CN109476722A - 用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法 - Google Patents

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J·J·梅勒霍斯特
M·C·米伦
D·J·小鲍威尔
Z·郑
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Abstract

本发明提供了制备可以被工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的方法、包含所述免疫效应细胞的组合物和反应混合物、和使用它们治疗的方法。

Description

用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法
相关申请
本申请要求2015年7月21日提交的美国系列号62/195,056的优先权，所述文献的内容通过引用的方式完整地并入本文。
序列表
本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。所述ASCII拷贝创建于2016年7月18日，命名为N2067-7081WO_SL.txt，并且大小为2,053,055字节。
发明背景
直至约十年前，体外T细胞活化主要利用促有丝分裂凝集素如植物凝集素(PHA)和伴刀豆球蛋白A(Con A)实施。这些促有丝分裂分子与细胞表面上的糖蛋白结合。为了实现T细胞受体(TCR)复合体特异性刺激，已经使用对表面分子(包括CD2、CD3、CD28和CD45)特异的抗体。这些抗体提供所需的共刺激信号以触发T细胞在培养下完全活化和增殖(Frauwirth和Thompson J Clin Invest(2002)Feb；109(3):295-9)。该领域已经进展到将这些抗体固定至附属细胞、珠或固态表面以稳健扩张(expansion)T淋巴细胞(Trickett和Kwan J Immunol Methods(2003)Apr 1；275(1-2):251-5)。
但是，现有的T细胞活化和扩张方案仍存在局限。示例性的一系列这些局限包括以下。例如，现有方案依赖于T细胞表面上存在功能性TCR。这将T细胞活化限于具有功能性TCR的那些细胞。原代T淋巴细胞是可以包括没有功能性TCR的T细胞的不均一细胞汇集物，因此限制了可以被活化的T细胞群体。生产、采购和使用针对细胞表面分子如CD2、CD3、CD28和CD45的抗体可能是昂贵的并且依赖于这类抗体的可获得性。另外，由于完全T细胞活化可能需要二种不同抗体(主要刺激物如抗CD3和次要刺激物如抗CD28)，因而成本进一步增加。另外，由于CD3/CD28刺激物一般长时间遗留在培养物中，总是接合TCR供延长、重复的刺激。延长的高水平TCR刺激可以向幼稚T细胞提供稳健的活化信号，同时伴随记忆T细胞出现活化诱导的细胞死亡(AIC)(Collette Y等人,Blood(1998)Aug 15；92(4):1350-63；Kerstan A和Hünig T J Immunol(2004)Feb 1；172(3):1341-5；；NOEL，P J Immunol.1996 Jul 15；157(2):636-42)。
因此，存在改善体外扩张和活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)的需求。
发明概述
本公开至少部分地涉及用于改善免疫细胞(例如，免疫效应细胞)扩张和/或活化(例如，体外扩张和/或活化)的方法。本文所述的一些实施方案通过瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)分子提供免疫细胞的扩张和/或活化。所述表达CAR的免疫细胞可以借助CAR分子的配体，例如，CAR抗原结合结构域的配体(例如，相应抗原分子或抗独特型抗体分子)来活化。在实施方案中，本文所公开的方法允许在不需要功能性T细胞受体存在和/或在基本上不改变免疫细胞表型的情况下扩张免疫细胞。例如，可以使用本文所述的方法扩张免疫效应细胞，包括无反应性T细胞、造血干细胞、NK细胞和B细胞。另外，免疫细胞可以在基本上不改变其未分化表型的情况下和/或在不延长、反复刺激T细胞受体的情况下扩张。在某些实施方案中，与常规的TCR刺激扩张相比，本文所述的方法允许优异的增殖和细胞数目产率。因此，本文公开的改进方法和组合物(例如，修饰的免疫细胞群体、反应混合物)可以为细胞疗法(例如，免疫疗法)提供明显益处。
因此，在一个方面，本发明的特征在于一种扩张和/或活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)群体的方法。该方法包括将CAR分子(例如，编码CAR分子的核酸)在适于表达(例如，瞬时表达)CAR分子的条件下引入免疫细胞群体中(例如，由此产生如本文提到的“表达第一CAR的细胞群体”或“瞬时表达CAR的细胞群体”)。在某些实施方案中，CAR分子包含抗原结合结构域(例如，抗体分子的抗原结合结构域)。该方法包括使表达第一CAR或瞬时表达CAR的细胞群体与CAR分子的配体，例如，CAR抗原结合结构域的配体(例如，相应抗原分子(例如，重组抗原)或抗独特型抗体分子)在出现免疫细胞扩张和/或活化的条件下接触，由此产生“扩张的和/或活化的免疫细胞群体”。在实施方案中，CAR分子的配体存在于(例如，固定至或连接至)基质(例如，非天然存在的基质)中/上。该方法还可以包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞群体。
在一个相关方面，本发明的特征在于一种扩张和/或活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)群体的方法。该方法包括提供如本文所述的表达第一CAR的细胞群体或瞬时表达CAR的细胞群体并且使表达第一CAR或瞬时表达CAR的细胞群体与CAR分子的配体，例如，CAR抗原结合结构域的配体(例如，相应抗原分子(例如，重组抗原)或抗独特型抗体分子)在出现免疫细胞扩张和/或活化的条件下接触，由此产生“扩张的和/或活化的免疫细胞群体”。在实施方案中，CAR分子的配体存在于(例如，固定至或连接至)基质(例如，非天然存在的基质)中/上。该方法还可以包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞群体。
在一个实施方案中，通过将编码CAR的核酸(例如，RNA或DNA)在允许产生CAR的条件下瞬时引入细胞中，产生瞬时表达的CAR。
在一个实施方案中，通过使用分选酶产生瞬时表达的CAR。例如，分选酶可以用来将胞外结构域(例如，包含抗原结合结构域和分选酶识别基序)偶联至分选酶受体成员(例如，包含分选酶受体基序、跨膜结构域；和任选地胞内信号传导结构域或开关结构域)。在一个实施方案中，瞬时表达的CAR包含分选酶转移特征标识，所述分选酶转移特征标识例如因分选酶识别基序偶联至分选酶受体基序所致。在一个实施方案中，分选酶、CAR或分选酶受体成员如2014年11月6日提交的PCT/CN2014/090503或2014年7月21日提交的PCT/CN2014/082600中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
上述方法可以在体外、离体或体内实施。
在一些实施方案中，从来自受试者(例如，癌症患者)的血液样品取得(例如，获得)在本文所述方法中使用的免疫细胞群体。在一个实施方案中，通过单采血液成分术获得免疫细胞群体。
在一些实施方案中，免疫细胞群体包括例如，如本文所述的免疫效应细胞。示例性免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、髓系衍生的吞噬细胞或其组合。
在某些实施方案中，免疫细胞群体包括原代T细胞或淋巴细胞亚群，例如包括无反应性T细胞(anergized T cells)、幼稚T细胞、调节性T细胞、Th-17细胞、干T细胞或其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞群体包括外周血单个核细胞(PBMC)或脐带血细胞(cord blood cells)或其组合。
在一个实施方案中，免疫细胞群体包括表达低水平的T细胞受体(例如，功能性T细胞受体)或没有该受体的细胞。在另一个实施方案中，免疫细胞群体包括具有无功能或实质上受损的T细胞受体的细胞。
在一个实施方案中，编码CAR分子(例如，第一CAR分子)的核酸是RNA分子，例如，体外转录的(IVT)RNA。在一个实施方案中，通过转染或电穿孔，将如本文所述的编码CAR的RNA构建体引入免疫细胞群体。在一个实施方案中，CAR分子瞬时表达(例如，CAR分子不整合或基本上不整合入细胞基因组)。在一个实施方案中，CAR分子在免疫细胞中表达有限的时间段或细胞复制次数，例如，少于50天(例如，少于40、30、25、20、15、10、5天或更少天数)。
在一个实施方案中，CAR分子在免疫细胞表面上瞬时表达并且在单次配体(例如，抗原)刺激后内化。在实施方案中，免疫细胞不接受反复的配体(例如，抗原)刺激。
在其他实施方案中，例如通过调节以下一者或两者，定制免疫细胞刺激强度至所需的水平：CAR表面密度或CAR抗原结合结构域对配体(例如，抗原)的亲和力。例如，增加免疫细胞上的CAR表面密度或增加CAR结合结构域对配体(例如，抗原)的亲和力可以增加刺激免疫细胞的强度。
在其他实施方案中，编码CAR分子(例如，第一CAR分子)的核酸是DNA载体或RNA载体。在一个实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是慢病毒。在一个实施方案中，核酸稳定整合入细胞基因组。
在实施方案中，编码的CAR分子如本文所述，例如，是如本文所述的肿瘤抗原结合性CAR(例如，CD19 CAR)。
在另一个实施方案中，CAR分子的配体是癌相关抗原，例如，如本文所述的CAR分子(例如，CD19 CAR)识别的癌相关抗原。
在一些实施方案中，基质是非细胞基质(non-cellular substrate)。非细胞基质可以是选自例如平板(例如，微量滴定板)、膜(例如，硝酸纤维素膜)、基体(matrix)、芯片或珠的固相支持物。在实施方案中，CAR分子的配体存在于基质中(例如，在基质表面上)。配体可以固定、连接或共价或非共价结合(例如交联)至基质。在一个实施方案中，将配体连接(例如共价连接)到珠上。在前述实施方案中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩张。
在其他实施方案中，基质是细胞，例如，表达配体的细胞，例如，在其表面上表达相应抗原的细胞。在一个实施方案中，相应抗原对细胞为异源，例如，是在细胞表面上表达的重组抗原。在另一个实施方案中，相应抗原在细胞(例如，肿瘤细胞)上内源表达。在前述实施方案中，免疫效应细胞群体可以在体外、离体或体内扩张。在一个实施方案中，例如通过淋巴结注射或通过注射肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)至肿瘤中，在体内扩张T细胞。
在一个实施方案中，将表达CAR的免疫细胞在CAR分子的配体存在下培养预定的时间段(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21、22、23或24小时或例如，1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天)。在一个实施方案中，将表达CAR的细胞培养4至9天时间。在一个实施方案中，将表达CAR的细胞培养8天或更短(例如，7、6或5天)时间。
在一些实施方案中，表达CAR的免疫细胞群体显示至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或更高的群体倍增。在一个实施方案中，表达CAR的免疫细胞群体显示总计8-10、或约9个群体倍增。
在一个实施方案中，表达CAR的免疫细胞群体扩张至每个细胞总计200-、300-、400-、450-、500-、550-、600-、650倍或更高的扩张。在一个实施方案中，将表达CAR的免疫细胞群体扩张约500倍。在一个实施方案中，细胞平均增殖超过400-600个或约500个细胞。在一些实施方案中，通过本文所述的方法如流式细胞术测量细胞扩张。在一个实施方案中，在用配体(例如，相应抗原)刺激后约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天测量细胞扩张。在一个实施方案中，在用配体刺激后10天和25天之间测量细胞扩张。在一个实施方案中，在用配体刺激后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天测量细胞扩张。
在一个实施方案中，使用本文所述的方法对扩张的和/或活化的免疫细胞群体基本上不刺激免疫细胞上的TCR。在实施方案中，本文所述的方法导致较不快速的免疫细胞分化和/或促进培养物中的“较年幼”T细胞表型。在一些实施方案中，扩张的和/或活化的免疫细胞群体包含具有较低分化表型的免疫效应细胞，例如，较年幼的细胞，例如，年幼T细胞。在一些实施方案中，较年幼T细胞可以是幼稚T细胞(TN)、记忆干细胞(TSCM)、中央记忆T细胞(TCM)或其组合。
在某些实施方案中，本文所公开的方法还包括使扩张的和/或活化的免疫细胞群体与编码第二CAR分子的核酸(例如，包含编码第二CAR的核酸的载体)接触，由此产生表达第二CAR的细胞群体。
在一个实施方案中，编码第二CAR分子的核酸选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，编码第二CAR分子的核酸载体是慢病毒。
在其他实施方案中，编码第二CAR分子的核酸是IVT RNA。
在一些实施方案中，第一和第二CAR分子针对相同的抗原，例如，相同的肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，第一和第二CAR分子是相同的CAR分子。在这类实施方案中，将表达(例如，瞬时表达)第一CAR的免疫细胞群体通过以下方式在体外或离体扩张和/或活化：使所述免疫细胞群体与肿瘤细胞抗原或针对CAR结合抗体分子的抗独特型抗体(例如，固定到如本文所述的非细胞或细胞基质上的CD19抗原或抗CD19独特型抗体)接触。备选地或联合地，将表达(例如，稳定表达)第二CAR的免疫细胞群体在体内扩张和/或活化，例如通过接触内源肿瘤细胞抗原(例如，CD19)。在一个实施方案中，将表达第二CAR的免疫细胞施用至受试者，例如，作为治疗性方案的部分。
在其他实施方案中，第一和第二CAR分子针对不同的抗原，例如，不同的肿瘤细胞抗原。在一个实施方案中，第一和第二CAR分子是不同的CAR分子(例如，第一和第二CAR分子)。在这类实施方案中，将表达(例如，瞬时表达)第一CAR的免疫细胞群体通过以下方式在体外或离体扩张和/或活化：使所述免疫细胞群体与第一肿瘤细胞抗原或针对CAR的抗原结合结构域的第一抗独特型抗体(例如，固定到如本文所述的非细胞或细胞基质上的间皮素抗原或对CAR分子的间皮素结合结构域的抗独特型抗体)接触。备选地或联合地，将表达(例如，稳定表达)第二CAR的免疫细胞群体在体内扩张和/或活化，例如通过接触内源第二肿瘤细胞抗原(例如，CD19)。在一个实施方案中，将表达第二CAR的免疫细胞施用至受试者，例如，作为治疗性方案的部分。
在一个实施方案中，第一和第二CAR选自ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR，例如，如本文所述的CAR。在一个实施方案中，第一和第二CAR是相同的。在其他实施方案中，第一和第二CAR是不同的。可以在本文中公开的方法中使用第一和第二CAR的任何组合。
在某些实施方案中，该方法还包括在适宜的扩张期间后，储存扩张的和/或活化的免疫细胞群体。在一个实施方案中，将扩张和/或活化免疫细胞群体根据本文所述的方法低温保存。在一个实施方案中，将扩张的和/或活化的免疫细胞群体在合适的介质(例如，可输注性介质)中低温保存，例如，如本文所述。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗受试者中病症或病状(例如，如本文所述的病症或病状)的方法。该方法包括向受试者施用根据本文所述的一种或多种方法产生的扩张的和/或活化的免疫细胞群体。在实施方案中，该方法包括取得(例如，获得)扩张的和/或活化的免疫细胞群体。扩张的和/或活化的免疫细胞群体可以从合适的储存条件(例如，低温保存(cryopreservation))获得。
在一些实施方案中，免疫细胞群体包括例如，如本文所述的免疫效应细胞。示例性免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、造血干细胞(HSC)、髓系衍生的吞噬细胞或其组合。
在某些实施方案中，免疫细胞群体包括原代T细胞或淋巴细胞亚群，例如包括无反应性T细胞、幼稚T细胞、调节性T细胞、Th-17细胞、干T细胞或其组合。
在一些实施方案中，免疫细胞群体包括外周血单个核细胞(PBMC)或脐带血细胞或其组合。
在又一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法。该方法包括向受试者单独或与额外疗法(例如，如本文所述的第二疗法)组合施用有效量的表达CAR分子(例如，如本文所述的第一和/或第二CAR分子)的免疫效应细胞群体(例如，如本文所述的扩张的和/或活化的免疫细胞群体)。
在一些实施方案中，治疗方法包括使用一个或多个本文所述的方法取得(例如，获得)扩张的和/或活化的免疫细胞群体。例如，扩张的和/或活化的免疫细胞群体可以事先已经通过以下方式获得：第一CAR分子(例如，编码如本文所述的第一CAR分子的核酸分子，例如，编码第一CAR的IVT RNA)在适于表达(例如，瞬时表达)CAR分子的条件下引入；并且使所述表达CAR的细胞群体与CAR分子的配体，例如，CAR抗原结合结构域的配体(例如，相应抗原分子(例如，重组抗原)或抗独特型抗体分子)在如此条件下接触，从而免疫细胞扩张和/或活化出现。在实施方案中，CAR分子的配体存在于(例如，固定至或连接至)基质(例如，非天然存在的基质)中/上，如本文所述。扩张的和/或活化的免疫细胞群体可以在合适条件下(例如，低温保存)储存，如本文所述。
在某些实施方案中，本文所公开的治疗方法还包括取得(例如，获得)表达第二CAR的细胞群体，例如，如本文所述的表达第二CAR的细胞群体。例如，扩张的和/或活化的免疫细胞群体可以事先已经与编码第二CAR分子的核酸(例如，包含编码第二CAR的核酸的载体)接触。在一个实施方案中，编码第二CAR分子的核酸选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，编码第二CAR分子的核酸载体是慢病毒。
在一些实施方案中，第一和第二CAR分子针对相同的抗原分子，例如，相同的癌相关抗原。在一个实施方案中，第一和第二CAR分子是相同的CAR分子。在这类实施方案中，将表达(例如，瞬时表达)第一CAR的免疫细胞群体通过以下方式事先在体外或离体扩张和/或活化：使所述免疫细胞群体与癌相关抗原或针对CAR结合抗体分子的抗独特型抗体(例如，固定到如本文所述的非细胞或细胞基质上的CD19抗原或抗CD19独特型抗体)接触。在一个实施方案中，将表达第二CAR的免疫细胞施用至受试者，例如，作为治疗性方案的部分。
在其他实施方案中，第一和第二CAR分子针对不同的抗原，例如，不同的癌相关抗原。在一个实施方案中，第一和第二CAR分子是不同的CAR分子(例如，第一和第二CAR分子)。在这类实施方案中，将表达(例如，瞬时表达)第一CAR的免疫细胞群体通过以下方式事先在体外或离体扩张和/或活化：使所述免疫细胞群体与第一癌相关抗原或针对CAR分子的抗原结合结构域的第一抗独特型抗体(例如，固定到如本文所述的非细胞或细胞基质上的抗原或对CAR分子的结合结构域的抗独特型抗体)接触。在一个实施方案中，将表达第二CAR的免疫细胞施用至受试者，例如，作为治疗性方案的部分。
在一个实施方案中，第一和第二CAR分子各自独立地选自ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR，例如，如本文所述的CAR。在一个实施方案中，第一和第二CAR是相同的。在其他实施方案中，第一和第二CAR是不同的。可以在本文中公开的方法中使用第一和第二CAR的任何组合。
在一个示例性实施方案中，第一CAR针对间皮素并且表达间皮素CAR的细胞与间皮素抗原或针对CAR的间皮素抗原结合结构域的抗独特型抗体接触；并且第二CAR针对CD19(例如，本文公开的CD19 CAR)。在另一个示例性实施方案中，第一CAR针对CD19并且表达CD19 CAR的细胞与CD19抗原或针对CAR的CD19抗原结合结构域的抗独特型抗体接触；并且第二CAR针对间皮素(例如，本文公开的间皮素CAR)。
在一些实施方案中，在上述治疗方法中使用的免疫细胞群体包括例如，如本文所述的免疫效应细胞。示例性免疫效应细胞包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、造血干细胞(HSC)、髓系衍生的吞噬细胞或其组合。
在又一个方面，本发明特征在于例如，根据本发明方法产生的免疫细胞制备物或反应混合物，例如，其包含免疫效应细胞群体(例如，包含第一和/或第二CAR分子或编码第一和/或第二CAR分子的核酸)。在某些实施方案中，第一和第二CAR分子同时表达(例如，完全地或部分重叠表达)或依次表达。
前述任何方法、制备物和反应混合物的额外特征或实施方案包括以下一者或多者：
免疫细胞扩张和/或活化
在某些实施方案中，本文所公开的方法包括扩张和/或活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)群体。该方法包括取得免疫细胞群体和使细胞与编码CAR分子的核酸在适于表达(例如，瞬时表达)CAR分子的条件下接触，其中CAR分子与配体(例如，相应抗原分子(例如，重组抗原)或针对CAR分子的抗原结合结构域的抗独特型抗体)结合；并且在相应抗原分子或抗独特型抗体存在下培养免疫细胞群体。
在一个实施方案中，免疫效应细胞群体相对于将施用细胞供治疗的受试者是自体的。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体相对于将施用细胞供治疗的受试者是同种异体的。
在一个实施方案中，免疫效应细胞群体是从外周血淋巴细胞分离的T细胞。在一个实施方案中，通过裂解红细胞和/或通过消耗单核细胞获得T细胞群体。在一个实施方案中，使用例如本文所述的方法从外周淋巴细胞分离T细胞群体。在一个实施方案中，T细胞包含CD4+ T细胞。在另一个实施方案中，T细胞包含CD8+ T细胞。在另一个实施方案中，T细胞包含调节性T细胞。在又一个实施方案中，T细胞包含幼稚T细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包含造血干细胞(例如，脐带血细胞)。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包含B细胞。在又一个实施方案中，免疫效应细胞包含NK细胞。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包含NKT细胞。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包含Th-17细胞。
在一个实施方案中，免疫效应细胞具有减低水平的T细胞受体或没有T细胞受体。在另一个实施方案中，免疫效应细胞具有无功能的或实质上受损的T细胞受体。
在一个实施方案中，免疫效应细胞群体可以从受试者的血液样品中获得，例如通过单采血液成分术获得。在一个实施方案中，通过单采血液成分术收集的免疫效应细胞经洗涤以除去血浆部分，并且任选地，将细胞提供在适当的缓冲液或介质中用于随后的加工步骤。在一个实施方案中，用缓冲液例如磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个实施方案中，将细胞在缺少一种或多种二价阳离子如钙和镁的洗涤液中洗涤。在一个实施方案中，将免疫效应细胞在基本上不含二价阳离子的缓冲液中洗涤。
在一个实施方案中，该方法包括从免疫效应细胞群体产生瞬时表达外源RNA的RNA工程化细胞群体。该方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入来自所述群体的细胞中，其中所述RNA包含编码CAR，例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR的核酸。
在一个实施方案中，将RNA通过本文所述的方法(例如，电穿孔)引入免疫效应细胞。在一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞表达CAR mRNA。
在另一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞在其细胞表面上表达CAR。
在一个实施方案中，通过在配体(例如，相应抗原分子或抗独特型抗体)存在下培养免疫效应细胞，扩张和/或活化免疫效应细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞在将RNA引入免疫效应细胞后至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28、32、36、36或48小时与相应抗原分子或抗独特型抗体接触。在一个实施方案中，免疫效应细胞在将RNA引入免疫效应细胞后少于24、15、12、10或8小时与相应抗原分子或抗独特型抗体接触。
在一个实施方案中，配体是这样的分子，所述分子结合于和/或活化例如在表达(例如，瞬时表达)CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19CAR)的免疫效应细胞群体的细胞表面上的CAR。在一个实施方案中，相应抗原分子是CAR的相应抗原。在一个实施方案中，相应抗原分子是由CAR的抗原结合部分识别的重组抗原。在一个实施方案中，相应抗原分子是癌相关抗原，例如，本文所述的癌相关抗原，例如，CD19。在一个实施方案中，配体是抗独特型抗体(例如，它是与CAR的抗原结合结构域结合的抗体分子)，例如抗CD19独特型抗体。
在一个实施方案中，配体与基质连接。在一个实施方案中，基质是固相支持物。在一个实施方案中，基质选自微量滴定板(例如，ELISA板)；膜(例如，硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、乙酸酯衍生物、及其组合)；纤维基体、琼脂糖凝胶基体、糖基体；塑料片；玻璃片；或任何类型的珠(例如，Luminex珠、Dyna珠、磁珠、流式细胞术珠及其组合)。在一个实施方案中，基质是ELISA板。在另一个实施方案中，基质是珠，例如，Dyna珠。
在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞与配体包被(例如，抗原包被)的珠按1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或15:1珠/免疫效应细胞的比率接触。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞与抗原包被的珠按3:1珠/免疫效应细胞的比率接触。
在一个实施方案中，将免疫效应细胞在适当的培养基(例如，本文所述的培养基)进一步中扩张，所述培养基可以任选地含有一种或多种用于增殖和/或成活力的因子，包含血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGFβ和TNF-α或任何其他用于细胞生长的添加物。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩张。在一个实施方案中，将免疫效应细胞在IL-2存在下扩张。
在一个实施方案中，用编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19CAR)的核酸转导的免疫效应细胞培养扩张几小时时间(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约40天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天)。在一个实施方案中，将细胞扩张4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩张8天或更短(例如，7、6、5、4或3天)时间。
免疫效应细胞的效力可以例如通过多种T细胞功能例如增殖、靶细胞杀伤作用、细胞因子产生、活化、移行或其组合定义。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，扩张5天的免疫效应细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。在一个实施方案中，将表达免疫效应细胞(例如，本文所述CD19 CAR的免疫效应细胞)培养扩张5天，并且与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎细胞因子产量，例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，扩张5天的免疫效应细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示以pg/ml计的促炎细胞因子产生(例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平)增加至少1、2、3、4、5、10倍或更多。
在一个实施方案中，免疫效应细胞扩张至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍或650倍)细胞增长，例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量。在一个实施方案中，细胞扩张约500倍。
在一个实施方案中，在用配体(例如，相应抗原分子)刺激后约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天测量细胞扩张。在一个实施方案中，在用配体(例如，相应抗原分子)刺激后10天和25天之间测量细胞扩张。在一个实施方案中，在用配体(例如，相应抗原分子)刺激后8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天测量细胞扩张。
在一个实施方案中，免疫效应细胞在适宜的扩张期间后低温保存。在一个实施方案中，将细胞根据本文所述的方法低温保存。在一个实施方案中，将扩张的细胞在合适的介质(例如，可输注性介质)中低温保存，例如，如本文所述。
在一个实施方案中，该方法包括将免疫效应细胞与编码第一CAR的核酸(例如，体外转录的RNA)在适于瞬时表达第一CAR的条件下接触，其中第一CAR靶向相应抗原分子，并且通过在相应抗原分子存在下培养表达第一CAR的免疫效应细胞扩张免疫效应细胞群体，并且进一步使细胞与载体接触，所述载体包含编码第二CAR的核酸。在一个实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，用载体转导来自免疫效应细胞群体的细胞一次，例如在从受试者的血液样品中获得免疫效应细胞群体(例如，通过单采血液成分术获得)后一天内。
在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向相同的相应抗原分子。在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向不同的相应抗原分子。在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的相同癌相关抗原。在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的不同癌相关抗原。在一个实施方案中，第一CAR是本文所述的ROR1 CAR、CD19CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179bCAR、间皮素CAR或CD79a CAR；并且第二核酸编码本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR。
在另一方面，本公开的特征在于包含免疫效应细胞群体的反应混合物，其中反应混合物中群体的多个细胞包含核酸分子，例如体外转录的RNA或合成的RNA，其包含CAR编码序列，例如CD19 CAR编码序列，例如本文所述。
在一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞表达CAR mRNA。
在另一个实施方案中，至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞在其细胞表面上表达CAR。
在一个实施方案中，反应混合物还可以包含如本文所述的配体(例如，相应抗原分子或抗独特型抗体)。在一个实施方案中，配体是这样的分子，所述分子结合于和/或活化例如在表达(瞬时表达)CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR)的免疫效应细胞群体的细胞表面上的CAR。在一个实施方案中，配体是CAR的相应抗原。在一个实施方案中，相应抗原是癌相关抗原，例如，本文所述的癌相关抗原，例如，CD19。在另一个实施方案中，配体是抗独特型抗体，例如，抗CD19独特型抗体。
在一个实施方案中，配体(例如，相应抗原分子或抗独特型抗体)连接至基质。在一个实施方案中，基质是固相支持物。在一个实施方案中，基质选自微量滴定板(例如，ELISA板)；膜(例如，硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、乙酸酯衍生物、及其组合)；纤维基体、琼脂糖凝胶基体、糖基体；塑料片；玻璃片；或任何类型的珠(例如，Luminex珠、磁珠(例如，Dyna珠)、流式细胞术珠及其组合)。在一个实施方案中，基质是ELISA板。在另一个实施方案中，基质是磁珠，例如，Dyna珠。
在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞和配体包被(例如，抗原包被)的珠按1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或15:1珠/免疫效应细胞的比率存在。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞和配体包被(例如，抗原包被)的珠按3:1珠/免疫效应细胞的比率存在。
在一个实施方案中，反应混合物还包含一种或多种用于增强增殖和/或成活力的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、例如以下一、二、三、四、五种或更多种：白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGFβ和TNF-α或用于细胞生长的任何其他添加物。在一个实施方案中，反应混合物还包含IL-15和/或IL-7。在一个实施方案中，将细胞在IL-2存在下扩张。
在一个实施方案中，反应混合物中的多个细胞群体包含以下一者或两者：编码第一CAR分子的核酸和编码第二CAR分子(例如，本文所述的CAR)的核酸。
在一个实施方案中，编码第一CAR的核酸是如本文所述的体外转录的RNA。
在一个实施方案中，编码第二CAR的核酸是载体，选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向相同的相应抗原分子。
在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向不同的相应抗原分子。
在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的相同癌相关抗原。
在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的不同癌相关抗原。
在一个实施方案中，第一CAR选自本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR；并且第二核酸编码本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR。
在一个实施方案中，反应混合物还包含低温保护剂或稳定剂，例如，糖、寡糖、多糖和多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐和冠醚。在一个实施方案中，低温保护剂是葡聚糖。
本文在名为“方法、制备物和反应混合物的其他实施方案”的部分中描述了方法的额外特征和实施方案。
CAR分子
根据本文所述的方法、制备物和反应混合物，免疫效应细胞，例如，通过本文所述的方法获得的免疫效应细胞，可以被工程化以含有靶向一种或多种癌相关抗原的CAR分子(本文也称作“CAR”)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
在一些实施方案中，癌相关抗原(肿瘤抗原)选自以下一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319，和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Ab1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标志物7相关的(TEM7R)；Claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(glycoceramide)的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟)，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；legumain；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一个实施方案中，由CAR分子靶向的癌相关抗原是CD19，例如，本文所述的CD19CAR(例如，CTL019)。在一个实施方案中，CD19 CAR包含表4中所示的氨基酸或具有表4中所示的核苷酸序列。
在一些实施方案中，CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域或驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，CAR分子的跨膜结构域包含这样的跨膜结构域，所述跨膜结构域选自以下者的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和/或NKG2C。
在某些实施方案中，CAR分子的跨膜结构域包含了具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰的CD8跨膜结构域的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:6的序列。
在其他实施方案中，编码CD8跨膜结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:17的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在某些实施方案中，抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含CD8铰链区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:2；或IgG4铰链区的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:36，或与SEQ ID NO:2或36具有95-99％同一性的序列。在其他实施方案中，编码铰链区的核酸序列包含分别对应于CD8铰链区或IgG4铰链区的SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:37的序列或与SEQ ID NO:13或37具有95-99％同一性的序列。
在其他实施方案中，CAR包含胞内信号传导结构域，例如，初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
在某些实施方案中，初级信号传导结构域包含了选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10和DAP12的蛋白质的功能性信号传导结构域。
在一个实施方案中，CAR分子的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。CD3ζ初级信号传导结构域可以包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰，或包含与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列。在其他实施方案中，编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，CAR分子的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如，胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域包含蛋白质的功能性信号传导结构域，所述蛋白质选自以下一种或多种：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或NKG2D。
在一些实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体包含细胞的混合物，所述细胞含有具有两种或更多种胞内信号传导结构域的CAR分子。在实施方案中，免疫效应细胞群体包含一种或多种包含CD28信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域的CAR。例如，第一免疫效应细胞包含了包含CD28信号传导结构域的CAR分子，并且第二免疫效应细胞包含了包含4-1BB信号传导结构域的CAR分子。包含CD28信号传导结构域和/或4-1BB信号传导结构域的CAR分子的表达可以是瞬时或稳定的。
在某些实施方案中，CAR分子的共刺激信号传导结构域包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不多于20、10或5个修饰，或包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:7或SEQID NO:16的序列。在其他实施方案中，编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:15的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在其他实施方案中，CAR分子的胞内结构域包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列和SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的序列，其中包含胞内信号传导结构域的氨基酸序列在相同的可读框中作为单条多肽链表达。
在其他实施方案中，编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:15的序列或与其具有95-99％同一性的序列，及SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:21的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，CAR还包含前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQID NO:1的序列。
在某些实施方案中，CAR分子的抗原结合结构域具有10-4M至10-8M的结合亲和力KD。
在一个实施方案中，CAR分子的抗原结合结构域是本文所述的抗原结合结构域，例如，本文所述的针对上文提供的靶的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，CAR包含本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR。
在一些实施方案中，CAR包含CD19 CAR，例如，本文所述的CD19 CAR。在实施方案中，CD19 CAR包含本文(例如，在表1或4中)所述的抗原结合结构域。
在其他实施方案中，CAR的抗原结合部分识别并结合至间皮素蛋白的胞外结构域。示例性间皮素CAR序列例如存在于国际公开号WO 2013/040557 A2中，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
治疗方法/联合疗法
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法。该方法包括向受试者施用有效量的免疫效应细胞群体，其中通过以下方式扩张或事先扩张免疫效应细胞群体：使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸在适于瞬时表达CAR的条件下接触，其中CAR靶向相应抗原分子；并且在配体，例如，相应抗原分子或抗独特型抗体分子存在下培养免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，核酸是RNA，例如，体外转录的RNA。在另一个实施方案中，相应抗原分子是癌相关抗原分子。在一个实施方案中，相应抗原分子或抗独特型抗体分子连接至基质，例如，珠。
在一些实施方案中，该方法还包括向受试者施用包含第二CAR(例如，包含编码第二CAR的核酸的载体)的免疫效应细胞群体，其中将免疫效应细胞群体如本文所述那样扩张或事先扩张。在一个实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
在一个实施方案中，用载体转导免疫效应细胞群体一次，例如在从受试者的血液样品中获得免疫效应细胞群体(例如，通过单采血液成分术获得)后一天内。在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向相同的相应抗原分子。在一个实施方案中，第一CAR靶向相应抗原分子并且第二CAR靶向不同的相应抗原分子。在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的相同癌相关抗原。在一个实施方案中，第一CAR靶向本文所述的癌相关抗原并且第二CAR靶向本文所述的不同癌相关抗原。
在一个实施方案中，第一CAR是本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR；并且第二核酸编码本文所述的ROR1 CAR、CD19 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3 CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR。
根据治疗如本文所述的病症(例如，癌症)和提供本文所述的抗肿瘤免疫的方法，在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用通过本文所述方法产生的CAR分子或免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，免疫效应细胞群体经工程化以表达CAR分子，例如本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR。
本文中还提供了组合物，所述组合物包含含有CAR分子(例如，如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞(例如，如本文所述那样产生的免疫效应细胞群)，用于治疗患有与表达肿瘤抗原相关的疾病(例如，如本文所述的病症)的受试者。
在一个实施方案中，癌症是血液学癌，例如，ALL或CLL。在一个实施方案中，癌症，例如，本文所述的血液学癌，例如，白血病(例如，ALL或CLL)或淋巴瘤(例如，MCL、HL、或NHL)。
在一个实施方案中，与肿瘤抗原(例如本文所述的肿瘤抗原，例如CD19)相关的疾病选自增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如骨髓增生异常，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或是与表达本文所述肿瘤抗原相关的非癌症相关适应症。在一个实施方案中，疾病是本文所述的癌症，例如本文所述为与本文所述靶相关的癌症。在一个实施方案中，血液学癌是白血病。在一个实施方案中，癌选自：一种或多种急性白血病，包括但不限于B-ALL、T-ALL、ALL；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)；额外的血液学癌或血液学病状，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、瓦尔登氏巨球蛋白血症、和/或“白血病前期”(例如，依据髓样血细胞的无效产生(或异型增生)归并的多样血液学病状集合)。在某些实施方案中，与表达本文所述的肿瘤抗原相关的疾病包括但不限于表达如本文所述的肿瘤抗原的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病；及其任意组合。
在实施方案中，与表达肿瘤抗原相关的疾病选自与表达肿瘤抗原相关的增生性疾病、癌前期病状、癌症和非癌症相关适应症。
在另一个实施方案中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。在实施方案中，癌症选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊枢椎肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、Kaposi肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境引起的癌、所述癌的组合和所述癌的转移性损害。
在前述任一方法或用途的某些实施方案中，与疾病相关的肿瘤抗原选自以下一种或多种：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、FAP、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、legumain、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
在一个实施方案中，细胞群体相对于施用该群体的受试者为自体。在一个实施方案中，细胞群体相对于施用该群体的受试者为同种异体的。在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，扩张用编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19CAR)的核酸转导的免疫效应细胞群体，例如，通过本文所述的方法扩张。在一个实施方案中，将细胞扩张8天或更短(例如，7、6、5、4或3天)时间。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)培养扩张5天，并且所产生的细胞比(例如，如本文所述的)相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞更为强力。
在一个实施方案中，向受试者施用104至106个免疫效应细胞/kg受试者的体重。在一个实施方案中，受试者接受免疫效应细胞群体的初始施用(例如，每kg受试者的体重初始施用104至106个免疫效应细胞，例如，每kg受试者的体重104至105个免疫效应细胞)，许多所述免疫效应细胞包含编码CAR，例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR的核酸和一次或多次后续施用免疫效应细胞群体(例如，一次或多次后续施用104至106个免疫效应细胞/kg受试者体重，例如，每kg受试者体重104至105个免疫效应细胞)，许多所述免疫效应细胞包含编码CAR，例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR的核酸。在一个实施方案中，一次或多次后续施用在前次施用之后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天，例如，在前次施用之后少于4、3、2天施用。在一个实施方案中，受试者在至少三次施用免疫效应细胞群体的过程中接受总共约106个免疫效应细胞/kg受试者的体重，例如，受试者接受1x 105个免疫效应细胞的初始剂量，第二次施用3x 105个免疫效应细胞，以及第三次施用6x105个免疫效应细胞，并且例如每次施用在前次施用后少于4、3、2天执行。
在某些实施方案中，这些方法或使用与增加免疫效应细胞的功效的物质(例如，如本文所述的物质)组合实施。
例如，在一个实施方案中，该物质可以是对抑制性分子抑制的物质。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如抑制性分子如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFβ、或这些分子中任一者的片段(例如，这些分子中任一者的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和作为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与改善与施用表达CAR分子的细胞相关的一种或多种副作用的物质(例如，本文所述的物质)组合施用。
在一个实施方案中，CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)与B细胞抑制剂组合施用。例如，将表达CD19 CAR的细胞与一种或多种额外的B细胞抑制剂组合施用。在一些实施方案中，B细胞抑制剂是第二种CD19抑制剂。在一些实施方案中，B细胞抑制剂是以下一者或多者的抑制剂：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。
在一些实施方案中，B细胞抑制剂是小分子抑制剂；与B细胞抗原(例如，以下一种或多种：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)结合的多肽，例如，可溶性配体、抗体或其抗原结合片段；或抑制性核酸(例如，双链RNA(dsRNA)、小干扰性RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA))。在其他实施方案中，B细胞抑制剂是表达与B细胞抗原(例如，以下一种或多种：CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)结合的CAR的细胞(例如，表达CAR的免疫效应细胞)。
在一个方面，CAR(例如，CD19 CAR、间皮素CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR、FLT-3CAR、CD79b CAR、CD179b CAR或CD79a CAR)包含任选的前导序列(例如，本文所述的任选的前导序列)、胞外抗原结合结构域、铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、和胞内刺激性结构域(例如，本文所述的胞内刺激性结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激结构域(例如，本文所述的胞内共刺激结构域)和胞内刺激性结构域。
受试者
在一个实施方案中，受试者，例如，从中获得免疫效应细胞的受试者和/或治疗的受试者，是人类，例如，癌症患者。
在某些实施方案中，受试者患有与表达肿瘤相关或癌相关抗原相关的疾病，例如，如本文所述的疾病。在一个实施方案中，受试者患有癌症，例如，如本文所述的癌症。
在一个实施方案中，受试者患有选自血液学癌、实体瘤或其转移性损害的癌症。示例性癌包括但不限于B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞早幼粒细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤和瓦尔登氏巨球蛋白血症。在一个实施方案中，癌是ALL。在另一个实施方案中，癌是CLL。
在实施方案中，受试者未患有复发的癌。在其他实施方案中，受试者患有复发的癌。
在一个实施方案中，获得免疫细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如，从患有血液学癌(例如，白血病(例如，CLL、ALL)或淋巴瘤(例如，MCL、NHL或HL)的受试者获得。
方法、制备物和反应混合物的其他实施方案
根据本文所述的治疗和/或产生(例如，扩张和/或活化)方法、制备物和反应混合物，在实施方案中，方法还包括从免疫细胞群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞，以由此提供适于表达CAR的调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的细胞)群体。
在一个实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞群体包括患有癌症的受试者(例如患有表达CD25的癌症(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL))的受试者)的细胞。在一个实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞。
在一个实施方案中，免疫细胞群体相对于将施用细胞供治疗的受试者是自体的。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体相对于将施用细胞供治疗的受试者是同种异体的。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与基质(例如，珠)缀合、或包被在基质(例如，珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的基质缀合。
在一个实施方案中，使用来自MilitenyiTM的CD25消耗试剂从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+ T细胞。在一个实施方案中，细胞对CD25消耗试剂的比率是1e7个细胞对20uL、或1e7个细胞对15uL、或1e7个细胞对10uL、或1e7个细胞对5uL、或1e7个细胞对2.5uL、或1e7个细胞对1.25uL。
在一个实施方案中，调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的细胞)群体适于表达本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR。在一个实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的白血病细胞，例如，CLL细胞、ALL细胞，或淋巴瘤细胞，例如，MCL细胞、NHL细胞或HL细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体从患有CLL的受试者获得，并且调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的细胞)群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的白血病细胞(例如，CLL细胞)并且适于表达本文所述的CD19 CAR。在一个实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。在一个实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。
在一个实施方案中，产生方法还包括从群体移除表达肿瘤抗原(例如，不包括CD25，例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b的肿瘤抗原)的细胞，以由此提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗)和肿瘤抗原消耗的细胞群体。在一个实施方案中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同基质(例如，珠)，或抗CD25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除所述细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。在一个实施方案中，产生方法还包括从群体移除表达检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者(例如，一种、二种或三种)，以由此提供调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的细胞)和检查点抑制蛋白消耗的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞)的群体。在一个实施方案中，将表达检查点抑制蛋白的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗CD25抗体或其片段或者抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达检查点抑制蛋白的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性T细胞，也不是肿瘤细胞，而是不利影响CART细胞的扩张和/或功能的细胞，例如，表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标志物的细胞。在一个实施方案中，构思将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述消耗后或按另一个顺序移除。
在一个实施方案中，该方法还包括从群体移除表达CD14的细胞，以由此提供调节性T细胞消耗(例如，CD25+细胞消耗)和CD14+细胞消耗群体。在一个实施方案中，将CD14+细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗CD14抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠；或抗CD25抗体或其片段或者抗CD14抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，T调节细胞例如CD25+细胞的移除以及CD14+细胞的去除是依次的，并且可以按任一顺序发生。
在一个实施方案中，已经基于以下一种或多种标志物(例如1、2、3、4、5、6、7或更多种标志物)的表达选择提供的免疫效应细胞群体：CD3、CD28、CD4、CD8、CD27、CD127、CD45RA和CD45RO，例如，提供的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体是CD3+和/或CD28+。
在一个实施方案中，该方法还包括获得就以下一种或多种标志物(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种标志物)表达而言富集的免疫效应细胞(例如T细胞)群体：CD3、CD28、CD4、CD8、CD27、CD127、CD45RA和CD45RO。在一个实施方案中，免疫效应细胞群体就CD3+细胞和/或CD28+细胞而言富集。例如，获得通过与抗CD3/抗CD28缀合的珠温育分离的T细胞。在一个实施方案中，所述方法还包括从调节性T细胞消耗(例如，CD25+细胞消耗)群体选择细胞，所述细胞表达以下一种或多种标志物(例如1、2、3、4、5、6、7种或更多种标志物)：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。
在一个实施方案中，该方法还包括例如通过本文所述的方法，活化调节性T细胞消耗(例如，CD25+细胞消耗)群体。
在一个实施方案中，产生方法还包括用包含编码CAR(例如本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR)的核酸的载体转导来自调节性T细胞消耗群体(例如，CD25+细胞消耗群体)的细胞。在一个实施方案中，载体选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，来自调节性T细胞消耗群体(例如CD25+细胞消耗群体)的细胞用载体转导一次，例如在从受试者的血液样品中获得免疫效应细胞的群体(例如通过单采血液成分术获得)后一天内。
在一个实施方案中，该方法还包括从调节性T细胞消耗群体(例如，CD25+细胞消耗群体)产生瞬时表达外源RNA的RNA工程化细胞群体。该方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入来自所述群体的细胞中，其中所述RNA包含编码CAR，例如本文所述的CAR，例如本文所述的CD19 CAR的核酸。
在一个实施方案中，将细胞在适当的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩张，所述培养基可以任选地含有一种或多种用于增殖和/或成活力的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGFβ和TNF-α或任何其他用于细胞生长的添加物。
在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩张，所述培养基包含导致细胞在14天扩张期间内增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)(例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量)的一种或多种白介素。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩张。
在一个实施方案中，将细胞在适当的扩张期间后低温保存。在一个实施方案中，将细胞根据本文所述的方法低温保存。在一个实施方案中，将扩张的细胞在合适的介质(例如，可输注性介质)中低温保存，例如，如本文所述。
在一个实施方案中，产生方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。在一个实施方案中，核酸是DNA或RNA。
在一个实施方案中，该方法还包括在扩张之前从群体中除去T调节细胞，例如CD25+ T细胞，从而提供调节性T细胞消耗(例如，CD25+细胞消耗)的待扩张群体。在一个实施方案中，通过本文所述的方法除去T调节细胞，例如CD25+细胞。
在一个实施方案中，该方法还包括在扩张之前从群体中除去T调节细胞，例如CD14+细胞，从而提供CD14+细胞消耗的待扩张群体。在一个实施方案中，通过本文所述的方法除去T调节细胞，例如CD14+细胞。
在一个实施方案中，该方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸接触。在一个实施方案中，核酸是DNA或RNA。
在实施方案中，该方法包括使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸和编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸在允许表达CAR和端粒酶的条件下接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是RNA。在另一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在实施方案中，产生方法包括使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸和编码端粒酶亚基(例如hTERT)的RNA在允许表达CAR和端粒酶的条件下接触。
在一个实施方案中，编码CAR的核酸和编码端粒酶亚基的RNA是相同核酸分子的组成部分。在一个实施方案中，编码CAR的核酸和编码端粒酶亚基的RNA是独立核酸分子的组成部分。
在一个实施方案中，该方法包括使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸和编码端粒酶亚基的RNA基本上同时接触。在一个实施方案中，产生方法包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基的RNA接触之前，使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸接触。在一个实施方案中，该方法包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基的RNA接触后，使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的RNA是mRNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的RNA包含聚腺苷酸尾。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的RNA包含5'帽结构。
在一个实施方案中，该方法包括用编码端粒酶亚基的RNA转染免疫效应细胞。在一个实施方案中，产生方法包括用编码端粒酶亚基的RNA转导免疫效应细胞。在一个实施方案中，产生方法包括在允许表达CAR和端粒酶的条件下用编码端粒酶亚基的RNA电穿孔免疫效应细胞。
在实施方案中，该方法包括提供表达CAR和/或包含编码CAR的核酸的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群体；并使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如hTERT)的核酸在允许表达hTERT的条件下接触。
在实施方案中，该方法包括提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群体，所述免疫效应细胞群体表达编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸；并使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸在允许表达CAR的条件下接触。
免疫效应细胞制备物
在一些实施方案中，通过本文所述的方法产生本文所述的免疫效应细胞制备物(例如，反应混合物或免疫效应细胞群体)。
在实施方案中，已经基于一种或多种标志物(例如，CCR7、CD62L、CD45RO和CD95)的表达选择免疫效应细胞群体，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞)群体为CCR7+和CD62L+。
在实施方案中，基于CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95-的表达模式鉴定幼稚T细胞，其中基于CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95+的表达模式鉴定干中央记忆T细胞，并且其中基于CCR7+、CD62L+、CD45RO+、CD95+的表达模式鉴定中央记忆T细胞。
在实施方案中，本文所述的免疫效应细胞制备物包含编码CAR(例如，如本文所述的CAR)的核酸。
在实施方案中，本文所述的免疫效应细胞制备物包含编码外源端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸。在一个实施方案中，编码外源端粒酶亚基的核酸是RNA，例如，mRNA。
在实施方案中，本文所述的免疫效应细胞制备物包含CAR，例如，如本文所述的CAR；和外源端粒酶亚基，例如，hTERT。在一个实施方案中，细胞不包含括编码外源端粒酶亚基的DNA。例如，细胞可能已经与编码外源端粒酶亚基的mRNA接触。
在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物是含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％CD25+细胞的调节性T细胞消耗群体。在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物是调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％表达CD25的肿瘤细胞(例如，CLL细胞)。在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物含有少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物含有少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。
在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物是调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％表达检查点抑制蛋白的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞或TIM3+细胞。
在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物是调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD14+细胞。
在实施方案中，本文所述的免疫效应细胞制备物包含自体免疫效应细胞群体，例如，多个所述细胞用包含编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR)的核酸分子的载体转染或转导，其中免疫效应细胞制备物含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物含有少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞制备物含有少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如，表达CD25的肿瘤细胞，例如，CLL细胞。
在一个实施方案中，反应混合物还可以包含活化和/或扩张群体中细胞的物质，例如，例如刺激CD3/TCR复合体相关信号的药剂和/或刺激细胞表面上共刺激分子的配体，例如，如本文所述。在一个实施方案中，所述物质是与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
在实施方案中，本文所述的反应混合物包含调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。在一个实施方案中，反应混合物包含调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。在一个实施方案中，细胞群体含有少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。在一个实施方案中，细胞群体含有少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于10％、5％、4％、3％、2％、1％的肿瘤细胞，例如表达CD25的肿瘤细胞，例如CLL细胞。
在一个实施方案中，反应混合物包含调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％表达检查点抑制蛋白的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞或TIM3+细胞。反应混合物还可以包含缓冲液或其它试剂，例如含有PBS的溶液。
在一个实施方案中，反应混合物包含调节性T细胞消耗群体，所述群体含有少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞和少于50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD14+细胞。反应混合物还可以包含缓冲液或其它试剂，例如含有PBS的溶液。
在一个实施方案中，反应混合物还包含一种或多种用于增殖和/或成活力的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、TGFβ和TNF-α或用于细胞生长的任何其他添加物。在一个实施方案中，反应混合物还包含IL-15和/或IL-7。
在一个实施方案中，反应混合物中的多个细胞群体包含核酸分子，例如，本文所述的核酸分子，所述核酸分子包含例如，如本文所述的编码CAR的序列，例如，编码CD19 CAR的序列。
在一个实施方案中，反应混合物中的多个细胞群体包含载体，所述载体包含编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR)的核酸序列。在一个实施方案中，载体是本文所述的载体，例如选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体的载体。
在一个实施方案中，反应混合物还包含低温保护剂或稳定剂，例如，糖、寡糖、多糖和多元醇(例如，海藻糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐和冠醚。在一个实施方案中，低温保护剂是葡聚糖。
在实施方案中，反应混合物包含免疫效应细胞群体和IL-7和/或IL-15，其中反应混合物中的多个细胞群体包含核酸分子，例如，本文所述的核酸分子，所述核酸分子包含例如，如本文所述的编码CAR的序列，例如，编码CD19 CAR的序列。
在一个实施方案中，反应混合物中的多个细胞群体包含载体，所述载体包含编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR)的核酸序列。在一个实施方案中，载体是本文所述的载体，例如选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体的载体。
本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从权利要求书中显而易见。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或检验本发明，仍在下面描述了合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。
附图简述
图1A-1D显示了γc细胞因子和IL-18对CAR-T细胞积累的差异作用。图1A是C4-27zCAR载体的示意图。图1B是显示CAR-T细胞响应于各种细胞因子暴露的总体累积的图。将T细胞转导并从接下来的天(第0天)暴露于终浓度为10ng/mL的各种外源性细胞因子。基于T细胞数和CAR表达百分数计算CAR-T细胞数目。图中是6个供体的表示值。*P<0.05，***P<0.001。NC，无细胞因子。图1C是显示响应于各种细胞因子的T细胞增殖的直方图。慢病毒转导后第7天，NC组T细胞用CFSE(2.5μM)标记，然后暴露于多种细胞因子。七天后，通过流式细胞术分析T细胞的CFSE稀释。图1D是显示慢病毒转导后15天T细胞成活力的图。来自各种细胞因子组的T细胞用膜联蛋白V(Annexin V)和7-AAD染色，然后分析活细胞的比例(膜联蛋白V和7-AAD阴性)。相对于IL-2组，*P<0.05，**P<0.01(n＝6)。
图2A-2F显示了CAR-T细胞的记忆T细胞亚组。图2A显示转导前T细胞的CD45RA+CD62L+亚群的CD95表达和在转导后15天CAR-T细胞的CD45RA+CD62L+亚群中的CD95表达。图2B和2C是显示慢病毒转导后CD4+T细胞(图2B)和CD8+T细胞(图2C)中记忆干T细胞(Tscm)比例增加的图。Tscm定义为CD45RA+CD62L+CD95+CCR7+T细胞亚组。图2D是显示转导前T细胞中幼稚T(Tn，定义为CD45RA+CD62L+CD95-亚群)的量与转导后CAR-T细胞中Tscm的比例之间的相关性的图(n＝6)。左侧条形表示转导前CD4+和CD8+T细胞中Tn的百分比，右侧条形表示CD4+和CD8+ CAR-T细胞中Tscm的百分比。*P<0.05，**P<0.01。图2E是显示不同亚组的CAR-T细胞的自我更新和分化的图表。暴露于IL-2(10ng/mL)培养FACS分选的CAR+Tscm，Tcm，Tem和Temra细胞3天，然后基于CD45RA和CD62L表达(n＝3)分析表型。图2F是直方图，显示响应IL-2的CAR-T细胞各种亚组的增殖。用CFSE(2.5μM)标记FACS分选的CAR+Tscm，Tcm，Tem和Temra细胞，然后暴露于IL-2(10ng/mL)培养3天。三天后，分析T细胞的CFSE稀释。
图3A-3B显示了CD45RA表达与CFSE强度之间的相关性。图3A阐明CD45RA表达与CFSE强度成反相关。图3B显示，对于所有细胞因子组(IL-2，IL-7，IL-15，IL-18和IL-21)，CD45RA+T细胞显示出比CD45RA暗和阴性T细胞低得多的CFSE水平，表明CD45RA+T细胞具有比CD45RA-T细胞更强的增殖活性。
图4显示了暴露于不同细胞因子导致的CAR-T细胞的表型。图4是一系列图，显示了在指定的细胞因子组中CAR-T细胞表面上CD45RA、CD62L、CCR7、CD27、CD28和IL7Rα表达通过FACS的定量。直方图表示来自6个独立供体的表达水平的平均值±SEM。相对于IL-2组，*P<0.05、**P<0.01。
图5A-5D显示了暴露于不同细胞因子的CAR-T细胞的功能分析。图5A、5B和5C是定量图，显示用于产生IFNγ(图5A)，TNF-α(图5B)和IL-2(图5C)的各种细胞因子组(n＝6)中产生细胞因子的CAR-T细胞百分比。将慢病毒转导的T细胞暴露于指定的细胞因子14天，然后与SKOV3细胞共培养5小时，然后收获用于流式细胞术分析。图5D是显示CAR-T细胞的抗原特异性细胞毒活性的图。在指示的细胞因子暴露后14天，以指定的E/T比与SKOV3共同培养18小时后，通过使用基于萤光素酶的测定法，来评估CAR-T细胞的细胞溶解能力。未转导的T细胞(UNT)用作阴性效应细胞对照。显示的数据是六次独立细胞溶解测定的平均值±SEM。
图6A-6C显示了上述图5中所述的CAR-T细胞的表型和功能。图6A和6B显示当与CD62L-CAR-T细胞(Tem和Temra)相比时，CD62L+ CAR-T细胞(Tscm和Tcm)表现出较少的细胞因子产生活性(图6A和6B)和较弱的细胞溶解能力(图6C)。
图7A和7B显示了暴露于抗原攻击的CAR-T细胞的扩张和表型。图7A描述了两个图，其显示了在抗原攻击后先前暴露于指定细胞因子的CAR-T的总累积和存活力。暴露于指定细胞因子的T细胞在第15天收获，然后与SKOV3以5:1的E/T比率共培养7天。计算CAR-T细胞的扩张，并在第七天评估T细胞的存活力。图7B是两个图，其显示各种细胞因子组中CD4+和CD8+CAR-T细胞的记忆T亚组的分布。N.S.，无统计学差异。
图8A-8C显示了具有先前细胞因子暴露的各种CAR-T细胞的抗肿瘤活性。图8A显示了用各种细胞因子暴露的C4-27z CAR-T细胞，抗CD19-27z CAR-T细胞和未转导的T细胞处理的小鼠的肿瘤生长曲线。数据以平均值±SEM表示。箭头表示T细胞输注的时间。图8B是显示在第一次剂量的CAR-T细胞输注后15天小鼠外周血中循环的人CD4+和CD8+T细胞计数的定量图。图8C是显示小鼠血液中循环的人CD4+和CD8+T细胞上CAR表达的定量图。
图9是来自单采血液成分术的细胞、用抗CD3/CD28选择的细胞、CD25消耗的细胞和富含CD25的细胞的一系列FACS图(顶部)，显示了CD3和CD19群体；和直方图(底部)，显示了CD14表达。
图10A、10B和10C显示了CD3/CD28选择的细胞和CD25消耗的细胞之间的增殖能力的比较。图10A是显示培养中在指定日的总细胞数的图。图10B是显示培养中每个指定日的定量群体倍增的图。图10C显示培养中指定日的活细胞百分比。
图11是一系列FACs图，显示了用指定的细胞因子补充剂IL-7、IL-15或IL-7和IL-15培养后未经操作的PBMC和CD25消耗的PBMC中CD3和CD19的分布。
图12是显示已经用抗CD3和CD28珠刺激、并且保留为未经操作的(UTD)或用CD19CAR转导的(CD19.BBz)、脱珠、然后在第5天和第9天收获的PBMC的群体倍增(图17A)和平均大小(fL)(图17B)的扩张谱的图。
图13是包括将细胞毒性表示为用PMBCs处理的表达CD19的K562细胞的百分比溶解，所述PMBCs已经用抗CD3和CD28珠刺激，并且保留为未经操作的(UTD)或用CD19 CAR转导的(CD19.BBz)，脱珠，然后在第5天和第9天收获。
图14是一组图，描述用抗CD3和CD28珠(3×28珠)刺激的PBMC，野生型K562细胞，表达CD19的K562细胞，ALL细胞(Nalm6)或CLL细胞(PI14)的增殖。将PBMC保持未经操作(UTD)或用CD19 CAR(CART19)转导，脱珠，然后在第5天和第9天收获。
图15是示例性制造方案的示意图。
图16是示例性制造方案的示意图。
图17是一组图，描述两个不同制造批次的用CTL019 CAR转染的供体细胞，即CHP959-115和CHP959-121在0至9天期间扩张的细胞增殖水平的图。
图18是一组图，显示在单采血液成分术后0至9天，两种不同制造批次的用CTL019CAR转染并扩张的供体细胞(即CHP959-115)或用ss1-mesoCAR转染并扩张的供体细胞(即CHP959-121)的促炎细胞因子：IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-4的产生的图。
图19是一组图，描述用抗CAR19独特型抗体珠或对照珠刺激，用CTL019CAR转染并扩张5至9天的供体细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-2、IL-1β、GM-CSF和IL-4的产生水平。用对照珠没有检测到细胞因子或检测到低细胞因子水平(<200pg/ml)。
图20是描述了使用Nalm6(ALL)细胞的萤光素酶测定法，基于保持未操作(UTD)或用CD19 CAR(CART19)转导，脱珠，然后在第5天和第9天收获的PBMC的总裂解物的细胞杀伤图。培养多种比例的PMBCs与Nalm6细胞(效应物(E)：靶标(T))。如图所示，在第5天收获的CART19细胞具有更好的杀伤能力。
图21是描述未经操作(UTD)或用CD19 CAR(CART19)转导，脱珠，然后在第5天和第9天收获的PBMC的长期体内杀伤能力的图。将PBMC引入接种Nalm6细胞的非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠。
图22是用间皮素CART，使用间皮素包被的珠用于扩张细胞的示意图。
图23是实施例4的研究设计的示意图。
图24A和图24B是描述图23中所示细胞类型的群体倍增(图24A)和细胞尺寸(图24B)的图。
图25A和图25B是描述5天后(图25A)和11天后(图25B)转导效率的图。
图26A和图26B显示间皮素CAR构建体和表达水平。图26A是实施例4中所用的不同CAR构建体的示意图。
图27A-27C显示通过间皮素CAR刺激扩张培养中的外周血T细胞和脐带血CD8 T细胞。图27A中显示CD8 T细胞。图27B中显示CD4 T细胞。图27C中显示脐带血CD8 T细胞。
图28显示通过其相应抗原，借助T细胞表面上瞬时表达的嵌合抗原受体(CAR)进行刺激的方法示意图。
图29是使用CAR与其相应抗原包被的珠用于扩张细胞的示意图。
图30A和图30B是描述暴露于间皮素包被的珠后表达间皮素CAR的细胞的群体倍增(图30A)和细胞尺寸(图30B)的图。
图31A-图31C是显示培养物中用间皮素CAR(图31A)或CD19 CAR(图31B)刺激的外周血T细胞扩张和用间皮素CAR(图31C)刺激的脐带血CD8 T细胞扩张的图。
图32A-32C显示实施例6的CAR构建体和研究设计。图32A是实施例6中比较的CAR构建体的示意图。两种CAR均含有识别人CD19的FMC63抗体的单链可变片段或结合人间皮素的SS1 scFv。显示跨膜(TM)和胞内结构域。图32B是描述与无CAR电穿孔仅(模拟)对照相比，在第1天电穿孔后CAR的细胞表面表达的流式细胞术分析的图。右小图显示用抗‐独特型试剂检测的CAR的平均荧光强度(MFI)。数据代表采用来自超过25个体健康人供体的细胞验证的独立实验。图32C是研究设计的示意图。将CD8+ T细胞用体外转录的RNA电穿孔。在允许细胞休息过夜后，证实CAR表达并且体外培养在相应抗原包被的珠和细胞因子存在下开始。
图33A-33E显示BBz ICD在体外向CD8 T细胞提供生存和增殖优势。图33A显示与相应抗原共培养后24小时细胞表面上测量的CD69水平。图33B显示CD19 CAR T细胞生长；将CD4+和CD8+ T细胞如图33A中和如实施例6中所述那样刺激。数据是至少十名不同健康供体的表示值。图33C显示大量CD8+ T细胞(左)或幼稚(CD45RO‐CD62L+CD8+)T细胞(右)的间皮素CAR T细胞生长。使用间皮素Fc包被的珠刺激CAR T细胞。图33D显示在培养期间于指定时间点处CAR T细胞上CCR7和CD45RO的细胞表面表达的代表性图(来自至少六名供体)。显示的细胞已经对活的CD3+CD8+ T细胞预设门。显示的数字是每种门中检测到的细胞的百分数。图33E显示在不同时间点28z和BBzCD19 CAR T细胞培养物中Tcm和Tem亚群的相对变化。在指定的时间点计算每个群体的绝对活细胞数目。这些图显示BBz CAR T细胞中对28z CART细胞归一化的Tcm或Tem的相对倍数变化。将数据作为均数±SEM作图(****，p<0.0001、**，p＝<0.01)。
图34A-34M显示CAR信号传导结构域对CAR T细胞的细胞代谢和偏好依赖于糖酵解或脂肪酸氧化的影响。如图34A-34D中所示，BBz CAR T细胞显示升高水平的氧消耗和储备呼吸能力。图34A显示用抗独特型刺激表达28z和BBz信号传导结构域的CD19 CAR CD8+ T细胞后抗原刺激对平均细胞容积的影响。如该图中所示，28z和BBz CAR T细胞具有可比较的平均细胞尺寸，如第0、7和20天测量。图34B显示在第0天基线时(在CAR mRNA电穿孔后和刺激之前)和在第7天和第21天基础条件下和响应于线粒体抑制剂下培养时刺激后28z和BBzCAR T细胞的耗氧率(OCR)，如实施例6中具体说明。在第7天和第21天测量基础OCR水平(图34C)、基础OCR/ECAR比率(图34D)、最大呼吸水平(图34F)和基础ECAR水平(图34G)(揭示BBzCAR T细胞中OXPHOS偏好性升高)。数据是用来自至少五名健康人类供体的细胞进行的至少五个独立实验的表示值，作图为均数±SEM(*，p<0.05)。图34E显示在28z和BBz CAR T细胞中评估的参与糖酵解代谢和脂质氧化的基因的相对mRNA表达水平。图中代表从四名独立供体获得细胞的至少三个独立实验的数据(**，p<0.01；*，p<0.05)。数据表示为均数±SEM。图34H-34J显示对不同记忆表型分选的CAR T细胞所测量的基础OCR水平：中央记忆细胞(CM；图34H)、幼稚细胞(N；图34I)和效应记忆细胞(EM；图34J)。数据是用来自至少三名健康人类供体的细胞进行的至少三个独立实验的表示值并且作图为均数±SEM。图34K显示对分选的三个不同记忆亚群所测量的基础ECAR水平。数据是用来自至少三名健康人类供体的细胞进行的至少三次独立实验的表示值，作图为均数±SEM(*，p<0.05)。图34L显示在48小时期间对从胞外介质摄取葡萄糖和乳酸释放入介质的测量。图34M显示用[13C16]棕榈酸培养的T细胞中测量的标记乙酰CoA的百分数，以评估脂肪酸摄取和分解。
图35A-35C显示，BBz CAR T细胞显示出增强的储备呼吸能力(spare respiratorycapacity；SRC)。图35A显示作为FCCP处理细胞后的最大OCR水平对培养下稳态时的基础OCR水平之间比率所测量的SRC。数据代表测试的三名独立供体(*p<0.05)。图35B显示在三个不同时间点成像的28z和BBz CAR CD8+ T细胞的透射电子显微照片。比例尺代表2μm。图35C显示每个细胞的独立线粒体计数。数据代表20次独立随机选择的细胞(来自每种条件至少75个分析的细胞)，表示为均数±SEM(***，p<0.001)。
图36A-36D显示BBz CAR信号传导带有增强线粒体生物生成的T细胞遗传改变印迹。图36A显示用线粒体示踪剂(绿色)、DAPI(蓝色)和细胞膜染料DiI(红色)染色的共聚焦图像。比例尺代表2μm。图36B显示线粒体占据的细胞质百分数的定量，其计量为细胞膜封闭的区域(红色)内部线粒体示踪剂(Mitotracker)(绿色)的百分数。数据各自表示为在指定的时间点来自至少三张图像的均数±SEM，每张图像评定至少15个独立细胞。(****，p<0.0001)。图36C显示在指定的时间点BBz CAR T细胞中对28z CAR T细胞的表达水平归一化的线粒体细胞色素c氧化酶1(MT-CO1)和线粒体转录因子A(TFAM)的相对mRNA表达。数据从采用四名独立供体的至少三个独立实验获得(*，p<0.05)，表示为均数±SEM。图36D显示在指定的时间点与28z CAR T细胞相比，BBz CAR T细胞中胞核呼吸因子1(NRF1)和GA结合蛋白(NRF2)的归一化mRNA表达水平。数据从采用四名独立供体的至少三个独立实验产生(*，p<0.05)并且表示为均数±SEM。
图37显示二名其他独立供体的CD19-28z和CD19-BBz CAR T细胞的扩张概况。始终观察到BBz CAR T细胞继续在培养下增殖并存活更长。
图38显示二名其他独立供体的间皮素特异性CAR T细胞的扩张概况。始终观察到BBz CAR T细胞继续在培养下增殖并存活更长。
图39显示28z和BBz CAR T细胞在刺激之前(第0天)和在第7天和第21天基础条件下和在线粒体抑制剂存在下培养时28z和BBz CAR T细胞的耗氧率(OCR)，如实施例6中具体说明。对间皮素特异性CAR进行的代谢测定法揭示BBz-CAR刺激的细胞中更高的耗氧率。
图40显示二个CAR构建体之间的总群体倍增(CD19 CAR n＝10，p**＝<0.01，间皮素CAR n＝6，p*＝<0.05)，如图37和图38中所示。用针对珠上固定的CD19scFv或间皮素Fc的抗独特型抗体分别刺激CD19或SS1 CAR T细胞。
图41显示抗原暴露后细胞表面上的CAR表达水平和关键细胞因子受体表达水平。顶部小图显示与针对珠上固定的CD19 scFv的抗独特型抗体接合后T细胞表面上缺少任何可检测的CAR表达水平。这些图代表在抗原刺激之前表达CAR的在图32B中分析的相同细胞群体。底部小图显示如通过流式细胞术所分析的细胞表面上细胞因子受体IL-2Rα、IL-7Rα和IL-15Rα的水平。
图42显示28z和BBz CAR T细胞中如在第21天测量的线粒体含量的变化。在第21天成像的代表性28z和BBz CAR CD8+ T细胞的透射电子显微照片。比例尺代表2μm。
发明详述
本文所述的方法至少部分地基于以下发现：活化免疫效应细胞表面上表达(例如，瞬时表达)的CAR提供了扩张和/或活化免疫效应细胞群体的有效手段。如本文所述，借助其相应抗原或抗独特型抗体活化免疫效应细胞表面上的CAR可以导致细胞扩张。在一些实施方案中，这类细胞扩张可以在基本上不改变细胞的基因型或表型的情况下通过瞬时表达CAR(例如，通过体外转录的RNA)实现。本文所述的方法提供了超过先前使用的免疫效应细胞扩张方法的明显优势。
除用来扩张原代人T细胞之外，本文所述的方法可以用于扩张特定的T淋巴细胞亚群，包括幼稚细胞、调节性T细胞、Th-17细胞、无反应性T细胞和干T细胞或脐带血细胞。不希望受具体理论约束，本文所述的方法和组合物提供了超过常规系统的改善，因为通过TCR反复刺激可以对未经历抗原的T细胞是致死的。通过瞬时表达表面受体的单次刺激可以避免这种问题。另外，本文提供的方法允许在不扰动TCR的情况下将T细胞用于免疫治疗，导致培养物中快速分化较慢并促进“年幼”T细胞。在其他实施方案中，本文所述的方法能够使用载体如慢病毒载体实现高效率转导。
有利地，可以扩张缺少T细胞受体或具有功能减弱的T细胞受体的其他细胞类型。例如，任何类型的造血干细胞可以在不改变其表型的情况下扩张，并且可以扩张无反应性T细胞、TH17、NK、NKT和B细胞。
病毒介导的基因转移系统广泛用于临床前和临床免疫疗法研究。用于病毒介导基因转移入T淋巴细胞的现行方法需要活化细胞，随后添加病毒载体。这种活化过程常规地再次借助TCR刺激来完成。本文所述的基于CAR的刺激方法可以用来以载体如慢病毒载体实现高效率转导。通过瞬时表达的CAR刺激以实现初始活化，细胞可以用编码相同或不同CAR构建体的慢病毒载体转导。
在实施方案中，本文所述的方法提供免疫效应细胞的体外扩张。在其他实施方案中，本文所述的方法提供淋巴结注射后T细胞的体内扩张或注射入肿瘤后TIL的体内扩张。
因此，在实施方案中，本文所公开的方法提供了通过以下方式扩张免疫效应细胞群体的方法：使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸在适于瞬时表达CAR的条件下接触，其中CAR靶向相应抗原分子；并且在相应抗原分子存在下培养免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，核酸是RNA，例如，体外转录的RNA。在另一个实施方案中，相应抗原分子是癌相关抗原分子。在一个实施方案中，相应抗原分子连接至基质，例如，珠，并且在体外扩张免疫效应细胞群体。在另一个实施方案中，相应抗原在细胞(例如，肿瘤细胞)上表达并且在体内扩张免疫效应细胞群体。在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法，包括向受试者施用有效量免疫效应细胞群体，其中通过本文所述的方法扩张免疫效应细胞群体。
定义
除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关领域的技术人员通常理解的相同意义。
术语“一个(a)”和“一种(an)”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
当谈及可度量值如数量、时间持续期等时，术语“约”意在涵盖距指定值±20％的变动或在一些情况下±10％的变动或在一些情况下±5％的变动或在一些情况下±1％的变动或在一些情况下±0.1％的变动，因为这类变动适于开展所公开的方法。
本文使用的术语“获取”是指通过“直接获取”或“间接获得”物理实体或值，获得物理实体(例如，样品、细胞或细胞群体、多肽、核酸或序列)或值，例如数值。在一个实施方案中，获取涉及获得或收获细胞或细胞群体(例如，如本文所述的免疫效应细胞或群体)。“直接获取”意指进行某个过程(例如，执行合成方法或分析方法或纯化方法)以获得物理实体或值。“间接获取”指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括执行包括物理物质(例如，起始材料)的物理变化的方法。示例性变化包括从两种或更多种起始材料产生物理实体、剪切或分裂物质、分离或纯化物质、将两个或更多个分离的实体组合成混合物、进行包括断裂或形成共价或非共价键的化学反应。直接获取某值包括执行方法，所述方法包括样品或其他物质的物理变化的方法，例如，执行包括物质(例如样品、分析物或试剂)的物理变化的分析过程(有时在本文中称为“物理分析”)；执行分析方法，例如包括以下一者或多者的方法：从另一物质中分离或纯化物质，例如分析物或其片段或其其他衍生物；将分析物或其片段或其他衍生物与另一物质(例如缓冲液、溶剂或反应物)组合；或通过在分析物的第一和第二个原子之间破坏或形成共价键或非共价键来改变分析物或其片段或其它衍生物的结构；或者通过改变试剂或其片段或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间破坏或形成共价或非共价键。
术语“生物等效的”指为产生与参比剂量或参比量的参比化合物(例如，RAD001)产生的效果等同的效果所需要的除参比化合物(例如，RAD001)之外的药物量。在一个实施方案中，效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70 S6激酶抑制作用所测量，例如，如在体内或体外测定法中评价，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量、或通过蛋白质印迹法测量磷酸化S6水平。在一个实施方案中，效果是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率改变，如通过细胞分选法所测量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的P70 S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变水平的量或剂量。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指一组多肽，在最简单的实施方案中一般指两种多肽，当在免疫效应细胞中时，所述多肽为细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性及提供胞内信号生成。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称作“胞内信号传导结构域”)，其包含从如下文定义的刺激性分子和/或共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽处于相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，该组多肽彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一个方面，刺激性分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含主要信号传导结构域(例如，CD3ζ的主要信号传导结构域)。在一个方面，胞质信号传导结构域还包含从至少一种如下文定义的共刺激分子衍生的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子CAR选自本文所述的共刺激分子，例如，4-1BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其包含从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其包含从共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，其至少包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个方面，CAR还在胞外抗原结合结构域的N末端包含前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域(例如，scFv)切下。
取决于上下文，“CAR分子”指CAR(例如，CAR多肽)、编码CAR的核酸或这两者。
包含靶向特定肿瘤抗原X(例如本文所述的那些)的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR也称为XCAR。例如，将包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR称为CD19CAR。
术语“信号传导结构域”指蛋白质的功能性部分，所述的功能性部分通过在细胞内部传输信息而发挥以下作用：通过产生第二信使或通过响应于这类信使作为效应子发挥功能，借助限定的信号传导途径调节细胞活性。
如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的蛋白质或衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子中的多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指抗体的至少一个部分，所述部分保留与抗原的表位特异性相互作用的能力(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、由VH结构域和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、驼类(camelid)VHH结构域、从抗体片段形成的多特异性抗体如包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段，和分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。也可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“抑制”或“抑制剂”包括给定分子例如CD19、CD20、CD10、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、间皮素、或CD79a的某些参数(例如，活性)降低。例如，该术语包括抑制至少5％、10％、20％、30％、40％或更大活性，例如CD20、CD10、CD19、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b、间皮素、或CD79a的活性。因此，抑制不必要是100％。可以如本文所述那样或通过本领域已知的测定法确定抑制剂的活性。
如本文所用，术语“CD10”指已知在白血病细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD10的氨基酸序列可以按登录号NP_009218.2；NP_000893.2；NP_009219.2；NP_009220.2找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_007287.2(变体1bis)；NM_000902.3(变体1)；NM_007288.2(变体2a)；NM_007289.2(变体2b)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD10蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD10蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD10”包括包含突变(例如，全长野生型CD10的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“CD19”指分化抗原簇19蛋白，所述蛋白质是白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD19的氨基酸序列可以作为UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，并且编码人CD19的核苷酸序列可以按登录号NM_001178098找到。如本文所用，“CD19”包括包含突变(例如，全长野生型CD19的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
CD19在大部分B系癌上表达，所述B系癌例如包括急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。下文在定义“与表达CD19相关的疾病”中提供了表达CD19的其他细胞。它也是B细胞祖细胞的早期标志物。参见，例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)。在一个方面，CART的抗原结合部分识别并结合在CD19蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD19蛋白在癌细胞上表达。
如本文所用，术语“CD20”指已知在B细胞上可检出的抗原决定簇。人CD20也称作跨膜4-结构域亚家族A成员1(MS4A1)。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD20的氨基酸序列可以按登录号NP_690605.1和NP_068769.2找到，并且编码人CD20的转录物变体1和3的核苷酸序列可以分别按登录号NM_152866.2和NM_021950.3找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在CD20蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD20蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD20”包括包含突变(例如，全长野生型CD20的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“CD22”指已知在白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD22同工型1-5的氨基酸序列可以分别按登录号NP001762.2、NP001172028.1、NP001172029.1、NP001172030.1和NP001265346.1找到，并且编码人CD22的变体1-5的核苷酸序列可以分别按登录号NM001771.3、NM001185099.1、NM001185100.1、NM001185101.1和NM001278417.1找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在CD22蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD22蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD22”包括包含突变(例如，全长野生型CD22的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“CD34”指已知在造血干细胞和一些癌细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD34的氨基酸序列可以按登录号NP_001020280.1(同工型a前体)；NP_001764.1(同工型b前体)找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_001025109.1(变体1)；NM_001773.2(变体2)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在CD34蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD34蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD34”包括包含突变(例如，全长野生型CD34的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“CD123”指已知在一些恶性血液学癌细胞(例如，白血病细胞)上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD123的氨基酸序列可以按登录号NP_002174.1(同工型1前体)；NP_001254642.1(同工型2前体)找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_002183.3(变体1)；NM_001267713.1(变体2)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD123蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD123蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD123”包括包含突变(例如，全长野生型CD123的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“CD79b”指已知在一些恶性血液学癌细胞(例如，白血病细胞)上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD79b的氨基酸序列可以按登录号NP_000617.1(同工型1前体)、NP_067613.1(同工型2前体)或NP_001035022.1(同工型3前体)找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_000626.2(转录物变体1)、NM_021602.2(转录物变体2)或NM_001039933.1(转录物变体3)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD79b蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD79b蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD79b”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD79b的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CD79a”指已知在一些恶性血液学癌细胞(例如，白血病细胞)上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD79a的氨基酸序列可以按登录号NP_001774.1(同工型1前体)或NP_067612.1(同工型2前体)找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_001783.3(转录物变体1)或NM_021601.3(转录物变体2)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD79a蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD79a蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD79a”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD79a的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“CD179b”指已知在一些恶性血液学癌细胞(例如，白血病细胞)上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人CD179b的氨基酸序列可以按登录号NP_064455.1(同工型前体)或NP_690594.1(同工型b前体)找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_020070.3(转录物变体1)或NM_152855.2(转录物变体2)找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合CD179b蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，CD179b蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“CD179b”包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD179b的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体。
如本文所用，术语“FLT-3”指已知在造血祖细胞和一些癌细胞(例如，白血病细胞)上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人FLT-3的氨基酸序列可以按登录号NP_004110.2找到，并且编码它们的mRNA序列可以按登录号NM_004119.2找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在FLT-3蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，FLT-3蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“FLT-3”包括包含突变(例如，全长野生型FLT-3的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“ROR1”指已知在白血病前体细胞上可检出的抗原决定簇。可以在公共数据库(如GenBank、UniProt和Swiss-Prot)中找到人和鼠氨基酸序列和核酸序列。例如，人ROR1的同工型1和2前体的氨基酸序列可以分别按登录号NP_005003.2和NP_001077061.1找到，并且编码它们的mRNA序列可以分别按登录号NM_005012.3和NM_001083592.1找到。在一个方面，CAR的抗原结合部分识别并结合在ROR1蛋白的胞外结构域内部的抗原。在一个方面，ROR1蛋白在癌细胞上表达。如本文所用，“ROR1”包括包含突变(例如，全长野生型ROR1的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
如本文所用，术语“间皮素”指一种40kDa蛋白质，间皮素，所述蛋白质由糖基磷脂酰肌醇(GPI)键和称作巨核细胞促进因子(MPF)的氨基端31kDa散布片段锚定在细胞膜处。两种片段含有N-糖基化位点。该术语还指40kDa羧基端片段的可溶性剪接变体，也称作“可溶性间皮素/MPF相关”。优选地，该术语指GenBank登录号AAH03512.1的人间皮素，及其天然切割的部分，例如，如在细胞膜(例如，癌细胞膜上)表达。如本文所用，“间皮素”包括包含突变(例如，全长野生型间皮素的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体)的蛋白质。
术语“scFv”指一种融合蛋白，其包含至少一个包含轻链可变区的抗体片段和至少一个包含重链可变区的抗体片段，其中轻链可变区和重链可变区连续地连接，例如，借助合成的接头，例如，柔性短多肽接头连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scFv保留衍生它的完整抗体的特异性。除非特别指出，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为邻接多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个实施方案中，CAR包含了含有scFv的抗体片段。如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性并且多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”指在抗体可变区内部赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。例如，通常，在每个重链可变区中存在三种CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)并且在每个轻链可变区中存在三种CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。可以使用多种熟知方案的任一者确定给定CDR的精确氨基酸序列界限，所述熟知方案包括由Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些方案或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施方案中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将在轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施方案中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在组合的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为KabatCDR、Chothia CDR或二者之部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为邻接多肽链的部分，例如包括单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。
术语“抗体重链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较大者，其通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”指以其天然存在构象在抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较小者。κ轻链和λ轻链指两个主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”指使用重组DNA技术生成的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。本术语应当还解释为意指已经通过合成编码抗体并且表达抗体蛋白的DNA分子或合成规定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中已经使用本领域可获得的和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”、“Ag”或“抗原分子”指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的活化、或这两者。在一些实施方案中，抗原是任何大分子，包括全部蛋白质或肽。在其他实施方案中，抗原衍生自重组或基因组DNA。包含了编码激发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如该术语在本文中所用那样的“抗原”。抗原不需要完全由基因的全长核苷酸序列编码。在实施方案中，抗原包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以编码激发所需免疫应答的多肽。在一个实施方案中，抗原根本不必要由“基因”编码。在一个实施方案中，可以合成产生或可以从生物样品衍生出抗原，或抗原可以是包括多肽在内的其他大分子。这种生物样品可以包括但不限于具有其他生物学组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。在实施方案中，抗原例如包括，糖(例如，单糖、二糖、低聚糖和多糖)。
术语“相应抗原分子”指本文所述的任何抗原。在一个实施方案中，它指由CAR分子(例如，本文所述的任何CAR)识别的抗原(例如，靶)。在另一个实施方案中，它指本文所述的癌相关抗原。在一个实施方案中，相应抗原分子是重组分子。
术语“抗独特型(或独特型)抗体分子”或“抗抗原独特型(独特型)抗体分子”指与抗体(例如，抗体的抗原结合位点或可变区)结合的抗体分子。在一个实施方案中，抗独特型抗体分子与抗体的接触于抗原(例如，如本文所述抗原的(例如，如本文所述的相应抗原分子))的表位结合。在一个实施方案中，抗独特型抗体分子与CAR抗原结合结构域(例如，包含抗体或抗体片段的CAR的部分(例如，CAR的抗原结合部分))结合。
如本文所用的术语“CAR分子的配体”指与CAR分子或CAR分子的一部分结合的分子。在一个实施方案中，配体与CAR抗原结合结构域(例如，包含抗体或抗体片段的CAR的部分)结合。在一个实施方案中，配体是抗原分子，例如，相应抗原分子，例如，如本文所述。在另一个实施方案中，配体是抗独特型抗体分子，例如，如本文所述的抗抗原(例如，CD19)独特型抗体分子。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异体的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上充分地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种”指从不同物种的动物衍生的任何材料。
术语“癌症”指异常细胞失控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，例如，两种术语涵盖实体瘤和液体肿瘤，例如，弥散型或循环型肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤。
“衍生自”如该术语在本文中所用那样，表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不意味或不包括衍生自第二分子的第一分子上的方法或来源限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它不意味或不包括局限于产生胞内信号传导结构域的特定方法，例如，这并不意味着提供胞内信号传导结构域必须从CD3ζ序列开始并缺失不需要的序列，或者施加突变以获得胞内信号传导结构域。
短语“与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与表达本文所述的肿瘤抗原相关的疾病或与表达本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的病症，包括，例如增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前病症如脊髓发育不良，脊髓发育不良综合征或白血病前期；或与表达本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个实施方案中，与表达本文所述的肿瘤抗原相关的癌症是血液癌。在一个实施方案中，与表达本文所述的肿瘤抗原相关的癌症是实体癌。与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的其他疾病例如包括但不限于与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或减低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
短语“与表达CD19相关的疾病”包括但不限于与表达CD19(例如，野生型或突变CD19)的细胞相关的疾病或与表达或在任何时间表达过CD19(例如，野生型或突变CD19)的细胞相关的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达CD19的细胞相关的非癌症相关适应症。为避免疑问，与表达CD19相关的疾病可以包括与下述细胞相关的病状，所述细胞目前不表达CD19的，例如，因为CD19表达已经下调，例如，原因在于用靶向CD19的分子(例如，CD19 CAR)治疗，但从前表达过CD19。在一个方面，与表达CD19相关的癌症是血液学癌。在一个方面，血液学癌是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与表达CD19相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如，急性髓样白血病(AML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与表达CD19相关的额外癌症或血液学疾病例如包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、瓦尔登氏巨球蛋白血症、骨髓增生性肿瘤；组织细胞病(例如，肥大细胞病或母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤)；肥大细胞病，例如，全身性肥大细胞增多症或肥大细胞白血病；B细胞幼淋巴细胞白血病、浆细胞骨髓瘤，和“白血病前期”，它们是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合等。
与表达CD19相关的其他疾病例如包括但不限于与表达CD19相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与表达CD19相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达CD19的细胞表达或在任何时间表达过CD19mRNA。在一个实施方案中，表达CD19的细胞产生CD19蛋白(例如，野生型或突变体)，并且CD19蛋白可以按正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达CD19的细胞在一个时间点产生可检测水平的CD19蛋白并且随后基本上不产生可检测的CD19蛋白。
在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或减低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。在其他实施方案中，疾病是CD19阴性癌症，例如，CD19阴性复发癌症。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞表达或在任何时间表达过编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以按正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原(例如，CD19)的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“复发”如本文所用，指在反应性(例如，完全应答或部分应答)的初始阶段后(例如，在用某疗法(例如，癌疗法)既往治疗后)疾病(例如，癌症)再出现。反应性的初始阶段可以涉及癌细胞水平降到某个阈值以下，例如，低于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。再出现可以涉及癌细胞水平升高到某个阈值以上，例如，高于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，在B-ALL的上下文中，再次出现可能指例如在完全应答之后在血液、骨髓(>5％)或任何髓外部位中胚细胞的再次出现。在这种情况下，完全应答可以涉及<5％的BM胚细胞。更一般地、在一个实施方案中，应答(例如完全应答或部分应答)可以指不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施方案中，反应性的初始阶段持续至少1、2、3、4、5或6天；至少1、2、3或4周；至少1、2、3、4、6、8、10或12个月；或至少1、2、3、4或5年。
如本文所用的“难治性”，指不响应于治疗的疾病，例如，癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始前或在治疗开始时抵抗治疗。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得抵抗治疗。难治性癌症也称作抵抗治疗的癌症。
术语“保守序列修饰”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这类种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本文所述的CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合体或CAR)与其相应配体(例如，抗原分子)的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，如，但不限于借助TCR/CD3复合体的信号转导或借助适宜NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变。
术语“刺激性分子”指由提供胞质信号传导序列的免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，所述胞质信号传导序列相对于免疫细胞信号传导途径的至少一些方面以刺激性方式调节免疫细胞的活化。在一个方面，信号是初级信号，所述初级信号例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致介导T细胞反应，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(也称作“初级信号传导结构域”)可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的在本发明中特别有用的胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些序列。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CARS中的胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3ζ的初级信号传导序列。在本发明的具体CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:9提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本发明的具体CAR中，CD3ζ的初级信号传导序列是在SEQ ID NO:10中提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞如附属细胞(例如，B细胞、树状细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将它们呈递至T细胞。
如本文中所用那样，术语“胞内信号传导结构域”指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以生成信号，所述信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能。(例如，在CART细胞中的)免疫效应子功能的例子包括溶细胞活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。在实施方案中，术语“胞内信号传导结构域”是传导效应子功能信号并且指导细胞执行特化功能的蛋白质的部分。尽管可以使用完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用完整链。使用胞内信号传导结构域的截短部分到这样的程度，由此可以使用这种截短的部分替代完整链，只要它转导效应子功能信号即可。术语“胞内信号传导结构域”因此意在包括胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括从负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子衍生的那些结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括从负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子衍生的那些结构域。例如，在CART的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包含称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10和DAP12的那些序列。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBank登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基，并且“ζ刺激性结构域”或备选地“CD3ζ刺激性结构域”或“TCR-ζ刺激性结构域”定义为来自ζ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个方面，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:9(突变CD3ζ)提供的序列。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:10(野生型人CD3ζ)提供的序列。
术语“共刺激分子”指T细胞上的相应结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，因而由T细胞介导共刺激反应(如但不限于增殖)。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和与CD83特异性结合的配体。共刺激胞内信号传导结构域指共刺激分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包含从中衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
胞内信号传导结构域可以包含从中衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQID NO:7提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指参与免疫应答，例如参与促进免疫效应子应答的细胞。免疫效应细胞的例子包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、和髓细胞衍生的吞噬细胞。
如该术语在本文中所用那样，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。
术语“效应子功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。术语“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成具有限定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基因或cDNA转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此作为简并形式并编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的“核苷酸序列”还可以包括内含子到这样的程度，从而编码蛋白质的核苷酸序列可以在某个形式中含有内含子。
术语”内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
术语”外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
术语“表达”指受启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”指物质组合物，所述物质组合物包含分离的核酸并且可以用来向细胞的内部递送分离的核酸。众多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子化合物或两性化合物结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制型质粒或病毒。该术语还应当解释成进一步包括促进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的充分顺式作用元件；其他表达用元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的全部那些表达载体，包括并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或含于脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞的DNA，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，特别包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活性慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且将是本领域技术人员已知。
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子(如，两个DNA分子或两个RNA分子之间)或在两个多肽分子之间)的次级单位序列同一性。当这两个分子中的次级单位位置被相同单体性次级单位占据时，例如，若两个DNA分子中每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或同一的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例如，如果两个序列中一半位置(例如长度为10个次级单位的聚合物中的5个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个位置中9个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是含有从人免疫球蛋白衍生的最少序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合子序列)。对大部分情况而言，人源化抗体及其抗体片段是这些人免疫球蛋白(受者抗体或抗体片段)，其中来自所述受者的互补决定区(CDR)中的残基替换为来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR中的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受者抗体中又不在输入的CDR或构架序列中存在的残基。这些修饰可以进一步修正和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将基本上包含至少1个、并且一般2个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人类免疫球蛋白的那些CDR区对应并且全部或显著部分的FR区是具有人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。对于进一步细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是部分或完全与其天然状态的共存物质分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
在本发明的上下文中，对常见出现的核酸碱基使用以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。
术语“有效连接的”或“转录性控制”指调节序列和异源核酸序列之间导致异源核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码性序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的DNA序列可以彼此邻接并且，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，处于相同的可读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外施用例如包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或其DNA或RNA的组合及其聚合物。术语“核酸”包括基因、cDNA或mRNA。在一个实施方案中，核酸分子是合成的(例如，化学合成)或重组的。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的类似物或衍生物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,NucleicAcid Res.19:5081,(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98,(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且不限制可以构成蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，本术语指短链，例如，所述短链还常见地在本领域称为肽、寡肽和寡聚体，并且还指较长链，所述较长链通常在本领域称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”例如包括多肽的生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”指由细胞合成装置或引入的合成装置识别、为启动多核苷酸序列特异性转录所需要的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，这个序列还可以包括表达基因产物需要的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的那种启动子/调节序列。
术语“组成型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中在细胞的大部分或全部生理状况下产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子指与基因编码或规定的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上只有细胞是与该启动子相对应的组织型的细胞才产生的核苷酸序列。
术语“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指与正常细胞相比，优选在癌细胞表面完整表达或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常为蛋白质、糖或脂质)，并且其可用于药剂对癌细胞的优先靶向。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞均表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施方案中，癌相关抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过量表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍过量表达或更多倍过量表达。在一些实施方案中，癌相关抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，癌相关抗原将仅在癌细胞的细胞表面完整表达或作为片段(例如MHC/肽)表达并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包括这样的CAR，其包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)。通常，源自内源蛋白的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的口袋并由CD8+ T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表免疫疗法的独特类型的细胞表面靶标。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形中来源于病毒或肿瘤抗原的TCR样抗体靶向肽(参见，例如Sastry等人,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,GeneTher 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以从筛选文库(例如人scFv噬菌体展示文库)鉴定TCR样抗体。
如scFv的上下文中所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指由氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其中单独或组合使用所述肽接头以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:22)，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5、n＝6，n＝7，n＝8，n＝9和n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:28)。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复序列(SEQ ID NO:29)。本发明的范围内还包括通过引用方式并入本文的WO 2012/138475中描述的接头。
如本文所用，5'帽(也称作RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经紧接在转录起点后添加至真核信使RNA“前端”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对核糖体识别并保护免遭RNA酶作用至关重要。帽添加与转录偶联并且以共转录方式出现，从而每一者影响另一者。在转录起始后不久，正在合成的mRNA的5'末端被结合于RNA聚合酶的帽合成复合物结合。这种酶促复合物催化mRNA加帽需要的化学反应。合成过程作为多步骤生物化学反应推进。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”指已经在体外合成的RNA，例如mRNA。通常，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包括用来产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚腺苷酸”是通过多聚腺苷化与mRNA连接的一系列腺苷。在用于瞬时表达的构建体的一个实施方案中，聚腺苷酸长度在50和5000(SEQ ID NO:30)之间，例如大于64，例如可以化学或酶学方式修饰大于100例如大于300或400的聚腺苷酸序列以调节mRNA功能，如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“多聚腺苷化”指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mRNA的长腺嘌呤核苷酸序列(经常几百个)。在高等真核生物中，聚腺苷酸尾添加到含有特定序列(多聚腺苷化信号)的转录物上。聚腺苷酸尾和与之结合的蛋白质协助保护mRNA免遭核酸外切酶降解。多聚腺苷化还对转录终止、mRNA从胞核输出和翻译重要。多聚腺苷化在DNA转录成RNA后立即在胞核中发生，但额外地还可以稍后在细胞质中发生。在转录已经终止后，mRNA链因与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用而切割。切割位点通常以切割位点附近存在碱基序列AAUAAA为特征。在已经切割mRNA后，腺苷残基被添加至切割位点处的游离3’末端。
如本文所用，“瞬时”指非整合的转基因表达数小时、数天或数周时间，其中表达时间段小于如果基因在细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制子内部时该基因表达的时间段。在实施方案中，CAR分子在细胞(例如，宿主细胞)中瞬时表达有限的时间段或细胞复制次数，例如，少于50天(例如，少于40、30、25、20、15、10、5、4、3、2天或更少天数)。在一个实施方案中，使用体外转录的RNA，实现瞬时表达。
如本文所用，“稳定的”指转基因的表达持续时间长于瞬时表达。在实施方案中，转基因整合入细胞(例如，宿主细胞)的基因组中或含于细胞中的稳定质粒复制子内部。在一个实施方案中，使用基因递送载体，例如，逆转录病毒载体，如慢病毒载体，将转基因整合入细胞基因组。
单采血液成分术是其中从个体取出全血、分离成选择的组分并将剩余部分返回循环的方法。一般来说，有两种分离血液成分的方法：离心和非离心方法。白细胞分离术导致主动选择和去除患者的白细胞。
如本文所用，术语“治疗”是指减少或改善增生性病症的进展、严重性和/或持续时间，或改善由施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗剂如本发明的CAR)引起的增生性病症的一种或多种症状(例如，一种或多种明显的症状)。在特定实施方案中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其它实施方案中，术语“治疗”指通过身体上(通过例如稳定可辨别的症状)或生理上(通过例如稳定身体参数)或两者来抑制增生性病症的进展。在其它实施方案中，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着”是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。治疗不必要是100％，并且在一些实施方案中，疾病或病症的至少一种症状减少或延迟至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％足以视为处于这些术语范围内。
术语“信号转导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物，例如，人)。受试者的例子包括人、猴、黑猩猩、犬、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。T细胞可以从众多来源获得，包括外周血单个核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。
术语“基本上纯化的”细胞指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指均一的细胞群体。在其他情况下，这个术语单纯地指已经与其天然状态下天然与它们结合的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞是体外培养的。在其他方面，细胞不是体外培养的。
在本发明的上下文中，“肿瘤抗原”或“过度增殖性疾病抗原”或“与过度增殖性疾病相关的抗原”指特定过度增殖性疾病常见的抗原。在某些实施方案中，肿瘤抗原衍生自癌，所述癌包括但不限于原发性或转移性黑素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、白血病、子宫癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌和腺癌如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌等。
术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和其后代。
术语“特异性结合”指识别样品中存在的相应结合配偶体蛋白并与之结合的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中其他分子。
范围：在本公开各处，本发明的多个方面可以按范围样式展示。应当理解，以范围样式描述仅出于方便和简洁目的并且不应当解释为刚性限制本发明的范围。因此，范围的描述应当视为具有具体公开的全部可能子范围以及该范围内部的各个数值。例如，范围如从1至6的描述应当视为具有具体公开的如下子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内部的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，范围(如95-99％同一性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。无论范围的宽度多大，这均适用。
生产免疫效应细胞及其产生方法
本文提供了可以用CAR(例如，本文所述的CAR)进行工程化的免疫效应细胞，以及包含此类细胞的反应混合物和组合物的制备方法。
在一个方面，本公开的特征在于工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其中工程化的免疫效应细胞表现出抗肿瘤特性。示例性抗原是本文所述的癌相关抗原(即，肿瘤抗原)。在一个方面，用CAR转化细胞并且在细胞表面上表达CAR。在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞、NK细胞)用编码CAR的病毒载体转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施方案中，细胞可以稳定表达CAR。在另一个实施方案中，用编码CAR的核酸例如mRNA、cDNA、DNA转染细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一些此类实施方案中，细胞可以瞬时表达CAR。
另外，本发明提供CART组合物及其在用于治疗涉及表达本文所述的肿瘤抗原的细胞或组织的癌症或任何恶性肿瘤或自身免疫性疾病等疾病的药物或方法中的用途。
在一个方面，本发明的CAR可用于根除表达本文所述的肿瘤抗原的正常细胞，从而可应用于用作细胞移植前的细胞调节疗法。
免疫效应细胞的来源
在扩张和基因修饰或其他修饰之前，可以从受试者取得(例如，获得)细胞源，例如，免疫效应细胞，例如，免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括T细胞。在一个实施方案中，T细胞包括CD4 T细胞。在另一个实施方案中，T细胞包括CD8 T细胞。在另一个实施方案中，T细胞包括调节性T细胞。在又一个实施方案中，T细胞包括幼稚T细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞包括造血干细胞(例如，脐带血细胞)。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包括B细胞。在又一个实施方案中，免疫效应细胞包括NK细胞。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包括NKT细胞。在另一个实施方案中，免疫效应细胞包括Th-17细胞。在一个实施方案中，免疫效应细胞没有T细胞受体。在另一个实施方案中，免疫效应细胞具有无功能的或实质上受损的T细胞受体。
在一些实施方案中，细胞群体，例如，收获的细胞群体，包含例如，处于多个分化阶段的T细胞或T细胞群体。T细胞分化阶段包括幼稚T细胞、干中央记忆T细胞、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞和终末效应T细胞，从分化最低至最为分化。在抗原暴露后，幼稚T细胞增殖并分化成记忆T细胞，例如，干中央记忆T细胞和中央记忆T细胞，其随后分化成效应记忆T细胞。一旦接受适宜的T细胞受体、共刺激和炎性信号，记忆T细胞进一步分化成终末效应T细胞。参见，例如Restifo.Blood.124.4(2014):476-77和Joshi等人,J.Immunol.180.3(2008):1309-15。
幼稚T细胞(TN)以如下的细胞表面标志物表达模式为特征：CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95-。干中央记忆T细胞(TSCM)以如下的细胞表面标志物表达模式为特征：CCR7+、CD62L+、CD45RO-、CD95+。中央记忆T细胞(TCM)以如下的细胞表面标志物表达模式为特征：CCR7+、CD62L+、CD45RO+、CD95+。效应记忆T细胞(TEM)以如下的细胞表面标志物表达模式为特征：CCR7-、CD62L-、CD45RO+、CD95+。终末效应T细胞(TEff)以如下的细胞表面标志物表达模式为特征：CCR7-、CD62L-、CD45RO-、CD95+。参见，例如Gattinoni等人,Nat.Med.17(2011):1290-7；和Flynn等人,Clin.Translat.Immunol.3(2014):e20。
在实施方案中，免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，例如，T细胞，衍生自(例如，分化自)干细胞，例如，胚胎干细胞或多潜能干细胞，例如，诱导的多潜能干细胞(iPSC)。在实施方案中，细胞是自体或同种异体的。在其中细胞为同种异体的实施方案中，将例如衍生自干细胞(例如，iPSC)的细胞修饰以减少其异体反应性。例如，可以修饰细胞，例如，通过修饰(例如，破坏)其T细胞受体，减少异体反应性。在实施方案中，位点特异性核酸酶可以用来例如在T细胞分化后破坏T细胞受体。在其他例子中，衍生自iPSC的细胞(例如，T细胞)可以从病毒特异性T细胞产生，这些细胞不太可能造成移植物抗宿主病，因为它们识别病原体衍生的抗原。在又一些其他例子中，可以通过从共同HLA单倍型产生iPSC减少异体反应性，例如，使其最小化，从而它们与匹配、不相关的接受受试者组织相容。在又一些其他例子中，可以通过基因修饰阻抑HLA表达，减少异体反应性，例如，使其最小化。例如，可以如Themeli等人,Nat.Biotechnol.31.10(2013):928-35中所述加工衍生自iPSC的T细胞，所述文献通过引用的方式并入本文。在一些例子中，可以使用WO2014/165707中描述的方法，加工/生成衍生自干细胞的免疫效应细胞(例如，T细胞)，所述文献通过引用的方式并入本文。本文中(例如，在本文的“同种异体CAR免疫效应细胞”部分中)描述了涉及同种异体细胞的额外实施方案。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞(例如，T细胞)可以从使用技术人员已知的任何种类的技术(如FicollTM分离)从受试者采集的血液成分中获得。一方面，通过单采血液成分术从个体的循环血液获得细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他的有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且任选地，以在用于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中放置细胞。在一个实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选实施方案中，洗涤液缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多(若非全部)二价阳离子。
在钙不存在情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将轻易领会，可以通过本领域技术人员已知的方法，如根据制造商说明通过使用半自动化“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics CellSaver 5)，完成洗涤步骤。在洗涤后，细胞可以重悬于多种生物相容缓冲液中，例如，无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或含有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。备选地，可以移除单采样品的不想要组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一个方面，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如，通过经PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。
本文所述的方法可以例如包括例如使用(例如，本文所述的)负选择技术，选择免疫效应细胞的T细胞特定亚群，例如，调节性T细胞消耗(CD25+消耗的细胞)群体的T细胞。在一些实施方案中，调节性T细胞消耗群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或结合CD25的配体，例如IL-2，从群体除去调节性T细胞，例如CD25+ T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体与基质(例如，珠)缀合、或包被在基质(例如，珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的基质缀合。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25消耗试剂，从群体除去调节性T细胞，例如CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞对CD25消耗试剂的比率是1e7个细胞对20uL、或1e7个细胞对15uL、或1e7个细胞对10uL、或1e7个细胞对5uL、或1e7个细胞对2.5uL、或1e7个细胞对1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于消耗调节性T细胞，例如，CD25+而言，使用大于500百万个细胞/ml。在又一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待消耗的免疫效应细胞群体包含约6x 109个CD25+ T细胞。在其他方面，待消耗的免疫效应细胞群体包含约1x 109个至1x 1010个CD25+ T细胞和二者之间任何整数值的CD25+ T细胞。在一个实施方案中，所产生的调节性T细胞消耗群体具有2x109个调节性T细胞，例如CD25+细胞，或更少(例如，1x 109、5x 108、1x 108、5x 107、1x 107或更少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用使用具有消耗管路套件，例如，管路162-01的CliniMAC系统，从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在消耗设定(例如，DEPLETION2.1)下运行。
不希望被特定理论束缚，在单采血液成分术前或在生产表达CAR的细胞产品期间降低免疫细胞的负调节物的水平(例如，减少不需要的免疫细胞，例如TREG细胞的数量)显著地降低受试者的复发风险。例如，消耗TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、消耗CD25、mTOR抑制剂及其组合。
在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达CAR的细胞之前(例如，消耗)减少TREG细胞的数目。例如，生产方法包括使样品(例如，单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如，以在产生表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前消耗TREG细胞。
不希望受具体理论约束，在单采血液成分术之前或在产生表达CAR的细胞产品期间降低受试者中免疫细胞的负向调节物水平(例如，减少不想要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数目)可以降低受试者的复发风险。在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用减少TREG细胞的一种或多种疗法预治疗，因而对表达CAR的细胞治疗而言，降低了受试者复发风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25消耗或其组合。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗GITR抗体、消耗CD25、mTOR抑制剂或其组合。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25消耗或其组合中一者或多者可以在输注表达CAR的细胞产品之前、其期间或之后进行。
在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达CAR的细胞之前(例如，消耗)减少TREG细胞的数目。例如，生产方法包括使样品(例如，单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如，以在产生表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前消耗TREG细胞。在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗(例如CTL019治疗)复发的风险。在一个实施方案中，在收集用于制造表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)产物的细胞之前，用抗GITR抗体预治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施方案中，修改表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)制备方法以在制备表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前消耗TREG细胞。在一个实施方案中，在制备表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物(例如CTL019产物)之前，使用CD25消耗法消耗TREG细胞。
在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性T细胞，也不是肿瘤细胞，而是负向影响CART细胞的扩张和/或功能的细胞，例如，表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标志物的细胞。在一个实施方案中，构思将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述消耗后或按另一个顺序移除。
本文所述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如，多于一个消耗步骤。可以例如，用针对负向选择的细胞独有的表面标志物的抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文所述的方法还可以包括从群体移除表达肿瘤抗原(例如，不包括CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的细胞，以由此提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的)细胞和肿瘤抗原消耗的细胞的群体。在一个实施方案中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同基质(例如，珠)，或抗CD25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段的可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除所述细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
还提供这些方法，所述方法包括从群体移除表达检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者，因而提供调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗)的细胞和检查点抑制蛋白消耗的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)，例如，如本文所述的。在一个实施方案中，将表达检查点抑制蛋白的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗CD25抗体或其片段或者抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达检查点抑制蛋白的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
本文所述的方法可以包括正选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如，3x28)缀合的珠(如M-450 CD3/CD28 T)温育一段足够正选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段是约30分钟。在又一个实施方案中，该时间段范围从30分钟至36小时或更长和二者之间的全部整数值。在又一个实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个实施方案中，该时间段是10至24小时，例如，24小时。较长的温育时间可以用来在其中如与其他细胞类型相比存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率(如本文进一步所述那样)，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。额外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养伊始或在其他所需的时间点偏好地选择T细胞亚群。
在一个实施方案中，可以选择表达以下一者或多者的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素、或其他适宜的分子，例如，其他细胞因子。可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述方法，确定用于筛选细胞表达的方法。
为了通过正向或负向选择分离所需的细胞群体，细胞和表面(例如，粒子如珠)的浓度可以变动。在某些方面，可能想要明显减少其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)以确保细胞和珠最大限度接触。例如，在一个方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、或50亿/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在一个相关方面，可能想要使用较低的细胞浓度。通过大幅度稀释T细胞和表面(例如，粒子如珠)的混合物，粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选出表达高量待与粒子结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+ T细胞表达较高水平的CD28并且在稀释的浓度比CD8+T细胞被更高效地捕获。在一个方面，使用的细胞浓度是5x 106/ml。在其他方面，所用的浓度可以是约1x 105/ml至1x 106/ml和其间的任何整数值。
在其他方面，可以将细胞在2-10℃或在室温在摇床上按不同的速度温育长度不同的时间。
在一个实施方案中，多个免疫效应细胞群体不表达二酰基甘油激酶(DGK)，例如，是DGK缺陷的。在一个实施方案中，多个免疫效应细胞群体不表达Ikaros，例如，是Ikaros缺陷的。在一个实施方案中，多个免疫效应细胞群体不表达DGK和Ikaros，例如，是DGK和Ikaros缺陷的。
待刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论约束，通过移除细胞群体中的粒细胞和一定程度移除单核细胞，冷冻和后续解冻步骤提供更均匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以悬浮于冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于这个上下文中，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸气相中。也可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或在液氮中不受控冷冻。
在某些方面，将冷冻保存的细胞如本文所述那样解冻和洗涤并允许在室温静置1小时，之后使用本发明的方法激活。
在本发明背景下还构思，在可能需要如本文所述的已扩张细胞时之前的某个时间段从受试者采集血液样品或单采产品。就这一点而论，待扩张的细胞来源可以在需要的任何时间点采集，并且所需的细胞(如T细胞)可以分离并冷冻供稍后用于将从免疫效应细胞疗法获益的任何种类的疾病或病状(如本文所述的那些)的免疫效应细胞疗法中。在一个方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者，所述受试者面临形成疾病的风险、但是尚未形成疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供稍后使用。在某些方面，可以将T细胞扩张、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，样品从诊断如本文所述的特定疾病后不久、但在任何治疗之前的患者采集。在又一个方面，在任何数目的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物分离细胞，所述的治疗模式包括但不限于药物治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药、化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体、或其它免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷氮芥、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和照射。
在本发明的又一个方面，在对受试者用有功能的T细胞治疗后直接从患者获得T细胞。在这个方面，已经观察到在某些癌症治疗、尤其用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久在患者正常情况下将从治疗中恢复的时间期间，获得的T细胞的质量可能就其离体扩张能力而言最佳或改善。同样地，在使用本文所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于移植和体内扩张增强的优选状态。因此，在本发明上下文的范围内构思了，在这个恢复期期间采集血细胞，包括T细胞、树状细胞或造血谱系的其他细胞。另外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和条件化方案可以用来在受试者中产生这样的条件，其中有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩张，特别在治疗后的定义的时间窗口期间有利。示意性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树状细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞从已经接受免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂的受试者获得。在一个实施方案中，在足够时间的mTOR抑制剂后或在充分给予免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂后收获待工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，从而受试者中的或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少瞬时增加。
在其他实施方案中，可以通过与下述量的mTOR抑制剂接触，离体处理已经工程化或将会工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体，所述量增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)数目或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
认识到本申请的方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人AB血清的培养基条件，并且使用已知的培养基条件和组成，例如在Smith等人,“Ex vivo expansion of human Tcells for adoptive immunotherapy usingnovel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
在一个实施方案中，本文所公开的方法可以利用包含无血清培养基的培养基条件。在一个实施方案中，无血清培养基是OpTmizer CTS(LifeTech)、Immunocult XF(Stemcell technologies)、CellGro(CellGenix)、TexMacs(Miltenyi)、Stemline(Sigma)、Xvivo15(Lonza)、PrimeXV(Irvine Scientific)或StemXVivo(RandD systems)。无血清培养基可以补充来自LifeTech的血清替代品如ICSR(免疫细胞血清替代品)。血清替代品(例如，ICSR)的水平可以例如是至多5％，例如，约1％、2％、3％、4％或5％。在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷性细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。可以通过遗传方法产生DGK缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止DGK表达的RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理，产生DGK缺陷性细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质的细胞或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂，例如siRNA、shRNA、miRNA，以减少或阻止Ikaros表达。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺)处理，产生Ikaros缺陷性细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷的和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros、或具有减少或抑制的DGK活性和Ikaros活性。这类DGK和Ikaros缺陷性细胞可以通过本文所述任何方法产生。
在一个实施方案中，NK细胞从受试者获得。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
在实施方案中，这些方法，例如，制造方法，还包括使细胞群体(例如，其中已消耗调节性T细胞，例如已消耗CD25+T细胞的细胞群体，或已预先接触抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，将细胞群体(例如，先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)在IL-15和/或IL-7存在下扩张。
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触，所述组合物包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)的组合。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在制造表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者组合的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在离体扩张期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩张期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合物在离体扩张期间接触。在一个实施方案中，接触过程导致淋巴细胞亚群(例如，CD8+ T细胞)存活和增殖。
同种异体CAR
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异体T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达任何功能性TCR；如此工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基(例如，如此工程化，从而它不表达(或显示减少表达)TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ、TCRε和/或TCRζ)，或如此工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达实质上受损的TCR，例如，通过表达突变或截短形式的一个或多个TCR亚基。术语“实质上受损的TCR”意指这种TCR将不在宿主中激发不良免疫反应。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。在一些实施方案中，可以通过减少或消除β-2微球蛋白(B2M)表达，实现HLA的下调。在一些实施方案中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA(例如HLA I类和/或HLA II类)。
可以通过任何合适的手段(包括敲除或敲减TCR或HLA的一个或多个亚基)，获得缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲减TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达(例如，通过本文所述的任何方法)抑制性分子的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如，所述抑制性分子可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。对抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如，如本文所述。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施方案中，可以在细胞(如T细胞)中使用靶向编码TCR和/或HLA和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷和TGFβ))的核酸的siRNA或shRNA，抑制TCR表达和/或HLA表达。
用于siRNA和shRNA及示例性shRNA的表达系统例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和第650段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用的“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”指一组成簇规律间隔的短回文重复序列或一个包含这种重复序列组的系统。如本文所用，“Cas”指CRISPR相关蛋白。“CRISPR/Cas”系统是指从CRISPR和Cas衍生的系统，所述系统可以用来在细胞(如T细胞)中沉默或突变TCR和/或HLA基因和/或本文所述的抑制性分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)。
CRISPR/Cas系统及其用途例如在2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第651-658段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化子样效应核酸酶，一种可用于在细胞中(例如T细胞中)编辑HLA和/或TCR基因和/或编码本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的人工核酸酶。
TALEN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第659-665段，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可用于在细胞中(例如T细胞中)编辑HLA和/或TCR基因和/或本文所述抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的人工核酸酶。
ZFN及其用途描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第666-671段，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
端粒酶表达
端粒在体细胞持久性中起关键作用，其长度由端粒酶(TERT)维持。CLL细胞中的端粒长度可能非常短(Roth等人,“Significantly shorter telomeres in T-cells ofpatients with ZAP-70+/CD38chronic lymphocytic leukaemia”British Journal ofHaematology,143,383-386.,August 28 2008)，并且在制造的表达CAR的细胞(例如CART19细胞)中可能更短、限制了其在过继转移到患者之后的扩张潜力。端粒酶表达可以拯救表达CAR的细胞免于复制消耗。
尽管不希望受任何具体理论约束，在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期留存，原因在于T细胞中端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者中的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基。在一些方面，本公开提供一种产生表达CAR的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基)的核酸接触。细胞可以在接触编码CAR的构建体之前、与之同时或之后与所述核酸接触。
端粒酶表达可以是稳定的(例如，核酸可以整合入细胞的基因组)或短暂的(例如，核酸不整合，并且表达在一段时间后，例如几天后下降)。通过用编码端粒酶亚基和可选择标记的DNA转染或转导细胞，并选择稳定的整合体，可以实现稳定的表达。备选地或组合地，可以通过位点特异性重组，例如使用Cre/Lox或FLP/FRT系统来实现稳定表达。
瞬时表达可以涉及用核酸例如DNA或RNA如mRNA转染或转导。在一些实施方案中，瞬时mRNA转染避免了有时与用TERT稳定转染相关的遗传不稳定性。外源端粒酶活性的瞬时表达描述于例如国际申请WO2014/130909中，其通过引用整体并入本文。在实施方案中，根据由Moderna Therapeutics商业化的信使RNA TherapeuticsTM平台进行基于mRNA的端粒酶亚基转染。例如，方法可以是美国专利号8710200、8822663、8680069、8754062、8664194或8680069中描述的方法。
在一个实施方案中，hTERT具有本文中作为SEQ ID NO:5提供的GenBank蛋白IDAAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human TelomeraseCatalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and duringImmortalization”Cell Volume 90,Issue 4,22 August 1997,Pages 785–795)。
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:5的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。在一个实施方案中，hTERT具有SEQ ID NO:5的序列。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或这两者处包含缺失(例如，不多于5、10、15、20、或30个氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或这两者处包含转基因氨基酸序列(例如，不多于5、10、15、20或30个氨基酸的转基因氨基酸序列)。
在一个实施方案中，hTERT由本文中作为SEQ ID NO:8提供的GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human TelomeraseCatalytic Subunit Gene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and duringImmortalization”Cell，90卷4期,1997年8月22日,785–795页)。
在一个实施方案中，hTERT由具有与SEQ ID NO:8的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列的核酸编码。在一个实施方案中，hTERT由SEQ IDNO:8的核酸编码。
RNA转染
本文公开了用于产生体外转录的RNA CAR的方法。本文所述的方法可以包括引入可以直接转染至细胞中的编码CAR的RNA构建体。一种产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和聚腺苷酸化尾的构建体，其中所述聚腺苷酸化尾长度一般为50-2000个碱基(例如，SEQ ID NO:30)。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括用于CAR的序列。RNA CAR及其使用方法描述于例如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第553-570段，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
免疫效应细胞可以包括信使RNA(mRNA)编码的CAR。在一个方面，将编码本文所述CAR的mRNA引入例如通过本文所述方法制备的免疫效应细胞，用于产生表达CAR的细胞。
在一个实施方案中，可以将体外转录的RNA CAR作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。来自任何来源的目的DNA可以直接通过PCR转化成模板，以使用适宜引物和RNA聚合酶，体外合成mRNA。DNA的来源可以例如是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适宜的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板包含细胞外区域，其包含针对本文所述的肿瘤相关抗原的抗体的单链可变结构域；铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包含胞内信号传导结构域，例如本文所述的胞内信号传导结构域，例如包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'非翻译区和/或3'非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列，包括5'UTR和3'UTR。DNA可以备选地是正常情况下在天然存在的生物中不表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有各基因部分的人工DNA序列，其中所述的各基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的各DNA部分可以来自单种生物或来自多于一种生物。
PCR用来产生模板以便体外转录用于转染的mRNA。用于开展PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR中的引物设计成具有与待用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”，指其中引物序列中的大部分或全部碱基互补或一个或多个碱基是非互补或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的复性条件下与预期的DNA靶复性或杂交。引物可以设计成与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以设计成扩增正常情况下在细胞中转录的核酸部分(可读框)，包括5'和3'UTR。引物也可以设计成扩增编码特定目的结构域的核酸部分。在一个实施方案中，引物是设计成扩增人cDNA的编码区，包括全部或部分的5'和3'UTR。可用于PCR的引物可以是通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域。“上游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言5'的位置。“反向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域。“下游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言3'的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶可以在本文中公开的方法中。试剂和聚合酶是从众多来源可商业获得的。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构物。在实施方案中，RNA具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR长度在1个和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'UTR和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，所述方法包括但不限于设计与UTR的不同区域复性的PCR用引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以调节为转染转录的RNA后实现最佳翻译效率所需要的5'UTR和3'UTR长度。
5'UTR和3'UTR可以是目的核酸的天然存在的、内源5'UTR和3'UTR。备选地，相对于目的核酸并非内源的UTR序列可以通过将该UTR序列并入正向引物和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰进行添加。使用相对于目的核酸并非内源的UTR序列可以用于调整RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的AU丰富元件可以降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域熟知的UTR特性，可以选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以含有内源核酸的Kozak序列。备选地，当通过如上文所述的PCR正在添加相对于目的核酸并非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列再设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA转录物的翻译效率、但似乎不是令全部RNA有效翻译需要的。本领域已知许多mRNA需要Kozak序列。在其他实施方案中，5'UTR可以是其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒的5’UTR。在其他实施方案中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中，以阻碍核酸外切酶降解mRNA。
为了能够在不需要基因克隆的情况下从DNA模板合成RNA，转录启动子应当在待转录序列上游与DNA模板连接。当作为RNA聚合酶启动子发挥作用的序列添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的可读框上游的PCR产物中。在一个实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他处描述。其他可用启动子包括但不限于T3RNA聚合酶启动子和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个实施方案中，mRNA具有在5'末端的帽和3'聚腺苷酸尾这两者，它们决定了在细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。在环状DNA模板，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于真核细胞中表达的长连环体产物。转录在3'UTR末端线性化的质粒DNA产生在真核转染中并非有效的大小正常的mRNA，即便转录后它发生聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以延伸转录物的3’末端越过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
整合多聚A/T片段至DNA模板中的常规方法是分子克隆。但是，整合入质粒DNA的多聚A/T序列可以造成质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常遭受缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆方法不仅繁琐和费时的，而且经常不可靠。这是为何迫切需要以下方法的原因：允许在不进行克隆情况下构建带多聚A/T 3'片段的DNA模板。
可以在PCR期间通过使用含有聚胸苷酸尾(如100T尾(SEQ ID NO:31)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:32)))的反向引物或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)，产生转录的DNA模板的多聚A/T区段。聚腺苷酸尾还向RNA提供稳定性并减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾长度在100和5000个腺苷(例如，SEQ ID NO:33)之间。
RNA的聚腺苷酸尾可以在体外转录后利用聚腺苷酸聚合酶(如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP))进一步延长。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至300个和400个核苷酸之间(SEQ ID NO:34)导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，接合不同化学基团至3’末端可以增加mRNA稳定性。这种接合可以含有修饰/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚腺苷酸聚合酶将ATP类似物并入聚腺苷酸尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。
5'帽也向RNA分子提供稳定性。在一个实施方案中，通过本文所公开的方法产生的RNA包含5'帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文所公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，所述序列启动帽非依赖性核糖体结合至mRNA并促进翻译的起始。可以包含适用于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和成活力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用众多不同方法的任一种方法，将RNA引入靶细胞中，例如包括但不限于以下的市售方法：电穿孔法(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,德国))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg,德国)、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导转染法、聚合物囊化法、肽介导的转染法或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
免疫效应细胞的活化和/或扩张
在实施方案中，本公开提供通过以下方式扩张免疫效应细胞群体的方法：使免疫效应细胞群体与编码CAR的核酸在适于表达(例如，瞬时表达)CAR的条件下接触，其中CAR靶向相应抗原分子；并且在配体(例如，相应抗原分子)存在下培养免疫效应细胞群体。在一个实施方案中，核酸是RNA，例如，体外转录的RNA。在另一个实施方案中，相应抗原分子是癌相关抗原分子。
提供本文展示的方法用于扩张免疫效应细胞群体，所述方法通过与连接有相应抗原分子的表面接触，刺激免疫效应细胞表面上的CAR。在某些方面，相应抗原分子可以在溶液中或与表面偶联。在一个方面，提供刺激性信号的相应抗原分子与细胞表面结合。在某些方面，相应抗原分子可以在溶液中。在一个方面，相应抗原分子可以处于可溶性形式并且随后交联至表面。
在一个实施方案中，相应抗原分子与基质连接。在一个实施方案中，基质是固相支持物。在一个实施方案中，基质选自微量滴定板(例如，ELISA板)；膜(例如，硝酸纤维素膜、PVDF膜、尼龙膜、乙酸酯衍生物、及其组合)；纤维基体、琼脂糖凝胶基体、糖基体；塑料片；玻璃片；或任何类型的珠(例如，Luminex珠、Dyna珠、磁珠、流式细胞术珠及其组合)。在一个实施方案中，基质是ELISA板。在另一个实施方案中，基质是珠，例如，Dyna珠。
可以使用1:500至500:1及其间任何整数值的粒子对细胞比率，刺激免疫效应细胞(例如，T细胞)或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以轻易地领会，粒子对细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小规格珠仅可能结合一些细胞，而较大的珠可能结合许多细胞。在某些方面，细胞对粒子的比率范围从1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在其他方面中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值、也可以用来刺激T细胞。导致刺激T细胞的相应抗原分子偶联的粒子对免疫效应细胞(例如，T细胞)比率的例子可以如上文所示变动，然而，某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个合适的比率为至少1:1的粒子/T细胞。在一个方面，使用1:1或更小的粒子对细胞比率。在其他方面，粒子:细胞比率可以根据刺激的日期变动。例如，在一个方面，粒子:细胞比率在第1天是1:1至10:1，并且此后每日或每隔1日添加额外粒子至细胞持续至多10天，按1:1至1:10的最终比率(基于添加日时的细胞计数)添加。在一个特定方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是1:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:5。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:5。在一个方面，粒子:细胞比率在第1刺激日是2:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:10。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:10。在一个特别的方面，合适的粒子:细胞比率为1:3。
在进一步的方面，将细胞如T细胞与相应抗原分子包被的珠组合，接着分离珠和细胞，然后培养细胞。在一个备选的方面，在培养之前，相应抗原分子包被的珠和细胞没有分离，而是一起培养。在又一个方面，首先通过应用某种力(如磁力)浓缩珠和细胞、导致细胞表面标志物的连接增加，因而诱导细胞刺激作用。
例如，可以通过允许与相应抗原分子连接的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞，连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如，M-450甲苯磺酰基活化的顺磁珠以1:3的比率)在缓冲液(例如PBS(不含二价阳离子，如钙和镁))中混合。构思了其他的细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并仅占样品的0.01％或整个样品(即，100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均属于本发明的情景范围内。在某些方面，可能想要明显减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)以确保细胞和粒子最大限度接触。例如，在一个方面，使用约100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml、50亿/ml、或20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩张。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达已表达的(例如，已瞬时表达的)CAR。
在一个实施方案中，通过例如本文所述的方法扩张用编码CAR，例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19 CAR的核酸转导的细胞。在一个实施方案中，将细胞培养扩张几小时时间(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约40天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天)。在一个实施方案中，将细胞扩张4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩张8天或更短(例如，7、6或5天)时间。在一个实施方案中，所述细胞在培养中扩张5天、且所得细胞比相同的培养条件下培养扩张9天的相同的细胞更有效。效力可以例如由多种T细胞功能例如增殖、靶细胞杀伤作用、细胞因子产生、活化、移行、或其组合定义。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，扩张5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少1、2、3或4倍。在一个实施方案中，将细胞，例如表达本文所述的CD19 CAR的细胞在培养下扩张5天，并且与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎细胞因子产量，例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩张9天的相同细胞相比，在培养下扩张5天的细胞(例如，本文所述的CD19 CAR细胞)显示以pg/ml计的促炎细胞因子产量(例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平)增长至少1、2、3、4、5、10倍或更多。
也可能需要几个刺激循环，使得免疫效应细胞(例如，T细胞)的培养时间可以为60天或以上。适于T细胞培养的条件包括适宜的培养基(例如，极限基本培养基或RPMI培养基1640或、X-vivo15、(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和成活力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加物。用于细胞生长的其他添加物包括但不限于表面活性剂、血浆和还原剂如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo15和X-Vivo20、Optimizer，连同添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充足以生长和扩张T细胞的适宜量的血清(或血浆)或限定的成组激素和/或某种量的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素仅包含于实验性培养物中，不包含于待输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，适宜的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气外加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩张，所述培养基包括导致细胞在14天扩张期间内增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)(例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量)的一种或多种白介素。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩张。在一个实施方案中，将细胞在IL-2存在下扩张。
已经暴露于变动的刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，常见的血液或单采外周血单个核细胞产物具有比细胞毒T细胞或阻抑T细胞群体(TC、CD8+)更大的辅助T细胞群体(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩张T细胞产生了约第8-9天之前由TH细胞优势组成的T细胞群体，而约第8-9天之后，T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注优势包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性亚群，可能有益的是更大程度地扩张这个亚群。
另外，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物也显著地变动，但是在细胞扩张过程期间大多可重复地变动。因此，这种重现性使得为特定目的而调整活化的T细胞产物的能力成为可能。
多种测定法可以用来评价本文所述方法的功效，如但不限于转导效率、表达CAR的能力、抗原刺激后扩张免疫效应细胞的能力和维持免疫效应细胞扩张的能力。下文进一步详细描述评价本发明方法的测定法。
可以通过流式细胞术测量转导效率。例如，如本文所述，可以测量表达CAR(例如，CD19 CAR)的免疫效应细胞上CAR的表面表达。通过以下方式检验CAR的表面表达：将细胞与生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)在4℃温育30分钟，随后用FACs缓冲液(加3％BSA的PBS)洗涤二次并与藻红蛋白标记的链霉亲和素(BD Pharmingen,San Diego,CA)偶联。样品数据可以在LSRII Fortessa(BDBiosciences)上采集并用FlowJo软件(Treestar)分析。也可以通过本领域已知的用于测量RNA水平(例如，RNA印迹分析、定量实时PCR)或蛋白质水平(例如，蛋白质印迹分析)的任何其他方法测量转导效率。
也可以通过流式细胞术测量抗原刺激后免疫效应细胞的扩张。例如，可以如本文所述那样测量经相应抗原分子(例如，抗独特型CD19)刺激的表达CAR(例如，CD19 CAR)的免疫效应细胞的扩张。将活细胞对Live/Dead Aqua阴性设门并且随后对CD4(或CD8)-阳性设门。T细胞绝对计数可以通过使用CountBright绝对计数珠(Life Technologies)，使用以下公式确定：
(T细胞事件数/珠事件数)X所用珠的数目。
也可以测量再次刺激不存在的情况下维持的CAR+ T细胞扩张。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用所示CAR转导后，在培养第8天使用Coulter Multisizer III粒子计数器测量平均T细胞体积(fl)。
其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些也可用于评估本文所述的CAR。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供免疫效应细胞，其经工程化以包含一种或多种指引免疫效应细胞至癌的CAR。这通过对癌相关抗原特异性的CAR上的抗原结合结构域来实现。有两类可以被本文所述的CAR靶向的癌相关抗原(肿瘤抗原)：(1)在癌细胞表面上表达的癌相关抗原；和(2)本身是细胞内的癌相关抗原，然而这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合体)呈递在癌细胞的表面上。
因此，免疫效应细胞(例如，通过本文所述的方法获得)可以工程化以含有靶向以下癌相关抗原(肿瘤抗原)之一的CAR：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1，CRACC，SLAMF7，CD319，和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关的糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；细胞表面相关的粘蛋白1(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome，Macropain)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区(BCR)和Alelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(AB1)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸基路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤血管内皮标志物1(TEM1/CD248)；肿瘤血管内皮标志物7相关的(TEM7R)；Claudin 6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；X染色体可读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺的己糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin 3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1A)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；FOS相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝素8)，由T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；细胞凋亡的黑素瘤抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；V-myc鸟髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点的调节物的兄弟(Brother ofthe Regulator of Imprinted Site))，T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；proacrosin结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；高级糖化终产物受体(RAGE-1)；肾泛素1(RU1)；肾泛素2(RU2)；legumain；人类乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人类乳头瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含有EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序以及针对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半部分抗体和针对第二表位具有结合特异性的半部分抗体。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半部分抗体或其片段和针对第二表位具有结合特异性的半部分抗体或其片段。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和针对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。用于产生双特异性或异二聚体抗体分子以及双特异性抗体分子的各种构型的方案描述于例如2015年3月13日提交的WO2015/142675的第455-458段中，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
在一个方面，双特异性抗体分子的特征在于第一免疫球蛋白可变结构域序列，例如scFv，其对CD19具有结合特异性，例如包含本文所述的scFv，或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR以及对不同抗原上的第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
嵌合TCR
一方面，本发明的抗体和抗体片段(例如，CD19抗体和片段)可以被移植到T细胞受体(“TCR”)链，例如TCRα或TCRβ链的一个或多个恒定结构域，以产生嵌合TCR。不受理论束缚，认为嵌合TCR将在抗原结合后通过TCR复合物发出信号。例如，本文公开的scFv可以移植到恒定结构域，例如TCR链(例如TCRα链和/或TCRβ链)的细胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分。作为另一个实例，抗体片段，例如本文所述的VL结构域可以移植到TCRα链的恒定结构域，并且抗体片段，例如本文所述的VH结构域可以移植到TCRβ链的恒定结构域(或者，VL结构域可以被移植到TCRβ链的恒定结构域，并且VH结构域可以被移植到TCRα链上)。作为另一个实例，抗体或抗体片段的CDR可以移植到TCRα和/或β链中以产生嵌合TCR。例如，本文公开的LCDR可以移植到TCRα链的可变结构域中，并且本文公开的HCDR可以移植到TCRβ链的可变结构域，反之亦然。这样的嵌合TCR可以例如通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy 2000；7:1369–1377；Zhang T等人,CancerGene Ther 2004；11:487–496；Aggen等人,Gene Ther.2012Apr；19(4):365-74)。
非抗体支架
在实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架，例如纤连蛋白、锚蛋白、结构域抗体、脂质运载蛋白、小模块免疫药物、maxybody、蛋白A或affilin。非抗体支架具有结合细胞上的靶抗原的能力。在实施方案中，抗原结合结构域是在细胞上表达的天然存在蛋白质的多肽或其片段。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含非抗体支架。可以使用多种非抗体支架，只要所得多肽包含至少一个特异性结合靶细胞上的靶抗原的结合区域即可。
非抗体支架包括：纤连蛋白(Novartis，MA)，锚蛋白(Molecular Partners AG，苏黎世，瑞士)，结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA和Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)，脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，Germany)，小模块免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)，maxybodies(Avidia，Inc.，MountainView，CA)，蛋白A(Affibody AG，Sweden)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil ProteinsGmbH，Halle，Germany)。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含结合靶细胞表面上的反配体的分子的胞外结构域或其反配体结合片段。免疫效应细胞可以包含含有编码CAR的序列的重组DNA构建体，其中CAR包含特异性结合肿瘤抗原，例如本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)和胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如，ζ链。如其他地方所述，本文所述的方法可包括用编码CAR(例如本文描述的CAR)的核酸转导细胞，例如来自调节性T细胞消耗群体的细胞。
在具体的方面，CAR包含scFv结构域，其中scFv可以前置有如SEQ ID NO:1中提供的任选前导序列，并且后接如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:23中提供的任选铰链序列、如SEQ ID NO:6中提供的跨膜区、包括SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:16的胞内信号传导结构域和包括SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的CD3ζ序列，其中各结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。
在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰合部(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内刺激性结构域(例如，本文所述的胞内刺激性结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如本文所述的抗原结合结构域)、铰链(例如本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、细胞内共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或细胞内初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)。
将示例性前导序列作为SEQ ID NO:1提供。将示例性铰链区/间隔序列作为SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:23提供。将示例性跨膜结构域序列作为SEQ ID NO:6提供。将4-1BB蛋白的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:7提供。将CD27的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:16提供。将示例性CD3ζ结构域序列作为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10提供。
在一个方面，免疫效应细胞包含一种重组核酸构建体，其包含编码CAR的核酸分子，其中核酸分子包含编码抗原结合结构域的核酸序列，其中该序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。可以在CAR中使用的示例性胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3ζ、CD28、CD27、4-1BB等中的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
可以使用本领域已知的重组方法获得编码目的分子的核酸序列，如，例如通过从表达核酸分子的细胞筛选文库、通过从已知包括核酸分子的载体衍生该基因、或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直接分离。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非克隆。
可以使用例如逆转录病毒或慢病毒载体构建体，将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。
也可以使用例如可直接转染入细胞的RNA构建体，将编码CAR的核酸引入免疫效应细胞。一种产生用于转染的mRNA的方法涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)(例如，本文所述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文所述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文所述的IRES)、待表达的核酸和长度一般为50-2000碱基的聚腺苷酸化尾(例如，本文所述，例如，SEQ ID NO:35)的构建体。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括用于CAR的序列。在一个实施方案中，将RNA CAR载体通过电穿孔转导至细胞(例如，T细胞)中。
抗原结合结构域
在一个方面，多种免疫效应细胞(例如调节性T细胞消耗群体)包含编码CAR的核酸，所述CAR包含另外称为抗原结合结构域的靶特异性结合元件。结合元件的选择取决于定义的靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。因此，可以在本文所述的CAR中充当抗原结合结构域的配体的细胞表面标志物例子包括与病毒感染、细菌感染和寄生虫性感染、自身免疫疾病和癌细胞相关的那些细胞表面标志物。
在一个方面，包含抗原结合结构域的CAR的部分包含靶向肿瘤抗原(例如，本文所述的肿瘤抗原)的抗原结合结构域。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体和其功能性片段，包括但不限于单一结构域抗体，如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和驼类衍生的纳米体的可变结构域(VHH)，以及本领域已知的作为抗原结合结构域发挥作用的备选支架，如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)或其片段，例如，单链TCR等。在一些情况下，抗原结合结构域衍生自最终会使用CAR的相同物种是有益的。例如，对于人类中使用，包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可以有益于CAR的抗原结合结构域。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如，scFv。例如，抗原结合结构域包含表1中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以例如是本文所述的任何接头序列，或备选地，可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:104)。
表1：抗CD19抗体结合结构域
含有人源化抗CD19 scFv结构域的CD19 CAR构建体在PCT公开WO2014/153270中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。
对于重链可变结构域，在表2中显示抗CD19 scFv结构域的鼠和人源化CDR序列，并且对于轻链可变结构域，在表3中显示之。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表2.CD19抗体的重链可变结构域CDR(Kabat)
候选物 FW HCDR1 ID HCDR2 ID HCDR3 ID
鼠_CART19 DYGVS 122 VIWGSETTYYNSALKS 123 HYYYGGSYAMDY 127
人源化_CART19a VH4 DYGVS 122 VIWGSETTYYSSSLKS 124 HYYYGGSYAMDY 127
人源化_CART19b VH4 DYGVS 122 VIWGSETTYYWSSLKS 125 HYYYGGSYAMDY 127
人源化_CART19c VH4 DYGVS 122 VIWGSETTYYNSSLKS 126 HYYYGGSYAMDY 127
表3.CD19抗体的轻链可变结构域CDR(Kabat)
候选物 FW LCDR1 ID LCDR2 ID LCDR3 ID
鼠_CART19 RASQDISKYLN 128 HTSRLHS 129 QQGNTLPYT 130
人源化_CART19a VK3 RASQDISKYLN 128 HTSRLHS 129 QQGNTLPYT 130
人源化_CART19b VK3 RASQDISKYLN 128 HTSRLHS 129 QQGNTLPYT 130
人源化_CART19c VK3 RASQDISKYLN 128 HTSRLHS 129 QQGNTLPYT 130
根据本公开可以使用任何已知的CD19 CAR，例如本领域中任何已知CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；在美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人，Leuk Lymphoma.2013 54(2)：255-260(2012)；Cruz等人，Blood 122(17)：2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood，118(18)：4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood 116(20)：4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood 122(25)：4129-39(2013)；和16th AnnuMeet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(5月15-18日，Salt Lake City)2013，Abst 10中描述的CD19 CAR。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA、和GFRα-4，连同其他，例如，如WO2014/153270、WO 2014/130635、WO2016/028896、WO 2014/130657、WO2016/014576、WO 2015/090230、WO2016/014565、WO2016/014535和WO2016/025880中描述，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。通过T细胞的基因修饰产生CTL019，所述基因修饰经自失活性复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导，通过稳定的插入介导，所述载体含有EF-1α启动子控制下的CTL019转基因。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞的百分比递送给受试者。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合人源化CD19，例如，可以包含WO2014/153270(通过引用并入本文)的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)。如在WO2014/153270中具体说明，在表1和其中提交的序列表中提供编码CD19CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如，可以包含根据WO2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的CAR分子(例如，CAR1至CAR8的任一个)或抗原结合结构域。如在WO2014/130635中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码CD123CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:142-193中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:142-193中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:147中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:147的氨基酸残基45-59、75-81、114-122、183-187、202-218和/或251-259)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:153中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:153的氨基酸残基45-59、75-81、114-122、183-187、202-218和/或251-259)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:159中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:159的氨基酸残基45-59、75-81、114-122、183-187、202-218和/或251-259)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:165中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:165的氨基酸残基45-59、75-81、114-122、183-187、202-218和/或251-259)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:171中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:171的氨基酸残基52-56、71-87、120-128、183-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:177中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:177的氨基酸残基52-56、71-87、120-128、183-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:183中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:183的氨基酸残基52-56、71-87、120-128、183-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:189中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:189的氨基酸残基52-56、71-87、120-128、183-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:191中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:191的氨基酸残基47-61、77-83、116-124、180-184、199-215和/或248-256)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:193中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:193的氨基酸残基54-58、73-89、122-127、177-187、203-209和/或242-250)。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD123，例如，可以包含根据WO2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的CAR分子(例如，CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32的任一个)或抗原结合结构域。如在WO2016/028896中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:194-413中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:194-413中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合EGFRvIII，例如可以包括根据WO 2014/130657(通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的CAR分子或抗原结合结构域。如在WO 2014/130657中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VLCDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:414-474中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:414-474中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含前导序列，例如，SEQ ID NO:418、424、430、436、442、448、454、460、466或472的氨基酸残基1-21。在其他实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含多组氨酸标签序列，例如，SEQ ID NO:418、424、430、436、442、448、454或460的氨基酸残基268-277、SEQ ID NO:466的氨基酸残基265-274或SEQ ID NO:472的氨基酸残基262-269。
在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:420中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:420的氨基酸残基52-56、71-87、120-123、179-194、210-216和/或249-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:426中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:426的氨基酸残基45-60、76-82、115-123、184-188、203-219和/或251-256)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:432中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:432的氨基酸残基52-56、71-87、120-124、179-194、210-216和/或249-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:438中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:438的氨基酸残基45-60、76-82、115-123、184-188、203-219和/或252-256)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:444中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:444的氨基酸残基52-56、71-87、120-124、179-194、210-216和/或249-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:450中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:450的氨基酸残基52-56、71-87、120-124、179-194、210-216和/或249-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:456中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:456的氨基酸残基45-60、76-82、115-123、184-188、203-219和/或252-256)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:462中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:462的氨基酸残基45-60、76-82、115-123、184-188、203-219和/或252-256)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:468中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:468的氨基酸残基52-56、71-87、119-124、176-191、207-213和/或246-254)。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CD33，例如，可以包含根据WO2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CAR分子(例如，CAR33-1至CAR-33-9的任一个)或抗原结合结构域。如在WO2016/014576中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:475-533中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:475-533中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合间皮素，例如可以包括根据WO 2015/090230(通过引用并入本文)的表2-3的CAR分子或抗原结合结构域。如在WO2015/090230中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:534-625中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:534-625中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:534中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:534的氨基酸残基26-35、50-66、99-106、161-171、187-193和/或226-234)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:535中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:535的氨基酸残基47-56、71-87、120-127、182-192、208-214和/或247-255)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:536中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:536的氨基酸残基26-35、50-66、99-115、170-180、196-202和/或235-243)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:537中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:537的氨基酸残基47-56、71-87、120-136、191-201、217-223和/或256-264)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:538中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:538的氨基酸残基26-35、50-66、99-109、164-174、190-196和/或229-236)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:539中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:539的氨基酸残基47-56、71-87、120-130、185-195、211-217和/或250-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:540中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:540的氨基酸残基26-35、50-66、99-103、158-168、184-189和/或223-232)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:541中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:541的氨基酸残基47-56、71-87、120-124、179-189、205-210和/或244-253)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:542中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:542的氨基酸残基26-35、50-65、99-104、159-169、185-191和/或224-231)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:543中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:543的氨基酸残基47-56、71-86、120-125、180-190、206-212和/或245-252)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:544中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:544的氨基酸残基26-35、50-66、99-115、170-180、196-202和/或235-243)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:545中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:545的氨基酸残基47-56、71-87、120-136、191-201、217-223和/或256-264)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:546中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:546的氨基酸残基26-35、50-66、98-110、165-176、192-198和/或231-240)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:547中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:547的氨基酸残基47-56、71-87、120-131、186-197、213-219和/或252-261)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:548中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:548的氨基酸残基26-35、50-66、99-108、163-173、189-195和/或228-236)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:549中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:549的氨基酸残基47-56、71-87、120-129、184-194、210-216和/或249-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:550中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:550的氨基酸残基26-35、50-66、99-110、165-175、191-197和/或230-238)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:551中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:551的氨基酸残基47-56、71-87、120-131、186-196、212-218和/或251-259)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:552中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:552的氨基酸残基26-35、50-65、99-111、166-182、198-204和/或237-245)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:553中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:553的氨基酸残基47-56、71-86、120-132、187-203、219-225和/或258-266)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:554中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:554的氨基酸残基26-35、50-66、99-104、159-169、185-191和/或224-231)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:555中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:555的氨基酸残基47-56、71-87、120-125、180-190、206-212和/或245-252)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:556中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:556的氨基酸残基26-35、50-66、99-107、162-172、188-194和/或227-236)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:557中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:557的氨基酸残基47-56、71-87、120-128、183-193、209-215和/或248-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:558中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:558的氨基酸残基26-35、50-66、99-110、165-176、192-198和/或231-239)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:559中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:559的氨基酸残基47-56、71-87、120-131、186-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:560中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:560的氨基酸残基26-35、50-66、99-111、166-176、192-198和/或231-239)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:561中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:561的氨基酸残基47-56、71-87、120-132、187-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:562中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:562的氨基酸残基26-35、50-65、99-111、160-169、186-192和/或225-244)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:563中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:563的氨基酸残基47-56、71-86、120-132、181-191、207-213和/或246-255)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:564中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:564的氨基酸残基26-35、50-66、99-112、161-171、187-193和/或226-236)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:565中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:565的氨基酸残基47-56、71-87、120-133、182-192、208-214和/或247-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:566中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:566的氨基酸残基26-35、50-66、99-112、161-171、187-193和/或226-236)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:567中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:567的氨基酸残基47-56、71-87、120-133、182-192、208-214和/或247-257)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:568中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:568的氨基酸残基26-35、50-66、99-111、166-177、193-199和/或232-241)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:569中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:569的氨基酸残基47-56、71-87、120-132、187-198、214-220和/或253-262)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:570中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:570的氨基酸残基26-35、50-66、99-110、165-176、192-198和/或231-240)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:571中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ IDNO:571的氨基酸残基47-56、71-87、120-131、186-197、213-219和/或252-261)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:572中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:572的氨基酸残基26-35、50-66、99-111、166-176、192-198和/或231-239)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:573中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:573的氨基酸残基47-56、71-87、120-132、187-197、213-219和/或252-260)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:574中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:574的氨基酸残基26-35、50-66、99-108、158-167、183-190和/或222-230)。在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含SEQ ID NO:575中的一个或多个(例如，2、3、4、5或全部)重链CDR序列和/或轻链CDR序列(例如，SEQ ID NO:575的氨基酸残基47-56、71-86、120-129、179-188、204-210和/或243-251)。
在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含接头序列(例如，SEQ ID NO:534的氨基酸残基118-137、SEQ ID NO:535的氨基酸残基139-158、SEQ ID NO:536的氨基酸残基127-146、SEQ ID NO:537的氨基酸残基148-167、SEQ ID NO:538的氨基酸残基121-140、SEQ ID NO:539的氨基酸残基142-161、SEQ ID NO:540的氨基酸残基115-134、SEQ IDNO:541的氨基酸残基136-155、SEQ ID NO:542的氨基酸残基116-135、SEQ ID NO:543的氨基酸残基137-156、SEQ ID NO:544的氨基酸残基127-146、SEQ ID NO:545的氨基酸残基148-167、SEQ ID NO:546的氨基酸残基122-141、SEQ ID NO:547的氨基酸残基143-162、SEQID NO:548的氨基酸残基120-139、SEQ ID NO:549的氨基酸残基141-160、SEQ ID NO:550的氨基酸残基122-141、SEQ ID NO:551的氨基酸残基143-162、SEQ ID NO:552的氨基酸残基123-142、SEQ ID NO:553的氨基酸残基144-163、SEQ ID NO:554的氨基酸残基116-135、SEQID NO:555的氨基酸残基137-156、SEQ ID NO:556的氨基酸残基119-138、SEQ ID NO:557的氨基酸残基140-159、SEQ ID NO:558的氨基酸残基132-141、SEQ ID NO:559的氨基酸残基143-162、SEQ ID NO:560的氨基酸残基123-142、SEQ ID NO:561的氨基酸残基144-163、SEQID NO:562的氨基酸残基123-137、SEQ ID NO:563的氨基酸残基144-158、SEQ ID NO:564的氨基酸残基124-138、SEQ ID NO:565的氨基酸残基145-159、SEQ ID NO:566的氨基酸残基124-138、SEQ ID NO:567的氨基酸残基145-159、SEQ ID NO:568的氨基酸残基123-142、SEQID NO:569的氨基酸残基144-163、SEQ ID NO:570的氨基酸残基122-141、SEQ ID NO:571的氨基酸残基143-162、SEQ ID NO:572的氨基酸残基123-142、SEQ ID NO:573的氨基酸残基144-163或SEQ ID NO:575的氨基酸残基141-155)。
在一些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含前导序列(例如，SEQ ID NO:535、537、539、541、543、545、547、549、551、553、555、557、559、561、563、565、567、569、571、573或575的氨基酸残基1-21、或由SEQ ID NO:577、579、581、583、585、587、589、591、593、595、597、599、601、603、605、607、609、611、613、615、617、619、621、623或625的核苷酸残基1-63编码)。
在其它实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合BCMA，例如可以包括根据WO2016/014565(通过引用并入本文)的表1或16、SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子或抗原结合结构域。如在WO2016/014565中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:626-859中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:626-859中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合CLL-1，例如，可以包含根据WO2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域。如在WO2016/014535中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:860-941中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:860-941中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在其他实施方案中，表达CAR的细胞可以特异性结合GFRα-4，例如，可以包括根据WO2016/025880(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域。如在WO2016/025880中具体说明，在其中提交的序列表中提供编码GFRα-4 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包含根据Kabat或Chothia的一个、二、三个VH CDR和一个、二、三个VL CDR)的氨基酸序列和核苷酸序列。与序列表中提供的上述序列同一或基本上同一的氨基酸序列和核苷酸序列特别并入本说明书中。
在某些实施方案中，CAR分子或抗原结合结构域包含根据SEQ ID NO:942-981中任一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:942-981中任一个的核苷酸序列编码，或者与它们基本上同一的序列。
在一个实施方案中，本文所述的任何CAR分子(例如，CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFRα-4的任一者)的抗原结合结构域包含来自上述抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR：HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文所列的抗原结合结构域的一个，二个，三个(例如，全部三个)轻链CDR：LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出或描述的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个方面，抗肿瘤抗原结合结构域是片段，例如单链可变片段(scFv)。在一方面，如本文所述的抗癌症相关抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段与本文所述的癌相关抗原结合，具有野生型或增强的亲和力。
在一些情况下，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见，例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH区和VL区连接在一起产生scFv分子。ScFv分子包含长度和/或氨基酸组成优化的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以大大影响scFv的可变区怎样折叠并相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折叠以使这两个可变区一起形成有功能的表位结合位点。关于接头取向和大小的例子，参见，例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，所述文献通过引用的方式并入本文。
scFv可以在其VL区和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含多组的甘氨酸和丝氨酸重复序列如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:26)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:25)。接头长度的变异性可以保留或增强活性，在活性研究中产生优越功效。
在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。产生这类TCR的方法是本领域已知的。参见例如Willemsen RA等人,Gene Therapy7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther 11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.19(4):365-74(2012)(所述文献通过引用的方式完整并入本文)。例如，可以改造scTCR，其含有来自T细胞克隆的通过接头(例如，柔性肽)连接的Vα和Vβ基因。这种方法对于本身是细胞内的癌相关靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在多个实施方案中，CAR可以设计成包含与CAR的胞外结构域连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个与跨膜区毗邻的额外氨基酸，例如，一个或多个与衍生跨膜区的蛋白质的胞外区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个直至15个胞外区氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个至多15个胞内区氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一缔合的结构域。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最小化与受体复合体的其他构件的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同方面，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列，从而最小化与相同CART中存在的天然结合配偶体的结合结构域相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，当CAR与靶结合，则跨膜结构域能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情况下，跨膜结构域可以借助铰链区(例如，来自人蛋白质的铰链区)与CAR的胞外区(例如，CAR的抗原结合结构域)连接。例如，在一个实施方案中，铰链区可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链区，例如，IgG4铰链区，或CD8a铰链区。在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ IDNO:6的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一个方面，铰链区或间隔区包含IgG4铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:36)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区：
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:37)。
在一个方面，铰链区或间隔区包含IgD铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔区包含具有以下氨基酸序列的铰链区
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，铰链区或间隔区包含由以下核苷酸序列编码的铰链区：
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:24)。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下它将包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以在重组跨膜结构域的每个末端存在。
任选地，2和10个氨基酸长度之间的短寡肽接头或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质区域之间形成键。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链区或间隔区包含KIR2DS2铰链区。
胞质结构域
CAR的胞质结构域或区域包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责活化其中已经引入CAR的免疫细胞的多项正常效应子功能的至少之一功能。
用于本文所述CAR中的胞内信号传导结构域的例子包括协同发挥作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
已知单独通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞并且已知还需要次级和/或共刺激信号。因此，可以将T细胞活化称作由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞内信号传导结构域可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞内信号传导结构域的例子包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称作“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12和CD66d的那些。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如，CD3ζ(例如，本文所述的CD3ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，如与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变ITAM结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含了含有修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，含有优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
共刺激信号传导结构域
CAR的胞内信号传导结构域可以本身包含CD3ζ信号传导结构域，或它可以与本发明CAR背景下有用的任何其他所需的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。在一个实施方案中，胞内结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。
共刺激分子可以是除抗原受体或其配体之外的、淋巴细胞对抗原作出有效反应所需要的细胞表面分子。这类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激作用已经证实在体外增强人CART细胞的扩张、效应子功能和存活并且在体内增进人T细胞留存和抗肿瘤活性(Song等人,Blood.2012；119(3):696-706)。这类共刺激分子的其他例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C和PAG/Cbp。
在CAR的胞质部分内部的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或指定顺序连接。任选地，例如2个和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)长度之间的短寡肽接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成键。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域由接头分子(例如，本文所述的接头分子)分隔。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:7的信号传导结构域。在一个方面，CD3ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:9的信号传导结构域。
在一个方面，胞内信号传导结构域设计成包含CD3ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:15)的核酸序列编码。
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以包含第二CAR，例如，包含不同抗原结合结构域的第二CAR，例如，所述抗原结合结构域针对相同靶或不同的靶(例如，除本文所述的癌相关抗原之外的靶或本文所述的不同癌相关抗原，例如，CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或叶酸受体β)。在一个实施方案中，第二CAR包含针对与癌症相关抗原相同的癌细胞类型所表达的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域、但没有初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，所述第二CAR靶向第二种不同的抗原并且包括具有初级信号传导结构域，但没有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)置于第一CAR上并且将初级信号传导结构域例如CD3ζ置于第二个CAR上可以将CAR活性限制在表达两种靶的细胞上。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域；跨膜结构域和共刺激结构域；和靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)的第二CAR，并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域及靶向除第一靶抗原之外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)的第二CAR，并且包括针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在另一方面，本公开特征在于表达CAR的细胞(例如，CART细胞)的群体。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包括表达具有针对本文所述的癌相关抗原的抗原结合结构域的CAR的第一细胞和表达具有不同抗原结合结构域的CAR的第二细胞，所述不同抗原结合结构域为例如针对本文所述的不同癌相关抗原的抗原结合结构域，例如针对本文所述的癌相关抗原的抗原结合结构域，该抗原结合结构域与由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合的癌相关抗原不同。作为另一个例子，表达CAR的细胞的群体可以包含表达CAR的第一细胞，所述CAR包含针对本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域，和表达CAR的第二个细胞，所述CAR包含针对不同于本文所述的癌症相关抗原的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包含初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述CAR包含次级信号传导结构域。
另一方面，本公开特征在于一个细胞群体，其中群体中的至少一种细胞表达具有针对本文所述的癌症相关抗原的抗原结合结构域的CAR，以及表达另一种物质，例如增强表达CAR的细胞的活性的物质的第二细胞。例如，在一个实施方案中，该物质可以是抑制了抑制性分子的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，PD-1)可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14orCD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质例如包含抑制性分子如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ或这些分子中任一者之片段的第一多肽和作为本文所述胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB、CD27、OX40或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。在一个实施方案中，该物质包含PD-1或其片段的第一多肽和本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
示例性CAR分子
上文在表1中提供抗CD19结合结构域的序列。可以使用表1中描述的任何抗原结合结构域与下面提供的一种或多种另外的CAR组分产生完整CAR构建体。
●前导序列(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
●前导序列(核酸序列)(SEQ ID NO:12)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
●CD8铰链区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:2)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
●CD8铰链区(核酸序列)(SEQ ID NO:13)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
●CD8跨膜区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
●跨膜区(核酸序列)(SEQ ID NO:17)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
●4-1BB胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:7)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
●4-1BB胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:18)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
●CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:9)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
●CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:20)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
●CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO:10)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
●CD3ζ(核酸序列；NCBI参考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO:21)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
IgG4铰链区(氨基酸序列)(SEQ ID NO:36)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链区(核苷酸序列)(SEQ ID NO:37)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
EF1α启动子
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA(SEQ ID NO:11)。
Gly/Ser(SEQ ID NO:25)
GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:26)：这个序列可以包含1-6个“Gly Gly Gly Gly Ser”重复单元
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:27)
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:28)
GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO:29)
GGGS
聚腺苷酸(SEQ ID NO:30)，聚腺苷酸1-5000
聚腺苷酸(SEQ ID NO:31)，聚胸苷酸1-100
聚腺苷酸(SEQ ID NO:32)，聚胸苷酸1-5000
聚腺苷酸(SEQ ID NO:33)，聚腺苷酸1-5000
聚腺苷酸(SEQ ID NO:34)，聚腺苷酸1-400
聚腺苷酸(SEQ ID NO:35)，聚腺苷酸1-2000
Gly/Ser(SEQ ID NO:38)：这个序列可以涵盖1-10个“Gly Gly Gly Ser”重复单元
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
表4中显示可以用于本文所述方法中的示例性CD19 CAR构建体：
表4：CD19 CAR构建体
CAR与其他分子或物质的共表达
第二CAR的共表达
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞可以进一步包含第二CAR，例如第二CAR，其包括不同的抗原结合结构域，例如针对相同靶(例如CD19)或不同靶(例如，CD19以外的靶，例如，本文描述的靶)的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR靶向第一抗原并且包括具有共刺激信号传导结构域、但没有初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，所述第二CAR靶向第二种不同的抗原并且包括具有初级信号传导结构域，但没有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27、OX-40或ICOS)置于第一CAR上并且将初级信号传导域例如CD3ζ置于第二CAR上可以将CAR活性限制针对表达两种靶的细胞。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，所述第二CAR靶向另一种抗原并包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，所述第二CAR靶向另一抗原并且包括针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含本文所述的XCAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合在正常细胞(例如也表达X的正常细胞)存在而不在癌细胞上存在的抗原的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的细胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGF(例如，TGFβ)的胞内结构域。
在一个实施方案中，当表达CAR的细胞包含两种或更多种不同CAR时，不同CAR的抗原结合结构域可以是这样的，从而抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如，作为不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scFv)，例如，第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。例子包括但不限于重链可变结构域、天然缺乏轻链的结合分子、衍生自常规4-链抗体的单结构域、工程化结构域和除抗体衍生的那些支架以外的单结构域支架。SDAB分子可以是现有技术的任何分子，或将来的任何单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠、人、骆驼、骆马、七鳃鳗、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。这个术语还包括来自骆驼物种和鲨鱼之外的物种中的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以衍生自鱼类中存在的免疫球蛋白的可变区，例如，从鲨鱼血清中存在的称作新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型衍生的那种可变区。产生从NAR(“IgNAR”)可变区衍生的单结构域分子的方法在WO 03/014161和Streltsov(2005)ProteinSci.14:2901-2909中描述。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称作缺少轻链的重链。这类单结构域分子例如在WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人,(1993)Nature363:446-448中公开。出于清晰原因，从天然缺少轻链的重链分子衍生的这种可变结构域在本文中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼属(Camelidae)物种，例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链分子；这类VHH处于本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、CDR移植的、人源化、骆驼化、去免疫化和/或在体外生成(例如，通过噬菌体展示法选择)。
还已经发现，具有多个膜包埋的嵌合受体(所述受体包含在所述受体的抗原结合结构域之间的相互作用的抗原结合结构域)的细胞可能是不期望的，例如因为其抑制一种或多种抗原结合结构域结合其相应抗原的能力。因此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的膜包埋的嵌合受体的细胞，所述受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域。本文还公开了编码第一和第二非天然存在的膜包埋的嵌合受体的核酸，所述受体包含使这种相互作用最小化的抗原结合结构域，以及制备和使用这些细胞和核酸的方法。在一个实施方案中，第一和第二非天然存在的嵌合膜包埋的受体之一的抗原结合结构域包含scFv，另一个包含单个VH结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域、或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。
在一些实施方案中，本文的组合物包含第一和第二CAR，其中第一和第二CAR之一的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，另一个不是scFv。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域、或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米体。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，另一个包含单个VH结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域、或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，另一个包含纳米体。在一些实施方案中，第一和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，另一个包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面时，第一CAR的抗原结合结构域与其相应抗原的结合作用基本上不因第二CAR的存在减少。在一些实施方式中，在所述第二CAR的存在下，所述第一CAR的抗原结合结构域与其相应抗原的结合作用是在所述第二种CAR不存在的情况下所述第一CAR的抗原结合结构域与其相应抗原的结合作用的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，第一和第二CAR的抗原结合结构域彼此结合少于如果两者均为scFv抗原结合结构域时的结合。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
增强CAR活性的物质的共表达
另一方面，本文所述的表达CAR的细胞可进一步表达另一种物质，例如增强表达CAR的细胞的活性或适应性的物质。
例如，在一个实施方案中，该物质可以是抑制调控或调节例如抑制T细胞功能的分子的物质。在一些实施方案中，调控或调节T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，PD1)可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、或TGFβ。
在实施方案中，物质，例如抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如抑制性蛋白质或系统，例如，成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指内切核酸酶(ZFN)，如本文所述，可以用于抑制分子的表达，所述分子调控或调节(例如抑制)表达CAR的细胞中的T细胞功能。在一个实施方案中，所述物质是shRNA，例如本文所述的shRNA。在一个实施方案中，调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的物质在表达CAR的细胞内被抑制。例如，抑制调控或调节(例如，抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。
在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质包含第一多肽(例如，抑制性分子)，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)接合。在一个实施方案中，该物质包含例如抑制性分子的第一多肽，所述抑制性分子为例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷或TGFβ或前者中任何一者的片段(例如，前者中任何一者的细胞外结构域的至少一部分)，和第二多肽，其是本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如，本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人,1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2与PD1结合时，下调T细胞活化(Freeman等人,2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001Nat Immunol 2:261-8；CART等人,2002 Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中丰富(Dong等人,2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人,2005 CancerImmunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人,2004 Clin Cancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。
在一个实施方案中，该物质包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，可以与跨膜结构域和胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ融合(本文也称作PD1CAR)。在一个实施方案中，与本文所述的XCAR组合使用时，PD1 CAR改善T细胞的持续性。在一个实施方案中，CAR是PD1 CAR，包含如SEQ ID NO:105中加下划线所示的PD1胞外结构域。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqt dklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevpt ahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:105)。
在一个实施方案中，PD1 CAR包含下文提供的氨基酸序列(SEQ ID NO:106)。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrv tqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:106)。
在一个实施方案中，该物质包含编码PD1 CAR的核酸序列(例如，本文所述的PD1CAR)。在一个实施方案中，下文显示PD1 CAR的核酸序列，下文在SEQ ID NO:103中对PD1ECD加下划线：
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttct ggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcga ccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagacc gacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaa tggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgc tggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaact gcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc(SEQ ID NO:103)。
在另一个例子中，在一个实施方案中，增强表达CAR的细胞的活性的物质可以是共刺激分子或共刺激分子配体。共刺激分子的例子包括MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其它例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体，例如，如本文所述。共刺激分子配体的例子包括CD80、CD86、CD40L、ICOSL、CD70、OX40L、4-1BBL、GITRL和LIGHT。在实施方案中，共刺激分子配体是不同于CAR的共刺激分子结构域的共刺激分子的配体。在实施方案中，共刺激分子配体是与CAR共刺激分子结构域相同的共刺激分子的配体。在一个实施方案中，共刺激分子配体是4-1BBL。在一个实施方案中，共刺激配体是CD80或CD86。在一个实施方案中，共刺激分子配体是CD70。在实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步工程化，以表达一种或多种另外的共刺激分子或共刺激分子配体。
CAR与趋化因子受体的共同表达
在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞，例如表达CD19 CAR的细胞，还包含趋化因子受体分子。趋化因子受体CCR2b或CXCR2在T细胞中的转基因表达增强了对分泌CCL2-或CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,JImmunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，认为在表达CAR的细胞中表达的趋化因子受体(其识别由肿瘤，例如实体瘤分泌的趋化因子)可以改善表达CAR的细胞归巢到肿瘤中，促进表达CAR的细胞向肿瘤的浸润、并增强表达CAR的细胞的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适用于在本文所述的表达CAR的细胞(例如，CAR-Tx)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子选择要用本文所述的CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞进一步包含，例如表达CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同的载体上或在两个不同的载体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子在相同载体上的实施方案中，CAR和趋化因子受体分子各自由两种不同的启动子控制、或者在同一启动子的控制下。
编码CAR的核酸构建体
本发明还提供免疫效应细胞，例如通过本文所述的方法产生的免疫效应细胞，其包含编码本文所述的一种或多种CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子作为DNA构建体提供。
本文所述的核酸分子可以是DNA分子、RNA分子或其组合。在一个实施方案中，核酸分子是编码如本文所述的CAR多肽的mRNA。在其它实施方案中，核酸分子是包括任何前述核酸分子的载体。
在一个方面，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，其序列已针对哺乳动物细胞中表达经密码子优化。在一个方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，其整个序列已针对哺乳动物细胞中的表达经密码子优化。密码子优化指以下发现：编码性DNA中同义密码子(即，编码相同氨基酸的密码子)出现的频率在不同物种中偏倚。这种密码子简并性允许相同多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如至少在美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
因此，一方面，例如通过本文所述的方法产生的免疫效应细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含与本文所述的肿瘤抗原结合的抗原结合结构域；跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)以及包含刺激性结构域的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)，例如共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的初级信号传导结构域，例如本文所述的ζ链)。
本发明还提供载体，其中插入了编码CAR的核酸分子(例如本文所述的核酸分子)。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的附加优点，在于它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有附加的低免疫原性优点。逆转录病毒载体也可以例如是γ逆转录病毒载体。γ逆转录病毒载体可以例如包含启动子、包装信号(ψ)、引物结合位点(PBS)、一个或多个(例如，两个)长末端重复序列(LTR)和目的转基因，例如，编码CAR的基因。γ逆转录病毒载体可以缺少病毒结构性基因如gag、pol和env。示例性γ逆转录病毒载体包括鼠白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)和骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)和从中衍生的载体。其他γ逆转录病毒载体例如在Tobias Maetzig等人,“Gammaretroviral Vectors:Biology,Technology andApplication”Viruses.2011Jun；3(6):677–713中描述。
在另一个实施方案中，包含编码所需CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子如睡美人、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成编码CAR的核酸的表达。参见下文June等人,2009Nature ReviewsImmunology 9.10:704-716，所述文献通过引用的方式并入本文。
简言之，一般通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成的核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节目的核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
可以将核酸克隆入众多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆入包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，可以将表达载体以病毒载体的形式向细胞提供。病毒载体技术是本领域熟知的并且例如在Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)中及在其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、便利限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发众多基于病毒的系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体输送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。众多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。一般，这些位于起始位点上游30-110bp的区域内，不过已经显示众多启动子也在起始位点下游含有功能性元件。启动子元件之间的间距往往灵活，从而当各元件反转或相对于彼此移动时，启动子功能保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达编码CAR的核酸分子的启动子的例子是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，所述α亚基负责酶促输送氨酰基tRNA至核糖体。EF1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已证明能有效驱动从克隆入慢病毒载体的核酸分子表达CAR。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。在一个方面，EF1a启动子包含实施例中提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。还构思诱导型启动子作为本发明的部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这类表达时启动与之有效连接的多核苷酸序列表达或在不需要这类表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施方案中，可能需要截短的PGK启动子(例如，与野生型PGK启动子序列比较时，具有一个或多个，例如1、2、5、10、100、200、300或400个核苷酸缺失的PGK启动子)。下文提供示例性PGK启动子的核苷酸序列。
WT PGK启动子：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQ ID NO:982)。
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:983)。
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ IDNO:984)。
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:985)。
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:986)。
载体还可以例如包括促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体型复制并且在原核生物中复制的元件(例如SV40复制起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素耐药基因和/或zeocin标志物)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报道基因或这两者以促进从寻求用病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择出现表达的细胞。在其他方面，选择标记可以在独立的DNA片段上携带并且在共转染法中使用。选择标记和报道基因可以旁侧分布有能够在宿主细胞中实现表达的适宜调节序列。可用的选择标记例如包括抗生素耐药性基因，如neo等。
报道基因用于确定潜在的经转染的细胞及评价调节序列的功能。通常，报道基因是这样的基因，所述基因不存在于接受生物或组织中或不由接受生物或组织表达并且编码其表达由某种轻易可检测特性(例如，酶活性)展示的多肽。在DNA已经引入接受细胞之后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术制备或商业地获得。通常，将显示最高报道基因表达水平的具有最少5'侧翼区的构建体鉴定为启动子。这类启动子区可以与报道基因连接并用来评价多种物质调节启动子驱动型转录的能力。
在实施方案中，载体可以包含两个或更多个核酸序列，所述核酸序列编码CAR，例如，本文所述的CAR，例如，CD19 CAR，和第二CAR，例如，抑制性CAR或与除CD19之外的抗原特异性结合的CAR。在这样的实施方案中，编码CAR的两个或多个核酸序列由相同框中的单个核酸分子编码和作为单个多肽链编码。在这方面，两个或更多个CAR可以例如被一个或多个肽剪切位点分开(例如，自剪切位点或细胞内蛋白酶的底物)。肽剪切位点的例子包括T2A、P2A、E2A或F2A位点。向细胞引入基因并表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可以通过本领域的任何方法轻易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞)中。例如，表达载体可以通过物理手段、化学手段或生物学手段转移至宿主细胞中。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、粒子轰击法、微量注射法、电穿孔法等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。用于引入多核苷酸至宿主细胞中的合适方法是磷酸钙转染法。
用于引入目的多核苷酸至宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA载体和RNA载体。病毒载体和尤其逆转录病毒载体已经具有变成使用最广泛的将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒我、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的化学手段包括胶态分散体系，如大分子复合物、纳米囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载具的示例性胶态体系是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有定向递送核酸的其他方法是可获得的，如用导引的纳米粒子或其他合适的亚微米尺度递送系统递送多核苷酸。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(体外，离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸相关联的连接分子连接到脂质体上，截留在脂质体中，与脂质体复合，分散在含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其它方式与脂质相关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以存在于双层结构中，如胶束或具有“塌陷”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可能是天然存在的或合成的脂质的脂肪物质。例如，脂质包括天然存在于胞质中的脂肪液滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类别。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体。脂质体可以表征为具有磷脂双层膜和内水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有通过水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在闭合结构形成之前经历自我重排，并将水和溶解的溶质截留在脂质双层之间(Ghosh等人，1991Glycobiology 5：505-10)。然而，也包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构，或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂转染胺(lipofectamine)-核酸复合体。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了确认宿主细胞中重组核酸序列的存在，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)检测特定肽的存在或不存在，或通过本文所述的测定来鉴定属于本发明范围内的物质。
一旦产生本文所述的CAR，则各种测定法可以用来评价分子的活性，如但不限于抗原刺激后扩张T细胞的能力、在再次刺激不存在的情况下维持T细胞扩张的能力和适宜的体外模型和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详细描述评价本发明CAR之作用的测定法。
可以使用原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析来检测单体和二聚体的存在，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第695段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
可以通过流式细胞术测量在抗原刺激后CAR+ T细胞的体外扩张。例如，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合物用αCD3/αCD28aAPC刺激，随后用在待分析的启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在培养第6日通过流式细胞术评价CD4+和/或CD8+ T细胞亚群中的GFP荧光。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。备选地，CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的混合物在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并且使用双顺反子慢病毒载体在第1天用CAR转导，其中所述双顺反子慢病毒载体使用2A核糖体跳跃序列表达CAR连同eGFP。培养物用本文所述的癌症相关抗原阳性的K562细胞(表达本文所述的癌症相关抗原的K562)，野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞，在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下再刺激培养物，然后洗涤。每隔1日按100IU/ml添加外源IL-2至培养物。使用基于珠的计数法，通过流式细胞术计数GFP+ T细胞。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量再次刺激不存在的情况下维持的CAR+ T细胞扩张。参见，例如，Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用所示CAR转导后，在培养第8天使用Coulter Multisizer III粒子计数器Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞体积(fl)。
也可以使用动物模型来测量表达CAR的细胞活性，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第698段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
可以评估剂量依赖性CAR治疗反应，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第699段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。之前已经(例如，在Milone等人,Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009))描述对细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第700段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。细胞毒性可以通过标准的51Cr释放测定法评估，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第701段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。也可以例如使用xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)，通过测量贴壁细胞电阻抗的变化，评估细胞毒性。在一些实施方案中，在多个时间点测量细胞毒性。
成像技术可用于评估荷瘤动物模型中CAR的特异性运输和增殖，例如，如2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第702段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入本文。其他测定法，包括本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些，也可用于评估本文所述的CAR。
调节嵌合抗原受体的策略
存在可以调节CAR活性的许多方式。例如，使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶的诱导性凋亡过程(参见，例如，Di Stasa等人,N Egnl.J.Med.2011 Nov.3；365(18):1673-1683)可以用作本发明CAR治疗中的安全开关。在一个实施方案中，表达本发明CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)还包含诱导性凋亡开关，其中人胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶9)或修饰形式与允许条件性二聚化的人FKB蛋白修饰融合。在小分子(如雷帕霉素类似物(例如，AP 1903、AP20187))存在下，诱导性胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶9)被激活并导致表达本发明CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)快速凋亡和死亡。基于胱天蛋白酶的诱导性凋亡开关(或这种开关的一个或多个方面)的例子已经在例如，US2004040047；US20110286980；US20140255360；WO1997031899；WO2014151960；WO2014164348；WO2014197638；WO2014197638中描述；所述文献均通过引用的方式并入本文。
在另一个例子中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型胱天蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致胱天蛋白酶-9活化和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介导二聚化的二聚化化学诱导物(CID)结合结构域。这导致表达CAR的细胞的可诱导和选择性消耗。在一些情况下，iCaspase-9分子由与CAR编码载体分立的核酸分子编码。在一些情况下，iCaspase-9分子由与编码CAR的载体相同的核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关，以避免对表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如Song等人,Cancer GeneTher.2008；15(10):667-75；Clinical Trial Id.No.NCT02107963，和Di Stasi等人.N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的备选策略包括利用失活或关闭CAR活化的小分子或抗体，例如，通过消耗表达CAR的细胞，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
在一个实施方案中，CAR疗法包括施用T细胞消耗剂。在一个实施方案中，T细胞消耗剂是例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体诱导的细胞死亡而消耗表达CAR的细胞的试剂。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由能够诱导细胞死亡，例如ADCC或补体诱导的细胞死亡的分子识别的抗原(例如，靶抗原)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达能够由抗体或抗体片段靶向的靶蛋白(例如受体)。这类靶蛋白的例子包括但不限于EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如，整联蛋白ανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如，TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/basigin、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7、和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个胞外表位但是缺乏细胞质结构域内的一个或多个区域的形式)。
在其他实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺少信号传导能力，但保留由能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗)识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后消耗表达CAR的细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda等人,Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一个策略包括表达一个高度紧密的标记/自杀基因，所述基因将本文描述的表达CAR的细胞中来自CD32和CD20抗原的结合利妥昔单抗的靶表位组合，导致表达CAR的细胞选择性消耗，例如通过ADCC(参见例如Philip等人,Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于消耗本文所述的表达CAR的细胞的其它方法包括施用CAMPATH，其是单克隆抗CD52抗体，所述抗体选择性结合并靶向成熟淋巴细胞，例如表达CAR的细胞，例如通过诱导ADCC进行破坏。在其它实施方案中，可以使用CAR配体(例如抗独特型抗体)选择性靶向表达CAR的细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数目。在其它实施方案中，CAR配体(例如抗独特型抗体)可以偶联至诱导细胞杀伤的试剂，例如毒素，从而减少表达CAR的细胞的数目。备选地，CAR分子本身可以如此配置，从而可以调节(例如开启和关闭)活性，如下文所述。
在其它实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，例如减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞消耗剂。在其它实施方案中，T细胞消耗剂是如本文实施例中所述的抗CD52抗体，例如阿仑珠单抗。
在一些实施方案中，本文公开的方法还包括在用细胞(例如本文所述的免疫效应细胞)处理后施用T细胞消耗剂，从而减少(例如，消耗)表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)。此类T细胞消耗剂可以用来有效地消耗表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞)以减轻毒性。在一些实施方案中，根据本文的方法制备表达CAR的细胞，例如根据本文方法测定(例如，在转染或转导之前或之后)测定。
在一些实施方案中，在施用细胞(例如本文所述的免疫效应细胞群体)后一、二、三、四或五周施用T细胞消耗剂。
在一些实施方案中，表达CAR的细胞共表达CAR和靶蛋白，例如，天然表达靶蛋白，或经工程化以表达靶蛋白。例如，细胞(例如，免疫效应细胞群体)可以包括包含CAR核酸(例如本文所述的CAR核酸)和编码靶蛋白的核酸的核酸(例如载体)。
在一个实施方案中，T细胞消耗剂是CD52抑制剂，例如，抗CD52抗体分子，例如，阿伦珠单抗。
在其它实施方案中，细胞，例如免疫效应细胞群体表达如本文所述的CAR分子(例如CD19 CAR)和由T细胞消耗剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20。在靶蛋白是CD20的实施方案中，T细胞消耗剂是抗CD20抗体，例如，利妥昔单抗。
在任何上述方法的进一步实施方案中，所述方法还包括将细胞例如造血干细胞或骨髓移植入受试者中。
另一方面，本发明的特征在于细胞移植之前对受试者进行调理的方法。该方法包括向受试者施用有效量的包含CAR核酸或多肽例如CD19 CAR核酸或多肽的细胞。在一些实施方案中，细胞移植是干细胞移植，例如造血干细胞移植或骨髓移植。在其它实施方案中，在细胞移植之前整备受试者包括减少受试者中表达靶标的细胞(例如表达CD19的正常细胞或表达CD19的癌细胞)的数目。
RCAR
在其他实施方案中，可以控制CAR活性的可调节性CAR(RCAR)是优化CAR疗法的安全性和疗效需要的。RCAR可以包含一组多肽，在最简单的实施方案中一般两种多肽，其中本文所述的标准CAR的组件(例如，抗原结合结构域和胞内信号传导结构域)分配在分离的多肽或构件上。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一个实施方案中，本发明的CAR利用二聚化开关，如例如WO2014127261中描述的那些二聚化开关，所述文献通过引用的方式并入本文。
本文和例如2015年3月13日提交的国际公开号WO 2015/090229的第527-551段中提供了这种可调节CAR的附加描述和示例性结构，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在一些实施方案中，RCAR涉及开关结构域，例如FKBP开关结构域，如SEQ ID NO:131中所示，或包含具有与FRB结合能力的FKBP的片段，例如如SEQ ID NO:132中所示。在一些实施方案中，RCAR涉及包含FRB序列的开关结构域，例如如SEQ ID NO:116中所示，或突变型FRB序列，例如SEQ ID NO:134-139的任一者中所示。
在一个方面，RCAR包含两种多肽或构件：1)包含胞内信号传导结构域(例如，本文所述的初级胞内信号传导结构域)和第一开关结构域的胞内信号传导构件；2)包含如本文所述的(例如靶向CD19的)抗原结合结构域和第二开关结构域的抗原结合构件。任选地，RCAR包含本文所述的跨膜结构域。在一个实施方案中，可以在胞内信号传导构件上、抗原结合构件上或在这两者上设置跨膜结构域。(除非另外说明，否则本文中描述RCAR的构件或元件时，该顺序可以是如所提供的那样，但是也可以包括其他顺序)。换而言之，在一个实施方案中，顺序如文本中所述那样，但是在其他实施方案中，顺序可以是不同的。例如，各元件在跨膜区一侧上的顺序可以与例子不同，例如，开关结构域相对于胞内信号传导结构域的安置可以是不同的，例如，倒转。
在一个实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构域可以形成胞内或胞外二聚化开关。在一个实施方案中，二聚化开关可以是同型二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域是相同的，或异二聚化开关，例如，其中第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同。
在实施方案中，RCAR可以包含“多重开关”。多重开关可以包含异二聚化开关结构域或同型二聚化开关结构域。多重开关在第一构件(例如，抗原结合构件)和第二构件(例如，胞内信号传导构件)上独立地包含多个例如，2、3、4、5、6、7、8、9、或10个开关结构域。在一个实施方案中，第一构件可以包含多个第一开关结构域，例如，基于FKBP的开关结构域，并且第二构件可以包含多个第二开关结构域，例如，基于FRB的开关结构域。在一个实施方案中，第一构件可以包含第一开关结构域和第二开关结构域，例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域，并且第二构件可以包含第一开关结构域和第二开关结构域，例如，基于FKBP的开关结构域和基于FRB的开关结构域。
在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含一个或多个胞内信号传导结构域(例如，初级胞内信号传导结构域)和一个或多个共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，抗原结合构件可以包含一个或多个胞内信号传导结构域，例如，一个或多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件包含多个，例如，2个或3个本文所述的共刺激信号传导结构域，例如，选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40的共刺激信号传导结构域，并且在多个实施方案中，不包含初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件从胞外至胞内方向包含以下共刺激信号传导结构域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-41BB；或41BB-CD28。在这类实施方案中，胞内结合构件包含CD3ζ结构域。在这样一个实施方案中，RCAR包含(1)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含抗原结合结构域、跨膜结构域和两个共刺激结构域和第一开关结构域；和(2)胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含跨膜结构域或膜束缚结构域和至少一个初级胞内信号传导结构域和第二开关结构域。
一个实施方案提供其中抗原结合构件未系留于CAR细胞表面的RCAR。这允许具有胞内信号传导构件的细胞在不用编码抗原结合构件的序列转化细胞的情况下便利地与一个或多个抗原结合结构域配对。在这类实施方案中，RCAR包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：第一开关结构域、跨膜结构域、胞内信号传导结构域(例如，初级胞内信号传导结构域)和第一开关结构域；和2)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含：抗原结合结构域和第二开关结构域，其中抗原结合构件不包含跨膜结构域或膜束缚结构域并且任选地不包含胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，RCAR还可以包含3)第二抗原结合构件，所述第二抗原结合构件包含第二抗原结合结构域，例如，结合被抗原结合结构域结合的不同抗原的第二抗原结合结构域；和第二开关结构域。
本文中还提供其中抗原结合构件包含双特异性激活和靶向能力的RCAR。在这个实施方案中，抗原结合构件可以包含多个，例如，2、3、4、或5个抗原结合结构域，例如，scFv，其中每种抗原结合结构域结合至靶抗原，例如不同的抗原或相同的抗原，例如，相同抗原上的相同或不同表位。在一个实施方案中，多个抗原结合结构域串联，并且任选地，接头或铰链区布置在每个抗原结合结构域之间。本文中描述了合适的接头和铰链区。
一个实施方案提供了具有允许增殖变换的构型的RCAR。在这个实施方案中，该RCAR包含：1)胞内信号传导构件，所述胞内信号传导构件包含：任选地，跨膜结构域或膜束缚结构域；一种或多种(例如，选自41BB、CD28、CD27、ICOS和OX40的)共刺激信号传导结构域，以及开关结构域；和2)抗原结合构件，所述抗原结合构件包含：抗原结合结构域、跨膜结构域和初级胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ结构域)，其中抗原结合构件不包含开关结构域或不包含与胞内信号传导构件上开关结构域二聚化的开关结构域。在一个实施方案中，抗原结合构件不包含共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含来自同型二聚化开关的开关结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导构件包含异二聚化开关的第一开关结构域，并且RCAR包含第二胞内信号传导构件，所述第二胞内信号传导构件包含异二聚化开关的第二开关结构域。在这类实施方案中，第二胞内信号传导构件包含与胞内信号传导构件相同的胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，二聚化开关是胞内的。在一个实施方案中，二聚化开关是胞外的。
在本文描述的任何RCAR构型中，第一开关结构域和第二开关结构域包含如本文所述的基于FKBP-FRB的开关。
本文中还提供包含本文所述的RCAR的细胞。经工程化以表达RCAR的任何细胞可以用作RCARX细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是T细胞并且称作RCART细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是NK细胞并且称作RCARN细胞。
本文中还提供包含编码RCAR的序列的核酸和载体。编码RCAR的多种元件的序列可以设置在相同的核酸分子上，例如，相同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体。在一个实施方案中，(i)编码抗原结合构件的序列和(ii)编码胞内信号传导构件的序列可以存在于相同的核酸(例如，载体)上。可以例如通过使用独立的启动子，或通过使用双顺反子转录产物(通过切割单一翻译产物或通过翻译两种独立的蛋白质产物，所述双顺反子转录产物可以导致产生两种蛋白质)实现相应蛋白质的产生。在一个实施方案中，编码可切割肽(例如，P2A或F2A序列)的序列布置在(i)和(ii)之间。在一个实施方案中，编码IRES(例如，EMCV IRES或EV71IRES)的序列布置在(i)和(ii)之间。在这些实施方案中，(i)和(ii)转录为单个RNA。在一个实施方案中，第一启动子与(i)有效连接并且第二启动子与(ii)有效连接，从而(i)和(ii)转录为独立的mRNA。
备选地，编码RCAR的多种元件的序列可以设置在不同的核酸分子上，例如，不同的质粒或载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体上。例如，(i)编码抗原结合构件的序列可以存在于第一核酸(例如，第一载体)上，并且(ii)编码胞内信号传导构件的序列可以存在于第二核酸(例如，第二载体)上。
二聚化开关
二聚化开关可以是非共价或共价的。在非共价二聚化开关中，二聚化分子促进各开关结构域之间的非共价相互作用。在共价二聚化开关中，二聚化分子促进各开关结构域之间的共价相互作用。
在一个实施方案中，RCAR包含基于FKBP/FRAP或基于FKBP/FRB的二聚化开关。FKBP12(FKBP、或FK506结合蛋白)是充当天然产物(免疫抑制药物雷帕霉素)的初始胞内靶的丰富胞质蛋白。雷帕霉素与FKBP结合并且与大PI3K同源物FRAP(RAFT、mTOR)结合。FRB是FRAP的93氨基酸部分，所述部分足以结合FKBP-雷帕霉素复合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.和Schreiber,S.L.(1995)Proc Natl Acad Sci U S A 92:4947-51)。
在实施方案中，基于FKBP/FRAP(例如，基于FKBP/FRB)的开关可以使用二聚化分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
FKBP的氨基酸序列如下：
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V VH Y T G M LED G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H AT LV F D V E L L K L E T S Y(SEQ ID NO:131)
在实施方案中，FKBP开关结构域可以包含具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的FKBP片段，例如，SEQ ID NO:131的加下划线部分，其是：
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K FD S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L TI S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S(SEQ IDNO:132)
FRB的氨基酸序列如下：
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLMEAQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO:133)
如该术语在本文中所用那样，“基于FKBP/FRAP(例如，基于FKBP/FRB)的开关”指包含第一开关结构域和第二开关结构域的二聚化开关，所述第一开关结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(例如，RAD001)存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的FKBP片段或其类似物并且与SEQ ID NO:131或132的FKBP序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不多于30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基；所述第二开关结构域包含了具有在雷帕霉素或雷帕霉素类似物存在下与FRB或片段或其类似物结合的能力的FRB片段或其类似物并且与SEQ ID NO:133的FRB序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不多于30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一个实施方案中，本文所述的RCAR包含一个包含在SEQ ID NO:131(或SEQ ID NO:132)中公开的氨基酸残基的开关结构域和一个包含在SEQ ID NO:133中公开的氨基酸残基的开关结构域。
在实施方案中，FKBP/FRB二聚化开关包含修饰的FRB开关结构域，所述修饰的FRB开关结构域显示出改变(例如，增强)的基于FRB的开关结构域(例如，修饰的FRB开关结构域、基于FKBP的开关结构域)和二聚化分子(例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如，RAD001)之间的复合物形成。在一个实施方案中，修饰FRB开关结构域包含一个或多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个选自氨基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105和F2108处的突变，其中野生型氨基酸突变成任何其他天然存在的氨基酸。在一个实施方案中，突变FRB包含在E2032处的突变，其中E2032突变成苯丙氨酸(E2032F)、甲硫氨酸(E2032M)、精氨酸(E2032R)、缬氨酸(E2032V)、酪氨酸(E2032Y)、异亮氨酸(E2032I)(例如，SEQ ID NO:134)或亮氨酸(E2032L)(例如，SEQ ID NO:135)。在一个实施方案中，突变FRB包含在T2098处的突变，其中T2098突变成苯丙氨酸(T2098F)或亮氨酸(T2098L)，例如，SEQ ID NO:136。在一个实施方案中，突变FRB包含在E2032处和T2098处的突变，其中E2032突变成任何氨基酸并且其中T2098突变成任何氨基酸，例如，SEQ ID NO:137。在一个实施方案中，突变FRB包含E2032I和T2098L突变，例如，SEQ ID NO:138。在一个实施方案中，突变FRB包含E2032L和T2098L突变，例如，SEQ ID NO:139。
表10.对二聚化分子具有增加的亲和力的示例性突变FRB
其他合适的二聚化开关包括基于GyrB-GyrB的二聚化开关、基于赤霉素的二聚化开关、标签/结合物二聚化开关和halo-标签/snap-标签二聚化开关。按照本文提供的指南，这类开关和有关的二聚化分子将是普通技术人员显而易见的。
二聚化分子
开关结构域之间的缔合由二聚化分子引发。在二聚化分子存在下，开关结构域之间的相互作用或缔合允许与第一开关结构域缔合(例如，融合)的多肽和与第二开关结构域缔合(例如，融合)的多肽之间的信号转导。在非限制水平的二聚化分子存在下，信号转导增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍，例如，如本文所述的系统中测量。
雷帕霉素和雷帕霉素类似物(有时称作雷帕类似物)，例如，RAD001、可以用作本文所述的基于FKBP/FRB的二聚化开关中的二聚化分子。在一个实施方案中二聚化分子可以选自雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、RAD001(依维莫司)、佐他莫司(zotarolimus)、坦罗莫司、AP-23573(地磷莫司)、百奥莫司(biolimus)和AP21967。适合随基于FKBP/FRB的二聚化开关一起使用的额外雷帕霉素类似物进一步在名为“联合疗法”的部分中或在名为“示例性mTOR抑制剂”的子部分中描述。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域、铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1、和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可与衔接子分子或细胞内信号传导结构域，例如DAP12相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述在国际公开号WO2014/145252中，所述文献的内容通过引用的方式并入本文。
分裂的CAR(split CAR)
在一些实施方案中，表达CAR的细胞包含分裂抗原CAR。公开号WO 2014/055442和WO 2014/055657中更详细地描述了分裂的CAR方案。简而言之，分裂的CAR系统包含细胞，所述细胞表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活并且细胞杀伤活性开启。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原存在下完全活化。
CAR配体及其用途
备选地或与本文公开的方法组合，公开了用于以下一种或多种的方法和组合物；检测和/或定量表达CAR的细胞(例如体外或体内(例如临床监测))；免疫细胞扩张和/或活化；和/或CAR特异性选择，其涉及使用CAR配体。在一个示例性实施方案中，CAR配体是结合CAR分子的抗体，例如结合CAR的细胞外抗原结合结构域的抗体(例如，结合抗原结合结构域的抗体，例如抗独特型抗体；或结合细胞外结合结构域的恒定区的抗体)。在其它实施方案中，CAR配体是CAR抗原分子(例如，本文所述的CAR抗原分子)。
在一个方面，公开了一种用于检测和/或定量表达CAR的细胞的方法。例如，CAR配体可用于在体外或体内检测和/或定量表达CAR的细胞(例如，临床监测患者中表达CAR的细胞或对患者给药)。该方法包括：
提供CAR配体(任选地，标记的CAR配体，例如包括标签、珠、放射性或荧光标记的CAR配体)；
获取表达CAR的细胞(例如，获取含有表达CAR的细胞的样品，例如，制造样品或临床样品)；
在发生结合的条件下使表达CAR的细胞与CAR配体接触，从而检测存在的表达CAR的细胞的水平(例如，量)。表达CAR的细胞与CAR配体的结合可以使用标准技术如FACS、ELISA等检测。
另一方面，公开了扩张和/或活化细胞(例如免疫效应细胞)的方法。该方法包括：
提供表达CAR的细胞(例如，表达第一CAR的细胞或瞬时表达CAR的细胞)；
在发生免疫细胞扩张和/或增殖的条件下使所述表达CAR的细胞与CAR配体例如本文所述的CAR配体接触，从而产生活化和/或扩张的细胞群体。
在某些实施方案中，CAR配体存在于基质(例如，固定化或附着到基质，例如非天然存在的基质)上。在一些实施方案中，基质是非细胞基质。非细胞基质可以是选自例如平板(例如，微量滴定板)、膜(例如，硝酸纤维素膜)、基体(matrix)、芯片或珠的固相支持物。在实施方案中，CAR配体存在于基质中(例如，基质表面上)。CAR配体可以固定、附着或共价或非共价结合(例如交联)至基质。在一个实施方案中，将CAR配体连接(例如共价连接)到珠上。在前述实施方案中，免疫细胞群体可以在体外或离体扩张。该方法还可以包括在CAR分子的配体存在下培养免疫细胞群体，例如，使用本文所述的任何方法。
在其它实施方案中，扩张和/或活化细胞的方法还包括添加第二刺激分子例如CD28。例如，CAR配体和第二刺激分子可固定在基质例如一个或多个珠上，从而提供增加的细胞扩张和/或活化。
另一方面，提供了一种用于选择或富集表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合选择细胞。
在其它实施方案中，提供了用于消耗、减少和/或杀死表达CAR的细胞的方法。该方法包括使表达CAR的细胞与本文所述的CAR配体接触；并基于CAR配体的结合靶向细胞、从而减少表达CAR的细胞的数量和/或杀死表达CAR的细胞。在一个实施方案中，CAR配体与毒性剂(例如，毒素或细胞消融性药物)偶联。在另一个实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性。
可以在本文公开的方法中使用的示例性抗CAR抗体描述于例如WO 2014/190273和J Jena等人,“Chimeric Antigen Receptor(CAR)-Specific Monoclonal Antibody toDetect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”,PLOS March 2013 8:3 e57838，所述文献的内容通过引用的方式并入。在一个实施方案中，抗独特型抗体分子识别抗CD19抗体分子，例如，抗CD19 scFv。例如，抗独特型抗体分子可以与Jena等人,PLOS 2013年3月8:3e57838中描述的CD19特异性CAR mAb克隆第136.20.1号结合竞争；可以具有与CD19特异性CAR mAb克隆第136.20.1号相同的CDR(例如，使用Kabat定义、Chothia定义或Kabat和Chothia定义的组合，具有以下一个或多个，例如，全部：VH CDR1、VH CDR2、CHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3)；可以具有CD19特异性CAR mAb克隆第136.20.1号的一个或多个(例如，2个)可变区，或可以包含CD19特异性CAR mAb克隆第136.20.1号。在一些实施方案中，抗独特型抗体根据Jena等人中描述的方法产生。在另一个实施方案中，抗独特型抗体分子是WO 2014/190273中描述的抗独特型抗体分子。在一些实施方案中，抗独特型抗体分子可以具有与WO 2014/190273的抗体分子如136.20.1相同的CDR(例如，以下一个或多个，例如，全部：VH CDR1、VH CDR2、CHCDR3、VL CDR1、VLCDR2和VLCDR3)；可以具有WO 2014/190273的抗体分子的一个或多个(例如，2个)可变区，或可以包含WO 2014/190273的抗体分子如136.20.1。在其他实施方案中，抗CAR抗体与CAR分子的胞外结合结构域的恒定区结合，例如，如WO2014/190273中所述。在一些实施方案中，抗CAR抗体与CAR分子的胞外结合结构域的恒定区(例如，重链恒定区(例如，CH2-CH3铰链区)或轻链恒定区)结合。例如，在一些实施方案中，抗独特型抗体分子可以与WO 2014/190273中描述的2D3单克隆抗体竞争结合，具有与2D3相同的CDR(例如，以下一个或多个，例如，全部：VH CDR1、VH CDR2、CHCDR3、VL CDR1、VLCDR2和VLCDR3)；或具有2D3的一个或多个(例如，2个)可变区，或包含如WO 2014/190273中所述的2D3。
在一些方面和实施方案中，本文的组合物和方法针对特定T细胞亚群优化，例如，如2015年7月31日提交的美国系列号PCT/US2015/043219中描述，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。在一些实施方案中，与对照T细胞(例如表达相同构建体的不同类型的T细胞(例如，CD8+或CD4+))相比，优化的T细胞亚群显示增强的持续性。
在一些实施方案中，CD4+ T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适于CD4+ T细胞(例如，针对导致CD4+ T细胞中增强的持久性而优化)的胞内信号传导结构域，例如，ICOS结构域。在一些实施方案中，CD8+ T细胞包含本文所述的CAR，所述CAR包含适于CD8+ T细胞(例如，针对导致CD8+ T细胞增强的持久性而优化)的胞内信号传导结构域，例如4-1BB结构域、CD28结构域或不为ICOS结构域的另一种共刺激结构域。在一些实施方案中，本文所述的CAR包含本文所述的抗原结合结构域，例如，包含抗原结合结构域的CAR。
在一方面，本文描述了治疗受试者(例如患有癌症的受试者)的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的：
1)包含CAR的CD4+ T细胞(CARCD4+)，所述CAR包含：
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，例如第一共刺激结构域，例如，ICOS结构域；和
2)包含CAR的CD8+ T细胞(CARCD8+)，所述CAR包含：
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
胞内信号传导结构域，例如第二共刺激结构域，例如4-1BB结构域、CD28结构域或不为ICOS结构域的另一种共刺激结构域；
其中CARCD4+和CARCD8+彼此不同。
任选地，所述方法还包括施用：
3)包含CAR的第二CD8+ T细胞(第二CARCD8+)，所述CAR包含:
抗原结合结构域，例如，本文所述的抗原结合结构域；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域，其中第二CARCD8+包含不存在于CARCD8+上的细胞内信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域，并且任选地不包含ICOS信号传导结构域。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可以用来递送编码本文所述的CAR的核酸至细胞或组织或受试者中。
在一些实施方案中，非病毒方法包括利用转座子(也称作转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将本身插入基因组中的某位置处的一段DNA，例如，能够自我复制并将其副本插入基因组中的一段DNA或可以是从较长核酸剪接出来并插入基因组中的另一个位置的一段DNA。例如，转座子包含DNA序列由反向重复序列组成，所述反向重复序列在用于换位的基因旁侧分布。
使用转座子递送核酸的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见，例如，Aronovich等人,Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20；Singh等人,Cancer Res.15(2008):2961–2971；Huang等人,Mol.Ther.16(2008):580–589；Grabundzija等人,Mol.Ther.18(2010):1200–1209；Kebriaei等人,Blood.122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515–16；Bell等人,Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65；和Ding等人,Cell.122.3(2005):473-83，所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶来源。转座酶可以令转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转置到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒切下转座子(包含转基因))并将它插入宿主细胞的基因组中。参见，例如，Aronovich等人,上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人,NucleicAcids Res.41.3(2013):1829-47；和Singh等人,Cancer Res.68.8(2008):2961–2971，所述文献均通过引用的方式并入本文。示例性转座酶包括Tc1/水手型转座酶，例如，SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃性转座酶)。参见，例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人,所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS的使用允许高效整合和表达转基因，例如，编码本文所述CAR的核酸。本文中提供例如使用转座子系统如SBTS，产生稳定表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法。
根据本文所述的方法，在一些实施方案中，将一种或多种含有SBTS组分的核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，T细胞或NK细胞)。例如，通过标准核酸(例如，质粒DNA)递送方法(例如，本文所述的方法，例如，电穿孔法、转染法或脂质体转染法)递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其他实施方案中，向系统提供两种核酸(例如，双质粒系统)，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子和第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共递送入宿主细胞中。
在一些实施方案中，通过使用采取SBTS的基因插入法和采取核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化大范围核酸酶(meganucleases)、再工程化归巢核酸内切酶)的遗传编辑法的组合，生成表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许再编程细胞(例如，T细胞或NK细胞)和直接输注细胞至受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于便利和成本相对低地产生满足患者群体、储存期间稳定性和缺少免疫原性所要求的足够量。
生物聚合物递送方法
在一些实施方案中，本文公开的一种或多种表达CAR的细胞可经由生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)施用或递送至受试者。生物聚合物支架可以支持或增强本文所述的表达CAR的细胞的输送、扩张和/或分散。生物聚合物支架包含可以是天然存在或合成的生物相容性(例如，基本上不诱导炎性反应或免疫应答)和/或生物可降解性聚合物。示例性生物聚合物例如描述于2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的段落1004-1006中，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
药物组合物和治疗
在一些方面，本公开提供了治疗患者的方法，其包括施用如本文所述制造的表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其它疗法组合。在一些方面，本公开提供一种治疗患者的方法，其包括施用包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物，任选地与一种或多种其它疗法组合。在一些方面，本公开提供一种运送或接收包含如本文所述的表达CAR的细胞的反应混合物的方法。在一些方面，本公开提供了一种治疗患者的方法，其包括接收如本文所述制造的表达CAR的细胞，并且还包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其它疗法组合。在一些方面，本公开提供了一种治疗患者的方法，包括制造本文所述的表达CAR的细胞，并且还包括向患者施用表达CAR的细胞，任选地与一种或多种其它疗法组合。其他疗法可以是例如癌疗法，例如化疗。
本文所述的方法还可包括在药物组合物中配制表达CAR的细胞。药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的表达CAR的细胞，例如，多个表达CAR的细胞。这类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。可以配制组合物例如供静脉内施用。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如，不存在)可检测水平的杂质，例如，所述杂质选自内毒素、支原体(Mycoplasma)、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残余抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自以下的至少一种：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)A群。
当谈及“免疫学上有效量”、“抗癌有效量”、“抑制癌有效量”或“治疗有效量”时，待施用的组合物的精确数量可以由医师在考虑个体年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及患者(受试者)的状况的情况下确定。通常可以声称，本文所述的包含免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物可以按104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内部的全部整数值)的剂量施用。T细胞组合物也可以按这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含至少约1x 106、1.1x106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含多达约1x 106、1.1x106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含约1.1x 106–1.8x 107个细胞/kg。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含至少约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。在一些实施方案中，一剂CAR细胞(例如，CD19 CAR细胞)包含多达约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。在某些方面，可能需要向受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、然后随后重新抽取血液(或进行单采血液成分术)、活化免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)、并且用这些活化和扩张的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)再次输注患者。这个过程可以每数周实施多次。在某些方面，可以活化来自10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在某些方面，活化来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。
在实施方案中，将表达CAR的细胞(例如，表达CD19 CAR的细胞)按多剂量施用，例如，第一剂、第二剂和任选地第三剂。在实施方案中，该方法包括治疗受试者(例如，患有癌症)(例如，急性淋巴样白血病(ALL))的成年受试者，包括向受试者施用第一剂、第二剂和任选地一个或多个追加剂量，每种剂量包含表达CAR分子(例如，CD19 CAR分子，例如，根据SEQID NO:89的CAR分子)的免疫效应细胞。
在实施方案中，该方法包括施用2-5x106个表达CAR的活细胞/kg的剂量，其中受试者具有小于50kg的身体质量；或
施用1.0-2.5x108个表达CAR的活细胞，其中受试者具有至少50kg的身体质量。
在实施方案中，将单剂量施用至受试者，例如，儿童受试者。
在实施方案中，按依次日施用剂量，例如，在第1天施用第一剂，在第2天施用第二剂并且在第3天施用任选的第三剂(如果施用的话)。
在实施方案中，施用第四、第五或第六剂或更多剂量。
在实施方案中，第一剂包含约10％的总剂量，第二剂包含约30％的总剂量，并且第三剂包含约60％总剂量，其中前述的百分数具有100％的总和。在实施方案中，第一剂包含约9-11％、8-12％、7-13％或5-15％的总剂量。在实施方案中，第二剂包含约29-31％、28-32％、27-33％、26-34％、25-35％、24-36％、23-37％、22-38％、21-39％或20-40％的总剂量。在实施方案中，第三剂包含约55-65％、50-70％、45-75％或40-80％的总剂量。在实施方案中，总剂量指在1周、2周、3周或4周期间施用的表达CAR的活细胞的总数目。在施用二剂的一些实施方案中，总剂量指在第一剂和第二剂中施用至受试者的表达CAR的活细胞数目的总和。在施用三剂的一些实施方案中，总剂量指在第一剂、第二剂和第三剂中施用至受试者的表达CAR的活细胞数目的总和。
在实施方案中，根据其中表达CAR的活细胞的数目计量剂量。可以使用结合CAR分子的抗体分子和可检测标志物，例如，通过流式细胞术测量CAR表达。可以例如通过细胞计数器测量成活力。
在实施方案中，按递增剂量施用表达CAR的活细胞。在实施方案中，第二剂大于第一剂，例如，大10％、20％、30％或50％。在实施方案中，第二剂两倍、三倍、四倍或五倍于第一剂的规格。在实施方案中，第三剂大于第二剂，例如，大10％、20％、30％或50％。在实施方案中，第三剂两倍、三倍、四倍或五倍于第二剂的规格。
在某些实施方案中，该方法包括以下a)-h)中的一、二、三、四、五、六、七或全部项：
a)在第一剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于在第二剂中施用的表达CAR的活细胞数目的1/3；
b)在第一剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于施用的表达CAR的活细胞的总数的1/X，其中X是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
c)在第一剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于1x 107、2x 107、3x 107、4x107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108或5x 108个表达CAR的活细胞，并且第二剂大于第一剂；
d)在第二剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于在第三剂中施用的表达CAR的活细胞数目的1/2；
e)在第二剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于施用的表达CAR的活细胞的总数的1/Y，其中Y是2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50；
f)在第二剂中施用的表达CAR的活细胞的数目不多于1x 107、2x 107、3x 107、4x107、5x 107、6x 107、7x 107、8x 107、9x 107、1x 108、2x 108、3x 108、4x 108或5x 108个表达CAR的活细胞，并且第三剂大于第二剂；
h)如此选择施用第一、第二和任选地第三剂的剂量和时间段，从而受试者按不大于4、3、2或1的水平经历CRS。
在实施方案中，总剂量是约5x 108个表达CAR的活细胞。在实施方案中，总剂量是约5x 107-5x 108个表达CAR的活细胞。在实施方案中，第一剂是约5x 107(例如，±10％、20％或30％)个表达CAR的活细胞，第二剂是约1.5x 108(例如，±10％、20％、或30％)个表达CAR的活细胞，并且第三剂是约3x 108(例如，±10％、20％或30％)个表达CAR的活细胞。
在实施方案中，在接受剂量后(例如，在接受第一剂、第二剂和/或第三剂后)评价受试者的CRS。
在实施方案中，受试者接受CRS治疗，例如，托珠单抗(tocilizumab)、皮质类固醇、依那西普或siltuximab。在实施方案中，在第一剂包含CAR分子的细胞之前或之后施用CRS治疗。在实施方案中，在第二剂包含CAR分子的细胞之前或之后施用CRS治疗。在实施方案中，在第三剂包含CAR分子的细胞之前或之后施用CRS治疗。在实施方案中，在第一和第二剂包含CAR分子的细胞之间和/或在第二剂和第三剂包含CAR分子的细胞之间施用CRS治疗。
可以按任何方便的方式进行主题组合物的施用。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、皮内、肿瘤内、淋巴结内、髓内、肌肉内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内注射，例如通过皮内或皮下注射施用于患者。免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物可以直接注射入肿瘤、淋巴结或感染部位。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与减少TREG细胞群体的分子组合施用于受试者。减少TREG细胞数目(例如，消耗REG细胞)的方法是本领域已知的并且包括例如CD25消耗、施用环磷酰胺和调节GITR功能。不希望受理论约束，认为在单采血液成分术之前或在施用本文所述的表达CAR的细胞之前，减少受试者中TREG细胞的数目减少了肿瘤微环境中不想要的免疫细胞(例如，Treg)的数目并降低受试者的复发风险。
在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子，如GITR激动剂和/或消耗调节性T细胞(TREG)的GITR抗体组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与环磷酰胺组合施用至受试者。在一个实施方案中，将GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或消耗Treg的GITR抗体)在施用表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在实施方案中，将环磷酰胺在施用(例如，输注或回输)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前施用至受试者。在实施方案中，将环磷酰胺和抗GITR抗体在施用(例如，输注或回输)表达CAR的细胞之前或在细胞的单采血液成分术之前施用至受试者。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，实体癌或血液学癌如ALL或CLL)。在一个实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有ALL。在实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述的实体癌。示例性GITR激动物例如包括GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，双价抗GITR抗体)，例如，以下文献中描述的GITR融合蛋白；美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO2010/003118和2011/090754，或例如以下文献中描述的抗GITR抗体：美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO2011/028683、PCT公开号WO2013/039954、PCT公开号WO2005/007190、PCT公开号WO2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO99/40196、PCT公开号WO2001/03720、PCT公开号WO99/20758、PCT公开号WO2006/083289、PCT公开号WO2005/115451、美国专利号7,618,632和PCT公开号WO 2011/051726。
在一个实施方案中，将本文所述表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)联合施用给受试者。在一个实施方案中，GITR激动剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
治疗方法
在一个方面，本公开提供了治疗与表达本文所述的肿瘤抗原相关的疾病的方法。
在一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法，包括向受试者施用有效量的免疫效应细胞群体，其中通过使瞬时表达第一CAR的免疫效应细胞群体与相应抗原接触来扩张免疫效应细胞群体。
在另一个方面，本发明的特征在于一种治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法，包括向受试者施用有效量的表达第二CAR的免疫效应细胞群体，其中通过使瞬时表达第一CAR的免疫效应细胞群体与相应抗原接触来扩张免疫效应细胞群体并用包含编码第二CAR的核酸的载体进一步转导免疫效应细胞群体。
在一个方面，本公开通过向需要其的受试者提供经工程化以表达CAR的、例如本文描述的CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，提供了治疗癌症(例如，血液学癌，例如ALL和CLL)的方法。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、MCL(套细胞淋巴瘤)或MM(多发性骨髓瘤)。
在一个方面，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达CAR(例如，如本文所述的CAR，例如，CD19 CAR)的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症(例如，血液学癌，如ALL和CLL)的方法，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)、CLL(慢性淋巴细胞白血病)、DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)、MCL(套细胞淋巴瘤)、霍奇金淋巴瘤或MM(多发性骨髓瘤)。
本公开内容包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)经基因修饰(例如，通过慢病毒载体转导)以表达CAR，并且将CAR表达细胞输注到需要其的接受者中。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)能够在体内复制，产生可以导致持久肿瘤控制的长期持续性。使用慢病毒载体产生的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)将具有稳定的CAR表达。在各个方面，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)或其后代在施用T细胞至患者后在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、二年、三年、四年或五年。
本发明还包括一种细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)经修饰，例如通过体外转录的RNA修饰，以瞬时表达CAR，并且将表达CAR的细胞输注到需要其的接受者中。通过CAR RNA转导产生的表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)(例如通过转染或电穿孔)在转导后瞬时表达RNA CAR持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，施用于患者的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)在T细胞施用于患者后持续小于一个月，例如三周、两周、一周。
在一个实施方案中，本公开提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症(例如，血液癌症，例如ALL和CLL)的方法，所述CAR特异性靶向或结合本文所述的肿瘤抗原(或癌症相关抗原)。在又一个实施方案中，治疗方法包括改变表达CAR的细胞的制造以富集幼稚T细胞，例如，如本文所述。
在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)经工程化以表达CD19CAR，用于治疗患有癌症(例如血液学癌，例如ALL和CLL)的受试者，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL或CLL。欲在免疫效应细胞中表达的CD19 CAR分子可以包含本领域任何抗CD19抗原结合结构域(例如表1或表4中提供的那些)与本文所述的任何CAR结构域组合以产生完整的CAR构建体。例如，完整的CAR构建体是表4中列出的CAR。表4提供了使用本文所述的多种CAR结构域(例如，跨膜和细胞内信号传导结构域)和表1或表4中列出的抗CD19抗原结合结构域产生的示例性完整CD19 CAR构建体。将氨基酸序列命名为(aa)，并将核酸序列命名为(nt)。
在一个方面，本公开提供了用表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)疗法治疗癌症(例如，与CD19表达相关的癌症)的方法。示例性的癌症包括但不限于例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B-ALL、T-ALL、ALL；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。
可以用本文所述方法治疗的额外癌症或血液学病状例如包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、瓦尔登氏巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合等。
上述血液学病状可以与表达CD19相关。此外，与CD19表达相关的疾病包括但不限于例如与CD19表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前病症或增殖性疾病。
在一个实施方案中，本公开提供了治疗CLL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗ALL的方法。
在另一个实施方案中，本公开提供了治疗B细胞ALL的方法。
在一方面，本公开提供了用CAR表达细胞(例如，T细胞、NK细胞)(例如如本文所述CD19 CAR表达细胞(例如，T细胞、NK细胞)，例如CTL019)治疗患有癌症(例如，血液学癌，如ALL和CLL)的受试者的方法。在一个实施方案中，本公开提供用表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)治疗受试者的方法，所述细胞与另一种治疗药，例如，本文所述的另一种治疗药(例如，另一种CAR，例如，本文所述的另一种CAR、抑制性CAR，例如，本文所述的抑制性CAR；化疗；激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂，例如，mTOR抑制剂、BTK抑制剂)、检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)、医护标准疗法等组合。所述组合可以是例如与任何本文所述的活性剂组合。
在一个实施方案中，干细胞移植包括自体干细胞移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括异体干细胞移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括同种异体骨髓移植。在一个实施方案中，干细胞移植包括造血干细胞移植(HSCT)。在一个实施方案中，造血干细胞衍生自各种组织，包括但不限于骨髓、外周血、脐带血及其组合。
在一个方面，本公开提供了治疗与CD19表达相关的疾病的方法。在一个方面，本发明提供用于治疗其中部分肿瘤为CD19阴性且部分肿瘤为CD19阳性的疾病的方法。例如，所提供的方法可用于治疗已经接受与CD19升高的表达相关的疾病治疗的受试者，其中经历了升高水平的CD19的治疗的受试者表现出与升高水平的CD19相关的疾病。
在一个方面，提供的方法包括含有有效连接到启动子以在哺乳动物细胞(例如，T细胞或NK细胞)中表达的CD19 CAR的载体。在一个方面，所提供的方法包括表达CD19 CAR的重组细胞(例如，T细胞或NK细胞)用于治疗表达CD19的肿瘤的方法，其中表达CD19 CAR的重组T细胞称为表达CD19 CAR的细胞。在一个方面，根据提供的方法施用的表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)能够使肿瘤细胞与其表面上表达的至少一种CD19 CAR接触，从而使表达CAR的细胞靶向肿瘤细胞并且抑制肿瘤的生长。
在一个方面，本公开的特征在于抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法，其包括使肿瘤细胞与本文所述的表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)接触，从而使表达CAR的细胞响应于抗原而活化并靶向癌细胞，其中抑制肿瘤的生长。
在一个方面，本公开内容包括一种细胞疗法，其中T细胞经基因修饰以表达CAR，并且将表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)输注到需要其的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR修饰的细胞(例如，T细胞或NK细胞)能够在体内复制，产生可以导致持久肿瘤控制的长期持续性。在各个方面，施用于患者的细胞或其后代在施用细胞至患者后在患者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、二年、三年、四年或五年。
本公开还包括一种细胞疗法，其中细胞(例如，T细胞、NK细胞)经修饰(例如通过体外转录的RNA)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且将表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)输注到需要其的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在各个方面，在向患者施用细胞(例如，T细胞、NK细胞)之后，施用于患者的细胞存在少于一个月，例如三周、两周、一周。
不希望受任何特定理论的约束，由CAR修饰的细胞(例如，T细胞、NK细胞)引起的抗肿瘤免疫应答可能是主动或被动免疫应答，或备选地可以因直接与间接免疫应答所致。在一个方面，CAR转导的T细胞显示出响应于表达CD19的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和强力溶细胞活性，抵抗可溶性CD19抑制，介导旁观者杀伤作用并介导建立的人肿瘤消退。例如，在表达CD19的肿瘤的不均一视野内部抗原较少的肿瘤细胞可能易遭CD19重定向的T细胞间接破坏，其中所述CD19重定向的T细胞事先已经与毗邻的抗原阳性癌细胞反应。
在一个方面，本文所述的全人CAR修饰的细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以是一种用于哺乳动物中离体免疫和/或体内疗法的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。
关于离体免疫，在将细胞施用于受试者之前，以下至少一种在体外发生:i)扩张细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，或iii)低温保存细胞。
离体程序是本领域已知并且在下文更充分地讨论。简而言之，将细胞从受试者(例如人)分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用至哺乳动物受者以提供治疗益处。哺乳动物受者可以是人并且CAR修饰的细胞可以相对于受者是自体的。备选地，细胞可以相对于受者是同种异体的、同基因的或异种的。
血液学癌
血液学癌疾病是影响血液、骨髓和淋巴系统的癌类型，如白血病和恶性淋巴组织增生症。
白血病可以划分成急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步划分为急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。其他相关的疾病包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称作“白血病前期”)，其是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合，和转变成AML的风险。
本公开提供了治疗癌症的组合物和方法。在一个方面，癌症是血液学癌，包括但不限于白血病或淋巴瘤。在一个方面，本发明的表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)可以用来治疗癌症和恶性肿瘤，如，但不限于例如，急性白血病，包括但不限于例如，B-ALL、T-ALL、ALL；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如，CML、CLL；额外的血液学癌或血液学疾病，包括但不限于例如，B细胞早幼粒细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤、瓦尔登氏巨球蛋白血症和作为依据髓样血细胞无效产生(或异型增生)联合的多样性血液学疾病集合的“白血病前期”等。
本公开还提供了抑制增殖或减少表达CD19的细胞群体的方法，所述方法包括使包含表达CD19的细胞的细胞群与本文所描述的与表达CD19的细胞结合的表达CD19 CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)接触。在具体方面，本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞的群体增殖或减少所述群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与与表达CD19的细胞结合的本文所述的表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)接触。在一个方面，本公开提供了抑制表达CD19的癌细胞群体的增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使表达CD19的癌细胞群体与本文所述的与表达CD19的细胞结合的表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)接触。在某些方面，相对于阴性对照，表达抗CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)将在患有骨髓性白血病或与CD19表达细胞相关的另一种癌症的受试者或动物模型中细胞和/或癌细胞的数量、数目、量或百分比减少至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％。在一个方面，受试者是人。
本公开还提供了用于预防、治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病(例如，表达CD19的血液学癌或非典型癌)的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本文所述的与表达CD19的细胞结合的表达CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)。在一个方面，受试者是人。与CD19表达细胞相关的病症的非限制性例子包括自身免疫性病症(例如狼疮)、炎性疾病(如变态反应和哮喘)和癌症(如表达CD19的血液学癌或非典型癌)。
本公开还提供了用于预防、治疗和/或控制与CD19表达细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用本文所述的与表达CD19的细胞结合的表达CD19 CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)。在一个方面，受试者是人。
本公开提供了用于预防与CD19表达细胞相关的癌症(例如，血液学癌例如ALL和CLL)复发的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用本文所述的与表达CD19的细胞结合的表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一个方面，所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的与有效量的另一种疗法组合的本文所述的表达CD19 CAR的细胞(例如T细胞、NK细胞)，所述细胞与表达CD19的细胞结合。
联合疗法
应当理解，如上文和本文所述的任何癌症疗法可以与一种或多种另外的疗法组合施用以治疗和/或减轻本文所述的癌症的症状。药物组合物可以与一种或多种其它疗法或治疗剂同时施用、在其他疗法之前或之后施用。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与其它已知的活性剂和疗法组合使用。如本文所用，“组合”施用意指，在受试者罹患病症期间向受试者递送两种或更多种不同治疗，例如，在受试者已经诊断患有该病症后并且在该病症已经治愈或消除或治疗已经出于其他原因而停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始递送第二治疗时，一种治疗的递送仍然正在进行，从而就施用而言存在重叠。这有时在本文中称作“同时”或“同步递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在开始递送第二种治疗前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗因为联合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，在第二治疗较少时观察到等同作用，或第二治疗减少症状到更大程度，大于如果第二治疗在第一治疗不存在时施用所见的程度、或采用第一治疗时观察到类似的情况。在一些实施方案中，如此递送，从而与该病症相关的症状或其他参数的减少大于一种治疗在另一种治疗不存在下递送情况下将会观察到的减少。两种治疗药的效果可以部分加合、完全加合或超过加合。递送可以是这样的，从而当递送第二治疗药时，仍然可检测第一治疗药的效果。
本文所述的表达CAR的细胞和至少一种另外的治疗剂可以同时或在相同或分开的组合物中施用或顺序施用。对于依次施用，本文所述的表达CAR的细胞可以首先施用并且额外的药物可以接着施用，或施用顺序可以反转。
在其他方面，本文所述的表达CAR的细胞可以与手术、化疗、照射、免疫抑制剂如环孢霉素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢霉素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和放射肽疫苗组合用于治疗方案中，如Izumoto等人,2008J NEUROSURG108:963-971中描述。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与化学治疗剂组合使用。示例性化疗药包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))、长春碱类生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如，苯达莫司汀、环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)、抗代谢物(包括例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)、免疫调节剂如沙立度胺或沙立度胺衍生物(例如，来那度胺)及其组合。
示例性mTOR抑制剂包括但不限于RAD001、坦罗莫司；地磷莫司(正式称作deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-氮杂三环并[30.3.1.04,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669、并且在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989、)；simapimod(CAS164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502、CAS1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧待-[[4-(4-氧-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰L-α-天冬氨酰L-丝氨酸，内盐(SF1126、CAS936487-67-1)(SEQ ID NO:140)、XL765及其组合。
示例性免疫调节剂包括但不限于阿夫土珠单抗(afutuzumab)(从可获得)；PEG化非格司亭来那度胺(CC-5013、雷利米得(Revlimid))；沙立度胺actimid(CC4047)；IRX-2(从IRX Therapeutics可获得的人细胞因子的混合物，包含白介素1、白介素2和干扰素γ、CAS951209-71-5)及其组合。
示例性蒽环类包括但不限于多柔比星(盐酸多柔比星和)；博来霉素佐柔比星(盐酸dauorubicin、柔红霉素和盐酸红比霉素(rubidomycin)、)；脂质体佐柔比星(枸橼酸佐柔比星脂质体、)；米托蒽醌(DHA、米托蒽醌)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)及其组合。
示例性长春花生物碱类包括但不限于酒石酸长春瑞滨(长春瑞滨)、长春新碱长春地辛)；长春碱(也称作硫酸长春碱、长春花碱和VLB、Alkaban-AQ和)；长春瑞滨(长春瑞滨)及其组合。
示例性蛋白酶体抑制剂包括但不限于硼替佐米卡非佐米(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧-1-(苯基甲基)乙基-L-丝氨酰胺(ONX-0912)及其组合。
示例性的GITR激动剂包括但不限于GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，二价抗GITR抗体)，例如，在美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO 2010/003118和2011/090754中描述的GITR融合蛋白或例如在美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、PCT公开号WO 2013/039954、PCT 公开号WO2005/007190、PCT公开号WO 2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO 99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT 公开号WO99/20758、PCT公开号WO2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632和PCT公开号WO2011/051726中描述的抗GITR抗体。
在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)(例如CTL019))与mTOR抑制剂(例如本文所述的mTOR抑制剂)(例如雷帕霉素信号传导途径的靶标，例如RAD001)组合施用于受试者，例如经鉴定为部分应答者或非应答者的受试者。在一个实施方案中，将mTOR抑制剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，mTOR抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液学癌例如ALL和CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞(例如表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)(例如CTL019))与GITR激动剂(例如，本文所述的GITR激动剂)组合施用于受试者，例如经鉴定为部分应答者或非应答者的受试者。在一个实施方案中，将GITR激动剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有癌症(例如，血液学癌例如ALL和CLL)。在一个实施方案中，受试者患有ALL。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，该物质可以是抑制了抑制性分子的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、或成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)可以用来在表达CAR的细胞中抑制抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。在一个实施方案中，抑制表达CAR的细胞内部的抑制性分子。在这些实施方案中，对抑制性分子表达进行抑制的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如，全部组分)的核酸连接。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可以例如是与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，所述抑制剂可以是与PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称作MDX-010和MDX-101并且作为销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(tremelimumab)(从Pfizer可获得的IgG2单克隆抗体，以前称作ticilimumab、CP-675,206))。在一个实施方案中，所述抑制剂是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抑制剂是与LAG3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，所述抑制剂是与CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)结合的抗体或抗体片段。
PD1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Agata等人,1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示PD1的两种配体PD-L1和PD-L2与PD1结合时，下调T细胞活化(Freeman等人,2000 JExp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001 Nat Immunol 2:261-8；CART等人,2002 Eur JImmunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中丰富(Dong等人,2003 J Mol Med 81:281-7；Blank等人,2005 Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人,2004ClinCancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。PD1、PD-L1及PD-L2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。
例如，纳武单抗(nivolumab)(也称作BMS-936558或MDX1106；Bristol-MyersSquibb)是特异性阻断PD1的全人IgG4单克隆抗体。与PD1特异性结合的纳武单抗(克隆5C4)和其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO 2006/121168中公开。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是与PD1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD1单克隆抗体在WO 2009/101611中公开。派姆单抗(Pembrolizumab)(以前称作lambrolizumab并且又称作Keytruda、MK03475；Merck)是与PD1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD1抗体在US 8,354,509和WO 2009/114335中公开。MEDI4736(Medimmune)是与PDL1结合的人单克隆抗体并且抑制配体与PD1的相互作用。MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化的IgG1单克隆抗体。针对PD-L1的MDPL3280A和其他人单克隆抗体在美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中公开。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链可变区和轻链可变区在WO 2010/077634的SEQ IDNO:20和21中显示)和MDX-1 105(也称作BMS-936559和例如WO 2007/005874中公开的抗PD-L1结合物)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，在WO 2010/027827和WO 2011/066342中公开)是阻断PD1和B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其他抗PD-1抗体包括AMP514(Amplimmune)，连同其他，例如，US 8,609,089、US 2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD1抗体。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules to PD-1 and Uses Thereof”的US 2015/0210769(所述文献通过引用的方式完整并入本文)中所述的抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称为全部CDR)，所述CDR来自抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E的任一者；或如表1所述；或由表1中的核苷酸序列或与任何前述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码，或包含密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，所述可变区来自本文所述的抗体，例如选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E中任一者的抗体；或如表1中所述，或由表1中或如US2015/0210769的表1中所述的核苷酸序列或与任何前述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包括：
(a)重链可变区(VH)，其包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和轻链可变区(VL)，其包含SEQ IDNO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每者在US 2015/0210769的表1中公开；
(b)VH，其包含选自SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，每者在US2015/0210769的表1中公开；
(c)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每者在US2015/0210769的表1中公开；或
(d)VH，其包含SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和VL，其包含SEQ ID NO:10的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32的VLCDR3氨基酸序列，每者在US2015/0210769的表1中公开；或
在下文的组合中，在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:224的VHCDR1氨基酸序列；SEQID NO:2或SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(VL)，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:13的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14的VLCDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的VLCDR3氨基酸序列，每者在US 2015/0210769的表1中公开。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约1至30mg/kg，例如，约5至25mg/kg、约10至20mg/kg、约1至5mg/kg或约3mg/kg的剂量施用。给药方案可以从例如一周一次变动至每2、3或4周一次。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以约1至20mg/kg的剂量每隔一周施用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体分子)的剂量是近平剂量(flatdose)。在一些实施方案中，将抗PD-1抗体分子通过注射(例如，皮下或静脉内)以约200mg至500mg例如，约250mg至450mg、约300mg至400mg、约250mg至350mg、约350mg至450mg或约300mg或约400mg的剂量(例如，近平剂量)施用。给药方案(例如，近平给药方案)可以从例如一周一次变动至每2、3、4、5或6周一次。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以约300mg至400mg的剂量每三周一次或每四周一次施用。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以从约300mg起的剂量每三周一次施用。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以从约400mg起的剂量每四周一次例如通过静脉内输注施用。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以从约300mg起的剂量每四周一次例如通过静脉内输注施用。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子以从约400mg起的剂量每三周一次例如通过静脉内输注施用。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含来自重链可变区和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称为全部CDR)，所述CDR来自BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-Clone-K、BAP058-Clone-L、BAP058-Clone-M、BAP058-Clone-N或BAP058-Clone-O中任一者的重链可变区和轻链可变区；或如表1中所述、或由US-2016/0108123的表1中显示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的或由表1中所示核苷酸序列编码的氨基酸序列，一个或多个CDR(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如，氨基酸置换或缺失。
在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包括至少一个或二个重链可变结构域(任选地包含恒定区)、至少一个或二个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或这两者，所述可变结构域包含BAP058-hum01、BAP058-hum02、BAP058-hum03、BAP058-hum04、BAP058-hum05、BAP058-hum06、BAP058-hum07、BAP058-hum08、BAP058-hum09、BAP058-hum10、BAP058-hum11、BAP058-hum12、BAP058-hum13、BAP058-hum14、BAP058-hum15、BAP058-hum16、BAP058-hum17、BAP058-克隆-K、BAP058-克隆-L、BAP058-克隆-M、BAP058-克隆-N、或BAP058-克隆-O中任一者的氨基酸序列；或如US-2016/0108123的表1中所述或由表1中的核苷酸序列或与任一前述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:2的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每者在USSN 14/881,888的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:9的VLCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:10的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:11的VLCDR3氨基酸序列，每者在US-2016/0108123的表1中公开。
在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含：
(i)重链可变区(VH)，其包含选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列；SEQ ID NO:5的VHCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:3的VHCDR3氨基酸序列，每者在US-2016/0108123的表1中公开；和
(ii)轻链可变区(VL)，其包含选自SEQ ID NO:12的VLCDR1氨基酸序列；SEQ IDNO:13的VLCDR2氨基酸序列；和SEQ ID NO:14的VLCDR3氨基酸序列，每者在US-2016/0108123的表1中公开。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:1的VHCDR1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:4的VHCDR1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗PD-L1抗体分子包含SEQ ID NO:195的VHCDR1氨基酸序列，每者在US-2016/0108123的表1中公开。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)也负向调节T细胞功能，特别在IFN-g分泌的CD4+辅助T细胞1和CD8+ T细胞毒性1细胞中，并且在T细胞消耗中发挥至关重要的作用。抑制TIM3和其配体(例如，半乳凝集素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以增加免疫应答。TIM3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与CAR(例如，本文所述的CD19 CAR)组合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子，或肽抑制剂与TIM3的IgV结构域结合以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽在WO2013/006490和US 20100247521中公开。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23的人源化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551中公开)和克隆8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541中公开)。抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体在US 20130156774中公开。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules toTIM3and Uses Thereof”的US 2015/0218274(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称为全部CDR)，所述CDR来自抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23；或如2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列或与任何前述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码，或包含密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个，三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR。
在又一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，所述可变区来自本文所述的抗体，例如选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中任一者的抗体；或如US2015/0218274的表1-4中所述，或由表1-4中的核苷酸序列或与任何前述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码。
在其他实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体在WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251和WO 2014/022332中描述，例如，单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，例如，如US 2004/0047858、US7,132,255和WO 99/052552中所述。在其他实施方案中，抗CEACAM抗体与CEACAM-5结合，如Zheng等人,PLoS One.2010 Sep 2；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，例如，如WO 2013/054331和US 2014/0271618中所述。
不希望受理论约束，认为癌胚抗原细胞黏附分子(CEACAM)(如CEACAM-1和CEACAM-5)至少部分地介导对抗肿瘤免疫应答的抑制(参见，例如，Markel等人,J Immunol.2002Mar15；168(6):2803-10；Markel等人,J Immunol.2006Nov 1；177(9):6062-71；Markel等人,Immunology.2009 Feb；126(2):186-200；Markel等人,Cancer Immunol Immunother.2010Feb；59(2):215-30；Ortenberg等人,Mol Cancer Ther.2012Jun；11(6):1300-10；Stern等人,J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng等人,PLoS One.2010 Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，已经将CEACAM-1描述为TIM-3的异嗜性配体及在TIM-3介导的T细胞耐受性和消耗中发挥作用(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，共同阻断CEACAM-1和TIM-3已经显示在异种移植物结直肠癌模型中增强抗肿瘤免疫应答(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014),上文)。在其他实施方案中，对CEACAM-1和PD-1的共同阻断降低T细胞耐受性，例如，如WO2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其他免疫调节剂(例如，抗PD-1和/或抗TIM-3抑制物)一起使用，以增强针对癌(例如，黑素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌以及如本文所述的其他癌)的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞活化基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其中已经显示所述细胞表面分子在CD8+ T细胞消耗中发挥作用。LAG3及其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的，并且可以与CAR(例如，本文所述的CD19CAR)组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗体并且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是消耗性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，所述IMP321是LAG3的可溶性部分和与MHC II类分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig的重组融合蛋白。其他抗体例如在WO2010/019570中公开。
在一个实施方案中，抗LAG3抗体或其片段是标题为“Antibody Molecules toLAG3and Uses Thereof”的US 2015/0259420(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗LAG3抗体分子。在一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或统称为全部CDR)，所述CDR来自抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser、或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J的任一者；或如US 2015/0259420的表1中所述；或由表1中的核苷酸序列或与任何前述序列基本上同一(例如至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码，或包含密切相关的CDR，例如，相同或具有至少一个氨基酸改变但不超过两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如保守性置换)的CDR。
在又一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，所述可变区来自本文所述的抗体，例如，选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-Clone-F、BAP050-Clone-G、BAP050-Clone-H、BAP050-Clone-I或BAP050-Clone-J中任一者的抗体；或如US 2015/0259420的表1中所述；或由表1中的核苷酸序列或与任一前述序列基本上同一(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列编码。
在一些实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质可以例如是包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并且第二结构域是与正向信号相关的多肽，例如，包含如本文所述的胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与正向信号相关的多肽可以包含CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如，CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域和/或(例如，本文所述的)(例如，CD3ζ的)初级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白是由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达CD19 CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)表达。
在一个实施方案中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的物质是miR-17-92。
ROR1抑制剂
本文中还提供ROR1抑制剂和联合疗法，例如，本文所述的表达CAR的细胞与ROR1抑制剂的组合。ROR1抑制剂可以是例如与ROR1结合的小分子、抗体或其片段(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)；重组蛋白，例如，融合蛋白；抑制性核酸；或表达ROR1 CAR的细胞，例如，表达ROR1 CAR的T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，ROR1抑制剂是表达抗ROR1的细胞，例如，表达ROR1 CART或ROR1的NK细胞。下文更详细地描述示例性ROR1抑制剂。
在一个实施方案中，本公开提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包括表达ROR1 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包含表达CD19 CAR的第一细胞和表达ROR1 CAR的第二细胞。
ROR1抑制剂包括但不限于表达抗ROR1 CAR的细胞，例如，CART，和抗ROR抗体(例如，抗ROR1单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗ROR1抑制剂可以用来治疗本文所述的疾病。
示例性抗ROR1抑制剂在Hudecek等人,Clin.Cancer Res.19.12(2013):3153-64中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。例如，抗ROR1抑制剂包括Hudecek等人中描述的抗ROR1 CART(例如，如Hudecek等人的第3155页第一整段中所述生成，所述文献通过引用的方式并入本文)。在其他例子中，抗ROR1抑制剂包括抗体或其片段，其包含Hudecek等人，在跨第3154-55页的段落处；Baskar等人,MAbs 4(2012):349–61；和Yang等人,PLoS ONE 6(2011):e21018中描述的2A2和R12抗ROR1单克隆抗体的VH和/或VL序列，所述文献通过引用的方式并入本文。
在其他实施方案中，ROR1抑制剂包括靶向ROR1的抗体或其片段(例如，单链可变片段(scFv))，其包括在US2013/0101607中描述的那些抗体或其片段，例如，US 2013/0101607的SEQ ID NO:1或2，所述文献通过引用的方式并入本文。在一些实施方案中，抗ROR1抗体片段(例如，scFvs)与生物活性分子缀合或融合，例如，以形成指引免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)以响应于表达ROR1的细胞的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，示例性ROR1抑制剂包括称作UC-961(Cirmtuzumab)的抗ROR1单克隆抗体。参见，例如，临床试验识别号NCT02222688。Cirmtuzumab可以用来治疗癌症，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)、卵巢癌和黑素瘤。参见，例如Hojjat-Farsangi等人,PLoSOne.8(4):e61167；和NCT02222688。在一些实施方案中，将Cirmtuzumab静脉内施用，例如，作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗ROR1抗体缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，ROR1抑制剂包括表达抗ROR1 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗ROR1 CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合ROR1的CAR编码的细胞。例如，通过将ROR1-CAR(包含ROR1结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗ROR1 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包括表达CD19 CAR和ROR1 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包含表达CD19 CAR的第一细胞和表达ROR1 CAR的第二细胞。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR(例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)的第一细胞，所述CAR包括初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR(例如，CD19CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR或CD22 CAR)的第二细胞，所述CAR包括次级信号传导结构域。
CD20抑制剂
本文中提供CD20抑制剂和联合疗法，例如，本文所述的表达CAR的细胞与CD20抑制剂的组合。CD20抑制剂可以是例如与CD20结合的小分子、抗体或其片段(例如，单特异性或双特异性抗体或其片段)；重组蛋白，例如，融合蛋白；抑制性核酸；或表达CD20 CAR的细胞，例如，表达CD20 CAR的T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，CD20抑制剂是表达抗CD20的细胞，例如，表达CD20 CART或CD20的NK细胞。下文更详细地描述示例性CD20抑制剂。
在一个实施方案中，本公开提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD20 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达CD20 CAR的第一细胞和表达CD19 CAR的第二细胞。
在一个实施方案中，第二CD20抑制剂是抗CD20抗体或其片段。在一个实施方案中，抗体是单特异性抗体，并且在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，CD20抑制剂是嵌合小鼠/人单克隆抗体，例如，利妥昔单抗。在一个实施方案中，CD20抑制剂是人单克隆抗体如奥法木单抗。在一个实施方案中，CD20抑制剂是人源化抗体如奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗、阿托珠单抗、ocaratuzumab或PRO131921(Genentech)。在一个实施方案中，CD20抑制剂是包含抗CD20抗体(如TRU-015(TrubionPharmaceuticals))的部分的融合蛋白。
例如，抗CD20抗体选自利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗、阿托珠单抗、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、ocaratuzumab或Pro131921(Genentech)。参见，例如Lim等人,Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包括利妥昔单抗。利妥昔单抗是与CD20结合和造成CD20表达细胞的细胞裂解的嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含奥法木单抗。奥法木单抗是分子量大约149kDa的抗CD20 IgG1κ人单克隆抗体。例如，奥法木单抗使用转基因小鼠和杂交瘤技术生成并且从重组鼠细胞系(NS0)表达及纯化。参见，例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验识别号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352和NCT01397591。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含奥瑞珠单抗(ocrelizumab)。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，例如，如临床试验识别号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570和Kappos等人,Lancet.19.378(2011):1779-87中所述。在一些实施方案中，将奥瑞珠单抗作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含维妥珠单抗。维妥珠单抗是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见，例如，临床试验识别号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581和Goldenberg等人,Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。在一些实施方案中，将维妥珠单抗皮下或静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含GA101。GA101(也称作obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号：NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。在一些实施方案中，将GA101静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含AME-133v。AME-133v(也称作LY2469298或ocaratuzumab)是针对的CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，所述单克隆抗体具有增加的FcγRIIIa受体亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒(ADCC)活性。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等人,Clin Cancer Res.18.5(2012):1395-403。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含PRO131921。PRO131921是与利妥昔单抗相比，经工程化以具有更好的FcγRIIIa结合作用和增强的ADCC的人源化抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Casulo等人,Clin Immunol.154.1(2014):37-46；临床试验识别号NCT00452127。在一些实施方案中，将PRO131921静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包含TRU-015。TRU-015是从针对CD20的抗体的结构域衍生的抗CD20融合蛋白。TRU-015比单克隆抗体小，但是保留Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25。TRU-015含有抗CD20单链可变片段(scFv)，与之连接有人IgG1铰链区、CH2和CH3结构域，但是缺少CH1结构域和CL结构域。在一些情况下，将TRU-015静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD20抗体缀合于或结合至治疗药，例如，本文所述的化疗药(例如，本文所述的化疗药，例如环磷氮芥、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂、CD20抗体或CD20抗体药物缀合物)、抗过敏药、抗恶心药(或镇吐药)、镇痛药或细胞保护药。
在一个实施方案中，CD20抑制剂包括表达CD20 CAR的细胞，例如，CD20 CART，或例如包含CD20结合结构域并且经工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)以与CD19 CART组合施用的CD20-CAR，和将其用于过继疗法的方法。在一些实施方案中，CD20抑制剂包括表达CD20CAR构建体或由包含scFv、CDR或VH和VL链的CD20 CAR编码的细胞。例如，通过将CD20-CAR(包含CD20结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)(例如，与本文所述的表达CAR的细胞(例如，本文所述的CD20 CART)组合施用)，产生表达CD20 CAR的细胞，例如，CART。
在另一个方面，本发明提供表达CAR的细胞群体，例如，表达CAR的细胞，包含表达CD20 CAR和CD19 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包含表达CD20 CAR的第一细胞和表达CD19 CAR的第二细胞。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR(例如，CD20 CAR或CD19 CAR)的第一细胞，所述CAR包括初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR(例如，CD20 CAR或CD19 CAR)的第二细胞，所述CAR包括次级信号传导结构域。
CD19抑制剂
本文中提供CD19抑制剂和联合疗法，例如，一种或多种CD19抑制剂。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物(例如，表达CD19 CAR的细胞)还包括第二CD19抑制剂。例如，本文所述的表达CD19 CAR的细胞与第二CD19抑制剂组合施用。CD19抑制剂包括但不限于表达CD19 CAR的细胞，例如，CD19 CART细胞、表达CD19 CAR的NK细胞、或抗CD19抗体(例如，抗CD19单特异性或双特异性抗体)或其片段。
示例性抗CD19抗体或其片段或缀合物包括但不限于兰妥莫单抗(blinatumomab)、SAR3419(Sanofi)、MEDI-551(MedImmune LLC)、Combotox、DT2219ARL(Masonic CancerCenter)、MOR-208(也称作XmAb-5574；MorphoSys)、XmAb-5871(Xencor)、MDX-1342(Bristol-Myers Squibb)、SGN-CD19A(Seattle Genetics)、和AFM11(AffimedTherapeutics)。参见，例如Hammer.MAbs.4.5(2012):571–77。
在一些实施方案中，抗CD19抗体或其片段或缀合物包含blinatomomab。Blinatomomab是包含二个scFv的双特异性抗体—一个与CD19结合并且一个与CD3结合。Blinatomomab指引T细胞攻击癌细胞。参见，例如Hammer等人；临床试验识别号NCT00274742和NCT01209286。在一些实施方案中，blinatomomab可以用来治疗NHL(例如，DLBCL)或ALL。
在一些实施方案中，抗CD19抗体包含MEDI-551。MEDI-551是具有经工程化以具有增强的抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)的Fc的人源化抗CD19抗体。参见，例如Hammer等人和临床试验识别号NCT01957579。在一些实施方案中，MEDI-551可以用来治疗B细胞恶性肿瘤(例如，NHL、CLL、DLBCL和多发性骨髓瘤)、多发性硬化和硬皮病。
在一些实施方案中，抗CD19抗体或其片段或缀合物包含Combotox。Combotox是与CD19和CD22结合的免疫毒素的混合物。免疫毒素是由融合于去糖基化蓖麻毒蛋白A链的scFv抗体片段组成。参见，例如Hammer等人；和Herrera等人J.Pediatr.Hematol.Oncol.31.12(2009):936-41；Schindler等人,Br.J.Haematol.154.4(2011):471-6。在一些实施方案中，Combotox可以用来治疗B细胞白血病，例如，ALL。
在一些实施方案中，抗CD19抗体或其片段或缀合物包含DT2219ARL。DT2219ARL是靶向CD19和CD22的双特异性免疫毒素，包含二个scFv和截短的白喉毒素。参见，例如Hammer等人；和临床试验识别号NCT00889408。在一些实施方案中，DT2219ARL可以用来治疗B细胞恶性肿瘤，例如，B细胞白血病和淋巴瘤。
在一些实施方案中，将DT2219ARL静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD19抗体或其片段或缀合物包含SGN-CD19A。SGN-CD19A是由连接于合成的细胞毒杀细胞药物单甲基澳瑞司他汀(MMAF)的抗CD19人源化单克隆抗体组成的抗体-药物缀合物(ADC)。参见，例如Hammer等人；和临床试验识别号NCT01786096和NCT01786135。在一些实施方案中，SGN-CD19A可以用来治疗B细胞ALL、NHL(例如，DLBCL、套细胞淋巴瘤或滤泡淋巴瘤)、伯基特淋巴瘤或白血病或B-谱系淋巴母细胞淋巴瘤(B-LBL)。在一些实施方案中，将SGN-CD19A静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，抗CD19抗体包含MOR-208(也称作XmAb-5574)。MOR-208是Fc工程化的抗CD19人源化单克隆抗体，其具有增强的FcγRIIIA结合作用，这导致改善的ADCC活性。参见，例如临床试验政府识别号NCT01685008、NCT01685021、NCT02005289和NCT01161511；Hammer等人；Woyach等人,Blood 124.24(2014)。
在一些实施方案中，MOR-208可以用来治疗NHL(例如，FL、MCL、DLBCL)、CLL、小淋巴细胞淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病或B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)。在一些实施方案中，将MOR-208静脉内例如作为静脉内输注施用。
在一些方面，抗CD19抗体或其片段或缀合物包含SAR3419。SAR3419是抗CD19抗体-药物缀合物(ADC)，其包含借助可切割接头与美坦辛衍生物缀合的抗CD19人源化单克隆抗体。参见，例如Younes等人,J.Clin.Oncol.30.2(2012):2776-82；Hammer等人,临床试验识别号NCT00549185和Blanc等人,Clin Cancer Res.2011；17:6448-58。在一些实施方案中，SAR3419可以用来治疗NHL(弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性小型切割的细胞淋巴瘤)或B细胞ALL。
在一些实施方案中，抗CD19抗体包含XmAb-5871。XmAb-5871是Fc工程化的人源化抗CD19抗体。在一些实施方案中，XmAb-5871可以用来治疗自身免疫性疾病，如狼疮。参见，例如Hammer等人。
在一些实施方案中，抗CD19抗体包含MDX-1342，其是具有增强的ADCC的人Fc工程化抗CD19抗体。在一些实施方案中，MDX-1342可以用来治疗CLL和类风湿性关节炎。参见，例如Hammer等人。
在一些实施方案中，抗CD19抗体包含AFM11。AFM11是靶向CD19和CD3的双特异性抗体。在一些实施方案中，AFM11可以用来治疗NHL(例如，DLBCL)、ALL、或CLL。参见，例如Hammer等人；和临床试验识别号NCT02106091。在一些实施方案中，将AFM11作为静脉内输注施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD19抗体缀合于或结合至治疗药，例如，化疗药(例如，本文所述的化疗药)、肽疫苗(如Izumoto等人,2008J Neurosurg108：963-971中描述)、免疫抑制剂(例如，本文所述的免疫抑制剂)或免疫清除剂(例如，本文所述的免疫清除剂)，例如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯、FK506、CAMPATH、抗CD3抗体、细胞毒素、氟达拉滨、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228或细胞因子。
在一些实施方案中，CD19抑制剂包括表达抗CD19 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD19 CAR构建体的细胞。在一个实施方案中，抗CD19 CAR构建体包含鼠scFv序列。例如，包含鼠scFv序列的抗CD19 CAR构建体是在PCT公开WO2012/079000中提供和本文中提供的CAR19构建体。
例如，通过将CD19-CAR(包含CD19结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD19 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面，本文中提供表达CAR的细胞群体，例如，表达CAR的细胞，包括表达CD22 CAR和CD19 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包含表达CD22 CAR的第一细胞和表达CD19 CAR的第二细胞。
CD123抑制剂
本文中提供CD123抑制剂和联合疗法。CD123抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD123 CAR的细胞，例如CART，和抗CD123抗体(例如，抗CD123单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD123抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD123抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD123抑制剂是重组蛋白，例如，包含CD123受体的天然配体(或片段)。例如，重组蛋白是SL-401(也称作DT388IL3；德克萨斯州大学西南医学中心)，其是包含与截短的白喉毒素融合的人IL-3融合蛋白。参见，例如Testa等人,BiomarkRes.2014；2:4；和临床试验识别号NCT00397579。
在另一个实施方案中，CD123抑制剂是抗CD123抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD123抗体或其片段包含单克隆抗体，例如，单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD123抗体或其片段包含CSL360(CSL Limited)。CSL360是与CD123结合的重组嵌合单克隆抗体。在一些实施方案中，将CSL360静脉内施用，例如，通过静脉输注施用。参见，例如临床试验识别号NCT01632852；和Testa等人。
在另一个实施方案中，CD123抗体或其片段包含CSL362(CSL Limited)。CSL362是靶向CD123并且经优化用于增强抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)活化过程的人源化单克隆抗体。在一些实施方案中，将CSL362静脉内施用，例如，通过静脉输注施用。参见，例如，临床试验识别号NCT01632852。
在一个实施方案中，CD123抗体或其片段包含双特异性抗体，例如，MGD006(MacroGenics)。MGD006是靶向CD123和CD3的双特异性抗体。参见，例如，临床试验识别号NCT02152956。
在一些实施方案中，CD123抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD123抑制剂包括表达抗CD123 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD123 CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD123的CAR编码的细胞。例如，通过将CD123-CAR(包含CD123结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD123 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。在一个实施方案中，抗CD123 CAR构建体包含scFv序列，例如，在US 2014/0322212 A1中提供的scFv序列，所述文献通过引用的方式并入本文。在一个实施方案中，抗CD123结合结构域是US 2014/0322212 A1中描述的scFv。在一个实施方案中，抗CD123结合结构域是US 2014/0322212 A1中提供的CAR构建体的部分。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD123 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD123 CAR的第二细胞。
CD10抑制剂
本文中还提供CD10抑制剂和联合疗法。CD10抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD10 CAR的细胞，例如CART，和抗CD10抗体(例如，抗CD10单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD10抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD10抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含小分子，如sacubitril(Novartis)、缬沙坦/sacubritril(Novartis)、奥马曲拉(Bristol-Myers Squibb)、RB-101、UK-414,495(Pfizer)、或其可药用盐或衍生物。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含sacubitril(AHU-377；Novartis)(4-{[(2S,4R)-1-(4-联苯基)-5-乙氧基-4-甲基-5-氧-2-戊基]氨基}-4-氧丁酸)、或其可药用盐或衍生物。
在另一个实施方案中，CD10抑制剂包括缬沙坦/sacubritril(LCZ696；Novartis)或其可药用盐或衍生物。缬沙坦/sacubritril是包含缬沙坦和sacubitril的1:1混合物的组合药物。缬沙坦的结构具有以下化学名称：((S)-3-甲基-2-(N-{[2'-(2H-1,2,3,4-四唑-5-基)联苯基-4-基]甲基}戊酰氨基)丁酸)。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含奥马曲拉(Bristol-Myers Squibb)((4S,7S,10aS)-5-氧-4-{[(2S)-3-苯基-2-硫烷基胺丙酰基]氨基}-2,3,4,7,8,9,10,10a--八氢吡啶并[6,1-b][1,3]硫氮杂卓-7-羧酸)或其可药用盐或衍生物。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含RB-101(N-(3-{[(2S)-2-氨基-4-(甲基硫代)丁基]二硫代}-2-苄基胺丙酰基)-L-苯丙氨酸苄酯)、或其可药用盐或衍生物。
在一个实施方案中，CD10抑制剂包含UK-414,495(Pfizer)((R)-2-({1-[(5-乙基-1,3,4-噻二唑-2-基)氨甲酰基]环戊基}甲基)戊酸)、或其可药用盐或衍生物。
在一些实施方案中，CD10抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD10抑制剂包括表达抗CD10 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD10 CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD10的CAR编码的细胞。例如，通过将CD10-CAR(包含CD10结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD10 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD10 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD10 CAR的第二细胞。
CD34抑制剂
本文中还提供CD34抑制剂和联合疗法。CD34抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD34 CAR的细胞，例如CART，和抗CD34抗体(例如，抗CD34单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD34抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD34抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD34抑制剂包含靶向CD34的单克隆抗体或其片段或者免疫脂质体，所述免疫脂质体包含抗CD34单克隆抗体或其片段。
在一个实施方案中，CD34抑制剂包含抗体或其片段，例如，My-10单克隆抗体，或包含My-10单克隆抗体的免疫脂质体，如Mercadal等人,Biochim.Biophys.Acta.1371.1(1998):17-23中所述。在其他实施方案中，CD34抑制剂包含靶向表达CD34的细胞的含有抗癌药物(例如，多柔比星)的免疫脂质体，如Carrion等人,Life Sci.75.3(2004):313-28中所述。在一个实施方案中，CD34抑制剂包含如Maleki等人,Hum.Antibodies.22(2013):1-8中所述的针对CD34的单克隆抗体。在另一个实施方案中，CD34抑制剂包含如Maleki等人,Cell J.16.3(2014):361-66中所述的靶向CD34的单克隆抗体。
在一些实施方案中，CD34抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD34抑制剂包括表达抗CD34 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD34 CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD34的CAR编码的细胞。例如，通过将CD34-CAR(包含CD34结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD34 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD34 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD34 CAR的第二细胞。
FLT-3抑制剂
Fms样酪氨酸激酶3(FLT-3)，也称作分化抗原簇抗原135(CD135)、受体型酪氨酸-蛋白激酶FLT3或胎肝激酶-2(Flk2)，是受体酪氨酸激酶。FLT-3是细胞因子Flt3配体(FLT3L)的细胞因子受体。FLT-3在许多造血祖细胞的表面上表达并且对淋巴细胞发育重要。FLT3基因常见地在白血病(例如，急性髓样白血病(AML))中突变。
本文中还提供FLT-3抑制剂和联合疗法。FLT-3抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗FLT-3 CAR的细胞，例如CART，和抗FLT-3抗体(例如，抗FLT-3单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗FLT-3抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，FLT-3抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含小分子，如奎扎替尼(quizartinib)(AmbitBiosciences)、米哚妥林(midostaurin)(Technische Universitat Dresden)、索拉非尼(Bayer和Onyx Pharmaceuticals)、舒尼替尼(Pfizer)、来他替尼(Cephalon)或其可药用盐或衍生物。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含奎扎替尼(AC220；Ambit Biosciences)或其可药用盐或衍生物。Quizartinib是小分子受体酪氨酸激酶抑制剂。Quizartinib具有以下化学名称：(1-(5-(叔丁基)异唑-3-基)-3-(4-(7-(2-吗啉代乙氧基)苯并[d]咪唑并[2,1-b]噻唑-2-基)苯基)脲)。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含米哚妥林(midostaurin)(PKC412；TechnischeDresden)或其可药用盐或衍生物。米哚妥林是作为星形孢菌素(来自细菌棍孢链霉菌(Streptomyces staurosporeus)的生物碱)的半合成衍生物的蛋白激酶抑制剂。米哚妥林的化学名称如下：((9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-六氢-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲基氨基)-9,13-环氧-1H,9H-二吲哚并[[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]benzodiamzonine-1-酮)。
在一个实施方案中，FLT-3抑制剂包括索拉非尼(Bayer和Onyx Pharmaceuticals)或其可药用盐或衍生物。参见，例如labeling.bayerhealthcare.com/html/products/pi/Nexavar_PI.pdf。索拉非尼的化学名称是(4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨甲酰基氨基]
苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺)。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含舒尼替尼(先前称作SU11248；Pfizer)或其可药用盐或衍生物。舒尼替尼具有以下化学名称：(N-(2-二乙基氨乙基)-5-[(Z)-(5-氟-2-氧-1H-吲哚-3-亚基)甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺)。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包含来他替尼(CEP-701；Cephalon)或其可药用盐或衍生物。来他替尼具有以下化学名称：((9S,10S,12R)-2,3,9,10,11,12-六氢-10-羟基-10-(羟甲基)-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]benzodiazocin-1-酮。
在一些实施方案中，FLT-3抑制剂包括表达抗FLT-3 CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗FLT-3 CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合FLT-3的CAR编码的细胞。例如，通过将FLT-3-CAR(包含FLT-3结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗FLT-3 CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和FLT-3 CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包含表达CD19 CAR的第一细胞和表达FLT-3 CAR的第二细胞。
CD79b抑制剂
本文中提供CD79b抑制剂和联合疗法。CD79b抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD79b CAR的细胞，例如CART，和抗CD79b抗体(例如，抗CD79b单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD79b抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD79b抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD79b抑制剂是抗CD79b抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD79b抗体或其片段包含单克隆抗体，例如，单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD79b抗体或其片段包含polatuzumab维多汀(Roche)(一种抗CD79b抗体药物缀合物)。在实施方案中，polatuzumab维多汀用来治疗癌症，例如，NHL，例如，滤泡淋巴瘤或DLBCL，例如，复发性或难治性滤泡淋巴瘤或DLBCL。参见，例如NCT02257567。在实施方案中，抗CD79b抗体或其片段包含MGD010(MacroGenics)，其为包含与CD32B和D79B结合的组分的双特异性抗体。参见，例如NCT02376036。
在一些实施方案中，CD79b抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD79b抑制剂包括表达抗CD79b CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD79b CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD79b的CAR编码的细胞。例如，通过将CD79b-CAR(包含CD79b结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD79b CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD79b CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD79b CAR的第二细胞。
CD79a抑制剂
本文中提供CD79a抑制剂和联合疗法。CD79a抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD79a CAR的细胞，例如CART，和抗CD79a抗体(例如，抗CD79a单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD79a抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD79a抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD79a抑制剂是抗CD79a抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD79a抗体或其片段包含单克隆抗体，例如，单特异性或双特异性抗体或其片段。例如，抗CD79a抗体或其片段包含在Polson等人,Blood 110.2(2007):616-23中描述的抗CD79a抗体或其片段，所述文献通过引用的方式并入本文。例如，抗CD79a抗体或其片段包含在Polson等人(参见上文)中描述的7H7、15E4或16C11抗体或其片段。
在一些实施方案中，CD79a抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD79a抑制剂包括表达抗CD79a CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD79a CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD79a的CAR编码的细胞。例如，通过将CD79a-CAR(包含CD79a结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD79a CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD79a CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD79a CAR的第二细胞。
CD179b抑制剂
本文中提供CD179b抑制剂和联合疗法。CD179b抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD179b CAR的细胞，例如CART，和抗CD179b抗体(例如，抗CD179b单特异性或双特异性抗体)及其片段。
在一些实施方案中，抗CD179b抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD179b抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD179b抑制剂是抗CD179b抗体或其片段。在一个实施方案中，抗CD179b抗体或其片段包含单克隆抗体，例如，单特异性或双特异性抗体或其片段。
在一些实施方案中，CD179b抑制剂缀合至或结合至治疗药。
在一些实施方案中，CD179b抑制剂包括表达抗CD179b CAR的细胞，例如，CART，例如，表达抗CD179b CAR构建体或由包含scFv、CDR、或VH和VL链的结合CD179b的CAR编码的细胞。例如，通过将CD179b-CAR(包含CD179b结合结构域)工程化入细胞(例如，T细胞或NK细胞)，产生表达抗CD179b CAR的细胞，例如，CART，用于与本文所述的表达CAR的细胞组合施用。本文中还提供本文所述的表达CAR的细胞用于过继疗法的方法。
在另一个方面中，本文中提供表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的群体，包含表达CD19 CAR和CD179b CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的细胞群体可以包括表达CD19 CAR的第一细胞和表达CD179b CAR的第二细胞。
CD22抑制剂
本文中提供CD22抑制剂和联合疗法。CD22抑制剂包括但不限于小分子、重组蛋白、表达抗CD22 CAR的细胞，例如CART，和抗CD22抗体(例如，抗CD22单特异性或双特异性抗体)及其片段。在一些实施方案中，抗CD22抑制剂可以用来治疗本文所述的B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，CD22抑制剂与CD19抑制剂(例如，表达CD19 CAR的细胞，例如，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达包含抗体结合结构域的CAR的细胞)联合施用，其中所述抗体结合结构域是鼠、人或人源化的。
在一个实施方案中，CD22抑制剂是本文所述的CD22抑制剂。CD22抑制剂可以例如是抗CD22抗体(例如，抗CD22单特异性或双特异性抗体)或CD22CART。在一些实施方案中，抗CD22抗体缀合至或结合至治疗药。示例性治疗药例如包括微管破坏药物(例如，单甲基澳瑞司他汀E)和毒素(例如，白喉毒素或假单胞菌外毒素A、蓖麻毒蛋白)。
在一个实施方案中，抗CD22抗体是抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如，DCDT2980S)。在一个实施方案中，抗体是抗CD22抗体的scFv，例如，抗体RFB4的scFv。这种scFv可以与假单胞菌外毒素-A的全体或片段融合(例如，BL22)。在一个实施方案中，抗体是人源化抗CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗)。在一个实施方案中，抗体或其片段包含抗CD22抗体的Fv部分，所述部分任选地与假单胞菌外毒素-A的全体或片段(例如，38KDa片段)共价融合(例如，moxetumomab pasudotox)。在一个实施方案中，抗CD22抗体是抗CD19/CD22双特异性抗体，任选地与毒素缀合。例如，在一个实施方案中，抗CD22抗体包含抗CD19/CD22双特异性部分，(例如，识别人CD19和CD22的二种scFv配体)，任选地连接至白喉毒素(DT)的全体或部分，例如，白喉毒素(DT)的前389个氨基酸(DT390)，例如，配体指引的毒素，如DT2219ARL)。在另一个实施方案中，双特异性部分(例如，抗CD19/抗CD22)连接至毒素，如去糖基化的蓖麻毒蛋白A链(例如，Combotox)。
在一个实施方案中，抗CD22抗体选自抗CD19/CD22双特异性配体指导的毒素(例如，识别人CD19和CD22的二种scFv配体，其连接至白喉毒素(DT)的前389个氨基酸(DT390)，例如，DT2219ARL)；抗CD22单克隆抗体-MMAE缀合物(例如，DCDT2980S)；与假单胞菌外毒素-A片段融合的抗CD22抗体RFB4的scFv(例如，BL22)；去糖基化蓖麻毒蛋白A链缀合的抗CD19/抗CD22(例如，Combotox)；人源化抗CD22单克隆抗体(例如，依帕珠单抗)；或与假单胞菌外毒素-A 38KDa片段共价融合的抗CD22抗体的Fv部分(例如，moxetumomab pasudotox)。
在一些实施方案中，本发明涵盖一种重组核酸构建体，其包含编码CAR(例如，CD19CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3CAR)的核酸分子，其中核酸分子包含编码(例如，本文所述的)抗原结合结构域的核酸序列，例如，所述核酸序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。可以在CAR中使用的示例性胞内信号传导结构域包括但不限于例如CD3ζ、CD28、4-1BB等中的一个或多个胞内信号传导结构域。在一些情况下，CAR可以包含CD3ζ、CD28、4-1BB等的任何组合。
在一个实施方案中，抗原结合结构域(例如，CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34或FLT-3抗原结合结构域)以抗体或抗体片段的特定功能性特征或特性为特征。例如，在一个实施方案中，本发明CAR组合物的包含抗原结合结构域的部分特异性结合人B细胞抗原(例如，CD19、ROR1、CD20、CD22、CD123、CD10、CD34或FLT-3)或其片段。在某些实施方案中，scFv与前导序列邻接并处于与之相同的可读框内。在一个方面，前导序列是作为SEQ IDNO:1提供的多肽序列。
在一个实施方案中，抗原结合结构域是片段，例如，单链可变片段(scFv)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2或双功能(例如双特异性)杂化抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型或增强的亲和力结合B细胞蛋白或其片段。在一些情况下，人scFv可以衍生自展示文库。
在一个实施方案中，抗原结合结构域(例如，scFv)包含至少一个突变，从而突变的scFv赋予CAR构建体改善的稳定性。在另一个实施方案中，抗原结合结构域(例如，scFv)包含源自例如人源化过程的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个突变，从而突变的scFv赋予CAR构建体改善的稳定性。
在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR(例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20 CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3CAR)的第一细胞，所述CAR包括初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR(例如，CD19 CAR、ROR1 CAR、CD20CAR、CD22 CAR、CD123 CAR、CD10 CAR、CD34 CAR或FLT-3CAR)的第二细胞，所述CAR包括次级信号传导结构域。
激酶抑制剂
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与激酶抑制剂(例如CDK4抑制剂、BTK抑制剂、MNK抑制剂、mTOR抑制剂、ITK抑制剂等)组合用于治疗方案中。在一个实施方案，受试者是完全应答者，并且对受试者施用治疗方案，所述治疗方案包括将本文所述的CAR表达细胞与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合施用，例如以本文所述的剂量或给药方案施用。在一个实施方案中，受试者是部分应答者或非应答者，并且对受试者施用治疗方案，所述治疗方案包括将本文所述的表达CAR的细胞与激酶抑制剂(例如，本文所述的激酶抑制剂)组合施用，例如，以本文所述的剂量或给药方案施用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂(例如，本文所述的CDK4抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作palbociclib或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的MNK抑制剂，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)和XL281(BMS908662)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，在28天周期中每日施用14-21天，或在21天周期中每日施用7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的palbociclib。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如ibrutinib(PCI-32765)、ibrutinib以每天约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量施用一段时间，例如21天周期每日施用、或例如28天周期每日施用。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126)(SEQ ID NO:140)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
与低剂量mTOR抑制剂组合
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞与免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂组合施用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；至少10％但不多于90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；至少15％但不多于90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；至少20％但不多于90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；至少30％但不多于90％、80％、70％、60％、50％或40％；至少40％但不多于90％、80％、70％、60％、50％、40％或30％；至少50％但不多于90％、80％、70％或60％；至少60％但不多于90％、80％或70％；或至少70％但不多于90％或80％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少5％但不多于30％、至少10％但不多于30％、至少15％但不多于30％、至少20％但不多于30％、至少25％但不多于30％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于20％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于30％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于35％、至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于40％或至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于45％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
在一个实施方案中，mTOR抑制剂的剂量与至少1％、2％、3％、4％或5％但不多于90％的mTOR抑制作用相关或提供前述mTOR抑制作用。
如本文中讨论，mTOR抑制作用的程度可以表述为P70 S6激酶抑制作用的程度，例如，mTOR抑制作用的程度可以通过P70 S6激酶活性下降的水平(例如，通过P70 S6激酶底物的磷酸化下降)来确定。可以通过本文所述的方法评价mTOR抑制水平，例如通过Boulay测定法或用蛋白质印迹法测量磷酸化的S6水平。
示例性mTOR抑制剂
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”指在细胞中抑制mTOR激酶的化合物或配体、或其可药用盐。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是催化性抑制剂。
变构性mTOR抑制剂包括中性三环状化合物雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、雷帕霉素相关化合物，所述雷帕霉素相关化合是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，例如包括雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称作雷帕类似物)和抑制mTOR活性的其他大环内酯类化合物。
雷帕霉素是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的已知大环内酯类抗生素，其具有式A中所示的结构。
其他合适的雷帕霉素类似物包括但不限于RAD001，另外称作依维莫司，具有化学名称((1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环并[30.3.1.04,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮、sirolimus(雷帕霉素、AY-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称作坦罗莫司或CCI-779)和地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。mTOR变构抑制剂的其他例子包括如US2005/0101624中所述的佐他莫司(zotarolimus)(ABT578)和umirolimus，所述文献的内容通过引用方式并入。其他合适的mTOR抑制剂在2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第946至第964段中描述，所述文献通过引用的方式完整并入。在2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第936段至第945段和第965段至第1003段中描述了免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂、与低剂量mTOR抑制剂相关的合适水平的mTOR抑制作用、用于检测mTOR抑制水平的方法及其合适的药物组合物，所述文献通过引用的方式完整并入。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。这些实施例仅是为了说明的目的而提供的，除非另有说明，否则不是限制性的。因此，本发明绝不应被解释为限于以下实施例，而应理解为包括由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有的变型。
实施例1：用外源性细胞因子优化CART生产
细胞因子具有与T细胞扩张、分化、存活和内稳态相关的重要功能。临床使用的最重要的细胞因子家族之一是常见的γ链(γc)家族细胞因子，其包括白介素(IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21(Liao等人，2013，Immunity，38：13-25)。IL-2作为癌症的免疫治疗剂被广泛研究。临床试验中IL-2的补充增强了抗CD19 CAR-T细胞的抗肿瘤能力(Xu等人，2013，Lymphoma，54：255-60)。然而，IL-2的施用受到副作用和调节性T细胞扩张倾向以及活化的诱导的细胞死亡(AICD)的影响的限制(Malek等人，2010，Immunity，33：153-65；和Lenardo等人，1999，Annu Rev Immunol，17：221-53)。IL-7，IL-15和IL-21各自可以提高过继性免疫疗法的有效性，并且与IL-2相比似乎毒性较低(Alves等人，2007，Immunol Lett，108：113-20)。尽管对上述细胞因子的作用进行了广泛的临床前和临床研究，但是缺乏对多种外源γc细胞因子对CAR-T细胞过继疗法的作用的多参数比较研究。
除了γ-链细胞因子外，IL-18是调节免疫应答的另一种免疫刺激细胞因子，其增强T细胞的IFN-γ产生，增加CTL的细胞溶解活性(Srivastava等人，2010，Curr Med Chem，17：3353-7)。即使剂量高达1000μg/kg，IL-18的施用也是安全和良好耐受的(Robertson等人，2006，Clin Cancer Res，12：4265-73)。因此，IL-18可能是用于增强CAR-T细胞抗肿瘤活性的另一种候选物。
在该实施例中，检查了不同外源细胞因子的施用对T细胞和叶酸受体α(FRα)CART细胞的扩张，表型，体外效应子功能和体内抗肿瘤功效的影响。
在本实施例中描述的实验中使用以下材料和方法。
CAR构建和慢病毒制备
pELNS-C4-27z CAR载体如前所述构建(评审中的手稿)。简言之，将含有抗FRαC4/AFRA4 scFv的pHEN2质粒用作C4片段的PCR扩增模板，使用引物5′-ataggatcccagctggtggagtctgggggaggc-3′(SEQ ID NO:3)和5′-atagctagcacctaggacggtcagcttggtccc-3′(SEQ ID NO:4)(BamHI和NheI加下划线)。PCR产物和第三代自灭活慢病毒表达载体pELNS用BamHI和NheI消化。然后将消化的PCR产物插入含有CD27-CD3z T细胞信号结构域的pELNS载体，该载体中延伸因子-1α(EF-1α)启动子驱动转基因的表达。
通过使用如前所述的Express In(Open Biosystems)，用四种质粒(pVSV-G、pRSV.REV、pMDLg/p.RRE和pELNS-C4-27z CAR)转染人胚胎肾细胞系293T(293T)细胞产生高滴度复制缺陷型慢病毒。转染后24h和48h收集上清液，并通过超速离心浓缩。通过使用有限稀释法，基于慢病毒向SupT1细胞的转导效率确定病毒滴度。
T细胞和细胞系
根据美国宾夕法尼亚大学的大学机构审查委员会批准的方案在知情同意后，从健康供体获得外周血淋巴细胞。通过阴性选择纯化后，原代T细胞购自人类免疫学核心(HumanImmunology Core)。将T细胞在完全培养基(补充有10％FBS，100U/mL青霉素，100μg/mL硫酸链霉素的RPMI 1640)中培养，并用1：1比例的抗CD3和抗CD28 mAb包被的珠(Invitrogen)按照说明书刺激。活化后24小时，细胞用慢病毒以5的MOI转导。从第二天向转导的T细胞中加入终浓度为10ng/mL的所示细胞因子。细胞因子每3天更换一次。
用于慢病毒包装的293T细胞和用于慢病毒滴定的SupT1细胞从ATCC获得。将已建立的卵巢癌细胞系SKOV3(FRα+)和C30(FRα-)用作细胞因子分泌和细胞毒性测定的靶细胞。对于生物发光测定，用慢病毒转导SKOV3以表达萤火虫萤光素酶(fLuc)。
流式细胞术分析和细胞分选
在BD FACSCanto上进行流式细胞术。抗人CD45(HI30)、CD3(HIT3a)、CD8(HIT8a)、CD45RA(HI100)、CD62L(DREG-56)、CCR7(G043H7)、IL-7Rα(A019D5)、CD27(M-T271)、CD28(CD28.2)、CD95(DX2)、TNF-α(MAb11)、IFN-γ(4S.B3)、IL-2(MQ1-17H12)、穿孔素(B-D48)、粒酶-B(GB11)从Biolegend获得。生物素-SP缀合的兔抗人IgG(H+L)购自JacksonImmunoresearch，APC缀合的链霉抗生物素蛋白购自Biolegand。抗人Bcl-xl(7B2.5)购自SouhernBiotech。细胞凋亡试剂盒和TruCount管从BD Bioscience获得。对于外周血T细胞计数，通过眶后取血获得血液，并染色确定人CD45，CD3，CD4和CD8 T细胞的存在。按照制造商的说明书，用TruCount管定量人CD45+门控的，CD3+，CD4+和CD8+亚组。
过继细胞疗法的体内研究
从宾夕法尼亚大学艾布拉姆森癌症中心的干细胞和异种移植中心(Stem Celland Xenograft Core of the Abramson Cancer Center，University of Pennsylvania)获得8至12周龄的雌性非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷/γ链-/-(NSG)小鼠。在第0天将小鼠肋腹皮下接种3×106个fLuc+SKOV3细胞。在治疗前，每组4只或5只小鼠随机分组。肿瘤变得可触知后，如前所述活化并转导人原代T细胞。T细胞在IL-2(5ng/mL)存在下扩张约2周。当肿瘤负荷为～250-300mm3，向小鼠静脉内注射5×106个CAR-T细胞或100μl盐水，然后每日腹膜内注射5μg IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21或磷酸缓冲溶液(PBS)7天。用卡尺测量肿瘤尺寸，用下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。眶后取血后通过流式细胞术测定受体小鼠血液中转移的T细胞的数量和表型。当肿瘤体积大于2000mm3时，将小鼠安乐死，并立即切除肿瘤进行进一步分析。
统计分析
使用Prism 5(GraphPad软件)和IBM SPSS Statistics 20.0软件进行统计分析。除非明确指出，数据显示为平均值±SEM。配对样品t检验或非参数Wilcoxon秩检验用于比较两组，并使用重复测量ANOVA或Friedman检验来检验三组或更多组之间差异的统计学显著性。当P值小于0.05时，结果被认为是统计学显著的。
结果
1.抗FRαC4 CAR的构建和表达
pELNS-C4-27z CAR包含与CD8α铰链和跨膜区连接的抗FRαC4 scFv，接着是与CD27细胞内信号传导基序串联的CD3ζ信号传导部分(图1A)。原代人T细胞用C4 CAR慢病毒载体有效转导，在转导后48h检测到转导效率为43％～65％。CAR表达水平在CD4+和CD8+T细胞之间是相当的(52.6±10.2％vs.49.5±17.1％，P＝0.713)。
2.细胞因子对CAR转导的T(CAR-T)细胞扩张的影响
研究了各种γc细胞因子和IL-18存在下，CAR-T细胞的扩张和积累。在暴露于培养物中不同细胞因子三周后，已经在IL2、IL-7或IL-5存在下培养的CAR-T细胞扩张了1000-2000倍。在IL-18、IL-21或NC(对照，无细胞因子)存在下培养的CAR-T细胞显示少于200倍的扩张(图1B)。
分析了导致CAR-T细胞较高积累的原因，特别地，评估了T细胞的增殖和凋亡。通过监测培养7天的CFSE标记的T细胞的细胞分裂来测量增殖反应。如图1C所示，用IL-2和IL-15培养的T细胞显示出最高的增殖能力，其次是IL-7；而IL-21和IL-18是不太有效的促有丝分裂刺激物。使用Annexin-V染色测试在不同细胞因子中培养的T细胞的凋亡。结果表明，与NC、IL-18和IL-21组相比，用IL-2、IL-7和IL-15培养的T细胞经历较少凋亡(图1D)。这些结果表明，在细胞因子例如IL-2、IL-7或IL-15的存在下扩张的T细胞的增加的积累可能由增殖增加和例如通过Bcl-xl抗凋亡途径的活化引起的凋亡减少这两者所造成。
3.细胞因子对CAR-T细胞表型的影响
接下来，检查在存在外源性细胞因子的情况下扩张的CAR-T细胞的表型。来自健康供体的新鲜T细胞通常基于CD45RA和CD62L表达分为四个亚组：1)幼稚T细胞(CD45RA+CD62L+，称为Tn)，2)中央记忆T细胞(CD45RA-CD62L+，称作Tcm)，3)效应记忆T细胞(CD45RA-CD62L-，称为Tem)和4)CD45RA阳性效应T细胞(CD45RA+CD62L-，简称Temra)。然后进一步评估每个亚组CCR7、CD27、CD28和CD95的表达。在慢病毒转导后CD95表达显著上调。后三种T细胞亚群对CD95阳性，而仅有一小部分Tn表达CD95(CD4+中为3.6±1.4％，CD8+T细胞中为3.7±1.3％)。这个小群体也共表达CD27、CD28和CCR7，被认为是记忆干细胞(Tscm)。然而，在用CAR进行慢病毒转导前后用抗CD3/CD28珠刺激后，CD95在该群体中极大地上调到接近100％(图2A)。与新鲜T细胞相比，在CD4+和CD8+T和CAR-T细胞中抗CD3/CD28珠刺激后，CD45RA+CD62L+CD95+T细胞的百分比大大增加(图2B和2C)。该群体同时高水平表达CD27、CD28和CCR7，表明其可以定义为Tscm。此外，CD8+CAR-T细胞具有较高百分比的Tscm细胞，这可能与起始的CD8+T细胞中Tn的较高比例有关(图2D)。
与各种细胞因子共培养后14天，通过测量CD45RA、CD62L和CD95的表达来研究CAR-T细胞的T细胞亚群的比例。在CD4+CAR-T细胞中，与IL-2组相比，IL-7组中存在显著较高百分比的Tscm细胞，而无细胞因子(NC)和IL-18组存在较低百分比的Tscm，但较高百分比的Tcm。IL-15组中T细胞亚群的分布与IL-2组相似，而IL-21组呈现Tcm百分比较高，而Tscm百分比与IL-2组相当。对于每个细胞因子施用组的四种T细胞亚群的分化和分布，CD8+CAR-T细胞表现出与CD4+CAR-T细胞相似的趋势，CD8+CAR-T细胞的相应组中与CD4+CAR-T细胞相比，Tscm的比例较高。
进一步研究了各种CAR-T细胞亚群自我更新和分化成其他细胞类型的能力。基于CAR、CD45RA和CD62L表达对CAR-T细胞的四个亚组进行分选，并在含有IL-2的培养基中分别培养3天。如图2E所示，Tscm亚组能够分化为所有其他三个亚组，Tcm和Temra亚组能够分化为Tem。这些结果表明CD62L+和CD45RA+T细胞能分别分化成CD62L和CD45RA-T细胞。通过CFSE稀释法评估四个亚组的增殖能力，然后进行比较。结果表明，Tscm表现出比其他亚组更强的增殖能力(图2F)。此外，CD45RA表达与CFSE强度呈负相关，而CD62L和CCR7表达与增殖直接相关。在所有细胞因子组中，CD45RA+T细胞表现出比CD45RA暗和阴性T细胞低得多的CFSE水平(图3A-3B)，表明CD45RA+T细胞具有比CD45RA-T细胞更强的增殖活性。因此，在IL-2、IL-7和IL-15存在下生长的T细胞的增加的积累可能与CD45RA+T细胞(其增殖能力增加)的增加的比例有关(图4)。
对于CAR-T细胞的表型，CAR-T细胞表现出较低的CD45RA、CD62L、CD27和CD28的表达，但在T细胞表面上CCR7的表达较高。基于以下表面标志物：CD27、CD28、CD62L、CCR7和IL7Rα的表达，进一步评估细胞因子对CAR-T细胞表型的影响。在IL-18存在下生长的CAR-T细胞与不补充细胞因子而生长的细胞呈非常相似的表达模式。与NC对照相比，IL-2显著下调CD27、CD28、CD62L、CCR7和ILR7α的表达。其他γc细胞因子中，与IL-2暴露的CAR-T细胞相比，IL-7暴露的CAR-T细胞呈现更高的CD62L、CD27和CD28表达，但显著降低的CCR7表达；IL-15组CAR-T细胞呈现更高的CD27和CD28表达；IL-21暴露的CAR-T细胞呈现更高的CD62L、CCR7、CD27和CD28表达，表明IL-2暴露诱导具有比所有其他组更成熟的T细胞表型的T细胞亚群的扩张(图4)。
4.细胞因子对CAR-T细胞效应子功能的影响
为了研究细胞因子对CAR-T细胞效应子功能的影响，评估了用表达FRα的SKOV3细胞刺激后CAR-T细胞的细胞因子产生能力。刺激5小时后，在CAR-T细胞的胞质中可检测到TNF-α、IFN-γ和IL-2，其中41.5-54.0％的CAR-T细胞产生TNF-α、12.4-15.3％的CAR-T细胞产生IFNγ，4.3-6.5％的CAR-T细胞产生IL-2(图5A-5C)。在扩张期间IL-2、IL-7和IL-15暴露促进CAR-T细胞产生TNF-α，而产生IFN-γ和IL-2的CAR-T细胞数目在所有细胞因子组中相当(图5A、5B、和5C)。接下来，比较响应CAR-T细胞的分数及其多功能性。与扩张期间暴露于IL-2相比，在扩张期间暴露于IL-18、IL-21或无细胞因子暴露诱导了较少的产生细胞因子的CAR-T细胞，而较少的CAR-T细胞具有被靶细胞刺激时产生多种细胞因子的能力。这些结果与如下表型一致：IL-18、IL-21和NC组中的CAR-T细胞比IL-2暴露组中的CAR-T细胞分化程度低。
然后，确定扩张期间细胞因子暴露对抗原刺激后细胞溶解分子穿孔素和粒酶B的表达的影响。与TNF-α生产类似，暴露于IL-2、IL-7和IL-15的CAR-T细胞与暴露于NC、IL-18和IL-21的CAR-T细胞相比，表现出增加的穿孔素表达。然而，尽管暴露于IL-21的CAR-T细胞产生较少的TNF-α和穿孔素，但它们产生最高水平的粒酶-B。在扩张期间暴露于IL-2和IL-15的CAR-T细胞中观察到下一个最高水平的粒酶-B产生。IL-18组中的CAR-T细胞在抗原刺激后呈现最少量的穿孔素和粒酶-B表达。
最后，通过萤光素酶测定法定量暴露于多种细胞因子的CAR-T细胞在暴露期间的肿瘤裂解活性。如图5D所示，与IL-2和IL-15共培养的CAR-T细胞比与NC和IL-18共培养的那些CAR-T细胞更有效地裂解SKOV3(这两者都P<0.05)。
CAR-T细胞表型与其功能之间的关联被进一步证实。在基于CAR和CD62L表达的慢病毒转导后14天分选T细胞。与CD62L-CAR-T细胞(Tem和Temra)相比，CD62L+CAR-T细胞(Tscm和Tcm)表现出较少的细胞因子产生活性和较弱的细胞溶解能力(图6A-6C)。在这个角度来看，暴露于IL-2和IL-15的CAR-T细胞产生更多的细胞因子并呈现更强的肿瘤裂解活性，这可能部分归因于这些组中Tem和Temra的较高比例。
5.抗原攻击后CAR-T细胞的扩张和表型
为了研究细胞因子对特定抗原攻击下CAR-T细胞扩张的影响，将暴露于IL-2两周的CAR-T细胞与SKOV3(FRα+)或C30(FRα-)细胞在指示的细胞因子存在下共培养7天。类似于无抗原的情况，暴露于IL-2、IL-7和IL-15的CAR-T细胞比暴露于其它细胞因子的CAR-T细胞呈现更高倍数的扩张。在扩张期间暴露于IL-21的CAR-T细胞更可能经历细胞凋亡。然而，当暴露于指定的细胞因子两周的CAR-T细胞与SKOV3或C30细胞在没有另外的细胞因子补充情况下共同培养7天时，所有组中CAR-T细胞的积累是相当的，暴露于IL-15和IL-18的那些细胞经历最少量的凋亡(图7A)。也分析CAR-T细胞的表型。对于记忆T细胞的四个亚组，结果不同于无抗原研究：Tscm是罕见的，并且Tem在无细胞因子、IL-18和IL-21的所有组中都占50％以上。细胞因子对记忆T亚组的组成没有显著影响，IL-7暴露不利于Tscm的增加(图7B)。
6.在动物模型中各种细胞因子的抗肿瘤功效
为了评估CAR-T细胞的离体(ex vivo)扩张过程中各种细胞因子对体内CAR-T细胞功效的影响，采用NSG小鼠卵巢癌异种移植模型研究了CAR-T细胞的持续性及其结果。用两次剂量的5×106C4-27z CAR-T细胞静脉内注射带有皮下SKOV3肿瘤的小鼠，所述CAR-T细胞之前已经离体暴露于指定的细胞因子2周。与注射未转染的T细胞和抗CD19 CAR-T细胞的那些小鼠相比，接受C4-27zCAR-T细胞输注的所有小鼠呈现较少的肿瘤负担(图8A)。在各种细胞因子组中，接受先前IL-2暴露的CAR-T细胞的小鼠显示出最高的肿瘤负担，与这些小鼠中循环的人T细胞的最少量一致。NC、IL-7、IL-15、IL-18和IL-21组中肿瘤均被显著抑制甚至消失，肿瘤大小无统计学差异。在过继转移后15天和32天确定外周血中转移的T细胞的持续性。接受IL-7和IL-21处理的CAR-T细胞的小鼠在第+15天在外周血中似乎具有比其他组更高量的人T细胞，而接受IL-2处理的CAR-T细胞的小鼠具有最低数目的人T细胞(图8B-8C)。对于不同的CAR-T细胞群体的百分比，与IL-2组相比，NC、IL-15、IL-18和IL-21暴露组均呈现较高的CD4+CAR-T细胞，而CD8+CAR-T细胞的百分比在所有组中是相当的。在T细胞表型中，CD62L、CD27和CD28仅在大约5-10％的T细胞上表达，并且在所有组中都是相当的，例外是IL-21组中的CD8+T细胞表达比IL-2和NC组中更高的CD28(这两者都P<0.05)。在第+32天，除了IL-2组外，所有CAR-T细胞组中循环的人T细胞显著扩张，平均T细胞计数为14907个/μl至19651个/μl(而IL-2组中仅242个/μl)。虽然肿瘤消退，但是两只老鼠死亡。
讨论
IL-2是用于过继性免疫疗法产生淋巴细胞的最常用的细胞因子。它促进T细胞的存活和扩张，增强T细胞的肿瘤杀伤能力。然而，IL-2的作用是受限的，因为它导致T细胞的活化诱导的细胞死亡(AICD)和调节性T细胞的发育(Malek等人，Immunity，2010，33：153-65；和Lenardo等人，Annu Rev Immunol，1999，17：221-53)。在这个实施例中，IL-2显著增加了CAR-T细胞的积累及其细胞毒性能力，但IL-2暴露的CAR-T细胞在过继转移后呈现较低的抗肿瘤免疫。这一发现证明了体外肿瘤裂解和体内肿瘤根除之间的反比关系。IL-2暴露的CAR-T细胞表现出相对成熟的表型，CD62L、CCR7、CD27和CD28的表达低，体内持久性较差(Yang等人，Cancer Immunol Immunother，2013，62：727-36)。最近的研究表明，较低分化的T细胞的过继转移与优良的肿瘤消退相关，这支持了IL-2暴露的CAR-T细胞比其他组更低效的发现(Gattinoni等人，Nat Med，2011，17：1290-7；和Markley等人，Blood，2010，115：3508-19)。
IL-15呈现与IL-2相似的刺激CAR-T细胞扩张和肿瘤裂解功能的表现，但诱导较少分化的表型(CD27和CD28的较高表达)。因此，IL-15支持在体内CAR-T细胞的持续性，并且在动物模型中显示出更好的抗肿瘤免疫。
与IL-2和IL-15相比，IL-7显示出促进CAR-T细胞扩张的相似能力，但诱导更高水平的CD62L表达，并且在无抗原环境中表现出最高比例的CAR-Tscm细胞。因此，与暴露于IL-2的CAR-T细胞相比，没有抗原攻击的IL-7的离体暴露增强了CAR-T细胞的抗肿瘤功效。由于在抗原攻击下CAR-T细胞的扩张较少，IL-7暴露的CAR-T细胞与IL-2暴露的CAR-T细胞相比没有导致更好的体内抗肿瘤功效并且功效弱于IL-15。
IL-21对CAR-T细胞的积累几乎没有影响，因为它不能例如通过促进Bcl-xL表达增强抗细胞凋亡能力。然而，即使在抗原攻击的情况下，IL-21也诱导较少分化的CAR-T细胞的扩张，具有高表达CD62L、CCR7、CD27和CD28的表型。因此，IL-21暴露的CAR-T细胞在体内的动物模型和IL-21注射中表现出最佳的持续性，并且在促进肿瘤根除方面表现出比除了IL-15之外的其它细胞因子组更好的功效。这些结果与先前发现一致：较少分化的CAR-T细胞与优异的肿瘤消退相关。
IL-18是属于IL-1家族的促炎细胞因子，其通过在体内激活单核细胞，NK细胞和T细胞以及产生IFN-γ以及其他细胞因子来调节先天和适应性免疫应答(Srivastava等人，Curr Med Chem，2010，17：3353-7)。本文提出的结果表明，IL-18在离体实验中对CAR-T细胞的扩张，表型和功能影响不大，因为IL-18组的大部分结果与NC组相似和相当。与对照(NC)组相比，IL-18促进了T细胞的少量增殖，并且在抗原攻击下维持更多的T细胞存活。体内研究表明，与没有细胞因子补充的小鼠相比，IL-18对CAR-T细胞功效没有显著影响。
总之，这些实验的发现表明，尽管广泛使用，但离体用于CAR-T细胞扩张的IL-2补充物不是最佳策略。对于IL-18、IL-21或没有细胞因子补充物，尽管它们可能诱导相对有效的CAR-T细胞，但它们不足够有效地促进CAR-T细胞的扩张，使得可以制备足够的CAR-T细胞在有限的扩张时间内用于临床使用。因此，IL-15和IL-7可能是更好的CAR-T细胞扩张剂。此外，IL-7和IL-15补充物的组合指示产生Tscm，其有益于产生更多的“年轻”CAR-T细胞。关于体内细胞因子注射，所有γc细胞因子补充物增强抗肿瘤功效，因为所述γc细胞因子有利于CAR-T细胞的扩张，IL-15呈现最佳效果。通过注射接受IL-15暴露的CAR-T细胞的小鼠具有增加的功效，部分是由于肿瘤治疗期间CAR-T细胞的扩张能力增加和持续性增加。因此，这些实验的结果表明，IL-7和IL-15显示出促进CAR-T细胞扩张的前景，并诱导对治疗性治疗最有效的T细胞表型。
实施例2：CD25消耗对细胞生长和转导效率的影响
白介素-2a链，也称为CD25，由调节性T细胞(Treg)表达，但也在慢性B细胞白血病(CLL)细胞(大于85％的CLL患者)中观察到。Treg具有免疫抑制功能，并且可以阻止免疫治疗的功效，例如通过抑制T细胞增殖。当前通过单采血液成分术从CLL患者中分离或富集T细胞通常含有显著增加比例的Treg和CLL细胞。通过CD25消耗方法在起始物质中消耗Treg和CLL细胞可显著改善效应T细胞的纯度，从而增加表达CAR19的T细胞(例如CART19细胞)的效力。
优化CD25消耗
使用CliniMACS系统中Miltenyi的CD25试剂进行验证实验以从两名患者的单采血液成分术的CD25消耗中鉴定最佳条件。使用制造商建议量的100％，70％和30％的CD25消耗试剂来鉴定是否通过使用较少的试剂可以获得相同的消耗效率。还测试了两个来自Miltenyi的不同试管组。消耗是按照制造商的指示进行的。实验结果如下表所示。对于对照，使用抗CD3/CD28免疫磁珠进行选择。
表2.CD25消耗的实验结果。
预期的CD25-(CD25阴性)T细胞产量代表通过假设相应操作中的100％效率计算的理论CD25-T细胞产量。CD25-T细胞的观测产量表示各个操作后CD25-T细胞的数目。如表2所示，使用比制造商推荐的更少的试剂没有导致CD25消耗中相同的效率。使用不同的管导致T细胞富集增加一个对数。
图9显示代表性流式细胞术分析图，表明与来自单采血液成分术的总细胞、对照CD3/CD28选择的细胞，CD25消耗细胞和富含CD25的细胞相比，CD25消耗的效率。细胞群体的单核细胞含量，如通过CD3-CD19-亚组的CD14表达所确定。这些结果表明有效的CD25消耗，并且CD25消耗也导致显著的单核细胞含量(相比来自单采血液成分术的总细胞、对照和富含CD25的细胞中少于2％而言，61.1％的CD14表达细胞)。
CD25消耗对T细胞群体和增殖的影响
接下来，通过测定CD4+和CD8+T细胞的比例和增殖能力来评估CD25消耗后T细胞产物的质量。
为了确定特定T细胞群体的比例，如上所述，通过抗CD3/CD28或CD25消耗选择后9天通过流式细胞术分析细胞。结果显示，与CD25消耗细胞相比，CD3/CD28选择的T细胞具有更大比例的CD4+T细胞(84.6％，相比46.8％的CD4+T细胞)。相反，与CD3/CD28选择的细胞相比，CD25消耗细胞具有更大比例的CD8+T细胞(与11.5％的CD8+T细胞相比为47.2％的CD8+T细胞)。因此，CD25消耗导致具有较大比例的CD8+T效应细胞的T细胞。
还在对照(CD3/CD28选择的细胞)和CD25消耗细胞中评估增殖能力和细胞成活力。将来自对照和CD25消耗细胞的1.6x107个细胞平板接种，并在10-13天测定细胞数量和成活力。图10A显示了随时间的总细胞数，图10B显示了计算的群体倍增(从总细胞数计算)。结果表明CD25消耗细胞表现出与对照细胞相似的生长特征。图10C显示了活细胞的百分比，并且结果显示对照和CD25消耗细胞之间的成活力也是相似的。
CD25消耗对慢病毒转导效率的影响
通过测定转导后CAR的表达来评估CD25消耗对慢病毒转导效率的影响。如上所述，用CD25细胞消耗患者单采血液。流式细胞仪分析图显示了CD25消耗的效率，比较了(单采血液成分术样品)前和CD25消耗后(CD25消耗的级分)CD25表达细胞群体。CD25消耗后，CD25消耗的级分含有约59.2％的CD25阴性细胞和仅10.3％的CD25阳性细胞。
CD25消耗的级分用编码CAR19的慢病毒构建体转导。培养11天后，通过流式细胞术评价CAR表达。未转导的细胞和转导的CD3选择的细胞用作对照。与CD3选择的细胞相比，CD25消耗细胞中CAR19表达显著较高(相比12.8％，为51.4％)。该结果表明CD25消耗细胞具有改善的慢病毒转导效率，这对于改善CART疗法的治疗效果可能是重要的。
实施例3：对CD25消耗细胞使用细胞因子
在该实施例中，检查了在培养物扩张期间CD25消耗与细胞因子补充物的作用。从患者中分离出外周血单个核细胞(PBMC)，如实施例2所述，将它们不经操作或者被消耗表达CD25的细胞。通过用抗CD3和CD28包被的珠刺激来实现T细胞富集。立即在补充有10ng/mlIL-7，10ng/ml IL-15，或者10ng/ml IL-7和10ng/ml IL-15的组合的培养基中培养T细胞。在第3天，添加相同的细胞因子来改变培养基。在第5天，加入含有100IU IL-2/ml的培养基，细胞共培养10天。
流式细胞术分析显示在IL7，IL-15，或者IL7和IL15存在下培养后，与未经操作的PBMC(标准CD3/CD28选择)相比，CD25消耗细胞中CD3和CD19细胞的分布的变化。评估起始群体中CD3、CD19和CD25表达细胞的分布(例如，在CD25消耗之前和用补充细胞因子培养之前)。起始群体具有高比例的CD3-CD19+细胞(～97.2％)和高比例的CD25表达细胞(～94.5％CD25+ CD3-；和～93.8％CD25+ CD19+)。在操作(CD25消耗)和用细胞因子培养后，分布如图11所示改变。与未操作的细胞相比，CD25消耗细胞总体显示出CD19表达细胞更大的减少。
还通过在用抗CD3和抗CD28包被的珠刺激后第10天，测定培养物中的细胞总数来评估相同细胞样品的增殖能力。每个细胞样品的细胞数目如下。
表3.体外扩张
这些结果表明，与未经操作的细胞相比，在CD25消耗的T细胞培养过程中补充IL-15导致增加的扩张。在培养过程中培养基中IL-7和IL-15的添加导致与未操作的细胞相比，并且与独立添加细胞因子IL-7或IL-15相比，扩张显著增加。因此，IL-7和IL-15补充的组合导致增殖能力增加最多的T细胞。
实施例4：刺激和扩张间皮素CAR T细胞
CD4或CD8 T细胞从外周血或脐带血获得。借助电穿孔，将体外转录的RNA引入细胞。在过夜温育以允许CAR最大表面表达后，将细胞与固定在甲苯磺酰基活化的磁珠(Invitrogen目录号14013)上的相应抗原在补充细胞因子的培养基中温育。允许细胞在体外扩张，每48小时定期补充新鲜的培养基(图22)。
培养始于CD4和CD8 T细胞的50:50混合物。将细胞模拟电穿孔或用SS1-BBz RNA电穿孔。在8小时后，细胞则暴露于间皮素缀合的珠(任由培养或持续1天)或CD3/CD28珠，任由培养。次日，将细胞模拟转染或用慢病毒转染。(图23)测量生长速率和细胞尺寸。用CD3/28珠刺激的细胞显示最高的群体倍增。但是，慢病毒转导降低2个群体倍增(暗红色)。(图24A)。无论是否用meso珠刺激1天或更长时间或用慢病毒转导，用SS1-BBz RNA预电穿孔的细胞均未显示群体倍增和细胞尺寸的差异。(图24A和图24B)。用CD3/28珠刺激的细胞和用间皮素包被的珠刺激的SS1-BBzCART细胞显示相似的转导效率。(图25A和25B)。
图26A中显示由肿瘤靶蛋白特异性抗体的重链和轻链的单链可变片段(scFv)组成的间皮素CAR。尽管本发明不限于任何单个scFv，但已经使用间皮素特异性scFv部分地获得这里展示的结果。这些CAR具有借助CD8z铰链区和跨膜结构域与scFv串联连接的共刺激结构域(如示意性图26A中所示)。图26B中显示间皮素CAR在人CD4或CD8 T细胞上的表面表达水平。
研究了通过间皮素CAR刺激扩张培养物中的外周血CD8 T细胞(图27A)CD4 T细胞(图27B)和脐带血CD8 T细胞(图27C)。在细胞因子存在下，将所示的表达间皮素CAR的CD4或CD8 T细胞与固定在磁珠上的间皮素共培养。CD4 T细胞接受IL2(30单位/mL)。在IL2(100单位/mL)或IL7+IL15(各自10ng/mL)存在下培养CD8 T细胞。每48小时计数细胞数目(使用Multisizer 3Coulter计数器)，并且按0.75e6/mL用新鲜培养基(补充有相应的细胞因子)再铺板。具有CAR的全部T细胞接受CAR特异性刺激并且在培养中扩张。不同的CAR共刺激结构域对培养的T细胞扩张具有不同影响，最佳组合是CD8 T细胞中的BBz CAR构建体。这些数目与使用CD3/28刺激条件时所见的扩张是可比较的。
实施例5：通过瞬时表达的嵌合抗原受体(CAR)活化和扩张T细胞
图28显示通过其相应抗原，借助T细胞表面上瞬时表达的嵌合抗原受体(CAR)进行刺激的方法示意图。CD4或CD8 T细胞从外周血或脐带血获得。借助电穿孔，将体外转录的RNA引入细胞。在过夜温育以允许CAR最大表面表达后，将细胞与固定到甲苯磺酰基活化的磁珠(Invitrogen目录号14013)上的相应抗原在补充有细胞因子的培养基中温育。允许细胞在体外扩张，每48小时定期补充新鲜的培养基。(图29)
测量了暴露于间皮素包被的珠后表达间皮素CAR的细胞的群体倍增(图30A)和细胞尺寸(图30B)以及培养下用间皮素CAR(图31A)或CD19 CAR(图31B)刺激的外周血T细胞和用间皮素CAR(图31C)刺激的脐带血CD8 T细胞的扩张。在细胞因子存在下，将表达CAR的T细胞与固定在磁珠上的CAR特异性抗原共培养。在IL7+IL15(各自10ng/mL)存在下培养CD8 T细胞。每48小时计数细胞数目(使用Multisizer 3 Coulter计数器)，并且按0.75e6/mL用新鲜培养基(补充相应的细胞因子)再铺板。
具有CAR的全部T细胞接受CAR特异性刺激并且在培养中扩张。不同的CAR共刺激结构域对培养的T细胞扩张具有不同影响，最佳组合是CD8 T细胞中的BBz CAR构建体。这些数目可比于(且在一些情况下，高于)使用CD3/28刺激条件时所见的扩张。
实施例6：通过嵌合抗原受体中的不同信号传导结构域再编程T细胞的代谢命运
嵌合抗原受体(CAR)使T细胞的细胞毒性重定向针对癌细胞，从而提供一种有前景的癌症免疫治疗新方法。尽管临床用途广泛，CAR共刺激结构域的影响CAR-T细胞的持续性和功能(例如，抗消耗性)的属性仍大多未确定。这个实施例报道了共受体CD28和4-1BB的信号传导结构域对移植CAR的人T细胞的增殖、细胞寿命、记忆分化和代谢特征的影响。在CAR结构中纳入4-1BB(TNF受体家族成员)促进CD8中央记忆T细胞的生长，所述细胞具有显著增强的呼吸能力、增加的脂肪酸氧化和增强的线粒体生物生成。相反，具有CD28结构域的CART细胞产生了遗传特征标识与糖酵解增强一致的效应子记忆细胞。这些结果至少部分地提供对临床试验中表达4-1BB或CD28信号传导结构域的CAR-T细胞的差异持续性的机理性认识并预示未来CAR T细胞疗法的设计。
基于输注基因重定向的自体T细胞的过继免疫疗法已经展示了治疗血液学恶性病和实体瘤的希望。因此，已经描述了基于T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，赋予T细胞所需抗原受体的多项功能获得型策略(June等人,Sci.Transl.Med.7,280ps7,2015)。在几项提出的策略当中，使用CAR已经在增进对癌、尤其B细胞恶性肿瘤的免疫应答方面显示强力作用(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38,2013；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509–1518,2013；Kalos等人,Sci.Transl.Med.3,95ra73,2011)。尽管CAR T细胞疗法可能对疾病清除具有明显影响，但是临床成功的CAR的必需组分及它们如何影响治疗功效仍大多不确定(Kalos和June,Immunity 39,49–60,2013)。
CAR是将T细胞的效应子功能与抗体结合结构域的精细特异性组合的合成的分子。在它们的最简单形式中，这些受体由移植至抗体的胞外可变区的TCR组成(Eshhar等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,720–724,1993；Kuwana等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.149,960–968,1987)。基于抗体的受体的一个优点是它们可以识别预定义的肿瘤靶，与抗原加工和主要组织相容性复合物(MHC)限制的呈递无关，从而令单次设计适用于广泛类型的患者。仅由Fc受体-γ链(g链)或CD3z信号传导模块的胞质结构域组成的第一代CAR经常变得无活动力并且未激发强力的T细胞抗肿瘤作用(Brocker,Blood 96,1999–2001,2000；Kershaw等人,Clin.Cancer Res.12,6106–6115,2006；Lamers等人,J.Clin.Oncol.24,e20–e22,2006)。这导致开发单独或按组合方式并入额外共刺激胞质结构域如CD28、4-1BB(CD137)、ICOS和OX40的第二代和第三代CAR(Dotti等人,Immunol.Rev.257,107–126,2014；Sadelain等人,Cancer Discov.3,388–398,2013)。这种模式设计成功地概括了天然共刺激作用的许多方面并增强CAR T细胞的增殖和功能(Maus等人,Cancer Immunol.Res.1,26–31,2014)。
CD19特异性CAR T细胞已经对各种血液学恶性肿瘤(包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和弥散性大B细胞淋巴瘤)显示出令人鼓舞的临床反应。然而，成功率难以比较，原因在于研究设计的几种变动以及单链可变抗体片段(scFv)、共刺激结构域、基因转移方案和输注CAR T细胞后的干预等的差异。采用并入CD28或4-1BB共刺激结构域的CAR所实施的试验已经在ALL患者中显示相似的初始应答率(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38,2013；Lee等人,Lancet 385,517–528,2015；Maude等人,N.Engl.J.Med.371,1507–1517,2014)。但是，在CLL中，具有4-1BB共刺激结构域的CAR T细胞的临床疗效(Porter等人,Sci.Transl.Med.7,303ra139,2015)似乎优于CD28结构域(Brentjens等人,Blood 118,4817–4828,2011Porter等人,Sci.Transl.Med.7,303ra139,2015)。与4-1BB CAR T细胞的持久表达和效应子功能(在某些患者中可以超过4年)(Porter等人,Sci.Transl.Med.7,303ra139,2015)相比，报告的体内基于CD28的CAR T细胞的持续性是约30天(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38,2013；Lee等人,Lancet 385,517–528,2015)。此外，在某些CAR中并入4-1BB信号传导结构域减轻消耗(Long等人,2015)。另一项重要考虑是内源CD28和肿瘤坏死因子受体家族(TNFR)成员(如4-1BB)在T细胞中激发不同的信号传导级联。CD28导致P13K-Akt途径激活，对葡萄糖代谢产生下游影响和糖酵解增加(Frauwirth等人,Immunity 16,769–777,2002)。相反，内源4-1BB信号传导已经涉及赋予T细胞长期存活获益(Sabbagh等人,J.Immunol.180,8093–8101,2008)并且由4-1BB使用的信号传导途径区别于CD28(Martinez-Forero等人,J.Immunol.190,6694–6706,2013)。因此，透彻理解CAR的分子信号传导作用可以部分地解释观察到的针对CLL的临床疗效差异。
确定最佳CAR设计的挑战在于缺少研究基于CAR的刺激的影响的生理学体外模型。另外，采用逆转录病毒的现有基因转移方案需要将T细胞借助其内源TCR同步活化，这可能模糊因借助CAR本身进行信号传导的作用。在这个实施例中，描述了允许在无需激活内源TCR的情况下在超过90％的T细胞中表达CAR的方法。用相应抗原刺激CAR T细胞允许鉴定对人原代T细胞分化和代谢的不同影响。发现CAR信号传导结构域可以介导代谢性再编程，同时调节生物能学和线粒体生物生成。发现4-1BBz CAR T细胞展示与增加的中央记忆T(Tcm)细胞频率相关的增强存活、线粒体生物生成和更大的氧化代谢。相反，对CD28z CAR T细胞的抗原刺激促进效应子记忆分化并导致增强的需氧糖酵解。
如这个实施例中所述，共受体的不同信号传导可以在CAR T细胞中调节特定的代谢途径并影响记忆形成。
实验流程
CAR构建体和产生编码CAR的体外转录(IVT)的RNA
出于这些研究的目的，使用对人CD19或间皮素抗原特异的CAR。图32A显示这项研究中使用的CAR的示意图。不管在何处指出，全部CAR均含有针对人CD19(克隆FMC-63)的单链可变片段(scFv)或针对人间皮素蛋白的SS1 scFv(Hassan等人,Clin.Cancer Res.8,3520–3526,2002；Nicholson等人,Mol.Immunol.34,1157–1165,1997)。先前描述了间皮素CAR(Carpenito等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106,3360–3365,2009)。如前述，CD28z CAR由通过CD8a铰链区和CD28跨膜结构域的顺式连接至CD28和CD3z的胞内结构域的scFv组成(Milone等人,Mol.Ther.17,1453–1464,2009)。类似地，BBz CAR含有通过CD8a铰链区和跨膜结构域与4-1BB胞内部分和CD3z结构域连接的scFv(Milone等人,Mol.Ther.17,1453–1464,2009)。为了制备体外转录(IVT)的RNA，如前述，将编码CAR的基因构建体亚克隆入基于pGEM.64A的载体(Zhao等人,Cancer Res.70,9053–9061,2010)。
CAR RNA制备
对于体外转录(IVT)的RNA，将T7mScriptTM RNA系统(Cellscript,Madison WI)根据生产商的说明和如前述(Zhao等人,Cancer Res.70,9053–9061,2010)使用。将IVT产物用RNeasy微量试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,CA)纯化并且将纯化的RNA以1μg/μL洗脱于无RNA酶的水中。
人原代T淋巴细胞的分离、电穿孔和扩张
在宾夕法尼亚大学单采血液成分术中心从匿名健康供体获得人原代T淋巴细胞。使用BTX CM380(Harvard Apparatus BTX)电穿孔仪，将IVT RNA按1ugRNA/106个细胞的比率引入T细胞。优化这项技术以促进细胞表面上CAR均匀表达(图32B)。用重组抗CD19独特型或间皮素Fc包被的磁珠刺激T细胞。
刺激珠的制备
对于体外刺激CAR T细胞，将重组抗CD19独特型抗体或间皮素Fc融合蛋白与甲苯磺酰基活化的Dyna珠M-450(Invitrogen,USA)偶联。为了偶联，将每4x108个珠洗涤1次并重悬于1mL无菌硼酸溶液(0.1M硼酸，pH 9.5)中。为此目的，添加1mL硼酸溶液中的150μg蛋白质并在37℃温育过夜(16-24小时)，同时持续混合。在捕获磁珠后，将溶液滗析并将珠用珠洗涤液(PBS中3％人白蛋白，0.1％叠氮钠和0.4％0.5M EDTA)洗涤3次，每次10分钟，并且随后在新鲜的珠洗涤液中进行另一次过夜洗涤，同时连续振摇。在用于体外刺激前，将包被的珠在R10(补充了10％FCS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素硫酸盐的RPMI)中洗涤3次。为了刺激，CAR RNA电穿孔的细胞与珠按3:1的珠:细胞比率共培养。
T细胞培养
整个培养期间，将细胞在R10中于37℃维持并且每48小时输以新鲜培养基。使用Coulter Multisizer III粒子计数器计数细胞。将每个时间点的群体倍增测量为当日对测量的最后时间点的总细胞比率。将累积性群体倍增作图。将培养基补充如下细胞因子：对于CD4+ T细胞，30U/mL人IL2(Chiron)，并且对CD8+ T细胞10ng/mL IL7+10ng/mL IL15(R&Dsystems)。
用于流式细胞术分析的表面染色
通过用Live/Dead Fixable Aqua胺反应性成活力染料(Life Technologies)在室温染色15分钟，测量细胞活力。以下荧光探针缀合的抗体购自BD Biosciences：αCD4-BV711、αCD8-APCH7、αCD45RO-PE、αCD69-PECF594、αCCR7-PE-Cy7、αCD25-PE-Cy7、αCD127-FITC和αCD215-PE。在补充3％胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在4℃进行表面染色30分钟。通过以下方式检验CAR的表面表达：将细胞与生物素标记的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体(Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)在4℃温育30分钟，随后用FACs缓冲液(加3％BSA的PBS)洗涤二次并用藻红蛋白标记的链霉亲和素(BD Pharmingen,San Diego,CA)检测。将样品数据在LSRII Fortessa(BD Biosciences)上采集并用FlowJo软件(Treestar)分析。
流式细胞术分析
将活细胞对Live/Dead Aqua阴性设门并且随后对CD3阳性事件、CD4阳性事件和CD8阳性事件设门。使用记忆细胞的标志物CCR7和CD45RO，我们分析了培养细胞并且使用BDFACSCalibur分析仪，将它们对三种不同的记忆表型分选。可以通过使用CountBright绝对计数珠(Life Technologies)，使用以下公式确定T细胞绝对计数：(T细胞事件数/珠事件数)X所用珠的数目。
代谢参数的分析
用胞外通量分析仪(Seahorse Bioscience)评估线粒体功能。根据生产商的说明，将XF24(图34B-34C和34F-34G)或XF96(图34H-34K)细胞培养微量平板的各个孔用CellTak包被。将基质在37℃吸附过夜，吸出，晾干并储存在4℃直至使用。在第0、7和21天评估线粒体功能。为了分析线粒体功能，将T细胞以1200x g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含有5.5mM葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的XF分析培养基(非缓冲的RPMI 1640)中并且按1x106个细胞/孔接种。将微量平板以1000x g离心5分钟并且在标准培养条件下温育60分钟。在仪器校正期间(30分钟)，将细胞转移至无CO2(37℃)培养箱。根据生产商的说明校准XF24和XF96分析管。在基础条件下并随后用5mM寡霉素、5mM碳酰氰氟苯腙(FCCP)和40nM鱼藤酮处理、用1mM抗霉素A(XFCell Mito Stress kit,Seahorse Bioscience)处理后测量细胞耗氧率(OCR)。
基因表达分析
定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)用来定量某些候选基因的表达水平。使用来自细胞的总RNA作为模板，以利用High Capacity RNA-to-cDNA试剂盒(AppliedBiosystems)合成cDNA。在ViiA7实时PCR系统上按照生产商的说明，用Taqman通用主混合物一式三份进行qRT-PCR。如通过PCR系统定量的每个候选基因的mRNA水平对持家基因GADPH归一化。所用的全部探针均可商业获得(Applied Biosystems)。
葡萄糖摄取测定法
将刺激后第7天的细胞在PBS中在室温饥饿30分钟，随后在37℃在补充11mM葡萄糖、10％FCS、100U/ml青霉素、100mg/ml硫酸链霉素和2mM glutamax的常规RPMI培养基中温育。将500uL等分的细胞培养物在指示的时间点收集并离心，并且用Nova BioProfileAnalyzer(Nova Biomedical)分析上清液的葡萄糖浓度和乳酸浓度。
棕榈酸摄取测定法
[13C16]棕榈酸购自Sigma-Aldrich。全部液相色谱质谱用溶剂均为Optima级并购自Fisher Scientific。对于棕榈酸标记的同位素实验，将细胞在不含D-葡萄糖或L-谷氨酰胺(Biological Industries)并且补充有10％活性炭处理的FBS(GIBCO)、2mM L谷氨酰胺(Life Technologies)、5.0mM葡萄糖和100mM[13C16]棕榈酸的RPMI 1640中培养过夜。
短链酰基CoA提取
提取过程如前述进行(Basu和Blair,Nat.Protoc.7,1–12,2012；Worth等人,J.Biol.Chem.289,26895–26903,2014)。简言之，将淋巴细胞以1200相对离心力(rcf)离心5分钟。将细胞沉淀重悬于750ml冰冷的10％三氯乙酸中并用超声细胞破碎仪(FisherScientific)脉冲超声处理。将样品以15000相对离心力离心15分钟，并且通过固相提取法纯化上清液。简言之，Oasis HLB 1ml(30mg)固相提取柱用1ml甲醇、随后1ml H2O调理。将上清液施加到柱上并用1ml H2O洗涤。将分析物洗脱在含有25mM乙酸铵的甲醇中，在N2气中干燥过夜，并重悬于50ml 5％5-磺基水杨酸中。在LC/ESI/MS/MS分析中施加10ml注射上样物。
酰基-CoA硫酯的LC/MS分析
如前述，以水中的5mM乙酸胺作为溶剂A、乙腈(ACN)/水(95:5，v/v)中的5mM乙酸胺作为溶剂B和ACN/水/甲酸(80:20:0.1，v/v)作为溶剂C，用Phenomenex Luna C18反相高效液相色谱柱(2.0 3 150mm，5mm孔径)分离酰基-CoA(Basu等人,Anal.Chem.83,1363–1369,2011；Worth等人,J.Biol.Chem.289,26895–26903,2014)。如下运行线性梯度：2％溶剂B持续1.5分钟，经3.5分钟增加至25％，经0.5分钟增加至100％，保持8.5分钟并用100％溶剂C洗涤5分钟，之后平衡5分钟。流速是200ml/分钟。用API 4000三重四极杆质谱仪(AppliedBiosystems)以阳性电喷雾电离(ESI)模式分析样品。将样品(10ml)用LEAP自动进样器(CTCAnalytics AG)进样并维持在4℃。用Analyst 1.4.1版软件(AB SCIEX)分析数据。将柱流出物从8–23分钟转移至质谱仪并且对于该运行的其余部分，转移废弃。质谱仪运行条件如下：离子喷雾电压(5.0kV)，氮气作为气帘气(15U)、离子源气体1(8U)、离子源气体2(15U)和碰撞诱导的解离气体(5U)。ESI探测器温度是450℃，去簇电势是105V，入口电势是10V，碰撞能是45V并且碰撞室出口电势是15V。监测每种酰基-CoA损失507Da。
显微术
将不同时间点的细胞用DiI、Mitotracker绿和DAPI(Life Technologies)染色并且用4％PFA固定，之后在Leica TSC SP8共聚焦显微镜上成像。用Fiji(ImageJ)分析捕获的图像并且将荧光发射定量为平均荧光强度(MFI)。对于透射电子显微术，细胞由Penn’sElectron Microscopy Resource Laboratory制备并使用Jeol-1010显微镜成像。
统计分析
不管何处指出，全部结果均表示为均数±均数标准误(SEM)或标准偏差(SD)。使用Prism(GraphPad软件)，通过Student’s t检验或两因素ANOVA模型执行统计比较，因素为CAR群体和样品采集时间点。对二个CAR T细胞群体之间的群体倍增执行Wilcoxon符号秩检验(双尾)。
结果
BBz CAR T细胞显示增加的离体扩张和存活
这项研究最初比较了对CD19或间皮素特异的二种CD19 CAR设计(图32A)。这些CAR配备了包含CD28(Kochenderfer等人,J.Immunother.32,689–702,2009)或4-1BB(Milone等人,Mol.Ther.17,1453–1464,2009)的信号传导结构域。选择这些CAR是因为它们已经在临床试验中经充分检验(Beatty等人,Cancer Immunol.Res.2,112–120,2014；Kochenderfer等人,Blood 119,2709–2720,2012；Lee等人,Lancet 385,517–528,2015；Maude等人,N.Engl.J.Med.371,1507–1517,2014；Maus等人,Cancer Immunol.Res.1,26–31,2013；Porter等人,Sci.Transl.Med.7,303ra139,2015)。两种CAR构建体均在>90％的CD4+和CD8+T细胞上按可比的平均荧光强度(MFI)表达(图32B)。图32C中显示研究设计的示意图。CD28和4-1BB(称作28z和BBz)信号传导结构域对T细胞分化和代谢命运的影响。CD4+ T细胞在补充30U/ml人IL2的培养基中培养。CD8+ T细胞在补充100U/ml人IL2或10ng/ml IL7和10ng/ml IL15的培养基中培养，如实验程序中所示。电穿孔后大约24小时，将CAR-T细胞用珠结合的针对FMC-63 scFv(其充当相应CD19抗原的代用物)的抗独特型Fc刺激。为了确保CAR T细胞接受均匀刺激，在活化后第1天分析活化分子CD69的表面表达。CD69是作为淋巴样活化的敏感指标的诱导型细胞表面糖蛋白(Hara等人,J.Exp.Med.164,1988–2005,1986)。接受CAR特异性刺激的细胞在第1天显示在28z和BBz CAR T细胞上相似的升高CD69表达(图33A)。但是，携带BBz CAR的CD4 T细胞和CD8 T细胞的增殖潜能均延长直到至少第20天。相反，28zCAR T细胞的增殖阶段限于14天(图33B和图37，p<0.01)。用相应抗原刺激后，CAR表面表达快速地降低(图41)。重要地，细胞因子受体表达在两种CAR群体中是可比较的(图41)，这表明在不同CAR T细胞之间的增殖差异并不因细胞因子受体表达的差异所致。在一位供体中，观察到BBz CAR T细胞培养物中群体倍增超过十，使4x 106个细胞的起始培养物在小于四周内扩张至超过5x 109的计算产量(表5)。单次刺激后，BBz CAR T细胞在补充细胞因子的培养基中培养下续存超过4周。相反，28z CAR T细胞的增殖和/或存活较低。尽管供体之间增殖能力有变动，但趋势仍始终如一，即与28z CAR T细胞相比，BBz CAR T细胞展示更高的增殖能力和持续性(图40，p<0.01)。用针对间皮素的CAR获得了类似结果(图33C，图38，表5和表7)。这个实施例的剩余部分主要集中于CD8+ T细胞中CAR设计的影响。
表5：3位独立人供体T细胞的群体倍增和总产量。如与28z细胞相比，BBz T细胞继续续存较长的持续时间。在观察到细胞数目连续下降至少两次后，停止培养。BBz CAR T细胞也在每位受检供体中显示较高的群体倍增。末栏显示扩张结束时获得的细胞的总数，每组中始于4x106个细胞。
BBζCAR信号传导促进增强的中央记忆T细胞(TCM)亚群
假设增强的BBz T细胞持续性归因于相对保存了具有更广泛增殖能力的细胞。为了测试BBz和28z CAR-T细胞的分化状态，使用一组与T细胞分化相关的标准细胞表面标志物。评估了与Tcm细胞相关的CD45RO和CCR7的表达。全部培养物在第0天均含有相同异质群体的T细胞亚群。受CAR刺激后，CD45RO+CCR7+细胞的比例渐进性富集(图33D)。值得注意地，与28z组相比，BBz CAR组中这个Tcm细胞群体的富集更高(p<0.01)并且续存直至培养结束(图33E)。相反，28z CAR培养物持续地产生更高比例的效应子-记忆表型(Tem)，其经鉴定为CD45RO+CCR7-细胞。细胞向记忆表型汇集物的分配/分化可能潜在地因相对于28z CAR经BBz CAR刺激的细胞的寿命差异所致。
表6：显示3位供体在培养下的TE和TM细胞比例的绝对细胞计数。28zCAR T细胞显示更高百分比的和更高数目的饰有TE细胞特征性标志物的细胞。在另一方面，BBz CAR T细胞具有更高数目的TM表型。
表7：通过meso CAR刺激的3位独立人供体T细胞的群体倍增和总产量。末栏显示扩张结束时获得的细胞的总数，每组中始于4x106个细胞。数据来自3位代表性供体(来自测试的至少6位独立供体T细胞)。
CAR信号传导结构域再编程T细胞代谢(BBζCAR T细胞展示不同的氧化特征)
刺激后，CD8+ T细胞发生涉及增殖和分化成效应细胞和记忆细胞的有序过程。活化与支持T细胞增殖和功能所要求的生物合成和生物能学通量相关(Pearce和Pearce,Immunity 38,633–643,2013；Wang和Green,Nat.Immunol.13,907–915,2012)。例如，幼稚和记忆T细胞主要依赖线粒体氧化游离脂肪酸供发育和续存(Pearce等人,Nature 460,103–107,2009；van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。相反，活化的效应T细胞转向糖酵解(或同时上调氧化磷酸化和有氧糖酵解)，以满足增殖的代谢需要(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。在调节T细胞分化和存活的其他因素(包括信号传导事件、细胞死亡和免疫功能)当中，这个实施例研究了细胞代谢与上述观测结果的相互联系。
基于28z和BBz CAR T细胞的不同生长速率和分化，我们力图探索细胞代谢和CAR信号传导的相互联系。首先，在刺激后的不同时间点检测表达二种CAR的T细胞的代谢谱。发现细胞体积(细胞质量的代用物)在相应抗原刺激后是可比较的(图34A)。测量对数期增殖期间抗原性刺激之前和之后7和21天的28z和BBz CAR T细胞的耗氧率(OCR)。测量基础OCR，随后系列添加寡霉素(ATP合成的抑制剂)、碳酰氰对三氟甲氧基苯腙(FCCP；解偶联离子载体)和鱼藤酮连同抗霉素A(分别是电子传递链的复合体I和III的阻断剂)(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。OCR谱与第0天抗原刺激之前相似(图34B)。在抗原刺激后，第7天和第21天在两个T细胞组中基础OCR增加约10倍(图34C)。但是，在第7天和第21天使用FCCP解偶联线粒体膜后，对BBz CAR T细胞特异的最大呼吸能力稳健增加(图34F)。相反，28z CAR T细胞的最大呼吸能力在第7天和第21天类似于其第0天的情况。为了证实OCR的这些差异归因于受体的信号传导结构域，用间皮素特异性CAR T细胞进行相似的实验。在间皮素刺激后第7天和第21天，间皮素-BBz CAR T细胞显示与28z CAR T细胞相比基础和最大呼吸能力升高(图39)。还测量了胞外酸化速率(ECAR)作为糖酵解期间乳酸产生的可度量代用物。糖酵解涉及以产生乳酸为终结的一系列酶催化反应。在生理pH，乳酸解离成胞外输出的乳酸盐和H+。在第7天和第21天，与BBz CAR T细胞相比，28z细胞中的ECAR水平升高(图34D和34G)。
几个报道已经显示，与效应记忆细胞和终末分化的效应细胞相比，分化的天然中央记忆T细胞显示升高的基础OCR和SRC。这些氧化特征表明，增加的脂肪酸氧化(FAO)依赖可能是中央记忆细胞分化和存活必需的(Pearce等人,Nature 460,103–107,2009；van derWindt等人,Immunity 36,68–78,2012)。因为在培养下的二个CAR T细胞组中观察到差异性记忆表型富集，所以延长分析以揭示各个记忆亚群如何有助于CAR T细胞的代谢特性。再次，利用CCR7和CD45RO作为表型标志物，将群体分选成CCR7+CD45RO-、CCR7+CD45RO+和CCR7-CD45RO+，以分别定义幼稚样亚群、Tcm细胞亚群和Tem细胞亚群。与28z CAR T细胞相比，代谢通量揭示在Tcm和Tn记忆亚型中BBz的基础OCR和最大呼吸能力更高(图34H和34I)。如涉及效应细胞的以往报道中观察，对于两个CAR组，Tem细胞亚群的基础OCR以及最大呼吸水平保持低(图34J)。在另一方面，对于从28z CAR T细胞培养物获得的Tcm和Tem细胞亚群，ECAR水平保持较高(图34K)。总之，这些研究显示BBz CART细胞在代谢上区别于28z CAR T细胞，前者展示出可能有助于BBz CAR T细胞的中央记忆分化和持续性增强的更大氧化代谢能力。
28z和BBz CAR T细胞具有不同的糖酵解和脂肪酸代谢
为了研究CAR T细胞中基础OCR的差异是否改变这些细胞籍此满足其生物能学需要的燃料来源，测量CAR T细胞中的葡萄糖摄取率和脂肪酸利用率。在刺激后第7天，将细胞再铺种于新鲜培养基中。在不同时点(如图34L中所示)，测量培养基中残余葡萄糖的量和产生的乳酸盐。28z CAR T细胞以相对更快的速率消耗葡萄糖，同时产生乳酸。这与我们在28zCAR T细胞中观察到的更大ECAR一致(图34G和34K)。
BBz CAR T细胞中增加的OCR促使我们检测这些细胞中的脂肪酸消耗速率。使用重碳标记的长链脂肪酸(棕榈酸)，通过测量重碳标记的乙酰CoA的水平，分析其摄取速率。在线粒体中，b氧化的分解代谢过程将脂肪酸分子分解成乙酰CoA以供给柠檬酸酸循环。发现如与28z CAR T细胞相比，BBz显示出更高百分数的标记的乙酰CoA汇集物(图34M)。该数据表明类似于CD8+ Tcm细胞，BBz CAR T细胞广泛地依赖于分解代谢途径如FAO以补充其生物能学需求。
为了深入了解导致由不同CAR信号传导结构域引起的代谢差异的机制，测量涉及糖酵解与脂质代谢的候选基因的表达。起初聚焦于两种涉及葡萄糖代谢的主要酶，Glut1和PDK1。在激活CD28后诱导Glut1(参与葡萄糖摄取的转运蛋白)的细胞表面表达(Frauwirth等人,Immunity 16,769–777,2002)。在某些背景(包括缺氧)下，PDK1抑制丙酮酸脱羧和葡萄糖衍生物进入三羧酸(TCA)循环(Duvel等人,Mol.Cell 39,171–183,2010)。在第7天，相对于BBz细胞，在28z细胞中诱导Glut1和PDK1至显著较高水平(图34E)。28z CAR T细胞中与其BBz对应物相比，与较早研究结果(ECAR增加)关联的Glut1和PDK1表达水平增加与糖酵解增强一致。
参与糖酵解途径的ATP生成步骤期间葡萄糖分解的两种重要酶是磷酸甘油激酶(PGK)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。PGK将磷酸酯基团转移给ADP，以促进ATP生成，而G6PD，一种NADP+-依赖性酶，催化磷酸戊糖途径(PPP)的氧化阶段。鉴于这些酶在糖酵解中具有重要作用，在第7天研究了它们在CART细胞中的表达水平。在28z CAR T细胞中它们的水平升高。最后，还检查了溶质载体家族16(SLC16A3)(糖酵解副物(乳酸和丙酮酸)输出蛋白)的水平。与BBz T细胞相比，28z CAR T细胞显示更高水平的SLC16A3mRNA，这与如下假设一致：28z CAR T细胞利用增加的糖酵解作为满足它们的代谢需要的手段。还在28z CAR T细胞中检测到VEGFA(其是低氧诱导因子(HIF)的已确立靶)表达增加。参与糖酵解的几个基因是HIF1a的靶(Finlay等人,J.Exp.Med.209,2441–2453,2012)，包括Glut1和PFK。其他人已经显示，HIF1A-/-T细胞显示受损的自身反应性(Dang等人,Cell 146,772–784,2011)。这个实施例中所示的研究结果增加了日益增长的涉及效应子分化中借助CD28的共刺激作用和糖酵解再编程的证据。接着，研究了与线粒体FAO相关的基因。日益增加的证据已经展示了肉碱棕榈酰转移酶(CPT1A)在调节CD8+细胞的氧化代谢中的作用(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。CPT1A是控制线粒体FAO中的限速步骤并促进线粒体生物生成的代谢酶。与28z CAR T细胞相比，在BBz CAR T细胞中观察到显著更较高的CPT1A mRNA水平。另外，与28z相比，BBz CAR T细胞中脂肪酸结合蛋白(FABP5)(其在长链脂肪酸摄取、转运和代谢方面发挥至关重要作用)的mRNA水平显著上调(图34E)。这些研究结果表明，28zCAR T细胞更依赖基于糖酵解的代谢而BBz将T细胞编程以利用脂肪酸作为优势能量来源，这些分别是天然效应T细胞和记忆T细胞的特征。
BBζCAR T细胞具有增加的储备呼吸能力
线粒体储备呼吸能力(SRC)是当细胞或线粒体应激时可以怎样将质子有效地穿梭运输入线粒体膜间间隙的指标(Mookerjee等人,Mech.Ageing Dev.131,463–472,2010；Nicholls,Biochem.Soc.Trans.37,1385–1388,2009)。通过向暴露于代谢性应激(包括养分消耗、氧丧失)或处于细胞活性增加条件下的细胞提供能量的储备来源，SRC增强记忆T细胞的存活和功能。增加SRC或许支持sT细胞在不友善的肿瘤环境中的功能(Ferrick等人,DrugDiscov.Today 13,268–274,2008；Nicholls,Biochem.Soc.Trans.37,1385–1388,2009；Yadava和Nicholls,J.Neurosci.27,7310–7317,2007)。记忆CD8 T细胞不同于效应细胞，维持相当多的SRC(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。当比较二个CAR组的SRC时，观察到在刺激后第7天和第21天，与28z CAR T细胞相比，BBz CAR T细胞维持更高水平的SRC(图35A)。这与长寿命CD8+记忆细胞的代谢特征一致，从而给予以下假设额外的支持：BBz信号支持有助于长寿命记忆样T细胞的代谢再编程。
鉴于氧化代谢中线粒体密度的作用(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)，探索了BBz CAR T细胞中增加的SRC与线粒体质量增加相关的可能性。使用电子显微镜检查，在第7天测量到28z和BBz CAR-T细胞之间相似的线粒体密度(图35B和35C)。但是，在抗原刺激后第14天(图35B)和第21天(图42)，BBz CAR T细胞的线粒体质量大幅增加。尽管细胞体积相似(图34A)，BBz CAR-T细胞中线粒体密度显著增加(p<0.001)。为了证实BBzCAR T细胞具有增强的线粒体含量，我们还使用共聚焦显微术，测量了线粒体密度(图36A)。BBz CAR T细胞在第14天和第21天显示增加的线粒体质量对总细胞质量比率(图36B)。
BBz CAR T显示增强的线粒体生物生成
构思了来自CAR结构中4-1BB信号传导结构域的特定信号支持线粒体生物生成，因此赋予这些细胞更大的线粒体质量。但是，除线粒体含量的定量差异之外，检测了线粒体的定性差异是否可能有助于这些CAR细胞之间代谢谱的差异。检测了胞核(线粒体基因组)编码的某些线粒体基因(即分别为线粒体转录因子A(TFAM)和MTCO-1)的水平。值得注意地，BBz细胞具有线粒体TFAM和线粒体编码的细胞色素c氧化酶1(细胞色素c氧化酶复合体的主亚基)的显著增强的mRNA表达(图36C)。
为了探索CAR T细胞背景下28z和BBz共刺激结构域对线粒体功能的影响，我们测量了线粒体基因的二种转录因子(即胞核呼吸因子1(NRF1)和GA-结合蛋白(也称作NRF2))的基因表达。虽然NRF1调节TFAM表达并协调mtDNA复制和表达，NRF2在OXPHOS组分的转录、线粒体输入和TFAM中具有作用。与其如依据代谢流分析和线粒体密度所见的增强的氧化特征一致，我们发现与28z CAR T细胞组相比，BBz CAR T细胞具有显著更高的NRF1和NRF2表达(图36D)。
总之，这些研究结果表明与28z CAR T细胞相比，BBz CAR T细胞中线粒体含量增加，这与这些细胞中观察到的SRC增加强烈相关。这些研究结果与BBz信号传导过程再编程的支持线粒体生物生成和氧化代谢的转录网络的模型一致。鉴于代谢性适应在允许T细胞记忆和效应子功能中的作用，BBz CAR T细胞中的前述氧化特征最可能支持中央记忆分化和T细胞持续性。
讨论
使用CD28或4-1BB信号传导结构域，这些研究揭示了CAR T细胞分化谱和代谢谱的显著差异。28z CAR T细胞中的优势代谢程序是需氧糖酵解，并且在BBz CAR T细胞中，它是脂肪酸的氧化分解。这些研究提供了T细胞代谢再编程可塑性的证据并且进一步提供了选择CAR信号传导结构域可以影响T细胞后续命运的证据。这些研究中观察到BBz的增强增殖和持续性超过28z CAR T细胞，反映了临床研究中观察到的CAR持续性的结果(Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38,2013；Brentjens等人,Blood 118,4817–4828,2011；Lee等人,Lancet 385,517–528,2015；Porter等人,Sci.Transl.Med.7,303ra139,2015)。这些研究表明，差异持续性的一种机制可能是CAR T细胞的代谢再编程增强作为记忆细胞特征的氧化磷酸化或作为效应细胞特征的需氧糖酵解(MacIver等人,Annu.Rev.Immunol.31,259–283,2013；van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。
先前研究已经显示，CD28信号传导过程启动导致Glut1表面表达增强和需氧糖酵解依赖性增加的级联(Frauwirth等人,Immunity 16,769–777,2002)。相反，启动线粒体FAO和T细胞记忆发育要求TNFR途径(Pearce等人,Nature 460,103–107,2009)。尽管IL2促进CD8+ T细胞中的效应子分化和糖酵解(Finlay等人,J.Exp.Med.209,2441–2453,2012；Liao等人,Immunity 38,13–25,2013；Pipkin等人,Immunity 32,79–90,2010)，IL7和IL15已经参与维持记忆T细胞和线粒体生物生成增加(Ku等人,2000；Schluns和Lefranc，ois,2003；van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。鉴于人CD8+ T存活在外源细胞因子不存在的情况下受损，IL7和IL15必须存在于培养系统中。尽管这些外来因素可以在稳定T细胞代谢谱方面发挥显著作用，但是假设在这个实施例中描述的系统主要由接受二种独特胞内CAR信号传导结构域影响的细胞内在因素支配。这进一步由这些细胞因子受体的细胞表面表达缺少差异确证，从而显示二种CAR之间代谢再编程的相对差异性不能完全由补充的细胞因子介导。因此，这些研究表明CAR中CD28或4-1BB信号传导结构域的异位表达导致天然T细胞活化过程的表型模拟。进一步地，这些研究表明，并入多种信号传导模块可以针对目的效应子功能或调节功能按生物合成方式再编程T细胞。例如，发现在CAR中并入ICOS信号传导结构域促进Th17细胞分化程序(Gued等人,Blood 124,1070–1080,2014)。
这种研究结果的一项临床应用是可以“如愿”产生短寿或长寿命CAR T细胞。取决于其中长期CAR作用可能因潜在脱肿瘤毒性而不可忍受的某些表面分子，这可能拓展靶的范围。在这种情况下，CD28信号传导结构域将预期是优越的。来自这些研究的另一个含意是，表达4-1BB结构域和CD28结构域的CAR T细胞的混合物可以优于作为单一群体的任一种CAR。构思这一点是因为CAR T细胞的组合将预期更彻底地模拟这样的天然免疫应答，所述天然免疫应答包含具有细胞质中增强的需氧糖酵解的用CD28 CAR实现的T效应细胞和具有增强的线粒体氧化磷酸化的用4-1BB CAR实现的T记忆细胞早期占优势。
除细胞内在因素之外，在理解肿瘤微环境下养分消耗对T细胞存活的影响方面存在巨大意义。T细胞具有存活和实施效应子功能的大量生物能学和生物合成挑战。结果是BBz CAR T细胞具有增加的产生线粒体质量的能力。线粒体质量的这种增加提供了存活优势(van der Windt等人,2013)。在BBz CAR T细胞中始终观察到较高的SRC，并且已经显示这种线粒体呼吸能力是天然CD8+ T细胞记忆发育的重要特征(van der Windt等人,Immunity 36,68–78,2012)。BBz细胞的基础耗氧量增加还提示了偏好性依赖氧化磷酸化作为优势能量生成机制，以满足CAR T细胞增殖增强所要求的代谢需要。另外，数据表明，代谢是CAR T细胞存活的重要中介物并且受CAR中包括的共刺激结构域诱导的信号传导影响。总之，这些结果揭示了CAR T细胞工程化以控制T细胞代谢作为T细胞效应子和记忆反应的关键决定因素的新作用。利用合成生物学，可能塑造免疫应答，使得长寿命记忆细胞和短寿效应细胞具有所需要的平衡。进一步地，这些研究应当影响在不利的肿瘤微环境和炎性微环境下工程化T效应细胞或抵抗消耗或具有增强的存活的工程化调节性T细胞的设计。
实施例7：通过瞬时表达的CAR活化和扩张T细胞
在这个方案中，通过刺激细胞表面上瞬时表达的嵌合抗原受体(CAR)，实现T细胞的完全活化和稳健扩张。用抗原性重组蛋白实施刺激，而非使用抗体。CAR的抗原特异性由抗体片段(也称作单链可变片段(scFv))赋予。这种scFv通过铰链区固定在T细胞的表面上，并且通过跨膜结构域与信号传导结构域连接。信号传导结构域可能仅是CD3z信号传导尾(第一代CAR)或除CD3z之外还有CD28、4-1BB和/或ICOSz的胞内区段。这免除需要TCR刺激细胞。重组蛋白可以自行制造并包被在培养板上或交联至微珠，以刺激淋巴细胞。另外，由于CAR在细胞表面上瞬时表达并且随后在单次抗原接合后内化，细胞不接受重复刺激。这个方案可以针对任何CAR模型定制。通过调节CAR表面密度以及scFv结构域的亲和力，可以精细调节刺激强度至所需水平。修改常规的TCR刺激扩张方案的附加说明，这种新方案显示可比较的和大多数情况下更优越的增殖谱和细胞数目产量。
RNA产生和表达
使用T7mScriptTM RNA系统(Cellscript,Madison WI)根据生产商的说明和如前述(Zhao等人,Cancer Res.70,9053–9061,2010)，自行制备体外转录(IVT)的编码CAR的RNA。使用微量试剂盒(Qiagen Inc.,Valencia,CA)，纯化IVT产物，并且将纯化的RNA洗脱入无RNA酶的水。
为了在细胞表面上获得CAR高表达，将IVT RNA电穿孔入人原代T细胞(Zhao等人,Cancer Res.70,9053–9061,2010)。在允许细胞休息过夜并允许CAR蛋白质翻译后，通过流式细胞术检测CAR的表面表达。基于电穿孔的基因转移技术产生95％+ CAR阳性T细胞。
CAR T细胞刺激
在证实CAR表达后，用偶联于Dyna珠M-450(Invitrogen，美国)的重组抗原蛋白刺激T细胞。根据生产商的操作方案实施蛋白质-珠偶联。简而言之，每1mL等分试样的400e6个珠与150ug蛋白质在无菌硼酸溶液(0.1M硼酸，pH 9.5)中温育过夜。在至少三次洗涤后，将这些珠最终重悬于R10培养基(补充10％FCS、100U/mL青霉素、100ug/mL硫酸链霉素的RPMI)中。这些珠随后用来在培养基中按珠对细胞比率3:1刺激CAR T细胞。
培养物维持
细胞培养以浓度7.5x 105个细胞/mL在补充有IL2(100单位/mL)或IL7和IL15(各自10ng/mL)的R10培养基的启动。当细胞饲以新鲜培养基并且按7.5x 105个细胞/mL再铺种时，每48小时测定细胞计数。维持这种培养物直至觉察到2个连续降低的细胞群体倍增。
与相应抗原温育的CAR T细胞接受初始刺激物以活化T细胞并且在培养物中增殖。不同CAR共刺激结构域的使用显示在培养扩张时对T细胞的生长曲线和分化影响不同。已经记录到多达9个总群体倍增，这对应于每个细胞增殖至超过500个细胞。这些产量是可比较的，并且在一些情况下优于使用基于CD3/28的常规刺激系统获得的产量。
等同物
本文引用的每份和每项专利、专利申请和出版物的公开内容因此通过引用的方式完整并入本文。尽管本发明已经参考具体方面公开，但显而易见本发明的其他方面和变型可以由本领域其他技术人员构思，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意在解释成包括全部此类方面和等同变型。

Claims (72)

1.一种扩张和/或活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)群体的方法，包括：
将编码第一嵌合抗原受体(CAR)分子的核酸在适于瞬时表达CAR分子的条件下引入免疫细胞群体中，由此产生表达第一CAR的细胞群体，其中CAR分子包含抗体分子的抗原结合结构域；和
使表达第一CAR的细胞群体与选自相应抗原分子(例如，重组抗原分子)或抗抗原独特型抗体分子的CAR抗原结合结构域的配体在出现免疫细胞扩张和/或活化的条件下接触，由此产生扩张的和/或活化的免疫细胞群体。
2.一种扩张和/或活化免疫细胞(例如，免疫效应细胞)群体的方法，包括：
提供表达第一CAR的细胞群体，所述表达第一CAR的细胞群体包含瞬时表达的第一CAR分子，并且所述CAR分子包含抗体分子的抗原结合结构域；和
使所述表达CAR的细胞群体与选自相应抗原分子(例如，重组抗原分子)或抗抗原独特型抗体分子的CAR分子的配体在出现免疫细胞扩张和/或活化的条件下接触，由此产生扩张的和/或活化的免疫细胞群体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中免疫细胞群体的扩张和/或活化在体外、离体或体内实施。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中从来自受试者(例如，癌症患者)的血液样品取得(例如，获得)免疫细胞群体，例如，通过单采血液成分术取得。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中免疫细胞群体包含选自T细胞(例如，α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞、髓系衍生的吞噬细胞或它们的组合的免疫效应细胞。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中免疫细胞群体包含原代T细胞或淋巴细胞亚群，所述淋巴细胞亚群选自无反应性T细胞、幼稚T细胞、调节性T细胞，Th-17细胞、干T细胞或它们的组合。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中免疫细胞群体包含外周血单个核细胞(PBMC)、脐带血细胞或它们的组合。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中免疫细胞群体包含表达低水平功能性T细胞受体、实质上受损的该受体或没有该受体的细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中配体是相应的抗原分子。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中配体是抗抗原独特型抗体分子。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中CAR分子的配体固定至或连接至非天然存在的基质，例如，基质表面。
12.根据权利要求11所述的方法，其中非天然存在的基质是选自板、膜、基体、芯片或珠(例如，磁珠)的固相支持物。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中CAR分子的配体存在于细胞(例如，在细胞表面上表达异源相应抗原的细胞)的表面上。
14.根据权利要求13所述的方法，其中例如通过淋巴结注射或通过注射肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)至肿瘤中，在体内扩张T细胞。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中编码第一CAR分子的核酸是RNA分子，例如，体外转录的(IVT)RNA。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中第一CAR分子在免疫细胞群体中瞬时表达有限的时间段或细胞复制次数，例如，少于50天(例如，少于40、30、25、20、15、10、5天或更少天数)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中第一CAR分子在单次配体(例如，抗原)刺激后内化。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中免疫细胞不接受反复的配体(例如，抗原)刺激。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中通过调节以下一者或两者，定制免疫细胞刺激强度至所需的水平：第一CAR表面密度或CAR抗原结合结构域对配体的亲和力。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中将表达第一CAR的免疫细胞在CAR分子的配体存在下培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21、22、23或24小时或约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50天。
21.根据权利要求20所述的方法，其中将表达第一CAR的细胞培养8天或更短时间，例如，7、6或5天。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞显示至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个或更高的群体倍增(例如，总计8-10个或约9个群体倍增)。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中将表达第一CAR的免疫细胞群体扩张至总计400-600个或约500个细胞，其中在用配体刺激后10天和25天之间测量细胞扩张。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中扩张的和/或活化的免疫细胞群体包含具有较低分化表型的免疫效应细胞，例如，较年幼的细胞，例如，较年幼的T细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中较年幼的T细胞选自幼稚T细胞(TN)、记忆干细胞(TSCM)、中央记忆T细胞(TCM)或它们的组合。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，所述方法还包括使扩张的和/或活化的免疫细胞群体与编码第二CAR分子的核酸接触，由此产生表达第二CAR的细胞群体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中编码第二CAR分子的核酸选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中第一和第二CAR分子针对相同的抗原，例如，相同的癌相关抗原，或针对不同的抗原，例如，不同的癌相关抗原。
29.根据权利要求28所述的方法，其中癌相关抗原选自CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、FAP、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、legumain、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或IGLL1。
30.根据权利要求28所述的方法，其中癌相关抗原是CD19。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中第一和第二CAR分子是相同或不同的CAR分子。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中第一和第二CAR分子各自独立地选自CD19CAR、BCMA CAR、CD33CAR、CLL-1CAR、EGFRvIII CAR、GFRα4CAR、ROR1CAR、CD20CAR、CD22CAR、CD123CAR、CD10CAR、CD34CAR、FLT-3CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79aCAR或它们的任意组合。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中将瞬时表达第一CAR的免疫细胞群体在体外或离体扩张和/或活化，并且将表达第二CAR的免疫细胞群体施用至受试者作为治疗方案的部分。
34.根据权利要求33所述的方法，其中将瞬时表达第一CAR的免疫细胞群体通过以下方式在体外或离体扩张和/或活化：使所述免疫细胞群体与癌相关抗原或针对CAR结合抗体分子的抗抗原独特型抗体(例如，固定到如本文所述的非细胞或细胞基质上的CD19抗原或抗CD19独特型抗体)接触。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，还包括在适宜的扩张期间后，储存扩张的和/或活化的免疫细胞群体，例如，低温保存扩张的和/或活化的免疫细胞群体。
36.在受试者中治疗癌症或提供抗肿瘤免疫的方法，包括向受试者仅施用或与额外疗法组合施用根据权利要求1-35中一项或多项产生的扩张的和/或活化的免疫细胞群体，由此治疗受试者或向其提供抗肿瘤免疫。
37.表达根据权利要求1-35中一项或多项产生的第一和/或第二CAR分子的扩张的和/或活化的免疫细胞群体，用于治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法中，其中将所述扩张的和/或活化的免疫细胞群体单独施用或与额外疗法组合施用至受试者。
38.治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法，包括：
向受试者同时或依次施用有效量的表达第一CAR分子和第二CAR分子的免疫细胞群体，其中第一CAR分子瞬时表达，并且第二CAR分子稳定表达。
39.治疗患有癌症的受试者或向其提供抗肿瘤免疫的方法，包括：
向受试者施用有效量的表达第二CAR分子的免疫细胞群体，其中通过在体外或离体扩张和/或活化瞬时表达第一CAR分子的免疫细胞群体，事先获得免疫细胞群体，所述第一CAR分子包含抗体分子的抗原结合结构域，例如，如本文所述的抗原结合结构域。
40.根据权利要求39所述的方法，其中免疫细胞群体的体外或离体扩张和/或活化包括使所述免疫细胞群体与第一CAR分子识别的癌相关抗原或针对第一CAR结合结构域的抗抗原独特型抗体接触。
41.根据权利要求40所述的方法，其中将癌相关抗原或针对CAR分子的结合结构域的抗抗原独特型抗体固定到非细胞上，例如，珠(例如，磁珠)上。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中表达第二CAR的细胞群体包含编码第二CAR分子的核酸，所述核酸选自DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中第一和第二CAR分子针对相同或不同的癌相关抗原。
44.根据权利要求43所述的方法，其中癌相关抗原选自CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、FAP、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、MAGEA1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、legumain、HPV E6、E7、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5或IGLL1。
45.根据权利要求36-44中任一项所述的方法，其中第一和第二CAR分子是相同的CAR分子或不同的CAR分子。
46.根据权利要求45所述的方法，其中第一和/或第二CAR分子各自独立地选自CD19CAR、BCMA CAR、CD33CAR、CLL-1CAR、EGFRvIII CAR、GFRα4CAR、ROR1CAR、CD20CAR、CD22CAR、CD123CAR、CD10CAR、CD34CAR、FLT-3CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79aCAR或它们的任意组合。
47.根据权利要求45所述的方法，其中第一和第二CAR分子分别是间皮素CAR和CD19CAR分子。
48.前述权利要求中任一项所述的方法，其中表达第一和/或第二CAR的免疫效应细胞包含CD19CAR、BCMA CAR、CD33CAR、CLL-1CAR、EGFRvIIICAR、GFRα4CAR、ROR1CAR、CD19CAR、CD20CAR、CD22CAR、CD123CAR、CD10CAR、CD34CAR、FLT-3CAR、CD79b CAR、CD179b CAR、间皮素CAR或CD79a CAR。
49.前述权利要求中任一项所述的方法，其中表达第一和/或第二CAR的免疫效应细胞包含CD19CAR。
50.前述权利要求中任一项所述的方法，其中CD19CAR包含表1或表4的序列。
51.前述权利要求中任一项所述的方法，其中CD19CAR包含CTL019的抗原结合结构域的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:51，或与之基本上同一的氨基酸序列。
52.前述权利要求中任一项所述的方法，其中CD19CAR包含CTL019的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:89(包括信号序列)或无信号序列，或与之基本上同一的氨基酸序列。
53.前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫效应细胞群体中至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫效应细胞在它们的细胞表面上表达第一和/或第二CAR分子。
54.前述权利要求中任一项所述的方法，其中从中获得免疫效应细胞的受试者和/或待治疗的受试者是人类癌症患者。
55.前述权利要求中任一项所述的方法，其中癌是选自以下一种或多种的血液学癌：B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞早幼粒细胞白血病、母细胞性浆细胞样树状细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和脊髓发育不良综合征、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树状细胞肿瘤和瓦尔登氏巨球蛋白血症。
56.前述权利要求中任一项所述的方法，其中免疫效应细胞群体来自患有血液学癌的受试者，所述血液学癌选自白血病，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)或淋巴瘤，例如，套细胞淋巴瘤(MCL)。
57.前述权利要求中任一项所述的方法，其中将细胞群体在细胞因子(例如，IL2或IL-15和IL-7)存在时扩张。
58.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括从免疫细胞群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞，以由此提供调节性T细胞消耗(例如，CD25+消耗的细胞)群体。
59.根据权利要求58所述的方法，其中调节性T细胞消耗群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
60.前述权利要求中任一项所述的方法，其中获得的免疫效应细胞群体是患有癌症的受试者(例如，患有表达CD25的癌，例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL)的受试者)的细胞。
61.根据权利要求59所述的方法，其中调节性T细胞消耗群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的白血病细胞，例如，CLL细胞、ALL细胞，或淋巴瘤细胞，例如，MCL细胞、HL细胞。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，还包括：
从免疫效应细胞群体移除表达肿瘤抗原(例如，不包含CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的细胞，以由此提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞消耗的、例如CD25+消耗的和肿瘤抗原消耗的细胞的群体。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，还包括从获得的免疫效应细胞群体移除表达检查点抑制蛋白的细胞，例如，表达本文所述的检查点抑制蛋白的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者，以由此提供调节性T细胞消耗的、例如CD25+消耗的细胞和检查点抑制蛋白消耗的细胞、例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞的群体。
64.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中已经基于一种或多种标志物例如CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的表达，选择获得的免疫效应细胞群体，例如，提供的免疫效应细胞(例如，T细胞)群体是CD3+和/或CD28+。
65.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：例如，通过本文所述的方法，活化调节性T消耗的细胞、例如CD25+消耗的细胞的群体。
66.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：用载体转导来自调节性T细胞消耗群体(例如，CD25+消耗的细胞群体)的细胞，所述载体包含编码CAR(例如，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19CAR)的核酸。
67.根据权利要求66所述的方法，还包括例如，通过本文所述的方法，扩张调节性T细胞消耗群体，例如，所述群体经工程化以表达CAR，本文所述的CAR，例如，本文所述的CD19CAR。
68.根据权利要求67所述的方法，其中将细胞群体扩张8天或更短时间，例如，7、6或5天。
69.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中免疫细胞群体在适宜的扩张期间后低温保存。
70.前述权利要求中任一项所述的方法，还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基(例如，hTERT)的核酸接触。
71.免疫细胞制备物或反应混合物，包含根据本文所述的任何方法制备的免疫效应细胞群体。
72.同时或依次表达第一和第二CAR分子的免疫效应细胞制备物或反应混合物，其中第一CAR分子瞬时表达，并且第二CAR分子稳定表达。
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