CN111978376A - 一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用 - Google Patents

一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SARS CoV‑2单表位T细胞抗原肽、由该抗原肽制备得到的多能T细胞表位肽，以及负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞，可在体内诱导MHC‑I途径的T细胞免疫，重建机体免疫功能，激发自体CD8+CTL的抗病毒功能，为冠状病毒感染相关疾病的预防和/或治疗提供了更有效、更安全的手段，具有广阔的临床应用和推广前景。

Description

一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制 备方法和其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物及其制备方法和其应用。
背景技术
SARS CoV-2感染会导致2019冠状病毒病(COVID-19)，病情严重情况下会导致感染者的死亡。目前尚未开发出针对SARS CoV-2感染有效的治疗药物。若能开发出有效的SARSCoV-2药物，必将对阻断病毒的传播、控制疫情继续爆发挥关键性作用。
截至目前，已有多项SARS CoV-2疫苗项目进入临床试验阶段。美国国家卫生研究院下属的国家过敏症和传染病研究所与莫德纳公司合作研发的mRNA疫苗mRNA-1273于2020年3月5日获FDA批准进入临床试验，3月16日开始了Ⅰ期临床试验。由军事医学研究院生物工程研究所与康希诺生物联合开发的重组新型冠状病毒疫苗(表达SARS CoV-2S抗原的重组腺病毒载体)Ad5-nCoV于2020年3月 18日获得国家药品食品监督管理局(NMPA)的临床批准。由德国 BioNTech生物技术公司与美国辉瑞公司合作开发的mRNA疫苗BNT- 162于2020年4月22日在德国首次获批进行I/II期临床试验。临床进展较快的SARS CoV-2疫苗多为传统的蛋白类疫苗或核酸类疫苗。
靶向树突细胞(Target-Dendritic Cell，简称T-DC)技术可诱导T细胞免疫，重建机体免疫功能并激发自体抗病毒或抗肿瘤功能，达到预防和/或治疗相关疾病的目的，并具有靶向性好、安全性高等特点。该疗法已于2018年10月获得肝癌治疗性疫苗美国FDA孤儿药资质。Luo等(Vaccine，vol28，issue13，pp2497-2504,2010)公开了基于T-DC技术的乙肝疫苗药物，380例慢性肝炎患者经该疫苗药物治疗后,总有效率约为85％，临床治愈率约为40％。
为满足COVID-19临床治疗的迫切需求，本发明创新性地提出了基于T-DC治疗技术开发的抗SARS CoV-2感染的药物组合物及其制备方法和其应用，为COVID-19及其相关疾病的预防和/或治疗提供了新的选择。
发明内容
本发明的目的之一在于提供SARS CoV-2的单表位T细胞抗原肽，所述的单表位T细胞抗原肽选自FLLVTLAIL、FLFLTWICL、SMWSFNPET 的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种多能T细胞表位肽，所述的多能 T细胞表位肽具有式Ⅰ所示结构：
Figure BDA0002539902630000031
其中，X为碱性氨基酸，Z为单表位T细胞抗原肽。
本发明的优选技术方案中，所述的碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的单表位T细胞抗原肽选自 FLLVTLAIL、FLFLTWICL、SMWSFNPET的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种诱导产生负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的方法，包括以下步骤：
1)从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；
2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)分选的CD14+细胞，将CD14+ 细胞分化为成熟的DC细胞；
3)使用多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟DC细胞，即得负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞。
本发明的优选技术方案中，采用白细胞分离法从外周血或骨髓分离所述单核细胞。
本发明的优选技术方案中，将步骤2)的DC细胞进行分子标记染色，以确认所述CD14+细胞分化为成熟的DC细胞。
本发明的优选技术方案中，所述的方法包括以下步骤：
1)采用白细胞分离法从外周血或骨髓中分离单核细胞，使用CD14 磁珠从所述单核细胞中分选出CD14+细胞；
2)将步骤1)分选的CD14+细胞重悬于含有30ng/ml IL-4和60 ng/ml GM-CSF的RPMI-1640培养基中，将所述CD14+细胞分化为DC 细胞，在培养过程中取样，并对所述样品进行分子标记CD86、CD40、 CD80、HLA-DR和MHC-I染色，当所述分子标记均呈阳性时，制得成熟的DC细胞；
3)使用多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟的DC细胞，即得负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞。
本发明的另一目的在于提供所述方法获得的负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有单表位T细胞抗原肽和药学上可接受的载体。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有多能T细胞表位肽和药学上可接受的载体。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞和药学上可接受的载体。
本发明的另一目的在于提供所述的单表位T细胞抗原肽、多能T 细胞表位肽、或负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞用于制备预防和/或治疗肺部疾病、肺部病变后功能修复的药物中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述肺部疾病为肺炎。
本发明的优选技术方案中，所述肺炎选自细菌、病毒、真菌、非典型病原体感染、理化因素的任一种或其组合所引发的肺炎。
本发明的优选技术方案中，所述细菌选自肺炎球菌、金黄色葡萄球菌的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述病毒选自流感病毒、冠状病毒、腺病毒、巨细胞病毒、科萨奇病毒、麻疹病毒、副流感病毒的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、SARS- CoV-2、MERS、229E、NL63、OC43、HKU1中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述真菌选自白念珠菌、曲霉的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述非典型病原体选自军团菌、支原体的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述理化因素选自放射性、胃酸吸入的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述预防和/或治疗SARS-CoV-2所引发的肺炎选自阻断SARS-CoV-2对肺部的入侵、抑制和/或杀灭SARS- CoV-2、免疫调节、改善肺炎症状中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述免疫调节选自提高免疫力、减少自身免疫对肺组织的攻击的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述改善肺炎症状选自改善肺炎引起的发热、乏力、干咳、鼻塞、流涕、单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、脓毒症休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍中的任一种症状或其组合症状。
本发明的另一目的在于提供包含所述单表位T细胞抗原肽、多能 T细胞表位肽、或负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的药物组合物用于制备预防和/或治疗肺部疾病、肺部病变后功能修复的药物中的应用。
本发明的优选技术方案中，所述肺部疾病为肺炎。
本发明的优选技术方案中，所述肺炎选自细菌、病毒、真菌、非典型病原体感染、理化因素的任一种或其组合所引发的肺炎。
本发明的优选技术方案中，所述细菌选自肺炎球菌、金黄色葡萄球菌的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述病毒选自流感病毒、冠状病毒、腺病毒、巨细胞病毒、科萨奇病毒、麻疹病毒、副流感病毒的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述流感病毒选自甲型流感病毒、乙型流感病毒中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述冠状病毒选自SARS-CoV-1、SARS- CoV-2、MERS、229E、NL63、OC43、HKU1中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述真菌选自白念珠菌、曲霉的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述非典型病原体选自军团菌、支原体的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述理化因素选自放射性、胃酸吸入的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述预防和/或治疗SARS-CoV-2所引发的肺炎选自阻断SARS-CoV-2对肺部的入侵、抑制和/或杀灭SARS- CoV-2、免疫调节、改善COVID-19症状中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述免疫调节选自提高免疫力、减少自身免疫对肺组织的攻击的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述改善COVID-19症状选自改善肺炎引起的发热、乏力、干咳、鼻塞、流涕、单纯性感染、轻症肺炎、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、脓毒症休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍中的任一种症状或其组合症状。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其包含所述单表位 T细胞抗原肽、多能T细胞表位肽、负载所述多能T细胞表位肽的DC 细胞、或包含所述T细胞抗原肽、多能T细胞表位肽、负载所述多能 T细胞表位肽的DC细胞的药物组合物，和其他类型的抗病毒或抗菌药物。
本发明的优选技术方案中，所述的抗病毒药物或抗菌药物选自α -干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、干扰素α-1b、干扰素-α2b、白蛋白、丙种球蛋白、CR3022(大分子单抗药物)、法匹拉韦、瑞德西韦、磷酸奥司他韦、巴洛沙韦(Baloxavir)、羟基氯喹、羟基磷酸氯喹、洛匹那韦/利托那韦、利巴韦林、阿比多尔、盐酸阿比多尔、糖皮质激素、藿香正气胶囊、藿香正气丸、藿香正气水、藿香正气口服液、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、连花清瘟颗粒、疏风解毒胶囊、疏风解毒颗粒、防风通圣丸、防风通圣颗粒、阿莫西林、阿奇霉素、头孢氨苄、头孢呋辛酯、头孢克肟、头孢地尼中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，本发明所述的肺泡吸入组合物与其他药物联合用药时，采取顺序给药、先后给药、同时给药的任一种方式联合给药。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.建立了基于T细胞表位肽和DC细胞的个体化细胞疗法，可在体内诱导MHC-I途径的T细胞免疫，重建机体免疫功能，激发自体 CD8+CTL的抗病毒功能，兼具传统疫苗的预防功能及传统药物的治疗效果。
2.采用了单表位多聚抗原肽(SEA-MAP)，易被DC细胞识别，特异性更强；分枝状多肽的设计可增加抗原肽的分子量和生物活性，使连接的表位肽的朝向具有一致性，在单位空间内指数级增加了表位肽的特异性结合能力和反应敏感性，提高了CTL的作用数量和作用效率，且被DC细胞摄取后不会进入细胞核，具有较好的安全性。
3.采用自体外周血细胞转化的树突(DC)细胞经体外负载SEA- MAP T细胞表位肽，进而培养成的靶向树突(DC)细胞作为治疗剂，在体内产生免疫应答反应，具有不易产生排异反应的效果，有效提高了治疗的靶向性及药物的安全有效性。
4.将T-DC治疗技术有效地应用到了抗病毒，尤其是抗冠状病毒感染领域，为冠状病毒感染相关疾病的预防和/或治疗提供了更有效、更安全的手段，具有广阔的临床应用和推广前景。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1抗原肽的制备
应用软件CLC Protein Workbench 5.8版本和Signal P5.0软件、SYFPE1TH1远程预测数据库、PREDEPP数据库对SARS CoV-2 Env 蛋白及细胞膜糖蛋白中的潜在T细胞单表位进行筛选，获得潜在HLA- A2限制性单表位T细胞抗原肽三条：FLLVTLAIL、FLFLTWICL、SMWSFNPET。
所述单表位T细胞抗原肽及树状多能T细胞表位肽可通过常规固相合成法进行合成。也可将各表位肽的氨基酸序列交由多肽合成公司进行合成。
实施例2负载多能T细胞表位肽的树突状细胞的制备
负载多能T细胞表位肽的树突状细胞的制备方法，包括下述步骤：
将人外周血的PBMC用CD14+磁珠标记，在磁场中分离出 CD14+PBMC；将分选得到的细胞在DC培养袋中加入IL-4(终浓度为 30ng/ml)，GM-CSF(终浓度为60ng/ml)于37℃、5％CO2培养箱中共培养，培养液为PRMI1640(含10％胎牛血清，0.1ml青-链霉素)，每3天半量更换1次培养液，同时补加IL-4和GM-CSF，诱导树突状细胞的生成。培养10天后，通过流式细胞仪筛选出高表达HLA-I (77.31％)，HLA-Dr(0.84％)，CD80(90.32％)，CD86(88.05％)，部分表达CD40(35.21％)的细胞，作为目的DC细胞。
将终浓度0.1mg/L多能T细胞表位肽与1*106个/L的目的DC细胞在37℃下共培养24h，收集活化的树突状细胞，即得。
实施例3负载多能T细胞表位肽的DC细胞对于T细胞的增殖效应
采用WST-1试剂盒(ab155902，Abcam)检测包含多能T细胞表位肽的DC细胞对于T淋巴细胞的增殖的刺激效应。对照组及试验组分别为：未转化抗原肽的DC细胞组、空白T细胞组、负载多能T细胞表位肽的DC细胞组，及空白对照组。
具体测定方法如下：
取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×105人外周血T淋巴细胞的RPMI1640(含0.3％w/wPHA)培养液,在37℃5％CO2培养2小时后，负载多能T细胞表位肽的DC细胞组加入0.1ml(含2×104个细胞)的负载多能T细胞表位肽的DC细胞，未转化抗原肽的DC细胞组加入0.1ml(含2×104个细胞)的未转化抗原肽的DC细胞，空白 T细胞组加入0.1ml(含2×104个细胞)的人外周血T淋巴细胞，空白对照组加入0.1ml RPMI1640培养液。
在37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养48小时，每孔加入10μl WST-1溶液，继续在37℃5％CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4小时。置酶联检测仪上测定光密度(OD)值，检测波长430nm，参考波长650nm。
结果见表1。
表1
组别 OD值
空白对照组 0.3±0.25
DC细胞组 0.4±0.23
空白T细胞组 0.3±0.49
表位肽1-DC细胞组 1.2±0.89
表位肽2-DC细胞组 2.3±0.12
表位肽3-DC细胞组 1.9±0.32
结果显示，负载多能T细胞表位肽的DC细胞能有效刺激T淋巴细胞的增殖，与其他组别有显著差异(p<0.05)。
实施例4 γ-IFN分泌
采用ELISPOT法检测经负载多能T细胞表位肽的DC细胞刺激后的释放γ-IFN的T细胞频数。对照组及试验组分别为：未转化的DC 细胞组、T细胞组、负载多能T细胞表位肽的DC细胞组及空白对照。
具体测定方法如下：
(1)将15μL 35％乙醇(v/v，溶剂为无菌
Figure BDA0002539902630000121
)加入到 ELISPOT板(cat：MSIPS4510，Millipore)的各个孔中，1分钟后采用150μL无菌PBS冲洗3次，去除洗涤缓冲液；
(2)每孔加入100μL IFN-γ捕获抗体(Cat.#ELI-016-H， Millipore，10μg/mL，溶于无菌PBS中)，4℃孵育过夜；
(3)去除抗体溶液，用150μL无菌Milli-
Figure BDA0002539902630000123
水冲洗各孔，以除去未结合的抗体，冲洗3次；
(4)于各孔中加入150ul无菌RPMI1640细胞培养液(含10％胎牛血清)，37℃下放置2h；
(5)吸除各孔中的细胞培养液，加入含2×105人外周血T淋巴细胞的RPMI1640(含0.3％w/wPHA)培养液100μL，37℃5％CO2培养 2小时后，负载多能T细胞表位肽的DC细胞组加入100μl(含2× 104个细胞)的负载多能T细胞表位肽的DC细胞，未转化抗原肽的DC 细胞组加入100μl(含2×104个细胞)的未转化抗原肽的DC细胞，空白T细胞组加入100μl(含2×104个细胞)的人外周血T淋巴细胞，空白对照组加入100μl RPMI1640培养液，37℃，5％CO2孵箱中孵育48h,孵育期间勿晃动ELISpot板；
(6)甩去板中液体，每孔采用200μL PBS/0.01％
Figure BDA0002539902630000122
20充分洗涤6次；
(7)每孔加入100μL在无菌PBS中以1:1000稀释的链霉亲和素碱性磷酸酶偶联物(Streptavdin-AP)，室温孵育45分钟；
(8)甩去板中液体，每孔采用200μL PBS/0.01％
Figure BDA0002539902630000131
20洗涤3次，然后再用PBS洗涤3次；
(9)加入100μL/孔BCIP/NBT显色底物，室温避光孵育30分钟；
(10)甩除显色剂，去离子水冲洗5次,洁净吸水纸上拍干，4℃避光放置过夜后，采用ELISPOT分析仪对斑点进行计数。
结果见表2。
表2
组别 斑点数
空白对照组 1±0.34
DC细胞组 3±0.46
空白T细胞组 2±0.87
表位肽1-DC细胞组 19±0.67
表位肽2-DC细胞组 16±0.84
表位肽3-DC细胞组 27±0.48
结果显示，负载多能T细胞表位肽的DC细胞能有效刺激T细胞的IFN-γ分泌(与其他组别有显著差异(p<0.05))，从而有效激发自体CD8+CTL的抗病毒功能。
以上所述仅为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单表位T细胞抗原肽，其特征在于，所述的单表位T细胞抗原肽选自FLLVTLAIL、FLFLTWICL、SMWSFNPET中的任意一种或其组合。
2.一种多能T细胞表位肽，其特征在于，所述多能T细胞表位肽具有式I所示的结构，
Figure FDA0002539902620000011
其中，X为碱性氨基酸，Z为单表位T细胞抗原肽，优选为FLLVTLAIL、FLFLTWICL、SMWSFNPET中的任意一种或其组合。
3.根据权利要求2所述的多能T细胞表位肽，其特征在于，所述的多能T细胞表位肽的N端由棕榈酰丝氨酸修饰。
4.根据权利要求3所述的多能T细胞表位肽，其特征在于，所述的棕榈酰丝氨酸以-AAA-柔性连接的方式进行多能T细胞表位肽的修饰。
5.一种诱导产生负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分离外周血或骨髓单核细胞；
2)使用GM-CSF和IL-4孵育步骤1)制得的单核细胞，将其分化为成熟的DC细胞；
3)使用权利要求2-4任一项所述的多能T细胞表位肽冲击步骤2)制得的成熟的DC细胞，即得。
6.根据权利要求5所述的方法获得的负载所述多能T细胞表位肽的DC细胞。
7.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1所述的单表位T细胞抗原肽、根据权利要求2-4任一项所述的多能T细胞表位肽和/或根据权利要求6所述的DC细胞。
8.根据权利要求1所述的单表位T细胞抗原肽、根据权利要求2-4任一项所述的多能T细胞表位肽和/或根据权利要求6所述的DC细胞在制备用于预防和/或治疗肺炎的药物中的应用。
9.根据权利要求7所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗肺炎的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述肺炎为病毒性肺炎。
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