JP2018512154A - キメラタンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＦＡＳエンドドメインに融合された複数回貫通型膜貫通タンパク質を含むキメラタンパク質であって、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質が細胞外リガンドに結合して、前記ＦＡＳエンドドメインの活性化をもたらすキメラタンパク質を提供する。キメラタンパク質は、自殺遺伝子として有用である。本発明はまた、養子Ｔ細胞免疫療手法において有用なかかるキメラタンパク質を含む細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。前記方法は、癌を処置するためのものであり得る。

Description

発明の分野
本発明は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用なキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質は、自殺遺伝子として作用して、キメラタンパク質を発現する細胞を排除することを可能にし得る。本発明はまた、かかるキメラタンパク質をコードする核酸、かかる核酸を含む細胞、およびその治療的使用を提供する。

発明の背景
養子免疫療法は、確立された発展的治療手法である。同種異系造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の状況では、血液悪性腫瘍の再発を処置するために、ドナーリンパ球注入（ＤＬＩ）が頻繁に行われる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、転移性メラノーマの処置に有効である。Ｔ細胞の遺伝子操作は、Ｔ細胞療法の範囲および効力を大きく増加させる：Ｔ細胞受容体移入は、細胞内癌抗原の標的化を可能にする一方、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、表面癌または系統特異的抗原の標的化を可能にする。臨床的応答は、両方の手法で観察されており、多数のさらなる試験が進行中である。

養子免疫療法後に、急性有害事象が起こり得る。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は、ＤＬＩの一般的かつ深刻な合併症である。操作されたＴ細胞の投与はまた、毒性をもたらした。例えば、メラノーマ抗原に対する天然Ｔ細胞受容体移入研究では、オンターゲットオフ腫瘍（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ）毒性が報告されている；腎細胞癌腫抗原炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に再指向されたＴ細胞は、予想外の肝毒性をもたらした。ＣＤ１９ ＣＡＲ治療後には、免疫活性化症候群が報告されている。最後に、ベクター誘導性挿入突然変異誘発は、リンパ増殖性障害の理論上のリスクをもたらす。これらの毒性の発生率および重症度は、予測不可能である。さらに、治療用タンパク質または小分子（これらの有害事象は、通常、治療薬の半減期を減少させる）とは対照的に、Ｔ細胞は生着および複製し、増大した劇症性な毒性をもたらす可能性がある。
自殺遺伝子

自殺遺伝子は、許容され得ない有毒性に面して、養子移入されたＴ細胞の選択的な破壊を可能にする遺伝的にコードされた機構である。臨床研究では、２つの自殺遺伝子が試験されている：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）および誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）。

Ｔ細胞におけるＨＳＶ−ＴＫの発現は、ガンシクロビルに対する感受性を付与する。ＨＳＶ−ＴＫは非常に有効な自殺遺伝子であるが、免疫原性が、ハプロタイプ一致ＨＳＣＴなどの深刻な免疫抑制の臨床状況への適用を限定する。さらに、それは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の処置のためのガンシクロビルの使用を妨げる。

ｉＣａｓｐ９は、実験的小分子化学誘導剤またはダイマー化剤（ｄｉｍｅｒｉｚｅｒ）（ＣＩＤ）によって活性化される。このＣＩＤは実験薬物であり、野生型ＦＫＢＰ１２と相互作用しないので、生物学的に不活性であると考えられる。しかしながら、この薬剤を用いた臨床経験は、非常に少数の患者に限定されている（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ，Ａら、（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５，１６７３−１６８３；およびＩｕｌｉｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄら、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１，８７０−８７９）。それは、比較的大きな極性分子であり、血液脳関門を通過する可能性が低い。ＦＡＳのＣＩＤ活性化に基づく自殺遺伝子が記載されている（Ａｍａｒａら、（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０，２６５１−２６５５）。これも活性化をこのＣＩＤに依存しており、アポトーシスカスケードを直接活性化しないので、（ＦＡＳ耐性を介した）回避が可能である。

突然変異型ヒトチミジル酸キナーゼ（ｍＴＭＰＫ）は、細胞をＡＺＴに対して感受性にする。最近、ＨＳＶ−ＴＫ、ｉＣａｓｐ９は、ｍＴＭＰＫと比較された（Ｍａｒｉｎら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，３７６−３８６）。ｍＴＭＰＫは、有用であるほど十分に活性ではない。

他の自殺遺伝子が提案されており、例えば、全長ＣＤ２０は、Ｔ細胞上において発現された場合、Ｔ細胞を治療用抗ＣＤ２０抗体リツキシマブによる溶解に対して感受性にし得る（Ｉｎｔｒｏｎａ，Ｍら、（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，６１１−６２０）。抗体認識に関するこのテーマでは、他の自殺遺伝子も記載されており、ＲＱＲ８は、Ｔ細胞をＣＤ２０に対して感受性にするが、全長ＣＤ２０分子よりもコンパクトである（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｂら、（２０１４）Ｂｌｏｏｄ ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０１−５４５０２０）；先端切除バージョンのＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）は、細胞を抗ＥＧＦＲ ｍＡｂによる溶解に対して感受性にする（Ｗａｎｇ，Ｘら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８，１２５５−１２６３）；細胞表面上において発現されたｍｙｃエピトープタグは、細胞を抗ｍｙｃ抗体による溶解に対して感受性にする（Ｋｉｅｂａｃｋら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，６２３−６２８）。これらの抗体依存性手法の主な限界は、作用する高い局所濃度における治療用抗体のバイオアベイラビリティへの依存性である。例えば、溶解抗体は、巨大病変に対して特に有効ではないことが公知であり、抗体に基づく自殺遺伝子の限界は、高い抗体濃度に達しない場所に常在する細胞が逃れることである。
したがって、上記欠点を伴わない代替的な自殺遺伝子が必要である。

Ｄｉ Ｓｔａｓｉ，Ａら、（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５，１６７３−１６８３ Ｉｕｌｉｕｃｃｉ，Ｊ．Ｄら、（２００１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１，８７０−８７９ Ａｍａｒａら、（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１０，２６５１−２６５５ Ｍａｒｉｎら、（２０１２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３，３７６−３８６ Ｉｎｔｒｏｎａ，Ｍら、（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１，６１１−６２０ Ｐｈｉｌｉｐ，Ｂら、（２０１４）Ｂｌｏｏｄ ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１４−０１−５４５０２０ Ｗａｎｇ，Ｘら、（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８，１２５５−１２６３ Ｋｉｅｂａｃｋら、（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，６２３−６２８

リツキシマブおよびオファツムマブによるＣＤ２０の先端切除の認識。ＣＤ２０のアミノおよびカルボキシ末端切除を行うことによって、アミノ末端またはカルボキシ末端のエンドドメインを先端切除した。これらをｅＧＦＰと共に発現させ、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。

ａ）ＲＱＲ８およびＲＱＲ８−ＦＡＳ、ならびにｂ）ｄＣＤ２０−ＦＡＳを示すカートゥーン。

ＲＱＲ８およびＲＱＲ８−ＦＡＳおよびｄＣＤ２０−ＦＡＳの機能の比較。異なる試験構築物における発現時およびオファツムマブによる活性化時のアポトーシス（発現細胞の割合として）が示されている。

リツキシマブに対するｄＣＤ２０−ＦＡＳの感度および経時変化。ｅＧＦＰと共発現させたｄＣＤ２０−ＦＡＳをジャーカットＴ細胞に形質導入した。異なる濃度のリツキシマブにおけるリツキシマブ誘導性の直接的な殺傷が経時的に示されている。

リツキシマブに対するｄＣＤ２０−ＦＡＳの広範囲の用量反応曲線。ｄＣＤ２０−ＦＡＳを形質導入したジャーカットＴ細胞であって、ｅＧＦＰを共発現するジャーカットＴ細胞を、漸増希釈のリツキシマブと共に４８時間培養した。異なる濃度のリツキシマブに対して、直接的な殺傷が示されている。

オファツムマブに対するｄＣＤ２０−ＦＡＳの感度および経時変化。ｅＧＦＰと共発現させたｄＣＤ２０−ＦＡＳをジャーカットＴ細胞に形質導入した。異なる濃度のオファツムマブにおけるオファツムマブ誘導性の直接的な殺傷が経時的に示されている。

オファツムマブに対するｄＣＤ２０−ＦＡＳの広範囲の用量反応曲線。ｄＣＤ２０−ＦＡＳを形質導入したジャーカットＴ細胞であって、ｅＧＦＰを共発現するジャーカットＴ細胞を、漸増希釈のオファツムマブと共に４８時間培養した。異なる濃度のオファツムマブに対して、直接的な殺傷が示されている。

ＣＤ２０のＰ１７２Ｗ突然変異は、リツキシマブ耐性をもたらす

ｄＣＤ２０−ＦＡＳおよびｄＣＤ２０_{Ｐ１７２Ｗ}−ＦＡＳによる初代ヒトＴ細胞の直接的な殺傷およびＣＤＣ媒介性殺傷。

オファツムマブによる初代Ｔ細胞のｄＣＤ２０−ＦＡＳによる直接的な殺傷の例。

本発明者らは、抗体などの細胞外リガンドで誘導可能な新たな自殺遺伝子であって、低い基本毒性および高い誘導毒性を有する新たな自殺遺伝子を開発した。自殺遺伝子は、ＦＡＳ活性化、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって自殺を引き起こし得るという点で「三重機能」である。

したがって、第１の態様において、ＦＡＳエンドドメインに融合された複数回貫通型膜貫通タンパク質を含むキメラタンパク質であって、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質が細胞外リガンドに結合して、前記ＦＡＳエンドドメインの活性化をもたらすキメラタンパク質が提供される。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、ＣＤ２０、またはアミノ末端エンドドメインもしくはカルボキシ末端エンドドメインを欠くその先端切除バージョンであり得るか、またはこれを含み得る。

細胞外リガンドは、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｕｍａｂ）、オファツムマブまたはベルツズマブなどの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり得る。細胞外リガンドは、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体由来の抗原結合部分（例えば、ＶＨ／ＶＬまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）配列）を含み得る。

キメラタンパク質は、アミノ末端エンドドメインを欠く先端切除バージョンのＣＤ２０のカルボキシ末端に融合されたＦＡＳエンドドメインを含み得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、その結合親和性または特異性を増加させるための１つまたはそれより多い突然変異を含み得る。複数回貫通型膜貫通タンパク質がＣＤ２０もしくはその一部であるか、またはＣＤ２０もしくはその一部を含む場合、それがリツキシマブではなくオファツムマブに結合するように、それは、１つまたはそれより多い突然変異を含み得る。例えば、ＣＤ２０は、配列番号３として示されている全長配列を基準にして、突然変異Ｐ１７２Ｗを含み得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質がＣＤ２０もしくはその一部であるか、またはＣＤ２０もしくはその一部を含む場合、それは、配列番号３、４、５または６として示されている配列を含み得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、ＣＤ２０などの内因性リガンド結合ドメインを含み得るか、またはそれは、細胞外リガンドに結合する異種リガンド結合ドメインを含み得る。

ＦＡＳエンドドメインは、配列番号２０として示されている配列を含み得る。

第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラタンパク質をコードする核酸配列を提供する。

また、１つまたはそれより多い本発明の第２の態様による核酸配列と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含む核酸構築物が提供される。

第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸配列または上記に定義される核酸構築物を含むベクターを提供する。

ベクターはまた、目的のヌクレオチドを含み得る。ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、標的細胞が、本発明の第１の態様によるキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、目的のヌクレオチドは、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし得る。

第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を発現する細胞を提供する。

細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または幹細胞であり得る。

第５の態様において、本発明の第４の態様による細胞を作製するための方法であって、本発明の第３の態様によるベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む方法が提供される。

第６の態様において、本発明の第４の態様による細胞を排除するための方法であって、複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合する細胞外リガンドに前記細胞を曝露する工程を含む方法が提供される。

本発明の第６の態様による方法では、細胞外リガンドの結合は、以下：
・細胞のアポトーシスをもたらすＦＡＳエンドドメインの活性化；
・補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす複数のキメラタンパク質の複数回貫通型膜貫通タンパク質の架橋；および
・抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）（この場合、細胞外リガンドは、抗体である）
の１つ、２つまたは３つすべてを引き起こし得る。

細胞外リガンドは、リツキシマブ、オファツムマブまたはベルツズマブなどの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり得る。

第７の態様において、被験体における疾患を予防または処置するための方法であって、本発明の第４の態様による細胞を前記被験体に投与する工程を含む方法が提供される。

前記方法は、以下：
（ｉ）本発明の第３の態様によるベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクトされた細胞を患者に投与する工程
を含み得る。

前記方法は、癌を処置するためのものであり得る。

第８の態様において、本発明は、被験体への本発明の第４の態様による細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫応答を予防および／または処置するための方法であって、複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合することができる細胞外リガンドを前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

前記病理学的免疫応答は、例えば、移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｔｕｍｏｕｒ）毒性；免疫活性化症候群；またはリンパ増殖性障害であり得る。

本発明の第７の態様による被験体における疾患を処置するための方法は、以下：
（ｉ）本発明の第４の態様による細胞を前記被験体に投与する工程；
（ｉｉ）病理学的免疫応答の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および
（ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫応答を発症するまたは発症した兆候を示す場合、複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合することができる細胞外リガンドを前記被験体に投与する工程
を含み得る。

造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するための本発明の第４の態様による細胞も提供される。

被験体への本発明の第４の態様による細胞の投与によって引き起こされる病理学的免疫応答の予防または処置に使用するための抗ＣＤ２０抗体も提供される。

（詳細な説明）
キメラタンパク質
本発明は、自殺遺伝子として作用するキメラタンパク質に関する。キメラタンパク質を発現する細胞は、細胞外リガンドの投与によって、インビボまたはインビトロで排除され得る。

キメラタンパク質は、ＦＡＳエンドドメインに融合された複数回貫通型膜貫通タンパク質を含む。

キメラタンパク質は、配列番号１もしくは配列番号２として示されている配列またはその変異型を含み得る。
配列番号１
配列番号２

変異型配列は、配列が有効な自殺遺伝子を提供する限り、配列番号１または２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。すなわち、配列が、細胞外リガンドに結合して、ＦＡＳエンドドメインの活性化をもたらす能力を保持する限り。
複数回貫通型膜貫通タンパク質

膜貫通タンパク質は、それが永久に付着している生体膜の全体を貫通するタンパク質である。すなわち、膜貫通タンパク質は、膜の一方の側から膜の他方の側に貫通する。

膜貫通タンパク質は、一般に、Ｎ末端およびＣ末端ドメインの位置に関して、トポロジーによって分類される。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型は、１回通過分子である一方、ＩＶ型は、複数回通過分子に関する。本発明のキメラタンパク質は、一連の細胞外および／または細胞内ループによって連結された複数の膜貫通α−ヘリックスを含むＩＶ型膜貫通タンパク質を含む。

ＩＶ型膜貫通タンパク質は、Ｎ末端ドメインが細胞質ゾルにターゲティングされるＩＶ−Ａ；およびＮ末端ドメインが合成中に小胞体の内腔にターゲティングされるＩＶ−Ｂに細分化される。膜貫通タンパク質が細胞表面で発現されると、ＩＶ−Ａ型膜貫通タンパク質は細胞内Ｎ末端ドメインを有する一方、ＩＶ−Ｂ型膜貫通タンパク質は細胞外Ｎ末端ドメインを有する。

キメラタンパク質は、ＩＶ−Ａ型またはＩＶ−Ｂ型複数回貫通型膜貫通タンパク質を含み得る。ＦＡＳエンドドメインは、膜貫通タンパク質のＮ末端ドメインまたはＣ末端ドメイン（これらはいずれも、細胞内に位置する）に融合され得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、膜を貫通する２つまたはそれより多い別個の配列領域（例えば、αヘリックス）を含み得る。複数回貫通膜タンパク質は、例えば、２〜８つ、３〜６つまたは約４つの膜貫通部分を含み得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、４つの膜貫通部分および２つの細胞外ループを含み得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、細胞外リガンドに結合するリガンド結合ドメインを含む。リガンド結合ドメインは、形質膜の細胞外側に位置する。リガンド結合ドメインは、複数回貫通型膜貫通タンパク質の必須部分、例えばＣＤ２０のリツキシマブ結合エピトープであり得るか、またはそれは、タンパク質操作によって導入され得る。

リガンド結合ドメインは、複数回貫通型膜貫通タンパク質の細胞外ループ（すなわち、２つの疎水性αヘリックス膜貫通部分間の親水性ループ）中にあり得るか、またはこの中に挿入され得る。あるいは、リガンド結合ドメインは、それが細胞質ゾル側ではなく形質膜の細胞外側に位置する限り、複数回貫通型膜貫通タンパク質のアミノ−またはカルボキシル末端細胞外部分の末端部（すなわち、複数回貫通型膜貫通タンパク質の親水性末端部分の一方）であり得るか、またはこの中に挿入され得るか、またはこれに連結され得る。

リガンド結合ドメインは、組換えタンパク質操作によって複数回貫通型膜貫通タンパク質に融合され得るか、またはこれに導入され得る。

細胞外リガンドは、天然に存在しないリガンド、例えば、複数回貫通型膜貫通タンパク質のリガンド結合ドメインに対して生じた抗体であり得る。

複数回貫通型膜貫通タンパク質のリガンド結合ドメインは、細胞外リガンドに結合することができ、その結合がＦＡＳエンドドメインの活性化を引き起こす。

自殺遺伝子を発現する細胞の無制御な排除を回避するために、複数回貫通タンパク質は内因性リガンドを有していなくてもよいし、またはそれがいかなる天然リガンド（複数も可）にも結合する能力をもはや有しないように改変されていてもよい。
ＣＤ２０

ＣＤ２０は、複数回貫通膜タンパク質である。ＣＤ２０は、最初および最後を除いて、Ｂ細胞発生のすべての段階で発現される：それは、後期プロＢ細胞から記憶細胞まで存在するが、初期プロＢ細胞または形質芽細胞および形質細胞のいずれにも存在しない。それは、ほぼすべてのＢ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病およびＢ細胞慢性リンパ性白血病で発現される。ＣＤ２０は、２つの細胞外ループ：ジスルフィド結合によって拘束されたマイナーループおよびメジャーループを有する。それは、アミノ末端およびカルボキシ末端エンドドメインを有する。ＣＤ２０は、特定の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体に曝露されると、脂質ラフトに凝集する。凝集は、カルボキシ末端エンドドメインに依存する。

全長ヒトＣＤ２０の配列は、配列番号３として示される。
配列番号３

Ａ１７０およびＰ１７２の位置は、太字下線で示されている。

本発明者らは、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでＣＤ２０を切除し、細胞表面で発現される能力、およびリツキシマブまたはオファツムマブなどの抗ＣＤ２０抗体によって認識される能力を保持することが可能であることを示した。

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、アミノ末端エンドドメインを欠く先端切除バージョンのＣＤ２０を含み得る。先端切除ＣＤ２０は、アミノ末端から最大４１アミノ酸（それを含む）を欠き得る。例えば、先端切除ＣＤ２０は、アミノ末端から１〜４１、５〜３５または１０〜２０アミノ酸を欠き得る。

先端切除ＣＤ２０は、配列番号４として示されている配列またはその変異型を含み得る。
配列番号４（ｄＣＤ２０）

複数回貫通型膜貫通タンパク質は、カルボキシ末端エンドドメインを欠く先端切除バージョンのＣＤ２０を含み得る。先端切除ＣＤ２０は、カルボキシ末端から最大６１アミノ酸（それを含む）を欠き得る。例えば、先端切除ＣＤ２０は、カルボキシ末端から１〜６１、５〜５５または１０〜２０アミノ酸を欠き得る。

先端切除ＣＤ２０は、配列番号５として示されている配列またはその変異型を含み得る。
配列番号５（ＣＤ２０ｄ）

ＣＤ２０は、結合親和性を増加させるように、または細胞外リガンドに対する結合の選択性を増加させるように操作され得る。例えば、ＣＤ２０は、上記配列番号３として示されている全長ＣＤ２０配列のナンバリングを基準にして位置Ａ１７０および／またはＰ１７２（配列番号３において太字下線で示されている）において、突然変異を含み得る。突然変異は、例えば、付加、欠失または置換であり得る。

特に、ＣＤ２０配列は、変異型ＣＤ２０がリツキシマブではなくオファツムマブに結合するように、突然変異Ｐ１７２Ｗを含み得る。

キメラタンパク質は、アミノ末端エンドドメインを欠く先端切除バージョンのＣＤ２０を含み得、先端切除バージョンのＣＤ２０は、配列番号３に示されている全長ＣＤ２０の位置ナンバリングを基準にして突然変異Ｐ１７２Ｗを含む。この配列は、以下に配列番号６として示されている。
配列番号６（ｄＣＤ２０_{Ｐ１７２Ｗ}）

リガンド結合ドメインは、リツキシマブなどの抗ＣＤ２０ ｍＡｂに結合し得る。

リガンド結合ドメインは、配列番号７として示されている配列を有するＣＤ２０由来のリツキシマブ結合エピトープ配列を含み得る。

Ｐｅｒｏｓａら（２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １７９：７９６７−７９７４）には、抗ＣＤ２０ ｍＡｂリツキシマブによって認識される抗原モチーフを有するが、モチーフ周辺のアミノ酸が異なる一連の７ｍｅｒのシステイン拘束環状ペプチドが記載されている。以下の表に示されているように、全部で１１個のペプチドが記載されていた：

また、Ｌｉら（２００６ Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３９：１３６−４３）には、配列：
を含むリツキシマブのミメトープが記載されている。

本発明のキメラタンパク質は、配列番号７〜１９のいずれかに示されているアミノ酸配列を有するリツキシマブ結合エピトープ、またはリツキシマブ結合活性を保持するその変異型を含み得る。

変異型リツキシマブ結合エピトープは、配列番号７〜１９のいずれかに示されているアミノ酸配列をベースとするが、エピトープがリツキシマブ結合活性を保持する限り、１つまたはそれより多いアミノ酸突然変異、例えばアミノ酸挿入、置換または欠失を含む。配列は、３つもしくはそれ未満、２つもしくはそれ未満、または１つのアミノ酸突然変異を含み得る。

配列番号７〜１９のいずれかに示されているアミノ酸配列を有するものまたはその変異型などのリツキシマブ結合エピトープは、当技術分野で公知の方法によって、例えば組換え技術を使用して、複数回貫通型膜貫通タンパク質の細胞外ループまたは細胞外アミノもしくはカルボキシ末端配列に導入され得る。
ＦＡＳエンドドメイン

表面抗原分類９５（ＣＤ９５）または腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）であるアポトーシス抗原１（ＡＰＯ−１またはＡＰＴ）としても公知のＦＡＳ受容体（ＦａｓＲ）は、プログラム細胞死（アポトーシス）をもたらす細胞表面上の死受容体である。

成熟ＦＡＳタンパク質は、３１９アミノ酸を有し、４８ｋＤの推定分子量を有し、３つのドメイン：細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに分割される。細胞外ドメインは１５７アミノ酸を有し、システイン残基が豊富である。膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、それぞれ１７アミノ酸および１４５アミノ酸を有する。

ＦＡＳの細胞質ドメインまたはエンドドメインは、「デスドメイン」を含有する。

ＦＡＳの生理学的リガンドは、ＴＮＦサイトカインファミリーのメンバーであるＦＡＳＬである。ＦＡＳＬは、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および免疫系の他の細胞上で発現される。ＦＡＳがそのリガンドに結合すると、カスパーゼカスケードが細胞内で開始され、最終的にはその死に至る。

リガンドが結合すると、ＦＡＳは、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を形成する。隣接細胞の表面上の膜アンカーＦＡＳリガンドトリマーは、ＦＡＳのオリゴマー化を引き起こす。それに続くデスドメイン（ＤＤ）の凝集により、受容体複合体は、細胞エンドソーム機構を介して内部移行される。これにより、アダプター分子ＦＡＤＤは、自らのデスドメインを介して、ＦＡＳのデスドメインに結合することができる。

ＦＡＳは、病原体感染細胞の殺傷、ならびに古い（ｏｂｓｏｌｅｔｅ）リンパ球および自己反応性リンパ球の死を含め、免疫系において重要な役割を果たす。このように、免疫系では、ＦＡＳは、自己免疫およびリンパ系腫瘍発生から保護する。ＦＡＳは、ＦＡＤＤ媒介性リクルートおよびカスパーゼ−８の活性化を介して、アポトーシスをトリガーする。一方、非リンパ系組織、例えば肝細胞では、ＦＡＳ誘導性アポトーシスは、アポトーシス促進性ＢＣＬ−２ファミリーメンバーＢＩＤのタンパク質分解性活性化を介する増幅を必要とする。しかしながら、リンパ系細胞は、ＦＡＳ活性化に対して極めて感受性である。

複数回貫通型膜貫通タンパク質に対する細胞外リガンドの結合は、ＦＡＳに結合するＦＡＳＬと類似の方法で、ＦＡＳエンドドメインの活性化を引き起こす。複数回貫通型膜貫通タンパク質に対する細胞外リガンドの結合は、ＦＡＳエンドドメインの凝集、ＦＡＤＤの結合、およびカスパーゼ−８の活性化を引き起こす。

ＦＡＳは、自己反応性リンパ球が排除される経路の重要な構成要素である。本発明のキメラタンパク質は、この経路を自殺遺伝子として利用し、その重要な適用の１つは、自己反応性の操作されたＴ細胞応答（例えば、オンターゲットオフ腫瘍毒性）を停止することである。

本発明のキメラタンパク質は、ＦＡＳの残基１７４〜３１７に対応し、配列番号２０として示されている配列またはその変異型を有するＦＡＳの細胞質ドメインを含み得る。
配列番号２０

本発明のキメラタンパク質は、ＦＡＳのエンドドメインの残基２３０〜３１４に対応し、配列番号２９として示されている配列またはその変異型を有するＦＡＳの「デスドメイン」を含み得る。
配列番号２９

変異型配列は、変異型ＦＡＳがアポトーシスをトリガーする能力を保持する限り、配列番号２０または２９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。すなわち、変異型ＦＡＳが、リガンド結合に際してＤＩＳＣの会合を引き起こして、それに続くカスパーゼ−８の活性化をもたらす能力を保持する限り。
細胞外リガンド

細胞外リガンドは、キメラタンパク質の複数回貫通型膜貫通部分のリガンド結合ドメインに結合して、ＦＡＳエンドドメインの活性化をもたらすことができる任意のタンパク質または他の実体であり得る。

用語「細胞外」は、リガンドが、その細胞膜中に本発明のキメラタンパク質を含む細胞の外側に存在することを示す。

細胞外リガンドは、細胞膜における本発明の第１の態様によるキメラタンパク質のクラスタ化を引き起こし得る。細胞外リガンドはそれ自体が溶解性であり（例えば、リツキシマブ）、キメラタンパク質を発現する細胞が破壊される別の機構を提供し得る。

細胞外リガンドは、可溶性リガンドであり得る（すなわち、膜結合型ではない）。

自殺遺伝子を発現する細胞の無制御な排除を回避するために、細胞外リガンドは、内因性リガンドであるべきではなく、またはキメラタンパク質の複数回膜貫通部分に結合することもできるいかなる内因性カウンターパートも有するべきではない。

細胞外リガンドは、合成リガンド、または被験体にとって内因性ではない（例えば、植物または他の動物種に由来する）天然リガンドであり得る。

特に、細胞外リガンドは、抗体（この用語は、抗体フラグメントおよび模倣物を含む）であり得る。

本明細書で使用される「抗体」は、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。抗体は、３つのＣＤＲを含み、ドメイン抗体（ｄＡｂ）のものと同等の抗原結合部位を有し得る。抗体は、６つのＣＤＲを含み、古典的な抗体分子のものと同等の抗原結合部位を有し得る。ポリペプチドの残りは、抗原結合部位のための適切な足場をもたらし、抗原との結合のために適切な様式でこれを提示する任意の配列であり得る。抗体は、免疫グロブリン分子全体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントもしくはナノボディなどのその一部であり得る。抗体は、二機能性抗体であり得る。抗体は、非ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。

したがって、抗体は、完全抗体の抗原特異性を保持する任意の機能性フラグメントであり得る。

一方、細胞外リガンド結合ドメインは、免疫グロブリンに由来するものではないまたは免疫グロブリンに基づくものではない結合部分を含み得る。非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するためにいくつかの「抗体模倣」設計反復タンパク質（ＤＲＰ）が開発されている。

アンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質などの反復タンパク質は、抗体とは異なり細胞内および細胞外に存在する遍在的な結合分子である。それらの独特のモジュール構成は、互いに積み重なって可変性のモジュール標的結合表面を提示する伸長反復ドメインを形成する反復構造単位（反復）を特徴とする。このモジュール性に基づいて、非常に多様な結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリーが生成され得る。ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）は、この技術に基づく抗体模倣物の一例である。

アンチカリンでは、結合特異性は、化学的に感受性または不溶性の化合物の生理的な輸送および貯蔵にインビボで関連する一定範囲の機能を果たすタンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、タンパク質の一方の末端において４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含むロバストな固有構造を有する。結合ポケットへの侵入のためのこれらのループおよび分子のこの部分のコンフォメーションの差異は、異なるリポカリン間における結合特異性の変動の原因である。

アビマーは、インビトロエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによって、結合特性および阻害特性を有するマルチドメインタンパク質を生成して、ヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化する。

バーサボディは、１５％超のシステインを有する３〜５ｋＤａの小さなタンパク質であって、ほとんどのタンパク質に存在する疎水性コアを置換して、高いジスルフィド密度の足場を形成するタンパク質である。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸を少数のジスルフィドで置換することにより、より小さく、より親水性であり、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性であり、より低密度のＴ細胞エピトープを有するタンパク質がもたらされる。これら４つの特性はすべて、顕著に減少した免疫原性を有するタンパク質をもたらす。それらはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて製造され得、高度に可溶性かつ安定である。
ＣＤ２０モノクローナル抗体

ＣＤ２０は、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブ、チウキセタンおよびトシツモマブなどのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の標的である。

細胞外リガンドは、これらのＣＤ２０ ｍＡｂまたはその結合ドメインであり得るか、またはこれらを含み得る。

いくつかの抗ＣＤ２０抗体は、治療的使用について承認されているか、または現在臨床試験中であり、例えば：
・非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の処置のためのリツキシマブ
・オファツムマブは、ＣＬＬについて、２００９年１０月にＦＤＡによって承認された；
・オビヌツズマブは、ＣＬＬについて、２０１３年１１月にＦＤＡによって承認された；

キメラｍＡｂリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）は、最初のＦＤＡ承認ＣＤ２０モノクローナル抗体であった。現在、それは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍；例えば、非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を処置するために承認されている。加えて、それは、関節リウマチを含むいくつかの自己免疫疾患における使用について承認されている。リツキシマブは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）または多発性硬化症などのいくつかの他の自己免疫疾患においてますます使用されている。腫瘍学指示では、リツキシマブは、典型的には、化学療法と組み合わせて使用されていた。例えば、リツキシマブを用いたＣＨＯＰレジメン（Ｒ−ＣＨＯＰ）は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の標準治療である。リツキシマブは、長期維持段階の単独療法として、無痛性リンパ増殖性障害においてますます使用されている。これまで、リツキシマブは、最も一般に使用されている治療用抗体である。その結果、非常に明確なその薬理学的特性像が明らかになっている：リツキシマブは、非常に強力なリンパ枯渇抗体である。それは、典型的には、非常に耐容性良好である。リツキシマブ単独療法はＢ細胞枯渇をもたらすが、特に短期レジメンによる感染症リスクの増加はわずかである。

リツキシマブは、いわゆるＩ型ＣＤ２０ ｍＡｂである。リツキシマブは、脂質ラフトへのＣＤ２０分子の再組織化を誘導し、その結果、補体系の古典的経路を効率的に活性化する。対照的に、ＩＩ型ＣＤ２０ ｍＡｂはこの効果を有さず、補体を不完全に活性化する。これらの型は両方とも、エフェクター細胞の存在下で抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。

リツキシマブは、遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体である。前記抗体は、マウス軽鎖可変領域および重鎖可変領域配列ならびにヒト定常領域配列を含有するＩｇＧ１κ免疫グロブリンである。

リツキシマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、配列番号２１および２２として示されている。

オファツムマブの重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、配列番号２３および２４として示されており、ＣＤＲ配列は、下線が付されている。
リツキシマブ重鎖可変鎖配列（配列番号２１）
リツキシマブ軽鎖可変鎖配列（配列番号２２）

本発明のキメラタンパク質に結合する細胞外リガンドは、リツキシマブまたはその結合部分であり得るか、またはこれを含み得る。例えば、細胞外リガンドは、配列番号２１として示されているリツキシマブの重鎖可変領域、および／または配列番号２２として示されているリツキシマブの軽鎖可変領域を含み得る。細胞外リガンドは、配列番号２１として示されているリツキシマブの重鎖可変領域由来のＣＤＲ３、および／または配列番号２２として示されているリツキシマブの軽鎖可変領域由来のＣＤＲ３を含み得る。細胞外リガンドは、配列番号２１として示されているリツキシマブの重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２２として示されているリツキシマブの軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。

リツキシマブは、臨床用途における最初の標準的な抗ＣＤ２０ ｍＡｂであるが、他のものが開発されており、使用中である。完全ヒトＣＤ２０ ｍＡｂオファツムマブは、アレムツズマブおよびフルダラビンの両方に対して耐性のＣＬＬ患者の処置について、２００９年にＦＤＡによって承認された。ＣＤ２０のオファツムマブ認識は、ＣＤ２０の小さなおよび大きな細胞外ループ上の重複するエピトープを認識する点で、リツキシマブのものと異なる。オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕａｍｂ）はＩ型抗体であり、おそらくは脂質ラフト形成がより良好であるので、リツキシマブよりも特に優れた補体活性化をもたらすと考えられる。ベルツズマブは、リツキシマブと類似のＣＤＲ配列を有するヒト化ＣＤ２０ ｍＡｂである（したがって、同じエピトープに結合する）。オビヌツズマブ（ＧＡ１０１としても公知である）は、ＩＩ型ＣＤ２０ ｍＡｂであるので、珍しい抗ＣＤ２０治療用ｍＡｂである。オビヌツズマブは、臨床開発中である。
オファツムマブ重鎖可変鎖配列（配列番号２３）
オファツムマブ軽鎖可変鎖配列（配列番号２４）

上記配列では、ＣＤｒ配列は、下線が付されている。

本発明のキメラタンパク質に結合する細胞外リガンドは、オファツムマブまたはその結合部分であり得るか、またはこれを含み得る。例えば、細胞外リガンドは、配列番号２３として示されているオファツムマブの重鎖可変領域、および／または配列番号２４として示されているオファツムマブの軽鎖可変領域を含み得る。細胞外リガンドは、配列番号２３として示されているオファツムマブの重鎖可変領域由来のＣＤＲ３、および／または配列番号２４として示されているオファツムマブの軽鎖可変領域由来のＣＤＲ３を含み得る。細胞外リガンドは、配列番号２３として示されているオファツムマブの重鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２４として示されているオファツムマブの軽鎖可変領域由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み得る。

リツキシマブおよびオファツムマブ（およびおそらくはベルツズマブ）は、ＣＤ２０のクラスタ化を引き起こし、本質的に高溶解性であり、特にリツキシマブは非常によく確立された安全性プロファイルを有するので、本発明の自殺遺伝子のＦＡＳトリガーに理想的である。時折、リツキシマブによってトリガーされる自殺遺伝子は、非実用的であり得る−これは、リツキシマブ、特にメンテナンスリツキシマブを定期的に服用する患者においてである。リツキシマブは非常に長い半減期を有し、本発明者らが開発している自殺遺伝子手法はかかる感受性を有する可能性が高いので、操作されたＴ細胞を与えることができるようになるには、リツキシマブ投与後数カ月を要し得る。これらの患者では、リツキシマブに対して非感受性であったがオファツムマブに対して感受性であった変異型ＣＤ２０を有することは有用であろう。
核酸配列

本発明の第２の態様は、本発明によるキメラタンパク質をコードする核酸配列を提供する。

本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義語であることを意図される。

当業者であれば、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることを理解するであろう。加えて、当業者であれば、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するために、ルーチンな技術を使用して、本明細書記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行い得ると理解すべきである。

本発明の第２の態様による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、１本鎖または２本鎖であり得る。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当技術分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書記載の使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ると理解すべきである。かかる改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。

ヌクレオチド配列に関して、用語「変異型」、「相同体」または「誘導体」は、配列からの、または配列への１つの（またはそれより多い）核酸の任意の置換、変異、改変、交換、欠失または付加を含む。

核酸配列は、配列番号１、配列番号２として示されているキメラタンパク質配列またはその変異型をコードし得る。

例えば、ヌクレオチド配列は、配列番号２５または２６として示されている配列を含み得る。
配列番号２５ ｄＣＤ２０−ＦＡＳ
配列番号２６ ｄＣＤ２０_{Ｐ１７２Ｗ}−ＦＡＳ
核酸構築物

本発明はまた、
ｉ）ＦＡＳエンドドメインに融合された複数回貫通型膜貫通タンパク質を含むキメラタンパク質をコードする第１の核酸配列；および
ｉｉ）目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）をコードする第２の核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。

ＮＯＩは、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。

核酸配列は、２つまたはそれより多い核酸配列の共発現を可能にする配列によって連結され得る。例えば、構築物は、内部プロモーター、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）配列、または切断部位をコードする配列を含み得る。ポリペプチドが産生されたら、いかなる外部切断活性も必要とせずに、それが個別のタンパク質に即時に切断されるように、切断部位は自己切断され得る。
配列番号２７または２８として示されている配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａ自己切断ペプチドを含む様々な自己切断部位が公知である：
配列番号２７
または
配列番号２８

共発現配列は、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は、内部プロモーターであり得る。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）

Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に見られる分子であって、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与する分子である。ＴＣＲと抗原との間の結合は、比較的低い親和性であり、変性する：多くのＴＣＲは同じ抗原を認識し、多くの抗原は同じＴＣＲによって認識される。

ＴＣＲは、２本の異なるタンパク質鎖（すなわち、それは、ヘテロダイマーである）から構成される。Ｔ細胞の９５％では、これは、アルファ（α）およびベータ（β）鎖からなるのに対して、Ｔ細胞の５％では、これは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。この比率は、個体発生中および疾患状態で変化する。

ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、Ｔリンパ球は、関連酵素、共受容体、特殊なアダプター分子、および活性化または放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象によって活性化される。

本発明の核酸構築物またはベクターは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖またはＴＣＲδ鎖をコードする核酸配列を含み得る。それは、例えば、ＴＣＲα鎖をコードする核酸配列およびＴＣＲβ鎖をコードする核酸配列；またはＴＣＲγ鎖をコードする核酸配列またはＴＣＲδ鎖をコードする核酸配列を含み得る。２つの核酸配列は、２つのＴＣＲ鎖の共発現を可能にする配列、例えば内部プロモーター、ＩＲＥＳ配列または切断部位、例えば自己切断部位によって連結され得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）

目的の核酸配列（ＮＯＩ）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。

古典的ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に結び付けるキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から誘導された１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦＶ）であるが、リガンドなどの抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくことも可能である。スペーサードメインは、膜からバインダーを単離し、好適な配向をもたせるのに必要であり得る。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサー、例えば、抗原によっては、ＣＤ８αからのストーク、さらにはＩｇＧ１ヒンジ単独でも十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜にタンパク質をつなぎ止め、スペーサーを、細胞内シグナル伝達メインを含むか、または関連し得るエンドドメインに結び付ける。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのζ鎖のどちらかの細胞内部分から誘導された細胞内シグナル伝達ドメインを有していた。したがって、これらの第一世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達するもので、同種標的細胞のＴ細胞による致死を誘発するのに十分ではあったが、Ｔ細胞を十分に活性化して増殖および生存をもたらすことはなかった。この限界を克服するため、複合シグナル伝達ドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分の融合により、抗原認識後活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達することができる第二世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８の共刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する最も強力な共刺激シグナル、すなわち免疫学的シグナル２を供給する。また、生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなど、ＴＮＦ受容体ファミリーのエンドドメインを含む一部の受容体も記載されている。活性化シグナル、増殖シグナルおよび生存シグナルを伝達することができる細胞内シグナル伝達ドメインを有するさらにいっそう強力な第三世代ＣＡＲが現在記載されている。

ＣＡＲエンコード核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを用いてＴ細胞に移入され得る。こうして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原と結合したとき、これにより、活性化シグナルの、それが発現されるＴ細胞への伝達がもたらされる。すなわち、ＣＡＲは、標的抗原を発現する細胞に向けたＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
ベクター

第３の態様において、本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターを提供する。

本発明はまた、１つまたはそれより多い本発明の核酸配列または核酸構築物と、必要に応じて、１つまたはそれより多い（ｏｎｅ ｏｆ ｍｏｒｅ）さらなる目的の核酸配列（ＮＯＩ）とを含むベクターまたはベクターのキットを提供する。かかるベクターは、宿主細胞が、１つまたはそれより多い本発明の第１の態様によるキメラタンパク質と、必要に応じて、１つまたはそれより多い他の目的のタンパク質（ＰＯＩ）とを発現するように、核酸配列または核酸構築物を宿主細胞に導入するために使用され得る。キットはまた、細胞外リガンドを含み得る。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターまたはトランスポゾンベースのベクターまたは合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、Ｔ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができるものであり得る。

ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、標的細胞がキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、ＮＯＩは、例えば、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードし得る。
細胞

本発明はまた、本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を含む細胞に関する。

細胞は、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞であり得る。

細胞は、造血幹細胞などの幹細胞であり得る。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を演じるリンパ球のタイプである。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球とは区別することができる。下記で概説する通り、様々なタイプのＴ細胞がある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスで他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原と共に提示されたときに活性化される。これらの細胞は、種々のサイトカインを分泌することにより、種々のタイプの免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、幾つかのサブタイプのうちの１つに分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶でも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在する、ＭＨＣクラスＩに随伴する抗原に結合することにより標的を認識する。調節性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子を通じて、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活化され得、実験的自己免疫脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。

記憶Ｔ細胞は、感染の消散後長期にわたって持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原に再曝露されると、迅速に多数のエフェクターＴ細胞に拡大し、過去の感染に対する「記憶」をもつ免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ：セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前にはサプレッサーＴ細胞として知られていた、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主たる役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を制止し、胸腺での負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主なクラス−天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞については記載されている。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても知られている）は、胸腺で生じ、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発達中のＴ細胞との間の相互作用に関連付けられている。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞からは区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止し得るため、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸが引き起こされ得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られている）は、正常な免疫応答中に生じ得る。

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、先天性免疫系の一部を形成する細胞溶解性細胞の１タイプである。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存的にウイルス感染細胞からの内生シグナルに対して、迅速な応答を提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化および成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。

幹細胞は、専門化した（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ）細胞に分化し得る未分化細胞である。哺乳動物では、大きく２種類の幹細胞がある：胚盤胞の内部細胞塊から単離される胚性幹細胞、および様々な組織に見られる成体幹細胞。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は、体の修復系として作用して、成体組織を補充する。発生中の胚では、幹細胞は、すべての専門化した細胞（外胚葉、内胚葉および中胚葉（人工多能性幹細胞を参照のこと））に分化し得るが、血液、皮膚または腸組織などの再生器官（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎ）の正常な代謝回転も維持する。
ヒトでは、３つの公知の利用可能な自己成体幹細胞源がある：
１．採取による抽出（すなわち、骨穿孔）を必要とする骨髄。
２．脂肪吸引による抽出を必要とする脂肪組織。
３．アフェレーシス（血液をドナーから採血し、幹細胞を抽出して血液の他の部分をドナーに戻す機械に通す）による抽出を必要とする血液。

成体幹細胞は、医学療法、例えば骨髄移植において頻繁に使用される。現在、幹細胞は人工的に増殖され、筋肉または神経などの様々な組織の細胞と一致する特徴を有する専門化した細胞型に変換（分化）され得る。体細胞核移植または脱分化によって生成された胚性細胞株および自己胚性幹細胞もまた、細胞療法のための専門化した細胞型を生成するために使用され得る。

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、すべての他の血液細胞を生じさせる血液細胞であり、中胚葉に由来する。それらは、ほとんどの骨のコアに含まれる赤色骨髄に存在する。

それらは、骨髄細胞系列（単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）およびリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を生じさせる。造血組織は、長期および短期の再生能を有する細胞、ならびにコミットした多能性、複能性および単能性の前駆細胞を含有する。

ＨＳＣは、異種集団である。血中におけるリンパ球と骨髄子孫との比（Ｌ／Ｍ）によって区別される３つのクラスの幹細胞が存在する。骨髄偏向型（Ｍｙ−ｂｉ）ＨＳＣは、低いＬ／Ｍ比（０〜３）を有するのに対して、リンパ偏向型（Ｌｙ−ｂｉ）ＨＳＣは、大きな比（＞１０）を示す。第３のカテゴリーは、Ｌ／Ｍ比が３〜１０であるバランス型（Ｂａｌａ）ＨＳＣからなる。骨髄偏向型ＨＳＣおよびバランス型ＨＳＣのみが、持続的な自己複製特性を有する。

本発明のキメラタンパク質発現細胞は、上記細胞型のいずれかであり得る。

１つまたはそれより多い本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（第一者）から、または造血幹細胞移植の状況ではドナー末梢血（第二者）から、または無関係のドナー由来の末梢血（第三者）のいずれかからエクスビボで作られ得る。

あるいは、１つまたはそれより多い本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を発現するＴ細胞またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞への誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエクスビボ分化から誘導され得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用し得る不死化Ｔ細胞株が使用され得る。

すべてのこれらの実施形態において、キメラタンパク質（複数も可）発現細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡによるトランスフェクションなどの手段によって、前記キメラタンパク質または各キメラタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、および必要に応じてＮＯＩを導入することによって生成される。

本発明のＴ細胞は、被験体由来の生体外ＴまたはＮＫ細胞であり得る。ＴまたはＮＫ細胞を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から得てもよい。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様による１つまたはそれより多くのキメラタンパク質をコードする核酸で形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理により活性化および／または拡大され得る。

本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上記で挙げた他の供給源からのＴまたはＮＫ細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）本発明の第２の態様による１つまたはそれより多くの核酸配列（複数も可）によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクション
により作製され得る。

本発明はまた、１つまたはそれより多い本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を含むＴ細胞またはＮＫ細胞と、ＣＩＤとを含むキットを提供する。
医薬組成物

本発明はまた、本発明の第４の態様による複数の細胞を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、所望により１種またはそれより多くのさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であり得る。
方法

本発明はまた、本発明の第４の態様による細胞を作製するための方法であって、本発明の第３の態様によるベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む方法を提供する。

ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。

本発明はまた、本発明の第４の態様による細胞を排除するための方法であって、複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合する細胞外リガンドに前記細胞を曝露する工程を含む方法を提供する。

細胞外リガンドの結合は、ＦＡＳエンドドメインの活性化および細胞のアポトーシスをもたらし得る。

細胞外リガンドの結合は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす複数のキメラタンパク質の複数回貫通型膜貫通タンパク質の架橋をもたらし得る。

細胞外リガンドが抗体である場合、細胞外リガンドの結合は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらし得る。

細胞は、インビボまたはインビトロで細胞外リガンドに曝露され得る。

細胞外リガンドは、例えば、リツキシマブ、オファツムマブまたはベルツズマブなどの抗ＣＤ２０ ｍＡｂであり得る。

細胞外リガンドは、医薬組成物の形態で投与され得る。医薬組成物は、医薬的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。医薬組成物は、１つまたはそれより多いさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を必要に応じて含み得る。かかる製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態であり得る。

本発明はまた、被験体への本発明の第４の態様による細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫応答を予防および／または処置するための方法であって、複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合することができる細胞外リガンドを前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

病理学的免疫応答は、以下の群：移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍毒性；免疫活性化症候群；およびリンパ増殖性障害から選択され得る。

本発明はまた、被験体における疾患を処置または予防するための方法であって、本発明の第４の態様による細胞を前記被験体に投与する工程を含む方法を提供する。細胞は、上記に定義される医薬組成物の形態であり得る。

前記方法は、以下：
（ｉ）本発明の第３の態様によるベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクトした細胞を患者に投与する工程
を含み得る。

疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書では、疾患に関連する少なくとも１つの症候を緩和、軽減もしくは改善するために、および／または疾患進行を遅延、軽減もしくは阻止するために、前記細胞は、既存の疾患または症状を有する被験体に投与され得る。

疾患を予防するための方法は、本発明の免疫細胞の予防的使用に関する。本明細書では、疾患の原因を予防しもしくは減弱するために、または疾患に関連する少なくとも１つの症候の発症を軽減もしくは予防するために、かかる細胞は、疾患にまだ罹っていない被験体、および／または疾患のいかなる症候も示していない被験体に投与され得る。被験体は、疾患を発症する素因を有し得るか、または疾患を発症するリスクを有すると考えられ得る。

本発明によって提供される疾患を処置するための方法は、疾患進行をモニタリングすること、および任意の毒性活性をモニタリングすること、ならびに被験体に投与される細胞外リガンドの用量を調整して、許容され得るレベルの疾患進行および毒性活性を提供することを含み得る。

疾患進行のモニタリングは、それらが軽減／改善または増加／悪化しているかを決定するために、疾患に関連する症候を経時的に評価することを意味する。

毒性活性は、被験体への投与後に本発明の細胞によって引き起こされる有害効果に関係する。毒性活性としては、例えば、免疫学的毒性、胆道毒性および呼吸窮迫症候群が挙げられ得る。

特に、本発明は、被験体における疾患を処置するための方法であって、以下：
（ｉ）本発明の第４の態様による細胞を前記被験体に投与する工程；
（ｉｉ）病理学的免疫応答の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および
（ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫応答を発症するまたは発症した兆候を示す場合、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体を前記被験体に投与する工程
を含む方法を提供する。

本発明は、疾患を処置および／または予防するのに使用するための本発明の細胞を提供する。

細胞は、例えば、造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するためのものであり得る。

本発明はまた、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における本発明の細胞の使用に関する。

本発明はまた、毒性活性の処置および／または予防に使用するための、本発明の第１の態様によるキメラタンパク質を活性化することができる細胞外リガンドを提供する。

本発明の細胞および方法によって処置および／または予防すべき疾患は、ウイルス感染症などの感染症であり得る。

本発明の方法はまた、例えば自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片対宿主拒絶における病原性免疫応答の制御のためのものであり得る。

本発明の細胞がＴＣＲまたはＣＡＲを発現する場合、それらは、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、白血病、肺癌、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、前立腺癌および甲状腺癌などの癌性疾患の処置に有用であり得る。

本発明のＴＣＲ／ＣＡＲ発現細胞は、標的細胞、例えば癌細胞を殺すことができる。

本発明の細胞は、改変細胞または非改変細胞を患者に投与する任意の細胞療法に使用され得る。細胞療法の例は、ＣＤ３４＋幹細胞移植後の養子Ｔ細胞移入である。幹細胞移植後におけるＴ細胞の投与は、患者レシピエントにおける免疫系の再構成を促進するのに役立つ。適合関連または非関連ドナーが利用不可能であるか、または広範なドナー探索のために疾患が過度に攻撃的である場合、ＨＬＡハプロタイプ一致家族ドナーの使用が有効であり得る。かかるドナーは、親、兄弟姉妹または二等親血縁者であり得る。かかる注入は免疫回復を増強し、それにより、ウイルス感染を軽減し、再発性白血病細胞を除去し得る。しかしながら、ドナー幹細胞移植片におけるアロ反応性Ｔ細胞の共存は、ドナー細胞がレシピエントに対して反応する移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）（これは、レシピエントの皮膚、腸、肝臓および他の器官を徐々に損傷し得る）を引き起こし得る。

細胞療法の他の例としては、天然細胞または異種遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞の使用が挙げられる。これらの処置は、血液障害を含む多くの障害に使用されるが、これらの治療は、マイナスの副作用を有し得る。別の方法では、罹患細胞の機能を代替することによって障害を処置するために、例えば間葉系間質細胞などの多くの種類の成熟細胞に分化し得る未成熟前駆細胞が使用され得る。本発明は、細胞療法に使用されるドナー細胞の考えられるマイナス効果を取り除くための迅速で有効な機構を提供する。

本発明は、ドナーＴ細胞移植後のヒト患者における移植片対宿主病の効果を軽減する方法であって、本発明のベクターを、ドナー細胞培養物中のヒトドナーＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する工程；形質導入またはトランスフェクトしたドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程；続いて、前記患者における移植片対宿主病の存在または非存在を検出する工程；および細胞外リガンドを、移植片対宿主病の存在が検出された患者に投与する工程を含む方法を提供する。Ｔ細胞は、アロ反応性除去処理されていない（ｎｏｎ−ａｌｌｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）ものであり得る。

本発明は、幹細胞移植の方法であって、ハプロタイプ一致幹細胞移植物をヒト患者に投与する工程；およびハプロタイプ一致ドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物中で、本発明によるベクターを前記Ｔ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する方法を提供する。

細胞は、ドナー細胞培養物中のアロ反応性除去処理されていないヒトドナーＴ細胞であり得る。

本発明はまた、幹細胞移植の方法であって、ハプロタイプ一致幹細胞移植物をヒト患者に投与する工程；およびアロ反応性除去処理されていないハプロタイプ一致ドナーＴ細胞を前記患者に投与する工程を含み、ハプロタイプ一致ドナー細胞培養物中で、本発明によるベクターを前記Ｔ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する方法を提供する。

ハプロタイプ一致幹細胞移植物は、ＣＤ３４＋ハプロタイプ一致幹細胞移植物であり得る。ヒトドナーＴ細胞は、患者のＴ細胞とハプロタイプ一致であり得る。患者は、幹細胞移植によって緩和され得る任意の疾患または障害であり得る。患者は、固形腫瘍または血液もしくは骨髄の癌などの癌を有し得る。患者は、血液または骨髄疾患を有し得る。患者は、鎌状赤血球貧血または異染性白質ジストロフィーを有し得る。

ドナー細胞培養物は、骨髄試料または末梢血から調製され得る。ドナー細胞培養物は、ドナー末梢血単核細胞から調製され得る。いくつかの実施形態において、ドナーＴ細胞は、トランスフェクションまたは形質導入の前に、ドナー細胞培養物からアロ反応性除去処理される。形質導入またはトランスフェクトしたＴ細胞は、患者への投与前に、ＩＬ−２の存在下で培養され得る。

以下、実施例により本発明をさらに記載するが、これは、本発明を実施する上で当業者を助ける役割を果たすことを意味するもので、本発明の範囲をいかなる意味にせよ限定する意図はない。
実施例１−先端切除バージョンのＣＤ２０の試験

ＣＤ２０は、Ｂ細胞上で、ならびにほぼすべてのＢ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病およびＢ細胞慢性リンパ性白血病で発現される複数回貫通膜タンパク質である。ＣＤ２０は、２つの細胞外ループ：ジスルフィド結合によって拘束されたマイナーループおよびメジャーループを有する。それは、アミノ末端およびカルボキシ末端エンドドメインを有する。

ＣＤ２０は、リツキシマブおよびオファツムマブを含む多くの治療用モノクローナル抗体によって認識される。本発明者らは、アミノまたはカルボキシエンドドメイン末端の欠失を有するＣＤ２０が、かかる抗体によって依然として認識され得るかを決定しようとした。

この目的のために：全長ＣＤ２０；アミノ末端（エンドドメイン）切除ＣＤ２０；およびカルボキシ末端（エンドドメイン）切除ＣＤ２０をｅＧＦＰとそれぞれ融合した。これらのプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、リツキシマブまたはオファツムマブで染色した。フローサイトメトリー分析により、これらの先端切除が、ＣＤ２０の表面発現／認識に影響を及ぼさなかったことが示された（図１）。
実施例２−低い基本毒性を有するＦＡＳキメラの生産

単純なＦＡＳキメラ（例えば、ＲＱＲ８とＦＡＳとの融合体）、またはＦＡＳエンドドメインを有するキメラ抗原受容体（Ｔｏｎｅら、（２０１３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４，１４１−１５０）の発現は、顕著な基本毒性をもたらす。ＦＡＳは、非常に感受性のあるアポトーシストリガーであるので、単純な過剰発現は、自然発生的な活性化をもたらす可能性がある。

これを試験するために、複数回膜貫通タンパク質とＦＡＳとの融合体であるＦＡＳキメラを生成した。これは、ＦＡＳエンドドメインの「パディングアウト」をもたらして、自然発生的な活性化の可能性を減少させ、それにより、基本毒性を軽減または排除するはずである。複数回貫通タンパク質としてＣＤ２０を選択し、アミノ末端切除バージョンのＣＤ２０のカルボキシ末端をＦＡＳのエンドドメインに融合させて、ｄＣＤ２０−ＦＡＳを作った（図２ｂ）。

この構築物はまた、それらの発現および機能を研究することを可能にするｅＧＦＰを共発現した。ＲＱＲ８およびＲＱＲ８−ＦＡＳ（ＦＡＳがＲＱＲ８のカルボキシ末端に結合された変異型ＲＱＲ８）も含まれていた。２９３Ｔ細胞において、それらの基本毒性と、オファツムマブへの曝露によって誘導される毒性とを比較して、機能を試験した。結果を図３に示す。高レベルの基本毒性を有していたＲＱＲ８−ＦＡＳとは異なり、ｄＣＤ２０−ＦＡＳは、非常に低い基本毒性および非常に高い誘導性毒性をもたらした。
実施例３−リツキシマブに対する感度の調査

ジャーカットＴ細胞にｄＣＤ２０−ＦＡＳを形質導入し、異なる濃度のリツキシマブ（補体なし）に曝露し、タイムコース（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ）を実施した。ＦＡＳ媒介性アポトーシスは、比較的徐々に活性化すると予想される。アネキシン−Ｖ／７ＡＡＤでＴ細胞を染色することによって、アポトーシスを決定した。注目すべきことに、図４に示されているように、２４時間および４８時間の時間経過において、細胞の５０％を殺すリツキシマブの濃度は、３．１２５ｕｇ／ｍｌ未満である。さらなる実験を実施して、ｄＣＤ２０−ＦＡＳ発現Ｔ細胞の殺傷を、さらなる希釈のリツキシマブに４８時間曝露した（図５）。この実験により、ｄＣＤ２０−ＦＡＳは非常に感受性のある活性化をもたらし、細胞の５０％を殺す割合は約０．６ｕｇ／ｍｌであることが示された。これは、約２００ｕｇ／ｍｌの治療レベルを十分に下回る（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎら、（１９９８）Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．Ｏｆｆ．Ｊ．Ｅｕｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．ＥＳＭＯ ９，９９５−１００１）。
実施例４−オファツムマブに対する感度の調査

ジャーカットＴ細胞にｄＣＤ２０−ＦＡＳを形質導入し、異なる濃度のオファツムマブに曝露し、タイムコースを実施した（図６）。Ｔ細胞は、オファツムマブに対して極めて感受性である。殺傷は、リツキシマブの場合よりも迅速かつ低濃度で起こった。ｄＣＤ２０−ＦＡＳ発現Ｔ細胞の感度を決定するために、さらなる実験を実施して、漸増希釈のオファツムマブに４８時間曝露した後のｄＣＤ２０−ＦＡＳ Ｔ細胞の殺傷を決定した（図７）。注目すべきことに、Ｔ細胞の５０％が殺されたオファツムマブの濃度は達せず、この濃度は０．１９５ｕｇ／ｍｌ未満であった。これは、（それぞれオファツムマブの初回注入および１２回目後に）６３ｕｇ／ｍｌ〜１４８２ｕｇ／ｍｌであると報告されているオファツムマブの治療濃度を十分に下回る（Ｇｒａｖａｎｉｓら、（２０１０）Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ；１５：１３３５−１３４３）。
実施例５−オファツムマブ結合ではなくリツキシマブ結合を破壊するためのＣＤ２０の操作

例えば、リツキシマブを定期的に服用する患者群にとっては、リツキシマブが理想的な活性化薬物ではない状況があり得る。オファツムマブは一般に使用されないが、リツキシマブと同等に有効であるかまたはそれよりも有効であると思われるので、これらの患者では、リツキシマブに対して非感受性であるが、オファツムマブに対して感受性であることが有用な手法であろう。

変異型ＣＤ２０を生産するために、リツキシマブ結合を移動させるがオファツムマブ結合に影響を及ぼさないと予測されたいくつかの突然変異を、残基Ａ１７０およびＰ１７２においてＣＤ２０に導入した。これらの突然変異から、Ｐ１７２Ｗ突然変異型ＣＤ２０はオファツムマブに結合するが、リツキシマブに結合しないことが見出された。ｗｔ ＣＤ２０およびＣＤ２０−Ｐ１７２ＷをｅＧＦＰと共発現させ、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした図８に示されている結果によって、このことが確認される。続いて、リツキシマブまたはオファツムマブのいずれかでこれらの細胞を染色した。ｗｔ ＣＤ２０は両方に結合するが、ＣＤ２０−Ｐ１７２Ｗはオファツムマブにのみ結合する。
実施例６−ＡＤＣＣの研究

ＡＤＣＣは、直接的な殺傷の時間枠内で起こるので、点突然変異（Ｅ２７２Ｋ）（Ｗａｎｇら、（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７，１１，１３２４−１３３０）を使用してＦＡＳエンドドメインを不活性化したｄＣＤ２０−ＦＡＳの突然変異を生成した。この構築物をＴ細胞に形質導入する。レトロウイルスベクター形質導入および単細胞クローニングによって樹立された、膜結合インターロイキン−１５および４１ＢＢＬを発現するＫ５６２刺激細胞株を使用して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞エフェクターを生成する（Ｋ５６２．４１ＢＢＬ．ｍＩＬ１５０。２４ウェル組織培養処理マルチウェルプレート中で、健常ドナー由来の新たに単離された末梢血単核細胞を、１２０Ｇｙで放射線照射した放射線照射Ｋ５６２．４１ＢＢＬ．ｍＩＬ１５と１：１で共培養し、４０ｉｕ ＩＬ２を補充する。必要に応じて、部分的な培地交換を実施する。７日間の培養後、１ラウンドのＭｉｌｔｅｎｙｉ ＣＤ５６陽性選択にしたがって、ＮＫ細胞の純粋な集団（約９５％の純度）を単離し、ＣｅｌｌＴＲＡＣＥ ｖｉｏｌｅｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識する。全長ＣＤ２０、ＲＱＲ８またはｄＣＤ２０−ＦＡＳ_{Ｅ２７２Ｋ}のいずれかを形質導入したＴ細胞を標的として使用し、ＮＫ細胞エフェクターと１６：１、８：１、４：１および２：１のエフェクター：標的比で４８時間共培養する。アネキシンＶ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）染色後、フローサイトメトリーによって細胞性排除（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を評価する。
実施例７−初代ヒトＴ細胞におけるｄＣＤ２０−ＦＡＳおよびｄＣＤ２０_{Ｐ１７２Ｗ}−ＦＡＳの機能の研究

リツキシマブおよびオファツムマブへの曝露に応じてアポトーシスを直接活性化する構築物ｄＣＤ２０−ＦＡＳおよびｄＣＤ２０Ｐ１７２Ｗ−ＦＡＳの能力を、初代ヒトＴ細胞において調査した。ＦＡＳ活性化は進展するのにある程度時間を要し、ＣＤＣはほぼ瞬間的であるので、補体の存在下で即時アポトーシスを試験することによって、これらの構築物がＣＤＣ媒介性殺傷も可能にするかを決定することができた。図９に示されているように、ｄＣＤ２０−ＦＡＳ Ｔ細胞は、リツキシマブおよびオファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕａｍｂ）の両方によって、有効に直接殺され、かつＣＤＣによって殺された。一方、ｄＣＤ２０_{Ｐ１７２Ｗ}−ＦＡＳ初代Ｔ細胞は、リツキシマブではなくオファツムマブによってのみ、有効に直接殺され、またはＣＤＣによって殺された。オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕａｍｂ）による初代Ｔ細胞におけるｄＣＤ２０−ＦＡＳによる直接的な殺傷の例は、図１０に示されている。

したがって、本発明者らは、治療用モノクローナル抗体によって活性化される三重機能自殺遺伝子を生成した。

本明細書で言及するすべての文書は、それらが言及されている主題に特に注意して、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法および系の様々な修飾および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく当業者には明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態と共に記載したが、請求されている本発明は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、分子生物学、または関連分野における専門家にとって明白な、本発明を実施するために記載された方法の様々な修飾も以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。

Claims (29)

1. ＦＡＳエンドドメインに融合された複数回貫通型膜貫通タンパク質を含むキメラタンパク質であって、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質が細胞外リガンドに結合して、前記ＦＡＳエンドドメインの活性化をもたらす、キメラタンパク質。
2. 前記複数回貫通型膜貫通タンパク質が、ＣＤ２０、またはアミノ末端エンドドメインもしくはカルボキシ末端エンドドメインを欠くその先端切除バージョンである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
3. 前記細胞外リガンドが、リツキシマブ、オファツムマブまたはベルツズマブである、請求項２に記載のキメラタンパク質。
4. 前記アミノ末端エンドドメインを欠く先端切除バージョンのＣＤ２０のカルボキシ末端に融合されたＦＡＳエンドドメインを含む、請求項２に記載のキメラタンパク質。
5. 前記ＣＤ２０が、配列番号３として示されている全長配列を基準にして、突然変異Ｐ１７２Ｗを含む、請求項２に記載のキメラタンパク質。
6. 前記ＣＤ２０が、配列番号３、４、５または６として示されている配列を含む、請求項２に記載のキメラタンパク質。
7. 前記複数回貫通型膜貫通タンパク質が、前記細胞外リガンドに結合する異種リガンド結合ドメインを含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
8. 前記ＦＡＳエンドドメインが、配列番号２０として示されている配列を含む、先行する請求項のいずれかに記載のキメラタンパク質。
9. 先行する請求項のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする、核酸配列。
10. １つまたはそれより多い請求項９に記載の核酸配列と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列とを含む、核酸構築物。
11. 請求項９に記載の核酸配列または請求項１０に記載の核酸構築物を含む、ベクター。
12. 目的のヌクレオチドも含む、請求項９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
13. 前記ベクターを標的細胞の形質導入に使用する場合、前記標的細胞が、請求項１〜８のいずれかに記載のキメラタンパク質およびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を共発現するように、前記目的のヌクレオチドがキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体をコードする、請求項１２に記載のベクター。
14. 請求項１〜８のいずれかに記載のキメラタンパク質を発現する、細胞。
15. Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または幹細胞である、請求項１４に記載の細胞。
16. 請求項１４または１５に記載の細胞を作製するための方法であって、請求項１１〜１３のいずれかに記載のベクターを細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程を含む、方法。
17. 請求項１４または１５に記載の細胞を排除するための方法であって、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合する細胞外リガンドに前記細胞を曝露する工程を含む、方法。
18. 前記細胞外リガンドの結合が、前記ＦＡＳエンドドメインの活性化および前記細胞のアポトーシスをもたらす、請求項１７に記載の方法。
19. 前記細胞外リガンドの結合が、複数のキメラタンパク質の複数回貫通型膜貫通タンパク質の架橋をもたらして、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす、請求項１７に記載の方法。
20. 前記細胞外リガンドが抗体であり、前記細胞外リガンドの結合が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をもたらす、請求項１７に記載の方法。
21. 前記細胞外リガンドが、リツキシマブ、オファツムマブまたはベルツズマブである、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 被験体における疾患を予防または処置するための方法であって、請求項１４または１５に記載の細胞を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
23. 以下：
    （ｉ）請求項１１〜１３のいずれかに記載のベクターを、被験体から単離された細胞の試料に形質導入またはトランスフェクトする工程、および
    （ｉｉ）前記形質導入／トランスフェクトされた細胞を患者に投与する工程
    を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 癌を処置するための、請求項２３に記載の方法。
25. 被験体への請求項１４または１５に記載の細胞の投与によって引き起こされる、前記被験体における病理学的免疫応答を予防および／または処置するための方法であって、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合することができる細胞外リガンドを前記被験体に投与する工程を含む、方法。
26. 前記病理学的免疫応答が、以下の群：移植片対宿主病；オンターゲットオフ腫瘍毒性；免疫活性化症候群；およびリンパ増殖性障害から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 請求項２２に記載の、被験体における疾患を処置するための方法であって、以下：
    （ｉ）請求項１４または１５に記載の細胞を前記被験体に投与する工程；
    （ｉｉ）病理学的免疫応答の発症について、前記被験体をモニタリングする工程；および
    （ｉｉｉ）前記被験体が、病理学的免疫応答を発症するまたは発症した兆候を示す場合、前記複数回貫通型膜貫通タンパク質に結合することができる細胞外リガンドを前記被験体に投与する工程
    を含む、方法。
28. 造血幹細胞移植、リンパ球注入または養子細胞移入に使用するための、請求項１４または１５に記載の細胞。
29. 被験体への請求項１４または１５に記載の細胞の投与によって引き起こされる病理学的免疫応答の予防または処置に使用するための、抗ＣＤ２０抗体。