CN113293145B - 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗 - Google Patents

一种麻疹病毒活载体新冠疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN113293145B
CN113293145B CN202110139726.3A CN202110139726A CN113293145B CN 113293145 B CN113293145 B CN 113293145B CN 202110139726 A CN202110139726 A CN 202110139726A CN 113293145 B CN113293145 B CN 113293145B
Authority
CN
China
Prior art keywords
measles virus
virus
measles
strain
live vector
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110139726.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113293145A (zh
Inventor
安祺
朱凤才
田大勇
张楠
牛彪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd, Shanghai Qingsai Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Saierfusen Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110139726.3A priority Critical patent/CN113293145B/zh
Publication of CN113293145A publication Critical patent/CN113293145A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113293145B publication Critical patent/CN113293145B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18421—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18451—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/18452—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种麻疹病毒活载体新冠疫苗。具体地，本发明公开了一种麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，其基因组中整合有新冠病毒的RBD序列。本发明还提供了包含所述麻疹病毒活载体新冠重组病毒株作为活性成分的疫苗组合物及其制备方法。本发明疫苗能够同时预防新冠肺炎和麻疹，副反应少，更适合儿童和老人使用；且在制备时只需一种病毒株，生产工艺简单，生物安全性高。

Description

一种麻疹病毒活载体新冠疫苗
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种麻疹病毒活载体新冠疫苗及其应用。
背景技术
麻疹是由麻疹病毒(Measles Virus，MV)感染引起的急性全身发疹性传染病，主要的传播途径是呼吸道分泌物飞沫传播。在麻疹疫苗出现之前，绝大多数人在儿童时期会患上麻疹，故曾被冠上最厉害的“儿童杀手”称号；成人也有麻疹，成人麻疹病状通常较重。随着麻疹减毒活疫苗的广泛使用，全球的麻疹发病率被极大的控制；但是近十几年，在全球疫苗接种率超过70％的条件下，欧洲和亚洲却反复出现麻疹的局地暴发，该现象引起了各国政府和科学家的关注，疫苗接种强度不够和接种率下降是造成麻疹疫情反复的关键因素之一。
新冠肺炎是由新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的一种高度传染性疾病。其传播能力高于SARS-CoV十倍以上。目前，全球各国政府，科研院所和研发企业分别开发了mRNA疫苗，灭活疫苗，亚单位疫苗，DNA疫苗，活载体疫苗等，有些产品已经表现出了良好的临床效果。
但是，目前的新冠疫苗普遍明确不适用于儿童和老人使用。儿童使用的疫苗需要更低的副反应。
因此，本领域亟待开发一种副反应少，更适合儿童和老人使用的新冠疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可同时预防麻疹和新冠肺炎的麻疹病毒活载体新冠疫苗。
本发明的第一方面，提供了一种麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株 rMV-PM-RBD1。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：5所示的新冠病毒的RBD序列。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
(i)在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的P基因和M基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥ 90％，更佳地≥95％。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的P基因和M基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种疫苗组合物，所述组合物包括：
(a)如权利要求1所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株；和
(b)疫苗上可接受的载体。
在另一优选例中，所述载体是药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。
在另一优选例中，所述载体还含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在另一优选例中，所述载体中还含有细胞转染试剂。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为二联疫苗。
在另一优选例中，所述疫苗组合物为预防麻疹病毒和新冠病毒的二联疫苗。
在另一优选例中，所述麻疹病毒为A基因型、H1a基因型、B3基因型或D8 基因型。
在另一优选例中，所述疫苗组合物针对新冠病毒的RBD序列。
在另一优选例中，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：风疹、乙型脑炎、甲型肝炎、水痘、脊髓灰质炎、流行性腮腺炎、或其组合。
在另一优选例中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。
在另一优选例中，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。
在另一优选例中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合；
另一优选例中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在另一优选例中，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少为4.0lgCCID50。
在另一优选例中，所述的疫苗组合物为注射剂型。
本发明的第三方面，提供了一种制备麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的方法，所述方法包括步骤：
(S1)构建在麻疹病毒P基因序列和M基因序列中插入新冠病毒的RBD序列的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的全长重组质粒；
(S2)分别获得包含麻疹病毒中的N基因、P基因和L基因以及T7启动子的四种辅助质粒；和
(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的四种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述麻疹病毒活载体新冠重组病毒株。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero 细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。
本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的用途，用于制备一种疫苗组合物，所述疫苗组合物用于预防新冠肺炎和/或麻疹。
本发明的第五方面，提供了一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括步骤：
(S1)对保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
本发明的第六方面，提供了一种预防新冠肺炎和麻疹的接种方法，包括步骤：给需要的对象接种如本发明第一方面所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，或如本发明第二方面所述的疫苗组合物。
在另一优选例中，所述的对象为8月龄及以上的新冠肺炎和/或麻疹易感者。
在另一优选例中，所述接种的方式为皮下注射接种。
在另一优选例中，所述接种的剂量不低于4.0lgCCID50。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了麻疹病毒活载体pMV的图谱。
图2显示了重组病毒基因组架构模式图。
图3显示了重组病毒基因组全长质粒的酶切鉴定结果。
图4显示了重组病毒的IFA鉴定结果。
图5显示了重组病毒的Western-Blot鉴定结果。
图6显示了重组病毒的多步生长曲线。
图7显示了重组病毒的免疫原性评价程序。
图8显示了重组病毒免疫后的小鼠血清麻疹病毒特异性中和抗体滴度。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种同时针对麻疹病毒和新冠病毒的二联疫苗株。具体地，本发明人在麻疹病毒株中，利用反向遗传操作系统，在其基因组的P基因和M基因中间插入新冠病毒的RBD基因序列，可获得基因组中整合有新冠病毒的RBD基因序列的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株。实验证明，获得的麻疹病毒活载体新冠疫苗能够同时预防新冠肺炎和麻疹，且与当前的麻疹疫苗株在生长特性、免疫原性等方面的水平相当。在对其的制备过程中，使用本发明的制备方法，只需一种病毒株，生产工艺更加简单和稳定；并且能够在常规疫苗生产车间生产，生物安全风险低。
在此基础上，完成了本发明。
术语
麻疹病毒和麻疹病毒减毒活疫苗
MV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)，其病毒粒子呈球型，直径约120nm～250nm，包括单股负链RNA和核衣壳 (nucleocapsid)结构。其基因组RNA能编码6个结构蛋白，分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、H蛋白、F蛋白和L蛋白。核衣壳外有脂质双分子层包膜，H蛋白和 F蛋白以其分子的一部分锚定在包膜内，而另一部分像突出物一样伸展在囊膜表面上形似刺突，包膜上无神经氨酸酶。其中圆锥型的H蛋白可使病毒结合到宿主细胞表面，而哑铃型的F蛋白使病毒进入细胞。
麻疹病毒减毒活疫苗的大规模应用已有数十年的历史，对该疫苗的免疫学检测表明，麻疹疫苗具有较好的免疫原性。主要原因之一是麻疹病毒能够有效激活宿主的先天性免疫反应。麻疹病毒感染人体后最初激活先天性免疫应答反应，激活感染细胞内Toll样受体及Ⅰ型干扰素信号转导通路。Ⅰ型干扰素IFN-α/β可抑制病毒复制，增强自然杀伤细胞(NKcells)清除病毒感染细胞的能力，并诱导NK细胞产生IFN-γ。麻疹病毒诱发的干扰素表达具有细胞特异性和毒株特异性，感染上皮细胞和树突细胞后能迅速刺激细胞产生IFN-α/β，而感染的有丝分裂原刺激的外周淋巴细胞则不能产生干扰素。麻疹病毒还能抑制CD4+T 细胞干扰素的产生及其信号转导，与疫苗株病毒相比野生型麻疹病毒诱导感染细胞表达干扰素的能力明显降低。不同麻疹病毒毒株的C、V蛋白氨基酸序列存在着差异，而C、V蛋白能抑制干扰素的产生及其信号转导，这可能是麻疫病毒诱发干扰素表达的能力存在毒株特异性的原因。野生型麻疹病毒H蛋白能和 TLR2相互作用，从而刺激单核细胞内Toll样受体应答基因IL-1、IL-6、IL-12p40 等表达，进而启动机体的获得性免疫应答反应。
新冠病毒RBD
RBD是指新型冠状病毒的主要免疫原蛋白S(刺突蛋白)的与受体结合的区域，其英文名称为receptor binding domain，缩写为RBD。新冠病毒的主要中和表位就位于该区域。
在本发明的实施例中，将新冠病毒的RBD序列插入到麻疹病毒活载体pMV 的P基因和M基因序列中间，得到麻疹病毒活载体新冠重组病毒株 (rMV-PM-RBD1)。
其中，所述新冠病毒的RBD序列为：
cctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacagga agagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcct actaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctcca gggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaa tcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatattt caactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggttt ccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgttt gtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactactgatgctgtccgtgatccac agacacttgagtaa(SEQ ID NO：5)。
麻疹病毒活载体
如本文所用，术语“麻疹病毒活载体”是指以麻疹病毒作为载体用于表达插入麻疹病毒基因组中的外源性基因的表达载体。麻疹病毒的各个结构基因之间是有基因间隔序列的，在该序列处插入外源一般不影响重组病毒的其它基因的表达和病毒颗粒的包装，同时外源基因能够随着病毒的复制而表达。
麻疹病毒的以上特点决定了该病毒可以作为一种载体，用于开发活载体疫苗。现有的研究表明，以麻疹为载体，插入腮腺炎病毒等的主要抗原基因构建的重组病毒能够表达外源基因，同时能够在动物体内诱导针对外源蛋白的特异性抗体。
针对于以上情况，本发明通过构建的麻疹病毒反向遗传操作技术平台，将新冠病毒S蛋白的RBD的基因插入到麻疹病毒的P基因和M基因之间，通过病毒拯救成功获得了重组麻疹病毒活载体新冠疫苗株。
本发明的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株
在本发明中，采用病毒学研究的前沿技术，反向遗传操作技术，直接构建基因组中整合有新冠病毒RBD序列的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，能够获得同时预防新冠肺炎和麻疹的活疫苗。
在本发明的实施例中，通过将新冠病毒的RBD序列克隆到麻疹病毒载体的P基因和M基因中间，得到重组的病毒全长克隆载体。将获得的病毒全长克隆载体与辅助质粒共同转染宿主细胞，培养3天后，裂解细胞，并将细胞裂解液离心，得到含有所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株(rMV-PM-RBD1)的上清液。
经多步生长曲线证明，rMV-PM-RBD1与亲本细胞具有基本相似的生长动力学；通过免疫原性分析，rMV-PM-RBD1能够同时刺激免疫小鼠产生针对新冠病毒和麻疹病毒的中和抗体，证明对新冠肺炎和麻疹均有预防作用。
具体地，本发明提供了一种麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，所述病毒株是保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株 (rMV-PM-RBD1)。优选地，本发明所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
其中，所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
(i)在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的P基因和M基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥ 90％，更佳地≥95％。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的P基因和M基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。
在本发明的另一优选例中，还提供了一种麻疹病毒活载体新冠重组病毒株 (rMV-HL-RBD1)，所述病毒株的基因组中含有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
(i)在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的H基因和L基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％，较佳地≥ 90％，更佳地≥95％。
在另一优选例中，所述病毒株的基因组中含有以下核苷酸序列：
在如SEQ ID NO：1所示的麻疹病毒的野生型基因组的H基因和L基因序列中间插入如SEQ ID NO：2所示的含有新冠病毒的RBD序列；和
(ii)与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的序列同一性≥85％、≥86％、≥ 87％、≥88％、≥89％、≥90％、≥91％、≥92％、≥93％、≥94％、≥95％、≥ 96％、≥97％、≥98％或≥99％。
其中，所述含有新冠病毒的RBD的核苷酸序列为：
cttaggaaccaggtccacacagccgccagcccatcaaccatccactcccacgattggagccaatgtttgtttttct tgttttattgccactagtctctagtcagcctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgca tctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttt taagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatg aagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcg ttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctc aaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgtta ctttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctactaatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtt taacaggcacaggtgttcttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgacactac tgatgctgtccgtgatccacagacacttgagtaagtgcgagaggccgagggccagaacaa catccgcctaccatccatcattgttataaaaaa(SEQ ID NO:2)；
其中下划线部分依次为麻疹病毒P基因的5'UTR序列和麻疹病毒N基因的 3'UTR序列，斜体部分为信号肽序列。
本发明的病毒株的制备方法
在本发明中，提供了一种制备麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的方法，所述方法包括步骤：
(S1)构建在麻疹病毒P基因序列和M基因序列中插入新冠病毒的RBD序列的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的全长重组质粒；
(S2)分别获得包含麻疹病毒中的N基因、P基因和L基因以及T7启动子的四种辅助质粒；和
(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的四种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述麻疹病毒活载体新冠重组病毒株。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：BSR-T7细胞、293T细胞、Vero 细胞、Slam/Vero细胞，或其组合。
疫苗组合物
在本发明中，提供了一种疫苗组合物及其制备方法。
本发明的疫苗组合物包括：
(a)如本发明第一方面所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株；和
(b)疫苗上可接受的载体。
优选地，所述的载体是药学上可接受的载体。在一个优选的实施方式中，所述药学上可接受的载体含有液体，较佳地为水、盐水或缓冲液。
所述载体还可含有辅助性的物质，较佳地为填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在另一个优选的实施方式中，所述载体中还含有细胞转染试剂。
在本发明中，所述疫苗组合物为二联疫苗或多联疫苗。优选地，所述疫苗组合物还含有源自一种或多种选自下组的病原体的疫苗组分：风疹、乙型脑炎、甲型肝炎、水痘、脊髓灰质炎、或其组合。
在一个实施方式中，所述的疫苗组分包括灭活株、减毒株、或蛋白、核酸等。
在本发明中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。优选地，所述佐剂包括：颗粒型和非颗粒型佐剂。在一个优选的实施方式中，所述颗粒型佐剂选自下组：铝盐、油包水乳剂、水包油乳剂、纳米颗粒、微小颗粒、脂质体、免疫刺激复合物，或其组合。在另一个优选的实施方式中，所述非颗粒型佐剂选自下组：胞壁酰二肽及其衍生物、皂苷、脂质A、细胞因子、衍生多糖、细菌毒素，微生物及其产物如分枝杆菌(结核杆菌、卡介苗)、短小杆菌、百日咳杆菌、蜂胶、或其组合。
在本发明中，优选地，所述疫苗组合物每剂量中病毒至少4.0lgCCID50。在更加优选的实施方式中，本发明所述的疫苗组合物为注射剂型。
本发明的疫苗组合物的制备方法包括以下步骤：
(S1)对保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒rMV-PM-RBD1进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
病毒株保藏
本发明的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株为麻疹病毒rMV-PM-RBD1，其已于2020年12月24日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉)，保藏号为CCTCC No:V202103。并且，保藏中心已于2020年12月28日对所述病毒株的存活性检测完毕，检测结果为存活。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所述疫苗在免疫机体后能够同时产生针对于麻疹病毒和新冠病毒的特异性抗体，实现使用一种疫苗株预防两种疫病(即新冠肺炎和麻疹)；
(2)本发明所述疫苗的生产用毒株仅为一株，生产工艺更加简单和稳定；
(3)本发明所述疫苗能够在常规疫苗生产车间生产，生物安全风险低。
(4)麻疹疫苗是一种普遍和长期使用的疫苗，一般接种8月龄及以上的儿童。本发明将麻疹病毒作为一种载体，将新冠病毒的主要免疫原蛋白序列插入，构建重组麻疹新冠疫苗，其安全性极大的得到保证，具有重要的现实和社会意义。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
麻疹病毒活载体新冠重组病毒全长克隆构建
重组病毒全长克隆的基本过程如下：
1：首先基于麻疹病毒疫苗株的反向遗传操作技术平台，用限制性内切酶 Sbf I与KasI将质粒pMV(麻疹病毒活载体，如图1所示)线性化，通过胶回收获得到15512bp的片段A；然后以新冠病毒的S基因(体外合成获得)为模板，分别用引物MV-PM-1-F和MV-PM-1-R，MV-PM-2-F和MV-PM-2-R，MV-PM-3-F 和MV-PM-3-R扩增获得片段1、片段2和片段3；用引物MV-PM-1-F和MV-PM-3-R 以片段1、片段2和片段3为模板，通过融合PCR获得片段4(3963bp)，然后用限制性内切酶Sbf I与KasI酶切获得大小为3893bp的片段5；最后将片段A和片段 5用T4连接酶与16℃条件下过夜链接，并转化感受态细胞XL10；最终通过酶切方法鉴定获得阳性克隆rMV-PM-RBD1，备用。
2：基于麻疹病毒疫苗株的反向遗传操作技术平台，用限制性内切酶EcoR I 与BamH I将质粒pMV-2+3+4(此载体为构建pMV载体的中间质粒)线性化，通过胶回收获得到10952bp的片段B；然后以新冠病毒的S基因(体外合成获得) 为模板，分别用引物MV-HL-1-F和MV-HL-1-R，MV-PM-2-F和MV-PM-2-R， MV-HL-3-F和MV-HL-3-R扩增获得片段6、片段2和片段7；用引物MV-HL-1-F 和MV-HL-3-R以片段6、片段2和片段7为模板，通过融合PCR获得片段8(3570 bp)，最后将片段B和片段8用同源重组连接酶于37℃条件下连接30min，并转化感受态细胞XL10；最终通过酶切方法鉴定获得阳性克隆 pMV-2+3+4-HL-RBD1。
用限制性内切酶SfoⅠ与NotⅠ将质粒pMV-2+3+4+RBD1线性化,通过胶回收获得到14455bp的片段C,用限制性内切酶SfoⅠ与NotⅠ将质粒SC-1双酶切，回收4924bp的片段D，最后将片段C和片段D用T4连接酶于16℃条件下过夜连接，并转化感受态细胞XL10；最终通过酶切方法鉴定获得阳性克隆rMV-HL-RBD1，备用。
获得的重组全长克隆的基因架构模式如图2，新冠病毒的RBD基因分别被插入到MV基因组中的P和M基因之间，H和L基因之间。rMV-PM-RBD1和 rMV-HL-RBD1我们将筛选克隆用酶切鉴定，结果如图3所示。rMV-PM-RBD1 全长克隆被Sbf I与KasⅠ切成两个片段，其在核酸凝胶电泳中的大小与理论值 15512bp和3893bp基因一致。rMV-HL-RBD1全长克隆被SmaⅠ切成三个片段，其在核酸凝胶电泳中的大小与理论值4377bp、3803bp和11225bp基因一致。
表1全长克隆构建相关引物信息
Figure GDA0003703349530000121
Figure GDA0003703349530000131
实施例2
麻疹病毒活载体新冠重组病毒的拯救与鉴定
首先用去内毒素试剂盒大量提取全长克隆和辅助质粒备用。
将293T细胞接种于六孔板中过夜培养，选择细胞汇合度80-90％的细胞孔用于病毒拯救。具体过程如下：将全长质粒pMV或rMV-PM-RBD1或者 rMV-HL-RBD1(4μg)、辅助质粒pcDNA3.1-N(1.5μg)、pcDNA3.1-P(0.2μg)、pcDNA3.1-L(1.0μg)、pCAGGS-T7(1.0μg)与LipofectamineTM 2000转染试剂 (12μL)混合于500μL DMEM培养基中，37℃孵育20min；用PBS洗涤细胞3次，而后将质粒转染试剂混合物加入细胞孔中，37℃孵育6h。用PBS洗涤3次，更换为含2％胎牛血清，1％抗生素的DMEM培养基，37℃继续培养3-4天；将细胞按1:3进行传代，同时加入等量的Vero-Slam细胞，继续培养，直至细胞出现融合病变，收集细胞上清并进行鉴定。分别通过IFA确定嵌合病毒拯救成功。
在24孔板中每孔接种105个Vero细胞过夜培养，分别用rMV、rMV-PM-RBD1 或者rMV-HL-RBD1以MOI＝0.01接种细胞，接种体积为200μl，37℃孵育1h，换含2％FBS的维持液继续培养48h，尽弃上清，用80％丙酮固定细胞15min，进行IFA鉴定。分别用MV的兔源多克隆抗体(1:500)和新冠病毒RBD的兔源多克隆抗体(1:500)作为一抗，37℃孵育90min，PBS洗三遍，然后用羊抗兔 FITC标记二抗(1:200)孵育45min，PBS洗三遍，于荧光显微镜下拍照观察。
结果如图4所示，当一抗是兔源MV多抗时，三种病毒感染的细胞均呈阳性；当一抗是兔源的新冠病毒RBD抗体时，rMV感染的细胞呈阴性，rMV-PM-RBD1 和rMV-HL-RBD1感染的细胞则呈现阳性。这说明，两个重组病毒 rMV-PM-RBD1或者rMV-HL-RBD1的RBD是正确插入并可以在体外表达的。
于12孔板中每孔接种5×105个Vero细胞过夜培养，分别用rMV、 rMV-PM-RBD1或者rMV-HL-RBD1以MOI＝0.1接种细胞，接种体积为100μl，37 ℃孵育1h，换含2％FBS的维持液继续培养48h，尽弃上清，加入RIPA裂解液， 4℃裂解细胞20min，10000g离心10min，Western-Blot检测RBD表达量，结果如图5所示，同样上样量条件下，rMV不表达RBD，rMV-PM-RBD1的RBD条带明显比rMV-HL-RBD1深，说明rMV-PM-RBD1的表达量比较大；并且，三者均表达MV的N蛋白。
实施例3
麻疹病毒活载体新冠重组病毒的生长特性
为了验证新冠病毒RBD基因的插入是否影响了重组麻疹病毒的复制能力，我们在Vero细胞中对重组病毒和亲本病毒的多步生长曲线进行了研究。首先在六孔细胞培养板每孔接种106个Vero细胞过夜培养，然后将分别rMV-PM-RBD1， rMV-HL-RBD1和亲本病毒rMuV分别以MOI＝0.01接种细胞，吸附感染1h后换成含2％胎牛血清的细胞维持液进行培养。分别于接种病毒24h、48h、72h、96h、 120h和收集培养上清进行毒价测定，绘制多步生长曲线，分析不同病毒在生长动力学上是否存在差异。
结果如图6所示，rMV和rMV-HL-RBD1的多步生长曲线几乎一致，说明 RBD在H基因和L基因间的间隔区的插入并没有显著影响MV的复制能力；而 rMV-PM-RBD1的滴度略低于亲本病毒rMV，但是差异不显著。该趋势符合负链RNA病毒的各个基因表达的衰减规律，即基因在基因组中越靠近3’端的先导序列，其表达量越高；外源基因的插入越靠近先导序列，其表达量也越高，但是对重组病毒的滴度影响越大。
综合以上结果，最终选择rMV-PM-RBD1作为候选病毒株并开展后续评价。
实施例4
麻疹病毒活载体新冠重组病毒的免疫原性分析
选取SPF级6-8周雌性BALB/c小鼠30只，随机分成3组(A、B和C组)；各组分别通过腹腔注射的方式免疫5×105CCID50的rMV，rMV-PM-RBD1和 DMEM，免疫体积为500μl(图7)；初次免疫14天时以相同的病毒量和体积加强免疫一次，初次免疫28天时，采集血液分离血清，通过微量病变中和法测定测定血清中麻疹病毒特异性中和抗体滴度，确定RBD的插入是否影响了病毒载体的免疫原性；同时用新冠病毒S蛋白抗体检测ELISA确定被免小鼠血清中的特异性新冠抗体滴度。
麻疹病毒的微量病变中和试验方法如下：
先将待检血清于56℃灭活30min，然后进行2倍倍比稀释，每个血清稀释度取50μL加入50μL的A基因型麻疹病毒(含100CCID50)，37℃条件下作用1h。加入100μL含有10％胎牛血清DMEM细胞培养液，37℃，5％CO2培养7天，于显微镜下观察细胞的病变情况。按照Reed-Muench公式计算血清抗体的中和效价。
新冠病毒特异性抗体ELISA方法如下：
抗原包被：将商品化RBD蛋白稀释后，加样包被至96孔板内，每孔加入 50μL，4℃包被过夜；
封闭：洗板4-5次，加入200μl封闭液，置于37℃，封闭2h；
加样：洗板4-5次，将稀释好的样品依次加到96孔板内，每孔加样100μL, 封膜置37℃，培养40min；
洗板4-5次，每孔加羊抗鼠IgG(稀释3000*)100μL，封膜置37℃，培养30min；
洗板4-5次，每孔加TMB 100μL，封膜置37℃，培养15min。并设好酶标仪预热；
每孔加终止液50μl，显色，在酶标仪中读数(10min内完成)。
结果如图8，无论是免疫后2周和4周，rMV和rMV-PM-RBD1免疫的小鼠外周血血清中的抗麻疹病毒特异性中和抗体滴度都一致，说明，RBD的插入并没有影响到载体病毒的免疫原性。同时，检测血清中抗新冠病毒特异性抗体的 ELISA效价，结果如表2所示，rMV和DMEM组的小鼠血清中没有效价，而 rMV-PM-RBD1免疫两次后的ELISA效价达到了1：6400(如表2所示)，说明该重组病毒具备作为新冠疫苗的潜质。
表2.重组病毒免疫后的RBD的ELISA抗体滴度
组别 一免后2周 一免后4周
rMV -- --
rMV-PM-RBD1 1:200 1:6400
DMEM -- --
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海青赛生物科技有限公司
北京赛尔富森生物科技有限公司
<120> 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗
<130> P2020-2811
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15894
<212> DNA
<213> 麻疹病毒（Measles virus）
<400> 1
accaaacaaa gttgggtaag gatagttcaa tcaatgatca tcttctagtg cacttaggat 60
tcaagatcct attatcaggg acaagagcag gattagggat atccgagatg gccacacttt 120
taaggagctt agcattgttc aaaagaaaca aggacaaacc acccattaca tcaggatccg 180
gtggagccat cagaggaatc aaacacatta ttatagtacc aatccctgga gattcctcaa 240
ttaccactcg atccagactt ctggaccggt tggtgaggtt aattggaaac ccggatgtga 300
gcgggcccaa actaacaggg gcactaatag gtatattatc cttatttgtg gagtctccag 360
gtcaattgat tcagaggatc accgatgacc ctgacgttag cataaggctg ttagaggttg 420
tccagagtga ccagtcacaa tctggcctta ccttcgcatc aagaggtacc aacatggagg 480
atgaggcgga ccaatacttt tcacatgatg atccaattag tagtgatcaa tccaggttcg 540
gatggttcgg gaacaaggaa atctcagata ttgaagtgca agaccctgag ggattcaaca 600
tgattctggg taccatccta gcccaaattt gggtcttgct cgcaaaggcg gttacggccc 660
cagacacggc agctgattcg gagctaagaa ggtggataaa gtacacccaa caaagaaggg 720
tagttggtga atttagattg gagagaaaat ggttggatgt ggtgaggaac aggattgccg 780
aggacctctc cttacgccga ttcatggtcg ctctaatcct ggatatcaag agaacacccg 840
gaaacaaacc caggattgct gaaatgatat gtgacattga tacatatatc gtagaggcag 900
gattagccag ttttatcctg actattaagt ttgggataga aactatgtat cctgctcttg 960
gactgcatga atttgctggt gagttatcca cacttgagtc cttgatgaac ctttaccagc 1020
aaatggggga aactgcaccc tacatggtaa tcctggagaa ctcaattcag aacaagttca 1080
gtgcaggatc ataccctctg ctctggagct atgccatggg agtaggagtg gaacttgaaa 1140
actccatggg aggtttgaac tttggccgat cttactttga tccagcatat tttagattag 1200
ggcaagagat ggtaaggagg tcagctggaa aggtcagttc cacattggca tctgaactcg 1260
gtatcactgc cgaggatgca aggcttgttt cagagattgc aatgcatact actgaggaca 1320
agatcagtag agcggttgga cccagacaag cccaagtatc atttctacac ggtgatcaaa 1380
gtgagaatga gctaccgaga ttggggggca aggaagatag gagggtcaaa cagagtcgag 1440
gagaagccag ggagagctac agagaaaccg ggcccagcag agcaagtgat gcgagagctg 1500
cccatcttcc aaccggcaca cccctagaca ttgacactgc aacggagtcc agccaagatc 1560
cgcaggacag tcgaaggtca gctgacgccc tgcttaggct gcaagccatg gcaggaatct 1620
cggaagaaca aggctcagac acggacaccc ctatagtgta caatgacaga aatcttctag 1680
actaggtgcg agaggccgag ggccagaaca acatccgcct accatccatc attgttataa 1740
aaaacttagg aaccaggtcc acacagccgc cagcccatca accatccact cccacgattg 1800
gagccaatgg cagaagagca ggcacgccat gtcaaaaacg gactggaatg catccgggct 1860
ctcaaggccg agcccatcgg ctcactggcc atcgaggaag ctatggcagc atggtcagaa 1920
atatcagaca acccaggaca ggagcgagcc acctgcaggg aagagaaggc aggcagttcg 1980
ggtctcagca aaccatgcct ctcagcaatt ggatcaactg aaggcggtgc acctcgcatc 2040
cgcggtcagg gacctggaga gagcgatgac gacgctgaaa ctttgggaat ccccccaaga 2100
aatctccagg catcaagcac tgggttacag tgttattacg tttatgatca cagcggtgaa 2160
gcggttaagg gaatccaaga tgctgactct atcatggttc aatcaggcct tgatggtgat 2220
agcaccctct caggaggaga caatgaatct gaaaacagcg atgtggatat tggcgaacct 2280
gataccgagg gatatgctat cactgaccgg ggatctgctc ccatctctat ggggttcagg 2340
gcttctgatg ttgaaactgc agaaggaggg gagatccacg agctcctgag actccaatcc 2400
agaggcaaca actttccgaa gcttgggaaa actctcaatg ttcctccgcc cccggacccc 2460
ggtagggcca gcacttccgg gacacccatt aaaaagggca cagacgcgag attagcctca 2520
tttggaacgg agatcgcgtc tttattgaca ggtggtgcaa cccaatgtgc tcgaaagtca 2580
ccctcggaac catcagggcc aggtgcacct gcggggaatg tccccgagtg tgtgagcaat 2640
gccgcactga tacaggagtg gacacccgaa tctggtacca caatctcccc gagatcccag 2700
aataatgaag aagggggaga ctattatgat gatgagctgt tctctgatgt ccaagatatt 2760
aaaacagcct tggccaaaat acacgaggat aatcagaaga taatctccaa gctagaatca 2820
ctgctgttat tgaagggaga agttgagtca attaagaagc agatcaacag gcaaaatatc 2880
agcatatcca ccctggaagg acacctctca agcatcatga tcgccattcc tggacttggg 2940
aaggatccca acgaccccac tgcagatgtc gaaatcaatc ccgacttgaa acccatcata 3000
ggcagagatt caggccgagc actggccgaa gttctcaaga aacccgttgc cagccgacaa 3060
ctccaaggaa tgacaaatgg acggaccagt tccagaggac agctgctgaa ggaatttcag 3120
ctaaagccga tcgggaaaaa gatgagctca gccgtcgggt ttgttcctga caccggccct 3180
gcatcacgca gtgtaatccg ctccattata aaatccagcc ggctagagga ggatcggaag 3240
cgttacctga tgactctcct tgatgatatc aaaggagcca atgatcttgc caagttccac 3300
cagatgctga tgaagataat aatgaagtag ctacagctca acttacctgc caaccccatg 3360
ccagtcgacc caactagtac aacctaaatc cattataaaa aacttaggag caaagtgatt 3420
gcctcccaag gtccacaatg acagagacct acgacttcga caagtcggca tgggacatca 3480
aagggtcgat cgctccgata caacccacca cctacagtga tggcaggctg gtgccccagg 3540
tcagagtcat agatcctggt ctaggcgaca ggaaggatga atgctttatg tacatgtttc 3600
tgctgggggt tgttgaggac agcgattccc tagggcctcc aatcgggcga gcatttgggt 3660
tcctgccctt aggtgttggc agatccacag caaagcccga aaaactcctc aaagaggcca 3720
ctgagcttga catagttgtt agacgtacag cagggctcaa tgaaaaactg gtgttctaca 3780
acaacacccc actaactctc ctcacacctt ggagaaaggt cctaacaaca gggagtgtct 3840
tcaacgcaaa ccaagtgtgc aatgcggtta atctgatacc gctcgatacc ccgcagaggt 3900
tccgtgttgt ttatatgagc atcacccgtc tttcggataa cgggtattac accgttccta 3960
gaagaatgct ggaattcaga tcggtcaatg cagtggcctt caacctgctg gtgaccctta 4020
ggattgacaa ggcgataggc cctgggaaga tcatcgacaa tacagagcaa cttcctgagg 4080
caacatttat ggtccacatc gggaacttca ggagaaagaa gagtgaagtc tactctgccg 4140
attattgcaa aatgaaaatc gaaaagatgg gcctggtttt tgcacttggt gggatagggg 4200
gcaccagtct tcacattaga agcacaggca aaatgagcaa gactctccat gcacaactcg 4260
ggttcaagaa gaccttatgt tacccgctga tggatatcaa tgaagacctt aatcgattac 4320
tctggaggag cagatgcaag atagtaagaa tccaggcagt tttgcagcca tcagttcctc 4380
aagaattccg catttacgac gacgtgatca taaatgatga ccaaggacta ttcaaagttc 4440
tgtagaccgt agtgcccagc aatgcccgaa aacgaccccc ctcacaatga cagccagaag 4500
gcccggacaa aaaagccccc tccgaaagac tccacggacc aagcgagagg ccagccagca 4560
gccgacggca agcgcgaaca ccaggcggcc ccagcacaga acagccctga cacaaggcca 4620
ccaccagcca ccccaatctg catcctcctc gtgggacccc cgaggaccaa cccccaaggc 4680
tgcccccgat ccaaaccacc aaccgcatcc ccaccacccc cgggaaagaa acccccagca 4740
attggaaggc ccctccccct cttcctcaac acaagaactc cacaaccgaa ccgcacaagc 4800
gaccgaggtg acccaaccgc aggcatccga ctccctagac agatcctctc tccccggcaa 4860
actaaacaaa acttagggcc aaggaacata cacacccaac agaacccaga ccccggccca 4920
cggcgccgcg cccccaaccc ccgacaacca gagggagccc ccaaccaatc ccgccggctc 4980
ccccggtgcc cacaggcagg gacaccaacc cccgaacaga cccagcaccc aaccatcgac 5040
aatccaagac gggggggccc ccccaaaaaa aggcccccag gggccgacag ccagcaccgc 5100
gaggaagccc acccacccca cacacgacca cggcaaccaa accagaaccc agaccaccct 5160
gggccaccag ctcccagact cggccatcac cccgcagaaa ggaaaggcca caacccgcgc 5220
accccagccc cgatccggcg gggagccacc caacccgaac cagcacccaa gagcgatccc 5280
cgaaggaccc ccgaaccgca aaggacatca gtatcccaca gcctctccaa gtcccccggt 5340
ctcctcctct tctcgaaggg accaaaagat caatccacca cacccgacga cactcaactc 5400
cccaccccta aaggagacac cgggaatccc agaatcaaga ctcatccaat gtccatcatg 5460
ggtctcaagg tgaacgtctc tgccatattc atggcagtac tgttaactct ccaaacaccc 5520
accggtcaaa tccattgggg caatctctct aagatagggg tggtaggaat aggaagtgca 5580
agctacaaag ttatgactcg ttccagccat caatcattag tcataaaatt aatgcccaat 5640
ataactctcc tcaataactg cacgagggta gagattgcag aatacaggag actactgaga 5700
acagttttgg aaccaattag agatgcactt aatgcaatga cccagaatat aagaccggtt 5760
cagagtgtag cttcaagtag gagacacaag agatttgcgg gagtagtcct ggcaggtgcg 5820
gccctaggcg ttgccacagc tgctcagata acagccggca ttgcacttca ccagtccatg 5880
ctgaactctc aagccatcga caatctgaga gcgagcctgg aaactactaa tcaggcaatt 5940
gagacaatca gacaagcagg gcaggagatg atattggctg ttcagggtgt ccaagactac 6000
atcaataatg agctgatacc gtctatgaac caactatctt gtgatttaat cggccagaag 6060
ctcgggctca aattgctcag atactataca gaaatcctgt cattatttgg ccccagttta 6120
cgggacccca tatctgcgga gatatctatc caggctttga gctatgcgct tggaggagac 6180
atcaataagg tgttagaaaa gctcggatac agtggaggtg atttactggg catcttagag 6240
agcggaggaa taaaggcccg gataactcac gtcgacacag agtcctactt cattgtcctc 6300
agtatagcct atccgacgct gtccgagatt aagggggtga ttgtccaccg gctagagggg 6360
gtctcgtaca acataggctc tcaagagtgg tataccactg tgcccaagta tgttgcaacc 6420
caagggtacc ttatctcgaa ttttgatgag tcatcgtgta ctttcatgcc agaggggact 6480
gtgtgcagcc aaaatgcctt gtacccgatg agtcctctgc tccaagaatg cctccggggg 6540
tacaccaagt cctgtgctcg tacactcgta tccgggtctt ttgggaaccg gttcatttta 6600
tcacaaggga acctaatagc caattgtgca tcaatccttt gcaagtgtta cacaacagga 6660
acgatcatta atcaagaccc tgacaagatc ctaacataca ttgctgccga tcactgcccg 6720
gtagtcgagg tgaacggcgt gaccatccaa gtcgggagca ggaggtatcc agacgctgtg 6780
tacttgcaca gaattgacct cggtcctccc atatcattgg agaggttgga cgtagggaca 6840
aatctgggga atgcaattgc taagttggag gatgccaagg aattgttgga gtcatcggac 6900
cagatattga ggagtatgaa aggtttatcg agcactagca tagtctacat cctgattgca 6960
gtgtgtcttg gagggttgat agggatcccc gctttaatat gttgctgcag ggggcgttgt 7020
aacaaaaagg gagaacaagt tggtatgtca agaccaggcc taaagcctga tcttacggga 7080
acatcaaaat cctatgtaag gtcgctctga tcctctacaa ctcttgaaac acaaatgtcc 7140
cacaagtctc ctcttcgtca tcaagcaacc accgcaccca gcatcaagcc cacctgaaat 7200
tatctccggc ttccctctgg ccgaacaata tcggtagtta atcaaaactt agggtgcaag 7260
atcatccaca atgtcaccac aacgagaccg gataaatgcc ttctacaaag ataaccccca 7320
tcccaaggga agtaggatag tcattaacag agaacatctt atgattgata gaccttatgt 7380
tttgctggct gttctgtttg tcatgtttct gagcttgatc gggttgctag ccattgcagg 7440
cattagactt catcgggcag ccatctacac cgcagagatc cataaaagcc tcagcaccaa 7500
tctagatgta actaactcaa tcgagcatca ggtcaaggac gtgctgacac cactcttcaa 7560
aatcatcggt gatgaagtgg gcctgaggac acctcagaga ttcactgacc tagtgaaatt 7620
aatctctgac aagattaaat tccttaatcc ggatagggag tacgacttca gagatctcac 7680
ttggtgtatc aacccgccag agagaatcaa attggattat gatcaatact gtgcagatgt 7740
ggctgctgaa gagctcatga atgcattggt gaactcaact ctactggaga ccagaacaac 7800
caatcagttc ctagctgtct caaagggaaa ctgctcaggg cccactacaa tcagaggtca 7860
attctcaaac atgtcgctgt ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt acaatgtgtc 7920
atctatagtc actatgacat cccagggaat gtatggggga acttacctag tggaaaagcc 7980
taatctgagc agcaaaaggt cagagttgtc acaactgagc atgtaccgag tgtttgaagt 8040
aggtgttatc agaaatccgg gtttgggggc tccggtgttc catatgacaa actatcttga 8100
gcaaccagtc agtaatgatc tcagcaactg tatggtggct ttgggggagc tcaaactcgc 8160
agccctttgt cacggggaag attctatcac aattccctat cagggatcag ggaaaggtgt 8220
cagcttccag ctcgtcaagc taggtgtctg gaaatcccca accgacatgc aatcctgggt 8280
ccccttatca acggatgatc cagtgataga caggctttac ctctcatctc acagaggtgt 8340
tatcgctgac aatcaagcaa aatgggctgt cccgacaaca cgaacagatg acaagttgcg 8400
aatggagaca tgcttccaac aggcgtgtaa gggtaaaatc caagcactct gcgagaatcc 8460
cgagtgggca ccattgaagg ataacaggat tccttcatac ggggtcttgt ctgttgatct 8520
gagtctgaca gttgagctta aaatcaaaat tgcttcggga ttcgggccat tgatcacaca 8580
cggttcaggg atggacctat acaaatccaa ccacaacaat gtgtattggc tgactatccc 8640
gccaatgaag aacctagcct taggtgtaat caacacattg gagtggatac cgagattcaa 8700
ggttagtccc tacctcttca ctgtcccaat taaggaagca ggcgaagact gccatgcccc 8760
aacataccta cctgcggagg tggatggtga tgtcaaactc agttccaatc tggtgattct 8820
acctggtcaa gatctccaat atgttttggc aacctacgat acttccaggg ttgaacatgc 8880
tgtggtttat tacgtttaca gcccaagccg ctcattttct tacttttatc cttttaggtt 8940
gcctataaag ggggtcccca tcgaattaca agtggaatgc ttcacatggg accaaaaact 9000
ctggtgccgt cacttctgtg tgcttgcgga ctcagaatct ggtggacata tcactcactc 9060
tgggatggtg ggcatgggag tcagctgcac agtcacccgg gaagatggaa ccaatcgcag 9120
atagggctgc tagtgaacca atcacatgat gtcacccaga catcaggcat acccactagt 9180
gtgaaataga catcagaatt aagaaaaacg tagggtccaa gtggttcccc gttatggact 9240
cgctatctgt caaccagatc ttataccctg aagttcacct agatagcccg atagttacca 9300
ataagatagt agccatcctg gagtatgctc gagtccctca cgcttacagc ctggaggacc 9360
ctacactgtg tcagaacatc aagcaccgcc taaaaaacgg attttccaac caaatgatta 9420
taaacaatgt ggaagttggg aatgtcatca agtccaagct taggagttat ccggcccact 9480
ctcatattcc atatccaaat tgtaatcagg atttatttaa catagaagac aaagagtcaa 9540
cgaggaagat ccgtgaactc ctcaaaaagg ggaattcgct gtactccaaa gtcagtgata 9600
aggttttcca atgcttaagg gacactaact cacggcttgg cctaggctcc gaattgaggg 9660
aggacatcaa ggagaaagtt attaacttgg gagtttacat gcacagctcc cagtggtttg 9720
agccctttct gttttggttt acagtcaaga ctgagatgag gtcagtgatt aaatcacaaa 9780
cccatacttg ccataggagg agacacacac ctgtattctt cactggtagt tcagttgagt 9840
tgctaatctc tcgtgacctt gttgctataa tcagtaaaga gtctcaacat gtatattacc 9900
tgacatttga actggttttg atgtattgtg atgtcataga ggggaggtta atgacagaga 9960
ccgctatgac tattgatgct aggtatacag agcttctagg aagagtcaga tacatgtgga 10020
aactgataga tggtttcttc cctgcactcg ggaatccaac ttatcaaatt gtagccatgc 10080
tggagcctct ttcacttgct tacctgcagc tgagggatat aacagtagaa ctcagaggtg 10140
ctttccttaa ccactgcttt actgaaatac atgatgttct tgaccaaaac gggttttctg 10200
atgaaggtac ttatcatgag ttaactgaag ctctagatta cattttcata actgatgaca 10260
tacatctgac aggggagatt ttctcatttt tcagaagttt cggccacccc agacttgaag 10320
cagtaacggc tgctgaaaat gttaggaaat acatgaatca gcctaaagtc attgtgtatg 10380
agactctgat gaaaggtcat gccatatttt gtggaatcat aatcaacggc tatcgtgaca 10440
ggcacggagg cagttggcca ccgctgaccc tccccctgca tgctgcagac acaatccgga 10500
atgctcaagc ttcaggtgaa gggttaacac atgagcagtg cgttgataac tggaaatctt 10560
ttgctggagt gaaatttggc tgctttatgc ctcttagcct ggatagtgat ctgacaatgt 10620
acctaaagga caaggcactt gctgctctcc aaagggaatg ggattcagtt tacccgaaag 10680
agttcctgcg ttacgaccct cccaagggaa ccgggtcacg gaggcttgta gatgttttcc 10740
ttaatgattc gagctttgac ccatatgatg tgataatgta tgttgtaagt ggagcttacc 10800
tccatgaccc tgagttcaac ctgtcttaca gcctgaaaga aaaggagatc aaggaaacag 10860
gtagactttt tgctaaaatg acttacaaaa tgagggcatg ccaagtgatt gctgaaaatc 10920
taatctcaaa cgggattggc aaatatttta aggacaatgg gatggccaag gatgagcacg 10980
atttgactaa ggcactccac actctagctg tctcaggagt ccccaaagat ctcaaagaaa 11040
gtcacagggg ggggccagtc ttaaaaacct actcccgaag cccagtccac acaagtacca 11100
ggaacgtgag agcagcaaaa gggtttatag ggttccctca agtaattcgg caggaccaag 11160
acactgatca tccggagaat atggaagctt acgagacagt cagtgcattt atcacgactg 11220
atctcaagaa gtactgcctt aattggagat atgagaccat cagcttgttt gcacagaggc 11280
taaatgagat ttacggattg ccctcatttt tccagtggct gcataagagg cttgagacct 11340
ctgtcctgta tgtaagtgac cctcattgcc cccccgacct tgacgcccat atcccgttat 11400
ataaagtccc caatgatcaa atcttcatta agtaccctat gggaggtata gaagggtatt 11460
gtcagaagct gtggaccatc agcaccattc cctatctata cctggctgct tatgagagcg 11520
gagtaaggat tgcttcgtta gtgcaagggg acaatcagac catagccgta acaaaaaggg 11580
tacccagcac atggccctac aaccttaaga aacgggaagc tgctagagta actagagatt 11640
actttgtaat tcttaggcaa aggctacatg atattggcca tcacctcaag gcaaatgaga 11700
caattgtttc atcacatttt tttgtctatt caaaaggaat atattatgat gggctacttg 11760
tgtcccaatc actcaagagc atcgcaagat gtgtattctg gtcagagact atagttgatg 11820
aaacaagggc agcatgcagt aatattgcta caacaatggc taaaagcatc gagagaggtt 11880
atgaccgtta ccttgcatat tccctgaacg tcctaaaagt gatacagcaa attctgatct 11940
ctcttggctt cacaatcaat tcaaccatga cccgggatgt agtcataccc ctcctcacaa 12000
acaacgacct cttaataagg atggcactgt tgcccgctcc tattgggggg atgaattatc 12060
tgaatatgag caggctgttt gtcagaaaca tcggtgatcc agtaacatca tcaattgctg 12120
atctcaagag aatgattctc gcctcactaa tgcctgaaga gaccctccat caagtaatga 12180
cacaacaacc gggggactct tcattcctag actgggctag cgacccttac tcagcaaatc 12240
ttgtatgtgt ccagagcatc actagactcc tcaagaacat aactgcaagg tttgtcctga 12300
tccatagtcc aaacccaatg ttaaaaggat tattccatga tgacagtaaa gaagaggacg 12360
agggactggc ggcattcctc atggacaggc atattatagt acctagggca gctcatgaaa 12420
tcctggatca tagtgtcaca ggggcaagag agtctattgc aggcatgctg gataccacaa 12480
aaggcttgat tcgagccagc atgaggaagg gggggttaac ctctcgagtg ataaccagat 12540
tgtccaatta tgactatgaa caattcagag cagggatggt gctattgaca ggaagaaaga 12600
gaaatgtcct cattgacaaa gagtcatgtt cagtgcagct ggcgagagct ctaagaagcc 12660
atatgtgggc gaggctagct cgaggacggc ctatttacgg ccttgaggtc cctgatgtac 12720
tagaatctat gcgaggccac cttattcggc gtcatgagac atgtgtcatc tgcgagtgtg 12780
gatcagtcaa ctacggatgg ttttttgtcc cctcgggttg ccaactggat gatattgaca 12840
aggaaacatc atccttgaga gtcccatata ttggttctac cactgatgag agaacagaca 12900
tgaagcttgc cttcgtaaga gccccaagtc gatccttgcg atctgctgtt agaatagcaa 12960
cagtgtactc atgggcttac ggtgatgatg atagctcttg gaacgaagcc tggttgttgg 13020
ctaggcaaag ggccaatgtg agcctggagg agctaagggt gatcactccc atctcaactt 13080
cgactaattt agcgcatagg ttgagggatc gtagcactca agtgaaatac tcaggtacat 13140
cccttgtccg agtggcgagg tataccacaa tctccaacga caatctctca tttgtcatat 13200
cagataagaa ggttgatact aactttatat accaacaagg aatgcttcta gggttgggtg 13260
ttttagaaac attgtttcga ctcgagaaag ataccggatc atctaacacg gtattacatc 13320
ttcacgtcga aacagattgt tgcgtgatcc cgatgataga tcatcccagg atacccagct 13380
cccgcaagct agagctgagg gcagagctat gtaccaaccc attgatatat gataatgcac 13440
ctttaattga cagagatgca acaaggctat acacccagag ccataggagg caccttgtgg 13500
aatttgttac atggtccaca ccccaactat atcacatttt agctaagtcc acagcactat 13560
ctatgattga cctggtaaca aaatttgaga aggaccatat gaatgaaatt tcagctctca 13620
taggggatga cgatatcaat agtttcataa ctgagtttct gctcatagag ccaagattat 13680
tcactatcta cttgggccag tgtgcggcca tcaattgggc atttgatgta cattatcata 13740
gaccatcagg gaaatatcag atgggtgagc tgttgtcatc gttcctttct agaatgagca 13800
aaggagtgtt taaggtgctt gtcaatgctc taagccaccc aaagatctac aagaaattct 13860
ggcattgtgg tattatagag cctatccatg gtccttcact tgatgctcaa aacttgcaca 13920
caactgtgtg caacatggtt tacacatgct atatgaccta cctcgacctg ttgttgaatg 13980
aagagttaga agagttcaca tttctcttgt gtgaaagcga cgaggatgta gtaccggaca 14040
gattcgacaa catccaggca aaacacttat gtgttctggc agatttgtac tgtcaaccag 14100
ggacctgccc accaattcga ggtctaagac cggtagagaa atgtgcagtt ctaaccgacc 14160
atatcaaggc agaggctatg ttatctccag caggatcttc gtggaacata aatccaatta 14220
ttgtagacca ttactcatgc tctctgactt atctccggcg aggatcgatc aaacagataa 14280
gattgagagt tgatccagga ttcattttcg acgccctcgc tgaggtaaat gtcagtcagc 14340
caaagatcgg cagcaacaac atctcaaata tgagcatcaa ggctttcaga cccccacacg 14400
atgatgttgc aaaattgctc aaagatatca acacaagcaa gcacaatctt cccatttcag 14460
ggggcaatct cgccaattat gaaatccatg ctttccgcag aatcgggttg aactcatctg 14520
cttgctacaa agctgttgag atatcaacat taattaggag atgccttgag ccaggggagg 14580
acggcttgtt cttgggtgag ggatcgggtt ctatgttgat cacttataaa gagatactta 14640
aactaaacaa gtgcttctat aatagtgggg tttccgccaa ttctagatct ggtcaaaggg 14700
aattagcacc ctatccctcc gaagttggcc ttgtcgaaca cagaatggga gtaggtaata 14760
ttgtcaaagt gctctttaac gggaggcccg aagtcacgtg ggtaggcagt gtagattgct 14820
tcaatttcat agttagtaat atccctacct ctagtgtggg gtttatccat tcagatatag 14880
agaccttgcc tgacaaagat actatagaga agctagagga attggcagcc atcttatcga 14940
tggctctgct cctgggcaaa ataggatcaa tactggtgat taagcttatg cctttcagcg 15000
gggattttgt tcagggattt ataagttatg tagggtctca ttatagagaa gtgaaccttg 15060
tataccctag atacagcaac ttcatctcta ctgaatctta tttggttatg acagatctca 15120
aggctaaccg gctaatgaat cctgaaaaga ttaagcagca gataattgaa tcatctgtga 15180
ggacttcacc tggacttata ggtcacatcc tatccattaa gcaactaagc tgcatacaag 15240
caattgtggg agacgcagtt agtagaggtg atatcaatcc tactctgaaa aaacttacac 15300
ctatagagca ggtgctgatc aattgcgggt tggcaattaa cggacctaag ctgtgcaaag 15360
aattgatcca ccatgatgtt gcctcagggc aagatggatt gcttaattct atactcatcc 15420
tctacaggga gttggcaaga ttcaaagaca accaaagaag tcaacaaggg atgttccacg 15480
cttaccccgt attggtaagt agcaggcaac gagaacttat atctaggatc acccgcaaat 15540
tctgggggca cattcttctt tactccggga acaaaaagtt gataaataag tttatccaga 15600
atctcaagtc cggctatctg atactagact tacaccagaa tatcttcgtt aagaatctat 15660
ccaagtcaga gaaacagatt attatgacgg ggggtttgaa acgtgagtgg gtttttaagg 15720
taacagtcaa ggagaccaaa gaatggtata agttagtcgg atacagtgcc ctgattaagg 15780
actaattggt tgaactccgg aaccctaatc ctgccctagg tggttaggca ttatttgcaa 15840
tatattaaag aaaactttga aaatacgaag tttctattcc cagctttgtc tggt 15894
<210> 2
<211> 928
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cttaggaacc aggtccacac agccgccagc ccatcaacca tccactccca cgattggagc 60
caatgtttgt ttttcttgtt ttattgccac tagtctctag tcagcctaat attacaaact 120
tgtgcccttt tggtgaagtt tttaacgcca ccagatttgc atctgtttat gcttggaaca 180
ggaagagaat cagcaactgt gttgctgatt attctgtcct atataattcc gcatcatttt 240
ccacttttaa gtgttatgga gtgtctccta ctaaattaaa tgatctctgc tttactaatg 300
tctatgcaga ttcatttgta attagaggtg atgaagtcag acaaatcgct ccagggcaaa 360
ctggaaagat tgctgattat aattataaat taccagatga ttttacaggc tgcgttatag 420
cttggaattc taacaatctt gattctaagg ttggtggtaa ttataattac ctgtatagat 480
tgtttaggaa gtctaatctc aaaccttttg agagagatat ttcaactgaa atctatcagg 540
ccggtagcac accttgtaat ggtgttgaag gttttaattg ttactttcct ttacaatcat 600
atggtttcca acccactaat ggtgttggtt accaaccata cagagtagta gtactttctt 660
ttgaacttct acatgcacca gcaactgttt gtggacctaa aaagtctact aatttggtta 720
aaaacaaatg tgtcaatttc aacttcaatg gtttaacagg cacaggtgtt cttactgagt 780
ctaacaaaaa gtttctgcct ttccaacaat ttggcagaga cattgctgac actactgatg 840
ctgtccgtga tccacagaca cttgagtaag tgcgagaggc cgagggccag aacaacatcc 900
gcctaccatc catcattgtt ataaaaaa 928
<210> 3
<211> 16822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
accaaacaaa gttgggtaag gatagttcaa tcaatgatca tcttctagtg cacttaggat 60
tcaagatcct attatcaggg acaagagcag gattagggat atccgagatg gccacacttt 120
taaggagctt agcattgttc aaaagaaaca aggacaaacc acccattaca tcaggatccg 180
gtggagccat cagaggaatc aaacacatta ttatagtacc aatccctgga gattcctcaa 240
ttaccactcg atccagactt ctggaccggt tggtgaggtt aattggaaac ccggatgtga 300
gcgggcccaa actaacaggg gcactaatag gtatattatc cttatttgtg gagtctccag 360
gtcaattgat tcagaggatc accgatgacc ctgacgttag cataaggctg ttagaggttg 420
tccagagtga ccagtcacaa tctggcctta ccttcgcatc aagaggtacc aacatggagg 480
atgaggcgga ccaatacttt tcacatgatg atccaattag tagtgatcaa tccaggttcg 540
gatggttcgg gaacaaggaa atctcagata ttgaagtgca agaccctgag ggattcaaca 600
tgattctggg taccatccta gcccaaattt gggtcttgct cgcaaaggcg gttacggccc 660
cagacacggc agctgattcg gagctaagaa ggtggataaa gtacacccaa caaagaaggg 720
tagttggtga atttagattg gagagaaaat ggttggatgt ggtgaggaac aggattgccg 780
aggacctctc cttacgccga ttcatggtcg ctctaatcct ggatatcaag agaacacccg 840
gaaacaaacc caggattgct gaaatgatat gtgacattga tacatatatc gtagaggcag 900
gattagccag ttttatcctg actattaagt ttgggataga aactatgtat cctgctcttg 960
gactgcatga atttgctggt gagttatcca cacttgagtc cttgatgaac ctttaccagc 1020
aaatggggga aactgcaccc tacatggtaa tcctggagaa ctcaattcag aacaagttca 1080
gtgcaggatc ataccctctg ctctggagct atgccatggg agtaggagtg gaacttgaaa 1140
actccatggg aggtttgaac tttggccgat cttactttga tccagcatat tttagattag 1200
ggcaagagat ggtaaggagg tcagctggaa aggtcagttc cacattggca tctgaactcg 1260
gtatcactgc cgaggatgca aggcttgttt cagagattgc aatgcatact actgaggaca 1320
agatcagtag agcggttgga cccagacaag cccaagtatc atttctacac ggtgatcaaa 1380
gtgagaatga gctaccgaga ttggggggca aggaagatag gagggtcaaa cagagtcgag 1440
gagaagccag ggagagctac agagaaaccg ggcccagcag agcaagtgat gcgagagctg 1500
cccatcttcc aaccggcaca cccctagaca ttgacactgc aacggagtcc agccaagatc 1560
cgcaggacag tcgaaggtca gctgacgccc tgcttaggct gcaagccatg gcaggaatct 1620
cggaagaaca aggctcagac acggacaccc ctatagtgta caatgacaga aatcttctag 1680
actaggtgcg agaggccgag ggccagaaca acatccgcct accatccatc attgttataa 1740
aaaacttagg aaccaggtcc acacagccgc cagcccatca accatccact cccacgattg 1800
gagccaatgg cagaagagca ggcacgccat gtcaaaaacg gactggaatg catccgggct 1860
ctcaaggccg agcccatcgg ctcactggcc atcgaggaag ctatggcagc atggtcagaa 1920
atatcagaca acccaggaca ggagcgagcc acctgcaggg aagagaaggc aggcagttcg 1980
ggtctcagca aaccatgcct ctcagcaatt ggatcaactg aaggcggtgc acctcgcatc 2040
cgcggtcagg gacctggaga gagcgatgac gacgctgaaa ctttgggaat ccccccaaga 2100
aatctccagg catcaagcac tgggttacag tgttattacg tttatgatca cagcggtgaa 2160
gcggttaagg gaatccaaga tgctgactct atcatggttc aatcaggcct tgatggtgat 2220
agcaccctct caggaggaga caatgaatct gaaaacagcg atgtggatat tggcgaacct 2280
gataccgagg gatatgctat cactgaccgg ggatctgctc ccatctctat ggggttcagg 2340
gcttctgatg ttgaaactgc agaaggaggg gagatccacg agctcctgag actccaatcc 2400
agaggcaaca actttccgaa gcttgggaaa actctcaatg ttcctccgcc cccggacccc 2460
ggtagggcca gcacttccgg gacacccatt aaaaagggca cagacgcgag attagcctca 2520
tttggaacgg agatcgcgtc tttattgaca ggtggtgcaa cccaatgtgc tcgaaagtca 2580
ccctcggaac catcagggcc aggtgcacct gcggggaatg tccccgagtg tgtgagcaat 2640
gccgcactga tacaggagtg gacacccgaa tctggtacca caatctcccc gagatcccag 2700
aataatgaag aagggggaga ctattatgat gatgagctgt tctctgatgt ccaagatatt 2760
aaaacagcct tggccaaaat acacgaggat aatcagaaga taatctccaa gctagaatca 2820
ctgctgttat tgaagggaga agttgagtca attaagaagc agatcaacag gcaaaatatc 2880
agcatatcca ccctggaagg acacctctca agcatcatga tcgccattcc tggacttggg 2940
aaggatccca acgaccccac tgcagatgtc gaaatcaatc ccgacttgaa acccatcata 3000
ggcagagatt caggccgagc actggccgaa gttctcaaga aacccgttgc cagccgacaa 3060
ctccaaggaa tgacaaatgg acggaccagt tccagaggac agctgctgaa ggaatttcag 3120
ctaaagccga tcgggaaaaa gatgagctca gccgtcgggt ttgttcctga caccggccct 3180
gcatcacgca gtgtaatccg ctccattata aaatccagcc ggctagagga ggatcggaag 3240
cgttacctga tgactctcct tgatgatatc aaaggagcca atgatcttgc caagttccac 3300
cagatgctga tgaagataat aatgaagtag ctacagctca acttacctgc caaccccatg 3360
ccagtcgacc caactagtac aacctaaatc cattataaaa aacttaggaa ccaggtccac 3420
acagccgcca gcccatcaac catccactcc cacgattgga gccaatgttt gtttttcttg 3480
ttttattgcc actagtctct agtcagccta atattacaaa cttgtgccct tttggtgaag 3540
tttttaacgc caccagattt gcatctgttt atgcttggaa caggaagaga atcagcaact 3600
gtgttgctga ttattctgtc ctatataatt ccgcatcatt ttccactttt aagtgttatg 3660
gagtgtctcc tactaaatta aatgatctct gctttactaa tgtctatgca gattcatttg 3720
taattagagg tgatgaagtc agacaaatcg ctccagggca aactggaaag attgctgatt 3780
ataattataa attaccagat gattttacag gctgcgttat agcttggaat tctaacaatc 3840
ttgattctaa ggttggtggt aattataatt acctgtatag attgtttagg aagtctaatc 3900
tcaaaccttt tgagagagat atttcaactg aaatctatca ggccggtagc acaccttgta 3960
atggtgttga aggttttaat tgttactttc ctttacaatc atatggtttc caacccacta 4020
atggtgttgg ttaccaacca tacagagtag tagtactttc ttttgaactt ctacatgcac 4080
cagcaactgt ttgtggacct aaaaagtcta ctaatttggt taaaaacaaa tgtgtcaatt 4140
tcaacttcaa tggtttaaca ggcacaggtg ttcttactga gtctaacaaa aagtttctgc 4200
ctttccaaca atttggcaga gacattgctg acactactga tgctgtccgt gatccacaga 4260
cacttgagta agtgcgagag gccgagggcc agaacaacat ccgcctacca tccatcattg 4320
ttataaaaaa cttaggagca aagtgattgc ctcccaaggt ccacaatgac agagacctac 4380
gacttcgaca agtcggcatg ggacatcaaa gggtcgatcg ctccgataca acccaccacc 4440
tacagtgatg gcaggctggt gccccaggtc agagtcatag atcctggtct aggcgacagg 4500
aaggatgaat gctttatgta catgtttctg ctgggggttg ttgaggacag cgattcccta 4560
gggcctccaa tcgggcgagc atttgggttc ctgcccttag gtgttggcag atccacagca 4620
aagcccgaaa aactcctcaa agaggccact gagcttgaca tagttgttag acgtacagca 4680
gggctcaatg aaaaactggt gttctacaac aacaccccac taactctcct cacaccttgg 4740
agaaaggtcc taacaacagg gagtgtcttc aacgcaaacc aagtgtgcaa tgcggttaat 4800
ctgataccgc tcgatacccc gcagaggttc cgtgttgttt atatgagcat cacccgtctt 4860
tcggataacg ggtattacac cgttcctaga agaatgctgg aattcagatc ggtcaatgca 4920
gtggccttca acctgctggt gacccttagg attgacaagg cgataggccc tgggaagatc 4980
atcgacaata cagagcaact tcctgaggca acatttatgg tccacatcgg gaacttcagg 5040
agaaagaaga gtgaagtcta ctctgccgat tattgcaaaa tgaaaatcga aaagatgggc 5100
ctggtttttg cacttggtgg gatagggggc accagtcttc acattagaag cacaggcaaa 5160
atgagcaaga ctctccatgc acaactcggg ttcaagaaga ccttatgtta cccgctgatg 5220
gatatcaatg aagaccttaa tcgattactc tggaggagca gatgcaagat agtaagaatc 5280
caggcagttt tgcagccatc agttcctcaa gaattccgca tttacgacga cgtgatcata 5340
aatgatgacc aaggactatt caaagttctg tagaccgtag tgcccagcaa tgcccgaaaa 5400
cgacccccct cacaatgaca gccagaaggc ccggacaaaa aagccccctc cgaaagactc 5460
cacggaccaa gcgagaggcc agccagcagc cgacggcaag cgcgaacacc aggcggcccc 5520
agcacagaac agccctgaca caaggccacc accagccacc ccaatctgca tcctcctcgt 5580
gggacccccg aggaccaacc cccaaggctg cccccgatcc aaaccaccaa ccgcatcccc 5640
accacccccg ggaaagaaac ccccagcaat tggaaggccc ctccccctct tcctcaacac 5700
aagaactcca caaccgaacc gcacaagcga ccgaggtgac ccaaccgcag gcatccgact 5760
ccctagacag atcctctctc cccggcaaac taaacaaaac ttagggccaa ggaacataca 5820
cacccaacag aacccagacc ccggcccacg gcgccgcgcc cccaaccccc gacaaccaga 5880
gggagccccc aaccaatccc gccggctccc ccggtgccca caggcaggga caccaacccc 5940
cgaacagacc cagcacccaa ccatcgacaa tccaagacgg gggggccccc ccaaaaaaag 6000
gcccccaggg gccgacagcc agcaccgcga ggaagcccac ccaccccaca cacgaccacg 6060
gcaaccaaac cagaacccag accaccctgg gccaccagct cccagactcg gccatcaccc 6120
cgcagaaagg aaaggccaca acccgcgcac cccagccccg atccggcggg gagccaccca 6180
acccgaacca gcacccaaga gcgatccccg aaggaccccc gaaccgcaaa ggacatcagt 6240
atcccacagc ctctccaagt cccccggtct cctcctcttc tcgaagggac caaaagatca 6300
atccaccaca cccgacgaca ctcaactccc cacccctaaa ggagacaccg ggaatcccag 6360
aatcaagact catccaatgt ccatcatggg tctcaaggtg aacgtctctg ccatattcat 6420
ggcagtactg ttaactctcc aaacacccac cggtcaaatc cattggggca atctctctaa 6480
gataggggtg gtaggaatag gaagtgcaag ctacaaagtt atgactcgtt ccagccatca 6540
atcattagtc ataaaattaa tgcccaatat aactctcctc aataactgca cgagggtaga 6600
gattgcagaa tacaggagac tactgagaac agttttggaa ccaattagag atgcacttaa 6660
tgcaatgacc cagaatataa gaccggttca gagtgtagct tcaagtagga gacacaagag 6720
atttgcggga gtagtcctgg caggtgcggc cctaggcgtt gccacagctg ctcagataac 6780
agccggcatt gcacttcacc agtccatgct gaactctcaa gccatcgaca atctgagagc 6840
gagcctggaa actactaatc aggcaattga gacaatcaga caagcagggc aggagatgat 6900
attggctgtt cagggtgtcc aagactacat caataatgag ctgataccgt ctatgaacca 6960
actatcttgt gatttaatcg gccagaagct cgggctcaaa ttgctcagat actatacaga 7020
aatcctgtca ttatttggcc ccagtttacg ggaccccata tctgcggaga tatctatcca 7080
ggctttgagc tatgcgcttg gaggagacat caataaggtg ttagaaaagc tcggatacag 7140
tggaggtgat ttactgggca tcttagagag cggaggaata aaggcccgga taactcacgt 7200
cgacacagag tcctacttca ttgtcctcag tatagcctat ccgacgctgt ccgagattaa 7260
gggggtgatt gtccaccggc tagagggggt ctcgtacaac ataggctctc aagagtggta 7320
taccactgtg cccaagtatg ttgcaaccca agggtacctt atctcgaatt ttgatgagtc 7380
atcgtgtact ttcatgccag aggggactgt gtgcagccaa aatgccttgt acccgatgag 7440
tcctctgctc caagaatgcc tccgggggta caccaagtcc tgtgctcgta cactcgtatc 7500
cgggtctttt gggaaccggt tcattttatc acaagggaac ctaatagcca attgtgcatc 7560
aatcctttgc aagtgttaca caacaggaac gatcattaat caagaccctg acaagatcct 7620
aacatacatt gctgccgatc actgcccggt agtcgaggtg aacggcgtga ccatccaagt 7680
cgggagcagg aggtatccag acgctgtgta cttgcacaga attgacctcg gtcctcccat 7740
atcattggag aggttggacg tagggacaaa tctggggaat gcaattgcta agttggagga 7800
tgccaaggaa ttgttggagt catcggacca gatattgagg agtatgaaag gtttatcgag 7860
cactagcata gtctacatcc tgattgcagt gtgtcttgga gggttgatag ggatccccgc 7920
tttaatatgt tgctgcaggg ggcgttgtaa caaaaaggga gaacaagttg gtatgtcaag 7980
accaggccta aagcctgatc ttacgggaac atcaaaatcc tatgtaaggt cgctctgatc 8040
ctctacaact cttgaaacac aaatgtccca caagtctcct cttcgtcatc aagcaaccac 8100
cgcacccagc atcaagccca cctgaaatta tctccggctt ccctctggcc gaacaatatc 8160
ggtagttaat caaaacttag ggtgcaagat catccacaat gtcaccacaa cgagaccgga 8220
taaatgcctt ctacaaagat aacccccatc ccaagggaag taggatagtc attaacagag 8280
aacatcttat gattgataga ccttatgttt tgctggctgt tctgtttgtc atgtttctga 8340
gcttgatcgg gttgctagcc attgcaggca ttagacttca tcgggcagcc atctacaccg 8400
cagagatcca taaaagcctc agcaccaatc tagatgtaac taactcaatc gagcatcagg 8460
tcaaggacgt gctgacacca ctcttcaaaa tcatcggtga tgaagtgggc ctgaggacac 8520
ctcagagatt cactgaccta gtgaaattaa tctctgacaa gattaaattc cttaatccgg 8580
atagggagta cgacttcaga gatctcactt ggtgtatcaa cccgccagag agaatcaaat 8640
tggattatga tcaatactgt gcagatgtgg ctgctgaaga gctcatgaat gcattggtga 8700
actcaactct actggagacc agaacaacca atcagttcct agctgtctca aagggaaact 8760
gctcagggcc cactacaatc agaggtcaat tctcaaacat gtcgctgtcc ctgttagact 8820
tgtatttagg tcgaggttac aatgtgtcat ctatagtcac tatgacatcc cagggaatgt 8880
atgggggaac ttacctagtg gaaaagccta atctgagcag caaaaggtca gagttgtcac 8940
aactgagcat gtaccgagtg tttgaagtag gtgttatcag aaatccgggt ttgggggctc 9000
cggtgttcca tatgacaaac tatcttgagc aaccagtcag taatgatctc agcaactgta 9060
tggtggcttt gggggagctc aaactcgcag ccctttgtca cggggaagat tctatcacaa 9120
ttccctatca gggatcaggg aaaggtgtca gcttccagct cgtcaagcta ggtgtctgga 9180
aatccccaac cgacatgcaa tcctgggtcc ccttatcaac ggatgatcca gtgatagaca 9240
ggctttacct ctcatctcac agaggtgtta tcgctgacaa tcaagcaaaa tgggctgtcc 9300
cgacaacacg aacagatgac aagttgcgaa tggagacatg cttccaacag gcgtgtaagg 9360
gtaaaatcca agcactctgc gagaatcccg agtgggcacc attgaaggat aacaggattc 9420
cttcatacgg ggtcttgtct gttgatctga gtctgacagt tgagcttaaa atcaaaattg 9480
cttcgggatt cgggccattg atcacacacg gttcagggat ggacctatac aaatccaacc 9540
acaacaatgt gtattggctg actatcccgc caatgaagaa cctagcctta ggtgtaatca 9600
acacattgga gtggataccg agattcaagg ttagtcccta cctcttcact gtcccaatta 9660
aggaagcagg cgaagactgc catgccccaa catacctacc tgcggaggtg gatggtgatg 9720
tcaaactcag ttccaatctg gtgattctac ctggtcaaga tctccaatat gttttggcaa 9780
cctacgatac ttccagggtt gaacatgctg tggtttatta cgtttacagc ccaagccgct 9840
cattttctta cttttatcct tttaggttgc ctataaaggg ggtccccatc gaattacaag 9900
tggaatgctt cacatgggac caaaaactct ggtgccgtca cttctgtgtg cttgcggact 9960
cagaatctgg tggacatatc actcactctg ggatggtggg catgggagtc agctgcacag 10020
tcacccggga agatggaacc aatcgcagat agggctgcta gtgaaccaat cacatgatgt 10080
cacccagaca tcaggcatac ccactagtgt gaaatagaca tcagaattaa gaaaaacgta 10140
gggtccaagt ggttccccgt tatggactcg ctatctgtca accagatctt ataccctgaa 10200
gttcacctag atagcccgat agttaccaat aagatagtag ccatcctgga gtatgctcga 10260
gtccctcacg cttacagcct ggaggaccct acactgtgtc agaacatcaa gcaccgccta 10320
aaaaacggat tttccaacca aatgattata aacaatgtgg aagttgggaa tgtcatcaag 10380
tccaagctta ggagttatcc ggcccactct catattccat atccaaattg taatcaggat 10440
ttatttaaca tagaagacaa agagtcaacg aggaagatcc gtgaactcct caaaaagggg 10500
aattcgctgt actccaaagt cagtgataag gttttccaat gcttaaggga cactaactca 10560
cggcttggcc taggctccga attgagggag gacatcaagg agaaagttat taacttggga 10620
gtttacatgc acagctccca gtggtttgag ccctttctgt tttggtttac agtcaagact 10680
gagatgaggt cagtgattaa atcacaaacc catacttgcc ataggaggag acacacacct 10740
gtattcttca ctggtagttc agttgagttg ctaatctctc gtgaccttgt tgctataatc 10800
agtaaagagt ctcaacatgt atattacctg acatttgaac tggttttgat gtattgtgat 10860
gtcatagagg ggaggttaat gacagagacc gctatgacta ttgatgctag gtatacagag 10920
cttctaggaa gagtcagata catgtggaaa ctgatagatg gtttcttccc tgcactcggg 10980
aatccaactt atcaaattgt agccatgctg gagcctcttt cacttgctta cctgcagctg 11040
agggatataa cagtagaact cagaggtgct ttccttaacc actgctttac tgaaatacat 11100
gatgttcttg accaaaacgg gttttctgat gaaggtactt atcatgagtt aactgaagct 11160
ctagattaca ttttcataac tgatgacata catctgacag gggagatttt ctcatttttc 11220
agaagtttcg gccaccccag acttgaagca gtaacggctg ctgaaaatgt taggaaatac 11280
atgaatcagc ctaaagtcat tgtgtatgag actctgatga aaggtcatgc catattttgt 11340
ggaatcataa tcaacggcta tcgtgacagg cacggaggca gttggccacc gctgaccctc 11400
cccctgcatg ctgcagacac aatccggaat gctcaagctt caggtgaagg gttaacacat 11460
gagcagtgcg ttgataactg gaaatctttt gctggagtga aatttggctg ctttatgcct 11520
cttagcctgg atagtgatct gacaatgtac ctaaaggaca aggcacttgc tgctctccaa 11580
agggaatggg attcagttta cccgaaagag ttcctgcgtt acgaccctcc caagggaacc 11640
gggtcacgga ggcttgtaga tgttttcctt aatgattcga gctttgaccc atatgatgtg 11700
ataatgtatg ttgtaagtgg agcttacctc catgaccctg agttcaacct gtcttacagc 11760
ctgaaagaaa aggagatcaa ggaaacaggt agactttttg ctaaaatgac ttacaaaatg 11820
agggcatgcc aagtgattgc tgaaaatcta atctcaaacg ggattggcaa atattttaag 11880
gacaatggga tggccaagga tgagcacgat ttgactaagg cactccacac tctagctgtc 11940
tcaggagtcc ccaaagatct caaagaaagt cacagggggg ggccagtctt aaaaacctac 12000
tcccgaagcc cagtccacac aagtaccagg aacgtgagag cagcaaaagg gtttataggg 12060
ttccctcaag taattcggca ggaccaagac actgatcatc cggagaatat ggaagcttac 12120
gagacagtca gtgcatttat cacgactgat ctcaagaagt actgccttaa ttggagatat 12180
gagaccatca gcttgtttgc acagaggcta aatgagattt acggattgcc ctcatttttc 12240
cagtggctgc ataagaggct tgagacctct gtcctgtatg taagtgaccc tcattgcccc 12300
cccgaccttg acgcccatat cccgttatat aaagtcccca atgatcaaat cttcattaag 12360
taccctatgg gaggtataga agggtattgt cagaagctgt ggaccatcag caccattccc 12420
tatctatacc tggctgctta tgagagcgga gtaaggattg cttcgttagt gcaaggggac 12480
aatcagacca tagccgtaac aaaaagggta cccagcacat ggccctacaa ccttaagaaa 12540
cgggaagctg ctagagtaac tagagattac tttgtaattc ttaggcaaag gctacatgat 12600
attggccatc acctcaaggc aaatgagaca attgtttcat cacatttttt tgtctattca 12660
aaaggaatat attatgatgg gctacttgtg tcccaatcac tcaagagcat cgcaagatgt 12720
gtattctggt cagagactat agttgatgaa acaagggcag catgcagtaa tattgctaca 12780
acaatggcta aaagcatcga gagaggttat gaccgttacc ttgcatattc cctgaacgtc 12840
ctaaaagtga tacagcaaat tctgatctct cttggcttca caatcaattc aaccatgacc 12900
cgggatgtag tcatacccct cctcacaaac aacgacctct taataaggat ggcactgttg 12960
cccgctccta ttggggggat gaattatctg aatatgagca ggctgtttgt cagaaacatc 13020
ggtgatccag taacatcatc aattgctgat ctcaagagaa tgattctcgc ctcactaatg 13080
cctgaagaga ccctccatca agtaatgaca caacaaccgg gggactcttc attcctagac 13140
tgggctagcg acccttactc agcaaatctt gtatgtgtcc agagcatcac tagactcctc 13200
aagaacataa ctgcaaggtt tgtcctgatc catagtccaa acccaatgtt aaaaggatta 13260
ttccatgatg acagtaaaga agaggacgag ggactggcgg cattcctcat ggacaggcat 13320
attatagtac ctagggcagc tcatgaaatc ctggatcata gtgtcacagg ggcaagagag 13380
tctattgcag gcatgctgga taccacaaaa ggcttgattc gagccagcat gaggaagggg 13440
gggttaacct ctcgagtgat aaccagattg tccaattatg actatgaaca attcagagca 13500
gggatggtgc tattgacagg aagaaagaga aatgtcctca ttgacaaaga gtcatgttca 13560
gtgcagctgg cgagagctct aagaagccat atgtgggcga ggctagctcg aggacggcct 13620
atttacggcc ttgaggtccc tgatgtacta gaatctatgc gaggccacct tattcggcgt 13680
catgagacat gtgtcatctg cgagtgtgga tcagtcaact acggatggtt ttttgtcccc 13740
tcgggttgcc aactggatga tattgacaag gaaacatcat ccttgagagt cccatatatt 13800
ggttctacca ctgatgagag aacagacatg aagcttgcct tcgtaagagc cccaagtcga 13860
tccttgcgat ctgctgttag aatagcaaca gtgtactcat gggcttacgg tgatgatgat 13920
agctcttgga acgaagcctg gttgttggct aggcaaaggg ccaatgtgag cctggaggag 13980
ctaagggtga tcactcccat ctcaacttcg actaatttag cgcataggtt gagggatcgt 14040
agcactcaag tgaaatactc aggtacatcc cttgtccgag tggcgaggta taccacaatc 14100
tccaacgaca atctctcatt tgtcatatca gataagaagg ttgatactaa ctttatatac 14160
caacaaggaa tgcttctagg gttgggtgtt ttagaaacat tgtttcgact cgagaaagat 14220
accggatcat ctaacacggt attacatctt cacgtcgaaa cagattgttg cgtgatcccg 14280
atgatagatc atcccaggat acccagctcc cgcaagctag agctgagggc agagctatgt 14340
accaacccat tgatatatga taatgcacct ttaattgaca gagatgcaac aaggctatac 14400
acccagagcc ataggaggca ccttgtggaa tttgttacat ggtccacacc ccaactatat 14460
cacattttag ctaagtccac agcactatct atgattgacc tggtaacaaa atttgagaag 14520
gaccatatga atgaaatttc agctctcata ggggatgacg atatcaatag tttcataact 14580
gagtttctgc tcatagagcc aagattattc actatctact tgggccagtg tgcggccatc 14640
aattgggcat ttgatgtaca ttatcataga ccatcaggga aatatcagat gggtgagctg 14700
ttgtcatcgt tcctttctag aatgagcaaa ggagtgttta aggtgcttgt caatgctcta 14760
agccacccaa agatctacaa gaaattctgg cattgtggta ttatagagcc tatccatggt 14820
ccttcacttg atgctcaaaa cttgcacaca actgtgtgca acatggttta cacatgctat 14880
atgacctacc tcgacctgtt gttgaatgaa gagttagaag agttcacatt tctcttgtgt 14940
gaaagcgacg aggatgtagt accggacaga ttcgacaaca tccaggcaaa acacttatgt 15000
gttctggcag atttgtactg tcaaccaggg acctgcccac caattcgagg tctaagaccg 15060
gtagagaaat gtgcagttct aaccgaccat atcaaggcag aggctatgtt atctccagca 15120
ggatcttcgt ggaacataaa tccaattatt gtagaccatt actcatgctc tctgacttat 15180
ctccggcgag gatcgatcaa acagataaga ttgagagttg atccaggatt cattttcgac 15240
gccctcgctg aggtaaatgt cagtcagcca aagatcggca gcaacaacat ctcaaatatg 15300
agcatcaagg ctttcagacc cccacacgat gatgttgcaa aattgctcaa agatatcaac 15360
acaagcaagc acaatcttcc catttcaggg ggcaatctcg ccaattatga aatccatgct 15420
ttccgcagaa tcgggttgaa ctcatctgct tgctacaaag ctgttgagat atcaacatta 15480
attaggagat gccttgagcc aggggaggac ggcttgttct tgggtgaggg atcgggttct 15540
atgttgatca cttataaaga gatacttaaa ctaaacaagt gcttctataa tagtggggtt 15600
tccgccaatt ctagatctgg tcaaagggaa ttagcaccct atccctccga agttggcctt 15660
gtcgaacaca gaatgggagt aggtaatatt gtcaaagtgc tctttaacgg gaggcccgaa 15720
gtcacgtggg taggcagtgt agattgcttc aatttcatag ttagtaatat ccctacctct 15780
agtgtggggt ttatccattc agatatagag accttgcctg acaaagatac tatagagaag 15840
ctagaggaat tggcagccat cttatcgatg gctctgctcc tgggcaaaat aggatcaata 15900
ctggtgatta agcttatgcc tttcagcggg gattttgttc agggatttat aagttatgta 15960
gggtctcatt atagagaagt gaaccttgta taccctagat acagcaactt catctctact 16020
gaatcttatt tggttatgac agatctcaag gctaaccggc taatgaatcc tgaaaagatt 16080
aagcagcaga taattgaatc atctgtgagg acttcacctg gacttatagg tcacatccta 16140
tccattaagc aactaagctg catacaagca attgtgggag acgcagttag tagaggtgat 16200
atcaatccta ctctgaaaaa acttacacct atagagcagg tgctgatcaa ttgcgggttg 16260
gcaattaacg gacctaagct gtgcaaagaa ttgatccacc atgatgttgc ctcagggcaa 16320
gatggattgc ttaattctat actcatcctc tacagggagt tggcaagatt caaagacaac 16380
caaagaagtc aacaagggat gttccacgct taccccgtat tggtaagtag caggcaacga 16440
gaacttatat ctaggatcac ccgcaaattc tgggggcaca ttcttcttta ctccgggaac 16500
aaaaagttga taaataagtt tatccagaat ctcaagtccg gctatctgat actagactta 16560
caccagaata tcttcgttaa gaatctatcc aagtcagaga aacagattat tatgacgggg 16620
ggtttgaaac gtgagtgggt ttttaaggta acagtcaagg agaccaaaga atggtataag 16680
ttagtcggat acagtgccct gattaaggac taattggttg aactccggaa ccctaatcct 16740
gccctaggtg gttaggcatt atttgcaata tattaaagaa aactttgaaa atacgaagtt 16800
tctattccca gctttgtctg gt 16822
<210> 4
<211> 16822
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
accaaacaaa gttgggtaag gatagttcaa tcaatgatca tcttctagtg cacttaggat 60
tcaagatcct attatcaggg acaagagcag gattagggat atccgagatg gccacacttt 120
taaggagctt agcattgttc aaaagaaaca aggacaaacc acccattaca tcaggatccg 180
gtggagccat cagaggaatc aaacacatta ttatagtacc aatccctgga gattcctcaa 240
ttaccactcg atccagactt ctggaccggt tggtgaggtt aattggaaac ccggatgtga 300
gcgggcccaa actaacaggg gcactaatag gtatattatc cttatttgtg gagtctccag 360
gtcaattgat tcagaggatc accgatgacc ctgacgttag cataaggctg ttagaggttg 420
tccagagtga ccagtcacaa tctggcctta ccttcgcatc aagaggtacc aacatggagg 480
atgaggcgga ccaatacttt tcacatgatg atccaattag tagtgatcaa tccaggttcg 540
gatggttcgg gaacaaggaa atctcagata ttgaagtgca agaccctgag ggattcaaca 600
tgattctggg taccatccta gcccaaattt gggtcttgct cgcaaaggcg gttacggccc 660
cagacacggc agctgattcg gagctaagaa ggtggataaa gtacacccaa caaagaaggg 720
tagttggtga atttagattg gagagaaaat ggttggatgt ggtgaggaac aggattgccg 780
aggacctctc cttacgccga ttcatggtcg ctctaatcct ggatatcaag agaacacccg 840
gaaacaaacc caggattgct gaaatgatat gtgacattga tacatatatc gtagaggcag 900
gattagccag ttttatcctg actattaagt ttgggataga aactatgtat cctgctcttg 960
gactgcatga atttgctggt gagttatcca cacttgagtc cttgatgaac ctttaccagc 1020
aaatggggga aactgcaccc tacatggtaa tcctggagaa ctcaattcag aacaagttca 1080
gtgcaggatc ataccctctg ctctggagct atgccatggg agtaggagtg gaacttgaaa 1140
actccatggg aggtttgaac tttggccgat cttactttga tccagcatat tttagattag 1200
ggcaagagat ggtaaggagg tcagctggaa aggtcagttc cacattggca tctgaactcg 1260
gtatcactgc cgaggatgca aggcttgttt cagagattgc aatgcatact actgaggaca 1320
agatcagtag agcggttgga cccagacaag cccaagtatc atttctacac ggtgatcaaa 1380
gtgagaatga gctaccgaga ttggggggca aggaagatag gagggtcaaa cagagtcgag 1440
gagaagccag ggagagctac agagaaaccg ggcccagcag agcaagtgat gcgagagctg 1500
cccatcttcc aaccggcaca cccctagaca ttgacactgc aacggagtcc agccaagatc 1560
cgcaggacag tcgaaggtca gctgacgccc tgcttaggct gcaagccatg gcaggaatct 1620
cggaagaaca aggctcagac acggacaccc ctatagtgta caatgacaga aatcttctag 1680
actaggtgcg agaggccgag ggccagaaca acatccgcct accatccatc attgttataa 1740
aaaacttagg aaccaggtcc acacagccgc cagcccatca accatccact cccacgattg 1800
gagccaatgg cagaagagca ggcacgccat gtcaaaaacg gactggaatg catccgggct 1860
ctcaaggccg agcccatcgg ctcactggcc atcgaggaag ctatggcagc atggtcagaa 1920
atatcagaca acccaggaca ggagcgagcc acctgcaggg aagagaaggc aggcagttcg 1980
ggtctcagca aaccatgcct ctcagcaatt ggatcaactg aaggcggtgc acctcgcatc 2040
cgcggtcagg gacctggaga gagcgatgac gacgctgaaa ctttgggaat ccccccaaga 2100
aatctccagg catcaagcac tgggttacag tgttattacg tttatgatca cagcggtgaa 2160
gcggttaagg gaatccaaga tgctgactct atcatggttc aatcaggcct tgatggtgat 2220
agcaccctct caggaggaga caatgaatct gaaaacagcg atgtggatat tggcgaacct 2280
gataccgagg gatatgctat cactgaccgg ggatctgctc ccatctctat ggggttcagg 2340
gcttctgatg ttgaaactgc agaaggaggg gagatccacg agctcctgag actccaatcc 2400
agaggcaaca actttccgaa gcttgggaaa actctcaatg ttcctccgcc cccggacccc 2460
ggtagggcca gcacttccgg gacacccatt aaaaagggca cagacgcgag attagcctca 2520
tttggaacgg agatcgcgtc tttattgaca ggtggtgcaa cccaatgtgc tcgaaagtca 2580
ccctcggaac catcagggcc aggtgcacct gcggggaatg tccccgagtg tgtgagcaat 2640
gccgcactga tacaggagtg gacacccgaa tctggtacca caatctcccc gagatcccag 2700
aataatgaag aagggggaga ctattatgat gatgagctgt tctctgatgt ccaagatatt 2760
aaaacagcct tggccaaaat acacgaggat aatcagaaga taatctccaa gctagaatca 2820
ctgctgttat tgaagggaga agttgagtca attaagaagc agatcaacag gcaaaatatc 2880
agcatatcca ccctggaagg acacctctca agcatcatga tcgccattcc tggacttggg 2940
aaggatccca acgaccccac tgcagatgtc gaaatcaatc ccgacttgaa acccatcata 3000
ggcagagatt caggccgagc actggccgaa gttctcaaga aacccgttgc cagccgacaa 3060
ctccaaggaa tgacaaatgg acggaccagt tccagaggac agctgctgaa ggaatttcag 3120
ctaaagccga tcgggaaaaa gatgagctca gccgtcgggt ttgttcctga caccggccct 3180
gcatcacgca gtgtaatccg ctccattata aaatccagcc ggctagagga ggatcggaag 3240
cgttacctga tgactctcct tgatgatatc aaaggagcca atgatcttgc caagttccac 3300
cagatgctga tgaagataat aatgaagtag ctacagctca acttacctgc caaccccatg 3360
ccagtcgacc caactagtac aacctaaatc cattataaaa aacttaggag caaagtgatt 3420
gcctcccaag gtccacaatg acagagacct acgacttcga caagtcggca tgggacatca 3480
aagggtcgat cgctccgata caacccacca cctacagtga tggcaggctg gtgccccagg 3540
tcagagtcat agatcctggt ctaggcgaca ggaaggatga atgctttatg tacatgtttc 3600
tgctgggggt tgttgaggac agcgattccc tagggcctcc aatcgggcga gcatttgggt 3660
tcctgccctt aggtgttggc agatccacag caaagcccga aaaactcctc aaagaggcca 3720
ctgagcttga catagttgtt agacgtacag cagggctcaa tgaaaaactg gtgttctaca 3780
acaacacccc actaactctc ctcacacctt ggagaaaggt cctaacaaca gggagtgtct 3840
tcaacgcaaa ccaagtgtgc aatgcggtta atctgatacc gctcgatacc ccgcagaggt 3900
tccgtgttgt ttatatgagc atcacccgtc tttcggataa cgggtattac accgttccta 3960
gaagaatgct ggaattcaga tcggtcaatg cagtggcctt caacctgctg gtgaccctta 4020
ggattgacaa ggcgataggc cctgggaaga tcatcgacaa tacagagcaa cttcctgagg 4080
caacatttat ggtccacatc gggaacttca ggagaaagaa gagtgaagtc tactctgccg 4140
attattgcaa aatgaaaatc gaaaagatgg gcctggtttt tgcacttggt gggatagggg 4200
gcaccagtct tcacattaga agcacaggca aaatgagcaa gactctccat gcacaactcg 4260
ggttcaagaa gaccttatgt tacccgctga tggatatcaa tgaagacctt aatcgattac 4320
tctggaggag cagatgcaag atagtaagaa tccaggcagt tttgcagcca tcagttcctc 4380
aagaattccg catttacgac gacgtgatca taaatgatga ccaaggacta ttcaaagttc 4440
tgtagaccgt agtgcccagc aatgcccgaa aacgaccccc ctcacaatga cagccagaag 4500
gcccggacaa aaaagccccc tccgaaagac tccacggacc aagcgagagg ccagccagca 4560
gccgacggca agcgcgaaca ccaggcggcc ccagcacaga acagccctga cacaaggcca 4620
ccaccagcca ccccaatctg catcctcctc gtgggacccc cgaggaccaa cccccaaggc 4680
tgcccccgat ccaaaccacc aaccgcatcc ccaccacccc cgggaaagaa acccccagca 4740
attggaaggc ccctccccct cttcctcaac acaagaactc cacaaccgaa ccgcacaagc 4800
gaccgaggtg acccaaccgc aggcatccga ctccctagac agatcctctc tccccggcaa 4860
actaaacaaa acttagggcc aaggaacata cacacccaac agaacccaga ccccggccca 4920
cggcgccgcg cccccaaccc ccgacaacca gagggagccc ccaaccaatc ccgccggctc 4980
ccccggtgcc cacaggcagg gacaccaacc cccgaacaga cccagcaccc aaccatcgac 5040
aatccaagac gggggggccc ccccaaaaaa aggcccccag gggccgacag ccagcaccgc 5100
gaggaagccc acccacccca cacacgacca cggcaaccaa accagaaccc agaccaccct 5160
gggccaccag ctcccagact cggccatcac cccgcagaaa ggaaaggcca caacccgcgc 5220
accccagccc cgatccggcg gggagccacc caacccgaac cagcacccaa gagcgatccc 5280
cgaaggaccc ccgaaccgca aaggacatca gtatcccaca gcctctccaa gtcccccggt 5340
ctcctcctct tctcgaaggg accaaaagat caatccacca cacccgacga cactcaactc 5400
cccaccccta aaggagacac cgggaatccc agaatcaaga ctcatccaat gtccatcatg 5460
ggtctcaagg tgaacgtctc tgccatattc atggcagtac tgttaactct ccaaacaccc 5520
accggtcaaa tccattgggg caatctctct aagatagggg tggtaggaat aggaagtgca 5580
agctacaaag ttatgactcg ttccagccat caatcattag tcataaaatt aatgcccaat 5640
ataactctcc tcaataactg cacgagggta gagattgcag aatacaggag actactgaga 5700
acagttttgg aaccaattag agatgcactt aatgcaatga cccagaatat aagaccggtt 5760
cagagtgtag cttcaagtag gagacacaag agatttgcgg gagtagtcct ggcaggtgcg 5820
gccctaggcg ttgccacagc tgctcagata acagccggca ttgcacttca ccagtccatg 5880
ctgaactctc aagccatcga caatctgaga gcgagcctgg aaactactaa tcaggcaatt 5940
gagacaatca gacaagcagg gcaggagatg atattggctg ttcagggtgt ccaagactac 6000
atcaataatg agctgatacc gtctatgaac caactatctt gtgatttaat cggccagaag 6060
ctcgggctca aattgctcag atactataca gaaatcctgt cattatttgg ccccagttta 6120
cgggacccca tatctgcgga gatatctatc caggctttga gctatgcgct tggaggagac 6180
atcaataagg tgttagaaaa gctcggatac agtggaggtg atttactggg catcttagag 6240
agcggaggaa taaaggcccg gataactcac gtcgacacag agtcctactt cattgtcctc 6300
agtatagcct atccgacgct gtccgagatt aagggggtga ttgtccaccg gctagagggg 6360
gtctcgtaca acataggctc tcaagagtgg tataccactg tgcccaagta tgttgcaacc 6420
caagggtacc ttatctcgaa ttttgatgag tcatcgtgta ctttcatgcc agaggggact 6480
gtgtgcagcc aaaatgcctt gtacccgatg agtcctctgc tccaagaatg cctccggggg 6540
tacaccaagt cctgtgctcg tacactcgta tccgggtctt ttgggaaccg gttcatttta 6600
tcacaaggga acctaatagc caattgtgca tcaatccttt gcaagtgtta cacaacagga 6660
acgatcatta atcaagaccc tgacaagatc ctaacataca ttgctgccga tcactgcccg 6720
gtagtcgagg tgaacggcgt gaccatccaa gtcgggagca ggaggtatcc agacgctgtg 6780
tacttgcaca gaattgacct cggtcctccc atatcattgg agaggttgga cgtagggaca 6840
aatctgggga atgcaattgc taagttggag gatgccaagg aattgttgga gtcatcggac 6900
cagatattga ggagtatgaa aggtttatcg agcactagca tagtctacat cctgattgca 6960
gtgtgtcttg gagggttgat agggatcccc gctttaatat gttgctgcag ggggcgttgt 7020
aacaaaaagg gagaacaagt tggtatgtca agaccaggcc taaagcctga tcttacggga 7080
acatcaaaat cctatgtaag gtcgctctga tcctctacaa ctcttgaaac acaaatgtcc 7140
cacaagtctc ctcttcgtca tcaagcaacc accgcaccca gcatcaagcc cacctgaaat 7200
tatctccggc ttccctctgg ccgaacaata tcggtagtta atcaaaactt agggtgcaag 7260
atcatccaca atgtcaccac aacgagaccg gataaatgcc ttctacaaag ataaccccca 7320
tcccaaggga agtaggatag tcattaacag agaacatctt atgattgata gaccttatgt 7380
tttgctggct gttctgtttg tcatgtttct gagcttgatc gggttgctag ccattgcagg 7440
cattagactt catcgggcag ccatctacac cgcagagatc cataaaagcc tcagcaccaa 7500
tctagatgta actaactcaa tcgagcatca ggtcaaggac gtgctgacac cactcttcaa 7560
aatcatcggt gatgaagtgg gcctgaggac acctcagaga ttcactgacc tagtgaaatt 7620
aatctctgac aagattaaat tccttaatcc ggatagggag tacgacttca gagatctcac 7680
ttggtgtatc aacccgccag agagaatcaa attggattat gatcaatact gtgcagatgt 7740
ggctgctgaa gagctcatga atgcattggt gaactcaact ctactggaga ccagaacaac 7800
caatcagttc ctagctgtct caaagggaaa ctgctcaggg cccactacaa tcagaggtca 7860
attctcaaac atgtcgctgt ccctgttaga cttgtattta ggtcgaggtt acaatgtgtc 7920
atctatagtc actatgacat cccagggaat gtatggggga acttacctag tggaaaagcc 7980
taatctgagc agcaaaaggt cagagttgtc acaactgagc atgtaccgag tgtttgaagt 8040
aggtgttatc agaaatccgg gtttgggggc tccggtgttc catatgacaa actatcttga 8100
gcaaccagtc agtaatgatc tcagcaactg tatggtggct ttgggggagc tcaaactcgc 8160
agccctttgt cacggggaag attctatcac aattccctat cagggatcag ggaaaggtgt 8220
cagcttccag ctcgtcaagc taggtgtctg gaaatcccca accgacatgc aatcctgggt 8280
ccccttatca acggatgatc cagtgataga caggctttac ctctcatctc acagaggtgt 8340
tatcgctgac aatcaagcaa aatgggctgt cccgacaaca cgaacagatg acaagttgcg 8400
aatggagaca tgcttccaac aggcgtgtaa gggtaaaatc caagcactct gcgagaatcc 8460
cgagtgggca ccattgaagg ataacaggat tccttcatac ggggtcttgt ctgttgatct 8520
gagtctgaca gttgagctta aaatcaaaat tgcttcggga ttcgggccat tgatcacaca 8580
cggttcaggg atggacctat acaaatccaa ccacaacaat gtgtattggc tgactatccc 8640
gccaatgaag aacctagcct taggtgtaat caacacattg gagtggatac cgagattcaa 8700
ggttagtccc tacctcttca ctgtcccaat taaggaagca ggcgaagact gccatgcccc 8760
aacataccta cctgcggagg tggatggtga tgtcaaactc agttccaatc tggtgattct 8820
acctggtcaa gatctccaat atgttttggc aacctacgat acttccaggg ttgaacatgc 8880
tgtggtttat tacgtttaca gcccaagccg ctcattttct tacttttatc cttttaggtt 8940
gcctataaag ggggtcccca tcgaattaca agtggaatgc ttcacatggg accaaaaact 9000
ctggtgccgt cacttctgtg tgcttgcgga ctcagaatct ggtggacata tcactcactc 9060
tgggatggtg ggcatgggag tcagctgcac agtcacccgg gaagatggaa ccaatcgcag 9120
atagggctgc tagtgaacca atcacatgat gtcacccaga catcaggcat acccactagt 9180
gtgaaataga catcagaatt aagaaaaact taggaaccag gtccacacag ccgccagccc 9240
atcaaccatc cactcccacg attggagcca atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta 9300
gtctctagtc agcctaatat tacaaacttg tgcccttttg gtgaagtttt taacgccacc 9360
agatttgcat ctgtttatgc ttggaacagg aagagaatca gcaactgtgt tgctgattat 9420
tctgtcctat ataattccgc atcattttcc acttttaagt gttatggagt gtctcctact 9480
aaattaaatg atctctgctt tactaatgtc tatgcagatt catttgtaat tagaggtgat 9540
gaagtcagac aaatcgctcc agggcaaact ggaaagattg ctgattataa ttataaatta 9600
ccagatgatt ttacaggctg cgttatagct tggaattcta acaatcttga ttctaaggtt 9660
ggtggtaatt ataattacct gtatagattg tttaggaagt ctaatctcaa accttttgag 9720
agagatattt caactgaaat ctatcaggcc ggtagcacac cttgtaatgg tgttgaaggt 9780
tttaattgtt actttccttt acaatcatat ggtttccaac ccactaatgg tgttggttac 9840
caaccataca gagtagtagt actttctttt gaacttctac atgcaccagc aactgtttgt 9900
ggacctaaaa agtctactaa tttggttaaa aacaaatgtg tcaatttcaa cttcaatggt 9960
ttaacaggca caggtgttct tactgagtct aacaaaaagt ttctgccttt ccaacaattt 10020
ggcagagaca ttgctgacac tactgatgct gtccgtgatc cacagacact tgagtaagtg 10080
cgagaggccg agggccagaa caacatccgc ctaccatcca tcattgttat aaaaaacgta 10140
gggtccaagt ggttccccgt tatggactcg ctatctgtca accagatctt ataccctgaa 10200
gttcacctag atagcccgat agttaccaat aagatagtag ccatcctgga gtatgctcga 10260
gtccctcacg cttacagcct ggaggaccct acactgtgtc agaacatcaa gcaccgccta 10320
aaaaacggat tttccaacca aatgattata aacaatgtgg aagttgggaa tgtcatcaag 10380
tccaagctta ggagttatcc ggcccactct catattccat atccaaattg taatcaggat 10440
ttatttaaca tagaagacaa agagtcaacg aggaagatcc gtgaactcct caaaaagggg 10500
aattcgctgt actccaaagt cagtgataag gttttccaat gcttaaggga cactaactca 10560
cggcttggcc taggctccga attgagggag gacatcaagg agaaagttat taacttggga 10620
gtttacatgc acagctccca gtggtttgag ccctttctgt tttggtttac agtcaagact 10680
gagatgaggt cagtgattaa atcacaaacc catacttgcc ataggaggag acacacacct 10740
gtattcttca ctggtagttc agttgagttg ctaatctctc gtgaccttgt tgctataatc 10800
agtaaagagt ctcaacatgt atattacctg acatttgaac tggttttgat gtattgtgat 10860
gtcatagagg ggaggttaat gacagagacc gctatgacta ttgatgctag gtatacagag 10920
cttctaggaa gagtcagata catgtggaaa ctgatagatg gtttcttccc tgcactcggg 10980
aatccaactt atcaaattgt agccatgctg gagcctcttt cacttgctta cctgcagctg 11040
agggatataa cagtagaact cagaggtgct ttccttaacc actgctttac tgaaatacat 11100
gatgttcttg accaaaacgg gttttctgat gaaggtactt atcatgagtt aactgaagct 11160
ctagattaca ttttcataac tgatgacata catctgacag gggagatttt ctcatttttc 11220
agaagtttcg gccaccccag acttgaagca gtaacggctg ctgaaaatgt taggaaatac 11280
atgaatcagc ctaaagtcat tgtgtatgag actctgatga aaggtcatgc catattttgt 11340
ggaatcataa tcaacggcta tcgtgacagg cacggaggca gttggccacc gctgaccctc 11400
cccctgcatg ctgcagacac aatccggaat gctcaagctt caggtgaagg gttaacacat 11460
gagcagtgcg ttgataactg gaaatctttt gctggagtga aatttggctg ctttatgcct 11520
cttagcctgg atagtgatct gacaatgtac ctaaaggaca aggcacttgc tgctctccaa 11580
agggaatggg attcagttta cccgaaagag ttcctgcgtt acgaccctcc caagggaacc 11640
gggtcacgga ggcttgtaga tgttttcctt aatgattcga gctttgaccc atatgatgtg 11700
ataatgtatg ttgtaagtgg agcttacctc catgaccctg agttcaacct gtcttacagc 11760
ctgaaagaaa aggagatcaa ggaaacaggt agactttttg ctaaaatgac ttacaaaatg 11820
agggcatgcc aagtgattgc tgaaaatcta atctcaaacg ggattggcaa atattttaag 11880
gacaatggga tggccaagga tgagcacgat ttgactaagg cactccacac tctagctgtc 11940
tcaggagtcc ccaaagatct caaagaaagt cacagggggg ggccagtctt aaaaacctac 12000
tcccgaagcc cagtccacac aagtaccagg aacgtgagag cagcaaaagg gtttataggg 12060
ttccctcaag taattcggca ggaccaagac actgatcatc cggagaatat ggaagcttac 12120
gagacagtca gtgcatttat cacgactgat ctcaagaagt actgccttaa ttggagatat 12180
gagaccatca gcttgtttgc acagaggcta aatgagattt acggattgcc ctcatttttc 12240
cagtggctgc ataagaggct tgagacctct gtcctgtatg taagtgaccc tcattgcccc 12300
cccgaccttg acgcccatat cccgttatat aaagtcccca atgatcaaat cttcattaag 12360
taccctatgg gaggtataga agggtattgt cagaagctgt ggaccatcag caccattccc 12420
tatctatacc tggctgctta tgagagcgga gtaaggattg cttcgttagt gcaaggggac 12480
aatcagacca tagccgtaac aaaaagggta cccagcacat ggccctacaa ccttaagaaa 12540
cgggaagctg ctagagtaac tagagattac tttgtaattc ttaggcaaag gctacatgat 12600
attggccatc acctcaaggc aaatgagaca attgtttcat cacatttttt tgtctattca 12660
aaaggaatat attatgatgg gctacttgtg tcccaatcac tcaagagcat cgcaagatgt 12720
gtattctggt cagagactat agttgatgaa acaagggcag catgcagtaa tattgctaca 12780
acaatggcta aaagcatcga gagaggttat gaccgttacc ttgcatattc cctgaacgtc 12840
ctaaaagtga tacagcaaat tctgatctct cttggcttca caatcaattc aaccatgacc 12900
cgggatgtag tcatacccct cctcacaaac aacgacctct taataaggat ggcactgttg 12960
cccgctccta ttggggggat gaattatctg aatatgagca ggctgtttgt cagaaacatc 13020
ggtgatccag taacatcatc aattgctgat ctcaagagaa tgattctcgc ctcactaatg 13080
cctgaagaga ccctccatca agtaatgaca caacaaccgg gggactcttc attcctagac 13140
tgggctagcg acccttactc agcaaatctt gtatgtgtcc agagcatcac tagactcctc 13200
aagaacataa ctgcaaggtt tgtcctgatc catagtccaa acccaatgtt aaaaggatta 13260
ttccatgatg acagtaaaga agaggacgag ggactggcgg cattcctcat ggacaggcat 13320
attatagtac ctagggcagc tcatgaaatc ctggatcata gtgtcacagg ggcaagagag 13380
tctattgcag gcatgctgga taccacaaaa ggcttgattc gagccagcat gaggaagggg 13440
gggttaacct ctcgagtgat aaccagattg tccaattatg actatgaaca attcagagca 13500
gggatggtgc tattgacagg aagaaagaga aatgtcctca ttgacaaaga gtcatgttca 13560
gtgcagctgg cgagagctct aagaagccat atgtgggcga ggctagctcg aggacggcct 13620
atttacggcc ttgaggtccc tgatgtacta gaatctatgc gaggccacct tattcggcgt 13680
catgagacat gtgtcatctg cgagtgtgga tcagtcaact acggatggtt ttttgtcccc 13740
tcgggttgcc aactggatga tattgacaag gaaacatcat ccttgagagt cccatatatt 13800
ggttctacca ctgatgagag aacagacatg aagcttgcct tcgtaagagc cccaagtcga 13860
tccttgcgat ctgctgttag aatagcaaca gtgtactcat gggcttacgg tgatgatgat 13920
agctcttgga acgaagcctg gttgttggct aggcaaaggg ccaatgtgag cctggaggag 13980
ctaagggtga tcactcccat ctcaacttcg actaatttag cgcataggtt gagggatcgt 14040
agcactcaag tgaaatactc aggtacatcc cttgtccgag tggcgaggta taccacaatc 14100
tccaacgaca atctctcatt tgtcatatca gataagaagg ttgatactaa ctttatatac 14160
caacaaggaa tgcttctagg gttgggtgtt ttagaaacat tgtttcgact cgagaaagat 14220
accggatcat ctaacacggt attacatctt cacgtcgaaa cagattgttg cgtgatcccg 14280
atgatagatc atcccaggat acccagctcc cgcaagctag agctgagggc agagctatgt 14340
accaacccat tgatatatga taatgcacct ttaattgaca gagatgcaac aaggctatac 14400
acccagagcc ataggaggca ccttgtggaa tttgttacat ggtccacacc ccaactatat 14460
cacattttag ctaagtccac agcactatct atgattgacc tggtaacaaa atttgagaag 14520
gaccatatga atgaaatttc agctctcata ggggatgacg atatcaatag tttcataact 14580
gagtttctgc tcatagagcc aagattattc actatctact tgggccagtg tgcggccatc 14640
aattgggcat ttgatgtaca ttatcataga ccatcaggga aatatcagat gggtgagctg 14700
ttgtcatcgt tcctttctag aatgagcaaa ggagtgttta aggtgcttgt caatgctcta 14760
agccacccaa agatctacaa gaaattctgg cattgtggta ttatagagcc tatccatggt 14820
ccttcacttg atgctcaaaa cttgcacaca actgtgtgca acatggttta cacatgctat 14880
atgacctacc tcgacctgtt gttgaatgaa gagttagaag agttcacatt tctcttgtgt 14940
gaaagcgacg aggatgtagt accggacaga ttcgacaaca tccaggcaaa acacttatgt 15000
gttctggcag atttgtactg tcaaccaggg acctgcccac caattcgagg tctaagaccg 15060
gtagagaaat gtgcagttct aaccgaccat atcaaggcag aggctatgtt atctccagca 15120
ggatcttcgt ggaacataaa tccaattatt gtagaccatt actcatgctc tctgacttat 15180
ctccggcgag gatcgatcaa acagataaga ttgagagttg atccaggatt cattttcgac 15240
gccctcgctg aggtaaatgt cagtcagcca aagatcggca gcaacaacat ctcaaatatg 15300
agcatcaagg ctttcagacc cccacacgat gatgttgcaa aattgctcaa agatatcaac 15360
acaagcaagc acaatcttcc catttcaggg ggcaatctcg ccaattatga aatccatgct 15420
ttccgcagaa tcgggttgaa ctcatctgct tgctacaaag ctgttgagat atcaacatta 15480
attaggagat gccttgagcc aggggaggac ggcttgttct tgggtgaggg atcgggttct 15540
atgttgatca cttataaaga gatacttaaa ctaaacaagt gcttctataa tagtggggtt 15600
tccgccaatt ctagatctgg tcaaagggaa ttagcaccct atccctccga agttggcctt 15660
gtcgaacaca gaatgggagt aggtaatatt gtcaaagtgc tctttaacgg gaggcccgaa 15720
gtcacgtggg taggcagtgt agattgcttc aatttcatag ttagtaatat ccctacctct 15780
agtgtggggt ttatccattc agatatagag accttgcctg acaaagatac tatagagaag 15840
ctagaggaat tggcagccat cttatcgatg gctctgctcc tgggcaaaat aggatcaata 15900
ctggtgatta agcttatgcc tttcagcggg gattttgttc agggatttat aagttatgta 15960
gggtctcatt atagagaagt gaaccttgta taccctagat acagcaactt catctctact 16020
gaatcttatt tggttatgac agatctcaag gctaaccggc taatgaatcc tgaaaagatt 16080
aagcagcaga taattgaatc atctgtgagg acttcacctg gacttatagg tcacatccta 16140
tccattaagc aactaagctg catacaagca attgtgggag acgcagttag tagaggtgat 16200
atcaatccta ctctgaaaaa acttacacct atagagcagg tgctgatcaa ttgcgggttg 16260
gcaattaacg gacctaagct gtgcaaagaa ttgatccacc atgatgttgc ctcagggcaa 16320
gatggattgc ttaattctat actcatcctc tacagggagt tggcaagatt caaagacaac 16380
caaagaagtc aacaagggat gttccacgct taccccgtat tggtaagtag caggcaacga 16440
gaacttatat ctaggatcac ccgcaaattc tgggggcaca ttcttcttta ctccgggaac 16500
aaaaagttga taaataagtt tatccagaat ctcaagtccg gctatctgat actagactta 16560
caccagaata tcttcgttaa gaatctatcc aagtcagaga aacagattat tatgacgggg 16620
ggtttgaaac gtgagtgggt ttttaaggta acagtcaagg agaccaaaga atggtataag 16680
ttagtcggat acagtgccct gattaaggac taattggttg aactccggaa ccctaatcct 16740
gccctaggtg gttaggcatt atttgcaata tattaaagaa aactttgaaa atacgaagtt 16800
tctattccca gctttgtctg gt 16822
<210> 5
<211> 765
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
cctaatatta caaacttgtg cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct 60
gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 120
aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat 180
ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 240
atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 300
acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 360
aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 420
actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 480
tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 540
gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag 600
tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact tcaatggttt aacaggcaca 660
ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt 720
gctgacacta ctgatgctgt ccgtgatcca cagacacttg agtaa 765
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
aatatcagac aacccaggac 20
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
ggatggttga tgggctggcg gctgtgtgga cctggttcct aagtttttta taatggatt 59
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
ccgccagccc atcaaccatc cactcccacg attggagcca atgtttgttt ttcttgtttt 60
<210> 9
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
atggtaggcg gatgttgttc tggccctcgg cctctcgcac ttactcaagt gtctgtgga 59
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
agaacaacat ccgcctacca tccatcattg ttataaaaaa cttaggagca aagtgattg 59
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
cctctggttg tcgggggttg ggggcgc 27
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
tctacatcct gattgcagtg tgtcttggag ggtt 34
<210> 13
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
ggatggttga tgggctggcg gctgtgtgga cctggttcct aagtttttct taattctgat 60
gt 62
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
agaacaacat ccgcctacca tccatcattg ttataaaaaa cgtagggtcc aagtggttc 59
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
ttaagcattg gaaaacctta tcactga 27

Claims (6)

1.一种麻疹病毒活载体新冠重组病毒株，其特征在于，所述病毒株是保藏号为CCTCCNo:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株rMV-PM-RBD1。
2.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包括：
(a)如权利要求1所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株；和
(b)疫苗上可接受的载体。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为注射剂型。
4.一种制备如权利要求1所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(S1)构建在如SEQ ID NO：1所示麻疹病毒野生型基因组的P基因序列和M基因序列中插入如SEQ ID NO：2所示含有新冠病毒RBD的序列的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的全长重组质粒；
(S2)分别获得包含麻疹病毒中的N基因、P基因和L基因以及T7启动子的四种辅助质粒；和
(S3)分别将(S1)中获得的全长重组质粒与(S2)所述的四种辅助质粒共转染宿主细胞，培养3天后，将细胞裂解，离心细胞裂解液后，得到上清液，即获得所述麻疹病毒活载体新冠重组病毒株。
5.如权利要求1所述的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株的用途，其特征在于，用于制备一种用于预防新冠肺炎和/或麻疹的疫苗组合物。
6.一种制备如权利要求2所述的疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(S1)对保藏号为CCTCC No:V202103的麻疹病毒活载体新冠重组病毒株进行传代或培养，从而制得减毒疫苗株；
(S2)将步骤(S1)中制备的所述减毒疫苗株与免疫上可接受的载体混合，从而制得疫苗组合物。
CN202110139726.3A 2021-02-01 2021-02-01 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗 Active CN113293145B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110139726.3A CN113293145B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110139726.3A CN113293145B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113293145A CN113293145A (zh) 2021-08-24
CN113293145B true CN113293145B (zh) 2022-08-26

Family

ID=77318909

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110139726.3A Active CN113293145B (zh) 2021-02-01 2021-02-01 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113293145B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114213547A (zh) * 2021-12-16 2022-03-22 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种展示新冠s蛋白的融合蛋白和重组病毒粒子及其应用
CN114404564A (zh) * 2022-01-05 2022-04-29 大连珍奥药业股份有限公司 脂肽化合物在抗麻疹病毒中的应用
CN114767843B (zh) * 2022-06-22 2022-11-04 北京赛尔富森生物科技有限公司 一种以腮腺炎病毒为活载体的新型冠状病毒疫苗
CN115353552B (zh) * 2022-08-19 2023-07-18 山东大学 一种降低蛋白质变性温度的方法及其突变体与应用
CN116785422B (zh) * 2023-06-25 2024-05-28 中国医学科学院病原生物学研究所 含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202010425D0 (en) * 2020-07-07 2020-08-19 Spicona Inc Combination vaccine
CN111560354A (zh) * 2020-05-22 2020-08-21 中国人民解放军总医院第五医学中心 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用
CN111978376A (zh) * 2020-06-15 2020-11-24 江苏安泰生物技术有限公司 一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3103474A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-14 Institut Pasteur Live recombinant measles-m2 virus and its use in eliciting immunity against influenza viruses

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111560354A (zh) * 2020-05-22 2020-08-21 中国人民解放军总医院第五医学中心 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用
CN111978376A (zh) * 2020-06-15 2020-11-24 江苏安泰生物技术有限公司 一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用
GB202010425D0 (en) * 2020-07-07 2020-08-19 Spicona Inc Combination vaccine

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as vaccine candidate;Weina Sun等;《bioRxiv》;20200728;全文 *
新型冠状病毒预防性疫苗非临床研究中的常见问题;王寅等;《中国生物制品学杂志》;20201231;第33卷(第7期);第837-839页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113293145A (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113293145B (zh) 一种麻疹病毒活载体新冠疫苗
CN111560354B (zh) 重组新型冠状病毒及其制备方法和应用
US20240100151A1 (en) Variant strain-based coronavirus vaccines
CN111019910B (zh) F基因型腮腺炎病毒减毒株及构建方法和应用
CN113293148B (zh) 一种h基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建
CN113293149B (zh) 一种f基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建
CN110256539B (zh) O型口蹄疫病毒新型基因工程亚单位疫苗
EP2391713A1 (en) Immunogenic compositions, vaccines and diagnostics based on canine distemper viruses circulating in north american dogs
CN112552413B (zh) 新型冠状病毒重组蛋白亚单位疫苗
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN109321535A (zh) 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株
AU2017405996A1 (en) Chimeric insect-specific flaviviruses
US20220372081A1 (en) Whole avian-origin reverse genetic system and recombinant h5n2 subtype avian influenza virus, vaccine and uses thereof
CN113293144B (zh) 一种重组f基因型腮腺炎病毒活载体麻疹疫苗
US20110195084A1 (en) Anti-HIV Vaccine Constructed Based on Amino Acid Mutations in Attenuated Live EIAV Vaccine
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
JP4691495B2 (ja) コロナウイルススパイクｓ１融合蛋白及びその発現ベクター
WO2022233287A1 (zh) 一种疫苗试剂和接种方法
CN102406929A (zh) 一种共表达分子佐剂加强型二价口蹄疫蛋白工程疫苗
CN116200403A (zh) 预防突变株的新型冠状病毒mRNA疫苗
US20230029979A1 (en) Broadly protective bovine parainfluenza 3 virus and bovine viral diarrhea virus vaccine
KR20200041821A (ko) 재조합 rsv 생백신주 및 이의 제조 방법
CN116785422B (zh) 含有新型冠状病毒联合抗原的麻疹减毒疫苗及其拯救方法
CN111676244B (zh) 以麻疹病毒为载体的麻疹、风疹联合疫苗
CN108690835B (zh) 一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 201507 No. 1136, langong Road, Jinshan Industrial Zone, Jinshan District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Qingsai Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee after: Beijing saierfusen Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 201507 No. 1136, langong Road, Jinshan Industrial Zone, Jinshan District, Shanghai

Patentee before: Shanghai Qingsai Biotechnology Co.,Ltd.

Patentee before: Beijing saierfusen Biotechnology Co.,Ltd.

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A live vector COVID-19 vaccine of Measles morbillivirus

Effective date of registration: 20230718

Granted publication date: 20220826

Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shanghai branch

Pledgor: Shanghai Qingsai Biotechnology Co.,Ltd.|Beijing saierfusen Biotechnology Co.,Ltd.

Registration number: Y2023310000382