JP2023548106A - 修飾された免疫細胞およびその用途 - Google Patents

Abstract

修飾された免疫細胞およびその免疫療法における用途であり、前記免疫細胞は末梢血のＰＤ－１+Ｔ細胞に由来する。前記免疫治療は腫瘍治療またはウイルス感染に関連する疾患の治療と予防に用いられる。

Description

本発明はバイオ医薬技術分野に属し、具体的には免疫細胞治療分野に属する。

Ｔ細胞は人体の最も重要な特異的免疫細胞の１つであり、近年、注目されている細胞治療分野において重要な役割を果たしており、例えば、患者の自己Ｔ細胞を修飾して患者に輸注することにより細胞治療を行うことができる。しかし、腫瘍の不均一性、患者ＭＨＣの個体性、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）生成過程（ＶＤＪ転位）のランダム性を考慮すると、患者体内で有害細胞を特異的に認識するＴ細胞集団は様々であり、言い換えると、高度に個体化されたＴＣＲコホートを含むＴ細胞集団である。どのように患者自身から特異的に有害細胞（癌細胞またはウイルス宿主細胞）を識別する能力を有するＴ細胞集団を迅速に獲得し、かつ、これを基礎として修飾を加え、更により効率的かつ安全に細胞治療に応用することは技術的難題である。

本発明の発明者は、ＰＤ－１陽性Ｔ細胞（ＰＤ－１⁺Ｔ細胞）が、抑制された状態にある１群の細胞であり、このような細胞は、おそらく標的細胞を認識することができ、かつ、標的細胞のＰＤ－Ｌ１との相互作用を経験したＴ細胞であると考察している。自己免疫疾患の既往のない個人において、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、有害細胞を攻撃するＴ細胞の集合と見なすことができる。正に、当該集合におけるＴ細胞はすでに有害細胞と接触しているため、これらのＴ細胞は有害細胞を標的とする能力を有していると考えられる。処理された末梢血中のＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、種々の疾患、特に腫瘍および感染性疾患の治療に有望である。ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の利点は、比較的良好な有害細胞に対する識別特性を有している点であるが、欠点は、ＰＤ－１の高発現がこれらの細胞を枯渇状態にさせ、機能が抑制され、殺傷効果を発揮し難い点である。ＰＤ－１⁺Ｔ細胞に識別特性と免疫活性とを兼備させるため、本発明ではＰＤ－１⁺Ｔ細胞の抑制状態を克服する数種の修飾方法を考察することにより、本発明を完成させている。

従って、第１の態様において、本願は、修飾された免疫細胞に関するものであり、前記免疫細胞は、末梢血中のＰＤ－１陽性Ｔ（ＰＤ－１⁺Ｔ）細胞に由来している。好適には、前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である。例えば、前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、例えばＰＤ－１およびＣＤ３をマーカーとして使用することなどにより、ＰＢＭＣを選別することによって得られる細胞である。

好適な実施形態において、前記修飾は、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の抑制状態を減弱または排除することが可能な修飾である。例えば、前記修飾は前記免疫細胞に遺伝子組み換えおよび／または蛋白質修飾を施すことにより行うことができる。

１つの具体的な実施形態において、前記修飾は、前記ＰＤ１⁺Ｔ細胞のＰＤ－１発現が欠失するかまたは減少するようなＰＤ１⁺Ｔ細胞に対する遺伝子修飾である。前記遺伝子修飾は、インビボまたはインビトロで行うことができる。１つの実施形態において、前記遺伝子修飾は、遺伝子編集または遺伝子治療によりインビボで行われる。別の実施形態において、前記遺伝子修飾はインビトロで、例えば前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の調製のあいだなどにおいて、行われる。前記遺伝子修飾は、前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の内因性ＰＤ－１に対するノックアウトまたはノックダウンとすることができる。内因性ＰＤ－１遺伝子をノックアウトする手段には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法、ＴＡＬＥＮなどが含まれるが、これらに限定されない。

１つの具体的な実施形態において、前記修飾は、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞表面のＰＤ－１とそのリガンドとの結合能が、修飾前と比較して低下するように、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞表面のＰＤ－１を修飾することである。具体的な実施形態においては、ＰＤ－１抗体がＰＤ－１⁺Ｔ細胞表面のＰＤ－１に競合的に結合するように、ＰＤ－１抗体を前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞と混合することにより、ＰＤ－１のそのリガンドへの結合能を低下させることにより、修飾が達成される。１つの実施形態において、前記修飾は、ＰＤ－１抗体との併用投与によりインビボで行われる。別の実施形態において、前記修飾はインビトロで行われ、例えば、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の調製中にＰＤ－１抗体を加えることなどにより行われる。前記ＰＤ－１抗体は、好適にはＰＤ－１モノクローナル抗体または１本鎖抗体である。

更なる実施形態において、前記修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、強化受容体（ＥＲ）を有し、前記強化受容体は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含み、前記ＩＣＤは、免疫細胞活性化シグナルを誘発する共刺激分子を含み、前記ＥＣＤは、前記免疫細胞の標的細胞に特異的に結合する部分を含む。具体的な実施形態において、前記免疫細胞の標的細胞に特異的に結合する部分は、前記標的細胞の膜タンパク質の受容体、リガンドおよび抗体、または、それが標的細胞に結合する機能を有する部分もしくはフラグメントから選択される。好適には、前記ＥＣＤは、ＰＤ１の部分配列または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、好適には抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、および／または、前記ＩＣＤはＣＤ２８に由来する。

好適には、前記修飾された免疫細胞は、被験者中の標的細胞に対して標的指向性を有する。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、腫瘍細胞、特には癌細胞である。いくつかの実施形態において、前記標的細胞は、ウイルスに感染した宿主細胞であり、前記ウイルスは、例えば肝炎ウイルス、好適にはＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、またはヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である。いくつかの実施形態において、前記修飾された免疫細胞の標的細胞は、腫瘍細胞、癌細胞、およびウイルス感染細胞からなる群の１または複数から選択される。

更なる実施形態において、前記修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、前記ＣＡＲが、前記免疫細胞の天然ＴＣＲによって認識される抗原とは異なる別の抗原を特異的に認識する。好適には、前記別の抗原はＣＤ１９である。

更なる実施形態において、前記修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、その他の修飾、例えば死滅スイッチなどを含む。

第２の態様において、本願は、第１の態様における修飾された免疫細胞を含む細胞集団を提供する。

第３の態様において、本願は修飾された免疫細胞を調製するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）末梢血からＰＤ－１⁺のＴ細胞を選別することと、
（ｂ）前記工程（ａ）において選別されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞に、以下の処理
ｉ．ＰＤ－１の発現をノックアウトまたはノックダウンする、
ii．ＰＤ－１抗体と混合する、
iii．強化受容体（ＥＲ）を発現させる、
iv．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる、および
ｖ．細胞死を制御する修飾、例えば死滅スイッチなどを発現させる、
のうちの１または複数を行うことと
を含む。好適な実施形態において、前記工程（ｂ）の処理は、少なくとも、強化受容体（ＥＲ）を発現させることを含む。更に、前記工程（ｂ）の処理は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させることを含む。別の実施形態において、またはそれを基礎とする実施形態において、前記工程（ｂ）の処理は、ＰＤ－１の発現をノックアウトまたはノックダウンすること、および／または、ＰＤ－１抗体と混合することを含む。更に、工程（ｂ）の処理は、死滅スイッチを発現させることを含む。前記処理は、インビボまたはインビトロで行うことができる。前記処理は、前記修飾された免疫細胞を被験者に輸注する前、後または同時に行われ得る。具体的な実施形態において、前記方法における工程（ａ）の選別は、末梢血単核細胞から任意の順序でＰＤ－１⁺細胞を選別することおよびＣＤ３⁺細胞を選別することを含む。好適な形態において、前記処理は、少なくともｉ．ＰＤ－１の発現をノックアウトまたはノックダウンすることを含む。

第４の態様において、本願は、第３の態様における方法により調製された修飾免疫細胞に関するものである。

第５の態様において、本願は、第１または第４の態様における修飾免疫細胞、または第２の態様における細胞集団を含む医薬組成物に関するものである。

第６の態様において、本願は、第１または第４の態様における免疫細胞または第２の態様における細胞集団の治療における用途、または薬物の調製における用途に関するものである。前記治療または薬物は、（１）腫瘍の治療、および／または、
（２）ウイルス感染に関連する疾患もしくは症状の治療もしくは予防、または、ウイルス感染に関連する疾患もしくは症状の再発防止、に用いられる。好適には、前記ウイルス感染は慢性ウイルス感染である。具体的な実施形態において、前記ウイルスは肝炎ウイルスであり、好適にはＢ型肝炎ウイルスである。別の具体的な実施形態において、前記ウイルスはヒトパピローマウイルスである。本発明の免疫細胞は被験者において治療後の残存ウイルス成分を除去し、ウイルス感染の再発を予防することに用いることができる。

図１は、実施例１におけるＰＤＸマウスの担癌状況を示す写真である。 図２は、実施例１において腫瘍組織を分離するために解剖した担癌マウスを示す写真である。 図３Ａは、患者の腫瘍組織と共培養された、患者の末梢血由来のＰＤ－１⁺Ｔ細胞またはＰＤ－１^-Ｔ細胞を使用したＩＦＮγ分泌を検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ実験を行った結果を示す図であり、当該結果は腫瘍に対する２種のＴ細胞の識別性および応答性の差異を示している。２４時間共培養したＥＬＩＳＰＯＴ染色写真およびＥＬＩＳＰＯＴ統計結果。 図３Ｂは、患者の腫瘍組織と共培養された、患者の末梢血由来のＰＤ－１⁺Ｔ細胞またはＰＤ－１^-Ｔ細胞を使用したＩＦＮγ分泌を検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ実験を行った結果を示す図であり、当該結果は腫瘍に対する２種のＴ細胞の識別性および応答性の差異を示している。共培養４８時間のＥＬＩＳＰＯＴ染色写真およびＥＬＩＳＰＯＴ統計結果である。 図４Ａは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能に対するＰＤ－１ノックアウトの影響を検出するインビトロ実験の結果を示す図である。フローサイトメトリーによって検出されたＰＤ－１選別効率。 図４Ｂは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能に対するＰＤ－１ノックアウトの影響を検出するインビトロ実験の結果を示す図である。フローサイトメトリーによって検出された、対照としてＴＣＲを発現しているウイルスを用いてトランスフェクトされていない細胞（ＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ）を用いたＴＣＲ発現。 図４Ｃは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能に対するＰＤ－１ノックアウトの影響を検出するインビトロ実験の結果を示す図である。フローサイトメトリーによって検出された、ＴＣＲを発現しているおよび発現していないＰＤ－１⁺Ｔ細胞における、両方のタイプの細胞のための対照として未処理の細胞および空電撃に付された細胞を用いたＰＤ－１ノックアウト効果。 図４Ｄは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能に対するＰＤ－１ノックアウトの影響を検出するインビトロ実験の結果を示す図である。Ｔ細胞がＪ８２－ＮＹ腫瘍細胞と共培養された後のＥＬＩＳＡ実験によって検出された、Ｔ細胞によるＩＦＮγ（Ｄ）およびＩＬ－２（Ｅ）の分泌。 図４Ｅは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能に対するＰＤ－１ノックアウトの影響を検出するインビトロ実験の結果を示す図である。Ｔ細胞がＪ８２－ＮＹ腫瘍細胞と共培養された後のＥＬＩＳＡ実験によって検出された、Ｔ細胞によるＩＦＮγ（Ｄ）およびＩＬ－２（Ｅ）の分泌。 図５Ａは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能における強化受容体の影響を検出するインビトロ実験の結果を示している示す図である。（Ａ）フローサイトメトリーによって検出されたＰＤ－１選別効率、（Ｂ～Ｃ）強化受容体を発現しているおよび発現していないＴ細胞をＪ８２－ＮＹ腫瘍細胞と共培養した後、ＥＬＩＳＡ実験によって検出された、Ｔ細胞によるＩＦＮγ（Ｂ）およびＩＬ－２（Ｃ）の分泌、ならびに（Ｄ）ＥＬＩＳＡ実験によって検出された、強化受容体を発現しているおよび発現していないＴ細胞による、ＯＫＴ３および／またはＰＤ－Ｌ１タンパク質で被覆された９６ウェルプレート中におけるＩＦＮγの分泌。 図５Ｂは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能における強化受容体の影響を検出するインビトロ実験の結果を示している示す図である。強化受容体を発現しているおよび発現していないＴ細胞をＪ８２－ＮＹ腫瘍細胞と共培養した後、ＥＬＩＳＡ実験によって検出された、Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌。 図５Ｃは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能における強化受容体の影響を検出するインビトロ実験の結果を示している示す図である。強化受容体を発現しているおよび発現していないＴ細胞をＪ８２－ＮＹ腫瘍細胞と共培養した後、ＥＬＩＳＡ実験によって検出された、Ｔ細胞によるＩＬ－２の分泌。 図５Ｄは、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能における強化受容体の影響を検出するインビトロ実験の結果を示している示す図である。ＬＩＳＡ実験によって検出された、強化受容体を発現しているおよび発現していないＴ細胞による、ＯＫＴ３および／またはＰＤ－Ｌ１タンパク質で被覆された９６ウェルプレート中におけるＩＦＮγの分泌。 図６Ａは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。ＰＢＳ対照。 図６Ｂは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ。 図６Ｃは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１^-ＴＣＲ－Ｔ細胞。 図６Ｄは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞。 図６Ｅは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１⁺－Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞。 図６Ｆは、実施例４におけるＪ８２－ＮＹ－ＥＳ０１腫瘍細胞が接種されたマウスにおけるインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能における強化受容体の影響を表している。各グループ内の平均値をまとめた図。 図７Ａは、結腸癌患者の腫瘍組織を接種したマウスにおける実施例４のインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能に対する強化受容体の影響を表している。ＰＢＳ対照。 図７Ｂは、結腸癌患者の腫瘍組織を接種したマウスにおける実施例４のインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能に対する強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１－Ｔ細胞。 図７Ｃは、結腸癌患者の腫瘍組織を接種したマウスにおける実施例４のインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能に対する強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１⁺Ｔ細胞。 図７Ｄは、結腸癌患者の腫瘍組織を接種したマウスにおける実施例４のインビボ実験の結果を示す図であり、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍抑制機能に対する強化受容体の影響を表している。ＰＤ－１⁺－Ｖ２Ｅ－Ｔ細胞。 図８Ａは、実施例６における患者における肝機能およびＨＢＶ関連指標を示す図である。 図８Ｂは、実施例６における患者における肝機能およびＨＢＶ関連指標を示す図である。 図８Ｃは、実施例６における対照被験者における肝機能およびＨＢＶ関連指標を示す図である。 図９は、宿主肝細胞内のＨＢＶの生物学的過程を示す図である。 図１０は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）攻撃および標的細胞免疫逃避を示す図である。 図１１は、ＳｃＴＩＬがＨＢＶの肝細胞における残存成分（活性ウイルスを除く）を排除していることを示す図である。 図１２は、ＮＹ－ＥＳＯ－１のためのＴＣＲを導入するためのレンチウイルスベクター構築物ｐＬｅｎｔｉ－ＴＣＲ－ＮＹ ＥＳＯ１のプラスミドマップを示す図である。 図１３は、強化受容体Ｖ１Ｅを導入するためのレンチウイルスベクター構築物ｐＬｅｎｔｉ－Ｖ１Ｅ－Ｔ２Ａ－ＴＣＲのプラスミドマップを示す図である。 図１４は、強化受容体Ｖ２Ｅを導入するためのレンチウイルスベクター構築物ｐＬｅｎｔｉ－Ｖ２Ｅ－Ｔ２Ａ－ＴＣＲのプラスミドマップを示す図である。 図１５は、増幅因子として使用されるＣＤ１９ ＣＡＲ構造概略図である。 図１６は、実施例５における患者１～４の治療前後の画像検査結果を示す図である。

定義
別途説明がある場合を除き、本明細書で開示する方法の実践には、免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学および組み換えＤＮＡの従来技術を採用しており、これらの技術は本分野の技術範囲内である。

用語「約」は、当業者が確定する特定の値の許容可能な誤差範囲内にあることを意味しており、これは当該値をどのように測定または確定するのか、すなわち測定システムの局限性により部分的に決定される。例えば、本分野の実践に基づくと、「約」は１以内または１より大きい標準偏差内であると表示することができる。あるいは、「約」は所定値の最大２０％、最大１０％、最大５％または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスにおいて、当該用語は数値のオーダーを示すことができ、好適には５倍以内、より好適には２倍以内である。本願および特許請求の範囲において特定値を記述している場合、別途説明がない限り、用語「約」は、特定値の許容可能な誤差範囲内を意味していると仮定すべきである。

用語「遺伝子」は、本明細書においては、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡなどのＤＮＡ）およびその対応するＲＮＡ転写生成物をエンコードするヌクレオチド配列を指している。ゲノムＤＮＡは、本明細書においては、介在非コード領域および調節領域を含み、かつ、５’および３’末端も含むことができる。いくつかの使用において、当該用語は転写配列を含み、５’および３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲ）、エクソンおよびイントロンが含まれる。いくつかの遺伝子において、転写領域にはポリペプチドをエンコードする「オープンリーディングフレーム」が含まれる。当該用語のいくつかの使用において、「遺伝子」には例えば「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」などのポリペプチドのエンコーディングに必要なコード配列のみが含まれる。いくつかの場合において、遺伝子は、例えばリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子などでありポリペプチドをコードしない。いくつかの場合において、用語「遺伝子」は転写配列だけでなく、例えば上流および下流調節領域、エンハンサーおよびプロモーターなどを含む非転写領域も含まれる。遺伝子とは、生物ゲノムの天然の位置における「内在性遺伝子」または天然遺伝子を指すことができる。遺伝子は、「外来遺伝子」または非天然遺伝子を指し得る。非天然遺伝子とは、通常は宿主の生物体内では見られないが遺伝子導入によって宿主の生物体に導入される遺伝子を指すことができる。また、非天然遺伝子は、生物体のゲノムの天然の位置にない遺伝子を指すこともできる。非天然遺伝子はまた、天然に存在する核酸、または、突然変異、挿入および／または欠失を含むポリペプチド配列（例えば、非天然配列）を意味し得る。

用語「ヌクレオチド」とは、通常、塩基－糖－リン酸塩の組合せを指している。ヌクレオチドは、ヌクレオチドの類似物または誘導体および合成ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドは、検出のために既知の技術により標識することができる。検出可能な標識には、例えば放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を含むことができる。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は互換使用が可能であり、一本鎖、二本鎖または多重鎖形式である任意の長さのヌクレオチドの重合形、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログを指している。ポリヌクレオチドは、細胞に対して外来のものでも内在のものでもよい。ポリヌクレオチドは、遺伝子またはそのフラグメントとすることができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有することができ、かつ、既知または未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドは、１または複数のアナログを含むことができる（例えば、改変された主鎖、糖または核酸塩基）。

用語「発現」とは、それによってポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから転写される（例えば、ｍＲＮＡまたはその他のＲＮＡ転写物へ）、および／または、それによって転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される１つまたは複数のプロセスを指している。転写生成物およびエンコードされたポリペプチドは、「遺伝子生成物」と総称され得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来である場合、発現には真核細胞中におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。発現の「上方調節」または「下方調節」とは、一般的に、野生型状態における発現レベルに対して、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡなど）および／またはポリペプチド配列の発現レベルの増加または減少を意味している。

発現または活性に関する用語「調節」とは、発現または活性のレベルを変化させることを指している。調節は、転写レベルおよび／または翻訳レベルにおいて起こり得る。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては互換使用が可能であり、ペプチド結合により結合する少なくとも２つのアミノ酸残基の重合体を指している。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては互換使用が可能であり、ペプチド結合により結合する少なくとも２つのアミノ酸残基の重合体を指している。当該用語は、特定の長さの重合体を意味しておらず、当該重合体が天然であること、修飾されていること、または人工であることも意味していない。いくつかの場合において、重合体は非アミノ酸によって中断されていてもよい。当該用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を含み、それには全長タンパク質、および二次および／または三次構造を有するまたは有しないタンパク質（例えば、ドメイン）が含まれる。当該用語には、更に、修飾されたアミノ酸重合体、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、酸化およびその他任意の操作、例えば、標識成分との共役なども含まれる。本明細書で用いる用語「アミノ酸」は、通常、天然及び非天然のアミノ酸を指しており、これらに限定される訳ではないが、修飾されたアミノ酸及びアミノ酸アナログを含んでいてもよい。用語「アミノ酸」にはＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の両方が含まれる。

用語「融合体」は、１つまたは複数の非天然配列（例えば、部分）を含むタンパク質および／または核酸を指すことができる。融合体は、１または複数の同一または異なる非天然配列を含むことができる。融合体はキメラとすることができる。融合体は、核酸親和性タグ、バーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）またはペプチド親和性タグを含むことができる。融合体は、ポリペプチドを亜細胞部位に局在化させるためのシグナル、例えば、細胞核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を標的とするための葉緑体局在化シグナル、小胞体（ＥＲ）保留シグナルなどを提供することができる。融合体は、追跡または精製に用いることが可能な非天然配列（例えば、親和性タグ）を提供することができる。融合体は、小分子、例えば、ビオチンまたは色素、例えば、Ａｌｅｘａフルオロ色素、Ｃｙａｎｉｎｅ３色素、およびＣｙａｎｉｎｅ５色素を含むことができる。

本明細書で用いる用語「抗原」とは、選択的な結合剤により結合可能な分子またはそのフラグメントを指している。例えば、抗原は、選択的な結合剤、例えば受容体により結合可能なリガンドとすることができる。別の例として、抗原は、免疫タンパク質（例えば抗体）のような選択的な結合剤により結合可能な抗原分子とすることができる。抗原は、更に、動物の体内において当該抗原に結合可能な抗体を産生するために使用される分子またはそのフラグメントを指すこともできる。

本明細書で用いる用語「抗体」とは、免疫グロブリン様の機能を有するタンパク質結合分子を指している。用語の抗体には、抗体（例えば、モノクローナルおよびポリクローナル抗体）およびその誘導体、バリアントおよびフラグメントが含まれる。抗体には、異なるクラス（すなわちＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）およびサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）の免疫グロブリン（Ｉｇ）が含まれるがそれらに限定されない。その誘導体、バリアントおよびフラグメントとは、対応する抗体の結合特異性（例えば、完全および／または部分的）を留保した機能的誘導体、バリアントまたはフラグメントを指すことができる。抗原結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、可変領域フラグメント（Ｆｖ）、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、マイクロ抗体、二重抗体およびシングルドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」もしくは「ラクダ化抗体」）が含まれる。抗体という用語には、最適化、プロセス化、または化学的に結合された抗体及び抗体の抗原結合フラグメントが含まれる。最適化された抗体の例には、親和性成熟された抗体が含まれる。改造された抗体の例には、Ｆｃ最適化抗体（例えば、フラグメントの結晶化可能領域を最適化した抗体）および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が含まれる。

用語「ＴＣＲ」または「Ｔ細胞受容体」は、当該技術分野において一般に理解される意味を有している。ＴＣＲはＴ細胞が仲介する抗原認識の基礎であり、免疫システムにおける重要な一環である。ＴＣＲには高度な多様性があり、このような多様性と疾患との間の関係は免疫学分野における研究のホットスポットである。Ｔ細胞がある条件下またはある時点で含むＴＣＲの集合は、ＴＣＲ集団レパトリ（ＴＣＲ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）またはＴＣＲプロファイル（ＴＣＲ ｐｒｏｆｉｌｅ）と称することができ、疾患の発生および進行に応じて非常に大きく変化する可能性がある。

用語「被験者」、「個体」および「患者」は、本明細書において互換使用が可能であり、脊椎動物、好適にはヒトなどの哺乳類を指している。哺乳類には、ネズミ類、サル、ヒト、家畜、競技用動物および愛玩動物が含まれるがそれらに限定されない。更に、インビボで獲得された、またはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞およびその子孫が含まれる。

用語「治療」は本明細書においては、有益なまたは所望の結果を得るための方法（治療上のメリットおよび／または予防上のメリットを含むがそれらに限定されない）を指している。例えば、治療には、本発明における修飾された免疫細胞または当該免疫細胞を含む細胞集団の投与を含むことができる。治療上のメリットとは、治療中の１または複数の疾患または症状に何らかの治療に関連した改善が存在することを指している。予防上のメリットは、本発明における修飾された免疫細胞を、特定の疾患または症状の発生リスクがある被験者に投与することができるか、または、疾患または症状がまだ顕在化していないにも関わらず疾患の１または複数の生理的兆候が存在している被験者に投与することができる点である。

用語「有効量」または「治療有効量」とは、組成物の量を指しており、例えば、本発明における修飾された免疫細胞、例えば、リンパ球（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）を含む組成物の量であり、当該量を必要とする被験者に投与した際に、所望の活性を生成するために十分な量を指している。

免疫細胞
本発明における免疫細胞は、末梢血、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及びその他の血球サブグループ由来であり、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単核細胞、単核細胞前駆細胞、造血幹細胞または非多能性幹細胞などが含まれるがそれらに限定されない。いくつかの場合において、本発明の免疫細胞は、任意のＴ細胞、例えば、腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）を含む任意の免疫細胞であることができる。免疫細胞は、治療対象の被験体（例えば、患者）に由来することができる。前記被験体は、哺乳類、例えば、マウス、サルまたはヒトとすることができる。具体的な実施形態において、前記免疫細胞は、被験者、例えば、ヒト被験者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。

任意の技術、例えばＦｉｃｏｌｌ単離を使用して、被験者から採取した血液中からＴ細胞を得ることができる。被験者の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球除去により得ることができる。アフェレーシス製品には、通常、Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞およびその他の有核白血球が含まれ、更に赤血球および血小板が含まれる。アフェレーシスにより採取された細胞を洗浄して血漿部分を除去するとともに、細胞を好適な緩衝液または培地中、例えば、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に配置して、その後の処理工程に用いることができる。洗浄後、細胞を各種の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ、Ｍｇを含有しないＰＢＳに再懸濁することができる。または、アフェレーシス試料中から不要成分を除去するとともに、細胞を直接培地で再懸濁することができる。試料は、被験者から直接提供されるか、または、１または複数の媒介者、例えば、試料採取業者または医療提供者（例えば医師または看護師）を介して間接的に提供することができる。いくつかの実施形態において、末梢血白血球中からのＴ細胞分離には、赤血球を溶解するとともに、例えば、ＰＥＲＣＯＬ ＴＭ勾配などを用いた遠心分離により末梢血白血球から単球を分離することを含むことができる。

正または負方向の選択技術により、更に免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の特定のサブセットを単離することができ、例えば、本発明の免疫細胞はＰＤ－１陽性のＴ細胞サブセットである。いずれの理論の制限も受けずに、ＰＤ－１陽性細胞は、標的細胞との相互作用を経験した細胞集団を代表する可能性が高いため、当該細胞集団は標的細胞に対する識別性を有していると考えられる。具体的な実施形態においては、ＰＤ－１をマーカーとして、末梢血から得られた免疫細胞、例えば、ＰＢＭＣを選別する。例えば、ＰＤ－１抗体を使用して磁気選別（例えば、磁気ビーズを使用する）またはフローサイトメトリーにより、好適には磁気ビーズを使用して、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞が選別され得る。

本発明では、選別されたＰＤ－１陽性のＴ細胞サブセットは、標的とされることが意図されている有害細胞と相互に作用したＴ細胞サブセットであるため、その中に含まれるＴ細胞は、有害細胞上の抗原を特異的に認識することが可能なＴＣＲレパトリまたはＴＣＲプロファイルを有していると考えられる。細胞治療中に使用されるＴリンパ球が、有害細胞、例えば、腫瘍細胞を標的として認識することを可能とするため、従来技術における１種の方法は、ＴＣＲレパトリをスクリーニングすることにより、有害細胞、例えば、腫瘍細胞を標的とすることが可能なＴＣＲを獲得するとともに、その遺伝情報を得ることにより、患者由来のＴ細胞を遺伝子改変して、有害細胞上の抗原を認識する能力を付与するものである。このような外因性修飾によりＴ細胞に識別性を付与する技術とは異なり、本発明は、ＴＣＲスクリーニングを行うことなく、また治療に用いられるＴ細胞に外因性ＴＣＲを追加的に導入することなく、患者の自己細胞から、有害細胞に対して特異的なＴＣＲを有する確率が高いＴ細胞を直接選別することにより、治療に用いられる細胞の標的化および安全性を保証することができる。従って、当業者であれば理解可能な通り、本発明では、Ｔ細胞が１または複数の特定のＴＣＲを有することを要求していないため、ＴＣＲレパトリは患者およびその疾患状態により大きく変わり得る。本発明では、Ｔ細胞集団と有害細胞との間に識別性が存在することを要求するだけでよく、このような識別性は、本発明においては、主にＰＤ－１陽性のＴ細胞を選別することにより得られる。本理由により、本発明の方法論は、様々な有害細胞を標的とするために使用され得、様々な疾患を治療するためにも用いることができる。

本発明の文脈において、「有害細胞」とは、免疫細胞、特に腫瘍細胞、癌細胞、ウイルス感染細胞により標的化され、および、攻撃されている細胞を指している。

本発明におけるＴ細胞は、更に、ＣＤ３陽性、ＣＤ４陽性、ＣＤ４陰性またはＣＤ８陽性のＴ細胞サブセットとすることができる。本分野における任意の技術を使用して、特定のマーカーを有するかまたは有さない細胞サブセットを選別することができる。例えば、関連するマーカーに対する抗体を結合させたマトリックス、例えば磁気ビーズ、例えば、ＣＤ３磁気ビーズまたはＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズなどによりＣＤ３⁺Ｔ細胞を選別することができる。細胞濃度を変化させることは、基質表面、例えば、磁気ビーズ表面との最大接触に寄与し得る。また、例えば、所望しない細胞特有の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて、細胞集団のネガティブセレクションを実現することもできる。好適な技術には、負の磁性免疫付着による細胞選別が含まれ、それは、所望しない細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体混合物を利用している。例えば、ＣＤ４⁺細胞を分離するために、モノクローナル抗体混合物は、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を含むことができる。

いくつかの実施形態において、免疫細胞は富化された細胞集団中の細胞である。任意の好適な方法により、例えば所望の細胞タイプの増殖および／または分化をトリガーすることにより、または、不要な細胞タイプの成長を停止させることにより、または、望ましくない細胞タイプを殺滅または溶解することによって、または所望の細胞タイプを精製する（例えば、アフィニティーカラム上で精製して、１種又また様々な細胞表面マーカーに基づき所望または不要の細胞タイプを留保する）ことによって、１または複数の所望する細胞タイプは富化され得る

修飾
標的細胞との相互作用に起因して、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、消耗され、および「不動態化」され、そして、それらの効力および機能はある程度脆弱化されている。本発明では、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞を修飾することにより、その効果を回復し、そして向上させている。

本発明における修飾された免疫細胞のＰＤ－１発現は、ノックアウトまたはノックダウンされている。遺伝子発現の「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）」とは、本明細書においては、当該遺伝子の発現を実質的に排除することを指している。遺伝子発現の「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）」とは、本明細書においては、当該遺伝子の発現低下を指している。好適な実施形態において、本発明の修飾された免疫細胞の内因性ＰＤ－１発現はノックアウトされている。本分野において既知の任意の方法を使用してＰＤ－１に対するノックアウトまたはノックダウンを実現することができ、前記方法には、ＲＮＡｉ（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用を含む）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ法、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）技術、部位特異的突然変異誘発、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＥＮ）技術またはその組合せが含まれるが、それらに限定されない。

好適な実施形態においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ法を使用して免疫細胞の内因性ＰＤ－１をノックアウトしており、前記方法には、標的遺伝子ＰＤ－１にハイブリダイズすることが可能なガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓタンパク質またはそのエンコード核酸分子を使用することが含まれる。具体的な実施形態において、ＰＤ－１を標的とするｓｇＲＮＡは、免疫細胞の内因性ＰＤ－１をノックアウトするために使用され、好適には、前記ｓｇＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されたヌクレオチド配列を有する。具体的な実施形態においては、Ｃａｓ９タンパク質またはそれをコードする核酸分子を使用してＰＤ－１がノックアウトされている。前記Ｃａｓ９タンパク質は、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）またはその他の種に由来することができる。例えば、Ｃａｓ９は、ｓｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣａｓＹ、ＣａｓＸまたはｓａＣａｓ９を含むことができる。

１つの態様において、本発明の修飾された免疫細胞には、強化受容体（ＥＲ）が含まれる。強化受容体は、免疫細胞活性に対して更なる制御、例えば、免疫細胞の活性化および増幅を提供することができるが、これらに限定されない。強化受容体がリガンドに結合することにより、修飾された免疫細胞において、免疫細胞不活性化シグナルではなく免疫細胞活性化シグナルを生成することができる。修飾された免疫細胞において免疫細胞不活性化シグナルではなく免疫細胞活性化シグナルを誘導することにより、免疫細胞中の免疫抑制作用を最小化することができる。免疫細胞中の免疫抑制作用を最小化することは、例えば標的細胞（例えば、腫瘍細胞または感染細胞）に対する免疫細胞細胞傷害性を高めることにより、免疫応答における免疫細胞の有効性を高めることができる。

強化受容体は、タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むことができる。前記タンパク質は、シグナル伝達受容体またはその任意の機能フラグメント、誘導体もしくはバリアントとすることができる。いくつかの場合において、前記シグナル伝達受容体は、膜結合型受容体とすることができる。リガンド結合に応答して、シグナル伝達受容体は、細胞内における１または複数のシグナル伝達経路を誘導することができる。いくつかの場合において、シグナル伝達受容体は、非膜結合型受容体とすることができる。強化受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、インテグリン受容体、カドヘリン受容体、酵素結合型受容体（例えば、キナーゼ）、細胞死受容体、チェックポイント受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、成長因子受容体、ホルモン受容体および免疫受容体から選択される受容体のフラグメント、例えば、細胞外ドメインを含むことができる。

いくつかの実施形態において、強化受容体は、免疫系の調節に関与することができる免疫チェックポイント受容体のフラグメントを含む。このような受容体の非限定的な例には、これらに限定される訳ではないが、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＩＤＯ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＳＩＲＰα、およびＮＫＧ２Ｄ、好適にはＰＤ－１が含まれ得る。

強化受容体は、任意の好適な免疫チェックポイント受容体リガンドに結合するフラグメントを含むことができる。このようなリガンドの非限定的な例には、Ｂ７－１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）、ＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２、ＰＰＰ２Ｒ５Ａ、ＭＨＣ（例えば、クラスＩ、クラスＩＩ）、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＰＤ－Ｌ１（またはＰＤＬ１）およびＰＤ－Ｌ２が含まれるが、それらに限定されない。強化受容体のこのようなリガンドに結合する領域は、このようなリガンドの天然の受容体、または、このようなリガンドのモノクローナル抗体であり得る。

強化受容体はまた、免疫細胞活性化シグナルを誘発する共刺激分子またはそのフラグメント、バリアントもしくは誘導体であり得る細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含み得る。いくつかの実施形態において、共刺激分子は免疫細胞中の増殖および／または生存シグナルの調節に用いることができる。いくつかの実施形態において、ＩＣＤは共刺激分子の細胞内ドメインであり、前記共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩタンパク質、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、ＳＬＡＭタンパク質、ＮＫ細胞活性型受容体、ＢＴＬＡまたはＴｏｌｌリガンド受容体から選択される。好適な実施形態において、前記共刺激分子は、Ｔ細胞共刺激分子であり、好適にはＴ細胞の正の共刺激分子、好適にはＣＤ２８である。

強化受容体のＥＣＤとＩＣＤとは、膜貫通ドメインを介して接続され得る。いくつかの実施形態において、前記膜貫通ドメインはポリペプチドを含む。膜貫通ポリペプチドは、任意の好適なポリペプチド配列を有することができる。いくつかの場合において、膜貫通ポリペプチドは、内在性または野生型膜貫通タンパク質の膜貫通部分のポリペプチド配列を含むか、または少なくとも１つのアミノ酸変化のバリアントを有する。いくつかの実施形態において、膜貫通ポリペプチドは、非天然ポリペプチド配列、例えばポリペプチドリンカーの配列を含む。ポリペプチドリンカーは、フレキシブルであってもよく、またリジットであってもよい。ポリペプチドリンカーは構造化されていても構造化されていなくてもよい。いくつかの実施形態において、膜貫通ポリペプチドは、ＥＣＤからのシグナル、例えば、リガンド結合を指示するシグナルをＩＣＤに伝達する。いくつかの実施形態において、ＥＣＤは膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＣＤは膜貫通ドメインを含む。

強化受容体遺伝子をトランスフェクションする手段においては、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞に強化受容体のｍＲＮＡを電気的にトランスフェクションするか、またはレンチウイルス、アデノ関連ウイルス、または非ウイルスベクターを介して強化受容体遺伝子をＰＤ－１⁺Ｔ細胞にトランスフェクションすることができる。

前記強化受容体は免疫細胞表面に発現する膜貫通タンパク質であり、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）により構成され、そのうちＩＣＤは免疫細胞活性化シグナルを誘発する共刺激分子を含み、免疫細胞活性化シグナルを誘発可能であり、ＥＣＤは前記免疫細胞の標的細胞に結合でき、前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の標的細胞の膜タンパク質の受容体、リガンド、抗体、または標的細胞に結合できる任意の１種の物質の完全配列構造またはその結合ドメインを含む部分である。

具体的な実施形態において、前記強化受容体はＶ１ＥまたはＶ２Ｅであり、ＥＣＤはそれぞれＰＤ－１のフラグメント（例えば、ＰＤ－１細胞外ドメインのフラグメント）または抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体のｓｃＦｖ配列を含み、および、前記強化受容体のＩＣＤはＣＤ２８の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。より好適には、前記強化受容体は、ＣＤ２８の膜貫通領域またはＣＤ８の膜貫通領域を含む。最も好適な実施形態において、前記強化受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から選択される配列を含むか、または配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する配列を含むか、またはそのような配列により構成される。

いくつかの実施形態において、本発明の修飾された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲが標的細胞を認識できる場合、強化受容体により修飾された例えばＴ細胞などの免疫細胞は、強化受容体により修飾されていない細胞に比べ、更に強力な免疫細胞活性化機能を有している。いくつかの場合において、ＣＡＲは修飾された免疫細胞の増幅を補助することができる。

好適な実施形態において、前記ＣＡＲは、前記免疫細胞の天然ＴＣＲとは異なる別種の抗原を特異的に認識する。好適には、前記ＣＡＲは、Ｂ細胞表面タンパク質に結合可能な抗原相互作用ドメイン（抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。Ｂ細胞表面タンパク質は、Ｂ細胞表面上に発現する任意のタンパク質とすることができ、好適にはＣＤ１９である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原相互作用ドメインは、表面タンパク質との結合が宿主の一般的な健康状態または免疫系を顕著に損なわない限り、非Ｂ細胞上の表面タンパク質と結合することができる。

抗原結合ドメインの非限定的な例としては、これらに限定される訳ではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体またはそれらの機能的誘導体、バリアントもしくはフラグメントが含まれ、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、マイクロ抗体、二重抗体およびシングルドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物に由来するナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および可変ドメイン（ＶＨＨ）などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖおよびｓｃＦｖのうち少なくとも１種、好適にはｓｃＦｖが含まれる。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインには、抗体ミメティックが含まれる。抗体ミメティックとは、抗体と同等の親和性で標的分子に結合可能な分子を指している。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインには、膜貫通受容体または任意のその誘導体、バリアントもしくはフラグメントが含まれる。例えば、抗原結合ドメインは、少なくとも膜貫通受容体のリガンド結合ドメインを含むことができる。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原相互作用ドメインは、粒子（例えば、ナノ粒子）にカップリング（例えば、共有および／または非共有結合を介して）するＢ細胞表面タンパク質またはそのフラグメントに結合可能である。粒子は、有機および／または無機材料を含む任意の粒子材料とすることができる。粒子は、各種形状および寸法を有することができる。粒子は、少なくとも１つの次元上において約１ナノメートル（ｎｍ）～約５０マイクロメートル（μｍ）とすることができる。粒子は、少なくとも１つの次元上において、少なくとも約１ｎｍ、５ｎｍ、１０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、５０μｍまたはそれより大きくてもよい。粒子は、少なくとも１つの次元上において、最大で５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、５００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、１ｎｍまたはそれより小さくてもよい。粒子は、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフェア、マイクロスフェア、ナノロッド、マイクロロッド、ナノファイバー、ナノリボンなどとすることができる。粒子の例には、金属ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子および鉄ナノ粒子）、金属間ナノ半導体ナノ粒子、コア－シェルナノ粒子、ポリマーシェルを有する無機コアの粒子、ポリマーシェルを有する有機コアの粒子およびそれらの混合物が含まれる。または、粒子は、有機ナノ粒子、例えば交差架橋ポリマー、ハイドロゲルポリマー、生分解性ポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、コポリマー、多糖、デンプン、セルロース、キトサン、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＡ）、ＰＨＢ、ＰＨＶ、脂質、ペプチド、ペプチド両親媒性物質、ポリペプチド（例えば、タンパク質）またはその組合せとすることができる。表面上にＢ細胞表面タンパク質を提示している粒子を、インビトロでＢ細胞表面タンパク質に結合するＣＡＲを含む免疫細胞に導入することができる。別種の選択または追加として、Ｂ細胞表面タンパク質を提示している粒子を、ＣＡＲを含む免疫細胞と共にインビボで導入することができる（例えば、局部的または全身的な注入）。これらの粒子は、インビトロまたはインビボでＣＡＲを含む免疫細胞集団を増幅するために用いることができる。

いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原相互作用ドメインは、死滅したＢ細胞上のＢ細胞表面タンパク質またはそのフラグメントに結合することができる。Ｂ細胞のアポトーシスは、免疫応答発現の前または後に起こり得る。従って、死滅したＢ細胞またはそのデブリは、依然として表面上にＢ細胞表面タンパク質またはそのフラグメントを提示することができる。ＣＡＲの生存Ｂ細胞及び死滅Ｂ細胞を標的とする能力は、前記ＣＡＲを含む修飾された免疫細胞がＢ細胞表面タンパク質に結合し、および細胞内シグナル伝達ドメインのシグナル伝達を開始させる確率を増加させることができる。いくつかの場合において、細胞内シグナル伝達ドメインのシグナル伝達は、ＣＡＲを含む免疫細胞の増幅（増殖）を促進することができる。

ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、修飾された免疫細胞の活性を誘導することができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを形質導入することができ、および、細胞が特徴的な機能を行うように導き得る。シグナル伝達ドメインは、その他分子のシグナル伝達ドメインを含むことができる。いくつかの場合においては、シグナルドメインのトランケートされた部分がＣＡＲに用いられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞シグナル伝達に関与する複数のシグナル伝達ドメイン、または任意のその誘導体、バリアントもしくはフラグメントを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメイン、例えば、共刺激由来分子を含むことができる。

具体的な実施形態において、本願のＣＡＲには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列、または当該配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の相同性を有する配列を含むか、またはそのような配列により構成される。

ＣＡＲを欠失した免疫細胞に比べ、包含される修飾された免疫細胞は、ＣＡＲとＢ細胞表面タンパク質との結合により免疫細胞の増殖を強化することができる。免疫細胞の増殖とは、免疫細胞の増幅または表現型変化を指すことができる。ＣＡＲを含む本発明の修飾された免疫細胞は、Ｂ細胞表面タンパク質に結合することができ、その増殖は、ＣＡＲを欠失している対応する免疫細胞の増殖の約５倍～約１０倍、約１０倍～約５０倍、約５０倍～約１００倍、約１００倍～約２００倍、約２００倍～約３００倍、約３００倍～約４００倍、約４００倍～約５００倍、約５００倍～約６００倍、約６００倍～約７００倍とすることができる。増殖は、Ｂ細胞をＣＡＲを含む修飾された免疫細胞に接触させた後、少なくとも約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４または９６時間後に確定することができる。インビトロまたはインビボにおいて、例えば、免疫細胞の数を測定することにより増殖を確定することができる。免疫細胞の数量を測定する方法としては、フローサイトメトリー、トリパンブルー色素排除法、および／または血球計算法が挙げられ得る。免疫細胞の表現型分析によっても、増殖は測定され得る。

本明細書で提供される強化受容体およびＣＡＲの各種ドメインは、化学結合、例えば、アミド結合またはジスルフィド結合、小さな有機分子（例えば、炭化水素鎖）、アミノ酸配列、例えば、ペプチドリンカー（例えば、約３～２００個のアミノ酸長であるアミノ酸配列）、またはその組合せにより接続することができる。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチドが適切な発現、活性および／またはコンフォーメション位置を有することが可能となるように、所望の柔軟性を提供することができる。ペプチドリンカーは、少なくとも２つの目標ドメインを接続するように、任意の好適な長さを有することができ、および、好適には、それが接続する１つまたは両方のドメインの適切なフォールディングおよび／または機能発揮および／または活性を有するように、十分に柔軟に設計されている。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの長さはアミノ酸約０～２００個、アミノ酸約１０～１９０個、アミノ酸約２０～１８０個、アミノ酸約３０～１７０個、アミノ酸約４０～１６０個、アミノ酸約５０～１５０個、アミノ酸約６０～１４０個、アミノ酸約７０～１３０個、アミノ酸約８０～１２０個、アミノ酸約９０～１１０個である。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、内在性タンパク質配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、グリシン、アラニンおよび／またはセリンのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＳＧまたはＳＧＧＧをモチーフとしているとともに、複数のこのようなモチーフ、例えば、複数の繰り返される同一モチーフを含むことができる。リンカー配列は、任意の天然に存在するアミノ酸、天然には非存在のアミノ酸またはその組合せを含むことができる。

いくつかの実施形態において、本発明の修飾された免疫細胞には、更に、死滅スイッチのような免疫細胞死を調節する修飾も含まれる。毒性が重篤である場合、例えば、高サイトカイン血症が出現した場合は、死滅スイッチを活性化させて免疫細胞を排除することができる。免疫系が、過度に強烈な反応を有し、多くの炎症性サイトカインが放出され、発熱、頭痛、発疹、心拍数上昇、血圧低下および呼吸困難を含む軽微～重篤な症状を引き起こす場合、死滅スイッチが開始され得る。死滅スイッチは、薬物誘導型死滅スイッチであり得る。死滅スイッチは、誘導型カスパーゼ９を含んでいてもよい。

好適な実施形態において、本発明の修飾された免疫細胞は、外因的に導入されたＴＣＲを含まない。

任意の好適な送達方法を使用して、必要とする組成物および分子、例えば、ポリペプチドおよび／またはポリペプチドをエンコードする核酸を、免疫細胞に導入して修飾を達成することができる。各種成分を、同時にまたは個別に伝達することができる。伝達方法は、１または複数の核酸を免疫細胞に導入することを含み得、前記核酸は、本発明の組成物をエンコードするヌクレオチド配列を含み、例えば、標的生成物をエンコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、例えば、組み換え発現ベクターとすることができる。宿主細胞と適合する任意の適切なベクターを本発明に用いることができる。

伝達方法または転化方法の非限定的な例には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接的なマイクロインジェクションおよびナノ粒子媒介核酸送達が含まれるが、それらに限定されない。

ウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入方法は、核酸を哺乳類の細胞または組織に導入するために使用することができるため、本発明では、標的核酸を培養中の細胞に導入するために使用することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、転写生成物）、ネイキッド核酸、および、例えばリポソームなどの送達ベクターと一体化された核酸を含むことができる。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含むことができ、細胞への送達後に、細胞のゲノムに組み込まれていてもよいし、組み込まれていなくてもよい。

ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づくシステムは、体内の特定の細胞を標的とするとともに、ウイルス担持物を細胞核に搬送するために用いることができる。ウイルスベクターは、直接（インビボ）投与するか、またはインビトロで細胞を処置するために用いることもでき、および、任意には細胞に投与されてもよい（エクスビボ）。ウイルスに基づくシステムには、遺伝子導入に用いられるレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含むことができる。宿主ゲノムの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入方法を利用して起こり得、これによって挿入された導入遺伝子の長期的な発現がもたらされ得る。多くの異なる細胞タイプおよび標的組織において、高い形質導入効率を観察することができる。好適には、本発明においてはレンチウイルスベクターが使用され得る。

いくつかの様態において、本発明では免疫細胞を修飾する方法が提供されており、１または複数のポリヌクレオチド、または本明細書に記載されている１種もしくは様々なベクター、またはそれらの１種もしくは様々な転写物、および／またはそれらから転写された１種もしくは様々なタンパク質を免疫細胞に伝達する方法が含まれている。いくつかの態様において、本開示では、更に、これらの方法により生成される修飾された免疫細胞、およびそれらの免疫細胞を含むことが提供されている。

標的細胞
本発明における修飾された免疫細胞は、インビトロ、インビボまたはエクスビボの様々な標的細胞に対して標的化、および作用し得る。標的細胞は分離した細胞とすることができる。標的細胞は生体内の細胞とすることができる。標的細胞は生体とすることができる。標的細胞は細胞培養物中の細胞とすることができる。

標的細胞は、哺乳類の細胞または哺乳類由来の細胞とすることができ、前記哺乳類は、齧歯類、ヒトなどの霊長類とすることができる。標的細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞、古細菌細胞に由来することができ、または真核細胞に由来することもできる。

標的細胞は、病原体に感染した細胞とすることができ、前記病原体は、微生物とすることができ、細菌、真菌またはウイルスを含むが、それらに限定されない。標的細胞は、宿主細胞、例えば、前記病原体の宿主細胞とすることができる。具体的な実施形態において、前記標的細胞は、例えば、肝炎ウイルスに感染した細胞またはヒトパピローマウイルスに感染した細胞であり、前記肝炎ウイルスは、好適にはＢ型肝炎ウイルスである。

標的細胞は特定の器官または組織由来とすることができる。標的細胞は単細胞生物とすることができる。

標的細胞は、幹細胞または前駆細胞とすることができ、成体幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）および前駆細胞、例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞などが含まれるが、それらに限定されない。標的細胞は多能性幹細胞とすることができる。

標的細胞は遺伝子修飾細胞であってよい。標的細胞は標的核酸を含むことができる。

標的細胞は罹患細胞、例えば、有疾患被験者の細胞由来とすることができる。罹患細胞は、代謝、遺伝子発現および／または形態学的特徴の改変を有することができる。罹患細胞は癌細胞またはウイルス感染細胞とすることができる。

好適な実施形態において、前記標的細胞は、腫瘍細胞、特に癌細胞である。前記腫瘍には、固形腫瘍および血液腫瘍が含まれ、好適には固形腫瘍である。

治療用途
本発明の修飾された免疫細胞は腫瘍の治療に用いることができ、換言すると標的細胞として腫瘍細胞と共に使用され得る。いくつかの実施形態においては、標的細胞は腫瘍を形成する。本発明の修飾された免疫細胞を用いた治療は、腫瘍の安定した成長、非進行および／または非転移をもたらし得る。例えば、前記「安定した成長」とは、治療後の一定期間中に、１または複数の腫瘍の体積が１％、５％、１０％、１５％または２０％を超えて増加しないことを意味している。いくつかの実施形態において、前記一定期間は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の週、好適には少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の月、より好適には少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の年である。いくつかの実施形態において、本発明の修飾された免疫細胞を用いた治療により、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞の数量を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低減させることができる。いくつかの実施形態において、腫瘍は完全に除去されるか、または検出レベル未満まで低減される。いくつかの実施形態において、被験者は治療後、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の週、好適には少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上の月、より好適には少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の年の間、腫瘍の無い状態を維持する。

腫瘍の治療に用いられる場合、被験者に投与される本発明の修飾された免疫細胞の量は、１０⁴から１０¹⁰の間、１０⁴から１０⁹の間、１０⁵から１０⁸の間、１０⁶から１０⁷の間である。本発明のＰＤ－１⁺Ｔ細胞が増幅因子の修飾、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む場合、輸注される総量は前記修飾を含まない本発明のＰＤ－１⁺Ｔよりも適当に低減することができ、それはＣＤ１９ ＣＡＲが、輸注される免疫細胞の患者体内における増幅に寄与するためであり、この効果は実施例５に詳細に記載されている。例えば、本発明のＰＤ－１⁺Ｔ細胞が増幅因子の修飾、例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲを含む場合、輸注される細胞の総量は、１０⁴から１０⁹の間、１０⁵から１０⁸の間、１０⁶から１０⁷の間とすることができる。本発明における修飾された免疫細胞は、１回または複数回に分けて被験者に輸注することができ、例えば、１回、２回、３回、４回である。輸注される各回の免疫細胞量は同一であってもよく異なっていてもよい。

本発明における修飾された免疫細胞は、ウイルス感染に関連する疾患または症状を治療するために、換言すると、ウイルス感染細胞を標的細胞として用いることができる。いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞は、患者の癌を治療すると同時に、患者体内のウイルス、例えば、抗ウイルス療法後の残存ウイルスを除去することができる。従って、本発明における修飾された免疫細胞および方法は、ウイルスに感染したことが知られている患者に特に適している。前記ウイルス感染症は、癌に関連していても、癌に関連していなくてもよい。別の実施形態において、本発明の免疫細胞は、ウイルスに感染した細胞に対して、ウイルスに関連する疾患の治療および／またはウイルスの除去に専門的に用いられる。

好適な実施形態において、前記ウイルス感染はＢ型肝炎ウイルス感染である。例えば、前記ウイルス感染は慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染であり、例えば、肝臓がＢ型肝炎ウイルスに感染した期間は６ヶ月を超えて持続している。慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染に関連する疾患には、肝硬変および肝細胞腫が含まれる。

別の好適な実施形態において、前記ウイルス感染は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染である。これまでに１００種を超えるヒトパピローマウイルスが発見されている。癌に関連しているか否かにより、一般に発癌する高リスク型（１６型、１８型、３１型、４５型、５２型、８４型が含まれるが、それらに限定されない）および発癌しない低リスク型（例えば、尖圭コンジローマを誘発する６型、１１型、４２型、４３型、４４型）に分けられる。ＨＰＶは、ヒトの皮膚粘膜の扁平上皮の増殖を引き起こし、皮膚、気道、口腔、消化管、眼、肛門、および泌尿生殖器の疾患を引き起こす。ＨＰＶに関連する疾患には、疣贅、例えば、尋常性疣贅、扁平疣贅、尖圭コンジローマや、腫瘍または癌、例えば、扁平上皮癌、子宮頸癌、外陰癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、中咽頭癌が含まれるが、それらに限定されない。

標的細胞の死滅は、任意の好適な方法により確定することができ、処理前および処理後の細胞数計算、または生存細胞もしくは死滅細胞に関するマーカーのレベルを測定することが含まれるが、それらに限定されない。細胞の死滅度は、任意の好適な方法により確定することができる。いくつかの実施形態においては、初期条件に対して細胞の死滅度を確定する。例えば、個体は既知の初期量の標的細胞を有することができ、例えば、既知のサイズの初期細胞マスまたは既知の濃度の循環標的細胞である。このような場合、細胞の死滅度は、治療後の生存細胞と初期細胞集団との比率で表示することができる。各種の細胞死滅アッセイが使用可能であり、および、様々な検出方法が利用可能である。検出方法の例としては、細胞染色、顕微鏡検査、フローサイトメトリー、セルソーティングおよびそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されない。

治療期間終了後、腫瘍を手術して切除する場合、壊死（すなわち死滅）した切除組織の割合を測定することにより、腫瘍サイズ減少における治療効果を確定することができる。いくつかの実施形態において、切除組織の壊死率が約２０％を超えている場合、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である場合、治療が有効である。いくつかの実施形態において、切除組織の壊死率が１００％であれば、活性腫瘍組織は存在しないか、または検出不能である。

標的細胞の本明細書で開示されている修飾された免疫細胞への曝露は、インビトロまたはインビボで行うことができる。標的細胞の修飾された免疫細胞への曝露とは、通常、標的細胞を修飾された免疫細胞に接触および／または十分に接近させることにより、標的細胞の抗原（例えば、膜結合または非膜結合抗原）は免疫細胞中に発現する強化受容体および／またはＣＡＲを含む受容体に結合することができることを指している。標的細胞および修飾された免疫細胞を共培養することにより、インビトロで修飾された免疫細胞を標的細胞に曝露することができる。共培養は壁細胞または懸濁液として行うことができる。標的細胞および修飾された免疫細胞は、各種の好適なタイプの細胞培地中で共培養することができ、例えば、補充物質、成長因子、イオンなどとの共培養である。インビボで標的細胞を修飾された免疫細胞に曝露することができ、例えば、修飾された免疫細胞を被験者、例えばヒトに投与するとともに、前記修飾された免疫細胞を循環系を介して標的細胞に局在化させることにより実現される。いくつかの場合において、修飾された免疫細胞は、標的細胞が所在する領域に伝達することができ、例えば、直接注射である。前記曝露は、任意の好適な時間にわたって行うことができ、例えば、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、少なくとも２０時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも１ヶ月またはそれ以上の時間である。

本発明の全面的理解および活用のため、以下の文では実施例および添付図を参照しつつ本発明につき詳細な説明を行う。前記実施例は、本発明について例を挙げつつ説明することのみを意図しており、本発明の範囲を限定する意図はない。本発明の範囲は、添付する特許請求の範囲により具体的に限定される。

実施例１．癌患者のＰＤ－１⁺Ｔ細胞による腫瘍認識特性の検証
癌患者末梢血ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の腫瘍に対する識別特性を検証するため、同一患者由来の腫瘍組織を処理し、ヒト腫瘍異種移植（Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ ｔｕｍｏｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ、ＰＤＸ）マウスモデルを構築した。具体的なプロセスは以下の通りである。

Ｉ．腫瘍移植
１．手術中に結腸癌患者から採取した新鮮な腫瘍試料を６０ｍｍの無菌ペトリ皿中に移し、１％ペニシリンストレプトマイシンを適量含むＰＢＳを加えて腫瘍を洗浄した。

２．滅菌外科用ブレードを用いて腫瘍試料を３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍサイズに切断するとともに、６～８週齢のＮＰＩ（遺伝的背景ＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｅｍ１Ｉｄｍｏ－ｉｌ２ｒｇｅｍ２Ｉｄｍｏ）雄マウスに皮下移植した。

３．移植前にＮＰＩマウスに対して腹腔に麻酔剤を注射し、マウスが麻酔されるのを待った後、滅菌眼科鋏を用いてマウスの右後肢外上方の皮膚に約１ｃｍの開口を切開し、眼科ピンセットを用いて腫瘍塊を右後肢外側の皮下に押し出した後、手術切開口を閉じた。

ＩＩ．腫瘍観察
１．腫瘍形成後の腫瘍をＰ０世代とし、ノギスを使用して腫瘍長径ａおよび短径ｂを計量するとともに、公式（Ｖ）＝１／２×ａ×ｂ²により腫瘍体積を計算した。

２．Ｐ０腫瘍が８００～１０００ｍｍ³の大きさまで成長した際に腫瘍を摘出し、壊死組織を除去した後に各３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍの大きさで再度切断するとともに、上記工程を繰り返してＮＰＩマウスの皮下に移植し、組織継代を行い、再度腫瘍を形成した後に腫瘍をＰ１世代と表記した（マウス担癌状況は図１に示されている通りである）。この工程を繰り返し、Ｐ３世代に達すると、それぞれ３匹のマウス上から腫瘍組織を摘出し、後続の体外機能実験を行った（解剖した腫瘍組織は図２に示されている通りである）。

３．各世代で取得した腫瘍サンプルは、いずれもゲノミクス、プロテオミクスおよび病理学分析などに使用することができると同時に、緩慢凍結サンプルを留保して、後続の実験需要がある際に蘇生して担癌を使用することができる。

ＩＩＩ．ＰＤ－１⁺ＴおよびＰＤ－１^-Ｔ細胞の選別
ＰＤＸマウスモデルを第３世代まで継代する際に、同一患者由来の末梢血ＰＤ－１⁺Ｔ細胞とＰＤ－１^-Ｔ細胞とを選別した。

ＩＩＩａ．ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の選別
１．予測選別したＰＤ－１⁺細胞数とＰＤ－１⁺細胞との割合に基づき、相応数量のＰＢＭＣ細胞を遠心分離管中に取り出した。
２．十分な生理食塩水を加えて細胞を再懸濁洗浄し、６００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を廃棄した。
３．工程２を繰り返し、生理食塩水で２回洗浄し、細胞沈殿を得た。
４．１×１０⁷総細胞ごとに４０μｌの緩衝液を加えて再懸濁し、１×１０⁶個の有効細胞ごとに２μｌの抗－ＰＤ－１－Ｂｉｏｔｉｎ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃３２９９３４）を加え、均等に混合した後、４°Ｃで１０～１５ｍｉｎ光を避けて培養した。
５．１×１０⁷の総計の細胞ごとに０．５～１ｍｌの緩衝液を加えて洗浄し、６００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を吸収して廃棄した。
６．１×１０⁷総計の細胞ごとに８０μｌの緩衝液を加えて再懸濁し、１×１０⁷個の有効細胞ごとに２０μｌの抗－Ｂｉｏｔｉｎ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ、Ｃａｔ＃１３０－０９０－４８５）を加え、均等に混合した後、４°Ｃで１５ｍｉｎ光を避けて培養した。
７．１×１０⁷の総計の細胞ごとに１～２ｍｌの緩衝液を加えて洗浄し、６００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を吸収して廃棄した。
８．１×１０⁸総計の細胞ごとに１ｍｌの緩衝液を加えて細胞を再懸濁した。
９．ＬＳ型選別カラムをマグネットホルダー上に配置し、下方に１５ｍｌの遠心分離管を配置し、３ｍｌの緩衝液を用いてカラムを１回濯ぎ洗浄し、その後、新たな５０ｍｌの遠心分離管に交換して捕集管とした。
１０．工程８において再懸濁した細胞を均等にＬＳ型カラム内に加え、カラム通過が完了した後、３ｍｌの緩衝液を用いてカラムを洗浄し、３回洗浄して、吸着していない細胞、すなわちＰＤ－１^-ＰＢＭＣ細胞を収集し、計数して、後続のＰＤ－１^-Ｔ細胞の選別に用いた。
１１．ＬＳ型選別カラムをマグネットホルダー上から取り外し、新たな１５ｍｌ遠心分離管上に配置した。
１２．５ｍｌの緩衝液をカラム内に加え、速やかにピストンを用いてカラム内の液体を押し出し、磁気ビーズで標識された細胞を収集してＰＤ－１⁺細胞とし、後段の使用のために計数された。
１３．それぞれ工程１０および工程１２で選別したＰＤ－１^-およびＰＤ－１⁺細胞が各５×１０⁵個取り出され、および、フローサイトメトリー検出のためにＣＤ３－ＡＰＣ抗体でラベルされた。
１４．実験の必要に応じて、相応数量のＰＤ－１⁺細胞を取り出し、６００ｇを１０ｍｉｎ遠心分離し、完全培地を用いて細胞を再懸濁した。
１５．再懸濁したＰＤ－１⁺Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃４０２０３Ｄ）を加えることにより活性化され、および、継代培養された。

ＩＩＩｂ．ＰＤ－１－Ｔ細胞の選別
１．ＣＤ３フローサイトメトリーによって、ＰＤ－１^-ＰＢＭＣにおけるＴ細胞の割合が検出され、および、総計のＴ砂防が細胞計数にしたがい算出された。
２．Ｔ細胞の数に基づき、およびＴ細胞のＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓに対する比１：３に応じて、相応数のＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを１５ｍｌの遠心分離管中に取り出し、マグネットホルダー上において保存液を除去した。
３．遠心分離管をマグネットホルダー上から取外し、培地再懸濁ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓ（体積１０倍）を加え、マグネットホルダー上に配置して培地を除去した。
４．工程３を２回繰り返し、最後に１～５ｍｌの培地を１回使用して、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを再懸濁した。
５．１／２の再懸濁ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを懸濁細胞液中に加えて、細胞濃度を３．３５～１５×１０⁶／ｍｌに調整して新たな遠心分離管中に加えた（５０ｍｌ遠心分離管１５～５０ｍｌ、１５ｍｌ遠心分離管２～１５ｍｌ）。
６．遠心分離管を交雑炉上（１ｒｐｍ／ｍｉｎ）に配置し、室温１８～２０℃で３０ｍｉｎ培養した。
７．慎重に遠心分離管をマグネットホルダー上に配置し、２ｍｉｎ静置し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓに結合したＴ細胞を採取し、および、適量の培地を用いて再懸濁し、および計数した。
８．吸着されていない細胞懸濁液に工程５～７を繰り返し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓに結合したＴ細胞を第２回目として採取しｍおよび、適量の培地を用いて再懸濁し、および計数した。
９．未吸着細胞懸濁液を計数し、凍結保存した。
１０．工程７、８の両方で採取したＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓに結合したＴ細胞が併せられ、細胞密度が１．２×１０⁶／ｍｌに調整され、Ｔｓｃｍが添加された（Ｔ１５０ １００～１２０ｍｌ、Ｔ７５ ５０～６０ｍｌ、Ｔ２５ １５～２９ｍｌ）。
１１．混合物が十分に混合され、および、継体培養のためにＣＯ２培養器に入れられた。

ＩＶ．Ｔ細胞活性化の検出
上記第ＩＩ部分から得られた３匹のＰ３世代マウスから腫瘍組織を分離して細かく裁断し、酵素消化法により単細胞懸濁液を調製するとともに、それぞれ１＃腫瘍組織、２＃腫瘍組織、３＃腫瘍組織と命名した。上記第ＩＩＩ部分で調製されたＰＤ－１^-Ｔ細胞およびＰＤ－１⁺Ｔ細胞をそれぞれ前記３つの腫瘍組織細胞と共培養して、６種の培養物を形成し、２４時間および４８時間にそれぞれこの６種の培養物に対してＥＬＩＳＰＯＴ実験を行い、ＩＦＮ－γを検出することにより、異なるＴ細胞の活性化状況を考察した。

図３Ａ～Ｂに示されている通り、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞のＩＦＮ－γ放出はＰＤ－１^-Ｔ細胞より顕著に高く、これはＰＤ－１⁺Ｔ細胞が腫瘍組織により活性化され、ＰＤ－１^-Ｔ細胞は活性化不能であることを意味している。当該結果は、上記選別方法により患者末梢血から取得したＰＤ－１⁺Ｔ細胞が効果的に腫瘍細胞を識別しているとともに、それに対して免疫応答を生成し、殺傷を起動できることを表明しており、患者末梢血中に腫瘍細胞に対して免疫機能を発揮可能なＴ細胞（腫瘍特異性Ｔ細胞）が存在しており、かつ、これらの細胞は主にＰＤ－１⁺成分中に集中していることを説明している。

実施例２．ＰＤ－１ノックアウトによるＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能の向上
ＰＤ－１のノックアウトが、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の「抑制状態」を除去することにより、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能を効果的に向上させることができるか否かを検証するために、本実施例における実験を行った。発明者は、インビトロモデルを構築し、ＮＹ－ＥＳＯ－１の発現を特徴とする腫瘍細胞を使用するとともに、それに対応するＮＹ－ＥＳＯ－１に結合可能なＴＣＲを含むＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞を構築した。これを基礎として、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用してＴ細胞中のＰＤ－１遺伝子をノックアウトし、腫瘍細胞に対する効果の変化を観察した。

先ず、患者白血球をアフェレーシスし、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別するためにＰＤ－１モノクローナル抗体を加えた。選別効率は図４Ａに示されている通りである。

その後、選別したＰＤ－１⁺Ｔ細胞中にＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを加え、一晩培養した。翌日ＰＤ－１⁺Ｔ細胞を２群に分け、１群はウイルストランスフェクションなしのＮＯＴＤ－Ｔであり、残りの１群はＴＣＲ－Ｔで、ＮＹ－ＥＳＯ－１を認識するＴＣＲを発現するレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＴＣＲ－ＮＹＥＳＯ１、プラスミド構造は図１２に示されている通りである）が加えられ、ＭＯＩ（レンチウイルス数／細胞数）＝２でレンチウイルスが加えられた。Ｔ細胞を培養および増幅し、当該ＴＣＲのフローサイトメトリーにより検出された発現率は４０．１％であった（図４Ｂ）。

レンチウイルスの添加後４日目にＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを除去し、５日目に電気的導入方式によりＰＤ－１ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ－Ｔ細胞およびＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ中に導入し、内因的に発現したＰＤ－１をノックアウトするとともに、無処理群および空電撃群を対照とした。図４Ｃに示されている通り、電気的導入後７日目にＰＤ－１の発現状況がフローサイトメトリーにより検出された。ＮＯＴＤ－Ｔ細胞無処理群および空電撃群のＰＤ－１陽性割合はそれぞれ３９．６％および３４．８％であり、ＰＤ－１をノックアウトした後のＰＤ－１陽性割合は３．６％まで低下していた。ＴＣＲ－Ｔ細胞無処理群および空電撃群ＰＤ－１陽性割合はそれぞれ４０．１％および３７．９％であり、ＰＤ－１をノックアウトした後のＰＤ－１陽性割合は４．０％まで低下しており、ノックアウト効果は比較的良好であり、後続実験を行うことができた。

ＰＤ－１ノックアウトのＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能に対する影響を検証するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。異なる群のＴ細胞を膀胱癌細胞株Ｊ８２またはＮＹ－ＥＳＯ－１タンパク質を過剰に発現するＪ８２－ＮＹ－ＥＳＯ１（Ｊ８２－ＮＹ）腫瘍細胞と２４時間共培養し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ－γおよびＩＬ－２分泌の状況を検出した。図４Ｄおよび４Ｅに示されている通り、ＰＤ－１をノックアウトすると、ＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌を顕著に促進することができ、同様にＴＣＲを発現するウイルスベクターをトランスフェクションするとともに、Ｊ８２－ＮＹ－ＥＳＯ１腫瘍細胞と共培養した後、２種の対照（未処理の対照および空電撃の対照）と比較したところ、ＰＤ－１をノックアウトしたＰＤ－１⁺Ｔ細胞のＩＦＮ－γの分泌は５０％近く増加し、ＩＬ－２の分泌は８０％以上増加しており、ＰＤ－１をノックアウトすることによりＰＤ－１⁺Ｔ細胞の免疫効力を効果的に向上可能であることが示されている。

実施例３．強化受容体によるＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能の向上（インビトロ実験）
固形腫瘍の細胞治療においては、抑制性受容体、例えばＰＤ－１による免疫細胞に対する抑制作用を解除し、更にＴ細胞の効力を向上させるために、前記免疫細胞の標的細胞に結合可能な細胞外ドメイン、およびＴ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む強化受容体を、治療に用いられるＴ細胞に導入することが提案されており、出願人が先行してＰＣＴ／ＣＮ２０２０／０７３０１７中に記載している通りである。

強化受容体が本発明の方法により得られるＰＤ－１⁺Ｔ細胞の免疫効力に対して影響を及ぼすか否かを検証するために、発明者は、腫瘍標的ＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲを含む以下の３種のＰＤ－１⁺Ｔ細胞を構築した。

１．ＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲを含むＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞。
２．強化受容体Ｖ１ＥおよびＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲを含むＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞であって、Ｖ１ＥはＰＤ１の部分配列を細胞外ドメインとして含むとともに、ＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含み、Ｖ１Ｅの配列は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されているとおりである。
３．強化受容体Ｖ２ＥおよびＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲを含むＰＤ－１⁺Ｖ２Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞であって、Ｖ２ＥはＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合可能なｓｃＦｖ抗体配列を細胞外ドメインとして含むとともに、ＣＤ２８の膜貫通および細胞内ドメインを含み、Ｖ２Ｅの配列は、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されている通りである。

ＮＹ－ＥＳＯ－１を標的とするＴＣＲを含有しない場合および任意の強化受容体のＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ－Ｔ細胞を対照とした。具体的な構築プロセスは以下の通りである。

先ず、患者白血球をアフェレーシスし、ＰＤ－１モノクローナル抗体を加えてＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別した。選別効率は図５Ａ示されている通りである。その後、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞中にＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓを加え、一晩培養した。翌日ＰＤ－１⁺Ｔ細胞を４群に分けた。それぞれ以下の通りである。
第１群：ＮＯＴＤ－Ｔ、ウイルストランスフェクションなし。
第２群：ＴＣＲ－Ｔ、ＮＹ－ＥＳＯ－１を認識するＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを加えた。
第３群：Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ、Ｖ１Ｅ－ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを加えた。ベクター構造は図１３に示されている通りである。
第４群：Ｖ２Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ、Ｖ２Ｅ－ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを加えた。ベクター構造は図１４に示されている通りである。

第２～４群に対して、ＭＯＩ（レンチウイルス数／細胞数）＝２でレンチウイルスを加え、Ｔ細胞を培養および増幅した。

強化受容体のＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能に対する影響を検証するために、ＥＬＩＳＡ実験を行った。発明者は、異なる群のＴ細胞をＪ８２腫瘍細胞またはＮＹ－ＥＳＯ１を過剰に発現するＪ８２－ＮＹ－ＥＳＯ１腫瘍細胞と２４時間共培養し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ－γおよびＩＬ－２分泌の状況を検出した。図５Ｂおよび５Ｃに示されている通り、強化受容体Ｖ１ＥはＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を顕著に促進することができ、強化受容体Ｖ１ＥおよびＶ２ＥはいずれもＰＤ－１⁺ＴＣＲ－Ｔ細胞のＩＬ－２分泌を顕著に促進することができ、２種の強化受容体はいずれも効果的にＰＤ－１⁺Ｔの細胞機能を向上できることが示されている。

強化受容体のＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能に対する影響を更に検証するため、上記４群のＴ細胞をそれぞれＯＫＴ３（ＣＤ３抗体）、ＰＤ－Ｌ１タンパク質またはＯＫＴ３＋ＰＤ－Ｌ１タンパク質をコーティングした９６ウェルプレート中に加え、４８時間培養して上清を取り出し、ＥＬＩＳＡでＩＦＮ－γ分泌状況を検出した。図５Ｄに示されている通り、ＯＫＴ３はＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌を効果的に活性化させることが可能である。ＯＫＴ３とＰＤ－Ｌ１タンパク質とを併用して刺激した場合、ＴＣＲ－ＴおよびＮＯＴＤ群の細胞が分泌するＩＦＮ－γの量は一定程度低下したが、これはＰＤ－Ｌ１タンパク質がＴ細胞表面のＰＤ－１タンパク質に結合して、Ｔ細胞の機能を抑制するためであり、これも標的細胞上のＰＤ－Ｌ１によるＴ細胞機能に対する抑制をシミュレートしている。対照的に、発現強化受容体のＴ細胞機能は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質により抑制されないばかりではなく、ＯＫＴ３のみを使用した処理に対して、同時にＯＫＴ３とＰＤ－Ｌ１とを使用した処理の発現強化受容体のＴ細胞は顕著により高いＩＦＮ－γ分泌を有しており、ＰＤ－Ｌ１タンパク質がＶ１ＥまたはＶ２Ｅ強化受容体上に結合すると、ＰＤ－Ｌ１自身への接触がＴ細胞に対する抑制となるばかりではなく、Ｔ細胞のサイトカイン分泌も顕著に促進することが示されている。この結果は、本発明により得られるＰＤ－１⁺Ｔ細胞発現強化受容体が、ＰＤ－Ｌ１の抑制シグナルをＴ細胞の活性化シグナルに効率的に変換して、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能を増強することを示している。

実施例４．強化受容体によるＰＤ－１⁺Ｔ細胞機能の向上（インビボ実験）
強化受容体のＰＤ－１⁺Ｔ細胞のインビボ腫瘍抑制機能に対する影響を更に検証するため、２つのシステムを構築した。１つは、腫瘍細胞株を移植されたマウス、および当該腫瘍細胞株を認識可能なＴＣＲおよび強化受容体を発現するＴ細胞を含み、他の１つは固形腫瘍患者由来の腫瘍細胞、および同一患者由来のＴ細胞を含んでいる。

１．Ｊ８２－ＮＹ－ＥＳＯ１腫瘍細胞株を接種したマウスを使用した試験
先ず、２０匹のＮＳＧマウスにＪ８２－ＮＹ－ＥＳＯ１腫瘍細胞株を接種した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ³に達した時、２０匹のマウスを無作為に５群に分け、各群４匹とした。

それと同時に、腫瘍患者の末梢血中からＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別し、同時に選別した陰性成分をＰＤ－１^-Ｔ細胞と定義した。選別後のＰＤ－１⁺ＴおよびＰＤ－１^-Ｔ細胞に対してレンチウイルストランスフェクションを行い、ＭＯＩ＝２の用量でそれぞれＴＣＲ（ＮＹ－ＥＳＯ１を認識するＴＣＲ）およびＶ１Ｅ－ＴＣＲを発現するレンチウイルスが導入され、実施例３に記載されているように、ＰＤ－１^-ＴＣＲ－Ｔ、ＰＤ－１⁺ＴＣＲ－ＴおよびＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞が調製され、ここでＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ（非ウイルストランスフェクションのＰＤ－１＋Ｔ細胞）が対照とされた。

細胞の調製が完了した後、それぞれ４群のマウスに輸注、同時に１群のマウスにＰＢＳを輸注して空白対照とした。輸注した後、種々の時点で皮下腫瘍の長さ、幅、高さを測定してマウス体内腫瘍の体積を計算した。

結果は図６に示されている通りであり、ＰＢＳおよびＰＤ－１⁺ＮＯＴＤ細胞を輸注したマウスの腫瘍は持続的に増殖し（図６Ａ、６Ｂ）、Ｔ細胞を輸注した後４４日目に腫瘍体積は５００ｍｍ³前後に達した。他の３群のマウスにはＰＤ－１^-ＴＣＲ－Ｔ、ＰＤ－１⁺ＴＣＲ－ＴおよびＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を輸注したところ、腫瘍体積はいずれも一定程度減少し（図６Ｃ～Ｅ）、ＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞の効果が最も明らかであり、この場合、腫瘍はほぼ完全に除去されていた。

図６Ｆには、各群の腫瘍体積平均値曲線が示されている。ＰＤ－１^-ＴＣＲ－Ｔ、ＰＤ－１⁺ＴＣＲ－ＴおよびＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞を輸注した各群内におけるマウス腫瘍体積の平均値はそれぞれ２５．４３ｍｍ³、１０２．４ｍｍ³および０ｍｍ³であり、いずれも比較的良好な腫瘍抑制効果が示されていた。

以上の通り、ＰＤ－１⁺Ｖ１Ｅ－ＴＣＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果が最も強く、４匹のマウスの腫瘍はいずれも完全に除去され、１００％ＣＲの治療効果が実現されていた。当該治療効果は、ＰＤ－１^-ＴＣＲ－Ｔの腫瘍抑制効果よりも更に良好であり、ＰＤ－１⁺Ｔ中に担持された強化受容体が効果的にＰＤ－１⁺Ｔ細胞の機能を向上させることができ、元々腫瘍抑制効果がＰＤ－１^-Ｔ細胞には及ばないＰＤ－１⁺Ｔ細胞の消耗状態を逆転させ、強化受容体を発現しないＰＤ－１^-Ｔ細胞よりも更に優れた効果を生成することが示されていた。

２．患者の腫瘍組織を移植したマウスを使用した試験
患者由来の腫瘍組織を移植したマウスおよび同一患者由来のＴ細胞を使用して同様の実験を行った。

発明者は、固形腫瘍患者由来の腫瘍組織からＰＤＸ（Ｐａｔｉｅｎｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルを構築した。ＰＤＸモデルが第５世代まで継代されたとき、２０匹のマウスを選出し、平均腫瘍体積が１００ｍｍ³に達した時に、２０匹のマウスを無作為に４群に分け、各群５匹とした。

それと同時に、同一患者の末梢血中からＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別し、同時に選別した後の陰性成分をＰＤ－１^-Ｔ細胞と定義した。選別後の一部のＰＤ－１⁺Ｔ細胞に対してレンチウイルストランスフェクションを行い、ＭＯＩ＝２の用量で強化受容体Ｖ２Ｅを発現するレンチウイルス（当該構築物は、実施例３におけるＶ２Ｅ－ＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターと同一であるが、ＴＣＲをエンコードするフラグメントを含んでいない）が導入され、そして、ＰＤ－１^-－Ｔ、ＰＤ－１⁺－ＴおよびＰＤ－１⁺Ｖ２Ｅ－Ｔ細胞が調製された。

細胞の調製が完了した後、それぞれ３群のマウスに輸注し、同時に１群のマウスにＰＢＳを輸注して空白対照とした。輸注した後、種々の時点でマウス体内における腫瘍の体積を測定した。

各群の種々のマウスの腫瘍増殖状況が比較され、そして、結果が図７Ａ～Ｃに示された。患者由来の腫瘍組織を使用して直接移植しているため、上記で使用した細胞株と比較して述べると、各マウスの体内に移植した腫瘍組織は、細胞構成上において比較的大きな不均一性を有する可能性があるため、同一群の異なるマウス間の結果にも一定の違いが存在していた。従って、本実験においては、先行する実験のように各群の平均値を計算して比較することは行わなかった。

それにも拘わらず、図７から理解できるように、ＰＢＳおよびＰＤ－１^-－Ｔ、ＰＤ－１⁺－Ｔ細胞を輸注したすべてのマウス腫瘍はいずれも持続的に増殖しており、かつ、増殖速度は速く、何らの腫瘍抑制効果も見られなかった。ＰＤ－１⁺Ｖ２Ｅ－Ｔ細胞を輸注したマウスについては、５匹のマウスのうち３匹に腫瘍体積の縮小が出現し、そのうち２匹のマウスの腫瘍体積は最初の９４ｍｍ³および８５ｍｍ³からそれぞれ２１ｍｍ³および５２ｍｍ³にまで減少した（図７Ｄ）。

当該結果は、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞中に強化受容体を担持することにより、ＰＤ－１^-Ｔ細胞の機能を効果的に向上させ、更にＰＤ－１⁺Ｔ細胞の状態を逆転し、体内における腫瘍抑制能力を促進することを示している。

実施例５．強化受容体およびＣＡＲで修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞の初回臨床試験
本願の文脈において、進行腫瘍患者の末梢血におけるＰＤ－１^-Ｔ細胞は、かつて腫瘍中に浸潤しており、かつ、腫瘍微小環境に抑制された後、再度末梢血に戻ったＴ細胞であると考えられ、ｃＴＩＬ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）と称される。

従来の治療が無効な９名の末期固形腫瘍患者（または被験者と称される）を臨床試験研究に組み入れ、患者のＰＢＭＣを採取し、その中のＰＤ－１⁺Ｔ細胞（ｃＴＩＬ）を分離し、それに対してＶ１Ｅ強化受容体と増幅因子（ＣＤ１９ＣＡＲ、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示される）を発現する遺伝子修飾を行い、スーパーｃＴＩＬ（ＳｃＴＩＬ）を調製し、その後、患者に輸注した。具体的な試験は以下の通りである。

１．被験者の選択
患者治療前の臨床状況は下記表に示されている通りである。

上記表において、ＴＭＢは、腫瘍遺伝子変異量（Ｔｕｍｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｂｕｒｄｅｎ）を代表しており、ゲノム中の１００万塩基当りの変異数で評価され、５未満は低変異量、５～１０は中変異量、１０以上は高変異量である。本分野においては、通常、ＴＭＢが高いほど免疫療法に適しており、低いほどこのような療法に適していないと考えられている。

上記表から明らかな通り、選出された患者は８種類の異なる癌種（胆嚢癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵神経内分泌腫瘍、腎癌、粘膜黒色腫、膵癌）の固形腫瘍患者であり、すべて末期であり、かつ、従来のマルチライン治療は無効であり、体内に多数の遠隔転移病巣を擁しており、かつ、大部分の患者のＴＭＢは高レベルではない。

２．治療前の細胞調製
２．１ ＰＤ－１⁺Ｔ（ｃＴＩＬ）細胞の分離：
（１）患者の末梢血単核細胞をアフェレーシスし、ＰＢＭＣを分離した。フローサイトメトリーを用いてＰＤ－１⁺Ｔ細胞（ＰＤ－１⁺ＣＤ３⁺二重陽性細胞）が全Ｔ細胞（ＣＤ３⁺細胞）に占める割合を検出した（下記表参照）。ＰＤ－１⁺Ｔ細胞の総Ｔ細胞中における割合は２８．５％（患者１）および１４．３％（患者２）であることが同定され（表２）、このように高い割合のＰＤ－１⁺Ｔ細胞は腫瘍組織に由来するＴＩＬと見なされ、腫瘍組織から末梢血に進入しているため、ｃＴＩＬ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ＴＩＬ）と称される。
（２）前記方法を用いてＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別した。

２．２ ＳｃＴＩＬの調製：
Ｖ１Ｅ－ＣＤ１９ ＣＡＲを同時に担持した複合レンチウイルスを用いてｃＴＩＬｓ細胞をトランスフェクトして、スーパーｃＴＩＬ（ＳｃＴＩＬ）を調製した。レンチウイルスのトランスフェクション過程は、実施例３の記載と同様である。８～１０日の自然増幅過程を経過させ、フローサイトメトリーを使用して細胞中のＣＡＲ⁺細胞（有効細胞と見なす）の割合を検出したところ、有効細胞割合は１０％～４０％であった。品質管理検査を行った後、細胞は輸注袋に装入された。全調製過程はわずか８～１０日であった（新たな抗原成分を含まない識別性Ｔ細胞の同定過程）。

３．輸注治療およびモニタリング：
すべての患者にいずれも静脈からＳｃＴＩＬを輸注した。静脈輸注に用いる半透明薄黄色のＳｃＴＩＬ細胞懸濁液を３８．５°Ｃの水浴を用いてベッドサイドで蘇生した後、速やかに経静脈的に注入した。輸注体積は細胞総量に応じて確定され、細胞総量は６．９×１０⁵～４．５×１０⁸、輸注体積は２０～４０ｍｌであり、細胞密度は約３×１０⁶～３×１０⁷／ｍｌであり、総有効細胞（ＣＡＲ陽性細胞）の輸注量は表２の通りである。輸注後の患者は入院観察を継続した。

３．１ 安全性評価
全９名の被験者のうち、３名のみが高熱を発症し、そのうち１名は天然寛解し、他の２名はトシリズマブ治療後に症状が寛解し、サイトカインストーム（ＣＲＳの発生率は３３％（３／９）であり、かつ、いずれも１級ＣＲＳであり、ＣＲＳのリスクはＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ治療の血液腫瘍を大きく下回り、いずれの患者も、治療後に自己免疫疾患を発症しなかった。

従って、本発明における増幅因子ＣＤ１９ＣＡＲおよび強化受容体を用いてｃＴＩＬ細胞を修飾するとともに、それを被験者に輸注する治療案は、制御不能かつ重篤な副作用は発生せず、理想的な安全性を有している。

３．２ 治療効果の評価
輸注前のベースラインと細胞輸注後の２ヶ月の画像学検査に基づくと、結果には、すべての被験者は細胞輸注後６週間の観察期間内に、疾患が全体的にすべて効果的に制御されていることが示されており、本願におけるＳｃＴＩＬの末期固体腫瘍に対する疾患制御率は約１００％（９／９）、つまり患者の治療に対する応答率は１００％であり、そのうち３例の患者の腫瘍には明らかな縮小または活性の消失が出現し、つまり客観的な寛解率は３３％（３／９）であった。

表２中の最も右欄における治療効果の評価にはいずれもＲＥＣＩＳＴ基準を採用した。患者１～４の画像学資料は図１６の通りであり、病巣は矢印または定規により示されている。図示されている通り、治療後に腫瘍病巣は顕著に縮小していた。

従って、本発明の増幅因子ＣＤ１９ＣＡＲおよび強化受容体で修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞は、様々な異なる固形腫瘍を効果的に制御、更には治療することができ、および、広範な潜在的応用スペクトルを有しているため、その効果は患者の腫瘍遺伝子変位量と関係せず、したがって、その適用はＴＭＢが高い患者に限定されない。

３．３ ＣＡＲのＳｃＴＩＬのインビボ増幅特性検証の促進
輸注後の種々の時点（３０分、２４時間、４日、７日、１０日、１４日、２８日、７１日および９１日）においてそれぞれ末梢血が、ＣＡＲ陽性細胞の数およびリンパ球の数の割合を検出するためのフローサイトメトリーを行うために採取され、患者１および２の末梢血ＣＡＲ陽性細胞（つまりＳｃＴＩＬ細胞）の割合を動的にモニタリングし、患者体内の数量絶対値を算出した。下記式により、末梢血中におけるＳｃＴＩＬ細胞の増幅する割合が算出された。

増幅倍数＝［リンパ球数濃度（個／Ｌ）×循環血液量（Ｌ）×ＳｃＴＩＬがリンパ球に占める割合］／輸注されたＳｃＴＩＬ細胞数

データによれば、細胞輸注後３０分における末梢血内ＣＡＲコピー数は輸注された有効細胞量を顕著に上回っており、細胞輸注後すぐに急速増殖を開始していることを提示している。従って、輸注細胞量を直接に上記計算式における基数とすることができ、輸注後３０分に採血して検出した末梢血ＣＡＲの数値はすでに増幅していないベースライン数値とすることができない。

そのうち、リンパ球数の濃度は血液標準検査により得ることができ、ＳｃＴＩＬがＴ細胞に占める割合は、フローサイトメトリーでＣＡＲ＋細胞がＣＤ３⁺細胞に占める割合を検出することにより得ることができる。総循環血液量は、細胞輸注治療前のキロ体重値に応じて換算し、男性は８０ｍｌ／キロ体重、女性は７５ｍｌ／キロ体重として総血液量（リットル／Ｌ）を算出した。

計算により、ＳｃＴＩＬの輸注後１４日目（Ｄ１４）に、患者１および２を無作為に抽出するとともに、ＳｃＴＩＬの末梢血中における増幅倍数を検出して計算したところ、それぞれ１４０倍および７５４倍であることが判明した。同時に、末梢血Ｂ細胞数は輸注前の８％～２５％（７５％～９２％の数量減少）まで大幅に減少していることが判明した。

観察期間内において患者に外因性の免疫グロブリンを投与しなかったとしても、すべての患者に免疫不全は出現しなかった。

従って、本発明における増幅因子ＣＤ１９ ＣＡＲ修飾を有するｃＴＩＬ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲによるＢ細胞の認識を介して体内での増幅を効果的に支援することができる。

３．４ ＳｃＴＩＬ二重識別性の検証
本発明におけるＳｃＴＩＬは、末梢血由来のＴＩＬ（ｃＴＩＬ）から採取され、これらのＴ細胞は、腫瘍を天然に認識する属性、つまりＴ細胞の第１の認識性を有している。また、ＳｃＴＩＬを基礎として、Ｂ細胞を標的とするＣＤ１９ ＣＡＲの設計を導入すると、Ｂ細胞のその標的ＣＤ１９に対する刺激により、ＳｃＴＩＬの体内における大幅な増幅を実現することができる。

無作為に患者１および患者２（表１および表２）を選出し、その末梢血循環腫瘍細胞数（ＣＴＣ）を動的にモニタリングし、輸注当日のベースライン値と輸注後２ヶ月以内における再検査の数値とを比較した。結果によれば、この両名の被験者は、ＳｃＴＩＬ細胞の輸注の２ヶ月後に、５ミリリットルごとの末梢血中におけるＣＴＣの数量が、下記表の通り、いずれも大幅に低下していた。

従って、本発明における増幅因子ＣＤ１９ ＣＡＲを有するｃＴＩＬ細胞は、ＣＤ１９ ＣＡＲを介してＢ細胞を識別して、ＴＩＬまたは腫瘍識別性Ｔ細胞の体内における大規模な増幅を引き起こすことが可能であるばかりではなく、細胞自身の腫瘍細胞に対する天然識別属性を介して、更に腫瘍患者体内の腫瘍細胞を識別して死滅させることが可能である。本発明における修飾された免疫細胞のこのような二重識別性は、上記臨床試験により成功裏に実証されている。

４．治療効果の証拠および分析
本実施例におけるＳｃＴＩＬ療法の疾患制御率は１００％であったが、天然ＴＩＬ細胞の輸注のみではこのような治療効果を得るには不十分であり、その理由は以下の通りである。

１）細胞の輸注数量が、このような治療効果を生み出すには不十分である。増幅後の末梢血中で検出されたＴ細胞数量（１０⁵～１０⁶／ｋｇ体重）を基礎として、過去の細胞治療に関する文献報告（例えば、Ｓｔｅｖｅｎ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの新抗原反応性Ｔ細胞またはＴＩＬ治療に関する報告において、輸注される細胞量は大体１０の１０～１１乗前後である）を結合して考慮すると、このような投与量は、通常の輸注量を下回っているため、固形腫瘍の治療時に本実施例において観察される治療効果を得るには不十分である。
２）ＳｃＴＩＬの起源はＴＩＬであり、通常は枯渇性Ｔ細胞であり、遺伝子組み換えを加えない場合、ＴＩＬの腫瘍殺傷作用は非常に限定的であり、このように低用量の枯渇性Ｔ細胞を輸注するだけでは、本実施例における治療効果を得るには不十分である。
従って、本実施例の治療効果データに基づき、本発明においては強化受容体をＰＤ－１⁺Ｔ細胞に応用することにより、これらの末梢血由来の免疫細胞の腫瘍抑制能力を増強することができることを側面から証明している。

５．総括
本実施例における複数項の実験結果を総合すると、本発明におけるＳｃＴＩＬ療法は以下の特徴を有していると総括することができる。

１）入手が容易な末梢血から簡単な選別を介してＰＤ－１⁺Ｔ細胞（ｃＴＩＬ）を得ることができるため、速やかに腫瘍識別性Ｔ細胞を得ることができ、調製周期が短縮される。
２）強化受容体は、スーパーｃＴＩＬ（ＳｃＴＩＬ）細胞を抑制状態から活性化状態に変化させることにより、腫瘍に対する殺傷効率を増強するように設計されている。
３）Ｂ細胞（ＣＤ１９）を標的とするＣＡＲの設計は、ＳｃＴＩＬ細胞をインビボで大幅に増幅することができるように設計されているため、極少量のＳｃＴＩＬ細胞を調製する必要があるだけであり、かつ、インビトロで大量に増幅させる必要はない。
４）細胞の調製過程は簡単かつ迅速であり、従来の新たな抗原治療技術における遺伝子配列の決定、スクリーニング、合成などの煩雑な工程が不要であるため、調製周期が大幅に短縮されるとともに、調製コストも大幅に削減される。
５）本発明のＳｃＴＩＬ療法は、異なる癌種、かつ、従来のマルチライン治療で効果がない固形腫瘍患者に対して、いずれも非常に良好な治療効果を示しており、潜在的かつ広範な応用側面を有している。
６）本発明のＳｃＴＩＬ療法は、理想的な安全性を有しており、ａ）重篤なオフターゲットまたは自己免疫病などの毒性副作用がなく、ｂ）軽度のサイトカインストーム（ＣＲＳ）のみが認められるが、ＣＡＲ－ＴによるＢ細胞血液腫瘍治療におけるＣＲＳレベルよりもはるかに低く、ｃ）正常なＢ細胞を殺傷してしまうが、その副作用はＣＡＲ－ＴでＢ細胞血液腫瘍を治療する場合よりも強くはない。これは、ＣＤ１９ ＣＡＲ－ＴによるＢ系血液悪性腫瘍の治療後、Ｂ細胞欠損状態が通常１８ヶ月以上持続し、一部の患者は終生にわたって代替免疫グロブリン療法を必要とするためである。対照的に、ＳｃＴＩＬによる治療後、Ｂ細胞はいずれも１～３ヶ月以内に回復するとともに、正常な生理的範囲の下限に近接または到達したレベルに安定したが、その期間、すべての被験者の免疫グロブリンはいずれも正常な生理的範囲の下限を下回っていないことが判明した。

実施例６．付帯した既往のＨＢＶ感染の残存ウイルスの除去
発明者は、ＳｃＴＩＬ細胞を使用して固形腫瘍患者を治療する臨床試験において、驚くべきことに、本発明の修飾された免疫細胞（ＳｃＴＩＬ）を使用して治療した後、患者のＢ型肝炎マーカーおよび肝酵素に異常が出現していることを観察した。このような観察結果に基づき、発明者は、実験を推測および設計して検証を行い、次いで、本発明の免疫細胞がＨＢＶ感染に関する疾患の治療に用いることができ、体内に残存するＨＢＶウイルスの治療に用いることができることを提起した。

１．ＳｃＴＩＬ細胞治療後に出現したＢ型肝炎マーカーと肝酵素の異常－性質と誘因
臨床試験においては、ＳｃＴＩＬ細胞を使用して治療した後、２例の群外患者で以下の現象が観察された。

ベースライン箇所で検出された肝機能およびＨＢＶマーカーは正常であり、細胞治療後に以下が出現した。
１）ＡＬＴ／ＡＳＴが正常範囲の上限を超えていた。
２）ＨＢｓＡｇが一過性に陽性となり、ＨＢｓＡｂおよび／またはその他の抗体はその後陽性に転じたが、ＨＢＶ ＤＮＡコピー数およびＨＢｃＡｂ ＩｇＭは一貫して陰性を保持していた。
３）被験者に主観的な急性肝炎の臨床的特徴はなかった（食欲不振、黄疸、肝腫大および圧痛を伴う肝腫大など）。
４）輸注に用いられた細胞製品はＨＢＶ検出が陰性であり、血漿免疫グロブリンは正常な生理レベルを保持していた。

上記現象を引き起こす原因を確定するため、複数項の実験を設計して実施することにより、以下のいくつかの問題に回答して、これらの現象を引き起こす誘因を分析した。

１）ＨＢＶによる細胞製品の汚染または外因性ＨＢＶ感染が存在するか否か？

細胞製品中にＨＢＶが含有されているか否か、および被験者の末梢血中にＨＢＶが存在するか否かを検出したところ、結果はいずれも陰性であったため、細胞製品はＨＢＶに汚染されておらず、被験者も臨床試験期間中に外因性ＨＢＶ感染を発症していないと認識することができる。

２）Ｂ細胞の減少に続発する免疫グロブリンの減少により、ＨＢＶウイルスの感受性が高くなり、二次感染に至ったか否か？

患者がＳｃＴＩＬの細胞治療を受けた後に末梢血リンパ球数が治療前のベースラインレベルよりも減少していることが観察されたが、血漿免疫グロブリン濃度は常に正常な生理範囲に保持されていたため、このような可能性は排除することができる。

３）肝機能異常は、細胞治療に関連する有害作用または自己免疫性肝損傷に由来するか否か？

ＳｃＴＩＬには化学毒性がなく、その分子作用機序により自己の健康な組織を損傷しないことが確保可能であるため、このような可能性は排除することができる。

２．患者の基本的状況
症例－１（ＷＪ）
女性、３６歳、胃印環細胞癌合併子宮頚転移２年。配列決定検出結果ＴＭＢ １．０３、新規抗原１６、ＨＬＡ全異型接合。２０１９年１１月１５日に単核細胞アフェレーシスを実施し、採取した細胞総数は５．５×１０Ｅ９／６２ｍｌであった。本実施例で使用したＳｃＴＩＬ細胞の調製は実施例５と実質的に同一であったが、Ｖ１Ｅ強化受容体に替えてＶ２Ｅ強化受容体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を用い、ＣＤ１９－ＣＡＲと共にＴＩＬ細胞をトランスフェクトしてＳｃＴＩＬを得た。治療細胞の調製：ＳｃＴＩＬ細胞７０ｍｌ×２バッグ＋３０ｍｌ×１バッグ、総有効細胞数２．５×１０Ｅ９。細胞は２回に分けて輸注し、日付はそれぞれ２０１９年１２月１３日（７０ｍｌ、有効細胞数１．０３×１０Ｅ９）および２０１９年１２月１８日（７０＋３０ｍｌ、有効細胞数１．４７×１０Ｅ９）であり、２回の輸注過程は順調であった。２回とも輸注完了の６時間後で体温の上昇が出現し、自ら寒気を訴え、頭痛、軽度の吐き気があったが、嘔吐やその他の特殊な不快感はなく、発熱はいずれも３日持続した後に正常レベルまで低下した。

Ｂ型肝炎関連指標の検出状況：
１）患者は２０１９／１１／１８（治療前）および２０１９／１２／１６（１回目の細胞輸注当日）の検査において肝酵素スペクトルおよびＢ型肝炎５項目にいずれも異常は認められなかった。
２）２回目輸注の２１日後（２０２０／０１／０９）の再検査において肝臓酵素スペクトルは正常であった。
３）２回目輸注の６４日後（２０２０／０２／２０）に改めて再検査したところ、肝酵素スペクトルの上昇が判明し、ＡＬＴ６５Ｕ／Ｌ（正常範囲０～５０ＵＬ）、ＡＳＴ６１Ｕ／Ｌ（正常範囲０～４０Ｕ／Ｌ）であり、当該時にＢ型肝炎５項目は検査しなかった。
４）２回目輸注の１１５日後（２０２０／０４／１５）に再検査したところ、肝機能酵素値は正常範囲まで低下していることが判明したが、Ｂ型肝炎の５項目はＢ型肝炎の表面抗体が陽性で、コア抗体が陽性（翌日の再検査は陰性）であったが、検査したＨＢＶ ＤＮＡコピー数の結果は陰性であった。細胞製品のＨＢＶ汚染を排除するため、当日に第三者検査機関に「細胞調製用アフェレースサンプル」および「完成品細胞試料」を送付したところ、Ｂ型肝炎ウイルス検査結果はすべて陰性であった。

以上の肝酵素とＢ型肝炎５項目の異常時間内に、患者は軽度の食欲不振があることを主訴としたが、吐き気、嘔吐、肝臓領域の腫れや痛みの不快感はなく、肝腫大、黄疸などの急性伝染性感染で常見される表現は出現しなかった。患者の肝機能およびＨＢＶの関連指標は図８Ａに示されている通りである。

症例－２（ＳＳＹ）
男性、４６歳、Ｓ状結腸癌合併腸周囲リンパ節転移。配列決定検出結果ＴＭＢ ２．３、新規抗原７、ＨＬＡ全異型接合。２０１９年１１月１５日に単核細胞球のアフェレーシスを実施し、採取した細胞総数は４．６６×１０Ｅ９／５４ｍｌ（調製完了後、現在の残存細胞量は１．８×１０Ｅ９）であり、治療細胞の調製：ＳｃＴＩＬ細胞５０ｍｌ×２バッグ、全有効細胞数９．９１×１０Ｅ８であった。細胞は２回に分けて輸注し、日付はそれぞれ２０２０／０１／０２および２０２０／０１／０６であり、２回の輸注量はそれぞれ４．９５５×１０Ｅ８／５０ｍｌであり、過程は順調であった。初回輸注後７時間で寒気が出現し、体温が最高３９．６°Ｃまで上昇し、内服した撲熱息痛＋物理的降温後に体温は正常まで低下した。発熱は３日間続き、脱力感以外に他の症状がなく、その後体温は自然に正常レベルまで低下した。２回目の輸注後に明らかな体温変化や不快感は見られなかった。

Ｂ型肝炎関連指標の検出情報：
１）患者は２０１９／１２／０９（治療前）、２０２０／０１／０６（２回目の細胞輸注当日）および２０２０／０１／１６（２回目の細胞輸注後１０日目）の計３回の検査においていずれも肝酵素スペクトルに異常を認められず、治療前のＢ型肝炎５項目は陰性であった。
２）２回目輸注の７７日後（２０２０／０３／２３）の再検査で肝酵素スペクトルの上昇が判明し、ＡＬＴ １６３Ｕ／Ｌ（正常範囲０～５０ＵＬ）、ＡＳＴ １１３Ｕ／Ｌ（正常範囲０～４０Ｕ／Ｌ）であり、当該時にＢ型肝炎５項目は検査しなかった。
３）２回目輸注の８５日後（２０２０／０４／０１）の再検査においては、ＡＬＴ７４３Ｕ／Ｌ（正常範囲０～５０Ｕ／Ｌ）、ＡＳＴ２４３Ｕ／Ｌ（正常範囲０～４０Ｕ／Ｌ）であり、Ｂ型肝炎５項目は、Ｂ型肝炎表面抗原は陽性、コア抗体は陽性であったが、コア抗体ＩｇＭは陰性であった。
４）２回目輸注の９３日後（２０２０／０４／０９）の再検査においては、ＡＬＴ ３０１Ｕ／Ｌ（正常範囲０～５０Ｕ／Ｌ）、ＡＳＴ ７６Ｕ／Ｌ（正常範囲０～４０Ｕ／Ｌ）であり、Ｂ型肝炎５項目は、Ｂ型肝炎表面抗原が陰性に転じていたが、コア抗体は陽性のままであった。
５）２回目輸注の１３２日後（２０２０／０４／０９）に再検査したところ、ＡＬＴおよびＡＳＴはいずれも正常範囲まで低下しており、Ｂ型肝炎５項目を検査しなかった。

以上の肝酵素およびＢ型肝炎５項目の異常時間内に、患者は軽度の食欲不振があることを主訴としたが、吐き気、嘔吐、肝臓領域の腫れや痛みの不快感はなく、肝腫大、黄疸などの急性伝染性感染で常見される表現は出現しなかった。患者の肝機能およびＨＢＶの関連指標は図８Ｂに示されている通りである。

対照症例－真のＨＢＶ感染（ＣＹ）
女性、２６歳、結腸癌術後に多発性肺転移を伴い、２０１９年５月９日にＳｃＴＩＬ細胞（有効細胞量６．４×１０Ｅ８）の輸注治療を受けた。患者は２０１９年８月１日にＢ型肝炎マーカーを検出し、結果は陰性であったが、２０１９年９月１３日に血源性ＨＢＶ接触の疑いが高い事案があり、２０１９年１０月１２日にはＢ型肝炎表面抗原とｅ抗原とが陽性、抗体が陰性であり、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡコピー数が陽性であることが検出された。肝臓保護治療を行った後、２０１９年１１月１２日に再検査した結果、Ｂ型肝炎抗原およびＢ型肝炎ウイルスＤＮＡコピー数はいずれも陰性に転じており、Ｂ型肝炎表面抗体およびコア抗体は陽性に転じていた。患者の肝機能およびＨＢＶの関連指標は図８Ｃに示されている通りである。

３．Ｂ型肝炎マーカーと肝酵素異常および細胞治療との相関機序
以上に記載の２例の患者の特徴は、免疫細胞の抗腫瘍治療効果を観察すると同時に、細胞の輸注後６～８週間に肝臓酵素（ＡＬＴ、ＡＳＴ）の上昇が検出され、一過性のＨＢｓＡｇ（表面抗原）が陽性に転じ（１週間持続後に陰性に転じた）、続いてＨＢｓＡｂ／ＨＢｃＡｂ（表面抗体／コア抗体）が陰性から陽性に転じ、肝臓酵素が正常レベルに低下している点にある。この期間、末梢血は細胞製品のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡコピー数およびＨＢｃＡｂ ＩｇＭの検出がいずれも陰性であり、血漿免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）はいずれも正常範囲内に保持されていた。

発明者は、このような現象は、従来のＨＢＶ感染後に少量のウイルス成分が肝細胞内に存在し（図９）、そのウイルスＤＮＡの複製／アセンブリ／エクソサイトーシスプログラムが宿主により増強された免疫機能により沈静化されることに関連していると認識している。ＨＢＶ感染後、肝細胞ＭＨＣ機序に提示されたＨＢＶタンパク質は免疫リンパ球により識別可能であるが、免疫リンパ球の標的細胞に対する攻撃はウイルス感染肝細胞の免疫殺傷逃避性機序（肝細胞のＰＤ－Ｌ１発現）の抑制を受け、それによりＨＢＶ成分を含む肝細胞の免疫性破壊およびＨＢＶ除去が阻止されるとともに（図１０）、生体の免疫機能が顕著に低下した際にＢ型肝炎感染再発のリスクが発生する。

本願の実施例において、採取並びにＳｃＴＩＬの調製に用いられる単核細胞は、ＰＤ－１抗体磁気ビーズを使用して選別されるとともに、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１⁺）リンパ球を得ることにより調製される。上記の通り、これらのＰＤ－１⁺細胞中には、ＨＢＶ提示膜タンパク質を特異的に認識するが、標的細胞に対する殺傷活性が肝細胞が発現するＰＤ－Ｌ１により阻害されるＣＴＬサブセットが含まれている。これらの細胞は、レンチウイルスを介してトランスフェクションされて、強化受容体を担持しているため、その細胞殺傷能力が再活性化している。再輸注後、これらの修飾された細胞（ＳｃＴＩＬ）は、特異的ＴＣＲを介してＨＢＶタンパク質を発現する標的細胞を認識し、かつ、細胞膜強化因子であるＰＤ－１の細胞外ドメインを介して標的細胞反応性高発現ＰＤ－Ｌ１と相互に結合して、ＳｃＴＩＬの更なる活性化および標的細胞に対する強化された殺傷効果を逆に誘発する。ＣＴＬの攻撃を受けて崩壊した肝細胞は、ＨＢＶ成分を末梢血流に放出させるとともに、体液性免疫および抗体価上昇を誘発し、一過性ＨＢｓＡｇの陽性および二次抗体の陽性として表現される（図１１）。以前のＢ型肝炎ウイルス感染時には、宿主細胞内おいてすでにアセンブリされた活性ウイルス粒子は、インターフェロンによるウイルス複製の阻害の影響を受けず、宿主細胞内に滞留することなく、能動的なエクソサイトーシス機序を介して血中に放出されるため、肝細胞崩壊時に活性ＨＢＶウイルス粒子が血中に放出されるとともに、感染の播種が発生することはない。この推測は、ＨＢＶ ＤＮＡおよびＨＢｃＡｂ ＩｇＭ陰性検出結果により実証されている。

以上をまとめると、発明者は、実験結果に基づき、ＳｃＴＩＬは特異的抗原認識能力を有する異質性Ｔリンパ球サブセットの組合せとして、抗悪性固形腫瘍効果を発揮すると同時に、過去の感染後に潜在的に一部の標的細胞内に残存していたウイルス成分を除去することにより、過去のウイルス感染が将来の免疫力低下時に再発する潜在的リスクを除去するとの作用機序を推測している。

従って、本発明の修飾された免疫細胞は、腫瘍患者の腫瘍疾患を治療すると同時に、体内のウイルスを排除し、ウイルス関連疾患の再発を防止することができる。

４．用途
上記実験における発見、およびＳｃＴＩＬ細胞治療後に出現した偽ＨＢＶ感染の臨床的意味に基づき、本発明のＳｃＴＩＬ細胞治療に関する以下の場面および用途が提出されている。

４．１ 細胞治療後における偽ＨＢＶ感染と真のＨＢＶ感染（対照例参照）との鑑別診断
ＳｃＴＩＬ細胞治療後における偽ＨＢＶ感染の特徴：
（１）ＨＢＶ ＤＮＡコピー数が陽性の閾値を下回っていた。
（２）肝臓酵素スペクトルとＨＢＶ抗原異常が先行して出現し、１～２ヶ月持続した後に正常に回復した。
（３）ＨＢＶ抗体が比較的遅延して出現しているとともに、長期間にわたり陽性を維持していた。

真のＨＢＶ感染の特徴：
（１）ＨＢＶ ＤＮＡコピー数が上昇しているとともに、抗原陽性を示し、高い力価を呈していた。
（２）肝酵素異常は、通常、ＨＢＶ抗原の定量異常と正に相関を呈している。

４．２ ＳｃＴＩＬ療法を使用した残存ＨＢＶウイルス成分の除去
既往のＨＢＶ感染が治癒した後、一部の肝細胞内には複製過程中のＨＢＶ成分が残存しており、生体免疫力が低下した際に感染の再発を引き起こす可能性がある。

末梢血ＰＤ－１陽性リンパ球中には特定のサブセットが含まれており、肝細胞膜に提示されたＨＢＶ膜タンパク質成分を特異的に認識して発現するが、二次発現ＰＤ－Ｌ１により抑制されるため、残存ウイルス成分の標的細胞を殺傷することはできない。

ＳｃＴＩＬの強化受容体分子は、ＰＤ－Ｌ１が引き起こす免疫逃避を克服することができ、体内に残存しているＨＢＶウイルス成分を一掃して、将来の感染再発のリスクを排除している。

実施例７．強化受容体で修飾されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞によるＨＰＶウイルス感染に関連する疾患の治療
実施例５に記載されている方法を使用し、ＨＰＶ陽性腫瘍患者からの末梢血試料に基づき、ＰＤ－１⁺Ｔ細胞を選別するとともに、強化受容体および任意選択のＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＳｃＴＩＬ細胞を調製した。調製したＳｃＴＩＬ細胞を患者に輸注して、腫瘍の治療に用いるとともに、ＨＰＶ感染を排除した。

Claims (19)

1. 修飾された免疫細胞であって、前記免疫細胞が末梢血由来のＰＤ－１陽性Ｔ（ＰＤ－１⁺Ｔ）細胞である修飾された免疫細胞。
2. 前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来である請求項１記載の修飾された免疫細胞。
3. 前記修飾が、遺伝子組み換えまたは細胞表面タンパク質修飾を含む請求項１または２に記載の修飾された免疫細胞。
4. 前記修飾が、前記ＰＤ－１⁺Ｔ細胞中でのＰＤ－１発現の欠失もしくは低下、または、ＰＤ－１の機能の阻害をもたらす請求項３記載の修飾された免疫細胞。
5. 前記ＰＤ－１発現の前記欠失もしくは低下が、ＰＤ－１遺伝子のノックアウトまたはノックダウンによって行われる請求項４記載の修飾された免疫細胞。
6. 前記ＰＤ－１機能の前記阻害が、前記免疫細胞とＰＤ－１抗体とをインビボまたはインビトロで接触させることによって行われ、前記接触により、前記ＰＤ－１抗体が前記免疫細胞の表面のＰＤ－１に結合する請求項４記載の修飾された免疫細胞。
7. 前記修飾された免疫細胞が、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含む強化受容体（ＥＲ）を含み、前記ＥＣＤは、前記免疫細胞の標的細胞に結合することができ、および、前記ＩＣＤは、免疫細胞活性化シグナルを誘発する共刺激分子またはそのフラグメントを含む請求項１～６のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞。
8. 前記ＥＣＤが、前記標的細胞の膜タンパク質の受容体、リガンドおよび抗体、または、前記標的細胞の膜タンパク質の受容体、リガンドおよび抗体の一部またはフラグメントであって、前記標的細胞に結合する機能を有する一部またはフラグメントを含む請求項７記載の修飾された免疫細胞。
9. 前記ＥＣＤが、ＰＤ１の部分配列または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、好適には抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖを含み、および／または、前記ＩＣＤが、ＣＤ２８由来である請求項８記載の修飾された免疫細胞。
10. 被験体中の標的細胞を標的化する能力を有する請求項１～９のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞。
11. 前記標的細胞が、腫瘍細胞、癌細胞およびウイルス感染細胞からなる群より選択される１または複数である請求項１０記載の修飾された免疫細胞。
12. 前記ウイルスが、肝炎ウイルス、好適にはＢ型肝炎ウイルス、またはヒトパピローマウイルスである請求項１１記載の修飾された免疫細胞。
13. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を更に発現し、前記ＣＡＲが、前記免疫細胞の天然ＴＣＲによって認識される抗原とは異なる抗原である別の抗原、好適にはＣＤ１９を特異的に認識する請求項１～１２のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞。
14. 死滅スイッチなどの免疫細胞死を制御するその他の修飾を更に含む請求項１～１３のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞。
15. 請求項１～１４のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞を含む細胞集団。
16. 治療性免疫細胞を調製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）末梢血からＰＤ－１⁺のＴ細胞を選別することと、
    （ｂ）前記工程（ａ）において選別されたＰＤ－１⁺Ｔ細胞に、以下の処理
    ｉ．ＰＤ－１の発現をノックアウトまたはノックダウンする、
    ii．ＰＤ－１抗体と混合する、
    iii．強化受容体（ＥＲ）を発現させる、
    iv．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる、
    ｖ．死滅スイッチを発現させる、
    のうちの１または複数を行うことと
    を含む治療性免疫細胞を調製する方法。
17. 請求項１９記載の方法により得られる修飾された免疫細胞。
18. 請求項１～１４または１７のいずれか１項に記載の免疫細胞または請求項１５記載の細胞集団を含む組成物。
19. （１）腫瘍の処置、および／または、
    （２）ウイルス感染に関連する疾患もしくは症状の処置もしくは予防、または、ウイルス感染に関連する疾患もしくは症状の再発の防止
    における使用のための請求項１８記載の組成物。

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