CN106397574A

CN106397574A - 抗原表位肽及其应用

Info

Publication number: CN106397574A
Application number: CN201610920705.4A
Authority: CN
Inventors: 陶荣; 郝思国; 张文皓
Original assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Current assignee: XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date: 2016-10-21
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2017-02-15

Abstract

本发明公开了一种抗原表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该抗原表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如NK/T细胞淋巴瘤的癌症的药物中。

Description

抗原表位肽及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的表位肽及其应用。

背景技术

NK/T细胞淋巴瘤是血液系统恶性肿瘤，在美国发病率不高但在亚洲特别是东亚，其发病率较欧美明显升高。NK/T细胞淋巴瘤原发部位多为鼻咽部，在接受联合放化疗及自体外周血造血干细胞移植后，部分患者可以达到治愈，但仍有不少患者最终会复发。目前认为这些患者复发的根源是因为体内存在微小残留病灶，因此需要一种有效的方法，能使接受放化疗或自体造血干细胞移植之后患者体内的微小残留病灶被有效清除。

免疫治疗就是一种非常合适的选择。淋巴瘤细胞分泌的独特型抗原是一种肿瘤特异性抗原。有学者用这种独特型抗原给淋巴瘤患者接种以进行免疫治疗，但是这种治疗疗效让人失望，一部分原因被归咎于这种独特型抗原的免疫原性不够强。因此，迫切地需要发现一种大部分患者共有的新型的肿瘤抗原来改善免疫治疗对多发性NK/T细胞淋巴瘤的疗效。理想的肿瘤抗原应该在不同起源的肿瘤细胞表明表达，在正常组织中低表达或者不表达，而且在肿瘤细胞的生长及生存中不可或缺，这样肿瘤细胞才不可能通过不表达或者下调表达该抗原以逃避免疫攻击。

潜伏性膜蛋白1(LMP1)和潜伏性膜蛋白2a(LMP2a)是多跨膜分子，缺乏有效的细胞外区域，都是组成性活性受体的独立配体。在EBV感染的肿瘤细胞中，LMP通过在细胞表面表达起到重要的信号传导作用，从而决定了细胞的生死。LMP通常表达于各种EBV相关肿瘤，包括鼻咽癌、伯基特瘤和NK/T细胞淋巴瘤等。近年来以LMP1为靶目标的免疫治疗证明，阻断LMP1在肿瘤细胞表面的表达，可以改善患者的预后。

细胞毒性T细胞(CTL)可以通过细胞表面表达的MHC I类分子识别肽段，从而与靶细胞结合达到杀伤靶细胞的目的。MHC I类分子及抗原特异性肽段决定了CTL细胞杀伤靶细胞时的MHC限制性和抗原特异性。中国汉族人群MHC I类分子HLA-A位点0201表达率超过50％，故选择这一MHC I类分子广泛表达的位点研究CTL细胞抗原特异性。

因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别的表位肽。

发明内容

有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本发明提供了一种抗原表位肽及其应用。

本发明的第一方面提供了一种抗原表位肽，其选自以下任一项：

1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；

2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；

3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。

进一步地，上述抗原表位肽为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。

本发明的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述抗原表位肽的氨基酸序列。

本发明的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述抗原表位肽。

本发明的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述抗原表位肽。

本发明的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：

1)如上所述的抗原表位肽；

2)如上所述的抗原呈递细胞；或

3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。

本发明的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：

1)如上所述的抗原表位肽；

2)如上所述的抗原呈递细胞；或

3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。

进一步地，上述癌症为NK/T细胞淋巴瘤。

本发明还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。

优选地，癌症为NK/T细胞淋巴瘤。

免疫治疗一直是医学领域研究的热点，众多研究者寻找到许多NK/T细胞淋巴瘤的靶点，比如EBV-LMP1和LMP2a等，但这些靶点都有各自的局限性，这就需要我们不断寻找新的淋巴瘤治疗靶点，以最终达到个体化治疗的目的：对于每位患者检测其体内各种肿瘤抗原的表达情况，根据其强弱选择合适的靶点，以达到最佳的治疗效果，这种个体化的有差异的治疗也许是今后肿瘤免疫治疗的发展方向。

本发明通过在线筛选、T2细胞亲和性和稳定性实验，筛选获得了两条目的抗原表位肽aa32和aa167。他们在健康供者及患者外周血中均存在，这为后续的研究供了必要条件。

通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，激活CTL并使之扩增。激活后的CTL作用于LMP1蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性，从而有效地杀伤NK/T细胞淋巴瘤细胞，但是其对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在LMP1-CTL细胞下调了肿瘤细胞LMP1表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。

附图说明

图1是本发明一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIV pol，aa32和aa167为两条预测的肽段。

图2是本发明一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。

图3是本发明一个实施例的LMP1-CTL产生结果图。

图4是本发明一个实施例的LMP1-CTL增殖实验结果图。

图5是本发明一个实施例的LMP1-CTL杀伤实验结果图。

图6是本发明一个实施例的LMP1-CTL细胞功能实验结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。

以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。

流式细胞仪购自BECKMAN COULTER，型号为Navios。

T2细胞购自ADCC。

FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。

FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。

多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。

氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。

T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极不稳定。但当HLA-A0201分子和与之结合力强的肽段结合后，HLA-A0201的表达情况会增强并稳定。并且，HLA-A0201分子和肽段的结合力越强，T2细胞表面的HLA-A0201分子降解就越少，表现为HLA-A0201分子的表达量越高。因此，可以直接用T2细胞表面HLA-A0201分子表达的强弱来反应所预测表位肽与HLA-A0201的结合能力。

同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。

实施例1：HLA-A0201限制性LMP1蛋白CTL表位肽预测及合成

(1)LMP1蛋白氨基酸序列的确定：

通过在Genbank数据库中查找LMP1蛋白序列，利用Genbank登录号为：AAS99612.1的序列集，获得一种LMP1蛋白序列，其由382个氨基酸残基组成，具体如SEQ ID No.1所示。

(2)LMP1蛋白表位肽的在线预测：

利用表位肽预测数据库

a：https://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform及

b：http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)

提供的服务对HLA-A0201限制性LMP1蛋白表位肽进行初步预测，选择其中得分最高的数条表位肽，之后用超基序及量化基序方案对初步预测出的CTL表位肽进行修饰，以进一步提高积分。修饰后得分最高的两条表位肽如表1所示：

表1 LMP1蛋白表位肽与人HLA-A0201亲和力预测积分

(得分I^a和得分II^b分别代表使用上方a网站和b网站各自预测的分数。

(3)多肽的合成、纯化与鉴定：

通过生物合成手段，合成、纯化及鉴定了表1中的两个肽段aa32和aa167(上海波泰生物科技公司)。

(4)对照肽：

选取文献报道中的HLA A0201阳性肽和阴性肽作为对照。这两条肽分别为：

阳性肽HIV pol：ILKEPVHGV(SEQ ID No.4)；

阴性肽：流感病毒基质蛋白肽段(FLU-matrix肽段)：GILGFVFTL(SEQ ID No.5)。

实施例2：T2细胞表位肽结合亲和及稳定性实验

借助T2细胞的特性进行HLA-A0201与肽段的亲和能力及稳定性测定。

(1)T2细胞亲和实验

收集T2细胞，用4℃的无菌PBS离心洗涤三次，加入无血清1640培养基，2×10⁵/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，设立实验组及对照组，每组重复三个副孔，将未加肽刺激的T2细胞作为空白对照，每孔加入相应的实验肽段(aa32和aa167)及对照肽段(阳性对照：HIVpol肽段；阴性对照：流感病毒基质蛋白肽段FLU-matrix)(终浓度50uM)，同时加入β2微球蛋白(终浓度2.5ug/ml)。将细胞置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育18h，再次收集细胞，4℃PBS洗涤三次，加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(2ul/孔)，4℃避光孵育15分钟，4℃PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测平均荧光强度。

用荧光系数(FI)作为衡量亲和力指标，荧光系数>1的表位肽被认为与HLA-A0201分子具有高亲和力，荧光系数由以下公式计算得到：

荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-空白对照平均荧光强度)/空白对照平均荧光强度。

亲和性实验结果如图1所示，aa32和aa167的用荧光系数(FI)均大于1，这表明aa32和aa167与HLA-A0201分子具有高亲和力。

(2)T2细胞表位肽结合稳定性实验

收集T2细胞，1×10⁵/孔接种于96孔细胞培养板中，加入无血清1640培养基、β2微球蛋白以及相应的实验肽段(aa32和aa167)，实验组设置三个副孔。将细胞置于5％CO₂培养箱中孵育18h，再次收集细胞，洗涤后加入无血清1640培养基、胞外布雷菲德菌素共同孵育1h，收集细胞，洗涤后再次加入含有胞外布雷菲德菌素(0.5ug/ml)的无血清1640培养基，放入培养箱中孵育，于不同的时间点(0、2、4、8、12、24h)收集细胞。加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(10ul/孔)，用流式细胞仪检测平均荧光强度，计算出每个时间点的FI，用此衡量表位肽诱导的HLA-A0201的表达情况。

结合稳定性实验结果如图2所示，在孵育24h时，肽段aa32和aa167仍然能和HLA-A0201分子保持较好的亲和性，这说明肽段aa32和aa167的结合稳定性好。

实施例3：肽段aa32和aa167相应五聚体阳性细胞毒性T细胞检测

肽段aa32和aa167相应五聚体是根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHC Ⅰ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装，并结合抗原表位肽形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体，再将5个单体组装在一起形成五聚体。

选取一名健康供者及七名患者，检测其外周血中LMP1表位肽五聚体阳性的CD8⁺细胞数目。收集健康供者及淋巴瘤确诊未缓解患者外周血5ml，用淋巴细胞分离液分离方法提取外周血单个核细胞，将细胞计数后取1×10⁶个细胞，溶于100ul PBS中，加入2ul肽段aa32或aa167对应的PE标记的五聚体及同型对照，常温避光孵育40分钟后，冰面放置1分钟，加入FITC标记的CD8+单克隆抗体，4℃避光15分钟，取出后以4℃PBS洗3次，用500ul PBS重悬后用流式细胞仪进行检测。

流式结果判读如表2所示，表明两条肽段aa32和aa167是LMP1蛋白在患者体内或者胞内裂解后的天然产物，为生理状态下产生的表位肽片段，并且健康供者体内LMP1-CTL水平明显低于淋巴瘤患者。

表2 aa32及aa167的五聚体阳性的CD8⁺细胞数目检测结果

健康供者

患者1

患者2

患者3

患者4

患者5

患者6

患者7

aa32

0.43％

1.0％

1.5％

1.2％

1.5％

1.0％

1.64％

2.26％

aa167

0.47％

0.9％

1.7％

1.3％

2.3％

1.7％

2.84％

实施例4：体外验证LMP1蛋白特异性细胞毒性T细胞对淋巴瘤细胞细胞溶解作用并研究其特性

一、诱导生成细胞毒性T细胞：

通过具有稳定的HLA-A0201+的健康供者的外周血，分离外周血单个核细胞(PBMC)，诱导培养DC细胞及细胞毒性T细胞(CTL)。

1.1)分离HLA-A0201⁺健康供者外周血单个核细胞

(1).抽取HLA-A0201⁺健康供者外周血约20ml，肝素钠抗凝。

(2).将外周血加入50ml无菌离心管中，并加入等体积无菌PBS。

(3).分2个50ml离心管，将约40ml稀释的外周血缓慢加入40ml淋巴细胞分离液上，使两者分两层(分两管操作)。

(4).离心400g 18min(相当于1500rpm/min)，离心机选择慢加速及慢减速程序。

(5).吸出在液相交界处的雾状细胞层(即单个核细胞层)，装入另一10ml离心管中。

(6).将单个核细胞用无菌PBS重悬，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。

(7).离心结束后弃上清，用保存于冰面的红细胞裂解液4ml重悬并混合吹打，4℃冰箱放置10分钟，再以300g 10分钟离心，弃上清。

(8).将单个核细胞用无菌PBS洗两遍，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。

(9).用8ml含有10％FBS的1640培养基重悬单个核细胞。

1.2)诱导生成DC细胞

(1).将提取的单个核细胞按照每孔1×10⁶个加入24孔板中，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2h，使单核细胞贴壁。

(2).吸尽24孔板中的细胞悬液，并用含有10％FBS的1640培养基0.5ml轻轻冲刷每孔，重复三次，按需要决定是否收集吸出的细胞悬液(其中含有单个核细胞)。

(3).每孔加入1ml含有10％FBS的1640培养基，并加入GM-CSF(粒-巨噬细胞集落刺激因子)10ng/ml及IL-4 10ng/ml。

(4).每3日半量换液一次，换液时同样加入GM-CSF 10ng/ml及IL-4 10ng/ml，第5日半量换液，加入GM-CSF 10ng/ml、IL-4 10ng/ml及TNF-α10ng/ml，48h后DC细胞成熟。

(5).加入aa167肽段，浓度为50ng/ml，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2-4h。

(6).30Gy伽马射线照射成熟的DC细胞。

(7).吸除所有上清，准备加入淋巴细胞或者诱导的CTL细胞

1.3)诱导生成PBMC来源CTL细胞

(1).第一次淋巴细胞与DC细胞共培养时，将前步中的细胞悬液收集并以1000转10分钟离心，后用含有IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-15 5ng/ml的10％FBS的1640培养基重悬，将淋巴细胞计数后与成熟DC细胞按照10：1比例混合。

(2).每2-3日半量换液一次，同时加入IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-155ng/ml。

(3).第7日新的DC成熟后，将淋巴细胞吹打后吸出，移入新生成DC孔中并与之共培养。

(4).每次与新的DC细胞共培养前，需取样检测特异性，一般与DC共培养4次，从而获得LMP1-CTL细胞。

1.4)CTL细胞CD8及五聚体双阳性率的检测

1.取5×10⁵个培养的CTL细胞(每次与DC共培养后第7天)，加入无菌PBS5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以100ul无菌PBS重悬.

2.在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)，室温避光反应15分钟。置细胞于冰上，孵育1分钟。加入抗-CD8-FITC。在冰上继续避光反应20分钟。

3.PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于适量PBS洗涤液中。

4.细胞流式仪分析。

利用流式细胞仪技术的检测，得到CD8+阳性及五聚体阳性细胞比例超过10％以上的LMP1-CTL，用以完成后续实验。CTL细胞的产生结果图如图3所示。

二、CTL细胞增殖实验：

取经过与DC细胞共培养四周的CTL细胞进行实验，即使用上方一中诱导产生的CTL进行实验。

在流式细胞学检测方法中，用CFSE标记CTL细胞，并将其与照射过的HLA-A0201+的NK/T细胞淋巴瘤细胞株共培养，以检测LMP1-CTL是否会表现出特定的细胞增殖。一般认为只有在与HLA-A0201+的NK/T细胞淋巴瘤细胞株共培养时，LMP1-CTL细胞才表现出明显的增殖，在没有任何抗原刺激的情况下，LMP1-CTL细胞不增殖，在MHC不匹配的情况下，LMP1-CTLs细胞也不增殖。通过这个实验，将论证LMP1-CTLs细胞对NK/T细胞淋巴瘤细胞的作用是否受限于抗原特异性及MHCI类分子限制性。

取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验：

(1).获取DC细胞，详见前述，DC细胞在24孔板中诱导成熟。

(2).DC细胞成熟后分为实验组及对照组：实验组的DC细胞加入筛选出的肽段aa167冲击(50ng/ml)，对照组的DC不加入肽段。

(3).放入37℃5％二氧化碳培养箱培养2-4小时后，将实验组及对照组DC细胞从培养箱取出，弃上清，以少量培养基重悬DC细胞并计数。

(4).取出共培养四周的CTLs细胞，吹打重悬后计数。

(5).将实验组及对照组的DC细胞分别与CTLs细胞按照梯度混合共培养，设置三个梯度：DC细胞与CTLs细胞的比例分别为：4:1、20:1及100：1。

(6).混合的几组细胞重新计数，取96孔板，每孔接种1×10⁵个细胞，培养基为含有10％FBS的1640培养基，不加任何细胞因子，放入37℃5％二氧化碳培养箱培养12小时。此时应将细胞分为以下几组：实验组、对照组及空白对照组，每组设4个复孔，每孔均加入10ulCCK-8试剂。

(7).12小时后取出96孔板，震荡10分钟，采用双波长酶标仪读取450nm波长吸光度(OD)值，均应减除空白对照组OD值。

(8).根据第12小时时间点测得OD值绘制该点各组细胞增殖情况。结果如图4所示，表明加入肽段aa167冲击后，T细胞出现了明显的增殖。

三、CTL细胞杀伤实验：

我们用乳酸脱氢酶释放试验检测LMP1-CTL细胞对HLA-A0201±的NK/T细胞淋巴瘤细胞株的特异性溶解作用。

(1).以下实验均需设置如下几组：空白背景对照组(含有10％FBS的1640培养基)，靶细胞自发LDH释放组(含有10％FBS的1640培养基+靶细胞)，最大LDH释放组(含有10％FBS的1640培养基+靶细胞+裂解液，其中裂解液在共培养第三小时添加)，效应细胞自发LDH释放组(含有10％FBS的1640培养基+CTLs)，实验组(靶细胞与效应细胞按照不同效靶比混合，培养于含有10％FBS的1640培养基中)，每组均设置4个副孔。

(2).取与DC细胞共培养4次后一周的CTLs细胞，计数并1000转10分钟离心后按照不同效靶比调整细胞浓度为2.5×10⁵个/50ul，5×10⁵个/50ul及10×10⁵个/50ul。

(3).取靶细胞计数，将靶细胞调整至5×10⁴个/50ul。

(4).将效应细胞与不同效靶比靶细胞按照1:1、5:1和10:1体积充分混合后加入新V型底96孔板，1000转离心10分钟，放入37℃5％二氧化碳培养箱共孵育4小时。

(5).取出培养板，以1000转离心培养板5分钟。

(6).用排枪从每孔转移50μl上清至一个新的96孔平底(酶分析)板中。

(7).融化Assay Buffer，取出12ml，迅速将未用的部分储存在-20℃。以37℃水浴迅速融化Assay Buffer(注意避光)，然后将这12ml Assay Buffer加入到一瓶SubstrateMix中。轻轻颠倒摇晃使底物溶解。一瓶底物足够做两块96孔板。底物一旦溶解，要避免强光直射，立即使用。

(8).将配置好的底物50ul加入细胞上清液中，室温孵育30分钟，避光。

(9).向每孔加入50ul终止液。

(10).用注射器针头戳破大气泡，加入终止液1h内采用酶标仪读取490nm波长吸光度(OD)值。

(11).细胞毒性％＝100×(实验组-效应细胞自发组-靶细胞自发组)/(靶细胞最大组-靶细胞自发组)。

实验结果如图5所示，其中A2+代表HLA-A0201+细胞株SNK-6，A2-a代表HLA-A0201-性细胞株HANK-1，A2-b代表HLA-A0201-性细胞株KHYG-1，P1代表HLA-A0201+患者1，P2代表HLA-A0201+患者2，P3代表HLA-A0201-患者3。结果表明，获得的LMP1-CTL细胞对HLA-A0201+性细胞有良好的细胞杀伤作用，而对HLA-A0201-性细胞基本没有细胞杀伤作用。并且，当效应细胞与靶细胞的体积比为10:1时，细胞杀伤作用能达到40％以上。

所以，来自于健康供者的LMP1蛋白特异性细胞毒性T细胞能有效地杀伤NK/T细胞淋巴瘤细胞，并且对正常造血细胞没有杀伤作用。特别地，在LMP1-CTL细胞下调了肿瘤细胞LMP1表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。

四、LMP1-CTL细胞功能测定：

为了衡量LMP1-CTL细胞杀伤NK/T细胞淋巴瘤细胞株的效能，借助测量CD107a在LMP1-CTL细胞表面的表达，评估其细胞杀伤NK/T细胞淋巴瘤细胞时的脱颗粒作用。其中，脱粒作用即CD107a在CTLs细胞释放细胞毒颗粒时会短暂的在CTLs细胞膜表面表达。

1)CTLs与HLA-A0201+靶细胞混合实验测定CD107a表达情况(该实验重复三次)

2)CTLs与HLA-A0201-靶细胞混合实验测定CTLs细胞CD107a表达情况(该实验重复三次)

(1).取1×10⁶个培养的CTLs细胞，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为333ul。

(2).取2×10⁶个培养的A2-A淋巴瘤瘤细胞(HLA-A0201^-)，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为667ul。

(3).将CTL细胞333ul与靶细胞A2-A淋巴瘤细胞667ul混合，共1ml。

(4).将效靶细胞混合液放入V型底96孔培养板中，每孔100ul，共10孔。

(5).将放有细胞的96孔板放入37℃5％二氧化碳培养箱中，培养4小时(对96孔板进行离心1000转5分钟)。

(6).培养4h后取出培养板，吹匀并吸出每孔细胞悬液，将10孔细胞混合。

(7).向效靶细胞混合液中加入5ml无菌PBS，混匀后以1000转10分钟离心，弃上清。以100ul无菌PBS重悬效靶细胞混合液，加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5在冰上避光反应20分钟。

(8).用无菌PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于500ulPBS中。

(9).用流式细胞仪进行检测。

检测结果如图6所示，LMP1-CTL细胞与HLA-A0201+淋巴瘤细胞株共培养4小时后，CD8+细胞中CD107a的表达明显上升，表明CTL杀伤HLA-A0201+淋巴瘤细胞株时的脱颗粒作用明显。

Claims

1.一种抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：

1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；

2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；

3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为SEQ ID No.2或SEQID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。

3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的抗原表位肽的氨基酸序列。

4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲以权利要求1或2所述的抗原表位肽。

5.一种主要组织相容性抗原复合物，其特征在于，包括HLA-A0201分子和如权利要求1或2所述的抗原表位肽。

6.一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，其特征在于，所述细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：

1)如权利要求1或2所述的抗原表位肽；

2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或

3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。

7.一种癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗的活性成分包括：

1)如权利要求1或2所述的抗原表位肽；

2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或

3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。

8.如权利要求5所述的癌症疫苗，其特征在于，所述癌症为NK/T细胞淋巴瘤。

9.如权利要求1或2所述的抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为NK/T细胞淋巴瘤。