1-Ferritin亚单位疫苗免疫应答反应的研究

本实施例采用BALB/c小鼠，通过肌肉注射、皮下注射两种给药途径给予了本发明的SS1-Ferritin亚单位疫苗，测定小鼠外周血中产生的抗体的有效极限稀释倍数，将达到半数抑制率时的稀释倍数作为EC50(指50％抑制稀释倍数，inhibitory dilution，EC50)，通过统计方法进行了各组间比较。由此评价了SS1-Ferritin亚单位疫苗免疫应答和免疫反应。

本实施例中的全部试验步骤委托国家药物安全评价监测中心实施。

首先将36只BALB/c小鼠(6-8周，雌性)如下表6所示分成6组，每组6只。肌肉注射给药部位为小鼠的股四头肌、皮下注射给药部位为颈背部皮下，每次注射体积均为200μl/只。

表6亚单位疫苗免疫小鼠试验的分组与剂量

采血方式：动物存活期间每次免疫后2周，在当天进行注射之前，进行异氟烷麻醉后经眼内眦静脉取血，每只小鼠取120μl血液；在末次免疫后2周，麻醉并剖解动物，由腹腔大静脉采血，分离血清进行中和抗体检测。整个实验中观察动物摄食情况等。

以50％抑制稀释度作为评价指标，测定了不同组别的血清样本对假病毒的抑制作用。具体步骤如下。

·材料：SARS-CoV-2假病毒，批号：20200424，滴度：1.4×10⁵TCID50/ml；批号：20200609，滴度：1.35×10⁵TCID50/ml，购自国家药物安全评价监测中心艾滋室。 Huh-7细胞，购自国家药物安全评价监测中心艾滋室。化学发光试剂，货号： 6066761，由PerkinElmer提供。DMEM，货号：12430054，由thermo Fisher提供。血清阴性对照：健康BALB/c小鼠血清。其中，将上述实施例得到的血清称为血清样品。

·仪器：VICTOR X5化学发光仪，生产厂家：Perkin Elmer。

试验步骤

在96孔板中设置以下各区域。每孔设置3个复孔。

细胞对照列：培养基，细胞。病毒对照列：培养基，细胞，病毒。

血清样品列：培养基，细胞，血清样品，病毒。

血清阴性对照列：培养基，细胞，血清阴性对照，病毒。

1)将各组的血清样品在56℃，30min灭活备用；

2)向板中的细胞对照列加入DMEM 150μl/孔，向病毒对照列加入DMEM 100μl/孔；血清样品列除在起始稀释梯度行中加入DMEM 127.5μl/孔，其他稀释梯度行中均加入 DMEM100μl/孔；

3)分别向各试验组血清样品列的起始稀释梯度行加入血清样品7.5μl/孔，用孔中的培养基润洗枪头；

4)将上述起始稀释行中液体混匀后每孔吸取50μl，转移到下一个稀释梯度行中，继续混匀后，再取50μl到下一个稀释梯度中，以此类推，按照3倍进行系列稀释而形成了30倍，90，270，810，2430，7290，21870，65610倍的稀释梯度。

5)混匀后，从最后一个稀释梯度行中每孔吸弃50μl液体；

6)关于血清阴性对照列，除将血清样品换成了阴性血清对照以外，与血清样品同样地进行了系列稀释；

7)将假病毒室温水浴解冻，用DMEM完全培养基稀释，使得终滴度范围为1.0×10⁴～ 5×10⁴TCID50/ml，然后以50μl/每孔添加到病毒对照列、血清阴性对照列及血清样品列。加盖，置于培养箱中(37℃，5％CO2)孵育1小时；

8)在此期间，将事先准备好的汇合率达80％～90％的Huh7细胞用胰酶消化后，加入 DMEM完全培养基混匀，将细胞浓度调整至2×10⁵/ml。

9)当板孵育至1小时时，以100μl/孔加入8)的细胞，此时每孔约为2×10⁴个细胞，晃动使细胞在孔中分散均匀，放入细胞培养箱于37℃，5％CO2培养24小时；

10)配制Britelite plus试剂，将Britelite plus(购自Perkin Elmer)室温平衡后复溶，静置10min，未使用完的Britelite plus试剂置于-20℃保存，再次使用时室温下水浴解冻Britelite plus试剂，使用前试剂置于水浴中至少30分钟；

11)培养结束后，从所有孔中吸弃150μl液体，使得孔中约剩余100μl；

12)以孔内剩余体积：Britelite plus体积＝1:1向所有孔中加入Britelite plus试剂，室温下避光孵育2min，使细胞裂解，然后用移液器混匀6-8次，然后转移150-160μl液体到化学发光板中；

13)将发光板置于发光仪中，约2min后读取RLU值(relative light unit，相对光单位)。

14)根据得到的RLU值评价试验，当以下条件同时满足时，认定试验成立。％CV指变异系数百分比

·复孔间的％CV≤30％；

·病毒对照列的RLU值的％CV≤30％；

·病毒对照列的RLU与细胞对照列的RLU比值≥1000；

·按下述式计算时阴性血清对照的EC50值<30，判定为试验成立；或者利用阴性血清对照在30倍稀释时的RLU如下述计算发光强度，以其均值+-2SD作为阴性血清对照的参考范围，当阴性血清对照的发光强度处于参考范围内时判定为试验成立；

·检测结果无倒置。在较低稀释度时，感染抑制率大于或等于50％，较高稀释度时感染抑制率小于50％。

15)根据每组RLU值计算出中和抑制率，式中术语“发光强度”指RLU，如无特殊说明则为同一组的均值。

中和抑制率＝[1-(血清样品组的发光强度-细胞对照的发光强度)/(血清阴性对照组的发光强度-细胞对照的发光强度)]×100％。

16)计算中和抑制率等于50％时对应的血清稀释度作为EC50，并用统计软件计算EC50 的几何均值(n＝6)。每只小鼠的个体数据示于表7，将表7的数据统计后得到的几何均值汇总示于表8，为方便理解，作为例子提供了肌肉注射低剂量组的抑制率-稀释倍数曲线图，见图1。需要说明的是图1中1表示抑制率为100％，0.5表示抑制率为50％，即当抑制率等于50％时，对应的曲线上的点的X轴投影即为该组的50％抑制稀释倍数。

表7小鼠个体的50％抑制稀释倍数

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*表示从该样品未分离到血清。

表8灭活血清对SARS-CoV-2假病毒的50％抑制稀释倍数

结果显示，在肌肉注射佐剂组和皮下注射佐剂组中，50％抑制稀释倍数EC50均小于30，与阴性空白对照的EC50为相同水平，证实未免疫亚单位疫苗的小鼠血清对假病毒不显示抑制作用，即，没有针对新冠病毒的中抗体。在注射了亚单位疫苗的全部小鼠中，均产生了高滴度的中和抗体。并且，肌肉注射低剂量组，皮下注射佐剂组，皮下注射加强组中，每只小鼠随着免疫次数的增加，对假病毒的抑制作用增强(表7，图1)。

具体地，注射了亚单位疫苗的全部组的EC50几何均值呈现随着免疫次数的增加，对假病毒的抑制作用增强的趋势(表8)。在三次免疫后，肌肉注射低剂量组最终达到 24143的极高的50％抑制稀释倍数(个别小鼠达到了55358，65610)，皮下注射加强组最终也达到了23346的极高的50％抑制稀释倍数。

在第三次免疫后2周，与肌肉注射低剂量组相比，肌肉注射高剂量组中随着剂量增加，免疫效果并未升高。对于其原因，我们注意到，在其中部分小鼠中出现了先升高后降低的趋势，特别是在小鼠(F15)中，虽然第3次免疫后的EC50仅为3132.99，但其经历了12593这样可观的高值。提示通过免疫剂量的增加，在接受肌肉注射的部分小鼠体内起效更加迅速，从而使诱导的中和抗体更早抵达峰值。而皮下注射加强组与肌肉注射高剂量组中各小鼠相比，通过进行首次剂量增加，使得EC50高峰到来的时间延后，在第3次免疫后2周EC50仍高至23346。

为了探索亚单位疫苗的耐受及安全性，观察了25μg/只的免疫量下动物的耐受。皮下注射高剂量组小鼠活动性、体温，摄食性均正常，未出现死亡，虽然为了避免造成动物数量损失没有进行第3次免疫，但第2次免疫后的EC50几何均值为5313，也得到了良好的免疫效果。提示了本发明的亚单位疫苗的优秀安全性。

实施例6

同样地，对S1-Ferritin、SS0-Ferritin、SS2-Ferritin、SS3-Ferritin以与实施例5相同的方案分别进行了中和抗体检测实验，均具备与SS1-Ferritin规律一致的效果，结果表明S1-Ferritin、SS0-Ferritin、SS2-Ferritin、SS3-Ferritin均能对假病毒起到较佳的抗体中和作用。

综上所述，经过实验验证，本发明制备的疫苗可以用于预防新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)感染或新型冠状病毒疾病(COVID-19)。

上述内容仅为本发明创造的较佳实施例，并不以此限定本发明的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

工业实用性

本发明提供的包含S1蛋白、SS0、SS1、SS2或SS3蛋白与幽门螺杆菌铁蛋白的融合蛋白，更易在CHO细胞中进行表达，并且能够明显提高S蛋白(S1、SS0、SS1、 SS2或SS3)-Ferritin表达量，能够用于制备疫苗用于预防新型冠状病毒疾病(COVID-19)，为生产新型冠状病毒人用亚单位疫苗奠定了坚实的基础。本发明还涉及新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白-Ferritin融合基因、载体、细胞、制备方法、治疗方法或制药用途，它们能够应用在病毒作用原理的基础研究，鉴别诊断，快速测定，流行病学调查，动物模型制备等广泛的领域中。

Claims (14)

1.融合蛋白，其为多肽-接头-幽门螺杆菌铁蛋白(Ferritin)，包含：

多肽，其含有经优化的新型冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的片段；接头，其为连接臂；和幽门螺杆菌铁蛋白片段，其中，

所述经优化的新型冠状病毒S蛋白的片段为SS0蛋白或SS1蛋白，

所述SS0蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述SS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；

所述幽门螺杆菌铁蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中：

所述SS0蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

所述SS1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示。

3.如权利要求1~2中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接臂选自：[A(EAAAK)nA]、(GGGGS)3、(G)n、(XP)n。

4. 如权利要求1~2中任一项所述的融合蛋白，其中所述连接臂的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。

5.如权利要求1~2中任一项所述的融合蛋白，进一步包含纯化标签。

6.如权利要求5所述的融合蛋白，所述纯化标签为His、Fc、HA、GST、Flag、MBP或FLAG标签。

7.基因，其编码如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白。

8.载体，其包含权利要求7所述的基因。

9.宿主细胞，其表达权利要求1~6中任一项所述的融合蛋白、和/或包含权利要求7所述的基因，和/或包含权利要求8所述的载体。

10.疫苗组合物，其包含权利要求1~6中任一项所述的融合蛋白。

11.如权利要求10所述的疫苗组合物，其还包含免疫学和药学上接受的载体或佐剂。

12.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂为铝佐剂、ISCOM、CpG。

13.如权利要求1~6中任一项所述的融合蛋白，权利要求7所述的基因，权利要求8所述的载体，权利要求9所述的宿主细胞，权利要求10-12中任一项所述的疫苗组合物在制备预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的药物或预防新型冠状病毒疾病COVID-19的药物中的用途。

14.新型冠状病毒SARS-CoV-2疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1) 构建如权利要求7所述的基因，

(2) 表达如权利要求1~6中任一项所述的融合蛋白，

(3) 采用SEC柱纯化所述融合蛋白，得到疫苗。

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