CN109072195A - 具有增强功效的免疫效应细胞疗法 - Google Patents

具有增强功效的免疫效应细胞疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN109072195A
CN109072195A CN201680082866.9A CN201680082866A CN109072195A CN 109072195 A CN109072195 A CN 109072195A CN 201680082866 A CN201680082866 A CN 201680082866A CN 109072195 A CN109072195 A CN 109072195A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
immune effector
effector cell
lsd1
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680082866.9A
Other languages
English (en)
Inventor
G·莫茨
K·J·马夫拉基亚斯
J·刘
刘磊
Q·郑
寻国良
Q·肖
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
University of Pennsylvania Penn
Original Assignee
Novartis AG
University of Pennsylvania Penn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG, University of Pennsylvania Penn filed Critical Novartis AG
Publication of CN109072195A publication Critical patent/CN109072195A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2815—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

本发明提供了LSD1抑制剂与例如经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的使用和制备联合以治疗患有疾病(例如与肿瘤抗原表达相关的疾病)的用途。

Description

具有增强功效的免疫效应细胞疗法
相关申请
本申请要求2015年12月30日提交的PCT专利申请号PCT/CN2015/099882的优先权，其全部内容通过引用并入本文作为参考。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且其全部内容通过引用并入本文作为参考。所述ASCII副本于2016年12月29日创建，命名为N2067-7105WO3_SL.txt，大小为1,118,768字节。
发明领域
本发明大体涉及连同免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的应用和生产使用LSD1抑制剂，以治疗患有疾病(例如与肿瘤抗原表达相关的疾病)的受试者，所述免疫效应细胞是例如经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。
背景技术
例如，利用嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞，过继性细胞转移(ACT)疗法在癌症试验中显示出前景。存在着对于T细胞疗法，尤其是具有改善的功效的CAR T细胞疗法的医疗需求。
发明概述
本文公开的方法和组合物涉及赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)抑制剂连同免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的应用和/或生产的用途，以治疗疾病，例如与癌相关抗原(或肿瘤标志物)的表达相关的疾病，所述免疫效应细胞是例如经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞。
已经发现LSD1的抑制在改善例如经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如如本文所述)的功能方面是有效的，并且可以与T细胞(例如CAR T细胞)疗法和/或生产相结合。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着幼稚T细胞(例如CD45RA+CD62L+T细胞，例如TSCM细胞)比例的增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或者被诱导增殖(例如响应于抗原识别，例如通过CAR分子(例如如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着幼稚T细胞(例如CD45RA+CD62L+T细胞，例如TSCM细胞)数量的增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或者被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如通过CAR的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着TEM细胞数量的减少，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或者被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着TEM比例降低，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着从所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如，IFNγ和/或IL-2)产生的增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着PD-1阳性免疫效应细胞的比例降低，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例降低，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。
尽管不希望受理论的束缚，但认为将例如经工程化以表达CAR分子(例如本文所述)的免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触相对于未接触的群体，至少暂时地伴随着免疫效应细胞的增殖增加，例如，当这样的细胞被刺激(例如，用抗CD3和/或抗CD28刺激)或被诱导增殖(例如，响应于抗原识别，例如，通过CAR分子(例如，如本文所述)的抗原识别)时。同样，不受理论的束缚，但认为T细胞可以通过例如用CD3/CD28刺激或抗原刺激(例如，通过CAR诱导的信号传导)刺激而消耗。这种消耗可以导致此类免疫效应细胞的功效或功能降低(例如，降低的增殖、持久性和/或抗肿瘤功效)。如本文所述，发明人已经发现，抑制LSD1增加了更多幼稚T细胞(例如TSCM细胞)的增殖和/或存活，其继而具有更好的功效和功能。因此，本发明的实施方案至少部分基于认识到LSD1抑制与改善的T细胞功能和/或表型相关。
在一个实施方案中，这些方法可用于优化受试者中免疫效应细胞(例如T细胞)的性能。尽管不希望受理论的束缚，但认为在一个实施方案中，内源性未修饰的免疫效应细胞例如T细胞的性能得到改善。尽管不希望受理论的束缚，但认为在一个实施方案中，(例如从施用LSD1抑制剂的受试者中)收获并经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的免疫效应细胞(例如T细胞)的性能得到改善。在其他实施方案中，已经或将经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞(例如T细胞)群体可以通过与一定量的LSD1抑制剂接触来离体(ex vivo)处理，该LSD1抑制剂相对于未接触的群体改善了幼稚T细胞(例如TSCM细胞)的数量或比率，和/或改善了PD-1阴性(例如PD-1-/Tim3-/Lag3-T细胞)的数量或比率。
在一个实施方案中，施用LSD1抑制剂的时间量足以在受试者的外周血中(或在从受试者分离的T细胞的制备物中)降低PD-1阳性T细胞的比例，增加PD-1阴性T细胞的比例或增加PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率。
在一个实施方案中，治疗例如促进受试者(例如人受试者)的免疫反应的方法包括例如相对于未与LSD1抑制剂接触的T细胞，抑制由PD-1与PD-L1或PD-L2的接合介导的负面免疫反应。
在一个实施方案中，治疗例如促进受试者(例如人类受试者)的免疫反应的方法包括例如相对于未与LSD1抑制剂接触的T细胞，增加能够增殖的T细胞的数量。
在一个实施方案中，治疗例如促进受试者(例如人类受试者)的免疫反应的方法包括例如相对于未与LSD1抑制剂接触的T细胞，增加能够发挥细胞毒性功能、分泌细胞因子或激活的T细胞的数量。
在一个实施方案中，治疗例如促进受试者(例如人类受试者)的免疫反应的方法包括例如相对于未与LSD1抑制剂接触的T细胞，响应于T细胞的刺激和/或激活而增加细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)和/或白细胞介素2(IL-2))分泌量。
在一个实施方案中，在施用免疫效应细胞(例如待经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的T细胞)之前(例如，收获免疫效应细胞之前或之后)，(体内或离体)施用LSD1抑制剂足以发生以下中的一种或多种的时间量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
并且其中1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)，12)，13)，14)或15)例如与未治疗的受试者相比至少暂时地，例如永久地发生。在一个实施方案中，开始或完成LSD1抑制剂给药后至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60天收获经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞例如T细胞。
在一个实施方案中，在收获免疫效应细胞(例如待经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的T细胞)之前，向受试者施用LSD1抑制剂足以例如在收获的细胞中或工程细胞中(或在未收获的细胞中，或在这两者中)发生以下中的一种或多种的时间量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
并且其中1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)，12)，13)，14)或15)例如与未治疗的受试者相比至少暂时地，例如永久地发生。在一个实施方案中，开始或完成LSD1抑制剂给药后至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60天收获经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞例如T细胞。
在一个实施方案中，在收获免疫效应细胞(例如待经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的T细胞)之后，施用LSD1抑制剂足以发生以下中的一种或多种的时间量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
并且其中1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)，12)，13)，14)或15)例如与未治疗的受试者相比，至少暂时地，例如永久地发生。
在一个实施方案中，在施用免疫效应细胞(例如待经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的T细胞)之后，施用LSD1抑制剂足以发生以下中的一种或多种的时间量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
并且其中1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)，12)，13)，14)或15)例如与未治疗的受试者相比，至少暂时地，例如永久地发生。
在一个实施方案中，将LSD1抑制剂离体施用于免疫效应细胞(例如已经或者将要经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的T细胞)足以发生以下中的一种或多种的时间量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
并且其中1)，2)，3)，4)，5)，6)，7)，8)，9)，10)，11)，12)，13)，14)或15)例如与未治疗的细胞相比，至少暂时地，例如永久地发生。
不受理论的束缚，认为LSD1也可以直接脱甲基化p53(Nature Reviews MolecularCell Biology 13,297-311(2012年5月)doi:10.1038/nrm3327)。因此，在一个实施方案中，本文公开的化合物和方法可用于抑制p53的脱甲基化。
在一个实施方案中，受试者患有癌症，并且该方法包括促进受试者对癌症的免疫反应。在一个实施方案中，基于患有癌症选择受试者。在一个实施方案中，癌细胞表达PD-L1或PD-L2。在一个实施方案中，癌症微环境中的细胞表达PD-L1或PD-L2。
在一个实施方案中，癌症包含实体瘤。在一个实施方案中，癌症是血液学癌症。在一个实施方案中，癌症是白血病。在一个实施方案中，癌症是慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一个实施方案中，癌症是CLL并且其中CAR的抗原结合结构域靶向CD19。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤。
在一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用额外治疗，例如化学治疗剂、辐射、细胞疗法或骨髓移植。在一个实施方案中，该方法还包括施用杀死T细胞的额外治疗，例如放疗或细胞毒性化疗。在一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用mTOR途径抑制剂，例如维生素E、维生素A、抗菌抗生素、抗氧化剂、L-肉毒碱、硫辛酸、二甲双胍、白藜芦醇、瘦素、非甾体抗炎药或COX抑制剂。在一个实施方案中，该方法还包括向受试者施用二甲双胍(metformin)。在一个实施方案中，在额外治疗开始之前或之后施用LSD1抑制剂。在一个实施方案中，该方法还包括对癌症施用额外治疗。
在一个实施方案中，该方法还包括与另一种药剂(除了LSD1抑制剂以外)组合施用工程化表达CAR分子的(例如如本文所述的)免疫效应细胞(例如T细胞)。在一个实施方案中，该药剂可以是激酶抑制剂，例如CDK4/6抑制剂、BTK抑制剂、mTOR抑制剂、MNK抑制剂或双重mTOR/PI3K激酶抑制剂及其组合。
在一个实施方案中，该方法包括在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性。在一个实施方案中，细胞是自体T细胞或自体NK细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体T细胞或同种异体NK细胞。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
在一个实施方案中，该方法包括治疗患有与癌相关抗原或肿瘤标志物的表达相关的疾病的哺乳动物。
在一个实施方案中，该方法包括施用增加经工程化以表达CAR分子的(例如如本文所述的)免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的功效的药剂，例如本文所述的药剂。
在一个实施方案中，该方法包括施用药剂，所述药剂改善与施用表达CAR分子(例如，如本文所述)的细胞(例如，经工程化以表达CAR分子的(例如如本文所述的)免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞))相关的一种或多种副作用，例如本文所述的药剂。
在一个实施方案中，该方法包括施用治疗与本文所述的癌相关抗原相关的疾病的药剂，例如本文所述的药剂。
在一个实施方案中，经工程化以表达CAR分子的(例如如本文所述的)免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，表达两种或更多种CAR分子，并且例如施用于有需要的受试者以治疗癌症。
在一个实施方案中，例如使用体外转录将CAR分子引入免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)中，并且受试者(例如人)接受包含CAR分子的细胞的初始施用，以及包含CAR分子的细胞的一次或多次后续施用，其中该一次或多次后续施用是在前次施用后少于15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用包含CAR分子的细胞多于一次的施用，例如每周施用包含CAR分子的细胞的2、3或4次施用。在一个实施方案中，受试者(例如人受试者)每周接受多于一次的包含CAR分子的细胞施用(例如，每周2、3或4次施用)(在本文中也称为周期)，接着是一周不施用包含CAR分子的细胞，然后向受试者施用包含CAR分子的细胞的一次或多次额外施用(例如，每周施用包含CAR分子的细胞的多于一次施用)。在另一个实施方案中，受试者(例如人受试者)接受多于一个周期的包含CAR分子的细胞，并且每个周期之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用包含CAR分子的细胞，每周3次施用。在一个实施方案中，包含CAR分子的细胞施用至少2、3、4、5、6、7、8或更多周。
在一个实施方案中，工程化表达CAR(例如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，作为疾病(例如癌症，例如本文描述的癌症)的第一线治疗施用。在另一个实施方案中，工程化表达CAR(例如本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞，例如T细胞，作为疾病(例如癌症，例如，本文所述的癌症)的第二、第三、第四线治疗。
在一个实施方案中，施用本文描述的细胞群体。
在一个实施方案中，LSD1抑制剂和经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞(例如T细胞)存在于单一组合物中，例如作为单一组合物施用。在一个实施方案中，LSD1抑制剂和经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞(例如T细胞)，存在于分开的组合物中，例如作为分开的组合物施用。
在一些方面，本公开内容提供了用于治疗受试者的LSD1抑制剂，其中所述LSD1抑制剂增强所述受试者的免疫反应，并且其中所述受试者已经接受、正在接受或即将接受经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞。
在一些方面，本公开内容提供了经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞用于治疗受试者，其中所述受试者已经接受、正在接受或即将接受LSD1抑制剂，例如，增强所述受试者的免疫反应的LSD1抑制剂。
在一些方面，本公开内容提供了经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞用于治疗受试者，其中所述经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞已经接触LSD1抑制剂，例如离体接触LSD1抑制剂。
在一个实施方案中，本发明自体或同种异体免疫效应细胞群体用包含编码CAR分子(例如如本文所述)的核酸分子的载体转染或转导。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是如本文其他地方所述的自灭活慢病毒载体。在一个实施方案中，载体被递送(例如通过转染或电穿孔)至细胞，例如T细胞或NK细胞，其中载体包含编码CAR分子(例如如本文所述)的核酸分子，其被转录为mRNA分子，并且CAR分子从RNA分子翻译并在细胞表面表达。
在一个实施方案中，施用CAR表达细胞群体，例如表达CAR的T细胞(CART细胞)或表达CAR的NK细胞。在一些实施方案中，CAR表达细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CAR表达细胞群体可以包括表达具有结合本文所述的第一肿瘤标志物的抗原结合结构域的CAR的第一细胞，和表达具有结合如本文所述的第二肿瘤标志物的不同抗原结合结构域的CAR的第二细胞。作为另一个实例，CAR表达细胞群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR包含结合如本文所述的肿瘤标志物的抗原结合结构域，和表达CAR的第二细胞，所述CAR包含针对不为如本文所述的肿瘤标志物的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞群体包括例如表达包含初级胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达包含次级信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在一个方面，本发明的特征在于治疗受试者(例如患有疾病，例如与肿瘤抗原的表达相关的疾病，例如癌症的受试者)的方法，其包括施用LSD1抑制剂和经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体。在实施方案中，该方法包括在免疫效应细胞群体之前施用LSD1抑制剂。在实施方案中，该方法包括与免疫效应细胞群体同时施用LSD1抑制剂。在实施方案中，该方法包括在免疫效应细胞群体后施用LSD1抑制剂。在实施方案中，该方法包括在施用免疫效应细胞群体之前和之后(例如，间隔一段时间)施用LSD1抑制剂。
在一个方面，本发明的特征在于治疗受试者(例如，患有疾病，例如与肿瘤抗原的表达相关的疾病，例如癌症的受试者)的方法，其包括向受试者施用LSD1抑制剂，其中所述受试者已经接受、正在接受或将要接受经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体。在实施方案中，该方法包括向受试者施用LSD1抑制剂和经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体，例如如本文所述。在实施方案中，在经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞群体之前施用LSD1抑制剂，并且其中在经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞施用后，所述LSD1抑制剂的施用持续一段时间。在其他实施方案中，在经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞群体施用后，LSD1抑制剂的施用是以相对于不存在所述LSD1抑制剂的情况下施用的经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞群体而言，足以增加经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的细胞的免疫效应群体的抗肿瘤作用的量进行。
在另一个方面，本发明的特征在于增加经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述，例如CAR19(例如CTL019))的免疫效应细胞群体的受试者的治疗功效的方法，包括至少暂时地降低所述细胞中LSD1的活性或表达的步骤。在实施方案中，降低所述细胞中LSD1的活性或表达的步骤包括使细胞与LSD1抑制剂接触。在实施方案中，接触是离体进行的。在实施方案中，接触在体内完成(例如，免疫效应细胞群体和LSD1抑制剂被共同施予受试者)。
在任何前述方面的实施方案中，LSD1抑制剂的施用或接触导致:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合。
在实施方案中，效果是暂时的。在实施方案中，效果是永久的。在实施方案中，效果是与未接触LSD1抑制剂的细胞相比。在实施方案中，效果是与未接触LSD1抑制剂的相同受试者的细胞相比。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者的方法，其包括:
a)向受试者施用LSD1抑制剂；
b)在LSD1抑制剂的所述施用后，收集来自a)的受试者的免疫效应细胞群体；
c)离体提供所述免疫效应细胞群体；
d)将所述免疫效应细胞的离体群体与LSD1抑制剂接触，其中与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合；
和e)向受试者施用免疫效应细胞群体。
在实施方案中，d)的效果是暂时的。在实施方案中，d)的效果是永久的。在实施方案中，d)的效果是与未与LSD1抑制剂接触的细胞相比。在实施方案中，步骤e)的施用是向与步骤b)的受试者相同的受试者(例如，涉及使用自体免疫效应细胞群体的治疗方法)。在实施方案中，步骤e)的施用是向与例如步骤b)的受试者不同的受试者，例如相同物种的受试者(例如，涉及使用同种异体免疫效应细胞群体的治疗方法)。
在实施方案中，步骤e)还包括向受试者施用LSD1抑制剂。在实施方案中，方法还包括将编码CAR分子的(例如本文所述的)核酸插入到免疫效应细胞的离体群体的细胞中的步骤。
在另一个方面，本发明的特征在于LSD1抑制剂在生产免疫效应细胞群体(例如经工程化以表达CAR分子，例如如本文所述)中的用途。在一个方面，本发明提供了制备免疫效应细胞群体(任选为T细胞群体)的方法，包括步骤：
a)使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触；
从而制备免疫效应细胞群体，其任选地为T细胞群体，
其中与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如，全部)的组合。
在实施方案中，1)-15)的效果是暂时的。在实施方案中，1)-15)的效果是永久的。在实施方案中，1)-15)的效果是与未接触LSD1抑制剂的细胞相比。
在实施方案中，方法还包括步骤：b)将编码CAR分子(例如如本文所述)的核酸插入免疫效应细胞群体的细胞中。在实施方案中，步骤a)的接触发生在步骤b)的所述插入
1)之前；
2)同时；
3)之后；或
4)之前和之后；
在实施方案中，步骤a)的接触和任选地，步骤b)的插入是离体的。
在另一个方面，本发明的特征在于例如经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的细胞例如免疫效应细胞，例如免疫效应细胞群体，通过前述方面中描述的任何方法制备。
在另一个方面，本发明的特征在于经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞群体，其中CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，并且其中所述细胞中LSD1的表达和/或功能已被减少或消除。在一个实施方案中，所述减少或消除至少是暂时的。在实施方案中，免疫效应细胞群体已与LSD1抑制剂接触。在实施方案中，本发明的特征在于包含上述免疫效应细胞群体和LSD1抑制剂的组合物。
在任何上述方面和实施方案中，细胞和/或细胞群体是(或包括)免疫效应细胞，例如免疫效应细胞群体包含T细胞或NK细胞，例如由T细胞或NK细胞组成。在实施方案中，细胞是T细胞，例如CD8+T细胞、CD4+T细胞或其组合。在实施方案中，细胞是NK细胞。
在实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是例如待施用细胞的受试者自体的。在实施方案中，细胞是例如待施用细胞的受试者同种异体的。
在一些实施方案中，细胞是或包括经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的细胞。
在涉及CAR的任何前述方面和实施方案中，CAR包含抗原结合结构域(其任选地为抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(其任选地为包括共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。在实施方案中，结合肿瘤抗原的抗原结合结构域选自:TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM,B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白酶(legumain)、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、Prostein、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/Galectin 8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤转位断裂点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。在一个实施方案中，抗原结合结构域结合CD19，例如，是例如WO2012/079000或WO2014/153270中所述的抗原结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域结合BCMA，例如是如WO2016/014565中所述的抗原结合结构域，例如是来自WO2016/014565的CAR BCMA-10(139109)的抗原结合结构域。
在实施方案中，抗原结合结构域是包含以下的抗体或抗体片段:
(i)根据表6-9的CD19结合结构域的氨基酸序列，例如根据表9的CTL019scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:957的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；
(ii)根据表6-9的人源化CD19结合结构域的氨基酸序列，例如根据表9的CAR2scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:898的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；或
(iii)根据表11A-11B的BCMA结合结构域的氨基酸序列，例如根据表11A的139109scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:967的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列。
在实施方案中，跨膜结构域包括:
(i)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；或
(ii)SEQ ID NO:12的序列。
在实施方案中，抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6，或与其具有95-99％同一性的序列。
在实施方案中，胞内信号传导结构域包括初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中初级信号传导结构域包括选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、共同FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεR1b)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10或DAP12的蛋白的功能性信号传导结构域。
在实施方案中，初级信号传导结构域包括:
(i)具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；或
(ii)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在实施方案中，胞内信号传导结构域包括共刺激信号传导结构域，或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中共刺激信号传导结构域包括选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS,ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM,CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS,SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46和NKG2D组成的组的蛋白的功能信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域包括具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列，例如共刺激信号传导结构域包括SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列，例如胞内结构域包括SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列，以及SEQ ID NO:18或SEQID NO:20的序列，其中包括胞内信号传导结构域的序列在相同的读框中并且作为单个多肽链表达。
在实施方案中，CAR包含前导序列，其包括SEQ ID NO:2，例如由SEQ ID NO:2组成。
在实施方案中，CAR包括:
(i)根据表6-9的CD19 CAR的氨基酸序列，例如根据表9的CTL019的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:956的氨基酸序列或与其至少95％同一的氨基酸序列；
(ii)根据表6-9的人源化CD19 CAR的氨基酸序列，例如根据表9的CAR2的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:902的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；或
(iii)根据表11A-11B的BCMA CAR的氨基酸序列，例如根据表11A的139109 CAR的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:971的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列。
在任何上述方面和实施方案中，LSD1抑制剂可以是:(1)靶向LSD1基因的一个或多个位点或其相应调节元件的基因编辑系统；(2)包括与LSD1基因的靶序列互补的序列的核酸(例如siRNA或shRNA或反义寡核苷酸)；(3)蛋白质(例如显性失活LSD1，例如催化失活的LSD1或LSD1的显性失活结合配偶体)；(4)小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合。
在一个方面，LSD1抑制剂是shRNA或siRNA。在实施方案中，LSD1抑制剂是shRNA。在实施方案中，LSD1抑制剂是如siRNA。在实施方案中，shRNA或siRNA包括与例如表1中列出的，例如选自SEQ ID NO:[43]至SEQ ID NO:[82]的LSD1基因(KDM1A)的靶序列互补的序列。
在另一个方面，LSD1抑制剂是由核酸编码的shRNA，其包括表1的编码抗LSD1shRNA的任一序列，例如由包含选自SEQ ID NO:[83]至SEQ ID NO:[122]的序列的核酸编码的。
在另一个方面，LSD1抑制剂是包括表1的编码抗LSD1 shRNA的任一序列的核酸，例如选自SEQ ID NO:[83]至SEQ ID NO:[122]的序列。
在另一个方面，LSD1抑制剂是反义寡核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸包括与LSD1 mRNA序列互补的序列。在实施方案中，反义寡核苷酸包括与LSD1前mRNA的序列互补的序列。
在实施方案中，将编码LSD1抑制剂的核酸置于载体上，例如进一步包含有效连接至所述核酸的U6或H1启动子的载体，例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、质粒、微环、纳米质粒或RNA载体。在实施方案中，载体还包含编码CAR分子的序列。
在另一个方面，LSD1抑制剂是对LSD1基因(KDM1A)或其调节元件的序列特异的基因组编辑系统，其选自CRISPR基因组编辑系统、锌指核酸酶基因组编辑系统、TALEN基因组编辑系统和大范围核酸酶基因组编辑系统(meganuclease genome editing system)。
在另一个方面，LSD1抑制剂是CRISPR基因组编辑系统，其包括含有与LSD1基因(KDM1A)或其调节元件的序列(例如包括SEQ ID NO:[132]至[862]中的任一个)互补的靶向结构域的gRNA分子。
在另一个方面，LSD1抑制剂是小分子。在实施方案中，小分子是可逆LSD1抑制剂。在实施方案中，小分子是不可逆的LSD1抑制剂。在实施方案中，小分子LSD1抑制剂是:
a)GSK2699537；
b)rel-2-[[(1R,2S)-2-[4-[(4-氯苯基)甲氧基]苯基]环丙基]氨基]-1-(4-甲基-1-哌嗪基)-乙酮(描述于PCT公开号WO 2010043721)；
c)(R)-4-(5-(吡咯烷-3-基甲氧基)-2-(对甲苯基)吡啶-3-基)苄腈；
d)(1S,2R)-N-((2-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙-1-胺；
e)N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺；
f)5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈；
g)rel-N-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-4-哌啶胺；或
h)2-(1R,2S)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；
i)反式-3-(3-氨基-2-甲基苯基)-1-(4-羟基环己基)-6-甲基-1H-吲哚-5-甲腈；或
j)前述任一种的可药用盐。在实施方案中，LSD1抑制剂是小分子并且所述LSD1抑制剂缀合至抗体或其抗原结合片段，例如识别T细胞表面上的抗原(例如，CD3)的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，LSD1抑制剂是蛋白质，例如是LSD1的显性失活结合配偶体(例如，与LSD1相互作用的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或者Co-REST或AR共激活子复合物的其他成员)，或编码LSD1的所述显性失活结合配偶体的核酸。
在另一个方面，LSD1抑制剂是蛋白质，例如是显性失活的(例如催化失活的)LSD1或编码所述显性失活LSD1的核酸。
在另一个方面，本发明提供治疗有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的前述方面和实施方案中任一项的免疫效应细胞群体。在实施方案中，该方法还包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。在实施方案中，受试者在免疫效应细胞群体施用之前接受LSD1抑制剂的预处理；在实施方案中，受试者接受用LSD1抑制剂和免疫效应细胞群体的同时治疗；在实施方案中，受试者在免疫效应细胞群体施用后接受LSD1抑制剂的治疗；在实施例中，受试者接收任何前述的组合。
在一个方面，包括与治疗方法有关的前述方面，本发明涉及治疗受试者的方法，其中所述受试者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如增殖性疾病，癌症前期病症，癌症或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。在实施方案中，癌症是选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性白血病，急性淋巴样白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)，慢性粒细胞白血病(CML)，B细胞幼淋巴细胞白血病，浆细胞样树突细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，或白血病前期。在实施方案中，癌症选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈部癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌腺体，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统肿瘤(CNS)，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱导的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病变。
在另一个方面，本发明提供了新化合物。这样的化合物例如可用于本文所述的方法和组合物中，但这样的用途和组合物并非意在限制。在一个实施方案中，本发明提供选自N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺和5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈。在一个实施方案中，本发明提供N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺。在一个实施方案中，本发明提供5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈。本发明进一步提供了前述任一种的可药用盐。本发明还提供了上述化合物用于制造药物。本发明进一步提供了用作药物的上述化合物。本发明进一步提供了上述化合物用作LSD1抑制剂，用于制造药物，例如在本文所述的任何方法中用作LSD1抑制剂。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗的上述化合物单独或任选与至少另一种药剂组合。
在另一个方面，本发明提供了用于离体生产免疫效应细胞群体的组合物，其包含LSD1抑制剂，例如小分子LSD1抑制剂。在实施方案中，组合物包含浓度范围从约0.001nM至约10mM，例如约0.001nM至约100nM或例如约0.1μM至约10μM的小分子LSD1抑制剂。
在一个方面，本发明提供了用于治疗受试者的LSD1抑制剂，其中所述受试者已经接受、正在接受或即将接受包括免疫效应细胞的治疗，所述免疫效应细胞例如经工程化以表达CAR的免疫效应细胞分子，例如如本文所述。
在一个方面，本发明提供了用于生产免疫效应细胞，例如经工程化以表达CAR分子(例如如本文所述)的免疫效应细胞的LSD1抑制剂。
在一个方面，本发明提供了生产免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群体)的方法，其包括向所述细胞中引入编码CAR分子(例如如本文所述)的核酸，其中所述核酸整合到所述细胞基因组的LSD1基因内，使得LSD1表达和/或功能降低。
附图的简要说明
图1描述了与对照相比，在存在LSD1抑制剂shRNA(分子1A、1B、2、3A、3B、4或6A)的情况下使用CD3/CD28激活后来自人供体的CD45RA+CD62L+的CD8+T细胞的百分数。
图2描述了与对照相比，在LSD1抑制剂shRNA(分子分子1A、1B、2、3A、3B、4或6A)存在下使用CD3/CD28激活后来自人供体的CD45RA+CD62L+的CD4+T细胞的百分数。
图3A显示了评估了所示化合物产生给定表型的T细胞的能力。通过负选择分离人幼稚T细胞(外周泛CD3+T细胞，合并群体)，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比率扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过FACS染色测定T细胞表型。相对于对照以及相对于其他已知条件，LSD1抑制在降低CD4+T细胞中Tem细胞的百分数的同时，显著提高了Tscm细胞的百分数。
图3B显示了评估了所示化合物产生给定表型的T细胞的能力。通过负选择分离人幼稚T细胞(外周泛CD3+T细胞，合并群体)，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比率扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过FACS染色测定T细胞表型。相对于对照以及相对于其他已知条件，LSD1抑制在降低CD8+T细胞中Tem细胞的百分数的同时，显著提高了TSCM细胞的百分数。
图4A显示了与被认为影响T细胞表型的其他化合物相比，LSD1抑制对CD4+细胞中TSCM对TEM比率的影响。
图4B显示了与被认为影响T细胞表型的其他化合物相比，LSD1抑制对CD8+细胞中TSCM对TEM比率的影响。
图5显示了在LSD1抑制剂存在下使用CD3/CD28刺激的T细胞的扩增。
图6显示了在LSD1抑制剂存在下，在扩增的T细胞上检查点蛋白PD1、Tim3和Lag3的表达。
图7显示了在LSD1抑制剂存在下扩增的T细胞上的CAR表达水平。
图8显示了在LSD1抑制剂存在下CD4+和CD8+CART和未转导的T细胞的比例。
图9显示了在LSD1抑制剂存在下CART细胞和未转导的T细胞的扩增。
图10显示了在LSD1抑制剂存在下，然后暴露于CD19+或CD19-肿瘤细胞，扩增的CART细胞的细胞因子产生。
图11显示了在CAR刺激后，LSD1抑制对显著增加的增殖能力的影响。通过负选择从PBMC分离人幼稚T细胞(外周泛CD3+T细胞，合并群体)，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比率扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直至第10天，在功能测定之前洗掉化合物。扩增后，将T细胞与CD19+肿瘤细胞系NALM6和Raji以及CD19-肿瘤细胞系K562混合。辐射肿瘤细胞，并将T细胞和肿瘤细胞以1:1的比例混合。在温育后的第4天使用蛋白L对T细胞染色CAR，使用发光计数珠通过FACS测定CAR+T细胞数。测量增殖为在计数2500个珠的时间段中检测到的FACS阳性细胞的数量。数据表示为无靶标(CD19-)对照(K562)的倍数。
图12显示了所示化合物对人幼稚T细胞(外周泛CD3+T细胞，合并群体)的影响，其中所述人幼稚T细胞(外周泛CD3+T细胞，合并群体)通过负选择从PBMC分离并用3:1比率的抗CD3/CD28珠在所示化合物存在下扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直至第10天，在功能测定之前洗掉化合物。扩增后，评估萤光素化的CD19+NALM6肿瘤细胞系的T细胞杀伤。20小时后，在EnVision仪器上使用Bright-GloTM萤光素酶测定法测量萤光素酶信号。
图13显示了在LSD1抑制剂存在下离体扩增的CART细胞的体内抗肿瘤功效。
图14A显示了在LSD1抑制剂存在下CD4+T细胞(例如TSCM)细胞的扩增水平。
图14B显示了在LSD1抑制剂存在下CD8+T细胞(例如TSCM)细胞的扩增水平。
图15A显示了在LSD1抑制剂存在下扩增的CD4+T细胞上的检查点蛋白PD1，Tim3和Lag3的表达水平。
图15B显示了在LSD1抑制剂存在下扩增的CD8+T细胞上的检查点蛋白PD1，Tim3和Lag3的表达水平。
图16描述了在LSD1抑制剂存在或不存在下扩增后表达PD1，Tim3或Lag3(左图)或共表达PD1/Lag3或PD1/Lag3/Tim3的总T细胞的百分数。
图17描述了在LSD1抑制剂存在或不存在下扩增后CD4+T细胞百分数(左图)和CD8+T细胞百分数(右图)，它们均是Tscm。
图18描述了在LSD1抑制剂存在或不存在下扩增后Tim3/Lag3/PD-1共表达的阳性的CD4+T细胞百分数(左图)和CD8+T细胞百分数(右图)。
图19描述了通过流式细胞术分析对Tscm，Tcm和Tem的门控策略的示意图。
图20描述了不同浓度的LSD1抑制剂对培养的经10天激活、处理和扩增后的T细胞表型变化的影响。显示了CD3+T细胞的Tscm，Tem和Tcm的百分数，以及子集CD8+/CD4+、Tscm/Tem和Tscm/Tcm的比率。
图21描述了在诱导Tscm，Tem和Tcm时化合物93(NVS化合物1)对CD8+和CD4+T细胞子集的剂量反应曲线。
图22描述了在诱导Tscm，Tem和Tcm时LSD1i-GSK对CD8+和CD4+T细胞子集的剂量反应曲线。
图23描述了化合物93和LSD1i-GSK在诱导Tscm时对CD3+和CD8+T细胞的剂量反应曲线(显示EC50)。
图24显示了与化合物93相比，化合物A和化合物B在激活后24小时开始给药时在100nM诱导Tscm和减少Tem时表现出类似的作用。
图25描述了通过流式细胞术分析对总T细胞和CAR+T细胞中Tscm，Tcm和Tem的门控策略的示意图。
图26显示了响应于化合物93对LSD1抑制的不同浓度，最终CART产物中总CD3+T细胞，CAR表达和CD8+CAR+对CD4+CAR+比率的FACS分析。
图27显示了响应化合物93对LSD1抑制的不同浓度，最终CART产物的总CD8+T细胞中Tscm，Tem，Tcm的FACS分析。
图28显示了响应于化合物93对LSD1抑制的不同浓度，CAR+CD8+T细胞中Tscm，Tem，Tcm百分数的FACS分析。
图29显示了体外细胞因子测定结果，其中CART细胞的IFNγ分泌有或没有LSD1抑制剂处理，响应于它们的特异性肿瘤靶细胞系，效应子与靶细胞的比例为1.25:1温育20小时。
图30显示了响应于它们的特定经辐照肿瘤细胞系在效应细胞与靶细胞比率1:1下4天的体外CD3+(总)和CD3+CAR+细胞增殖水平。
图31显示了响应于它们特定经辐照的肿瘤细胞系在效应细胞与靶细胞比例1:1下4天的体外CD8+和CD8+CAR+T细胞增殖水平。
图32显示了响应于它们特定经辐照的肿瘤细胞系在效应细胞与靶细胞比率1:1下4天的体外CD4+和CD4+CAR+T细胞增殖水平。
图33显示了BCMA CART细胞对BCMA+肿瘤系的体内抗肿瘤功效。UTD＝未用CAR基因转导的T细胞；LSDi＝表示在化合物93存在下离体扩增的那些群体；BCMA 0.167百万＝表示用CAR基因转导的那些群体，以及群体中CAR+细胞的数量；PBS＝无细胞对照(仅磷酸盐缓冲盐水注射)。
详细说明
定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
术语“一”和“一个”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。
当提及诸如量、持续时间等的可测量值时，术语“约”意味着涵盖从指定值±20％或在一些情况下±10％，或在一些情况下±5％，或者在一些情况下±1％，或者在一些情况下±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两个，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在一些实施方案中，CAR包括至少一个细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包括衍生于如下定义的刺激性分子和/或共刺激性分子的功能信号传导结构域。在一些方面，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，该组多肽包括在存在二聚化分子时可以使多肽彼此偶联的二聚化开关，例如，可以使抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，刺激性分子为与T细胞受体复合体结合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域进一步包括一种或多种衍生于至少一个如下定义的共刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激性分子选自本文所述的共刺激性分子，例如4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包括嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含衍生于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含衍生于共刺激性分子的功能性信号传导结构域和衍生于刺激性分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含衍生于一个或更多个共刺激性分子的两个功能性信号传导结构域和衍生于刺激分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面中，CAR包含嵌合融合蛋白，该融合蛋白包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含衍生于一个或更多个共刺激性分子的至少两个功能性信号传导结构域和衍生于刺激分子的功能性信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个方面，CAR包含在CAR融合蛋白的氨基末端(N-末端)的任选的前导序列。在一个方面，CAR进一步包含在细胞外抗原结合结构域的N-末端的前导序列，其中所述前导序列任选地在所述CAR的细胞加工和定位于细胞膜期间被从抗原结合结构域(例如scFv)上切割下来。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如scFv或TCR)的CAR，例如本文所述的那些，也称为XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR称为CD19 CAR。
术语“信号传导结构域”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应子作用的经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
正如本文中使用的那样，术语“抗体”是指源于特异性地结合抗原的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以为多克隆的或单克隆的、多链或单链、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生于天然来源或重组来源。抗体可以为免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fab，Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键-连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体例如sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。抗原结合片段也可以被掺入单域抗体、最大抗体、微小抗体、纳米抗体、胞内抗体双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。抗原结合片段也可以接枝到基于多肽的支架，例如III型纤连蛋白(Fn3)(参见美国专利号:6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微小抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链可变区的抗体片段和至少一个包括重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链可变区和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的本发明的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表达为连续的多肽链的一部分，所述多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人，1999，在:Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989，在:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NewYork；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人，1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。在一个进一步的方面，CAR包括包含scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任何一种来确定，包括Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,”第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案),Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的方案或其组合。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”包括抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中所述多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性和多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中且通常决定抗体所属类型的两种多肽链中较大者。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在构象存在于抗体分子中的两种多肽链的较小者。κ(k)和λ(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链的同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母菌表达系统表达的抗体。该术语也应当解释为指已经通过合成编码抗体的DNA分子且其中DNA分子表达抗体蛋白质或指定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中所述DNA或氨基酸序列已经使用本领域可获得且熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生或有特异性免疫能力的细胞的活化或两者。本领域技术人员应当理解包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子都可以充当抗原。此外，抗原可以衍生于重组或基因组DNA。当在本文中使用该术语时，本领域技术人员应当理解包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA，因此编码“抗原”。此外，本领域技术人员应当理解抗原无需仅通过基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本发明包括但不限于使用超过一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以多种组合排列以编码引发期望免疫应答的多肽。而且，本领域技术人员应当理解抗原根本无需由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以合成产生，或者可以衍生于生物样品，或者还可以是除了多肽之外的大分子。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、具有其他生物组分的细胞或液体。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、癌细胞增殖减少、癌细胞存活降低或与癌性病症有关的多种生理学症状的改善。“抗癌作用”也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体预防癌症首次出现的能力。术语“抗癌作用”是指可以通过多种手段表现的生物学效应，包括但不限于例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞死亡增加、肿瘤细胞凋亡增加或肿瘤细胞存活降低。
术语“自体的”是指衍生于个体的任何物质，所述物质后来再被引入到的该相同个体。
术语“同种异体的”是指衍生于与将导入物质的个体相同物种的不同动物的任何物质。当一个或更多个基因座的基因不相同时，两个或多个个体被认为是彼此同种异体的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异体物质可以在遗传上是足够不同的以在抗原性上相互作用。
术语“异种的”是指移植物衍生于不同物种的动物。
术语“癌症”是指特征为异常细胞的不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统至身体的其他部分。各种癌症的实例是本文描述的，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。术语“肿瘤”和“癌症”在本文中可互换使用，例如，这两个术语包含实体肿瘤和液体肿瘤，例如弥散性或循环性肿瘤。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”包括癌前病变以及恶性癌症和肿瘤。
本文所用术语“衍生自”表示第一和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并且不暗示从第二分子衍生的第一分子或包括对其的方法或来源限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，使其具有所需功能，即在适当条件下产生信号的能力。它并不暗示或包括对产生胞内信号传导结构域的特定方法的限制，例如，它不意味着提供胞内信号传导结构域必须以CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或施加突变，以实现胞内信号传导结构域。
短语“与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与如本文所述的肿瘤抗原的表达相关的疾病或与如本文所述的表达肿瘤抗原的细胞相关的病症，例如增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌症前期病症如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病；或与本文所述的表达肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个方面，与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌症是血液学癌症。在一个方面，与如本文所述的肿瘤抗原表达相关的癌症是实体癌症。本文所述的与肿瘤抗原表达相关的其他疾病包括但不限于例如与本文所述的肿瘤抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病变或增殖性疾病。如本文所述的与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施方案中，肿瘤抗原表达细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“保守的序列修饰”是指不会显著地影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR-介导的诱变)引入到本发明的抗体或抗体片段中。保守的氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，在本发明的CAR之内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文所述的功能性测定来测试改变的CAR。
术语“刺激”是指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合体或CAR)与其相应配体(或在CAR的情况下为肿瘤抗原)的结合，由此介导信号转导事件(例如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号转导或经由合适的NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导)而诱导的初次应答。刺激可以介导某些分子的改变的表达。
术语“刺激性分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞，NK细胞、B细胞)表达的提供细胞质信号传导序列的分子，其以刺激性方式调节用于免疫细胞信号传导途径的至少某个方面的免疫细胞的活化。在一个方面，信号是通过例如TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子的结合启动的初级信号，并且其导致介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的一级细胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。特别地用于本发明的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生于下述的那些:CD3ζ、常见的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。在本发明的具体CAR中，在本发明的任一个或更多个CAR中的胞内信号传导结构域包括细胞内信号传导序列，例如CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:18中提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是如SEQ ID NO:20中提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴、猿等的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是指其表面上呈递与主要组织相容性复合体(MHC的)复合的外来抗原的免疫系统细胞，例如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合体。APC加工抗原且将其呈递给T细胞。
正如本文中使用的那样，术语“胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。胞内信号传导结构域产生促进含有CAR的细胞例如CART细胞的免疫效应子功能的信号。在例如CART细胞中免疫效应子功能的实例包括细胞裂解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括初级胞内信号传导结构域。示例性的初级胞内信号传导结构域包括衍生于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激细胞内结构域。示例性的共刺激胞内信号传导结构域包含来源于负责共刺激信号或抗原独立的刺激的分子的那些结构域。例如，在CART的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的细胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共同受体或共刺激性分子的细胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的一级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于衍生于下述的那些:CD3ζ、共有的FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ(或CD3ζ、CD3ζ或CD3z)”或“TCRζ”定义为如GenBanAcc.No.BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基，且“ζ刺激结构域”或备选地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所需的起始信号。在一个方面，ζ的细胞质结构域包含GenBankAcc.No.BAG36664.1的残基52至164或作为其功能性直向同源物的来自非人类物种(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”是如SEQ ID NO:18提供的序列。在一个方面，“ζ刺激结构域”或“CD3-ζ刺激结构域”为如SEQ ID NO:20提供的序列。
术语“共刺激性分子”是指T细胞上的相应结合配偶体，其特异性地结合共刺激配体，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激性分子为除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其促进有效的免疫应答。共刺激性分子包括但不限于MHC I类分子，BTLA和Toll配体受体，以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这样的共刺激性分子的进一步实例包括CDS,ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM,CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS,SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及特异性地结合CD83的配体。
共刺激性胞内信号传导结构域可以为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可以以下述蛋白质家族代表:TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞性活化分子(SLAM蛋白质)、和活化NK细胞受体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、与淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3以及特异性地结合CD83的配体等。
胞内信号传导结构域可以包含所述结构域的来源分子的全部细胞内部分或全部天然胞内信号传导结构域、或其功能片段或衍生物。
术语“4-1BB”是指具有如GenBankAcc.No.AAA62478.2提供的氨基酸序列的TNFR超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”被定义为GenBankAcc.No.AAA62478.2的氨基酸残基214-255，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”为如SEQ ID NO:14提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。
本文使用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应的细胞，例如促进免疫效应子应答。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如，α/βT细胞和γ/δT细胞，B细胞，天然杀伤(NK)细胞，天然杀伤T(NKT)细胞，肥大细胞和骨髓来源的吞噬细胞。
如本文使用的术语“免疫效应子功能或免疫效应子应答”是指增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或应答，例如免疫效应细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答是指促进靶细胞杀死或抑制生长或增殖的T或NK细胞的特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的实例。
术语“编码”是指多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列在生物学过程中作为合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，其达到编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些形式中含有内含子的程度。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换地使用，并且是指如本文中所述有效地实现特定生物学结果的化合物、制剂、物质或组合物的量。术语“内源的”是指来自或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
术语“外源的”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
术语“表达”是指由启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含分离的核酸且可用于将所分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。大量载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物有关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当被解释为进一步包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体等。
术语"表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，其包含有效连接要表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中。表达载体包括本领域已知的所有那些，包括掺入了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，因为其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，从而它们是基因递送载体的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。
术语“慢病毒载体”是指衍生于慢病毒基因组的至少一部分的载体，特别地包括自我灭活性慢病毒载体，如Milone等人，Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的。可用于临床中的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自Oxford BioMedica的基因递送技术，来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可获得的，并且将是本领域技术人员已知的。
术语“同源的”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间例如两个DNA分子或两个RNA分子之间，或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位点被相同的单体亚单位占据时；例如，如果两个DNA分子中的每个分子上的一个位置被腺嘌呤占据时，则它们在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同源性为匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位点(例如，长度为十个亚单位的聚合物中的五个位置)为同源的，则这两个序列是50％同源；如果90％的位点(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人(例如，鼠科动物)抗体的“人源化的”形式是含有衍生于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。对于大部分，人源化的抗体和其抗体片段是人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被来自具有期望特异性、亲和性和能力的例如小鼠、大鼠或兔子的非人类物种(供体抗体)的CDR的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应非人类残基替代。此外，人源化抗体/抗体片段可以包括既没有在接受者抗体中发现，也没有在所引入的CDR或构架序列中发现的残基。这些修饰可以进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将包含至少一个且典型地两个可变结构域的基本上所有氨基酸，其中所有的或基本上所有的CDR区域对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区域为人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段也可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般为人免疫球蛋白的那些。关于进一步的细节，参见Jones等人，Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
术语“完全的人”免疫球蛋白是指例如抗体或抗体片段的免疫球蛋白，其中整体分子具有人类来源或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”是指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽为“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境例如宿主细胞中。
术语“有效连接”或“转录控制”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能性连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系排布时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子有效连接编码序列。有效连接的DNA序列可以彼此邻接，并且例如当需要连接两个蛋白编码区时处在同一读码框中。
术语免疫原性的组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确地限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质，并且以与天然存在核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指定的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生下述序列而实现，所述序列中一个或更多个所选择的(或所有的)密码子的三个位置被混合碱基和/或去氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数量没限制。多肽包括含有彼此通过肽键结合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。正如本文中使用的那样，该术语是指短链(其在本领域通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物)以及较长链(其在本领域通常也称为蛋白质，其存在多种类型)。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指被细胞的合成机构识别的、或被引入了合成机构、启动多核苷酸序列的特异性转录目的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”是指有效连接启动子/调节序列的基因产物的表达所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可包括增强子序列及表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的序列。
术语“组成型”启动子是指有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，在细胞的大多数或全部生理条件下引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“可诱导的”启动子是指当有效连接编码或指定基因产物的多核苷酸时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性的”启动子是指当有效连接编码或指定基因的多核苷酸时，基本上仅当细胞为对应于启动子的组织类型的细胞时才引起基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
术语“与癌症相关的抗原”或“肿瘤抗原”可互换地是指全部地或以片段形式(例如MHC/肽)在癌细胞表面上被表达的分子(通常为蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且其用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原为由正常细胞和癌细胞表达的标志物，例如谱系标志物例如在B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原为在癌细胞中与正常细胞相比过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原为癌细胞中被不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原全部或以片段形式(例如，MHC/肽)被专一性地表达在癌细胞的细胞表面上，而不是在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本发明的CAR包括包含结合MHC呈递肽的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生于内源蛋白质的肽填充主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCRs)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表免疫疗法的独特类型的细胞表面靶点。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形中衍生于病毒或肿瘤抗原的TCR样抗体靶向肽(参见，例如Sastry等人，JVirol.201185(5):1935-1942；Sergeeva等人，Blood,2011117(16):4262-4272；Verma等人，J immunol 2010184(4):2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 20018(21):1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med20135(176):176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther 201219(2):84-100)。例如，TCR样抗体可以从筛选文库例如人scFv噬菌体展示文库鉴定。
术语“肿瘤支持抗原”或“癌症支持抗原”可互换地表示在细胞表面上表达的分子(通常为蛋白质，碳水化合物或脂质)，其本身不是癌的但支持癌细胞，例如通过促进它们的生长或存活，例如促进它们对免疫细胞的抗性。这种类型的示例性细胞包括基质细胞和骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。只要该抗原存在于支持癌细胞的细胞上，肿瘤支持抗原本身就不需要在支持肿瘤细胞中发挥作用。
如在scFv的上下文中使用的那样，术语“柔性的多肽接头”或“接头”是指由例如单独或联合使用的甘氨酸和/或丝氨酸残基的氨基酸组成的肽接头，其将重链可变区和轻链可变区连接在一起。在一个实施方案中，柔性的多肽接头为Gly/Ser接头且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10(SEQ ID NO:28)。在一个实施方案中，柔性的多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一个实施方案中，接头包括多个重复的(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO:31)。在本发明的范围内也包括描述在WO2012/138475中的接头，将其并入本文作为参考。
正如本文中使用的那样，5'帽(也称为RNA帽，RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是一种修饰的鸟嘌呤核苷酸，其在开始转录后不久已经被添加到真核信使RNA的“前面”或5'端。所述5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对于被核糖体识别和保护免遭RNA酶很重要。帽加入与转录偶联，并且以辅助转录方式进行，使得彼此影响。在转录开始后不久，合成的mRNA的5'端被与RNA聚合酶缔合的帽合成复合体结合。该酶复合体催化mRNA加帽所需的化学反应。以多步生化反应方式进行合成。加帽部分可以经修饰以调节mRNA的功能性，例如其翻译稳定性或效率。
正如本文中使用的那样，“体外转录的RNA”是指已经体外合成的RNA、优选mRNA。通常，体外转录的RNA是由体外转录载体产生的。体外转录载体包含用于产生体外转录的RNA的模板。
正如本文中使用的那样，“聚(A)”为通过聚腺苷酸化连接至mRNA的一系列腺苷。在用于短暂表达的构建体的一个优选实施方案中，聚A在50至5000个之间(SEQ ID NO:34)，优选地大于64个，更优选地大于100个，最优选大于300个或400个。聚(A)序列可以被化学或酶修饰以调节mRNA功能性，例如翻译的定位、稳定性或效率。
正如本文中使用的那样，“聚腺苷酸化”是指聚腺苷部分或其修饰的变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大多数信使RNA(mRNA)分子在3'末端被聚腺苷酸化。3'聚(A)尾部为通过酶，即，聚腺苷酸聚合酶的作用添加到前-mRNA的腺嘌呤核苷酸(通常几百个)的长序列。在高等真核生物中，聚(A)尾部被添加到含有特异性序列(聚腺苷酸化信号)的转录物上。聚(A)尾及结合其的蛋白质有助于保护mRNA免于被外切核酸酶降解。聚腺苷酸化对于转录终止、mRNA从细胞核输出和翻译也很重要。在DNA转录成RNA之后立即在细胞核中发生聚腺苷酸化，但是另外也可后来在细胞质中发生聚腺苷酸化。在转录已经终止之后，通过与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用，mRNA链被切割下来。切割位点通常的特征在于在切割位点附近存在碱基序列AAUAAA。在mRNA已经被切割下来之后，将腺苷残基添加到切割位点的游离3'末端。
如本文结合表达，例如CAR分子的表达时所使用，“短暂”表达是指表达非整合的转基因数小时、数天或数星期的时间段，其中该表达的时间段小于如果整合到基因组中或含在宿主细胞中的稳定质粒复制子之内时基因的表达时间段。
如本文结合效果，例如LSD1抑制剂的效果时所使用的，“短暂”效果意指该效果存在例如数小时，数天，数周或数月的期间，但是在一段时间后减少(例如，直到所述效果不再是可测量的。在实施方案中，效果如根据本文，例如在实施例中所述的测定法测量。
正如本文中使用的那样，术语“治疗”和“处理”是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂例如本发明的CAR)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(优选地，一种或多种可辨别的症状)。在特定实施方案中，术语“治疗”是指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数例如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。在其他实施方案中，术语“治疗”是指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在其他实施方案中，术语“治疗”是指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
术语“信号转导途径”是指在将信号从细胞的一个部分传递到细胞的另一个部分中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够跨越细胞膜接受信号和传递信号的分子和分子复合体。
术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物、人类)。
术语“基本上纯的”细胞是指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞是指其已经与其天然存在状态中通常有关的其他细胞类型分离的细胞。在某些情况下，基本上纯的细胞群是指细胞的同质群体。在其他的情况下，该术语仅指与在其天然状态下天然有关的细胞分离的细胞。在一些方面中，所述细胞是体外培养的。在其他方面中，所述细胞不是体外培养的。
正如本文中使用的那样，术语“治疗”是指治疗。治疗效果是通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态获得的。
正如本文中使用的那样，术语“预防”是指预防性或保护性治疗疾病或疾病状态。
术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指一个过程，外源性核酸通过该过程转移或引入到宿主细胞中。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原发性受试者细胞及其后代。
术语“特异性地结合”是指识别并且结合存在于样品中的结合配偶体(例如肿瘤抗原)蛋白质的抗体或配体，但是该抗体或配体基本上不会识别或结合样品中的其他分子。
正如本文中使用的那样，术语“可调节的嵌合抗原受体(RCAR)”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两个多肽，当在RCARX细胞中时，其向RCARX细胞提供针对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，且提供可调节的细胞内信号产生或增殖，其可以优化RCARX细胞的免疫效应子性质。RCARX细胞至少部分依赖于抗原结合结构域，以向包含被抗原结合结构域结合的抗原的靶细胞提供特异性。在一个实施方案中，RCAR包括二聚化开关，当存在二聚化分子时，其可以将胞内信号传导结构域偶联至抗原结合结构域。
正如本文中使用的那样，术语“膜锚”或“膜系链结构域”是指足够将细胞外或细胞内结构域锚固于质膜的多肽或部分例如豆蔻酰基团。
正如本文中使用的那样，术语“开关结构域”，例如当谈及RCAR时，是指在二聚化分子存在下与另一个开关结构域缔合的实体，通常为基于多肽的实体。该缔合导致与第一开关结构域连接(例如融合)的第一实体和与第二开关结构域连接(例如融合)的第二实体的功能性偶联。第一和第二开关结构域一起被称为二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此相同的，例如它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为同二聚化开关。在实施方案中，第一和第二开关结构域是彼此不同的，例如它们是具有不同的一级氨基酸序列的多肽，并且一起被称为异源二聚化开关。在实施方案中，所述开关在细胞内。在实施方案中，所述开关在细胞外。在实施方案中，所述开关结构域是基于多肽的实体，例如基于FKBP或FRB，并且所述二聚化分子是小分子，例如雷帕系物。在实施方案，开关结构域是基于多肽的实体，例如结合myc肽的scFv，并且二聚化分子为多肽、其片段或多肽的多聚体，例如结合一个或更多个mycscFvs的myc配体或myc配体的多聚体。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如myc抗体。
正如本文中使用的那样，例如当谈及RCAR时，术语“二聚化分子”是指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的分子。在实施方案中，二聚化分子不天然存在于受试者中，或者没有以导致显著二聚化的浓度存在。在实施方案中，二聚化分子为小分子，例如雷帕霉素或雷帕系物，例如RAD001。
术语“生物等同物”是指要产生与参考剂量或参考量的参考化合物产生的效果等同的效果所需要的不同于参考化合物的作用剂的量。在一个实施方案中，所述的效果是LSD1抑制的水平，例如正如通过LSD1蛋白水平测量的，例如正如在体内或体外测定法中评价的那样，例如如通过本文所述测定法测量的那样，例如流式细胞仪。在一个实施方案中，所述效果是增强的TSCM细胞例如CD45RA+CD62L+细胞的增殖，例如相对于其他T细胞表型例如TCM(例如CD45RA-CD62L+)，TEM(例如CD45RA-CD62L-)，TEFF或TREG细胞而言增强的增殖，例如通过细胞分选测量的。在一个实施方案中，所述效果是增强的TSCM细胞例如CD45RA+CCR7+细胞的增殖，例如相对于其他T细胞表型(例如CD45RA-CCR7+，CD45RA-CCR7-，CD45RA+CCR7-，TEFF或TREG细胞而言增强的增殖，例如通过细胞分选测量的。
如本文所用的“难治性”是指对治疗无反应的疾病，例如癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗之前或在治疗开始时对治疗有抗性。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得有抗性。难治性癌症也被称为耐药性癌症。
如本文所用，“复发”是指疾病(例如，癌症)或诸如癌症之类的疾病的迹象和症状在经过一段时间的改善之后，例如，在治疗的先前治疗之后，例如癌症治疗之后的回复。
“LSD1”、“赖氨酸特异性脱甲基酶1A”、“赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A”、“KDM1A”、“AOF2”、“KIAA0601”和“BHC110”在本文中可互换使用，并且指基因KDM1A(赖氨酸特异性脱甲基化酶1A)和由所述基因编码的蛋白质：赖氨酸特异性脱甲基化酶1A(LSD1)。该基因编码含有SWIRM结构域，FAD结合基序和胺氧化酶结构域的核蛋白。这种蛋白质是几种组蛋白脱乙酰酶复合物的组分，通过它作为组蛋白脱甲基化酶起作用使基因沉默。在人类基因组中，KDM1A位于染色体1Chr1:23030596(在组装GRCh38上)。目前已知LSD1的两种同工型，并且基因库编号NM_001009999.2和NM_015013.3描述了同工型。
人LSD1的蛋白质序列的实例以具有如下氨基酸序列的UniProt登录号O60341-1提供:
本发明还包括LSD1的其他同工型，包括同工型2，以UniProt登录号O60341-2提供。
下面提供了编码LSD1的核酸序列的实例。有2种经鉴定的人LSD1同工型。下面提供了mRNA序列(在实施方案中，在每个序列中，T可以用U替换)。在实施方案中，LSD1包括由以下各序列编码的蛋白质:
如在本文使用的术语“LSD1抑制剂”是指减少或消除LSD1的功能和/或表达的一个分子或一组分子(例如系统)。在实施方案中，LSD1抑制剂是抑制LSD1表达的分子，例如减少或消除LSD1的表达。在实施方案中，LSD1抑制剂是抑制LSD1功能的分子。抑制LSD1表达的LSD1抑制剂的实例是例如如本文所述的基因编辑系统，其靶向LSD1基因内(例如KDM1A基因内)的核酸或其调控元件，使得基因编辑系统结合位点处或附近的核酸修饰被修饰为减少或消除LSD1的表达。抑制LSD1表达的LSD1抑制剂的另一个实例是能够与LSD1 mRNA杂交并引起LSD1翻译减少或消除的核酸分子，例如RNA分子，例如短发夹RNA(shRNA)或短干扰RNA(siRNA)。抑制LSD1表达的LSD1抑制剂的另一个实例是反义寡核苷酸。LSD1抑制剂还包括编码抑制LSD1表达的分子的核酸(例如，编码抗LSD1 shRNA或siRNA的核酸，或编码抗LSD1基因编辑系统的一种或多种，例如全部组分的核酸)。抑制LSD1功能的分子的实例是这样的分子，例如抑制LSD1的一种或多种活性的蛋白质或小分子。一个实例是LSD1的小分子抑制剂，例如如本文所述。在一个示例性实施方案中，小分子LSD1抑制剂是可逆LSD1抑制剂。在另一个示例性实施方案中，小分子LSD1抑制剂是不可逆LSD1抑制剂。小分子LSD1抑制剂可以在催化位点或催化位点以外的位点结合LSD1。另一个实例是显性失活LSD1蛋白。另一个实例是抗LSD1抗体或其抗原结合片段。另一个实例是抑制LSD1结合配偶体的分子，例如小分子。LSD1抑制剂还包括编码LSD1功能的抑制剂的核酸。下文在标题为“LSD1抑制剂”的部分中提供了LSD1抑制剂的进一步描述。
如本文在LSD1结合配偶体的上下文中使用的术语“结合配偶体”是指与LSD1蛋白质相互作用(例如结合)的分子，例如蛋白质。不受理论的束缚，认为LSD1结合一种或多种HDAC蛋白，例如HDAC1。这类HDAC蛋白被认为是LSD1结合配偶体的实例。其他LSD1结合配偶体包括例如Co-REST/REST复合物的蛋白质例如HDAC1，HDAC2，p40，p80，Co-REST和ZNF217(Lee，MG，Wynder，C.，Cooch，N.&Shiekhattar，R.An essential role for CoREST innucleosomal histone 3lysine 4demethylation.Nature437,432–435(2005))；Blimp1复合物的蛋白质(Mol Cell Biol.2009Mar；29(6):1421-31.doi:10.1128/MCB.01158-08。2009年1月5日电子公开)；NuRD复合物的蛋白质(Cell.2009Aug.21；138(4):660-72.doi:10.1016/j.cell.2009.05.050)；和雄激素受体(Nature.2005Sep 15；437(7057):436-9。2005年8月3日电子公开)。
如本文中与例如基因编辑有关的术语联合使用的术语“系统”是指一组分子，例如一个或多个分子，其共同起作用以产生期望的功能。
本文使用的术语“基因编辑系统”是指指导和影响所述系统靶向的基因组DNA位点处或附近的一种或多种核酸的改变(例如缺失)的系统，例如一种或多种分子。基因编辑系统在本领域中是已知的，并且在下面更全面地描述。
“显性失活”基因产物或蛋白质是干扰基因产物或蛋白质功能的基因产物或蛋白质。受影响的基因产物可以与显性失活蛋白相同或不同。显性失活基因产物可以有许多形式，包括截短，具有点突变的全长蛋白或其片段，或全长野生型或突变蛋白或其片段与其他蛋白的融合物。观察到的抑制水平可以非常低。例如，与功能性蛋白质或参与过程的蛋白质相比，为了看到效果它可能需要大量过量的显性失活蛋白质。在正常生物测定条件下可能很难看到效果。在一个实施方案中，显性失活LSD1是催化失活的LSD1。
术语“比例”是指特定分子与群体中分子总数的比率。在一个示例性实施方案中，具有特定表型的T细胞(例如TSCM细胞)的比例是指具有该表型的T细胞数量相对于群体中T细胞总数的比率。在一个示例性实施方案中，具有特定表型的T细胞(例如CD45RA+CD62L+细胞)的比例是指具有该表型的T细胞数量相对于群体中T细胞总数的比率。应该理解，这种比例可以针对某些被指示的细胞子集进行测量。例如，可以针对CD4+T细胞的总数量来测量CD4+TSCM细胞的比例。
如本文所用的术语“免疫效应细胞群体”是指包含至少两种，例如两种或更多种，例如超过一种免疫效应细胞的组合物，并且不表示其他细胞类型的任何纯度水平或存在或不存在。在一个示例性实施方案中，群体基本上不含其他细胞类型。在另一个示例性实施方案中，群体包含至少两种特定细胞类型或具有指定的功能或性质的细胞。
术语“TSCM样细胞”，“幼稚T细胞”和“幼稚的T细胞”可互换使用，并指较低分化的T细胞状态，其特征在于CD45RA和CD62L的表面表达(例如是CD45RA阳性和CD62L阳性(有时写作CD45RA+CD62L+))。通常，T细胞分化从大多数“幼稚的”到大部分“消耗的”进行，TSCM样(例如CD45RA+CD62L+细胞)>TCM(例如CD45RA-CD62L+细胞)>TEM(例如CD45RA-CD62L-细胞)>TEFF。相对于更消耗的T细胞表型，幼稚T细胞可以例如表征为具有增加的自我更新、抗肿瘤功效、增殖和/或存活。在示例性实施方案中，幼稚T细胞是指CD45RA+CD62L+T细胞。在另一个示例性实施方案中，幼稚T细胞是指TSCM细胞，例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+T细胞。
术语“TSCM”是指具有干细胞记忆表型的T细胞，特征在于它在其细胞表面表达CD45RA，CD62L，CCR7，CD27和CD95(例如是CD45RA阳性，CD62L阳性，CCR7阳性，CD27阳性和CD95阳性(有时写作CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+))。TSCM细胞是幼稚T细胞的一个实例。T细胞可以是CD4+和/或CD8+T细胞。
范围:在整个公开中，本发明的各个方面都可以以范围形式存在。应当理解，范围形式的描述仅仅为方便和简洁起见，而不应当被看作是对本发明的范围不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为特别地公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围的描述例如从1至6就应当被认为具体地公开了子范围例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个实例，范围例如95-99％的同一性包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围例如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％的同一性。无论范围的宽度如何，这均适用。
标题，副标题或编号或字母元素，例如(a)，(b)，(i)等被示出为仅供简单阅读。在本文本中使用标题或编号或字母元素不要求步骤或元素按字母顺序执行，或者步骤或元素必须彼此离散。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容通过引用并入本文作为参考。
从说明书和附图以及权利要求中，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。
LSD1抑制剂
任何抑制LSD1的分子都可用于本文所述的本发明的方面，例如结合本文公开的细胞、组合物和方法。以下部分提供了示例性LSD1抑制剂，并非旨在进行限制。
在实施方案中，LSD1抑制剂是例如在培养物中或在受试者中，例如与未处理的CAR表达细胞或未治疗的受试者相比，导致具有幼稚表型的CAR表达细胞(例如，TSCM细胞)增加或延长的增殖或持久性的分子或系统。在实施方案中，增加的增殖或持久性与CAR表达细胞的数量增加相关联。用于测量增加的或延长的增殖的方法描述于实施例4中。在另一个实施方案中，例如在培养物中或在受试者中，例如与未处理的CAR表达细胞或未治疗的受试者相比，施用或接触LSD1抑制剂导致由CAR表达细胞增加的细胞因子释放或增加的癌细胞杀伤。用于测量增加的细胞因子释放的方法描述于例如实施例4中。在实施方案中，增加的癌细胞杀伤与肿瘤体积减少相关联。用于测量增加的癌细胞杀伤的方法描述于实施例4中，并且例如在国际申请WO2014/153270中描述，其通过引用整体并入本文。
核酸抑制剂
在一个方面，LSD1抑制剂是核酸分子。在实施方案中，核酸是DNA分子，例如反义寡核苷酸(例如，Watts等人，J.Pathol.，2012,2 26(2)，pp.365-379)。在一个实施方案中，反义寡核苷酸与LSD1 mRNA或前mRNA分子互补。在另一个方面，LSD1抑制剂包括编码所述反义寡核苷酸的核酸。
在实施方案中，核酸LSD1抑制剂是抑制LSD1的表达(例如翻译)的干扰RNA分子，例如shRNA或siRNA。在另一个方面，LSD1抑制剂包括编码所述干扰RNA分子的核酸。在实施方案中，抑制LSD1的表达(例如翻译)的干扰RNA分子(例如shRNA或siRNA)包含与LSD1 mRNA序列(这些序列在本文中相对于干扰RNA分子，例如shRNA或siRNA，称为“靶序列”)互补的结构域。表1中提供了这些靶序列的实例。
用于shRNA和siRNA LSD1抑制剂的示例性靶序列和编码shRNA LSD1抑制剂的示例性核酸在下表1中提供，
表1
核酸LSD1抑制剂分子包括包含化学修饰的核酸分子，所述修饰例如对核酸碱基、糖和/或磷酸骨架的修饰，所述核酸分子包括例如肽核酸，磷酸吗啉代骨架，硫代磷酸酯骨架，5'和3'端帽，2'-O甲基修饰，2'-F修饰以及本领域已知的其他修饰。
基因组编辑系统LSD1抑制剂
基因组编辑系统在本领域中是已知的，并且包括锌指核酸酶基因编辑系统，TALEN基因编辑系统，大范围核酸酶基因编辑系统和CRISPR基因编辑系统。如本文所用，术语“基因组编辑系统”(在本文中与“基因编辑系统”同义)是指：指导所述系统靶向的位点处或附近的核酸的修饰(例如插入或缺失)所需且足够的一个分子或分子集合。如本文所使用的术语，术语“基因组编辑系统”还指编码基因组编辑系统的一个或多个组件(例如分子)的核酸。示例性的基因编辑系统在本领域中是已知的，并且在下面更全面地描述。
CRISPR基因编辑系统
如本文所用，术语“CRISPR系统”，“CRISPR/Cas系统”，“CRISPR/Cas基因编辑系统”，“CRISPR/Cas基因组编辑系统”，“CRISPR基因组编辑系统”和“CRISPR基因编辑系统”在本文同义使用。天然存在的CRISPR系统在大约40％的已测序真细菌基因组和90％的已测序古细菌中发现。Grissa等人(2007)BMC Bioinformatics 8:172。该系统是一类原核免疫系统，其赋予对外源遗传元件如质粒和噬菌体的抗性并提供一种获得性免疫的形式。Barrangou等人(2007)Science 315:1709-1712；Marragini等人(2008)Science 322:1843-1845。
已修改了CRISPR系统用于真核生物(如小鼠、灵长类动物和人类)中的基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)。Wiedenheft等人，(2012)Nature 482:331-8。这例如通过向真核细胞中引入一种或多种编码特定工程化的引导RNA(gRNA)(例如，包含与真核生物基因组的序列互补的序列的gRNA)的载体以及一种或多种合适的RNA引导的核酸酶例如Cas蛋白。RNA引导的核酸酶与gRNA形成复合物，然后通过将gRNA序列与真核基因组的互补序列杂交，将RNA引导的核酸酶引导至靶DNA位点，在那里RNA引导的核酸酶然后诱导DNA双链或单链断裂。在链断裂处或附近的核苷酸插入或缺失产生修饰的基因组。
由于这些天然存在于许多不同类型的细菌中，CRISPR的确切排列以及Cas基因及其产物的结构、功能和数量在物种间多少有所不同。Haft等人(2005)PLoS Comput.Biol.1:e60；Kunin等人(2007)Genome Biol.8:R61；Mojica等人(2005)J.Mol.Evol.60:174-182；Bolotin等人(2005)Microbiol.151:2551-2561；Pourcel等人(2005)Microbiol.151:653-663；和Stern等人(2010)Trends.Genet.28:335-340。例如，Cse(Cas亚型，大肠杆菌)蛋白(例如CasA)形成功能复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录本加工成Cascade保留的间隔区重复单位。Brouns等人(2008)Science 321:960-964。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录本。在大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1或Cas2。在Pyrococcus furiosus和其他原核生物中的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小CRISPRRNA形成功能性复合物，其识别和切割互补的靶RNA。更简单的CRISPR系统依赖于蛋白质Cas9，该蛋白质是具有两个活性切割位点的核酸酶，每个用于双螺旋的一个链。组合Cas9和修饰的CRISPR基因座RNA可以用于基因编辑系统。Pennisi(2013)Science 341:833-836。
关于CRISPR-Cas系统、其组分和这些组分的递送(包括方法，材料，递送运载体，载体，粒子，AAV)及其制备和使用(包括量和制剂)的一般信息，均可用于本发明的实践，参照:US专利Nos.8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418和8,895,308；US专利公开US 2014-0310830(US APP.Ser.No.14/105,031)、US 2014-0287938 Al(U.S.App.Ser.No.14/213,991)、US 2014-0273234 Al(U.S.App.Ser.No.14/293,674)、US2014-027323 2Al(U.S.App.Ser.No.14/290,575)、US 2014-0273231(U.S.App.Ser.No.14/259,420)、US 2014-0256046 Al(U.S.App.Ser.No.14/226,274)、US2014-0248702 Al(U.S.App.Ser.No.14/258,458)、US 2014-0242700 Al(U.S.App.Ser.No.14/222,930)、US 2014-0242699 Al(U.S.App.Ser.No.14/183,512)、US2014-0242664 Al(U.S.App.Ser.No.14/104,990)、US 2014-0234972 Al(U.S.App.Ser.No.14/183,471)、US 2014-0227787 Al(U.S.App.Ser.No.14/256,912)、US2014-0189896 Al(U.S.App.Ser.No.14/105,035)、US 2014-0186958(U.S.App.Ser.No.14/105,017)、US 2014-0186919 Al(U.S.App.Ser.No.14/104,977)、US 2014-0186843 Al(U.S.App.Ser.No.14/104,900)、US 2014-0179770 Al(U.S.App.Ser.No.14/104,837)和US2014-0179006 Al(U.S.App.Ser.No.14/183,486)、US 2014-0170753(US App Ser No 14/183,429)；欧洲专利公开EP 2 771 468(EP13818570.7)、EP 2 764 103(EP13824232.6)和EP 2 784 162(EP14170383.5)；和PCT专利公开WO 2014/093661(PCT/US2013/074743)、WO2014/093694(PCT/US2013/074790)、WO 2014/093595(PCT/US2013/074611)、WO 2014/093718(PCT/US2013/074825)、WO 2014/093709(PCT/US2013/074812)、WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO 2014/093635(PCT/US2013/074691)、WO 2014/093655(PCT/US2013/074736)、WO 2014/093712(PCT/US2013/074819)、WO 2014/093701(PCT7US2013/074800)、WO 2014/018423(PCT/US2013/051418),WO 2014/204723(PCT/US2014/041790)、WO 2014/204724(PCT/US2014/041800)、WO 2014/204725(PCT/US2014/041803)、WO 2014/204726(PCT US2014/041804)、WO 2014/204727(PCT US2014/041806)、WO 2014/204728(PCT/US2014/041808)和WO 2014/204729(PCT US2014/041809)。还参考分别于2013年1月30日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日和2013年5月28日递交的US临时专利申请61/758,468；61/802,174；61/806,375；61/814,263；61/819,803和61/828,130。还参考于2013年6月17日递交的US临时专利申请61/836,123。另外参考各在2013年6月17日递交的US临时专利申请61/835,931、61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080和61/835,973。还参考2013年8月5日递交的US临时专利申请61/862,468和61/862,355；2013年8月28日递交的61/871,301；2013年9月25日递交的61/960,777，和2013年10月28日递交的61/961,980。再又参考:各自在2014年6月10日，2014 6/10/14递交的PCT专利申请No:PCT/US2014/041803、PCT/US2014/041800、PCT/US2014/041809、PCT/US2014/041804和PCT US2014/041806；2014年6月1日递交的PCT US2014/041808；和2014年10月28日递交的PCT/US2014/62558和各自在2013年12月12日递交的US临时专利申请序号:61/915,150、61/915,301、61/915,267和61/915,260；2013年1月29日和2013年2月25日递交的61/757,972和61/768,959；2013年6月17日递交的61/835,936、61/836,127、61/836,101、61/836,080、61/835,973和61/835,931；2014年6月11日递交的62/010,888和62/010,879；各自在2014年6月10日递交的62/010,329和62/010,441；各自在2014年2月12日递交的61/939,228和61/939,242；2014年4月15日递交的61/980,012；2014年8月17日递交的62/038,358；各自在2014年9月25日递交的62/054,490、62/055,484、62/055,460和62/055,487；和2014年10月27日递交的62/069,243。还参考2014年4月15日递交的US临时专利申请Nos.62/055,484、62/055,460和62/055,487；2014年4月15日递交的US临时专利申请61/980,012；和2014年2月12日递交的US临时专利申请61/939,242。还参考2014年6月10日递交的尤其指定美国的PCT申请，其申请号PCT/US 14/41806。参考2014年1月22日递交的美国临时专利申请61/930,214。参考2013年12月12日递交的US临时专利申请61/915,251、61/915,260和61/915,267。参考2014年4月15日递交的US临时专利申请USSN 61/980,012。参考2014年6月10日递交的尤其指定美国的PCT申请，其申请号No.PCT/US 14/41806。参考2014年1月22日递交的US临时专利申请61/930,214。参考各自在2013年12月12日递交的US临时专利申请61/915,251；61/915,260和61/915,267。
还参考2014年12月12日递交的US申请62/091,455、PROTECTED GUIDE RNAS(PGRNAS)；2014年12月24日递交的US申请62/096,708、PROTECTED GUIDE RNAS(PGRNAS)；2014年12月24日递交的US申请62/091,462、DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTIONFACTORS；2014年12月23日递交的US申请62/096,324、DEAD GUIDES FOR CRISPRTRANSCRIPTION FACTORS；2014年12月24日递交的US申请62/091,456、ESCORTED ANDFUNCTI ON AL IZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月24日递交的US申请62/091,461、DELIVERY、USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMSAND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS(HSCs)；2014年12月19日递交的US申请62/094,903、UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRANDBREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING；2014年12月24日递交的US申请62/096,761、ENGINEERING OF SYSTEMS,METHODS ANDOPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION；2014年12月30日递交的US申请62/098,059、RNA-TARGETING SYSTEM；2014年12月24日递交的US申请62/096,656、CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS；2014年12月14日递交的US申请62/096,697、CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV；2014年12月30日递交的US申请62/098,158、ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS；2015年4月22日递交的US申请62/151,052、CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAREXOSOMAL REPORTING；2014年9月24日递交的US申请62/054,490、DELIVERY、USE ANDTHERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FORTARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS；2014年9月25日递交的US申请62/055,484、SYSTEMS,METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月4日递交的US申请62/087,537、SYSTEMS,METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATIONWITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年9月14日递交的US申请62/054,651、DELIVERY,USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS ANDCOMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO；2014年10月23日递交的US申请62/067,886、DELIVERY,USE AND THERAPEUTICAPPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELINGCOMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO；2014年9月24日递交的US申请62/054,675、DELIVERY,USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMSAND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES；2014年9月24日递交的US申请62/054,528、DELIVERY,USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS ANDCOMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS；2014年9月14日递交的US申请62/055,454、DELIVERY,USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS ANDCOMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATIONPEPTIDES(CPP)；2014年9月14日递交的US申请62/055,460、MULTIFUNCTIONAL-CRISPRCOMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTION AL-CRISPR COMPLEXES；2014年12月14日递交的US申请62/087,475、FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONALCRISPR-CAS SYSTEMS；2014年9月14日递交的US申请62/055,487、FUNCTIONAL SCREENINGWITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月14日递交的US申请62/087,546、MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKEDFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES；和2014年12月30日递交的US申请62/098,285、CRISPRMEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TΜMOR GROWTH ANDMETASTASIS。
这些专利、专利出版物和申请中的每一个，以及其中或在其审查期间引用的所有文件(“申请引用的文件”)以及在所引用的文件中引用或参考的所有文件，以及任何说明书，描述，产品规范和其中提及的任何产品或其中的任何文件中以及通过引用结合于此的产品页，在此通过引用并入本文，并且可以用于本发明的实践中。所有文件(例如，这些专利、专利出版物和申请以及申请引用的文件)通过引用并入本文，其程度如同每个单独文件被具体且单独地指示为通过引用并入。
同样关于CRISPR-Cas系统的一般信息，提及以下内容(也通过引用并入本文):
使用CRISPR/Cas系统的多重基因组工程，Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,&Zhang,F.ScienceFeb 15；339(6121):819-23(2013)；使用CRISPR-Cas系统的细菌基因组的RNA引导的编辑。Jiang W.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F,Marraffini LA.Nat Biotechnol Mar；31(3):233-9(2013)；通过CRISPR/Cas介导的基因组工程一步生成携带多个基因的突变的小鼠。WangH.,Yang H.,Shivalila CS.,Dawlaty MM.,Cheng AW.,Zhang F.,Jaenisch R.Cell May9；153(4):910-8(2013)；哺乳动物内源性转录和表观遗传状态的光学控制，Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Hsu PD,Heidenreich M,Cong L,Piatt RJ,Scott DA,ChurchGM,Zhang F.Nature.2013年8月22日；500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature 12466.2013年8月23日电子公开；
通过RNA引导的CRISPR Cas9双切口用于增强的基因组编辑特异性。Ran,FA.,Hsu,PD.,Lin,CY.,Gootenberg,JS.,Konermann,S.,Trevino,AE,,Scott,DA.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y,,&Zhang,F.Cell Aug 28.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013
RNA引导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性，Hsu,P.,Scott,D.,Weinstein,J.,Ran,FA.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.,Wu,X.,Shalem,O.,Cradick,TJ.,Marraffini,LA.,Bao,G.,&Zhang,F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013)；
使用CRISPR-Cas9系统的基因组工程，Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov；8(l l):2281-308.(2013)；在人类细胞中进行基因组规模的CRISPR-Cas9敲除筛选，Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013)，[电子版提前于印刷]；cas9与引导RNA和靶DNA复合的晶体结构，Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27.(2014).156(5):935-49；
哺乳动物细胞中CRISPR内切核酸酶Cas9的全基因组结合，Wu X.,Scott DA.,KrizAJ.,Chiu AC,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.(2014)Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889，
用于基因组编辑和癌症建模的CRISPR-Cas9敲入小鼠，Piatt等人，Cell 159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014
用于基因组工程的CRISPR-Cas9的开发和应用，Hsu等人Cell 157,1262-1278(2014年6月5日)(Hsu 2014)，
使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中的遗传筛选，Wang等人，Science.2014年1月3日；343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981，
用于CRISPR-Cas9介导的基因失活的高活性sgRNAs的合理设计，Doench等人，Nature Biotechnology，2014年9月3日在线公开；doi:10.1038/nbt.3026，以及使用CRISPR-Cas9在哺乳动物大脑中基因功能的体内询问，Swiech等人，NatureBiotechnology；2014年10月19日在线公开；DOI:10.1038/nbt.3055。
通过工程化的CRISPR-Cas9复合物的基因组规模转录激活，onermann S,BrighamMD,Trevino AE,Joung J,Abudayyeh 00,Barcena C,Hsu PD,Habib N,Gootenberg JS,Nishimasu H,Nureki O,Zhang F.,Nature.Jan 29；517(7536):583-8(2015)。
用于诱导型基因组编辑和转录调节的分裂Cas9(split-Cas9)结构，Zetsche B,Volz SE,Zhang F.,(2015年2月2日在线发表)Nat Biotechnol.Feb；33(2):139-42(2015)；
在肿瘤生长和转移的小鼠模型中的全基因组CRISPR筛选，Chen S,Sanjana NE,Zheng,Shalem O,Lee,Shi X,Scott DA,Song J,Pan JQ,Weissleder R,Lee H,Zhang F,Sharp PA.Cell 160,1246-1260，2015年3月12日(小鼠中的多重筛选)，和
使用金黄色葡萄球菌Cas9进行体内基因组编辑，Ran FA,Cong L,Yan WX,ScottDA,Gootenberg JS,Kriz AJ,Zetsche B,Shalem O,Wu X,Makarova KS,oonin EV,SharpPA,Zhang F.,(2015年4月1日在线公开),Nature.Apr 9；520(7546):186-91(2015)。
使用CRISPR-Cas9的高通量功能基因组学，Shalem等人“Nature ReviewsGenetics 16,299-311(2015年5月)。
改进的CRISPR sgRNA设计的序列决定因素，Xu等人，Genome Research 25,1147-1157(2015年8月)。
用于解剖调控网络的原代免疫细胞中的全基因组CRISPR筛选，Parnas等人，Cell162，675-686(2015年7月30日)。
CRISPR/Cas9切割病毒DNA有效抑制乙型肝炎病毒，Ramanan等人，ScientificReports 5:10833.doi:10.1038/srepl0833(2015年6月2日)。
金黄色葡萄球菌Cas9的晶体结构，Nishimasu等人，Cell 162，1113-1126(2015年8月27日)。
通过Cas9介导的原位饱和诱变进行的BCL11A增强子解剖，Canver等人，Nature527(7577):192-7(2015年11月12日)doi:10.1038/naturel 5521。2015年9月16日电子公开。在此引入作为参考，并在下面简要讨论:
Cong等人基于嗜热链球菌Cas9和化脓链球菌(Streptoccocus pyogenes)Cas9工程化II型CRISPR/Cas系统以在真核细胞中使用，并显示Cas9核酸酶可以被短RNA引导以诱导人和小鼠细胞中DNA的精确切割。他们的研究进一步表明，转化成切口酶的Cas9可以用于促进真核细胞中的同源性定向修复而具有最小的致突变活性。此外，他们的研究表明，多个引导序列可以编码入单一的CRISPR阵列，以便能够同时编辑哺乳动物基因组内的多个内源基因组位点，证明了RNA引导的核酸酶技术易于程序化和广泛适用。这种使用RNA来编程细胞中序列特异性DNA切割的能力定义了一类新的基因组工程化工具。这些研究进一步表明，其他CRISPR基因座可能可移植入哺乳动物细胞，并且也可以介导哺乳动物基因组切割。重要的是，可以设想CRISPR/Cas系统的几个方面可以进一步改进以提高其效率和多功能性。
江等人使用与双RNA复合的簇集的、规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)相关的Cas9内切核酸酶在肺炎链球菌和大肠杆菌的基因组中引入精确的突变。该方法依赖于在靶向基因组位点处的双RNA:Cas9引导的切割来杀死未突变的细胞，并且避免了对可选择标记或反选择系统的需要。该研究报道通过改变短CRISPR RNA(crRNA)的序列重编程双重RNA:Cas9特异性以在编辑模板上进行单核苷酸和多核苷酸变化。该研究表明，同时使用两种crRNA允许能够进行多重诱变。此外，当该方法与重组组合用时，在肺炎链球菌中，使用所述方法回收的几乎100％的细胞含有所需的突变，并且在大肠杆菌中，回收的65％含有该突变。
Wang等人(2013)使用CRISPR/Cas系统用于一步生成在多个基因中携带突变的小鼠，这些基因传统上通过胚胎干细胞中的连续重组和/或具有单一突变的小鼠的耗时互交而在多个步骤中产生。CRISPR/Cas系统将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。
Konermann等人解决了本领域对多功能和强大技术的需求，该技术允许进行基于DNA结合结构域的CRISPR Cas9酶和转录激活剂样效应子的光学和化学调节。
Ran等人(2013-A)描述了将Cas9切口酶突变体与配对的引导RNA组合以引入靶向双链断裂的方法。这解决了来自微生物CRISPR-Cas系统的Cas9核酸酶通过引导序列靶向特定基因组基因座的问题，所述引导序列可以容忍与DNA靶标的某些错配并因此促进不期望的脱靶诱变。由于基因组中的单个缺口以高保真度进行修复，因此双链断裂需要通过适当偏移的引导RNA进行同时切割，并延伸特异性识别的碱基的数量用于靶标切割。作者证明，使用成对的切口可以使细胞系中的脱靶活性减少50倍到1,500倍，并且促进小鼠受精卵中的基因敲除而不牺牲靶上切割效率。这种多功能策略允许进行各种需要高特异性的基因组编辑应用。Hsu等人(2013)表征了SpCas9在人类细胞中的靶向特异性，以通知靶位点的选择并避免脱靶效应。该研究评估了在293T和293FT细胞中>100个预测的基因组脱靶位点处>700个引导RNA变体和SpCas9诱导的indel突变水平。作者认为SpCas9以序列依赖的方式在不同位置上容忍引导RNA与靶DNA之间的错配，对错配的数量、位置和分布敏感。作者进一步表明SpCas9介导的切割不受DNA甲基化影响，并且可以滴定SpCas9和sgRNA的剂量以最小化脱靶修饰。此外，为了促进哺乳动物基因组工程应用，作者报告提供了基于网络的软件工具来指导靶序列的选择和验证以及脱靶分析。
Ran等人(2013-B)描述了一组用于通过哺乳动物细胞中的非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行Cas9介导的基因组编辑的工具，以及用于下游功能研究的修饰细胞系的生成。为了使脱靶切割最小化，作者进一步描述了使用带有成对引导RNA的Cas9切口酶突变体的双切口策略。作者提供的方案实验性地得到了靶位点选择指导、切割效率评估和脱靶活性分析。研究表明，从靶标设计开始，可以在少至1-2周内实现基因修饰，并且修饰的克隆细胞系可以在2-3周内得到。
Shaiem等人描述了在全基因组范围内询问基因功能的新方法。他们的研究表明，基因组规模的CRISPR-Cas9敲除(GeC O)文库的递送靶向18,080个具有64,751个独特引导序列的基因，允许在人类细胞中进行阴性和阳性选择筛选。首先，作者表明了使用GeCKO文库鉴定在癌症和多能干细胞中细胞活力所必需的基因。接下来，在黑素瘤模型中，作者筛选了其基因丢失与抗抑制突变蛋白激酶BRAF的治疗药威罗菲尼有关的基因。他们的研究表明，排名最高的候选者包括先前验证过的基因NF1和MED12以及新的命中NF2、CUL3、TADA2B和TADAL。作者观察到靶向相同基因的独立引导RNA之间高度一致性，以及高比率的命中确认，从而证明了用Cas9的基因组规模筛选的前景。
Nishimasu等人报道了化脓链球菌Cas9与sgRNA及其靶DNA复合物在分辨率的晶体结构。该结构揭示了由靶标识别和核酸酶叶组成的双叶结构，在其界面处的带正电荷的凹槽中容纳sgRNA:DNA异源双链体。尽管识别叶对于结合sgRNA和DNA是必需的，但是核酸酶叶包含HNH和RuvC核酸酶结构域，其分别适合地定位用于靶DNA的互补链和非互补链地切割。核酸酶叶还含有负责与原型间隔子相邻基序(PAM)相互作用的羧基末端结构域。这种高分辨率结构和相应的功能分析揭示了Cas9靶向的RNA引导的DNA的分子机制，由此为合理设计新的多功能基因组编辑技术铺平了道路。
Wu等人在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中绘制了来自装载有单一引导RNA(sgRNA)的化脓链球菌的催化失活的Cas9(dCas9)的全基因组结合位点。作者表明，测试的四个sgRNA中的每一个都将dCas9靶向到数十和数千计的基因组位点之间，通常以sgRNA中的5个核苷酸种子区域和NGG原型间隔子邻接基序(PAM)为特征。染色质不可访问性降低了dCas9与具有匹配种子序列的其他位点的结合；因此70％的脱靶位点与基因有关。作者表明，在用催化活性Cas9转染的mESC中295个dCas9结合位点的靶向测序仅鉴定了一个突变超过背景水平的位点。作者提出了Cas9结合和切割的双态模型，其中种子匹配触发结合，但需要与目标DNA充分配对用于切割。
Piatt等人建立了Cre依赖性Cas9敲入小鼠。作者在神经元、免疫细胞和内皮细胞中使用腺相关病毒(AAV)-，慢病毒-或颗粒介导的引导RNA的递送来进行在体内以及离体基因组编辑。
Hsu等人(2014)是一篇综述文章，大体讨论了从酸奶到基因组编辑(包括细胞遗传筛选)的CRISPR-Cas9历史。
Wang等人(2014)涉及使用基因组级慢病毒单一引导RNA(sgRNA)文库的适用于阳性和负选择的合并的功能丧失性遗传筛选方法。
Doench等人创建了sgRNA池，将一组6个内源性小鼠和3个内源性人类基因的所有可能靶位点平铺，并通过抗体染色和流式细胞术定量评估它们产生其靶基因的无效等位基因的能力。作者表明PAM的优化改善了活性，并提供了用于设计sgRNA的在线工具。
Swiech等人证明AAV介导的SpCas9基因组编辑可以允许进行脑中基因功能的反向遗传研究。
Konermann等人(2015)讨论了在导向物上的适当位置处例如具有和不具有接头的茎或四环，附接多个效应结构域，例如转录激活因子，功能基因组和表观基因组调控因子的能力。
Zetsche等人证明Cas9酶可以分成两个，因此可以控制用于激活的Cas9的组装。
Chen等人涉及通过证明在小鼠中全基因组体内CRISPR-Cas9筛选显示调节肺转移的基因来进行多重筛选。Ran等人(2015)涉及SaCas9及其编辑基因组的能力，并证明不能从生化测定推断。Shalem等人(2015)描述了使用无催化活性的Cas9(dCas9)融合来合成抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)表达的方法，显示了使用Cas9进行基因组级筛选的进展，包括排列和汇集的筛选，使基因组基因座失活的敲除方法和调节转录活性的策略。
Shalem等人(2015)描述了使用无催化活性的Cas9(dCas9)融合来合成抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)表达的方法，显示了使用Cas9进行基因组级筛选的进展，包括排列和汇集的筛选，使基因组基因座失活的敲除方法和调节转录活性的策略。
Xu等人(2015)评估了在基于CRISPR的筛选中有助于单一引导RNA(sgRNA)效率的DNA序列特征。作者研究了在切割位点的CRISPR/Cas9敲除和核苷酸偏好的效率。作者还发现，CRISPRi/a的序列偏好与CRISPR Cas9敲除的序列偏好基本上不相同。
Parnas等人(2015)将全基因组合并的CRISPR-Cas9文库引入树突细胞(DC)以鉴定控制细菌脂多糖(LPS)诱导肿瘤坏死因子(Tnf)的基因。已知的TIr4信号传导调节控物和先前未知的候选者被鉴定并分类为三个功能模块，其对LPS的规范应答具有不同的作用。
Ramanan等人(2015)证实了在感染细胞中病毒附加体DNA(cccDNA)的切割。HBV基因组在受感染的肝细胞的核中，以被称为共价闭合环状DNA(cccDNA)的3.2kb的双链附加型DNA种类存在，其是HBV生命周期中的关键组分，其复制不受当前疗法的抑制。作者表明，特异性靶向HBV高度保守区域的sgRNA强力抑制病毒复制并消耗cccDNA。Nishimasu等人(2015)报道了含有5'-TTGAAT-3'PAM和5'-TTGGGT-3'PAM的SaCas9与单一引导RNA(sgRNA)及其双链DNA靶标复合的晶体结构。SaCas9与SpCas9的结构比较突出了结构保守性和分歧性，解释了它们独特的PAM特异性和直向同源sgRNA识别。
Slaymaker等人(2015)报道了使用结构引导的蛋白质工程来改进化脓链球菌Cas9(SpCas9)的特异性。作者开发了“增强的特异性”SpCas9(eSpCas9)变体，其保持强大的靶向切割并减少脱靶效应。
Tsai等人，“Dimeric CRISPR A-guided Fokl nucleases for highly specificgenome editing”，Nature Biotechnology 32(6):569-77(2014)，其不被认为是本发明或本申请的现有技术，但其可以在实施本发明时应予以考虑。还提及Konermann等人，“Genome-scale transcription activation by an engineered CRISPR-Cas9complex,"doi:10.1038/naturel4136，本文通过引用作为参考。
一般而言，CRISPR-Cas或CRISPR系统如在前述文献(例如WO2014/093622(PCT/US2013/074667))中所使用，并且统称为涉及CRISPR相关联的(Cas)基因的表达或指导CRISPR相关联的(Cas)基因的活性的转录本和其他元件，包括编码Cas基因的序列，tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)，tracr-mate序列(在内源性CRISPR系统的上下文中涵盖直接重复序列和tracrRNA加工的部分直接序列重复)，引导序列(在内源性CRISPR系统的上下文中也称为间隔子)或如本文使用的术语中的gRNA(包括例如单一引导RNA(sgRNA)(嵌合RNA)和双引导RNA(dgRNA))。在CRISPR系统上下文中，“靶序列”是指gRNA分子的靶向结构域序列被设计为具有互补性的序列，其中靶序列和gRNA的靶向结构域序列之间的杂交指导CRISPR系统至包含靶序列的该基因座。靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施方案中，直接重复可以通过搜索满足以下任何或全部标准的重复基序来在硅片上鉴定:1.在II型CRISPR基因座侧翼的基因组序列的2Kb窗口中发现；2.跨度从20到50bp；和3.间隔20至50bp。在一些实施方案中，可以使用这些标准中的2个，例如1和2、2和3或1和3。在一些实施方案中，可以使用全部3个标准。在一些实施方案中，在CRISPR系统中优选tracr序列具有一个或多个发夹并且长度为30或更多个核苷酸，40或更多个核苷酸或50或更多个核苷酸；引导序列的长度在10至30个核苷酸之间，CRISPR/Cas酶是II型Cas9酶。在本发明的实施方案中，术语引导序列和引导RNA可以如在前述引用文献如WO2014/093622(PCT US2013/074667)中互换使用。通常，引导序列是与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR系统与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，引导序列与其相应的靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％，60％，75％，80％，85％，90％，95％，97.5％，99％或更多。可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法，Needleman-Wunsch算法，基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows WheelerAligner)，ClustalW，Clustal X，BLAT，Novoalign(Novocraft Technologies；可从www.novocraft.com获得)，ELAND(IllμMina，San Diego，CA)，SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和aq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，引导序列大约或多于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多个核苷酸长。在一些实施方案中，引导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少的核苷酸长。优选地引导序列为10-30个核苷酸长。引导序列指导CRISPR系统与靶序列的序列特异性结合的能力可以通过任何合适的测定法来评估。例如，足以形成CRISPR系统(包括待测试的引导序列)的CRISPR系统的组分可以提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码CRISPR序列的组分的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割，例如通过文献中描述的Surveyor测定法并且是本领域技术人员已知的。类似地，可通过提供靶序列，CRISPR系统的组分(包括待测试的引导序列)和不同于测试引导序列的对照引导序列，并比较在测试和对照引导序列反应之间在靶序列处的结合或切割速率，在试管中评估靶多核苷酸序列的切割。其他测定法是可能的，并且对于本领域技术人员而言将会发生。可以选择引导序列来靶向任何靶序列。在一些实施方案中，靶序列是细胞基因组内的序列。示例性的靶序列包括那些在靶基因组中是独特的靶序列。例如，对于化脓链球菌Cas9，基因组中的独特序列可以包括NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXGG形式的Cas9靶序列(其中N是A，G，T或C；并且X可以是任何)，其中该序列具有在基因组中出现一次。对于嗜热链球菌CRISPR/Cas9系统，基因组中的独特序列可以包括NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXXAGAAW(SEQ ID NO:863)形式的Cas9靶位点(其中N是A，G，T或C；X可以是任何；并且W是A或T)，其中该序列在基因组中具有单一出现。对于化脓链球菌Cas9或嗜热链球菌(S.Thermophilius)Cas9，基因组中的独特序列可以包括NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXGGXG(其中N是A，G，T或C；并且X可以是任何)形式的Cas9靶位点，其中该序列在基因组中出现一次。在一些实施方案中，选择引导RNA序列以降低引导RNA序列内的二级结构程度。在一些实施方案中，引导序列的大约或小于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的核苷酸参与最佳折叠时的自我互补的碱基配对。最佳折叠可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序是基于计算最小吉布斯自由能。如Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981)，133-148)所述，一种这样的算法的实例是mFold。折叠算法的另一实例是使用在线网络服务器RNAfold，其是使用核心结构预测算法，在维也纳大学理论化学研究所开发的(参见例如AR Gruber等人，2008，Cell106(1):23-24；和PA Carr和GM Church，2009，Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。
在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶是Cas分子，例如Cas9分子。许多物种的Cas9分子可用于本文所述的方法和组合物中。在优选的实施方案中，Cas9分子是化脓链球菌Cas9分子。在实施方案中，Cas9分子衍生于化脓链球菌Cas9分子(例如，UniProt Q99ZW2)。尽管化脓链球菌Cas9分子是本文许多公开内容的主题，但也可以使用衍生于或基于本文所列其他种类的Cas9蛋白的Cas9分子。换句话说，其他Cas9分子，例如嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌和/或脑膜炎奈瑟氏球菌Cas9分子可用于本文所述的系统、方法和组合物中。另外的Cas9物种包括:燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属(Actinomyces sp.)、cycliphilus denitrificans,Aminomonas paucivorans,蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、史氏芽孢杆菌(Bacillussmithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、拟杆菌属(Bacteroides sp.)、Blastopirellula marina、慢生根瘤菌属(Bradyrhiz obium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、CandidatusPuniceispirillum,解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、Corynebacterium matruchotii、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ-变形菌纲(gammaproteobacterium)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、嗜血弯曲杆菌(Haemophilus sputorum)、Helicobacter canadensis,同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、Ilyobacter polytropus,金氏金氏菌(Kingellakingae)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌科菌(Listeria ceaebacterium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis sp.)、甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、奈瑟氏杆菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、浅黄色奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、奈瑟氏菌属(Neisseria sp.)、瓦茨瓦尔西奈瑟氏菌(Neisseriawadsworthii)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、出血败血性巴士杆菌(Pasteurella multocida)、Phascolarctobacterium succinatutens,Ralstonia syzygii、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、Sporolactobacillusvineae、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属(Streptococcus sp.)、Subdoligranulum sp.、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属(Treponemasp.)或Verminephrobacter eiseniae。
如本文使用的术语，Cas9分子是指可以与gRNA分子(例如tracr的结构域的序列)相互作用的分子，并且与gRNA分子一致，定位(例如靶标或家)到包含靶序列和PAM序列的位点。
在实施方案中，活性Cas9分子与靶核酸相互作用并裂解靶核酸的能力是PAM序列依赖性的。PAM序列是靶核酸中的序列。在一个实施方案中，靶核酸的切割发生在PAM序列的上游。来自不同细菌物种的活性Cas9分子可以识别不同的序列基序(例如PAM序列)。在一个实施方案中，化脓链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGG，并指导该序列上游的靶核酸序列1至10，例如3至5个碱基对的切割。参见例如Mali等人，SCIENCE 2013；339(6121):823-826。在一个实施方案中，嗜热链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGGNG和NNAGAAW(W＝A或T)并指导这些序列的上游的核心靶核酸序列1至10，例如，3至5个碱基对的切割。参见例如Horvath等人，SCIENCE 2010；327(5962):167-170以及Deveau等人，J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400。在一个实施方案中，变形链球菌的活性Cas9分子识别序列基序NGG或NAAR(R-A或G)并指导该序列上游的核心靶核酸序列1至10，例如，3至5个碱基对的切割。参见例如Deveau等人，J BACTERIOL 2008；190(4):1390-1400。
在一个实施方案中，变形链球菌(S.aureus)的活性Cas9分子识别序列基序NNGRR(R＝A或G)并指导该序列上游的靶核酸序列1至10，例如，3至5个碱基对的切割。参见例如Ran F.等人，NATURE,vol.520,2015,pp.186-191。在一个实施方案中，脑膜炎奈瑟氏球菌的活性Cas9分子识别序列基序NNNNGATT并指导该序列上游的靶核酸序列1至10，例如3至5个碱基对的切割。参见例如Hou等人，PNAS EARLY EDITION 2013,1-6。可以确定Cas9分子识别PAM序列的能力，例如使用Jinek等人，Science 2012,337:816中描述的转化测定法。
示例性的天然存在的Cas9分子描述于Chylinski等人，RNA Biology 2013；10:5,727-737。这样的Cas9分子包括簇1细菌家族，簇2细菌家族，簇3细菌家族，簇4细菌家族，簇5细菌家族，簇6细菌家族，簇7细菌家族，簇8细菌家族，簇9细菌家族，簇10细菌家族，簇11细菌家族，簇12细菌家族，簇13细菌家族，簇14细菌家族，簇1细菌家族，簇16细菌家族，簇17细菌家族，簇18细菌家族，簇19细菌家族，簇20细菌家族，簇21细菌家族，簇22细菌家族，簇23细菌家族，簇24细菌家族，簇25细菌家族，簇26细菌家族，簇27细菌家族，簇28细菌家族，簇29细菌家族，簇30细菌家族，簇31细菌家族，簇32细菌家族，簇33细菌家族，簇34细菌家族，簇35细菌家族，簇36细菌家族，簇37细菌家族，簇38细菌家族，簇39细菌家族，簇40细菌家族，簇41细菌家族，簇42细菌家族，簇43细菌家族，簇44细菌家族，簇45细菌家族，簇46细菌家族，簇47细菌家族，簇48细菌家族，簇49细菌家族，簇50细菌家族，簇51细菌家族，簇52细菌家族，簇53细菌家族，簇54细菌家族，簇55细菌家族，簇56细菌家族，簇57细菌家族，簇58细菌家族，簇59细菌家族，簇60细菌家族，簇61细菌家族，簇62细菌家族，簇63细菌家族，簇64细菌家族，簇65细菌家族，簇66细菌家族，簇67细菌家族，簇68细菌家族，簇69细菌家族，簇70细菌家族，簇71细菌家族，簇72细菌家族，簇73细菌家族，簇74细菌家族，簇75细菌家族，簇76细菌家族，簇77细菌家族或簇78细菌家族的Cas9分子。
示例性的天然存在的Cas9分子包括簇1细菌家族的Cas9分子。实例包括化脓链球菌(例如菌株SF370、MGAS 10270、MGAS 10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131和SSI-1)、嗜热链球菌(例如菌株LMD-9)、假豕链球菌(S.pseudoporcinus)(例如，菌株SPIN20026)、变异链球菌(例如，菌株UA159、NN2025)、猕猴链球菌(S.macacae)(例如，菌株NCTC11558)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)(例如，菌株UCN34、ATCCBAA-2069)、马链球菌(S.equinus)(例如，菌株ATCC9812、MGCS124)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)(例如，菌株GGS124)、牛链球菌(S.bovis)(例如，菌株ATCC700338)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)(例如，菌株F0211)、无乳链球菌(S.agalactiae)(例如，菌株NEM316、A909)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(例如，菌株F6854)、无害李斯特菌(Listeria innocua)(无害李斯特菌(L.innocua)(例如，菌株Clip11262))、意大利肠道球菌(Enterococcus italicus)(例如，菌株DSM15952)或屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(例如，菌株1,23,408)。另外的示例性Cas9分子是脑膜炎奈瑟菌(Hou等人，PNAS早期版2013，1-6)的Cas9分子和金黄色葡萄球菌Cas9分子。
在一个实施方案中，Cas9分子(例如活性Cas9分子或无活性Cas9分子)包含以下氨基酸序列:与本文描述的任何Cas9分子序列或天然存在的Cas9分子序列(例如，本文列出的或描述于Chylinski等人，RNA Biology 2013，10:5，727-737；Hou等人，PNAS早期版2013，1-6中的物种的Cas9分子)相比，具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性；与之不同不多于1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、或40％的氨基酸残基；与之不同至少1、2、5、10或20个氨基酸但不同不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或与之相同。
在一个实施方案中，Cas9分子包含以下氨基酸序列:与化脓链球菌Cas9(UniProtQ99ZW2)相比，具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同源性；与之不同不多于1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、或40％的氨基酸残基；与之不同至少1、2、5、10或20个氨基酸但不同不多于100、80、70、60、50、40或30个氨基酸；或与之相同。在一些实施方案中，Cas9分子是化脓链球菌Cas9变体，例如Slaymaker等人所述，Science Express，2015年12月1日在线提供在Science DOI:10.1126/science.aad5227；Kleinstiver等人，Nature，529,2016，pp.490-495，2016年1月6日在线提供在doi:10.1038/nature16526；或US2016/0102324，其内容通过整体引用并入本文作为参考。在一个实施方案中，Cas9分子是催化失活的，例如dCas9。Tsai等人(2014)，Nat.Biotech.32:569-577；美国专利号8,871,445；8865406；8795965；8771945；和8,697,359，其内容通过整体引用并入本文作为参考。无催化活性的Cas9例如dCas9分子可以与转录调节物例如转录阻遏物或转录激活物融合。
在实施方案中，Cas9分子(例如化脓链球菌的Cas9)可以另外包含赋予额外活性的一个或多个氨基酸序列。在一些方面，Cas9分子可以包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。通常，NLS由暴露于蛋白质表面的一个或多个带正电荷的赖氨酸或精氨酸的短序列组成，但其他类型的NLS是已知的。NLS的非限制性实例包括含有或衍生自具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:864)的SV40病毒大T抗原的NLS的NLS序列。其他合适的NLS序列是本领域已知的(例如，Sorokin，Biochemistry(莫斯科)(2007)72:13,1439-1457；Lange J Biol Chem.(2007)282:8,5101-5)。在任何上述实施方案中，Cas9分子可以另外(或替代地)包含标签，例如His标签，例如His(6)标签(SEQ IDNO:865)或His(8)标签(SEQ ID NO:866)，例如在N末端和/或C末端。
因此，例如用于真核细胞中的基因编辑的工程化CRISPR基因编辑系统通常涉及(1)引导RNA分子(gRNA)，包含靶向结构域(其能够与基因组DNA靶序列杂交)和能够结合Cas，例如Cas9酶的序列，和(2)Cas，例如Cas9蛋白。该第二结构域可以包含被称为tracr结构域的结构域。靶向结构域和能够与Cas(例如Cas9酶)结合的序列可以设置在相同的(有时称为单个gRNA、嵌合gRNA或sgRNA)或不同分子(有时称为双引导RNA、双gRNA或dgRNA)上。如果设置在不同的分子上，则各自包括允许分子例如通过杂交来缔合的杂交结构域。
gRNA分子形式在本领域中是已知的。本发明的示例性gRNA分子，例如dgRNA分子包含具有以下序列的第一核酸，例如由其组成:
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUG(SEQ ID NO:867)，
其中“n”是指靶向结构域的残基，例如KDM1A的靶向结构域，例如如本文所述，并且可以由15-25个核苷酸组成，例如由20个核苷酸组成；
和具有示例性序列的第二核酸序列:
AACUUACCAAGGAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC，任选地在3'末端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如7个)另外的U核苷酸(SEQ IDNO:868)。
第二核酸分子可以备选地由以上序列的片段组成，其中此类片段能够与第一核酸杂交。这种第二核酸分子的实例是:
AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC，任选地在3'末端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如7个)额外的U核苷酸(SEQ IDNO:869)。
本发明的另一个示例性gRNA分子，例如sgRNA分子包含具有以下序列的第一核酸，例如由其组成:
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnGUUUUAGAGCUAGAAAUAGUCAGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:870)，其中“n”是指靶向结构域的残基，例如KDM1A的靶向结构域，例如如本文所述，并且可以由15-25个核苷酸组成，例如，由20个核苷酸组成，任选地在3'末端具有1、2、3、4、5、6或7个(例如4或7个，例如4个)额外的U核苷酸。
表2中提供了用于本发明的gRNA分子靶向结构域的示例性序列(例如，其靶向LSD1基因，例如KDM1A)。
例如在美国公开号2014/0068797，WO2015/048577和Cong(2013)Science 339:819-823中描述了本领域已知的CRISPR基因编辑系统的其他组分和/或元件，其内容通过整体引用并入本文作为参考。通过例如工程化CRISPR基因编辑系统以包括含有与靶基因序列杂交的靶向结构域的gRNA分子，可以产生抑制靶基因的此类系统。在实施方案中，gRNA包含与靶基因例如KDM1A或其调控元件的15-25个核苷酸，例如20个核苷酸完全互补的靶向结构域。在实施方案中，靶基因的15-25个核苷酸，例如20个核苷酸被置于紧邻CRISPR基因编辑系统的被RNA引导的核酸酶(例如Cas蛋白)识别的原型间隔子相邻基序(PAM)序列5'(例如，当系统包含化脓链球菌Cas9蛋白质，PAM序列包含NGG，其中N可以是A，T，G或C中的任何一个)。
在实施方案中，CRISPR基因编辑系统的gRNA分子和RNA引导的核酸酶(例如Cas蛋白)可以复合以形成RNP复合物。在其他实施方案中，可以使用编码CRISPR基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。
在实施方案中，可以将外源DNA(例如编码所需转基因的DNA)连同CRISPR基因编辑系统一起引入细胞中，其中所述外源DNA具有或不具有对靶细胞类型有活性的启动子。根据外源DNA和基因组靶序列的序列，该方法可以用于将外源DNA整合到CRISPR基因编辑系统靶向的位点处或附近的基因组中。例如，侧接转基因的3'和5'序列可以包含在与由基因编辑系统切割的基因组中的位点的基因序列3'和5'(分别)同源的外源DNA中。可以称这种外源DNA分子为“模板DNA”。
在一个实施方案中，本发明的CRISPR基因编辑系统包含Cas9，例如化脓链球菌Cas9，和包含与目的基因如KDM1A序列杂交的靶向结构域的gRNA。在一个实施方案中，gRNA和Cas9复合形成RNP。在一个实施方案中，CRISPR基因编辑系统包含编码gRNA的核酸和编码Cas蛋白(例如Cas9，例如化脓链球菌Cas9)的核酸。在一个实施方案中，CRISPR基因编辑系统包含gRNA和编码Cas蛋白(例如Cas9，例如化脓链球菌Cas9)的核酸。
在一个示例性实施方案中，基因组编辑系统LSD1抑制剂是CRISPR系统。可用于实施本发明的CRISPR基因组编辑系统描述于例如使用本领域已知的技术(例如美国公开号20140068797和Cong(2013)Science 339:819-823中描述的技术)可以产生抑制LSD1的人工CRISPR/Cas系统。还可以产生本领域已知的其他人工CRISPR/Cas系统，其抑制TCR和/或HLA，例如描述于Tsai(2014)Nature Biotechnol.，32:6 569-576，美国专利号8,871,445；8865406；8795965；8771945；和8,697,359。
表2:示例性LSD1gRNA靶向结构域序列。
TALEN基因编辑系统
通过使TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合来人工产生TALEN。可以将转录活化物样效应物(TALEs)经工程化以结合任一目的DNA序列，例如靶基因。通过将工程化的TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对于任一目的DNA序列特异的限制性酶。然后，这些可以通过例如引入到细胞中被用于例如作为基因组编辑系统(例如TALEN基因编辑系统)的组分，其中它们可以用于基因编辑。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science 326:3501。
TALE是由黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌分泌的蛋白质。DNA结合结构域含有重复的、高度保守的33-34个氨基酸序列，但第12和13个氨基酸除外。这两个位置是高度可变的，显示与特定核苷酸识别的强相关性。因此，它们可以经工程化以结合目的DNA序列。
为了产生TALEN，将TALE蛋白质融合至核酸酶(N)，其例如是野生型或突变的FokI核酸内切酶。已经对FokI进行了几处突变以使其用于TALEN；这些例如改善了切割的特异性或活性。Cermak等人(2011)Nucl.Acids Res.39:e82；Miller等人(2011)NatureBiotech.29:143-8；Hockemeyer等人(2011)Nature Biotech.29:731-734；Wood等人(2011)Science 333:307；Doyon等人(2010)Nature Methods 8:74-79；Szczepek等人(2007)Nature Biotech.25:786-793；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.200:96。
FokI结构域以二聚体发挥作用，需要两个构建体，所述两个构建体具有针对靶基因组中的位点以合适的方向和间距分布的独特DNA结合结构域。在TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间的氨基酸残基数量和两个个体TALEN结合位点之间的碱基数量似乎是获得获得高水平活性的重要参数。Miller等人(2011)Nature Biotech.29:143-8。
可在细胞内使用TALEN(或TALEN对)以产生双链断裂(DSB)。如果修复机制经由非同源端结合不适当地修复所述断裂，则可以在所述断裂位点处引入突变。例如，不合适的修复可能引入移码突变。备选地，可以将外源DNA与TALEN，例如编码转基因的DNA一起引入到细胞中，并且取决于外源DNA的序列和染色体的序列，该过程可用于将转基因整合到由TALEN靶向的位点处或附近。可以使用本领域已知的任何方法构建特异于靶基因例如LSD1的TALEN，包括使用模块化组件的各种方案。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:e19509；US 8,420,782；US 8,470,973，其内容通过整体引用并入本文作为参考。
因此，在示例性实施方案中，基因组编辑系统LSD1抑制剂是针对LSD1基因例如KDM1A的序列的TALEN基因编辑系统。这样的系统在本领域中通常是已知的，并且可以使用已知方法产生特异于LSD1的TALEN基因组编辑系统。参见例如Boch(2011)NatureBiotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science326:3501；Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PLoS ONE 6:e19509；美国专利号8,420,782；美国专利号8,470,973。
锌指核酸酶(ZFN)基因编辑系统
“ZFN”或“锌指核酸酶”是指锌指核酸酶、人工核酸酶或核酸酶对，其可以用作例如ZFN基因编辑系统的一部分以在目的核酸序列(例如LSD1基因的目的序列)处或附近修饰(例如插入或删除)一个或多个核酸。
类似于TALEN，ZFN包含与DNA-结合结构域融合的FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况下，DNA-结合结构域包含一个或更多个锌指。Carroll等人(2011)Genetics Society of America 188:773-782；和Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:1156-1160。
锌指是被一个或更多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2，并且可以识别约3-bp序列。可以将具有已知特异性的多种锌指组合来产生多指多肽，其识别约6、9、12、15或18-bp序列。可获得多种选择和模块装配技术来产生识别特定序列的锌指(及其组合)，包括噬菌体展示、酵母菌单杂交系统、细菌单杂交系统和细菌双杂交系统及哺乳动物细胞。
类似于TALEN，ZFN必须二聚化才能切割DNA。因此，要求一对ZFN来靶向非回文结构的DNA位点。两个单个的ZFN必须与DNA的相对链结合，并且其核酸酶被适当地间隔隔开。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10570-5。
也类似于TALEN，ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果没有适合地修复，则其可以产生移码突变，导致细胞中靶基因的表达和数量降低。ZFN也可以被用于同源重组，以突变靶基因或基因座，或在靶序列处或附近引入编码目的靶基因的核酸。
使用本领域已知的任一方法可以构建对靶基因中的序列特异的ZFN。参见，例如Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230，其内容通过引用整体并入本文。在实施方案中，ZFN基因编辑系统还可以包含编码ZFN基因编辑系统的一种或多种组分的核酸。
因此，在示例性实施方案中，基因组编辑系统LSD1抑制剂是对LSD1基因(例如KDM1A)特异性的锌指核酸酶基因编辑系统。这种系统在本领域中通常是已知的，并且可以使用已知方法产生特异于LSD1的锌指核酸酶基因组编辑系统。参见例如Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；郭等人(2010)J.Mol.Biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。
在一个示例性实施方案中，基因组编辑系统LSD1抑制剂是大范围核酸酶系统。此类系统在本领域中通常是已知的，并且可以使用已知方法产生特异于LSD1的大范围核酸酶基因组编辑系统。
小分子LSD1抑制剂
在一个方面，LSD1抑制剂是小分子。示例性的小分子LSD1抑制剂在下面提供，并且另外的候选分子可以通过已知的测定法例如LSD1结合测定法和本文描述的测定法来鉴定。
有用的赖氨酸特异性脱甲基酶1(LSD1)抑制剂包括不可逆和可逆抑制剂。描述各种可逆和不可逆LSD1抑制剂的综述公开于Mold，Daniel P.等人“Reversible Inhibitorsof LSD1as Therapeutic Agents in Acute Myeloid Leukemia:Clinical Significanceand Progress to Date”，Med.Res.Rev.,35,No.3,586–618,(2015)；和Xheng,Yi-Choa等人，“A Systematic Review of Histone Lysine-Specific Demethylase 1and ItsInhibitors”Med.Res.Rev.,35,No.5,1032–1071,(2015)，其通过引用并入本文作为参考。合适的LSD1抑制剂也公开在PCT专利公开号WO07/021839；WO2010/043721；WO2010/084160；WO2011/035941；WO2011/042217；WO2012/013727；WO2012/034116；WO2012/071469；WO2012/135113；WO2013/057320；WO2013/057322；WO2014/205213；WO2015/031564；WO2015/123408；WO2015/123437；WO2015/123465；和WO2015/156417。下面描述了不可逆和可逆LSD1抑制剂的代表性实例。
示例性的不可逆LSD1抑制剂包括:GSK-LSD1(反式外消旋)二盐酸盐，rel-N-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-4-哌啶胺盐酸盐(1:2)(可获自Sigma-Aldrich)。苯环丙胺(Tranylcypromine)；N-[(1S,2R)-2-苯基环丙基]-4-哌啶甲胺(GSK2699537，描述于PCT公开号WO2013057320和WO2012135113中)；4-[[[4-[[(1R,2S)-2-苯基环丙基]氨基]甲基]-1-哌啶基]甲基]-苯甲酸或其可药用盐(GSK2879552，描述于PCT公开号WO2012135113)；反式-N1-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-1,4-环己烷二胺或其可药用盐(ORY-1001，描述于PCT公开号WO 2013057322)；rel-1-(4-甲基-1-哌嗪基)-2-[[(1R*,2S*)-2-[4-苯基甲氧基]苯基]环丙基]氨基]乙酮或其可药用盐(RN-1，描述于PCT公开号WO 2010043721)；rel-2-[[(1R,2S)-2-[4-[(4-氯苯基)甲氧基]苯基]环丙基]氨基]-1-(4-甲基-1-哌嗪基)乙酮或其可药用盐(描述于PCT公开号WO 2010043721)；4'-((1R,2S)-2-氨基环丙基)联苯-3-醇或其可药用盐(OG-L002，描述于PCT公开号WO 2012013727)；(1S,2R)-N-((2-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙-1-胺(描述于PCT公开号WO2010/084160)或其可药用盐。
示例性可逆LSD1抑制剂包括:Namoline(可获自ChemBridge，San Diego，CA)；3-(4-吗啉基磺酰基)-苯甲酸，(2E)-2-[1-(5-氯-2-羟基苯基)亚乙基]酰肼(SP-2509，描述于PCT公开号WO2014205213)；3-[[4-[4-(氨基亚氨基甲基]苯甲酰基]-1-哌嗪基]羰基]-5-[[4-(氨基亚氨基甲基)-1-哌嗪基]甲基]苯甲酸甲酯(CBB-1007，可获自DSK Biopharma，Inc.，并描述于PCT公开号WO2012/071469)；(R)-4-(5-(吡咯烷-3-基甲氧基)-2-(对甲苯基)吡啶-3-基)苄腈(GSK354)；N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺；5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈；和反式-3-(3-氨基-2-甲基苯基)-1-(4-羟基环己基)-6-甲基-1H-吲哚-5-甲腈；或前述任一种的可药用盐。
其他示例性LSD1抑制剂在下表3中提供。
表3
*由LCMS测量的LSD1IC50
根据本发明有用的小分子LSD1抑制剂还包括任何前述化合物的前药，衍生物，可药用盐或其类似物。
基于本文所述的特定剂量，小分子LSD1抑制剂可以基于本领域中公认的方法配制用于递送。
在实施方案中，LSD1小分子抑制剂可以缀合至抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对在T细胞表面表达的抗原具有特异性。
蛋白质LSD1抑制剂
在实施方案中，LSD1抑制剂可以是蛋白质LSD1抑制剂。在实施方案中，蛋白质LSD1抑制剂是LSD1的显性失活结合配偶体(例如，与LSD1相互作用的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或者Co-REST或AR共激活子复合物的其他成员)，或编码LSD1的所述显性失活的结合配偶体的核酸。在实施方案中，蛋白质LSD1抑制剂是显性失活的(例如催化失活的)LSD1或编码所述分子的核酸。
使用LSD1抑制剂制备免疫效应细胞群体的方法
本发明的特征在于LSD1抑制剂在免疫效应细胞群体的制造中的用途，所述免疫效应细胞群体例如经工程化以表达CAR分子，例如如本文所述。不受理论的束缚，本发明部分依赖于令人惊讶且出人意料的发现，即在免疫效应细胞(例如T细胞)中抑制LSD1导致具有更高数量和/或更高比例的幼稚免疫效应细胞(例如T细胞)，并且具有改善的治疗特性的免疫效应细胞群(例如T细胞)。在所述免疫效应细胞中抑制LSD1可以在包括所述细胞的疗法之前和/或同时发生。因此，本发明的一个方面涉及用于制备免疫效应细胞(例如T细胞)的LSD1抑制剂的组合物和用途。
在一个方面，本发明提供了制备免疫效应细胞群体的方法，所述免疫效应细胞群体任选为T细胞群，包括以下步骤：
a)使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触；
从而制备免疫效应细胞群体，其任选地为T细胞群体，
其中与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未接触的免疫效应细胞群体相比。
在实施方案中，该方法还包括步骤：b)将编码CAR的核酸插入免疫效应细胞群体的细胞中。在实施方案中，步骤a)的接触在步骤b)的所述插入1)之前；2)同时；3)之后；或者4)在之前和之后两者发生。在实施方案中，步骤a)的接触和任选地，步骤b)的插入是离体的。
在另一个方面，本发明提供了制备免疫效应细胞群体的方法，所述免疫效应细胞群体任选地是T细胞群体，包括任选地按所列顺序的步骤：
a)离体提供免疫效应细胞群体；
b)使免疫效应细胞群体离体与LSD1抑制剂接触；
从而制备免疫效应细胞群体，其任选地为T细胞群体，其中与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未接触的免疫效应细胞群体相比。
在实施方案中，该方法还包括以下步骤：c)将编码CAR的核酸插入到免疫效应细胞群体的细胞中。在实施方案中，步骤b)的接触在步骤c)的所述插入1)之前；2)同时；3)之后；或者4)在之前和之后两者发生。在实施方案中，步骤b)的接触和任选地，步骤c)的插入是离体的。
在另一个方面，本发明提供了制备免疫效应细胞群体的方法，所述免疫效应细胞群体任选地是T细胞群体，包括任选地按所列顺序的步骤：
a)向受试者施用LSD1抑制剂；
其中所述施用LSD1抑制剂导致所述受试者中发生以下一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与来自非施用给受试者的免疫效应细胞群体相比；
b)离体提供来自所述受试者的免疫效应细胞群体；
由此制备免疫效应细胞群体，其任选地是T细胞群体。
在实施方案中，该方法还包括以下步骤：c)将编码CAR的核酸插入到免疫效应细胞群体的细胞中。
在另一个方面，本发明提供了制备免疫效应细胞群体的方法，所述免疫效应细胞群体任选地是T细胞群体，包括任选地按所列顺序的步骤：
a)向受试者施用LSD1抑制剂；
b)离体提供来自所述受试者的免疫效应细胞群体；
c)使免疫效应细胞群体离体接触LSD1抑制剂；
从而制备免疫效应细胞群体，其任选地为T细胞群体，
其中发生以下一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未接触和未施用的免疫效应细胞群体相比。
在实施方案中，该方法还包括以下步骤：d)将编码CAR的核酸插入免疫效应细胞群体的细胞中。在实施方案中，步骤c)的接触在步骤d)的所述插入1)之前；2)同时；3)之后；或者4)在之前和之后两者发生。
在多个方面中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前向受试者施用LSD1抑制剂可能具有足够的时间和/或足够的剂量，从而发生以下一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未施用的免疫效应细胞群体相比。可以利用本文所述的测定法以便确定适当的施用剂量和时间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，将LSD1抑制剂施用至少1天的期间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少2天的期间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少3天的期间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少4天的期间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少5天的期间。在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少6天的期间。在实施方案中，在收集来自所述受试者的免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少7天的期间。在实施方案中，在收集来自所述受试者的免疫效应细胞群体之前，施用LSD1抑制剂至少一周或数周的时间。
在实施方案中，在从所述受试者收集免疫效应细胞后继续向受试者施用LSD1抑制剂，例如，在收集免疫效应细胞后继续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，例如，继续至少直到免疫效应细胞(离体修饰)回输施用给受试者，例如，继续直到免疫效应细胞(离体修饰)回输到受试者的时间。
在一些方面，LSD1抑制剂与免疫效应细胞群体的接触(例如，离体)可以具有足够的时间和/或足够的剂量，从而发生以下一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未接触的免疫效应细胞群体相比。可以利用本文所述的测定以便确定适当的施用剂量和时间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少1天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少2天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少3天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少4天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少5天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少6天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少7天的期间。在实施方案中，使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触至少一周或几周的时间。在实施方案中，在免疫效应细胞离体期间，含有LSD1抑制剂的培养基用含有LSD1抑制剂的新鲜培养基替换例如一次，两次，三次，四次，五次，六次，七次或多于七次(例如每天或每隔一天替换)。可以调节LSD1抑制剂的浓度以便发生期望的效应，并且可以是例如约0.001nM至约10mM，例如约0.01nM至约1mM，例如约0.1nM至约100μM，例如约1nM至约100μM，例如约10nM至约100μM，例如约100nM至约10μM，例如约0.001nM至约100nM，或例如约0.1μM至约10μM。在实施方案中，LSD1抑制剂的浓度是100nM。在实施方案中，LSD1抑制剂的浓度是约100μM。在实施方案中，LSD1抑制剂的浓度是200nM。在实施方案中，LSD1抑制剂的浓度为约200μM。
在另一个方面，本发明提供了用于离体制备免疫效应细胞群体的组合物，其包含LSD1抑制剂，例如小分子LSD1抑制剂。在实施方案中，组合物包含浓度为约0.001nM至约10mM，例如约0.001nM至约100nM，或例如约0.1μM至约10μM的小分子LSD1抑制剂。
在涉及经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如如本文所述)的实施方案中，应理解，所述方法可以进一步包括下面在涉及嵌合抗原受体的部分中描述的任何方面、步骤或特征。
用免疫效应细胞和LSD1抑制剂治疗的方法
本发明的特征在于使用LSD1抑制剂治疗患者的疾病例如癌症，其中所述治疗与施用免疫效应细胞群体(例如经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞，例如如本文所述)组合。不受理论的束缚，本发明部分依赖于令人惊讶且出人意料的发现，即LSD1在免疫效应细胞(例如T细胞)中的抑制导致具有更高数量的免疫效应细胞群(例如T细胞)和/或更高比例的幼稚免疫效应细胞，例如T细胞，并且具有改善的治疗特性。因此，本发明的一个方面提供了用免疫效应细胞群体(例如经工程化以表达CAR分子，例如，如本文所述)和LSD1抑制剂的组合治疗疾病(例如癌症)。
在一个方面，本发明的特征在于治疗受试者的方法，包括向受试者施用LSD1抑制剂，其中所述受试者已经接受、正在接受或即将接受经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体。在实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用LSD1抑制剂和经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体，例如如本文所述。在实施方案中，LSD1抑制剂在经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体(例如如本文所述)之前施用，并且其中所述LSD1抑制剂的施用在施用经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如如本文所述)后持续一段时间。在其他实施方案中，相比于在不存在所述LSD1抑制剂的情况下施用经工程化以表达CAR分子的等效免疫效应细胞群体(例如如本文所述)，在施用经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体(例如如本文所述)后施用LSD1抑制剂的量足以增加经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群(例如，如本文所述)的抗肿瘤作用。
在另一个方面，本发明的特征在于提高经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体(例如，如本文所述，例如CAR19(例如CTL019))的受试者的治疗功效的方法，包括步骤：至少暂时地降低所述细胞中LSD1的活性或表达。在实施方案中，降低所述细胞中LSD1的活性或表达的步骤包括使细胞与LSD1抑制剂接触。在实施方案中，接触是离体进行的。在实施方案中，接触在体内完成(例如，免疫效应细胞群体和LSD1抑制剂被共同施用给受试者)。
在任何上述方面的实施方案中，LSD1抑制剂的施用或接触导致:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多个(例如全部)的组合。
在实施方案中，效果是与未接触LSD1抑制剂的细胞相比的效果。在实施方案中，效果与未接触LSD1抑制剂的相同受试者的细胞相比。
在另一个方面，本发明提供了治疗受试者的方法，其包括:
a)向所述受试者施用LSD1抑制剂；
b)在所述LSD1抑制剂施用后，从所述受试者收集免疫效应细胞群体；
c)离体提供所述免疫效应细胞群体；
d)将所述免疫效应细胞的离体群体与所述LSD1抑制剂接触，其中与所述LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，与未接触的免疫效应细胞的离体群体相比较；和
e)向受试者施用免疫效应细胞群体。
在实施方案中，e)的步骤还包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。在实施方案中，该方法还包括将编码CAR的核酸插入到免疫效应细胞的离体群体的细胞中的步骤。
在另一个方面，本发明提供治疗有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的前述方面和实施方案中任一项的免疫效应细胞群体。在实施方案中，该方法还包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。在实施方案中，受试者在施用免疫效应细胞群体之前接受LSD1抑制剂的预治疗。在实施方案中，受试者接受用LSD1抑制剂和免疫效应细胞群体的同时治疗。在实施方案中，受试者在免疫效应细胞群体施用后接受LSD1抑制剂的治疗；在实施方案中，受试者接收任何前述的组合。
在一个方面，包括与治疗方法有关的前述方面，本发明涉及治疗受试者的方法，其中所述受试者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如增殖性疾病，癌症前期病症，癌症以及与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。在实施方案中，癌症是选自慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性白血病，急性淋巴样白血病(ALL)，急性髓样白血病(AML)，B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)，慢性粒细胞白血病(CML)，B细胞幼淋巴细胞白血病，浆细胞样树突细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，或白血病前期。在实施方案中，癌症选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈部癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门癌，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌腺体，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统肿瘤(CNS)，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，脑干神经胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱导的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病变。
在涉及经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如如本文所述)的实施方案中，应理解，治疗方法可进一步包括下面在与嵌合抗原受体有关的部分中描述的任何步骤、方面或特征。
细胞
如本领域技术人员根据本公开将显而易见的，本发明涉及包含LSD1抑制剂的细胞。本发明进一步包括已经与LSD1抑制剂接触的细胞，例如持续一段时间和/或以足以使一种或多种下列情况发生的剂量:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
任选地，相对于未接触的细胞。
本发明还涉及通过本文所述的任何方法制备的细胞。
细胞优选是免疫效应细胞。在一个实施方案中，细胞是T细胞。在一个实施方案中，细胞是NK细胞。在实施方案中，本发明涉及本发明的细胞群，例如本发明的免疫效应细胞群体。在实施方案中，本发明的细胞群体包含所示类型的细胞，并且可以包含其他类型的细胞(例如经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体，例如T细胞，例如如本文所述，可以包括经工程化以表达CAR分子的T细胞以及尚未经工程化以表达CAR分子的T细胞(或其他细胞类型))。在实施方案中，本发明的细胞群基本上由所示类型的细胞组成。在实施方案中，本发明的细胞群体基本上不含其他细胞类型。在实施方案中，本发明的细胞群由指定的细胞类型组成。
在任何上述方面和实施方案中，细胞和/或细胞群是或包括免疫效应细胞，例如免疫效应细胞群体包含T细胞或NK细胞，例如由其组成。在实施方案中，细胞是T细胞，例如CD8+T细胞、CD4+T细胞或它们的组合。在实施方案中，细胞是NK细胞。
在实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是自体的，例如对于待施用该细胞的受试者而言是自体的。在实施方案中，细胞是同种异体的，例如对于待施用该细胞的受试者而言是同种异体的。
在一些实施方案中，细胞是或包括经工程化以表达CAR分子的细胞，例如如本文所述。用于本发明的细胞的其他特征和/或方面在下面标题为嵌合抗原受体的部分描述。
在一个实施方案中，表达CAR分子例如本文所述的CAR分子的免疫效应细胞，是获自已接受LSD1抑制剂的受试者。在一个实施方案中，在给予LSD1抑制剂足够时间后或足量后收获待经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞群体(例如T细胞)，以使在受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞例如T细胞或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率至少暂时地增加。
在其他实施方案中，具有或将经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的免疫效应细胞(例如T细胞)群体可以通过与一定量的增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)的数量或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率的LSD1抑制剂接触来离体治疗。
在一个实施方案中，NK细胞获自受试者。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92细胞系(Conkwest)。
在一个实施方案中，在向受试者施用LSD1抑制剂后，从受试者获得或收获免疫效应细胞，例如T细胞。
在一个实施方案中，免疫效应细胞例如T细胞在PD1阴性免疫效应子(例如T细胞)数量增加之后或在PD1阴性免疫效应子(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应子(例如T细胞)的比率增加已经发生后收集。
在一个实施方案中，免疫效应细胞例如T细胞在发生幼稚T细胞数目增加之后收集。
在一个实施方案中，免疫效应细胞例如T细胞在以下一种或多种后收集:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
增加或减少可以是暂时的。增加或减少可以是永久性的。增加或减少可以与标准，例如来自未经治疗的受试者的细胞比较。
在实施方案中，使免疫效应细胞例如T细胞与LSD1抑制剂离体(在从受试者或供体移出后并在引入至受试者之前)接触。
在一个实施方案中，接触处于导致PD1阴性免疫效应子(例如T细胞)数量增加或PD1阴性免疫效应细胞(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应子(例如T细胞)的比率增加的水平。
在一个实施方案中，使免疫效应细胞(例如T细胞)与LSD1抑制剂以导致幼稚T细胞的数量增加的水平离体接触(在从受试者或供体移出后且在引入至受试者之前)。
在一个实施方案中，使免疫效应细胞(例如T细胞)与LSD1抑制剂离体(在从受试者或供体移出后且在引入至受试者之前)接触，其水平导致以下一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
增加或减少可以是暂时的。增加或减少可以是永久性的。增加或减少可以与标准，例如来自未经治疗的受试者的细胞比较。
在一个实施方案中，评估T细胞的制备物的PD1阴性免疫效应子(例如T细胞)数量增加，或PD1阴性免疫效应子(例如T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如T细胞)的比率增加的水平。
在一个实施方案中，对T细胞的制备物评估幼稚T细胞数量的增加水平。在一个实施方案中，对T细胞的制备物评估以下中的一种或多种:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上的二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或更多(例如全部)的组合；
增加或减少可以是暂时的。增加或减少可以是永久性的。增加或减少可以是与标准，例如未治疗的受试者的细胞比较。
药物组合物:LSD1抑制剂
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含配制成用作药物的LSD1抑制剂，例如本文所述的LSD1抑制剂。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含配制用于制备免疫效应细胞群体的LSD1抑制剂，例如本文所述的LSD1抑制剂。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含配制成与本文所述的CAR细胞组合使用的LSD1抑制剂，例如本文所述的LSD1抑制剂。
在一些实施方案中，将LSD1抑制剂配制成除了CAR细胞(例如，如本文所述)外还与另一种药剂组合施用。
一般而言，本发明化合物将以如上所述的治疗有效量经由本领域已知的任何常规和可接受的模式(单独或与一种或多种治疗剂组合)施用。
药物制剂可以使用常规溶解和混合程序来制备。例如，在本文所述的一种或多种赋形剂存在下，将散装药物物质(例如LSD1抑制剂或该化合物的稳定化形式(例如与环糊精衍生物或其他已知络合剂的复合物)溶解在合适的溶剂中。通常将LSD1抑制剂配制成药物剂型以提供易于控制的药物剂量并给患者提供优雅且易于处理的产品。
本发明化合物可通过任何常规途径以药物组合物的形式施用，特别是肠内如口服，例如以片剂或胶囊的形式；或者胃肠外，例如以可注射溶液或悬液的形式；局部，例如以洗剂、凝胶、软膏或乳膏的形式，或者以鼻用和栓剂的形式。当LSD1抑制剂与本文所述另一种药剂组合施用(与其同时或分开施用)时，在一个方面，两种组分可以通过相同途径(例如胃肠外)施用。备选地，另一种药剂可以通过相对于LSD1抑制剂的不同途径施用。例如，LSD1抑制剂可以口服给药并且另一种药剂可以肠胃外给药。包含游离形式或可药用盐形式的LSD1抑制剂和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物可通过混合、制粒或包衣方法以常规方式制备。例如，口服组合物可以是含有活性成分和下列物质的片剂或明胶胶囊:a)稀释剂，如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，如二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还含有c)粘合剂，如硅酸镁铝、淀粉糊剂、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；根据需要d)崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或e)吸附剂、着色剂、调味剂和增甜剂。口服制剂还可以包含活性成分以及20-60％Eudragit EPO，羟丙基纤维素EF，羟丙基甲基纤维素或Kollidon VA64，以及多达5％的普朗尼克F68，Cremophor EL或Gelucire 44/14。可注射的组合物可以是含水等渗溶液或悬液，且栓剂可由脂肪乳剂或悬液制备。此类组合物可以是无菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、促溶剂、用于调控渗透压的盐和/或缓冲液。此外，它们也可以含有其他治疗有价值的物质。适合的用于透皮施用的制剂包括有效量的本发明化合物和载体。载体可包括有助于通过宿主皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置是绷带的形式，包括背衬部件、含有化合物，任选地还含有载体的储库、任选的速率控制屏障用来以可控且预设的速率在延长的时段内递送化合物至宿主皮肤、和固定装置至皮肤的元件。还可使用基质(matrix)透皮制剂。在另一个方面，本文所述的LSD1抑制剂可以通过微针贴片施用。基于微针的药物递送在本领域中是公知的(参见例如美国专利8,162,901)，并且本领域技术人员可以调整这些技术和方法用于施用如本文所述的LSD1抑制剂。用于局部应用例如应用至皮肤和眼睛的适合制剂优选为本领域中熟知的含水溶液、软膏剂、乳膏剂或凝胶剂。这些制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
取决于用于施用药物的方法，用于施用的药物组合物(或制剂)可以以多种方式包装。通常，用于分配的物品包括具有以适当形式在其中保存有药物制剂的容器。合适的容器对于本领域技术人员来说是公知的，并且包括诸如瓶子(塑料瓶和玻璃瓶)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒等的材料。该容器还可以包括防篡改装置以防止不恰当地接近包装内容物。另外，容器上已经放置了描述容器内容物的标签。标签还可包括适当的警告。本发明还提供了药物组合，例如试剂盒，其包括a)第一剂，其为游离形式或可药用盐形式的本文所公开的LSD1抑制剂，和b)至少一种额外的药剂。所述试剂盒可包含用于其施用的说明书。
如本文所用的术语“药物组合”是指通过将多于一种活性成分混合或组合而形成的产品，并且包括活性成分的固定和非固定组合。术语“固定组合”是指以单一实体或剂量的形式同时对患者施用活性成分如LSD1抑制剂和其他药剂。术语“非固定组合”是指以分离实体同时、并行或没有特定时间限制地依次对患者施用活性成分如LSD1抑制剂和其他药剂，其中这种施用提供了2种化合物在患者体内的治疗有效水平。后者还用于鸡尾酒疗法，例如3种或更多种活性成分的施用。
嵌合抗原受体
与本发明相关的嵌合抗原受体技术的一般描述
本文描述了将LSD1抑制剂的施用与经工程化以表达CAR分子(例如，如本文所述)的免疫效应细胞群体(例如T细胞或NK细胞)(细胞经工程化以表达CAR，并且在一些实施方案中，在细胞被施用于受试者时表达CAR。在其他实施方案中，表达在施用后启动)的施用组合的方法。在一些实施方案中，细胞是经工程化以表达CAR分子的T细胞，例如如本文所述，其中CAR T细胞(“CART”)表现出抗癌性质。本文还描述了使用LSD1抑制剂来制造例如激活和/或扩增经工程化以表达CAR分子的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的群体(例如如本文所述)的方法，其中相对于不使用LSD1抑制剂制造的细胞而言，该细胞具有增强的活性(例如增殖、细胞因子释放和/或肿瘤靶向功效)和/或较幼稚的表型。通常，本节中讨论的分子、细胞、方法或其他方面可用于本发明的方法、组合物、细胞和其他方面，例如与LSD1抑制剂组合。
通常，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含结合如本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域)和胞内信号传导结构域(例如本文所述的胞内信号传导结构域)(例如，包含共刺激结构域的胞内信号传导结构域(例如本文所述的共刺激结构域和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)的胞内信号传导结构域。在其他方面，本发明包括:含有上述核酸和由这些核酸分子编码的分离蛋白的宿主细胞。与本发明相关的CAR核酸构建体、编码的蛋白质、包含的载体、宿主细胞、药物组合物以及施用和治疗方法在国际专利申请公开号WO2015/142675中详细描述，其全部内容通过引用并入本文作为参考。
在一个方面，本发明涉及编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中CAR包含结合肿瘤支持抗原(例如，如本文所述的肿瘤支持抗原)的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)，跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和细胞内信号传导结构域(例如本文描述的细胞内信号传导结构域)(例如，包含共刺激结构域(例如，本文所述的共刺激结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，肿瘤支持抗原是存在于基质细胞或骨髓样衍生的抑制细胞(MDSC)上的抗原。在其他方面，本发明的特征在于由这些核酸编码的多肽和含有这些核酸和/或多肽的宿主细胞。在其他方面，本发明的特征在于经工程化以表达CAR分子的细胞(例如细胞群)，例如免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞，例如如本文所述。
靶标
本发明提供免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)，其经工程化以含有一种或多种将免疫效应细胞导向不需要的细胞(例如癌细胞)的CAR。这是通过CAR上对癌相关抗原特异的抗原结合结构域实现的。有两类可以被本发明的CAR靶向的癌相关抗原(肿瘤抗原):(1)在癌细胞表面上表达的癌相关抗原；和(2)这样的癌相关抗原，其本身是细胞内的抗原，但是这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
在一些实施方案中，肿瘤抗原选自以下中的一种或多种:CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素-13受体亚单位α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1、细胞表面相关物(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；Prostase；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；EphrinB2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain)亚单位β型9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断点簇区域(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同系物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；ephrinA型受体2(EphA2)；岩藻糖GM1；唾液酸路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标志1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标志7相关物(TEM7R)；claudin6(CLDN6)；甲状腺刺激激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组D成员(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性(placenta-specific)1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(glycoceramide)的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；pannexin3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；Wilms肿瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；幸存(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳凝集素8(Galectin8))，被T细胞识别的黑素瘤抗原1(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽髓细胞瘤病病毒癌基因神经母细胞瘤衍生的同系物(MYCN)；Ras同系物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P4501B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节因子兄弟(Brother ofthe Regulator of Imprinted Sites))、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白(proacrosin)结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异的蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(renal ubiquitous 1)(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；legumain；人乳头瘤病毒E6(UPVE6)；人乳头瘤病毒E7(UPVE7)；肠羧基酯酶；突变的热休克蛋白70-2(muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样蛋白2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Glypican-3，GPC3)；Fc受体样蛋白5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
本文所述的CAR可以包含结合肿瘤支持抗原(例如，如本文所述的肿瘤支持抗原)的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)。在一些实施方案中，肿瘤支持抗原是存在于基质细胞或骨髓样衍生的抑制细胞(MDSC)上的抗原。基质细胞可以分泌生长因子以促进微环境中的细胞分裂。MDSC细胞可以抑制T细胞增殖和激活。不希望受理论的束缚，在一些实施方案中，CAR表达细胞破坏肿瘤支持细胞，从而间接抑制肿瘤生长或存活。
在实施方案中，基质细胞抗原选自骨髓基质细胞抗原2(BST2)，成纤维细胞激活蛋白(FAP)和肌腱蛋白中的一种或多种。在一个实施方案中，FAP特异性抗体是西布罗珠单抗(sibrotuzumab)、与西布罗珠单抗(sibrotuzumab)竞争结合、或具有与西布罗珠单抗相同CDR的抗体。在实施方案中，MDSC抗原选自CD33，CD11b，C14，CD15和CD66b中的一种或多种。因此，在一些实施方案中，肿瘤支持抗原选自骨髓基质细胞抗原2(BST2)，成纤维细胞激活蛋白(FAP)或肌腱蛋白，CD33，CD11b，C14，CD15和CD66b中的一种或多种。
抗原结合结构域结构
在一些实施方案中，编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如双特异性)杂合抗体(例如Lanzavecchia等人，Eur.J.Immunol.17,105(1987))。
在一些情况中，scFv可以根据本领域已知的方法制备(参见例如Bird等人，(1988)Science 242:423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。scFv分子可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起而产生。scFv分子可以含有具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如Ser-Gly接头)。接头长度可以很大地影响scFv的可变区折叠和相互作用的方式。事实上，如果使用短多肽接头(例如5-10个氨基酸)，将妨碍链内折叠。此外也需要链间折叠以将两个可变区拉到一起以形成功能性表位结合位点。接头取向和大小的例子可以参见例如，Hollinger等人，1993Proc NatlAcad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543，2005/0175606，2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，这些文献的内容特此并入作为参考。
scFv可以在其VL和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。另一实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复，例如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保持或增强活性，在活性研究中引起优异的功效。
在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如单链TCR(scTCR)。制造这种TCR的方法在本领域中是已知的。参见例如Willemsen RA等人，GeneTherapy 7:1369-1377(2000)；Zhang T等人，Cancer Gene Ther 11:487-496(2004)；Aggen等人，Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献全文并入本文)。例如，可以工程化scTCR，其含有通过接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα和Vβ基因。这种方法对这样的癌症相关的靶标非常有用，其本身是胞内，但这种抗原(肽)的片段通过MHC呈现在癌细胞的表面上。
在一些实施方案中，编码的抗原结合结构域具有10-4M至10-8M的结合亲和力KD。
在一个实施方案中，编码的CAR分子包含抗原结合结构域，其对于靶抗原具有10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M的结合亲和力KD。在一个实施方案中，抗原结合结构域具有比参考抗体(例如，本文所述的抗体)低至少5倍，10倍，20倍，30倍，50倍，100倍或1000倍的结合亲和力。在一个实施方案中，编码的抗原结合结构域具有比参考抗体(例如，从其衍生抗原结合结构域的抗体)小至少5倍的结合亲和力。在一个方面，这样的抗体片段是功能性的，因为它们提供生物反应，所述生物反应可以包括但不限于免疫反应激活，从其靶抗原的信号转导起始抑制，激酶活性抑制等，如技术人员将理解的那样。
在一个方面，CAR的抗原结合结构域是与其衍生的scFv的鼠科序列相比被人源化的scFv抗体片段。
在一个方面，本发明的CAR的抗原结合结构域(例如scFv)由核酸分子编码，所述核酸分子的序列已经对在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。在一个方面，本发明的整个CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的整个序列已经对在哺乳动物细胞中表达进行了密码子优化。密码子优化是指在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)出现的频率偏向于不同物种的发现。这种密码子简并性允许相同的多肽由多种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域已知的，并且包括例如至少美国专利号5,786,464和6,114,148中公开的方法。
特异性抗原结合结构域
在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的CAR部分包含靶向肿瘤抗原的抗原结合结构域，例如本文中描述的肿瘤抗原(例如，标题为“靶标”的部分)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675中描述的肿瘤抗原，其全文通过整体引用并入本文作为参考。可以使用CAR表达细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于，CD19，CD123，EGFRvIII，CD33，间皮素，BCMA和GFRα-4等，如例如描述于WO2014/153270，WO2014/130635，WO2016/028896，WO 2014/130657，WO2016/014576，WO 2015/090230，WO2016/014565，WO2016/014535和WO2016/025880，其各自通过整体引用并入本文作为参考。
在实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文描述的抗体或通过引用并入本文的任何公开中的抗体的一个、两个、三个(例如全部三种)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HCCDR3，和/或来自本文描述的抗体或通过引用并入本文的任何公开中的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本文描述的或在通过引用并入本文的任何公开中的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在一个实施方案中，本文所述的任何CAR分子的(例如，CD19，CD123，EGFRvIII，CD33，间皮素，BCMA和GFRα-4中的任何一种的)抗原结合结构域包含来自本文描述的或在通过引用并入本文的任何公开中的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HCCDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文描述的或通过引用并入本文的任何公开中的抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本文描述的或在通过引用并入本文的任何公开中的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文所述抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3(例如WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230所述的抗体，通过引用并入本文)和/或来自本文所述抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3(例如WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230所述的抗体，通过引用并入本文)。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区。在实施方案中，抗原结合结构域是描述于WO2015/142675，US-2015-0283178-A1，US-2016-0046724-A1，US2014/0322212A1，US2016/0068601A1，US2016/0051651A1，US2016/0096892A1，US2014/0322275A1或WO2015/090230的抗原结合结构域，其通过引用并入本文作为参考。
在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是例如在PCT公开WO2012/079000；PCT公开WO2014/153270；Kochenderfer，J.N.等人，J.Immunother.32(7)，689-702(2009)；Kochenderfer，J.N.等人，Blood，116(20)，4099-4102(2010)；PCT公开WO2014/031687；Bejcek，Cancer Research，55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190中描述的CAR(例如CD19 CAR)、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，CD19 CAR包括根据WO2014/153270(通过引用并入本文)的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2014/153270中具体说明。在实施方案中，CD19 CAR或抗原结合结构域包含WO2014/153270(通过引用并入本文)中所示的氨基酸或具有WO2014/153270(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述序列至少85％、90％、95％或更高同一)。
在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如scFv。例如，抗原结合结构域包含表6-9中列出的可变重链和可变轻链，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述序列至少85％、90％、95％或更高同一)。连接可变重链和可变轻链的接头序列可以是例如本文所述的任何接头序列，或者可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQID NO:871)。
表6:抗CD19抗体结合结构域
表7:额外的抗CD19抗体结合结构域
表8:额外的鼠抗CD19抗体结合结构域
根据本公开可以使用任何CD19 CAR，例如任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；描述于US Pat.No.8,399,645；US Pat.No.7,446,190；Xu等人，LeukLymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人，Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人，Blood，118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人，Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人，Blood 122(25):4129-39(2013)；和16th Annu MeetAm Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst 10中的CD19CAR。
在一个实施方案中，针对EGFRvIII的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2014/130657或US2014/0322275A1中描述的CAR、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，CAR分子包含EGFRvIII CAR或根据WO2014/130657的表2或SEQ IDNO:11的抗原结合结构域，其通过引用并入本文，或与其基本上同一(例如至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130657中具体说明。
在一个实施方案中，抗间皮素的抗原结合结构域是例如PCT公开WO2015/090230中所述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，抗间皮素的抗原结合结构域是例如PCT公开WO1997/025068，WO1999/028471，WO2005/014652，WO2005/WO2006/099141，WO2009/045957，WO2009/068204，WO2013/142034，WO2013/040557或WO2013/063419中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的间皮素CAR。在实施方案中，间皮素CAR包含WO 2015/090230(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有WO 2015/090230(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述间皮素CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。在一个实施方案中，CAR分子包含间皮素CAR或根据WO2015/090230的表2-3的抗原结合结构域，其通过引用并入本文，或与其基本上同一的序列(例如与其至少85％，90％，95％或更高同一)。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2015/090230中具体说明。
在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2016/028896中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是例如PCT公开WO2014/130635中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是例如PCT公开WO2014/138805，WO2014/138819，WO2013/173820，WO2014/144622，WO2001/66139，WO2010/126066，WO2014/144622或US2009/0252742中所述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR，二者均通过引用并入本文作为参考。在实施方案中，CD123 CAR包含US2014/0322212A1或US2016/0068601A1(二者均通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1(二者均通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述CD123 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。在一个实施方案中，CAR分子包含根据WO2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的CD123 CAR(例如CAR1-CAR8中的任一者)或抗原结合结构域，或与其基本上同一的序列(例如，与任何上述CD123 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VLCDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130635中具体说明。
在其他实施方案中，CAR分子包含CD123 CAR，所述CD123 CAR包含根据WO2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的CAR分子(例如，CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任何一种)或抗原结合结构域，或与其基本上同一的序列(例如，与任何前述CD123CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/028896中具体说明。
在一个实施方案中，针对CD22的抗原结合结构域是例如Haso等人，Blood，121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人，Clin Cancer Res16(6):1894-1903(2010)；Kato等人，LeukRes 37(1):83-88(2013)；Creative BioMart(creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CS-1的抗原结合结构域是Elotuzumab(BMS)的抗原结合部分，例如CDR，参见例如Tai等人，2008，Blood 112(4):1329-37；Tai等人，2007，Blood.110(5):1656－63。
在一个实施方案中，针对CLL-1的抗原结合结构域是可获自R&D，ebiosciences，Abcam，的抗体的抗原结合部分，例如CDR，例如PE-CLL1-hu Cat#353604(BioLegend)和PE-CLL1(CLEC12A)Cat#562566(BD)。
在其他实施方案中，CLL1 CAR包括根据WO2016/014535(其通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域。编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014535中具体说明。
在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是例如Bross等人，Clin CancerRes 7(6):1490-1496(2001)(Gemtuzumab Ozogamicin,hP67.6)，Caron等人，Cancer Res52(24):6761-6767(1992)(Lintuzumab，HUM195)，Lapusan等人，Invest New Drugs 30(3):1121-1131(2012)(AVE9633),Aigner等人，Leukemia 27(5):1107-1115(2013)(AMG330,CD33BiTE),Dutour等人，Adv hematol 2012:683065(2012),和Pizzitola等人，Leukemiadoi:10.1038/Lue.2014.62(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。在实施方案中，CD33CAR包含US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述CD33CAR序列至少85％，90％，95％或更多同一)。在其他实施方案中，CD33 CAR CAR或其抗原结合结构域可以包括根据WO2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CAR分子(例如，CAR33-1至CAR-33-9中的任何一个)或抗原结合结构域，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如，与任何上述CD33 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014576中具体说明。
在一个实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是例如在Mujoo等人，CancerRes.47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人，Cancer Res45(6):2642-2649(1985),Cheung等人，J Clin Oncol 5(9):1430-1440(1987),Cheung等人，J Clin Oncol 16(9):3053-3060(1998),Handgretinger等人，Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204(1992)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是选自mAb 14.18,14G2a,ch14.18,hu14.18,3F8,hu3F8,3G6,8B6,60C3,10B8,ME36.1和8H9的抗体的抗原结合部分，参见例如WO2012033885，WO2013040371，WO2013192294，WO2013061273，WO2013123061，WO2013074916和WO201385552。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是美国公开号20100150910或PCT公开号WO 2011160119中描述的抗体的抗原结合部分。
在一个实施方案中，针对BCMA的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2016/014565中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR，例如如WO2016/014565所述的CAR BCMA-10的抗原结合部分。在一个实施方案中，针对BCMA的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2016/014789中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，针对BCMA的抗原结合结构域是在例如WO2012/163805，WO2001/12812和WO2003/062401中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在其他实施方案中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子或针对BCMA的抗原结合结构域，例如US-2016-0046724-A1或WO2016/014565中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含US-2016-0046724-A1或WO2016/014565(通过引用并入本文)的表1或16，SEQID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子或抗原结合结构域的氨基酸或具有根据US-2016-0046724-A1或WO2016/014565(通过引用并入本文)的表1或16，SEQ ID NO:271或SEQ IDNO:273的CAR分子或抗原结合结构域的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如，与任何上述BCMA CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014565中具体说明。
在一个实施方案中，针对GFRα-4 CAR抗原的抗原结合结构域是在例如WO2016/025880(通过引用并入本文)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。在一个实施方案中，CAR分子包含根据WO2016/025880(通过引用并入本文)的表2的GFRα-4 CAR，例如CAR分子或抗原结合结构域，或与任何前述序列基本上同一的序列(例如，与任何前述GFRα-4序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码GFRα-4 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/025880中具体说明。
在一个实施方案中，针对Tn抗原的抗原结合结构域是在例如US8,440,798；Brooks等人，PNAS107(22):10056-10061(2010)和Stone等人，OncoImmunology 1(6):863-873(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对PSMA的抗原结合结构域是例如Parker等人，ProteinExpr Purif 89(2):136-145(2013)，US 20110268656(J591ScFv)；Frigerio等人，EuropeanJ Cancer 49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAbs 3/A12，3/E7和3/F11)和单链抗体片段(scFv A5和D7)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对ROR1的抗原结合结构域是例如Hudecek等人，ClinCancer Res 19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US20130101607中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对FLT3的抗原结合结构域是例如WO2011076922，US5777084，EP0754230，US20090297529中描述的抗体和若干商业目录抗体(R&D，ebiosciences，Abcam)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对TAG72的抗原结合结构域是例如Hombach等人，Gastroenterology 113(4):1163-1170(1997)和Abcam ab691中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对FAP的抗原结合结构域是例如Ostermann等人，ClinicalCancer Research 14:4584-4592(2008)(FAP5)，US专利公开号2009/0304718中所述的抗体；sibrotuzumab(参见例如，Hofheinz等人，Oncology Research and Treatment 26(1)，2003)；和Tran等人，J Exp Med 210(6):1125-1135(2013)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD38的抗原结合结构域是达拉木单抗的抗原结合部分，例如CDR(参见例如Groen等人，Blood 116(21):1261-1262(2010)；MOR202(参见例如，US8,263,746)；或US8,362,211中描述的抗体。
在一个实施方案中，针对CD44v6的抗原结合结构域是例如Casucci等人，Blood122(20):3461-3472(2013)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CEA的抗原结合结构域是例如Chmielewski等，Gastoenterology 143(4):1095-1107(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自MT110，EpCAM-CD3双特异性Ab(参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；Edrecolomab；3622W94；ING-1；和adecatumumab(MT201)的抗体的抗原结合部分(例如CDRS)。
在一个实施方案中，针对PRSS21的抗原结合结构域是US专利号8,080,650中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对B7H3的抗原结合结构域是抗体MGA271(Macrogenics)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对KIT的抗原结合结构域是例如US7915391，US20120288506中描述的抗体和若干商业目录抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是例如WO2008/146911，WO2004087758，几种商业目录抗体和WO2004087758中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD30的抗原结合结构域是例如US7090843B1和EP0805871中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对GD3的抗原结合结构域是例如US7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761；WO2005035577；和US6437098中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD171的抗原结合结构域是例如Hong等人，J Immunother37(2):93-104(2014)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对IL-11Rα的抗原结合结构域是可从Abcam(cat#ab55262)或Novus Biologicals(cat#EPR5446)购买的抗体的抗原结合部分，例如CDR。在另一个实施方案中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是肽，参见例如Huang等人，Cancer Res 72(1):271-281(2012)。
在一个实施方案中，针对PSCA的抗原结合结构域是例如Morgenroth等人，Prostate 67(10):1121-1131(2007)(scFv 7F5)；Nejatollahi等人，J of Oncology 2013(2013)，文章ID 839831(scFv C5-II)；和美国专利公开号20090311181中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对VEGFR2的抗原结合结构域是例如Chinnasamy等人，JClin Invest 120(11):3953-3968(2010)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对LewisY的抗原结合结构域是例如Kelly等人，CancerBiother Radiopharm 23(4):411-423(2008)(hu3S193Ab(scFv))；Dolezal等人，ProteinEngineering 16(1):47-56(2003)(NC10scFv))中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD24的抗原结合结构域是例如Maliar等人，Gastroenterology 143(5):1375-1384(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(CellSignaling)或其他商业上可获得的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗，Ofatumumab，Ocrelizumab，维妥珠单抗或GA101的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或US20120009181；US4851332，LK26:US5952484中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗，帕尼单抗，扎鲁木单抗，尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对NCAM的抗原结合结构域是抗体克隆2-2B:MAB5324(EMDMillipore)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对肝配蛋白B2的抗原结合结构域是例如Abengozar等人，Blood 119(19):4565-4576(2012)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对IGF-I受体的抗原结合结构域是例如US8344112B2；EP2322550 A1；WO 2006/138315或PCT/US2006/022995中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&DSystems)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对LMP2的抗原结合结构域是例如US7,410,640或US20050129701中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对gp100的抗原结合结构域是抗体HMB45，NKIβB或WO2013165940或US20130295007中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对酪氨酸酶的抗原结合结构域是例如US5843674；或US19950504048中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对EphA2的抗原结合结构域是例如在Yu等人，Mol Ther 22(1):102-111(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对GD3的抗原结合结构域是例如US7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761A3；20120276046；WO2005035577；或US6437098中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对岩藻糖基GM1的抗原结合结构域是例如US20100297138；或WO2007/067992中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对sLe的抗原结合结构域是抗体G193(对于lewis Y)的抗原结合部分，例如CDR，参见Scott AM等人，Cancer Res 60:3254-61(2000)，也描述于Neeson等人，J Immunol May 2013 190(会议摘要增本(Meeting Abstract Supplement))177.10中。
在一个实施方案中，针对GM3的抗原结合结构域是抗体CA2523449(mAb 14F7)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对HMWMAA的抗原结合结构域是例如在Kmiecik等人，Oncoimmunology 3(1):e27185(2014)(PMID:24575382)(mAb9.2.27)；US6528481；WO2010033866；或US 20140004124中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对邻乙酰基-GD2的抗原结合结构域是抗体8B6的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对TEM1/CD248的抗原结合结构域是例如Marty等人，CancerLett 235(2):298-308(2006)；Zhao等人，J Immunol Methods 363(2):221-232(2011)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CLDN6的抗原结合结构域是抗体IMAB027(GanymedPharmaceuticals)的抗原结合部分，例如CDR，参见例如clinicaltrial.gov/show/NCT02054351。
在一个实施方案中，针对TSHR的抗原结合结构域是在例如US8,603,466；US8,501,415；或US8,309,693中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对GPRC5D的抗原结合结构域是抗体FAB6300A(R&DSystems)；或LS-A4180(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD97的抗原结合结构域是在例如US6,846,911；de Groot等人，J Immunol 183(6):4127-4134(2009)中描述的抗体；或来自R&D:MAB3734的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对ALK的抗原结合结构域是例如Mino-Kenudson等人，ClinCancer Res 16(5):1561-1571(2010)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对多聚唾液酸的抗原结合结构域是例如Nagae等人，J BiolChem 288(47):33784-33796(2013)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对PLAC1的抗原结合结构域是例如Ghods等人，BiotechnolAppl Biochem 2013doi:10.1002/bab.1177中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对GloboH的抗原结合结构域是抗体VK9或例如KudryashovV等人，Glycoconj J.15(3):243-9(1998)，Lou等人，Proc Natl Acad Sci USA 111(7):2482-2487(2014)；MBr1:Bremer E-G等人，J Biol Chem 259:14773-14777(1984)中所述的抗体的抗原结合部分。
在一个实施方案中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是例如Jager等人，ApplImmunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83(2007)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对WT-1的抗原结合结构域是例如Dao等人，Sci Transl Med5(176):176ra33(2013)或WO2012/135854中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对MAGE-A1的抗原结合结构域是例如Willemsen等人，JImmunol 174(12):7853-7858(2005)(TCR样scFv)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域是例如Song等人，TargetOncol 2013Aug 14(PMID:23943313)；Song等人，Med Oncol 29(4):2923-2931(2012)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对Tie2的抗原结合结构域是抗体AB33(Cell SignalingTechnology)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是例如PMID:2450952；US7635753中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(NovusBiologicals)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对MelanA/MART1的抗原结合结构域是EP2514766A2；或US7,749,719中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对肉瘤易位断裂点的抗原结合结构域是例如Luo等人，EMBOMol.Med.4(6):453-461(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对TRP-2的抗原结合结构域是例如Wang等人，J ExpMed.184(6):2207-16(1996)中描述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是例如Maecker等人，Blood102(9):3287-3294(2003)中所述的抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMDMillipore)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是抗体目录号LS-B95-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对肠羧基酯酶的抗原结合结构域是抗体4F12:目录号:LS-B6190-50(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是抗体LifespanBiosciences:单克隆:目录号:LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD79a的抗原结合结构域是可获自Abcam的抗体抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；可获自Cell Signaling Technology的抗体CD79A抗体#3351；或可获自Sigma Aldrich的抗体HPA017748-兔产生的抗CD79A抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD79b的抗原结合结构域是Dornan等人，“Therapeuticpotential of an anti-CD79b antibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for thetreatment of non-Hodgkin lymphoma”Blood.2009Sep 24；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500，2009年7月24日电子公开的抗体polatuzumab vedotin，或4507Pre-Clinical Characterization of T Cell-Dependent Bispecific AntibodyAnti-CD79b/CD3As a Potential Therapy for B Cell Malignancies”Abstracts of 56thASH Annual Meeting and Exposition,San Francisco,CA December 6-9 2014中所述的双特异性抗体抗CD79b/CD3的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD72的抗原结合结构域是Myers和Uckun，“An anti-CD72immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblasticleukemia.”Leuk Lymphoma.1995Jun；18(1-2):119-22中描述的抗体J3-109，或Polson等人，“Antibody-Drug Conjugates for the Treatment of Non–Hodgkin's Lymphoma:Target and Linker-Drug Selection”Cancer Res March 15,2009 69；2358中描述的抗CD72(10D6.8.1,mIgG1)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对LAIR1的抗原结合结构域是可获自ProSpec的抗体ANT-301LAIR1抗体；或可获自BioLegend的抗人CD305(LAIR1)抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对FCAR的抗原结合结构域是可获自Sino Biological Inc.的抗体CD89/FCAR抗体(目录#10414-H08H)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对LILRA2的抗原结合结构域是可获自Abnova的抗体LILRA2单克隆抗体(M17)，克隆3C7或可获自Lifespan Biosciences的鼠抗LILRA2抗体单克隆(2D7)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CD300LF的抗原结合结构域是可获自BioLegend的抗体小鼠抗-CMRF35样分子1抗体，单克隆[UP-D2]或可获自R&D Systems的大鼠抗-CMRF35样分子1抗体，单克隆[234903]的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对CLEC12A的抗原结合结构域是Noordhuis等人，“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugatesand Bispecific CLL-1xCD3BiTE Antibody”53rd ASH Annual Meeting and Exposition,December 10-13,2011所描述的抗体双特异性T细胞Engager(BiTE)scFv-抗体和ADC；以及MCLA-117(Merus)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对BST2(也称为CD317)的抗原结合结构域是可获自Antibodies-Online的抗体小鼠抗CD317抗体，单克隆[3H4]或可获自R&D Systems的小鼠抗CD317抗体，单克隆[696739]的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对EMR2(也称为CD312)的抗原结合结构域是可获自Lifespan Biosciences的抗体小鼠抗CD312抗体，单克隆[LS-B8033]或可获自R&D Systems的小鼠抗CD312抗体，单克隆[494025]的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对LY75的抗原结合结构域是可获自EMD Millipore的抗体小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体，单克隆[HD30]或可获自Life Technologies的小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体，单克隆[A15797]的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对GPC3的抗原结合结构域是Nakano K，Ishiguro T，Konishi H等人，Generation of a humanized anti-glypican 3antibody by CDRgrafting and stability optimization.Anticancer Drugs.2010Nov；21(10):907–916中描述的抗体hGC33，或MDX-1414，HN3或YP7(所有三种均在Feng等人的“Glypican-3antibodies:a new therapeutic target for liver cancer.”FEBS Lett.2014Jan 21；588(2):377-82中描述)的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对FCRL5的抗原结合结构域是Elkins等人，“FcRL5as atarget of antibody-drug conjugates for the treatment of multiple myeloma”MolCancer Ther.2012Oct；11(10):2222-32”中所述的抗FcRL5抗体的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，针对IGLL1的抗原结合结构域是可获自LifespanBiosciences的抗体小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1抗体，单克隆[AT1G4]，可获自BioLegend的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1抗体，单克隆[HSL11]的抗原结合部分，例如CDR。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上面列出的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文列出的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，将非人抗体人源化，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，抗原结合结构域是人源化的。
双特异性CARs
在一些实施方案中，抗原结合结构域是双特异性或多特异性分子(例如多特异性抗体分子)。在一个实施方案中，多特异性抗体分子为双特异性抗体分子。双特异性抗体具有对不超过两个抗原的特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列，和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一和第二表位在同一个抗原，例如，相同的蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位是在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含具有对第一表位的结合特异性的半抗体或其片段，和具有对第二表位的结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含具有对第一表位的结合特异性的scFv或其片段和具有对第二表位的结合特异性的scFv或其片段。
在一些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如双特异性或三特异性)抗体分子。这样的分子包括双特异性融合蛋白，例如含有两个scFv以及完整的恒定区的表达构建体，所述两个scFv之间具有亲水性螺旋肽接头，如例如US5637481所述；具有连接的VL和VH链的微抗体构建体进一步通过肽间隔子连接至抗体铰链区和CH3区，其可以二聚化以形成双特异性/多价分子，如例如US5837821所述；通过在C端具有可交联基团的肽连接所连接的VH结构域串(或家族成员中的VL结构域)进一步与VL结构域缔合以形成一系列FV(或scFv)，如US5864019所述；并且通过非共价或化学交联将具有通过肽接头连接的VH和VL结构域的单链结合多肽组合成多价结构，以使用scFV或双抗体类型形式形成例如同双价、异双价、三价和四价结构，如例如US5869620中所述。上述申请的内容通过整体引用并入本文作为参考。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)排列为VH(VH1)在VL(VL1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)排列为VL(VL2)在VH(VH2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有排列VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如scFv)排列为VL(VL1)在VH(VH1)上游，并且下游抗体或抗体片段(例如scFv)排列为VH(VH2)在VL(VL2)上游，使得整个双特异性抗体分子具有排列VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被排列为VH1-VL1-VL2-VH2，则在两个抗体或抗体片段(例如scFv)之间，例如在VL1和VL2之间布置接头，或者如果构建体排列为VL1-VH1-VH2-VL2，则在VH1和VH2之间布置接头。接头可以是如本文所述的接头，例如(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选4(SEQ ID NO:890)。一般而言，两个scFv之间的接头应该足够长以避免两个scFv的结构域之间错配。任选地，接头位于第一个scFv的VL和VH之间。任选地，接头位于第二scFv的VL和VH之间。在具有多个接头的构建体中，任何两个或更多个接头可以是相同的或不同的。因此，在一些实施方案中，双特异性CAR包含本文所述排列的VL，VH和任选的一个或多个接头。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在多个实施方案中，可以设计本发明的嵌合分子(例如CAR)以包含连附接至嵌合分子的胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个额外的氨基酸，例如与衍生跨膜的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个至多达15个氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个额外的氨基酸(例如，细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个至多达15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与嵌合蛋白(例如CAR)的其他结构域之一相关的跨膜结构域，例如，在一个实施方案中，跨膜结构域可以来自与信号结构域，共刺激结构域或铰链结构域相同的蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不是衍生于与嵌合蛋白质的任何其他结构域(例如CAR)所源自的相同蛋白质。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与CAR表达细胞的细胞表面上的另一种CAR同二聚化。在不同的方面，跨膜结构域的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便最小化与存在于相同CAR表达细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生于天然或重组来源。如果来源是天然的，则该结构域可以衍生于任何膜结合的或跨膜蛋白。在一个方面，无论CAR何时结合靶标，跨膜结构域都能够向胞内结构域发出信号。本发明中特别使用的跨膜结构域可至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD27，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154的跨膜区。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包括例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM,CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C的跨膜区。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如来自人蛋白质的铰链)附接于CAR的细胞外区域，例如CAR的抗原结合结构域。例如，在一个实施方案中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链，IgD铰链)，GS接头(例如本文所述的GS接头)，KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一个实施方案中，铰链或间隔子包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(例如由其组成)。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如由其组成)。
在一些实施方案中，编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的CD8跨膜结构域的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列。
在其他实施方案中，编码CAR的核酸分子包含CD8跨膜结构域的核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO:13的序列或具有其95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码的抗原结合结构域通过铰链区连接到跨膜结构域。在一个实施方案中，编码的铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:4；或IgG4铰链的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:4或6具有95-99％同一性的序列。在其他实施方案中，编码铰链区的核酸序列包含分别对应于CD8铰链或IgG4铰链的SEQ ID NO:5或7的序列，或与SEQ ID NO:5或7具有95-99％同一性的序列的。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgG4铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔子包含如下氨基酸序列的铰链:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:6).
在一些实施方案中，铰链或间隔子包含由如下核苷酸序列编码的铰链:
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:7)。
在一个方面，铰链或间隔子包含IgD铰链。例如，在一个实施方案中，铰链或间隔子包含以下氨基酸序列的铰链:
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，铰链或间隔子包含由以下核苷酸序列编码的铰链:
AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:9)。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体可见于重组跨膜结构域的每个末端。
任选地，长度在2至10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质区域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链或间隔子包含KIR2DS2铰链。
信号传导结构域
在具有胞内信号传导结构域的本发明的实施方案中，这样的结构域可以含有例如一个或多个初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
本发明的CAR的细胞质部分内的细胞内信号序列可以以随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡或多肽接头可以形成细胞内信号序列之间的连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，可以使用单个氨基酸，例如丙氨酸，甘氨酸作为合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计为包含两个或更多个，例如2、3、4、5个或更多个共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个，例如2、3、4、5个或更多个共刺激信号传导结构域被接头分子分开，例如本文所述的接头分子。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
初级信号传导结构域
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初始激活。以刺激方式起作用的初级胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM的信号传导基序。
含有本发明中特别使用的初级胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括CD3ζ，共有的FcRγ(FCER1G)，FcγRIIa，FcRβ(FcεR1b)，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD79a，CD79b，DAP10和DAP12的那些ITAM。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如CD3ζ的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，编码的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。编码的CD3ζ初级信号传导结构域可以包含具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一些实施方案中，编码的初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列。在其他实施方案中，编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列或与其具有95-99％同一性的序列。
共刺激信号传导结构域
在一些实施方案中，编码的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如，胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含选自以下一种或多种的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27,CD28,4-1BB(CD137),OX40,CD30,CD40,PD-1,ICOS,淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1),CD2,CD7,LIGHT,NKG2C,B7-H3,特异性结合CD83的配体,CDS,ICAM-1,GITR,BAFFR,HVEM(LIGHTR),SLAMF7,NKp80(KLRF1),CD160,CD19,CD4,CD8α,CD8β,IL2Rβ,IL2Rγ,IL7Rα,ITGA4,VLA1,CD49a,ITGA4,IA4,CD49D,ITGA6,VLA-6,CD49f,ITGAD,CD11d,ITGAE,CD103,ITGAL,CD11a,LFA-1,ITGAM,CD11b,ITGAX,CD11c,ITGB1,CD29,ITGB2,CD18,LFA-1,ITGB7,TNFR2,TRANCE/RANKL,DNAM1(CD226),SLAMF4(CD244,2B4),CD84,CD96(Tactile),CEACAM1,CRTAM、Ly9(CD229),CD160(BY55),PSGL1,CD100(SEMA4D),CD69,SLAMF6(NTB-A,Ly108),SLAM(SLAMF1,CD150,IPO-3),BLAME(SLAMF8),SELPLG(CD162),LTBR,LAT,GADS,SLP-76,PAG/Cbp,NKp44,NKp30,NKp46和NKG2D。
在一些实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:14或SEQID NO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。在其他实施方案中，编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列或其95％-99％同一性的序列。
在其他实施方案中，编码的胞内结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列以及SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列被表达在相同的框架中并且作为单个多肽链。
在一些实施方案中，编码胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列，或与其具有95-99％同一性的序列，和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列，或与其具有95-99％同一性的序列。
在一些实施方案中，核酸分子进一步编码前导序列。在一个实施方案中，前导序列包含SEQ ID NO:2的序列。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域被设计为包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。
在一个方面，胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由以下核酸序列编码:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:17)。
示例性的CAR分子
本文公开的CAR分子可包含结合靶标(例如本文所述的靶标)的结合结构域；跨膜结构域，例如本文所述的跨膜结构域；和胞内信号传导结构域，例如本文所述的胞内结构域。在实施方案中，结合结构域包含本文所述的重链结合结构域的重链互补决定区1(HCCDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)和/或本文所述的轻链结合结构域的轻链互补决定区1(LC CDR1)，轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
在其他实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD19 CAR分子，例如US-2015-0283178-A1中描述的CD19 CAR分子，例如CTL019。在实施方案中，CD19 CAR包含US-2015-0283178-A1(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US-2015-0283178-A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与其基本上同一的序列(例如与其至少85％，90％，95％或更高同一)。
在一个实施方案中，特异性结合CD19的CAR T细胞具有USAN名称TISAGENLECLEUCEL-T。CTL019由T细胞的基因修饰通过稳定插入介导而产生，所述稳定插入经由在EF-1α启动子控制下的含有CTL019转基因的自灭活复制缺陷型慢病毒(LV)载体转导。CTL019可以是转基因阳性和阴性T细胞的混合物，其基于转基因阳性T细胞百分数被递送至受试者。
在其他实施方案中，CD19 CAR包括根据WO2014/153270(通过引用并入本文)的表3的CAR分子或抗原结合结构域(例如人源化抗原结合结构域)。编码CD19 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2014/153270中具体说明。在实施方案中，CD19 CAR包含WO2014/153270(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有WO2014/153270(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如与任何上述CD19 CAR序列至少85％，90％，95％或者更高同一)。
在一个实施方案中，亲本鼠scFv序列是在PCT公开WO2012/079000(通过引用并入本文)中提供且在本文表9中提供的CAR19构建体。在一个实施方案中，抗CD19结合结构域是WO2012/079000中描述的scFv并在本文在表9中提供。
在一个实施方案中，CD19 CAR包含PCT公开WO2012/079000中以SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。在实施方案中，氨基酸序列是:
MALPVTALLLPLALLLHAARPdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:891)，或者与其基本同一的序列(例如，与其至少85％，90％或95％或更高同一的)，有或没有以大写字母表示的信号肽序列。
在实施方案中，氨基酸序列是:
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:892)，或者与其基本上同源的序列(例如，与其至少85％，90％或95％或更高同一的)。
在实施方案中，CAR分子是本文所述的CD19 CAR分子，例如本文描述的人源化CAR分子，例如表6-9的人源化CD19 CAR分子或具有表10A和10B中所列的CDR。
在实施方案中，CAR分子是本文所述的CD19 CAR分子，例如本文所述的鼠CAR分子，例如表9的鼠CD19 CAR分子或具有表10A和10B中所列的CDR。
在一些实施方案中，CAR分子包含来自表10A和10B中鼠或人源化CD19 CAR的重链可变区的一个，两个和/或三个CDR和/或轻链可变区的一个，两个和/或三个CDR。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含来自本文列举的抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)重链CDR，HC CDR1，HC CDR2和HC CDR3，和/或来自本文所列抗体的一个、两个、三个(例如全部三个)轻链CDR，LC CDR1，LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含本文列出或描述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
示例性CD19 CAR包括本文所述的任何CD19 CAR或抗CD19结合结构域，例如在本文所述的一个或多个表格(例如，表6-9)中(例如，或者Xu等人，Blood 123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人，Blood 122.25(2013):4129-39，Cruz等人，Blood 122.17(2013):2965-73，NCT00586391，NCT01087294，NCT02456350，NCT00840853，NCT02659943，NCT02650999，NCT02640209，NCT01747486，NCT02546739，NCT02656147，NCT02772198，NCT00709033，NCT02081937，NCT00924326，NCT02735083，NCT02794246，NCT02746952，NCT01593696，NCT02134262，NCT01853631，NCT02443831，NCT02277522，NCT02348216，NCT02614066，NCT02030834，NCT02624258，NCT02625480，NCT02030847，NCT02644655，NCT02349698，NCT02813837，NCT02050347，NCT01683279，NCT02529813，NCT02537977，NCT02799550，NCT02672501，NCT02819583，NCT02028455，NCT01840566，NCT01318317，NCT01864889，NCT02706405，NCT01475058，NCT01430390，NCT02146924，NCT02051257，NCT02431988，NCT01815749，NCT02153580，NCT01865617，NCT02208362，NCT02685670，NCT02535364，NCT02631044，NCT02728882，NCT02735291，NCT01860937，NCT02822326，NCT02737085，NCT02465983，NCT02132624，NCT02782351，NCT01493453，NCT02652910，NCT02247609，NCT01029366，NCT01626495，NCT02721407，NCT01044069，NCT00422383，NCT01680991，NCT02794961，或NCT02456207描述的抗CD19 CAR，其各通过整体引用并入本文作为参考。
可用于本文所述方法的示例性CD19 CAR和抗原结合结构域构建体显示于表6-9中。根据Kabat的轻链和重链CDR序列以粗体和下划线文字示出，并且也概括在下表9和10A-10B中。信号序列和组氨酸标签的位置也加下划线。在实施方案中，CD19 CAR序列及其抗原结合片段不包括信号序列和/或组氨酸标签序列。
在实施方案中，CD19 CAR包含抗CD19结合结构域(例如鼠或人源化抗CD19结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，并且其中所述抗CD19结合结构域包含表6-9和10A-10B中列出的任何抗CD19重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)或与其至少85％，90％，95％或更高同一性(例如，具有小于5、4、3、2或1个氨基酸取代，例如保守取代)的序列。
在一个实施方案中，抗CD19结合结构域包含本文描述的轻链可变区(例如表6-9中)和/或本文描述的重链可变区(例如表9中)，或者其至少85％，90％，95％或更高同一的序列。
在一个实施方案中，编码的抗CD19结合结构域是scFv，其包含表6-9的氨基酸序列的轻链和重链或与其至少85％，90％，95％或更高同一的序列。
在一个实施方案中，人或人源化抗CD19结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表6-9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)，但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列，或其至少85％，90％，95％或更高同一的序列；和/或重链可变区，其包含具有表6-9中提供的重链可变区的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列或与其至少85％，90％，95％或更高同一的序列。
表9:CD19 CAR构建体
在一些实施方案中，CD19 CAR或结合结构域包含CTL019的氨基酸序列，或者由表9的CTL019的核苷酸序列编码，具有或不具有前导序列或组氨酸标签，或与其基本上同一的序列(例如，至少85％，90％，95％或更高的同一性)。
在一些实施方案中，根据Kabat编号方案，Chothia编号方案或其组合来定义CDR。
scFv结构域的人源化CDR序列的序列在表10A中显示重链可变结构域和在表10B中显示轻链可变结构域。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表10A、重链可变结构域CDR(根据Kabat)
表10B、轻链可变结构域CDR(根据Kabat)
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的BCMA CAR分子，例如US-2016-0046724-A1或WO2016/014565中所述的BCMA CAR。在实施方案中，BCMA CAR包含根据US-2016-0046724-A1或WO2016/014565的表1或16，SEQ ID NO:271或SEQ ID NO:273的CAR分子的氨基酸或具有所述CAR分子的核苷酸序列或抗原结合结构域，其通过引用并入本文，或与任何上述序列基本上同一的序列(例如，与任何上述BCMA CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)。编码BCMA CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014565中具体说明。
在实施方案中，BCMA CAR包含抗BCMA结合结构域(例如人或人源化抗BCMA结合结构域)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，并且其中所述抗BCMA结合结构域包含表11A或11B中列出的任何抗BMCA重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)，重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)或与其至少85％，90％，95％或更高同一(例如，具有少于5、4、3、2或1个氨基酸取代，例如保守取代)的序列。
在一个实施方案中，抗BCMA结合结构域包含本文描述的轻链可变区(例如表11A或11B中)和/或本文描述的重链可变区(例如表11A或11B中)或与其至少85％，90％，95％或更高同一的序列。
在一个实施方案中，编码的抗BCMA结合结构域是包含表11A或11B的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。
在一个实施方案中，人或人源化抗BCMA结合结构域(例如scFv)包含：轻链可变区，其包含具有表11A或11B中提供的轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如取代，例如保守取代)，但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列或其至少85％，90％，95％或更高同一的序列；和/或重链可变区，其包含具有表11A或11B中提供的重链可变区的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如保守取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列或与其至少85％，90％，95％或更高同一的序列。
表11A、示例性抗BCMA scFv结构域和BCMA CAR分子的氨基酸和核酸序列
表11B、额外的示例性BCMA CAR序列
本文公开的示例性BCMA CAR构建体包含scFv(例如表11A或11B中公开的scFv，任选地前面有任选的前导序列(例如，分别用于示例性前导氨基酸和核苷酸序列的SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3或1938)。scFv片段的序列(例如，来自SEQ ID NO:967-1182中任一个的ScFv，例如SEQ ID NO:967，973，979，985，991，997，1003，1009，1015，1021，1027，1033，1039，1045，1051，1057，1063，1069，1075，1081，1087，1093，1099，1105，1111，1117，1123，1129，1135，1141，1147，1153，1159，1165，1171，1177但不包括任选的前导序列)在本文中的表11A或11B中提供。BCMA CAR构建体可以进一步包括任选的铰链结构域，例如CD8铰链结构域(例如包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:5的核酸序列编码)；跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域(例如，包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由SEQ ID NO:13或1939的核苷酸序列编码)；胞内结构域，例如4-1BB胞内结构域(例如，包括SEQ ID NO:14的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15或1940的核苷酸序列编码；以及功能性信号传导结构域，例如CD3ζ结构域(例如，包括SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列，或由SEQ ID NO:19，1941或21的核苷酸序列编码)。在一些实施方案中，所述结构域与相同的阅读框连续并在相同的阅读框中以形成单一融合蛋白。在其他实施方案中，该结构域处于不同的多肽中，例如，如在本文所述的RCAR分子中。
在一些实施方案中，全长BCMA CAR分子包括表11A或或11B中提供的BCMA-1，BCMA-2，BCMA-3，BCMA-4，BCMA-5，BCMA-6，BCMA-7，BCMA-8，BCMA-9，BCMA-10，BCMA-11，BCMA-12，BCMA-13，BCMA-14，BCMA-15，149362，149363，149364，149365，149366，149367，149368，149369，BCMA_EBB-C1978-A4，BCMA_EBB-C1978-G1，BCMA_EBB-C1979-C1，BCMA_EBB-C1978-C7，BCMA_EBB-C1978-D10，BCMA_EBB-C1979-C12，BCMA_EBB-C1980-G4，BCMA_EBB-C1980-D2，BCMA_EBB-C1978-A10，BCMA_EBB-C1978-D4，BCMA_EBB-C1980-A2，BCMA_EBB-C1981-C3，BCMA_EBB-C1978-G4，A7D12.2，C11D5.3，C12A3.2或C13F12.1的氨基酸序列或由核苷酸序列编码，或其基本上(例如，85％，95-99％或更高)同一的序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包括表11A或或11B中提供的BCMA-1，BCMA-2，BCMA-3，BCMA-4，BCMA-5，BCMA-6，BCMA-7，BCMA-8，BCMA-9，BCMA-10，BCMA-11，BCMA-12，BCMA-13，BCMA-14，BCMA-15，149362，149363，149364，149365，149366，149367，149368，149369，BCMA_EBB-C1978-A4，BCMA_EBB-C1978-G1，BCMA_EBB-C1979-C1，BCMA_EBB-C1978-C7，BCMA_EBB-C1978-D10，BCMA_EBB-C1979-C12，BCMA_EBB-C1980-G4，BCMA_EBB-C1980-D2，BCMA_EBB-C1978-A10，BCMA_EBB-C1978-D4，BCMA_EBB-C1980-A2，BCMA_EBB-C1981-C3，BCMA_EBB-C1978-G4，A7D12.2，C11D5.3，C12A3.2或C13F12.1的scFv氨基酸序列(具有或不具有前导序列)，或与任何前述序列基本同一(例如85％，95-99％或更高同一，或多达20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变，例如，取代(例如，保守取代))的序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包括表11A或或11B中提供的BCMA-1，BCMA-2，BCMA-3，BCMA-4，BCMA-5，BCMA-6，BCMA-7，BCMA-8，BCMA-9，BCMA-10，BCMA-11，BCMA-12，BCMA-13，BCMA-14，BCMA-15，149362，149363，149364，149365，149366，149367，149368，149369，BCMA_EBB-C1978-A4，BCMA_EBB-C1978-G1，BCMA_EBB-C1979-C1，BCMA_EBB-C1978-C7，BCMA_EBB-C1978-D10，BCMA_EBB-C1979-C12，BCMA_EBB-C1980-G4，BCMA_EBB-C1980-D2，BCMA_EBB-C1978-A10，BCMA_EBB-C1978-D4，BCMA_EBB-C1980-A2，BCMA_EBB-C1981-C3，BCMA_EBB-C1978-G4，A7D12.2，C11D5.3，C12A3.2或C13F12.1的重链可变区和/或轻链可变区，或与任何前述序列基本同一(例如85％，95-99％或更高同一，或多达20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变，例如，取代(例如，保守取代))的序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含BCMA-1,BCMA-2,BCMA-3,BCMA-4,BCMA-5,BCMA-6,BCMA-7,BCMA-8,BCMA-9,BCMA-10,BCMA-11,BCMA-12,BCMA-13,BCMA-14,BCMA-15,149362,149363,149364,149365,149366,149367,149368,149369,BCMA_EBB-C1978-A4,BCMA_EBB-C1978-G1,BCMA_EBB-C1979-C1,BCMA_EBB-C1978-C7,BCMA_EBB-C1978-D10,BCMA_EBB-C1979-C12,BCMA_EBB-C1980-G4,BCMA_EBB-C1980-D2,BCMA_EBB-C1978-A10,BCMA_EBB-C1978-D4,BCMA_EBB-C1980-A2,BCMA_EBB-C1981-C3,BCMA_EBB-C1978-G4,A7D12.2,C11D5.3,C12A3.2或C13F12.1的来自表12中提供的重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或来自表13中提供的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1，LCDR2和/或LCDR3)；或与任何上述序列基本上同一(例如85％，95-99％或更高同一，或多达20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化，例如，取代(例如，保守取代))的序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含BCMA-1,BCMA-2,BCMA-3,BCMA-4,BCMA-5,BCMA-6,BCMA-7,BCMA-8,BCMA-9,BCMA-10,BCMA-11,BCMA-12,BCMA-13,BCMA-14,BCMA-15,149362,149363,149364,149365,149366,149367,149368,149369,BCMA_EBB-C1978-A4,BCMA_EBB-C1978-G1,BCMA_EBB-C1979-C1,BCMA_EBB-C1978-C7,BCMA_EBB-C1978-D10,BCMA_EBB-C1979-C12,BCMA_EBB-C1980-G4,BCMA_EBB-C1980-D2,BCMA_EBB-C1978-A10,BCMA_EBB-C1978-D4,BCMA_EBB-C1980-A2,BCMA_EBB-C1981-C3,BCMA_EBB-C1978-G4,A7D12.2,C11D5.3,C12A3.2或C13F12.1的来自表14中提供的重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或来自表15中提供的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1，LCDR2和/或LCDR3)；或与任何上述序列基本上同一(例如85％，95-99％或更高同一，或多达20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化，例如，取代(例如，保守取代))的序列。
在一些实施方案中，BCMA CAR分子或抗BCMA抗原结合结构域包含BCMA-1,BCMA-2,BCMA-3,BCMA-4,BCMA-5,BCMA-6,BCMA-7,BCMA-8,BCMA-9,BCMA-10,BCMA-11,BCMA-12,BCMA-13,BCMA-14,BCMA-15,149362,149363,149364,149365,149366,149367,149368,149369,BCMA_EBB-C1978-A4,BCMA_EBB-C1978-G1,BCMA_EBB-C1979-C1,BCMA_EBB-C1978-C7,BCMA_EBB-C1978-D10,BCMA_EBB-C1979-C12,BCMA_EBB-C1980-G4,BCMA_EBB-C1980-D2,BCMA_EBB-C1978-A10,BCMA_EBB-C1978-D4,BCMA_EBB-C1980-A2,BCMA_EBB-C1981-C3,BCMA_EBB-C1978-G4,A7D12.2,C11D5.3,C12A3.2或C13F12.1的来自表16中提供的重链可变区的一个、两个或三个CDR(例如HCDR1、HCDR2和/或HCDR3)；和/或来自表17中提供的轻链可变区的一个、两个或三个CDR(例如LCDR1，LCDR2和/或LCDR3)；或与任何上述序列基本上同一(例如85％，95-99％或更高同一，或多达20、15、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化，例如，取代(例如，保守取代))的序列。
scFv结构域的人类CDR序列的序列在表12、14和16中示出重链可变结构域以及在表13、15和17中示出轻链可变结构域。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。
表12:根据Kabat编号方案的重链可变结构域CDR(Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)
表13:根据Kabat编号方案的轻链可变结构域CDR(Kabat等(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD)
表14:根据Chothia编号方案的重链可变结构域CDR(Al-Lazikani等人，(1997)JMB273,927-948)
表15:根据Chothia编号方案的轻链可变结构域CDR(Al-Lazikani等人，(1997)JMB273,927-948)
表16:根据Kabat编号方案(Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)和Chothia编号方案(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948)的组合的重链可变域CDR
表17:根据Kabat编号方案(Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)和Chothia编号方案(Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948)的组合的轻链可变域CDR
在一些实施方案中，本文描述的CAR分子(例如CAR核酸或CAR多肽)或BCMA结合结构域包括:
(1)选自以下之一的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1320的LC CDR1，SEQ ID NO:1360的LCCDR2和SEQ ID NO:1400的LC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1319的LC CDR1，SEQ ID NO:1359的LCCDR2和SEQ ID NO:1399的LC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1331的LC CDR1，SEQ ID NO:1371的LCCDR2和SEQ ID NO:1411的LC CDR3；或
(iv)BCMA-15 CAR(139114)的SEQ ID NO:1333的LC CDR1，SEQ ID NO:1373的LCCDR2和SEQ ID NO:1413的LC CDR3，和/或
(2)来自以下之一的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1200的HC CDR1，SEQ ID NO:1240的HCCDR2和SEQ ID NO:1280的HC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1199的HC CDR1，SEQ ID NO:1239的HCCDR2和SEQ ID NO:1279的HC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1121的HC CDR1，SEQ ID NO:1251的HCCDR2和SEQ ID NO:1291的HC CDR3；或
(iv)BCMA-15(139114)的SEQ ID NO:1213的HC CDR1，SEQ ID NO:1253的HC CDR2和SEQ ID NO:1293的HC CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的CAR分子(例如CAR核酸或CAR多肽)包括:
(1)选自以下之一的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1560的LC CDR1，SEQ ID NO:1600的LCCDR2和SEQ ID NO:1640的LC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1559的LC CDR1，SEQ ID NO:1599的LCCDR2和SEQ ID NO:1639的LC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1571的LC CDR1，SEQ ID NO:1611的LCCDR2和SEQ ID NO:1651的LC CDR3；或
(iv)BCMA-15 CAR(139114)的SEQ ID NO:1573的LC CDR1，SEQ ID NO:1613的LCCDR2和SEQ ID NO:1653的LC CDR3；和/或
(2)选自以下之一的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1440的HC CDR1，SEQ ID NO:1480的HCCDR2和SEQ ID NO:1520的HC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1439的HC CDR1，SEQ ID NO:1479的HCCDR2和SEQ ID NO:1519的HC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1451的HC CDR1，SEQ ID NO:1491的HCCDR2和SEQ ID NO:1531的HC CDR3；或
(iv)BCMA-15 CAR(139114)的SEQ ID NO:1453的HC CDR1，SEQ ID NO:1493的HCCDR2和SEQ ID NO:1533的HC CDR3。
在一些实施方案中，本文描述的CAR分子(例如CAR核酸或CAR多肽)包括:
(1)选自以下之一的一个、两个或三个轻链(LC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1800的LC CDR1，SEQ ID NO:1840的LCCDR2和SEQ ID NO:1880的LC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1799的LC CDR1，SEQ ID NO:1839的LCCDR2和SEQ ID NO:1879的LC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1811的LC CDR1，SEQ ID NO:1851的LCCDR2和SEQ ID NO:1891的LC CDR3；或
(iv)BCMA-15 CAR(139114)的SEQ ID NO:1813的LC CDR1，SEQ ID NO:1853的LCCDR2和SEQ ID NO:1893的LC CDR3；和/或
(2)选自以下之一的一个、两个或三个重链(HC)CDR:
(i)BCMA-4 CAR(139103)的SEQ ID NO:1680的HC CDR1，SEQ ID NO:1720的HCCDR2和SEQ ID NO:1760的HC CDR3；
(ii)BCMA-10 CAR(139109)的SEQ ID NO:1679的HC CDR1，SEQ ID NO:1719的HCCDR2和SEQ ID NO:1759的HC CDR3；
(iii)BCMA-13 CAR(139112)的SEQ ID NO:1691的HC CDR1，SEQ ID NO:1731的HCCDR2和SEQ ID NO:1771的HC CDR3；
(iv)BCMA-15CAR(139114)的SEQ ID NO:1693的HC CDR1，SEQ ID NO:1733的HCCDR2和SEQ ID NO:1773的HC CDR3。
CAR分子的示例性组分
前导(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1919)
MALPVTALLLPLALLLHAARP
前导(核酸序列)(SEQ ID NO:1920)
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
CD8铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1921)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
CD8铰链(核酸序列)(SEQ ID NO:1922)
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
CD8跨膜(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1923)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
CD8跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO:1924)
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
4-1BB胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1925)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB胞内结构域(核酸序列)(SEQ ID NO:1926)
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
CD28胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1927)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:1927)
CD28胞内结构域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:1928)
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:1928)
ICOS胞内结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1929)
T K K K Y S S S V H D P N G E Y M F M R A V N T A K K S R L T D V T L(SEQ ID NO:1929)
ICOS胞内结构域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:1930)
ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA(SEQ ID NO:1930)
CD3ζ结构域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1931)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列)(SEQ ID NO:1932)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
CD3ζ结构域(氨基酸序列；NCBI参考号NM_000734.3)(SEQ ID NO:1933)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
CD3ζ(核酸序列；NCBI参考号NM_000734.3)；(SEQ ID NO:1934)
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGC
CCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
IgG4铰链(氨基酸序列)(SEQ ID NO:1935)
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
IgG4铰链(核苷酸序列)(SEQ ID NO:1936)
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的间皮素CAR，例如WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的间皮素CAR。在实施方案中，间皮素CAR包含WO 2015/090230(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有WO 2015/090230(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述间皮素CAR序列至少85％，90％，95％或更多同一)的序列。在一个实施方案中，CAR分子包含间皮素CAR或根据WO2015/090230(通过引用并入本文)的表2-3的抗原结合结构域，或与其基本上同一(例如与其至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码间皮素CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2015/090230中具体说明。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CLL1 CAR，例如US2016/0051651A1(通过引用并入本文)中描述的CLL1 CAR。在实施方案中，CLL1 CAR包含US2016/0051651A1(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US2016/0051651A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述CLL1 CAR序列至少85％，90％，95％或更多同一)的序列。
在其他实施方案中，CLL1 CAR包括根据WO2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述CLL1 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码CLL-1 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014535中具体说明。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD33 CAR，例如US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中所述的CD33 CAR。在实施方案中，CD33 CAR包含US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US2016/0096892A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述CD33 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。在其他实施方案中，CD33 CAR CAR或其抗原结合结构域可以包括根据WO2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CAR分子(例如，CAR33-1至CAR-33-9中的任何一个)或抗原结合结构域，或与任何上述序列基本上同一(例如，与任何上述CD33 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VLCDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/014576中具体说明。
在实施方案中，CAR分子包含本文所述的CD123 CAR，例如US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中描述的CD123 CAR，二者均通过引用并入本文作为参考。在实施方案中，CD123 CAR包含US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的氨基酸，或具有US2014/0322212A1或US2016/0068601A1中所示的核苷酸序列，二者均通过引用并入本文，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述CD123 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。在一个实施方案中，CAR分子包含根据WO2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的CD123 CAR(例如CAR1-CAR8中的任一者)或抗原结合结构域，或与其基本上同一(例如，与任何上述CD123 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码CD123CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130635中具体说明。
在其他实施方案中，CAR分子包含CD123 CAR，其含有根据WO2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的CAR分子(例如，CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32中的任何一种)或抗原结合结构域，或与其基本上同一(例如，与任何前述CD123 CAR序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域(例如，包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/028896中具体说明。
在一个实施方案中，CAR分子包含本文所述的EGFRvIII CAR分子，例如US2014/0322275A1(通过引用并入本文)中描述的EGFRvIII CAR。在实施方案中，EGFRvIII CAR包含US2014/0322275A1(通过引用并入本文)中所示的氨基酸，或具有US2014/0322275A1(通过引用并入本文)中所示的核苷酸序列，或与任何上述序列基本上同一(例如与任何上述EGFRvIII CAR序列至少85％，90％，95％或更多同一)的序列。在一个实施方案中，CAR分子包含根据WO2014/130657(通过引用并入本文)的表2或SEQ ID NO:11的EGFRvIII CAR或抗原结合结构域，或与其基本上同一(例如其至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码EGFRvIII CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VHCDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO 2014/130657中具体说明。
在其他实施方案中，CAR分子包含GFRα-4 CAR，例如可以包括根据WO2016/025880(通过引用并入本文)的表2的CAR分子或抗原结合结构域，或与任何的前述序列基本上同一(例如，与任何前述GFRα-4序列至少85％，90％，95％或更高同一)的序列。编码GFRα-4 CAR分子和抗原结合结构域(例如包括根据Kabat或Chothia的一个、两个、三个VH CDR；以及一个、两个、三个VL CDR)的氨基酸和核苷酸序列在WO2016/025880中具体说明。
抑制性结构域
在一个实施方案中，载体包含编码CAR，例如本文所述的CAR的核酸序列，和编码抑制性分子的核酸序列，所述抑制性分子包含：inhKIR胞质结构域；跨膜结构域，例如KIR跨膜结构域；和抑制物胞质结构域，例如ITIM结构域，例如inhKIR ITIM结构域。在一个实施方案中，抑制性分子是天然存在的inhKIR，或与天然存在的inhKIR共有至少50、60、70、80、85、90、95或99％同源性的序列，或不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基。
在一个实施方案中，编码抑制性分子的核酸序列包含：SLAM家族细胞质结构域；跨膜结构域，例如SLAM家族跨膜结构域；和抑制物胞质结构域，例如SLAM家族结构域，例如SLAM家族ITIM结构域。在一个实施方案中，抑制性分子是天然存在的SLAM家族成员，或与其共有至少50、60、70、80、85、90、95或99％同源性，或不同不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的天然存在的SLAM家族成员。
在一个实施方案中，载体是体外转录的载体，例如转录本文所述的核酸分子的RNA的载体。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含聚(A)尾巴，例如聚A尾。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含3'UTR，例如本文所述的3'UTR，例如包含衍生自人β-球蛋白的3'UTR的至少一个重复序列。在一个实施方案中，载体中的核酸序列还包含启动子，例如T2A启动子。
启动子
在一个实施方案中，载体还包含启动子。在一些实施方案中，启动子选自EF-1启动子，CMV IE基因启动子，EF-1α启动子，泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一个实施方案中，启动子是EF-1启动子。在一个实施方案中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:1的序列。
宿主细胞
如上所述，在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的核酸分子、嵌合多肽分子或载体的细胞，例如免疫效应细胞(例如细胞群体，例如免疫效应细胞群体)。
在本公开的某些方面，免疫效应细胞，例如T细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(例如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。单采血液成分术的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级分，并且任选地将细胞置于适合的缓冲液或培养基中用于后续加工步骤。在一个实施方案中，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个备选的实施方案中，洗涤溶液不含钙，且可以不含镁或可以不含许多(即使不是全部)二价阳离子。
在不存在钙下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员应当容易地理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)。在洗涤之后，可以将细胞再悬浮在多种生物相容性缓冲液中，例如不含Ca、不含Mg的PBS,PlasmaLyte A、或含或不含缓冲剂的其他盐溶液。备选地，可以除去单采血液成分术样品的不期望组分，并将细胞直接再悬浮在培养基中。
认识到本申请的方法可以利用包含5％或更少，例如2％的人AB血清的培养基条件，并采用公知的培养基条件和组合物，例如在Smith等人，“Ex vivo expansion of humanT cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune CellSeruM Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4，e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所述。培养基可另外包括一种或多种，例如一种如本文所述的LSD1抑制剂。
在一个方面，通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过对流(counterflow)离心洗脱法从外周血淋巴细胞分离T细胞。一旦分离，细胞可以与例如本文所述的LSD1抑制剂接触，例如离体接触。
本文描述的方法可以包括，例如，使用例如本文所述的负选择技术，选择免疫效应细胞，例如，T细胞的特定亚群，其是T调节细胞消耗的群体，CD25+消耗的细胞。优选地，调节性T消耗细胞群包含少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。在选择之前或之后，可以使细胞与本文所述的LSD1抑制剂接触，例如离体接触。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体IL-2从所述群体去除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段，或CD25结合配体缀合到基质，例如，珠，或以其他方式包被在基质，例如，珠上。在一个实施方案中，所述抗CD25抗体或其片段缀合到如本文所述基质上。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25消耗剂从所述群体去除所述调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞对CD25消耗剂的比率为1e7个细胞对20uL，或1e7个细胞对15uL，或1e7个细胞对10uL，或1e7个细胞对5uL，或1e7个细胞对2.5uL，或1e7个细胞对1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于调节性T细胞(例如，CD25+)消耗，使用大于5亿个细胞/ml。在进一步的方面，使用6亿、7亿、8亿、或9亿个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待被消耗的免疫效应细胞群体包含大约6x109个CD25+T细胞。在其他方面中，待被消耗的免疫效应细胞群体包括约1x109到1x1010个CD25+T细胞，和两者之间的任一整数值。在一个实施方案中，所得的群体T调节消耗的细胞具有2x109个T调节细胞，例如，CD25+细胞，或更少(例如，1x 109，5x 108，1x 108，5x 107，1x 107或更少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用CliniMAC系统，利用消耗管路设置，例如,管路162-01，从所述群体去除所述调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在消耗设置上，例如，DEPLETION2.1上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采血液成分术前或在制造CAR表达细胞产物过程中，降低受试者中免疫细胞的负调节子(例如，减少不希望的免疫细胞，例如TREG细胞的数量)的水平可以降低受试者复发的风险。例如，消耗TREG细胞的方法在本领域中是公知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺，抗GITR抗体(本文中描述的抗GITR抗体)，CD25消耗，以及它们的组合。这些方法可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
在一些实施方案中，制造方法包括在制造CAR表达细胞之前减少TREG细胞的数目(例如，消耗)。例如，制造方法包括用抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段，或CD25结合配体)接触样品，例如，单采血液分离术样品，例如，以在制造CAR表达细胞(例如，T细胞，NK细胞)产品前消耗TREG细胞。这些方法可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
在一个实施方案中，在收集细胞用于CAR表达细胞产物制造前，受试者用减少TREG细胞的一种或多种疗法预处理，从而减少受试者对CAR表达细胞治疗复发的风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于，对受试者施用环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25消耗，或它们的组合的一种或多种。环磷酰胺，抗GITR抗体，CD25消耗，或它们的组合的一种或多种的施用可以在CAR表达细胞产物的输注之前、期间或之后发生。这些方法可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
在一个实施方案中，在收集细胞用于CAR表达细胞产物制造前，受试者用环磷酰胺预处理，从而减少受试者对CAR表达细胞治疗复发的风险。在一个实施方案中，在收集细胞用于CAR表达细胞产物制造前，受试者用抗GITR抗体预处理，从而减少受试者对CAR表达细胞治疗复发的风险。这些方法可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
在一个实施方案中，要去除的细胞群不是调节性T细胞或肿瘤细胞，而是另外不利地影响CART细胞的扩增和/或功能的细胞，例如表达CD14，CD11b，CD33，CD15或潜在的免疫抑制细胞表达的其他标志物的细胞。在一个实施方案中，考虑了将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时除去，或在所述消耗后去除，或以另一顺序去除。
本文描述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如，多于一个的消耗步骤。例如，使用针对负选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合，通过负选择可以实现对T细胞群体的富集。一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用针对存在于负选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。这些步骤可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
本文描述的方法可以进一步包括从群体中除去表达肿瘤抗原的细胞，例如肿瘤抗原不包含CD25，所述肿瘤抗原例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b，从而提供T调节性消耗的(例如，CD25+消耗的)和肿瘤抗原消耗的细胞群体，其适用于表达CAR，例如，本文所述的CAR。在一个实施方案中，肿瘤抗原表达细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段，以及抗肿瘤抗原抗体或其片段，可以连接到相同的基质，例如，珠，其可用来除去所述细胞；或者抗CD25抗体或其片段，或抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附着到单独的小珠，它们的混合物可以用来除去所述细胞。在其他实施方案中，去除T调节细胞，例如，CD25+细胞，和去除肿瘤抗原表达细胞是顺序的，并且可以例如以任一顺序发生。这些步骤可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
还提供了一些方法，其包括从群体中除去细胞，所述细胞表达检查点抑制分子，例如，本文所述的检查点抑制分子，例如，一种或多种PD1+细胞，LAG3+细胞，和TIM3+细胞，以由此提供T调节消耗的，例如，CD25+消耗的细胞，和检查点抑制分子消耗的细胞，例如，PD1+，LAG3+和/或TIM3+消耗的细胞。示例性检查点抑制分子包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施方案中，检查点抑制分子表达细胞与T调节细胞(例如，CD25+细胞)同时被去除。例如，抗CD25抗体或其片段，以及抗检查点抑制分子抗体或其片段，可以附着到相同的珠，所述珠可以用来除去所述细胞；或者抗CD25抗体或其片段，以及抗检查点抑制分子抗体或其片段可以附着到单独的珠，所述珠的混合物可以用来除去所述细胞。在其他实施方案中，去除T调节细胞，例如，CD25+细胞，和除去检查点抑制分子表达细胞是顺序的，并且可以例如以任一顺序发生。这些步骤可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
本文描述的方法可以包括阳性选择步骤。例如可以通过与抗CD3/抗CD28(例如3x28)缀合珠(例如 M-450CD3/CD28T)温育足以进行所需T细胞阳性选择的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，时间段为约30分钟。在另一实施方案中，时间范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一实施方案中，时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。又在另一实施方案中，时间段为10至24小时，例如24小时。在与其他细胞类型相比较少的T细胞的任一情况下，例如从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的情况下，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。此外，使用更长的温育时间可以提高捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合CD3/CD28珠和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述)，可以为了或针对在培养开始时或在过程中的其他时间点优先选择T细胞亚群。另外，通过增加或降低珠或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以为了或针对在培养开始或在其他所需时间点优选地选择T细胞亚群。这些步骤可以与制造方法组合，包括使免疫效应细胞群与本文所述的LSD1抑制剂接触。
在一个实施方案中，可以选择表达下述一种或多种的T细胞群:IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔蛋白或其他适合的分子例如其他细胞因子。用于筛选细胞表达的方法可以例如通过PCT公开号WO2013/126712中描述的方法确定。
对于通过正选择或负选择分离期望的细胞群，细胞的浓度和表面(例如，粒子，例如珠)可以变化。在一些方面，可能期望显著地降低珠和细胞混合在一起的体积(例如，提高细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个方面，使用100亿细胞/ml、90亿细胞/ml、80亿细胞/ml、70亿细胞/ml、60亿细胞/ml或50亿细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用来自7500万、8000万、8500万、9000万、9500万或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的方面，可以使用1.25亿或1.50亿个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产率提高、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度能够更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或者从其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)更有效地捕获细胞。这样的细胞群体可以具有治疗价值，并且将是期望得到的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关的方面，可能期望使用较低的细胞浓度。通过显著地稀释T细胞和表面(例如，粒子例如珠)的混合物，使粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量目的抗原的、欲结合粒子的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度中比CD8+T细胞更有效地被捕获。在一个方面，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其他方面，使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml及其中任一整数值。
在其他方面，可以在2-10℃或在室温下在旋转器中以可变速率培养细胞可变的时间长度。
也可以在洗涤步骤之后冷冻用于刺激的T细胞。不希望受到理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过在细胞群中除去粒细胞及在一定程度上除去单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞悬浮在冷冻液中。虽然许多冷冻液和参数是本领域已知的且将适用于本上下文中，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或含有例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并贮存在液氮储存罐的气相中。可以使用控制冷冻的其他方法以及在-20℃下或在液氮中立即不受控制的冷冻。
在一些方面，将冷藏保存的细胞解冻并如本文所述洗涤，并且允许在室温下静置1小时，之后使用本发明的方法活化。
本发明的上下文中还涉及在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间从受试者收集血样或单采血液成分术产物。因而，要扩增的细胞来源可以在任一必须的时间点收集，并且可以分离期望的细胞，例如T细胞并冷冻，以后用于将受益于免疫效应细胞疗法的任何数量的疾病或病症(如本文所述那些)的细胞疗法中。在一个方面，血样或单采血液成分术是从通常健康的受试者采集的。在一些方面，血样或单采血液成分术是从处于发展为疾病的风险中但还没有发展为疾病的通常健康的受试者采集的，并且分离和冷冻目的细胞用于以后使用。在一些方面，T细胞可以扩增、冷冻和在后来的时间使用。在一些方面，可以在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任一治疗之前，从患者采集样品。在一个进一步的方面，在任一数量的相关治疗模式之前，从受试者的血样或单采血液成分术分离细胞，所述治疗模式包括但不限于用如下药剂治疗：例如那他珠单抗(natalizumab)、艾法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、辐射、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体、或其他免疫消蚀剂例如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和辐射进行治疗。
在本发明的在另一方面，T细胞是直接在治疗后从患者获得的，所述治疗给受试者留下功能性T细胞。在这方面，已经观察到，在某些癌症治疗之后，特别是用破坏免疫系统的药物治疗不久之后，在患者通常正在从治疗中恢复的时期内，获取的T细胞的质量可能是最佳的或者其离体扩增的能力得到改善。同样，在使用本文所述的方法的离体操作之后，这些细胞可能处于用于增强移植和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文中，考虑在该恢复期期间收集血细胞，包括造血谱系的T细胞，树突状细胞或其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如，使用GM-CSF动员)和调节方案可以用于在受试者中产生一种情形，其中特定细胞类型的再增殖，再循环，再生和/或扩增是有利的，特别是在治疗后限定的时间窗口内。阐示性细胞类型包括T细胞，B细胞，树突细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的免疫效应细胞，是从已接受了LSD1抑制剂的受试者获得的。在一个实施方案中，免疫效应细胞，例如，待工程化以表达CAR的T细胞的群体，在LSD1抑制剂的足够时间之后收获或在足够给药后收获，以使得受试者中或从受试者收获的PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的水平，或PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率至少暂时增加。
在其他实施方案中，已经或将要经工程化以表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体可以通过用一定量的LSD1抑制剂接触离体处理，所述LSD1抑制剂增加PD1阴性免疫效应细胞，例如，T细胞的数目，或增加PD1阴性免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率。
在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质，或具有降低的或抑制的DGK活性的细胞。可通过遗传方法来生成DGK缺陷的细胞，例如，施用RNA干扰剂，例如，siRNA、shRNA、miRNA，以减少或防止DGK表达。备选地，可通过用本文所述DGK抑制剂处理来产生DGK缺陷型细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质的细胞，或具有降低的或抑制的Ikaros活性的细胞，可通过遗传方法来生成Ikaros缺陷的细胞，例如，施用RNA干扰剂，例如，siRNA、shRNA、miRNA，以减少或防止Ikaros表达。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂，例如，来那度胺处理来产生Ikaros缺陷的细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros，或具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。此类DGK和Ikaros缺陷的细胞可通过任一本文所述的方法产生。
在一个实施方案中，所述NK细胞得自受试者。在另一实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
其他的表达物
在另一个实施方案中，本文所述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步表达另一种物质，例如增强CAR表达细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，所述物质可以是抑制抑制性分子的物质。抑制性分子的实例包括PD-1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGFβ，例如如本文所述。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的物质包含第一多肽，例如抑制性分子，其与向细胞提供阳性信号的第二多肽，例如本文所述的胞内信号传导结构域缔合。在一个实施方案中，所述物质包含第一多肽，例如抑制性分子如PD-1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4或TGFβ或任何这些的片段，和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，如本文所述的41BB，CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域。在一个实施方案中，所述物质包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28，CD27，OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
在一个实施方案中，本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步包含第二CAR，例如第二CAR，其包含例如针对相同靶标(例如，上述靶标)或不同靶标的不同抗原结合结构域。在一个实施方案中，第二CAR包含针对在与第一CAR的靶标相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第一CAR和靶向第二不同抗原并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第二CAR。
尽管不希望受理论的束缚，但是将第一CAR上的共刺激信号传导结构域(例如4-1BB，CD28，CD27或OX-40)和第二CAR上的初级信号传导结构域(例如CD3ζ)可以将CAR活性限制在两个靶标都被表达的细胞中。在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR包含靶向例如上文所述的靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，第二CAR靶向除了由第一CAR所靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，第二CAR靶向除了由第一CAR所靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞包含本文所述的CAR，例如，针对上述靶标的CAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合在正常细胞但不是癌细胞上发现的抗原的抗原结合结构域，例如也表达靶标的正常细胞。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。例如，抑制性CAR的胞内结构域可以是PD1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4或TGFβ的胞内结构域。
在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)包含第一CAR和第二CAR，所述第一CAR包含结合本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域，所述第二CAR包含PD1细胞外结构域或其片段。
在一个实施方案中，细胞还包含如上所述的抑制性分子。
在一个实施方案中，细胞中的第二CAR是抑制性CAR，其中抑制性CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和抑制性分子的胞内结构域。抑制性分子可以选自PD1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4，TGFβ，CEACAM-1，CEACAM-3和CEACAM-5中的一种或多种。在一个实施方案中，第二CAR分子包含PD1的胞外结构域或其片段。
在实施方案中，细胞中的第二CAR分子还包含胞内信号传导结构域，其包含初级信号传导结构域和/或胞内信号传导结构域。
在其他实施方案中，细胞中的胞内信号传导结构域包含含有CD3ζ功能结构域的初级信号传导结构域和含有4-1BB功能结构域的共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，细胞中的第二CAR分子包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，且第二CAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
拆分CAR(split CAR)
在一些实施方案中，CAR表达细胞使用拆分CAR。在出版物WO2014/055442和WO2014/055657中更详细地描述了拆分CAR方法。简言之，拆分CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且该细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活，细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活并开始细胞杀伤活性。因此，CAR表达细胞仅在两种抗原存在下被完全激活。
多CAR表达
在一个方面，本文描述的CAR表达细胞可以进一步包含第二CAR，例如这样的第二CAR，其包含例如针对相同靶标或不同靶标的不同抗原结合结构域(例如，不是本文所述的癌相关抗原的靶标或是本文所述的不同癌相关抗原的靶标)。在一个实施方案中，第二CAR包含针对与表达癌相关抗原的相同癌细胞类型的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含靶向第一抗原并包含具有共刺激信号传导结构域但不是初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第一CAR和靶向第二种不同抗原，并且包括具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域的第二CAR。尽管不希望受理论的束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如4-1BB，CD28，CD27或OX-40)置于第一CAR上和将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制在两个靶标都被表达的细胞中。在一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一癌相关抗原CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域以及靶向不同靶抗原(例如在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包括抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域的第二CAR。在另一个实施方案中，CAR表达细胞包含第一CAR和第二CAR，第一CAR包含结合本文所述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，且第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包括针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施方案中，要求保护的发明包含第一和第二CAR，其中所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如骆驼科、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR之一的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
同种异体的细胞
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异体的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异体T细胞，例如功能性T细胞受体(TCR)和/或人类白细胞抗原(HLA)(例如I类HLA和/或II类HLA)表达缺乏的同种异体T细胞。
缺乏功能性TCR的T细胞可以例如经工程化以使得在其表面上不表达任一功能性TCR，经工程化以使其不表达包括功能性TCR的一个或更多个亚基，或经工程化以使得在其表面产生非常少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达基本上受损的TCR，例如通过表达突变或截短的形式的一个或更多个TCR的亚基。术语“基本上受损的TCR”是指该TCR不会在宿主中引发不利的免疫反应。
本文所述的T细胞可以例如经工程化以使得其在表面上不表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以经工程化以使得细胞表面表达HLA(例如1类HLA和/或II类HLA)下调。
在一些实施方案中，T细胞可缺少功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLAII类。
缺乏功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞可以通过任一合适的方法获得，包括一个或更多个TCR或HLA的亚基的敲除或敲减。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲减TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，同种异体细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如通过本文所述任一方法。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如所述抑制性分子可以降低CAR表达细胞建立免疫效应子应答的能力。抑制性分子的实例包括PD1，PD-L1，CTLA4，TIM3，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGFβ。抑制性分子的抑制，例如通过在DNA、RNA或蛋白水平的抑制，可以优化CAR表达细胞性能。在实施方案中，可以使用如本文所述的抑制性核酸，例如这样的抑制性核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA，簇状的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)。
siRNA和shRNA以抑制TCR或HLA
在一些实施方案中，可以使用靶向T细胞中编码TCR和/或HLA的核酸的siRNA或shRNA来抑制TCR表达和/或HLA表达。
抑制TCR或HLA的CRISPR系统
如本文中使用的“针对TCR和/或HLA的CRISPR系统”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”是指CRISPR系统(例如，CRISPR/Cas9系统)，其包含一种或多种引导RNA分子和RNA引导的内切核酸酶(例如，Cas，例如Cas9)，所述引导RNA分子包含与TCR和/或HLA或β-2微球蛋白(B2M)的组分的基因内的靶序列互补的靶向结构域。
可以使用本领域已知的技术，例如在美国公开号20140068797和Cong(2013)Science 339:819-823中所述的技术，产生抑制TCR和/或HLA的人工CRISPR/Cas系统。也可产生本领域已知的抑制TCR和/或HLA的其他人工CRISPR/Cas系统，例如在Tsai(2014)Nature Biotechnol.，32:6569-576，美国专利号8,871,445；8,865,406；8,795,965；8,771,945；和8,697,359中描述的。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“HLA和/或TCR的TALEN基因组编辑系统”或“抑制HLA和/或TCR的TALEN”是指转录活化物样效应物核酸酶，一种可用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
通过使TAL效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合来人工产生TALEN。可以将转录活化物样效应(TALEs)经工程化以结合任一目的DNA序列，包括HLA或TCR基因的一部分。通过将工程化的TALE与DNA切割结构域组合，可以产生对于任一目的DNA序列(包括HLA或TCR序列)特异性的限制性酶。然后，这些可以被引入到细胞中，其中它们可用于基因组编辑。Boch(2011)Nature Biotech.29:135-6；和Boch等人(2009)Science 326:1509-12；Moscou等人(2009)Science 326:3501。
使用本领域已知的任一方法，包括使用模块组分的多种方案，可以构建对HLA或TCR中的序列特异的TALEN。Zhang等人(2011)Nature Biotech.29:149-53；Geibler等人(2011)PloS ONE 6:e19509。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“HLA和/或TCR的ZFN基因组编辑系统”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”是指锌指核酸酶，一种可以用于编辑HLA和/或TCR基因的人工核酸酶。
使用本领域已知的任一方法可以构建对HLA和/或TCR中的序列特异的ZFN。参见，例如Provasi(2011)Nature Med.18:807-815；Torikai(2013)Blood 122:1341-1349；Cathomen等人(2008)Mol.Ther.16:1200-7；和Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400:96；美国专利公开2011/0158957；和美国专利公开2012/0060230。
端粒酶表达
虽然不希望受任一特定理论的束缚，在一些实施方案中，由于在T细胞中端粒缩短，治疗性T细胞在患者中具有短期持久性；因此，用端粒酶基因转染能延长T细胞的端粒和改善患者中T细胞的持久性。见Carl June，“Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”，Journal of Clinical Investigation，117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞，例如，T细胞，异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT。在一些方面，本公开内容提供了生产CAR表达细胞的方法，其包括将细胞与编码端粒酶亚基，例如，端粒酶催化亚基，例如，TERT，例如，hTERT的核酸接触。该细胞可以在与编码CAR的构建体接触之前，同时或之后与所述核酸接触。
扩增和激活
免疫效应细胞，如T细胞可通常使用以下所述的方法活化和扩增:例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005，其各通过整体引用并入本文作为参考。
通常，免疫效应细胞，例如T细胞的群体可通过与表面的接触进行扩增，所述表面具有附着于其上的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的例如通过与固定在表面上的抗CD3抗体、或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与钙离子载体协同与蛋白激酶C活化剂(例如苔藓抑素)接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。可以如本领域已知的其它常用方法那样使用抗CD28抗体的实例，包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
在某些方面，可以通过不同的方案提供用于T细胞的初次刺激信号和共刺激信号。例如，提供每种信号的试剂可以在溶液中或被偶联至表面。当与表面偶联时，可以将所述试剂偶联到相同的表面(即，“顺式”形式)或单独的表面(即，“反式”形式)。备选地，可以将一种试剂偶联到表面，且另一种试剂可以在溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的试剂与细胞表面结合，且提供主要活化信号的试剂在溶液中或被偶联至表面。在某些方面，两种试剂都可以在溶液中。在一个方面，试剂可以呈可溶性形式，然后被交联至表面，比如表达将会与该试剂结合的Fc受体或抗体或其它结合剂的细胞。在这点上，关于人工抗原呈递细胞(aAPCs)，参见例如美国专利申请公开号：20040101519和20060034810，考虑其在本发明中用于活化和扩增T细胞。
在一个方面，两种试剂被固定在珠上，其中固定在相同的珠上，即“顺式”，或固定在不同的珠上，即“反式”。举例说明，提供初级活化信号的试剂为抗CD3抗体或其抗原结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至相同的珠。在一个方面，使用结合至用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长的珠的1:1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用一定比率的结合至珠的抗CD3:CD28抗体，以便与利用1:1比率观察到的扩增相比，观察T细胞扩增的增加。在一个具体的方面，与利用1:1比率观察到的扩增相比，观察到从大约1至大约3倍的增加。在一个方面，结合至珠的CD3:CD28抗体的比率处于100:1至1:100的范围内和其间的所有整数值。在一个方面中，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体被结合至颗粒，即CD3:CD28的比率小于1。在一些方面，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个具体的方面，使用结合至珠的抗体的1:100的CD3:CD28比率。在一个方面，使用结合至珠的抗体的1:75的CD3:CD28比率。在进一步的方面，使用结合至珠的抗体的1:50的CD3:CD28比率。在另一个方面，使用结合至珠的抗体的1:30的CD3:CD28比率。在一个优选的方面，使用结合至珠的抗体的1:10的CD3:CD28比率。在一个方面，使用结合至珠的抗体的1:3的CD3:CD28比率。还在另一个方面，使用结合至珠的抗体的3:1的CD3:CD28比率。
从1:500至500:1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多细胞。在一些方面，细胞与颗粒的比率在1:100至100:1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的方面，该比率包括1:9至9:1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3偶联的和抗CD28偶联的颗粒与T细胞的比率可如以上所述的变化，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率为至少1:1颗粒/每个T细胞。在一个方面，使用1:1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的方面，优选的颗粒:细胞的比率为1:5。在进一步的方面，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个方面，颗粒与细胞的比率在第一天为1:1至10:1，和额外的颗粒在每天或此后每隔一天直至10天，以1:1至1:10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:5。在一个方面，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以达到第一天1:1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1:5的最终比率。在一个方面，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2:1并在刺激的第三和第五天被调节至1:10。在一个方面，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以达到第一天1:1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1:10的最终比率。本领域技术人员将理解多种其他比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。在一个方面，最典型的使用比率在第一天在1:1、2:1和3:1附近。
在进一步的方面，细胞(例如T细胞)与包被试剂的珠组合，珠和细胞随后被分离，并且随后培养该细胞。在备选的方面，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的方面，珠和细胞首先通过施加例如磁力的力被聚集，这导致增加的细胞表面标志物的连接作用，由此诱导细胞刺激。
举例说明，可通过允许附接抗CD3和抗CD28的顺磁珠(3×28珠)接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个方面，细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如1:1比率的 M-450CD3/CD28T顺磁珠)在诸如PBS的缓冲液(没有例如钙和镁的二价阳离子)中组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占样本的0.01％，或整个样本(即，100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容中。在一些方面，可期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个方面，使用大约100亿细胞/ml、90亿细胞/ml、80亿细胞/ml、70亿细胞/ml、60亿细胞/ml、50亿细胞/ml或20亿细胞/ml的浓度。在一个方面，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万细胞/ml的细胞浓度。还在另一个方面，使用7.5、8、8.5、9、9.5或10千万细胞/ml的细胞浓度，在进一步的方面，可使用1.25或1.5亿细胞/ml的浓度。利用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩增。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在一些方面期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效地选择正常地具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞例如通过本文所述的方法扩增。在一个实施方案中，细胞在培养中扩增几个小时(例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，细胞扩增4至9天。在一个实施方案中，细胞扩增8天或更短的时间，例如7、6或5天。在一个实施方案中，细胞在培养中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞更有效。可以通过例如各种T细胞功能，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、激活、迁移或其组合来定义效能。在一个实施方案中，与相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，细胞扩增5天，显示在抗原刺激后细胞倍增至少增加1、2、3或4倍。在一个实施方案中，细胞在培养中扩增5天，并且与相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎细胞因子产生，例如IFN-γ和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞显示出pg/ml促炎性细胞因子产生例如IFN-γ和/或GM-CSF水平增加至少1、2、3、4、5、10或更多倍。
也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，所述因子包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇的还原剂。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM,MEM,α-MEM,F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、优选子(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在待注入受试者的细胞培养物中。靶细胞被维持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
在一个实施方案中，细胞在合适的培养基(例如，本文描述的培养基)中扩增，所述培养基包含一种或多种导致细胞在14天的扩增期内增加至少200倍(例如200倍、250倍、300倍、350倍)，例如，如通过本文所述的方法如流式细胞术所测量的。在一个实施方案中，细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩增。
在实施方案中，本文所述的方法，例如CAR表达细胞生产方法，包括从细胞群中移除T调节细胞，例如CD25+T细胞，例如使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2。本文描述了从细胞群移除T调节细胞，例如CD25+T细胞的方法。在实施方案中，该方法(例如制造方法)还包括使细胞群体(例如其中T调节细胞，例如CD25+T细胞已经消耗的细胞群体；或之前与CD25抗体、其片段或CD25结合配体接触的细胞群)与IL-15和/或IL-7接触。例如，在IL-15和/或IL-7存在下，细胞群(例如先前已与抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体接触的细胞群)扩增。
在一些实施方案中，在CAR表达细胞的制造(例如离体)期间，本文所述的CAR表达细胞与包含白细胞介素-15(IL-15)多肽、白细胞介素-15受体α(IL-15Rα)多肽或IL-15多肽和IL-15Rα多肽两者组合(例如，hetIL-15)的组合物接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞在制备CAR表达细胞(例如离体)期间与包含IL-15多肽的组合物接触。在实施方案中，本文所述的CAR表达细胞在制备CAR表达细胞(例如离体)期间与包含IL-15多肽和IL-15Rα多肽的组合的组合物接触。在实施方案中，本文描述的CAR表达细胞在CAR表达细胞的制造(例如离体)期间与包含hetIL-15的组合物接触。
在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞在离体扩增期间与包含hetIL-15的组合物接触。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞在离体扩增期间与包含IL-15多肽的组合物接触。在一个实施方案中，本文所述的CAR表达细胞在离体扩增期间与包含IL-15多肽和IL-15Rα多肽两者的组合物接触。在一个实施方案中，接触导致淋巴细胞亚群例如CD8+T细胞的存活和增殖。
已经暴露于改变的刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，常见的血液或单采外周血单个核细胞产物具有比细胞毒T细胞或阻抑T细胞群体(TC、CD8+)更大的辅助T细胞群体(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩增T细胞产生了约第8-9天之前优势由TH细胞组成的T细胞群体，而约第8-9天之后，T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注优势包含TH细胞的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性亚群，可能有益的是更大程度地扩增这个亚群。
另外，除CD4和CD8标志物之外，其他表型标志物也显著地变动，但是在细胞扩增过程期间大多可重复地变动。因此，这种重现性使得为特定目的而调整活化的T细胞产物的能力成为可能。
一旦本文所述的CAR被构建，则多种测定法可以用来评价该分子的活性，如但不限于抗原刺激后扩增T细胞的能力、在再次刺激不存在的情况下维持T细胞扩增的能力和适宜的体外模型和动物模型中的抗癌活性。下文进一步详细描述评价本发明的CAR的功效的测定法。
原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可以用来检测单体和二聚体的存在。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。非常简要地，将表达CAR的T细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞的1:1混合物)在体外扩增多于10天，随后裂解和在还原条件下进行SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体，通过蛋白质印迹法检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源TCR-ζ链的CAR。相同T细胞亚群用于非还原性条件下的SDS-PAGE分析以允许评价共价二聚体形成。
可以通过流式细胞术测量在抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。例如，CD4+T细胞和CD8+T细胞的混合物用αCD3/αCD28aAPC刺激，随后用待分析的启动子控制下表达GFP的慢病毒载体转导。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。在培养第6日通过流式细胞术评价CD4+和/或CD8+T细胞亚群中的GFP荧光。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009)。备选地，CD4+T细胞和CD8+T细胞的混合物在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并且使用双顺反子慢病毒载体在第1天用CAR转导，其中所述双顺反子慢病毒载体使用2A核糖体跳跃序列表达CAR连同eGFP。在洗涤后，将培养物用本文所述的癌相关抗原+K562细胞(表达本文所述的癌相关抗原的K562)、野生型K562细胞(K562野生型)或表达hCD32和4-1BBL的K562细胞在抗CD3和抗CD28抗体(K562-BBL-3/28)存在下再刺激。每隔1日按100IU/ml添加外源IL-2至培养物。使用基于珠的计数法，通过流式细胞术计数GFP+T细胞。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。
也可以测量在再次刺激不存在的情况下维持的CAR+T细胞扩增。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激并在第1天用所示CAR转导后，在培养第8天使用库尔特粒度分析仪III粒子计数器Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter测量平均T细胞容积(fl)。
动物模型也可以用来测量CART活性。例如，可以使用在免疫缺陷性小鼠中利用人(本文所述的癌相关抗原)特异性CAR+ T细胞处理原代人前B ALL的异种移植模型。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009)。非常简短地，在建立ALL后，将小鼠随机分配至治疗组。将不同数目的癌相关抗原特异性CAR工程化的T细胞按1:1比率共注射至携带B-ALL的NOD-SCID-γ-/-小鼠中。在注射T细胞后的多个时间评价来自小鼠的脾DNA中癌相关抗原特异性CAR载体的拷贝数。按每周一次间隔评估动物的白血病。在用本文所述的癌相关抗原ζCAR+T细胞或模拟转导的T细胞注射的小鼠中测量外周血如本文所述的癌相关抗原+B-ALL母细胞计数。使用对数秩检验，比较各组的生存曲线。此外，也可以分析NOD-SCID-γ-/-小鼠中注射T细胞后4周的外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞绝对计数。将小鼠用白血病细胞注射并且3周后，用经工程化以通过双顺反子慢病毒载体表达CAR的T细胞注射，所述双顺反子慢病毒载体编码与eGFP连接的CAR。通过注射之前与模拟转导的细胞混合，将T细胞对45-50％输入的GFP+T细胞归一化，并且通过流式细胞术证实。按1周间隔评估动物的白血病。使用对数秩检验，比较各CAR+T细胞组的生存曲线。
可以评价剂量依赖性CAR治疗应答。参见，例如，Milone等人，Molecular Therapy17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21日用CAR T细胞、等同数目的模拟转导的T细胞或不用T细胞注射的小鼠中建立白血病后35-70天，获得外周血。来自每个组的小鼠随机采血以测定外周血本文所述癌相关抗原+ALL母细胞计数并且随后在第35和第49日杀死。在第57和第70天评价剩余动物。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如，在Milone等人，Molecular Therapy 17(8):1453-1464(2009)处描述。简而言之，在微量滴定板中通过将洗涤的T细胞与表达本文所述癌相关抗原(K19)的K562细胞或表达CD32和CD137的K562细胞(KT32-BBL)按T细胞:K562最终比率2:1混合，评估CAR介导的增殖。K562细胞在使用之前用γ-辐射照射。将抗CD3(克隆OKT3)单克隆抗体和抗CD28(克隆9.3)单克隆抗体添加至培养物，以KT32-BBL细胞充当刺激T细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持CD8+T细胞离体长期扩增。如制造商所描述那样使用CountBrightTM荧光珠(Invitrogen,Carlsbad,CA)和流式细胞术，计数培养物中的T细胞。使用T细胞依据GFP表达鉴定CAR+ T细胞，其中使用的所述T细胞用表达eGFP-2A连接的CAR的慢病毒载体工程化。对于不表达GFP的CAR+ T细胞，用生物素酰化的重组本文所述癌相关抗原蛋白和第二亲和素-PE缀合物检测CAR+ T细胞。还同时用特异性单克隆抗体(BD Biosciences)检测T细胞上的CD4+表达和CD8+表达。使用人TH1/TH2细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD Biosciences,SanDiego,CA)根据制造商的说明，对再次刺激后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用FACScalibur流式细胞仪评估荧光并且根据制造商的说明分析数据。
细胞毒性可以由标准51Cr释放测定法评估。参见，例如，Milone等人，MolecularTherapy 17(8):1453-1464(2009)。简而言之，将靶细胞(K562系和原代前B-ALL细胞)在37℃用51Cr(作为NaCrO4，New England Nuclear,Boston,MA)加载2小时伴以频繁搅拌，在完全RPMI中洗涤2次并铺种至微量滴定板中。在孔中，将效应T细胞与靶细胞在完全RPMI中按不同的效应细胞:靶细胞比率(E:T)混合。还制备仅含有培养基(自发释放，SR)或1％triton-X100去垢剂溶液(总释放，TR)的额外孔。在37℃温育4小时后，从每个孔收获上清液。随后使用γ粒子计数器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)测量释放的51Cr。每条件按至少三次重复进行并且使用下式计算裂解百分数:裂解％＝(ER-SR)/(TR–SR)，其中ER代表每种实验条件的51Cr平均释放。
成像技术可以用来评价携瘤动物模型中CAR的特异性转运和增殖。已经描述此类测定法，例如，在Barrett等人，Human Gene Therapy 22:1575-1586(2011)中描述。简而言之，将NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠用Nalm-6细胞静脉内注射，7天后，用CAR构建体电穿孔后4小时，用T细胞静脉内注射。T细胞用表达萤火虫萤光素酶的慢病毒构建体稳定转染并且对小鼠的生物发光成像。备选地，可以如下测量Nalm-6异种移植模型中单次注射CAR+ T细胞的治疗功效和特异性:NSG小鼠用经转导以稳定表达萤火虫萤光素酶的Nalm-6注射，7天后，随后单次尾静脉注射经工程化以表达本发明CAR的(例如用编码本发明CAR的核酸转导的)T细胞。在注射后的多个时间点对动物成像。例如，可以在第5日(处理前2天)和第8日(CAR+PBL后24小时)生成代表性小鼠中萤火虫萤光素酶阳性白血病的光子密度热图。
其他测定法，包括在本文实施例部分中描述的那些以及本领域已知的那些，也可以用来评价本发明所述的CAR。
治疗方法/联合治疗
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括作为疗法联合施用本发明的LSD1抑制剂与免疫效应细胞群体，例如经工程化以表达CAR分子，例如如本文所述。通常，这种施用将呈现表达CAR的细胞(例如，自体或同种异体宿主细胞)和分开施用LSD1抑制剂的形式。备选地，LSD1抑制剂可以与经工程化以表达CAR分子的细胞在相同的组合物中施用。备选地，经工程化以表达CAR分子的细胞也可以经工程化以表达LSD1抑制剂。在一个实施方案中，受试者患有本文所述的病症，例如受试者患有癌症，例如受试者患有表达本文所述的靶抗原的癌症。在一个实施方案中，受试者是人。
本文描述的包括施用本文所述的LSD1抑制剂和CAR表达细胞的方法可以与其他已知的药剂和疗法联合使用。
如本文所用，“组合”施用意指，在受试者罹患病症期间向受试者递送两种或更多种不同治疗，例如，在受试者已经诊断患有该病症后并且在该病症已经治愈或消除或治疗已经出于其他原因而停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始递送第二治疗时，一种治疗的递送仍然正在进行，从而就施用而言存在重叠。这有时在本文中称作“同时”或“同步递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在开始递送第二种治疗前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗因为联合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，在第二治疗较少时观察到等同作用，或第二治疗减少症状到更大程度，大于如果第二治疗在第一治疗不存在时施用所见的程度、或采用第一治疗时观察到类似的情况。在一些实施方案中，如此递送，从而与该病症相关的症状或其他参数的减少大于一种治疗在另一种治疗不存在下递送情况下将会观察到的减少。两种治疗药的效果可以部分加合、完全加合或超过加合。递送可以是这样的，其中当递送第二治疗药时，仍然可检测第一治疗的效果。
本文描述的CAR表达细胞，LSD1抑制剂和至少一种额外治疗剂可以同时、在相同或分开的组合物中或顺序施用。这三种药剂可以以任何顺序施用。例如，在顺序施用中，本文所述的LSD1抑制剂和CAR表达细胞可以首先施用，并且其他药剂可以其次施用，或者施用顺序可以相反。
CAR治疗和/或其他治疗剂、程序或方式可在活动病症的周期期间或疾病缓解或更少活动疾病期间施用。CAR疗法可以在其它治疗之前，与其他治疗同时、治疗后或在病症的缓解期间施用。
在另一个方面，本发明涉及治疗患有与如本文所述的癌相关抗原表达相关的疾病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的包含CAR分子的细胞，例如本文所述的CAR分子。
在一个方面，本发明提供了用于治疗与本文所述的癌相关抗原表达相关的疾病的方法。该方法包括施用LSD1抑制剂和施用细胞，例如T细胞，例如表达或可以表达CAR的T细胞。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达XCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中X代表肿瘤标志物(或癌相关抗原；如本文所用，术语XCAR和CARX可互换使用，例如，CAR19或CAR CD19与CD19CAR相同)，并且其中所述癌细胞表达所述X肿瘤标志物(或癌相关抗原)。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD19 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是ALL(急性淋巴细胞白血病)，CLL(慢性淋巴细胞性白血病)，DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)，MCL(套细胞淋巴瘤或MM(多发性骨髓瘤))。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达EGFRvIIICAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达EGFRvIII。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达间皮素CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达间皮素。在一个实施方案中，待治疗的癌症是间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD123CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD123。在一个实施方案中，待治疗的癌症是AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD22CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD22。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CS-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CS-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CLL-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CLL-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD33CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD33。在一个实施方案中，待治疗的癌症是AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GD2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GD2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达BCMACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达BCMA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TnCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Tn抗原。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PSMACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PSMA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ROR1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达ROR1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达FLT3 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达FLT3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TAG72CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TAG72。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD38CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD38。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD44v6CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD44v6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是宫颈癌、AML或MM。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CEACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CEA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠道癌症或胰腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达EPCAMCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达EPCAM。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达B7H3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达B7H3。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达KITCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达KIT。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达IL-13Rα2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达IL-13Rα2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD30CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD30。在一个实施方案中，待治疗的癌症是淋巴瘤或白血病。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GD3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GD3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD171CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD171。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或NSCLC(非小细胞肺癌)。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达IL-11RαCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达IL-11Ra。在一个实施方案中，待治疗的癌症是骨肉瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PSCACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PSCA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达VEGFR2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达VEGFR2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达LewisYCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LewisY。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌或AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD24CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD24。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胰腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PDGFR-βCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PDGFR-β。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、前列腺癌、GIST(胃肠道间质瘤)、CML、DFSP(隆突性皮肤纤维肉瘤)或神经胶质瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达SSEA-4CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达SSEA-4。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌或干细胞癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD20CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD20。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达叶酸受体αCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达叶酸受体α。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、NSCLC、子宫内膜癌、肾癌或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ERBB2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达ERBB2(HER2/neu)。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、肺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MUC1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达MUC1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达EGFRCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达EGFR。在一个实施方案中，待治疗的癌症是成胶质细胞瘤、SCLC(小细胞肺癌)、SCCHN(头颈部鳞状细胞癌)、NSCLC或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达NCAMCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达NCAM。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CAIXCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CAIX。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肾癌、CRC、宫颈癌或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达EphA2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达EphA2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是GBM。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GD3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GD3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达岩藻糖基GM1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达岩藻糖基GM。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达sLeCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达sLe。在一个实施方案中，待治疗的癌症是NSCLC或AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GM3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GM3。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TGS5CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TGS5。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达HMWMAACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达HMWMAA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤，成胶质细胞瘤或乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达邻乙酰基-GD2 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达邻乙酰基-GD2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达叶酸受体βCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD19。在一个实施方案中，待治疗的癌症是AML或骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TEM1/CD248CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TEM1/CD248。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TEM7RCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TEM7R。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CLDN6CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CLDN6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌，肺癌或乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TSHRCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TSHR。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌或多发性骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GPRC5DCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GPRC5D。在一个实施方案中，待治疗的癌症是多发性骨髓瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CXORF61CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CXORF61。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD97CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD97。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤、胃癌、胰腺癌、食管癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌或结肠直肠癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CD179aCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD179a。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ALK CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达ALK。在一个实施方案中，待治疗的癌症是NSCLC、ALCL(间变性大细胞淋巴瘤)、IMT(炎性肌纤维母细胞瘤)或神经母细胞瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达多聚唾液酸CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达多聚唾液酸。在一个实施方案中，待治疗的癌症是小细胞肺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PLAC1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PLAC1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是HCC(肝细胞癌)。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GloboHCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GloboH。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达NY-BR-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达NY-BR-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达UPK2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达UPK2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是膀胱癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达HAVCR1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达HAVCR1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肾癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ADRB3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达ADRB3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是尤因氏肉瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PANX3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PANX3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是骨肉瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达GPR20CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GPR20。在一个实施方案中，待治疗的癌症是GIST。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达LY6KCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LY6K。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌、卵巢癌或宫颈癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达OR51E2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中癌细胞表达OR51E2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TARPCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TARP。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达WT1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达WT1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达NY-ESO-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达NY-ESO-1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达LAGE-1a CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达LAGE-1a。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MAGE-A1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MAGE-A1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MAGE A1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达MAGE A1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ETV6-AML CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达ETV6-AML。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达精子蛋白17CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌症细胞表达精子蛋白17。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、HCC或NSCLC。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达XAGE1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达XAGE1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是尤因瘤或者横纹肌癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达Tie2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Tie2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MAD-CT-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达MAD-CT-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌或黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MAD-CT-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达MAD-CT-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌、黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达Fos相关抗原1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Fos相关抗原1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经胶质瘤、鳞状细胞癌或胰腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达p53CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达p53。
在一个方面中，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达prostein CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达prostein。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达存活蛋白和端粒酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达存活蛋白和端粒酶。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PCTA-1/半乳凝素8CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PCTA-1/半乳凝素8。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MelanA/MART1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MelanA/MART1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达Ras突变体CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达Ras突变体。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达p53突变体CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达p53突变体。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达hTERT CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达hTERT。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达肉瘤易位断点CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌症细胞表达肉瘤易位断点。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肉瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ML-IAP CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌症细胞表达ML-IAP。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达ERGCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达NA17CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达NA17。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PAX3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PAX3。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肺泡横纹肌肉瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达雄激素受体CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达雄激素受体。在一个实施方案中，待治疗的癌症是转移性前列腺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达细胞周期蛋白B1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达细胞周期蛋白B1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达MYCNCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达MYCN。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达RhoC CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达RhoC。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达TRP-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达TRP-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达CYP1B1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CYP1B1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、结肠癌、肺癌、食管癌、皮肤癌、淋巴结癌、脑癌或睾丸癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达BORIS CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达BORIS。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肺癌。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达SART3CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达SART3。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PAX5CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PAX5。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达OY-TES1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达OY-TES1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达LCK CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LCK。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达AKAP-4CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达AKAP-4。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达SSX2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达SSX2。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达RAGE-1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达RAGE-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是RCC(肾细胞癌)或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达人端粒酶逆转录酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达人端粒酶逆转录酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达RU1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达RU1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达RU2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达RU2。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达肠羧基酯酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达肠羧基酯酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌、RCC、CRC(结肠直肠癌)、乳腺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化而表达Prostase CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达Prostase。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达PAPCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达PAP。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达IGF-I受体CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达IGF-I受体。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达gp100 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达gp100。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达bcr-abl CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达bcr-abl。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达酪氨酸酶CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达酪氨酸酶。
在一个方面，本发明提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达岩藻糖基GM1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达岩藻糖基GM1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供LSD1抑制剂和经工程化以表达mut hsp70-2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌症细胞表达mut hsp70-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD79aCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD79a。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD79bCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD79b。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD72 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD72。
在一个方面，本发明提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达LAIR1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LAIR1。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达FCAR CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达FCAR。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达LILRA2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LILRA2。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD300LFCAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CD300LF。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CLEC12ACAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达CLEC12A。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达BST2CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)来治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达BST2。
在一个方面，本发明提供了通过向需要其的受试者提供经工程化以表达EMR2 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达EMR2。
在一个方面，本发明提供了通过向需要的受试者提供经工程化以表达LY75 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达LY75。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达GPC3 CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达GPC3。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达FCRL5CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达FCRL5。
在一个方面，本发明提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达IGLL1CAR的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)治疗癌症的方法，其中所述癌细胞表达IGLL1。
在一个方面，本发明涉及使用LSD1抑制剂和PD1 CAR在体内治疗受试者，从而抑制癌性肿瘤的生长。可以仅使用PD1 CAR用于抑制癌性肿瘤的生长。备选地，PD1 CAR可以与其他CAR、免疫原性剂、标准癌症治疗或其他抗体联合使用。在一个实施方案中，用本文所述的PD1 CAR和XCAR治疗受试者。在一个实施方案中，PD1 CAR与另一种CAR(例如本文所述的CAR)和激酶抑制剂(例如本文所述的激酶抑制剂)联合使用。
在另一个方面，提供治疗受试者的方法，例如减轻或改善受试者中过度增殖性病症或紊乱(例如癌症)，例如，实体瘤，软组织肿瘤，血液学癌症或转移性病变。在一些实施方案中，所述方法包括施用LSD1抑制剂和工程化以表达CAR的免疫效应细胞群体，例如T细胞。
在又一个方面中，本发明的特征在于治疗患有与肿瘤抗原(例如本文所述的抗原)的表达相关的疾病的受试者的方法，包括给予所述受试者有效量的包含CAR分子的细胞，例如，免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群体)，其中所述CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域结合至与疾病相关的肿瘤抗原，如本文所述肿瘤抗原。
在相关的方面，本发明提供治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病的受试者的方法。该方法包括给予所述受试者有效量的包含CAR分子的细胞，例如，免疫效应细胞(例如免疫效应细胞群体)与增加免疫细胞的功效的作用剂(除了LSD1抑制剂之外还有的其它作用剂)的组合，其中:
该增加免疫细胞的功效的作用剂选自以下一种或多种:
(i)蛋白磷酸酶抑制剂；
(ii)激酶抑制剂；
(iii)细胞因子；
(iv)免疫抑制分子的抑制剂；或
(v)降低TREG细胞的水平或活性的作用剂。
在另一个方面，本发明描述了包含含有CAR分子(例如，如本文所描述的CAR分子)的免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群)的组合物，用于治疗患有与肿瘤抗原的表达相关的疾病如本文所述的病症的受试者。
在任何上述方法或用途的某些实施方案中，与肿瘤抗原，例如，本文所述的肿瘤抗原相关的疾病选自增生性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤或癌前疾病，如脊髓发育不良，骨髓增生异常综合征或白血病前期，或与本文所述的肿瘤抗原的表达相关联的非癌症相关的适应征。在一个实施方案中，该疾病是本文所述的癌症，例如，本文中描述为与本文中所描述的靶标有关的癌症。在一个实施方案中，该疾病是血液癌症。在一个实施方案中，血液癌症是白血病。在一个实施方案中，癌症选自一种或多种急性白血病，包括但不限于B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)，T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)，急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于慢性髓性白血病(CML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)；附加血癌或血液病症，包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥散性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴增殖状况，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆母细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症，以及“白血病前期”，这是由无效产生(或发育异常)髓血细胞联合的一组不同的血液学状况，以及与本文所述肿瘤抗原的表达相关的疾病包括，但不局限于，非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，表达如本文所述肿瘤抗原的癌前期病症或增生性疾病；和它们的任意组合。在另一个实施方案中，与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病是实体瘤。
在一些实施方案中，所述方法或用途与增加免疫效应细胞的功效的作用剂，例如，如本文所述的作用剂组合实施。
在任何上述方法或用途中，与肿瘤抗原的表达相关的疾病选自增生性疾病，癌前疾病，癌症和与肿瘤抗原的表达相关的非癌症相关的适应征。
所述癌症可以是血液癌症，例如，选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞急性淋巴性白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴性白血病(T-ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞树突状细胞瘤、伯基特淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞-滤泡型淋巴瘤、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、或白血病前期的一种或多种的癌症。
癌症也可以选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺的非小细胞癌、小肠癌、食道癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊椎肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病灶。
在本文所描述的方法或用途的某些实施方案中，CAR分子与增加免疫效应细胞的功效的作用剂(除了LSD1抑制剂之外还有的其它作用剂)组合，例如，一种或多种蛋白磷酸酶抑制剂，激酶抑制剂，细胞因子，免疫抑制分子的抑制剂；或降低TREG细胞的水平或活性的作用剂组合施用。
在本文中所描述的方法或用途的某些实施方案中，蛋白磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂和/或SHP-2抑制剂。
在本文中所描述的方法或用途的其他实施方案中，激酶抑制剂选自一种或多种CDK4抑制剂，CDK4/6抑制剂(例如，palbociclib)，BTK抑制剂(例如，ibrutinib或RN-486)，mTOR抑制剂(如，雷帕霉素或依维莫司(RAD001))，MNK抑制剂或双P13K/mTOR抑制剂。在一个实施方案中，所述BTK抑制剂不减少或抑制白介素-2诱导的激酶(ITK)的激酶活性。
在本文中所描述的方法或用途的其他实施方案中，抑制免疫抑制分子的作用剂包括抗体或抗体片段，抑制性核酸，聚簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)，转录激活子样效应核酸(TALEN)，或抑制所述抑制性分子的表达的锌指内切核酸酶(ZFN)。
在本文中所描述的方法或用途的其他实施方案中，所述降低TREG细胞的水平或活性的作用剂选自环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25消耗，或它们的组合。
在本文所描述的方法或用途的某些实施方案中，免疫抑制性分子选自PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5。
在其他实施方案中，抑制抑制性分子的作用剂包括含有抑制性分子或其片段的第一多肽，和提供正信号给细胞的第二多肽，以及其中所述第一和第二多肽在含CAR的免疫细胞上表达，其中(i)所述第一多肽包含PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFβ、CEACAM-1、CEACAM-3和CEACAM-5或其片段；和/或(ii)所述第二多肽包含含有初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能结构域；和/或共刺激信号传导结构域包含选自41BB、CD27和CD28的蛋白质的功能结构域。
在其他实施方案中，细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21或其组合。
在其他实施方案中，将包含CAR分子的免疫效应细胞和第二种，例如，本文公开的任何联合疗法(例如，增加免疫效应细胞的功效的作用剂)基本上同时或顺序施用。
在其他实施方案中，将包含CAR分子的免疫细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子组合施用。在一些实施方案中，靶向GITR和/或调节GITR功能的分子在CAR表达细胞或细胞群之前，或单采血液成分术之前施用。
在一个实施方案中，淋巴细胞输注，例如同种异体淋巴细胞输注用于癌症的治疗中，其中所述淋巴细胞输注包含至少一种本发明的CAR表达细胞。在一个实施方案中，自体淋巴细胞输注用于癌症治疗中，其中自体淋巴细胞输注包含至少一种本文描述的CAR表达细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是T细胞并且T细胞是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。在一个实施方案中，所述细胞是T细胞并且T细胞是Ikaros缺陷的。在一个实施方案中，所述细胞是T细胞并且T细胞是DGK和Ikaros基因都缺陷的。
在一个实施方案中，该方法包括施用如本文所述的表达CAR分子的细胞，与增强CAR表达细胞的活性的作用剂的组合，其中所述作用剂是细胞因子，例如，IL-7、IL-15、IL-18、IL-21或它们的组合。所述细胞因子可与例如CAR表达细胞组合递送，与CAR表达细胞同时施用或CAR表达细胞施用之后不久施用。备选地，细胞因子可以在CAR表达细胞施用之后延长的时间后，例如，评估受试者对CAR表达细胞的应答后递送。在一个实施方案中，细胞因子与权利要求61-80任一项的细胞或细胞群被同时(例如，在同一天施用)施用于受试者或所述细胞或细胞群施用后不久(例如，施用后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天)施用。在其他实施方案中，细胞因子在权利要求61-80任一项的细胞或细胞群施用后延长的时间段之后(例如，至少2周、3周、4周、6周、8周、10周或以上)或在评估受试者对细胞的应答后施用给受试者。
在其他实施方案中，将表达CAR分子的细胞与改善与表达CAR分子的细胞的施用相关的一种或多种副作用的作用剂组合给药。与CAR表达细胞相关的副作用可以选自细胞因子释放综合征(CRS)或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。
在任何前述方法或用途的实施方案中，将表达CAR分子的细胞与治疗与肿瘤抗原的表达相关的疾病的作用剂，例如，本文公开的任何第二或第三疗法组合给药。另外的示例性组合包括以下一种或多种。
在另一个实施方案中，如本文所述的表达CAR分子的细胞与另一种作用剂，例如，本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂组合施用。在一个实施方案中，表达CAR分子的细胞可以进一步表达另一种作用剂，例如，增强CAR表达细胞的活性的作用剂。
例如，在一个实施方案中，可增强CAR表达细胞的活性的作用剂可以是抑制抑制性分子(例如，免疫抑制分子)的作用剂。抑制性分子的实例包括PD1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGFβ。
在一个实施方案中，抑制抑制性分子的作用剂是抑制性核酸，如dsRNA，siRNA或shRNA。在实施方案中，抑制性核酸连接到编码CAR分子的组分的核酸。例如，抑制性分子可以在CAR表达细胞上表达。
在另一个实施方案中，抑制抑制性分子的作用剂是，例如，本文中所描述的分子，例如，包含第一多肽(例如，抑制性分子)与提供正信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合的作用剂。在一个实施方案中，所述作用剂包含第一多肽，例如，抑制性分子，例如，PD-1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如，CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4或TGFβ，或这些任一种的片段(例如，这些任一种的至少部分细胞外结构域)的第一多肽，和第二多肽，其是本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB，CD27或CD28，例如，如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述作用剂包含PD1的第一多肽或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)，和本文所述的胞内信号传导结构域的第二多肽(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。
在一个实施方案中，本发明的CAR表达免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，被施用于已接受先前干细胞移植，例如，自体干细胞移植的受试者。
在一个实施方案中，本发明的CAR表达免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，被施用于已经接受美法仑的先前剂量的受试者。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞，与增加表达CAR分子的细胞的功效的作用剂，例如，本文中所描述的作用剂组合施用。
在一个实施方案中，与LSD1抑制剂联合施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。虽然不希望受理论的束缚，但是认为伴随采用LSD1抑制剂的治疗的是PD-1阳性T细胞的减少或PD-1阴性细胞的增加。PD-1阳性T细胞而非PD-1阴性T细胞能够因结合表达PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)的细胞而被消耗。
在一个实施方案中，这种方法能够被用来优化所述受试者中本文中描述的CAR细胞的性能。虽然不希望受理论的束缚，但是认为，在一个实施方案中，所述内源性的没有修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)的性能得到了改善。虽然不希望受理论的束缚，但是认为，在一个实施方案中，所述的表达靶抗原CAR的细胞的性能得到了改善。在其他实施方案中，可以通过与一定量的增大PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的数目或增大PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率的LSD1抑制剂离体接触，来处理已经或将要被工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一个实施方案中，在施用本文中描述的表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)之前，开始施用LSD1抑制剂。在一个实施方案中，在足够的时间或足够的剂量施用LSD1抑制剂之后，施用所述的CAR细胞，使得PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少暂时地增大了。
在一个实施方案中，在足够的时间或足够的定量施用所述的LSD1抑制剂，使得在所述的受试者中或从所述的受试者收获的PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的水平或PD1阴性的免疫效应细胞(例如，T细胞)/PD1阳性的免疫效应细胞(例如，T细胞)的比率已经至少暂时地增大之后，收获将要被工程化以表达CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一个实施方案中，与减轻一种或更多种与施用表达CAR分子的细胞相关的副作用的作用剂(例如，本文中描述的作用剂)联合，来施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一个实施方案中，与治疗所述的与如本文所述的癌相关抗原相关的疾病的作用剂(例如，本文中描述的作用剂)联合，来施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一个实施方案中，将表达两种或两种以上CAR分子，例如，如本文中所描述的CAR分子的细胞施用于需要其的受试者以治疗癌症。在一个实施方案中，将包括例如，如本文所述的CAR表达细胞的细胞群体施用于需要其的受试者以治疗癌症。
在一个实施方案中，以本文中描述的剂量和/或施用方案计划施用所述的表达CAR分子(例如，本文中描述的CAR分子)的细胞。
在一个实施方案中，例如，利用体外转录将所述的CAR分子引入免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)中，并且所述的受试者(例如，人)接受包含CAR分子的细胞的初次施用，以及包含CAR分子的细胞的一次或更多次后续的施用，其中所述的一次或更多次后续的施用是在所述先前的施用之后15天以内，例如，14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天以内。在一个实施方案中，每个星期给所述的受试者(例如，人)施用多于一次的包含CAR分子的细胞施用，例如，每个星期施用2、3或4次包含CAR分子的细胞。在一个实施方案中，所述的受试者(例如，人受试者)每个星期接受超过一次的包含CAR分子的细胞施用(例如，每个星期2、3或4次施用)(本文中也被称为循环)，随后一个星期不施用包含CAR分子的细胞，再然后给所述的受试者施用一次或更多次额外的包含CAR分子的细胞施用(例如，每个星期施用所述的包含CAR分子的细胞超过一次)。在另一个实施方案中，所述的受试者(例如，人受试者)接受超过一个循环的包含CAR分子的细胞，并且每个循环之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4、或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用所述的包含CAR分子的细胞，每个星期3次施用。在一个实施方案中，施用所述的包含CAR分子的细胞持续至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个星期。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞，被作为疾病例如，癌症，例如，本文所述的癌症的第一线治疗施用。在另一个实施方案中，表达CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞，被作为疾病例如，癌症，例如，本文所述的癌症的第二，第三，第四线治疗施用。
在一个实施方案中，施用本文描述的细胞群体。
在另一个方面，本发明涉及分离的编码本发明的CAR的核酸分子，分离的本发明的CAR的多肽分子，包含本发明的CAR的载体和包含本发明的CAR的细胞用作药物。
在另一个方面，本发明涉及分离的编码本发明的CAR的核酸分子，分离的本发明的CAR的多肽分子，包含本发明的CAR的载体和包含本发明的CAR的细胞用于治疗表达如本文所述的癌相关抗原的疾病。
在另一个方面，本发明涉及表达如本文所述的CAR分子的细胞与细胞因子例如，如本文所述的IL-7，IL-15和/或IL-21组合用作药物。在另一个方面，本发明涉及本文所述的细胞因子与表达本文所述的CAR分子的细胞组合用作药物。
在另一个方面，本发明涉及表达如本文所述的CAR分子的细胞与如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂组合用作药物。在另一个方面，本发明涉及如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂与表达本文所述的CAR分子的细胞组合用作药物。
在另一个方面，本发明涉及表达如本文所述的CAR分子的细胞与细胞因子例如，如本文所述的IL-7，IL-15和/或IL-21组合用于治疗表达CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。在另一个方面，本发明涉及本文所述的细胞因子与表达本文所述的CAR分子的细胞组合治疗表达CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。
在另一个方面，本发明涉及表达如本文所述的CAR分子的细胞与如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂组合用于治疗表达CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。在另一个方面，本发明涉及如本文所述的激酶抑制剂和/或检查点抑制剂与表达本文所述的CAR分子的细胞组合治疗表达CAR靶向的肿瘤抗原的疾病。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括施用CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)，或包含编码CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的核酸的细胞。在一个实施方案中，受试者具有本文所描述的病症，例如，受试者患有癌症，例如，受试者患有癌症并且具有表达本文所述的肿瘤支持抗原的肿瘤支持细胞。在一个实施方案中，受试者是人。
在另一个方面，本发明涉及治疗患有与如本文描述的肿瘤支持抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的包含CAR分子(例如，本文所述的CAR分子)的细胞。
在又一个方面中，本发明描述了治疗患有与肿瘤支持抗原的表达相关的疾病的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的细胞，例如，包含CAR分子的免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群体)，其中所述CAR分子包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，所述细胞内结构域包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域结合与疾病有关的肿瘤支持抗原，例如本文所述肿瘤支持抗原。
在另一个方面，本发明描述了包含含有CAR分子(例如，如本文所描述的CAR分子)的免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群)的组合物，用于治疗与肿瘤支持抗原的表达相关的疾病(例如，本文所描述的疾病)的受试者。
在任何上述方法或用途中，与肿瘤支持抗原的表达相关的疾病选自与肿瘤支持抗原的表达相关的增生性疾病，癌前疾病，癌症和非癌症相关的适应征。在一个实施方案中，与本文中所述的肿瘤支持抗原相关的疾病是实体瘤。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，CAR分子与另一种药剂组合施用。在一个实施方案中，所述药剂可以是激酶抑制剂，例如CDK4/6抑制剂，BTK抑制剂，mTOR抑制剂，MNK抑制剂或双重PI3K/mTOR抑制剂及其组合。在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂(例如，本文所述的CDK4抑制剂，例如，CD4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作帕布昔利布或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的MNK抑制剂，如，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。双PI3K/mTOR抑制剂可以是，例如PF-04695102。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂:aloisineA；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；帕布昔利布(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)和XL281(BMS908662)。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，帕布昔利布(PD0332991)，并且帕布昔利布以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，在28天周期中每日施用14-21天，或在21天周期中每日施用7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的帕布昔利布。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂:依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个实施方案中，BTK抑制剂不减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼(PCI-32765)，并且依鲁替尼以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是不抑制ITK的激酶活性的BTK抑制剂，例如RN-486，并且RN-486以每天约100mg、110mg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg、210mg、220mg、230mg、240mg、250mg(例如、150mg、200mg或250mg)的剂量施用一段时间，例如每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7或更多个RN-486周期。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂:坦罗莫司；地磷莫司((1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十七碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126)(SEQ IDNO:1937)；和XL765。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂:CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR双重抑制剂:2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的免疫效应细胞与蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如本文所述的蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用于受试者。在一个实施方案中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如本文所述的SHP-1抑制剂，例如锑葡糖酸钠。在一个实施方案中，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在本文所述的方法或用途的一个实施方案中，CAR分子与另一种药剂组合施用，并且所述药剂是细胞因子。细胞因子可以是例如IL-7，IL-15，IL-21或其组合。在另一个实施方案中，CAR分子与检查点抑制剂例如本文所述的检查点抑制剂联合施用。例如，在一个实施方案中，检查点抑制剂抑制选自PD-1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGFβ的抑制性分子。
在一个方面，本发明的CAR可以用于根除本文所述的表达肿瘤抗原的正常细胞，从而可用于在细胞移植之前用作细胞调理疗法。在一个方面，如本文所述表达肿瘤抗原的正常细胞是正常干细胞，且细胞移植是干细胞移植。
治疗应用
在另一个方面，提供了治疗受试者的方法，例如减少或改善受试者中的过度增殖性病症或病症(例如癌症)，例如实体瘤，软组织肿瘤或转移性病变。如本文所用，术语“癌症”意指包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵入阶段。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤，腺癌和癌，例如影响肝，肺，乳腺，淋巴，胃肠(例如结肠)，泌尿生殖道(例如肾，尿道上皮细胞)，前列腺和咽部的那些。腺癌包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌和食道癌。在一个实施方案中，癌症是黑素瘤，例如晚期黑素瘤。使用本发明的方法和组合物也可以治疗或预防上述癌症的转移性病灶。可以治疗的其他癌症的实例包括骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈部癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌症，胃癌，睾丸癌癌症，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，食道癌，小肠癌，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，慢性或急性白血病包括急性骨髓性白血病，慢性粒细胞性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞性白血病，儿童实体瘤，淋巴细胞性淋巴瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌中枢神经系统(CNS)肿瘤，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱导的癌症，包括由石棉诱导的那些，以及所述癌症的组合。使用本文所述的抗体分子可以实现转移性癌症，例如表达PD-L1的转移性癌症的治疗(Iwai等人(2005)Int.Immunol.17:133-144)。
其生长可以被抑制的示例性癌症包括一般对免疫治疗有反应的癌症。用于治疗的癌症的非限制性实例包括黑素瘤(例如转移性恶性黑素瘤)，肾癌(例如透明细胞癌)，前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)，乳腺癌，结肠癌和肺癌(例如非小细胞肺癌)。另外，可以使用本文所述的分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
在一个方面，本发明涉及包含与启动子有效连接以便在哺乳动物免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)中表达的CAR的载体。在一个方面，本发明提供了表达本发明的CAR的重组免疫效应细胞，用于治疗如本文所述的癌相关抗原表达的癌症。在一个方面，本发明的CAR表达细胞能够接触表面上表达至少一种癌相关抗原的肿瘤细胞，使得CAR表达细胞靶向癌细胞并且抑制癌症的生长。
在一个方面，本发明涉及抑制癌症生长的方法，包括使癌细胞与本发明的CAR表达细胞接触，使得CART响应于抗原被激活并靶向癌细胞，其中肿瘤的生长受到抑制。
在一个方面，本发明涉及治疗受试者中的癌症的方法。该方法包括向受试者施用本发明的CAR表达细胞，使得在受试者中治疗癌症。在一个方面，如本文所述与癌相关抗原表达相关的癌症是血液学癌症。在一个方面，血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与如本文所述的癌相关抗原表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于例如一种或多种急性白血病，包括但不限于例如B细胞急性淋巴性白血病(“BALL”)，T细胞急性淋巴性白血病(“TALL”)，急性淋巴性白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性骨髓性白血病(CML)，慢性淋巴性白血病(CLL)。与本文所述的癌相关抗原表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病，胚细胞浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特氏淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，多毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴增生症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，浆细胞淋巴瘤，浆细胞样树突状细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和“白血病前期”，它们是由骨髓血细胞的无效产生(或发育不良)合起来的血液学疾病的各种集合，等等。此外，与本文所述的癌相关抗原相关的疾病包括但不限于例如与本文所述的癌相关抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病变或增殖性疾病。
在一些实施方案中，可以用本发明的CAR表达细胞治疗的癌症是多发性骨髓瘤。一般而言，骨髓瘤细胞被认为对于通过流式细胞术表达的如本文所述的癌相关抗原是阴性的。因此，在一些实施方案中，例如如本文所述的CD19 CAR可用于靶向骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，本发明疗法的CAR可以与一种或多种另外的疗法(例如来那度胺治疗)联合使用。
本发明包括一个类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)并且将表达CAR的T细胞或NK细胞输注至有需求的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。不同于抗体疗法，CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)能够在体内复制，产生可以导致持久肿瘤控制的长期留存。在多个方面中，在施用免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)至患者后，向患者施用的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)或其后代在患者中留存至少4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年或5年。
本发明还包括一个类型的细胞疗法，其中免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)经修饰(由体外转录的RNA修饰)以瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)并且将CAR T细胞或NK细胞输注至有需求的接受者。输注的细胞能够杀伤接受者中的肿瘤细胞。因此，在多个方面，在施用免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)至患者后，向患者施用的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)存在少于1个月，例如，3周、2周、1周。
不希望受任何具体理论约束，由CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)激发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答、或备选地可以归因直接与间接免疫应答。在一个方面，CAR转导的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)显示出响应于表达本文所述的癌相关抗原的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和强力溶细胞活性，抵抗可溶性本文所述的癌相关抗原抑制，介导旁观者杀伤作用并介导建立的人肿瘤消退。例如，在表达本文所述的癌相关抗原的肿瘤的内部不均一视野内部抗原较少的肿瘤细胞可能易遭本文所述的癌相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的间接破坏，其中所述癌相关抗原重定向的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)之前已经针对毗邻的抗原阳性癌细胞进行了应答。
在一个方面，本发明的全人CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)可以是一类在哺乳动物中用于离体免疫和/或体内治疗的疫苗。在一个方面，哺乳动物是人。
对于离体免疫，在施用细胞至哺乳动物之前在体外进行至少一种以下操作:i)扩增细胞、ii)引入编码CAR的核酸至细胞或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域熟知的并且在下文更充分地讨论。简而言之，将细胞从哺乳动物(例如，人)分离并用本文公开的表达CAR的载体进行基因修饰(即，在体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用至哺乳动物受者以提供治疗益处。哺乳动物受者可以是人并且CAR修饰的细胞可以相对于受者是自体的。备选地，细胞可以相对于接受者是同种异体的、同基因的或异种的。
造血干细胞和祖细胞离体扩增的方法描述于美国专利No.5,199,942(通过引用并入本文)，可以应用于本发明的细胞。其他合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的离体培养和扩增包括:(1)从外周血采集物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩增这些细胞。除了在美国专利No.5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3L，IL-1，IL-3和c-kit配体也可以用于培养和扩增细胞。
就离体免疫而言除使用基于细胞的疫苗之外，本发明还提供了用于体内免疫以激发患者中针对抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述的细胞活化和扩增可以用于治疗和预防在免疫受损的个体中出现的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)用于治疗与表达本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状。在一些方面，本发明的细胞用于治疗面临形成与表达本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状的风险的患者。因此，本发明提供用于治疗或预防与表达本文所述的癌相关抗原相关的疾病、病症和病状的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。
在一个方面，本发明的CAR表达细胞可用于治疗增殖性疾病如癌症或恶性肿瘤，或者是癌症前期病症，如骨髓增生异常，骨髓增生异常综合征或白血病前期。此外，与本文所述的癌相关抗原相关的疾病包括但不限于例如本文所述的表达癌相关抗原的非典型和/或非经典癌症，恶性肿瘤，癌前病变或增殖性疾病。如本文所述与癌相关抗原表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫性疾病(例如狼疮)，炎性病症(变态反应和哮喘)和移植。
本发明的CAR修饰的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。
血液癌症
血液癌疾病是多种类型的侵袭血液、骨髓和淋巴系统的癌症如白血病、淋巴瘤和恶性淋巴细胞增生性疾病。
白血病可以划分成急性白血病和慢性白血病。急性白血病可以进一步划分为急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)。慢性白血病包括慢性髓性白血病(CML)和慢性淋巴样白血病(CLL)。其他相关的疾病包括骨髓增生异常综合征(MDS，以前称作“白血病前期”)，其是依据髓样血细胞无效产生(或发育异常(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合，和转变成AML的风险。
淋巴瘤是一组从淋巴细胞形成的血细胞肿瘤。示例性淋巴瘤包括非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤。
本发明还提供了用于抑制如本文所述的癌相关抗原表达的细胞群体的增殖或减少所述细胞群体的方法，所述方法包括使包含本文所述的癌相关抗原表达的细胞的群体与本文的表达CAR的T细胞或NK细胞接触，所述表达CAR的T细胞或NK细胞结合本文所述的表达癌相关抗原的细胞。在一个具体的方面，本发明提供了用于抑制如本文所述的癌相关抗原表达的癌细胞群体的增殖或减少所述癌细胞群体的方法，所述方法包括使本文所述的癌相关抗原表达的癌细胞群体与本文的表达CAR的T细胞或NK细胞接触，所述表达CAR的T细胞或NK细胞结合本文所述的表达癌相关抗原的细胞。在一个方面，本发明提供了用于抑制如本文所述的癌相关抗原表达的癌细胞群体的增殖或减少所述癌细胞群体的方法，所述方法包括使本文所述的癌相关抗原表达的癌细胞群与本发明的表达CAR的T细胞或NK细胞接触，所述表达CAR的T细胞或NK细胞与本文所述的癌相关抗原表达的细胞结合。在一些方面，相对于阴性对照，本发明的表达CAR的T细胞或NK细胞将受试者或动物模型中的细胞和/或癌细胞的数量，数目，量或百分数减少至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％或至少99％，所述受试者或动物模型具有本文所述的用于骨髓性白血病或另一种与本文所述的癌相关抗原表达的细胞相关的癌症。在一个方面，受试者是人。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制与本文描述的表达癌相关抗原的细胞(例如，如本文所述的癌相关抗原表达的血液学癌症或非典型癌症)相关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合本文所述的癌相关抗原表达的细胞的本发明的CAR T细胞或NK细胞。在一个方面，受试者是人。与本文所述的癌相关抗原表达的细胞相关的病症的非限制性实例包括自身免疫病症(例如狼疮)，炎性病症(例如变态反应和哮喘)和癌症(例如血液癌症或表达如本文所述的癌相关抗原的非典型癌症)。
本发明还提供了用于预防、治疗和/或控制与本文所述的癌相关抗原表达的细胞相关的疾病的方法，所述方法包括向需要的受试者施用结合如本文所述的癌相关抗原表达的细胞的本发明的CAR T细胞或NK细胞。在一个方面，受试者是人。
本发明提供了用于预防如本文所述的表达与癌相关抗原的细胞相关的癌症复发的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用与如本文所述的癌相关抗原表达的细胞结合的本发明CAR T细胞或NK细胞。在一个方面，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的与本文所述的癌相关抗原结合的本文所述的表达CAR的T细胞或NK细胞联合有效量的另一疗法。
药物组合物和治疗:LSD1抑制剂和CAR表达细胞的组合
本发明的药物组合物可以包含CAR表达细胞，例如本文所述的多种CAR表达细胞，与一种或多种药学或生理学可接受的载体，稀释剂或赋形剂组合。药物组合物可以另外包含一种或多种，例如一种LSD1抑制剂。这样的组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，本发明的组合物被配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适合待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管通过临床试验可以确定合适的剂量，但是施用的数量和频率将由诸如患者状况和患者疾病的类型和严重程度等因素决定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含，例如没有可检测水平的污染物，例如选自内毒素，支原体，复制型慢病毒(RCL)，p24，VSV-G核酸，HIV gag，残留的抗CD3/抗CD28包被的珠，小鼠抗体，合并的人血清，牛血清白蛋白，牛血清，培养基组分，载体包装细胞或质粒组分，细菌和真菌。在一个实施方案中，所述细菌为选自粪产碱菌，白色念珠菌，大肠杆菌，流感嗜血杆菌，脑膜炎奈瑟菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和化脓链球菌组A中的至少一种。
当指出“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的精确量可由医师通过考虑个体的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度，以及患者(受试者)的状态的差异而确定。可以概括地说:包含本文所描述的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，在一些情况下105至106个细胞/kg体重的剂量施用,包括那些范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。所述细胞可以通过使用免疫疗法中通常已知的输液技术施用(参见例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)。
在一些方面中，可能希望的是:给受试者施用活化的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，然后随后再次抽血(或者进行单采血液成分术)，按照本发明活化从中得到的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，并且再给所述的患者输注这些活化的并且扩增的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。每隔几个星期可以进行这种方法多次。在一些方面中，可以从10cc至400cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。在一些方面中，从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc、或100cc的抽血中活化所述的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。
所述主题组合物的施用可以以常规方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄入、输液、植入或移植。可以以下列方式给患者施用本文中描述的组合物:经动脉方式，皮下方式，皮内方式，肿瘤内方式，节内方式，髓内，肌肉内方式，通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内方式。在一个方面中，通过皮内或皮下注射给患者施用本发明所述的T细胞组合物。在一个方面中，通过静脉内注射施用本发明所述的T细胞组合物。可以将所述的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染位点。
在一个具体的示例性的方面中，受试者可以经受白细胞去除术，其中将白细胞收集，富集或离体消耗以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。可以通过本领域中已知的方法将这些T细胞分离物扩增和处理，使得可以引入本发明的一种或更多种CAR构建体，从而制出本发明的CAR T细胞。需要其的受试者随后可以经受采用高剂量化疗然后外周血干细胞移植的标准治疗。在一些方面中，在所述的移植之后或与所述的移植同时，受试者接受本发明所述的扩增的CAR T细胞的输注。在另外一个方面中，在外科手术之前和之后，施用扩增的细胞。
上述将要给患者施用的治疗的剂量将会随被治疗的状况的精确性质和所述治疗的接受者而变化。可以根据本领域公认的实践进行用于人施用的剂量的定标。例如，对于成年患者，CAMPATH剂量一般将会在1至大约100mg的范围，通常每日施用，持续1至30天的一段时间。优选的每日剂量是1至10mg/天，然而在一些实例中，可以使用高达40mg/天的更大剂量(在美国专利号6,120,766中描述)。
在一个实施方案中，将所述的CAR引入到免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)中，例如利用体外转录，并且所述的受试者(例如人)接受本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的初次施用，以及本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的一次或更多次随后的施用，其中所述的一次或更多次随后的施用是在先前的施用之后15天以内，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天内被施用的。在一个实施方案中，每个星期给所述的受试者(例如人)超过一次施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，例如每个星期施用2，3或4次本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)。在一个实施方案中，每个星期所述的受试者(例如人受试者)接受超过一次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的施用(例如每个星期2，3或4次施用)(在本文中也被称为循环)，随后一个星期不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，然后给所述的受试者施用一次或更多次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的额外施用(例如每个星期超过一次的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)的施用)。在另一个实施方案中，所述的受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，并且每个循环之间的时间少于10、9、8、7、6、5、4、或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)，每个星期3次施用。在一个实施方案中，施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)持续至少2、3、4、5、6、7、8或更多个星期。
在一个方面中，利用慢病毒病毒载体，例如慢病毒来产生本发明的表达CAR的细胞。以这种方式产生的细胞，例如CART将会具有稳定的CAR表达。
在一个方面中，使用病毒载体，如γ逆转录病毒载体，例如，本文所述的γ逆转录病毒载体产生CAR表达细胞，例如，CART。使用这些载体产生的CART可以有稳定的CAR表达。
在一个方面中，在转导后，CART短暂地表达CAR载体持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。CAR的短暂表达可以由RNA CAR载体递送实现。在一个方面中，通过电穿孔将所述的CAR RNA转导到所述的T细胞中。
可能在利用短暂地表达CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)(特别是采用具有鼠scFv的CART)治疗的患者中产生的潜在问题是多次治疗后的过敏反应。
不受这个理论的束缚，认为这样的过敏反应可能是由患者产生的体液抗CAR应答，即具有抗IgE同种型的抗CAR抗体引起的。认为当在暴露于抗原中有10到14天的间断时，患者的产生抗体的细胞发生从IgG同种型(它不引起过敏反应)到IgE同种型的类别转换。
如果在短暂的CAR治疗的过程期间，患者处于产生抗CAR抗体应答(例如通过RNA转导产生的那些)的高风险下，CART输注间断不应该持续超过10至14天。
制备CAR表达细胞的方法
在另一个方面，本发明涉及制备细胞(例如，免疫效应细胞或其群体)的方法，包括向细胞(例如本文所述的T细胞或NK细胞)导入(例如，转导)包含编码CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的核酸的载体；或编码CAR分子(例如本文所述的CAR)的核酸。
该方法中的细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞，或其组合)。在一些实施方案中，该方法中的细胞是二酰甘油激酶(DGK)和/或Ikaros缺陷的细胞。
在一些实施方案中，引入编码CAR分子的核酸分子包括转导包含编码CAR分子的核酸分子的载体或转染编码CAR分子的核酸分子，其中所述核酸分子是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，该方法还包括:
提供免疫效应细胞群体(例如T细胞或NK细胞)；和
从群体中去除T调节细胞，由此提供T调节消耗细胞群体；
其中步骤a)和b)在将编码CAR分子的核酸引入群体之前进行。
在该方法的实施方案中，T调节细胞包含CD25+T细胞，并使用抗CD25抗体或其片段从细胞群中除去。抗CD25抗体或其片段可以与基质例如珠缀合。
在其他实施方案中，步骤(b)提供的T调节消耗细胞群包含小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，4％，3％，2％，1％的CD25+细胞。
在其他实施方案中，该方法还包括从表达不包含CD25的肿瘤抗原的群体中除去细胞，以在将编码CAR分子的核酸引入到所述细胞中之前提供T调节消耗的和肿瘤抗原消耗的细胞的群体。肿瘤抗原可以选自CD19，CD30，CD38，CD123，CD20，CD14或CD11b或其组合。
在其他实施方案中，该方法还包括在将编码CAR分子的核酸引入群体之前，从表达检查点抑制分子的群体中除去细胞以提供T调节消耗的和抑制性分子消耗的细胞群体。检查点抑制分子可以选自PD-1，LAG-3，TIM3，B7-H1，CD160，P1H，2B4，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，TIGIT，CTLA-4，BTLA和LAIR1。
本文公开的其他实施方案包括提供免疫效应细胞群体。提供的免疫效应细胞群体可以基于CD3，CD28，CD4，CD8，CD45RA和/或CD45RO中的一种或多种的表达来选择。在一些实施方案中，提供的免疫效应细胞群体是CD3+和/或CD28+。
在该方法的某些实施方案中，该方法还包括在引入编码CAR分子的核酸分子后扩增细胞群。
在实施方案中，细胞群体扩增8天或更少的时间。
在一些实施方案中，细胞群体在培养中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞更有效。
在其他实施方案中，细胞群在培养中扩增5天显示出，与在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，在抗原刺激时细胞倍增增加至少1、2、3或4倍。
在其他实施方案中，细胞群体在培养中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎性IFN-γ和/或GM-CSF水平。
在其他实施方案中，通过在刺激CD3/TCR复合体相关信号的试剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的配体存在下培养细胞来扩增细胞群。试剂可以是与抗CD3抗体或其片段和/或抗CD28抗体或其片段缀合的珠。
在其他实施方案中，细胞群体在适当的培养基中扩增，所述培养基包含一种或多种白细胞介素，其在14天的扩增期中导致细胞增加至少200倍，250倍，300倍或350倍，如通过流式细胞术所测量的。
在其他实施方案中，细胞群在IL-15和/或IL-7存在下扩增。
在一些实施方案中，该方法还包括在适当的扩增期后冷冻保存细胞群。
又在其他实施方案中，本文公开的制造方法还包括使免疫效应细胞群体与编码端粒酶亚基例如hTERT的核酸接触。编码端粒酶亚基的核酸可以是DNA。
本发明还提供了产生RNA工程化细胞群，例如本文所述的细胞，例如，瞬时表达外源RNA的免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞)的方法。该方法包括将体外转录的RNA或合成RNA引入细胞中，其中RNA包含编码本文所述CAR分子的核酸。
在另一个方面，本发明涉及在受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，包括向受试者施用有效量的包含CAR分子的细胞，例如表达本文所述CAR分子的细胞。在一个实施方案中，细胞是自体T细胞或NK细胞。在一个实施方案中，细胞是同种异体T细胞或NK细胞。在一个实施例中，受试者是人。
在一个方面，本发明包括用包含编码CAR分子(例如如本文所述)的核酸分子的载体转染或转导的自体细胞群。在一个实施方案中，载体是逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体是如本文其他地方所述的自灭活慢病毒载体。在一个实施方案中，载体被递送(例如通过转染或电穿孔)至细胞，例如T细胞或NK细胞，其中载体包含编码如本文所述的本发明的CAR的核酸分子，其被转录为mRNA分子，并且本发明的CAR从该RNA分子翻译并在细胞表面表达。
在另一个方面，本发明提供了CAR表达细胞群，例如表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)。在一些实施方案中，CAR表达细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，表达CAR的免疫效应细胞(例如T细胞或NK细胞)的群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR具有结合如本文所述第一肿瘤抗原的抗原结合结构域，和表达CAR的第二细胞，所述CAR具有如本文所述的结合第二肿瘤抗原的不同抗原结合结构域。作为另一个实例，CAR表达细胞群体可以包括表达CAR的第一细胞，所述CAR包含如本文所述的结合肿瘤抗原的抗原结合结构域，和表达CAR的第二细胞，所述CAR包含针对除了如本文所述的肿瘤抗原以外的靶标的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR表达细胞群包括例如表达包含初级胞内信号传导结构域的CAR的第一细胞和表达包含次级信号传导结构域，例如共刺激信号传导结构域的CAR的第二细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种细胞群体，其中群体中的至少一种细胞表达具有如本文所述的与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域的CAR和表达另一种物质的第二细胞，例如该物质增强CAR表达细胞的活性。例如，在一个实施方案中，所述物质可以是抑制抑制性分子的物质。抑制性分子的实例包括PD-1，PD-L1，CTLA-4，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，LAG-3，VISTA，BTLA，TIGIT，LAIR1，CD160，2B4和TGFβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的物质例如是本文所述的分子，例如，该物质包含与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如本文所述的细胞内信号传导结构域)缔合的第一多肽(例如抑制性分子)。在一个实施方案中，所述物质包含第一多肽，例如抑制性分子如PD-1，LAG-3，CTLA-4，CD160，BTLA，LAIR1，TIM-3，CEACAM(例如CEACAM-1，CEACAM-3和/或CEACAM-5)，2B4和TIGIT或任何这些的片段的第一多肽，和第二多肽，其为本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如41BB，CD27或CD28，例如，如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，所述物质包含PD-1或其片段的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如本文所述的CD28，CD27，OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个实施方案中，编码本发明分子的CAR的(例如如本文所述的)核酸分子表达为mRNA分子。在一个实施方案中，表达本发明的遗传修饰的CAR的细胞(例如免疫效应细胞(例如T细胞，NK细胞))可以通过将编码目的CAR的RNA分子(例如，没有载体序列)转染或电穿孔到细胞中来产生。在一个实施方案中，本发明分子的CAR一旦被掺入重组细胞就从RNA分子翻译并在重组细胞表面表达。
产生用于转染的mRNA的方法包括用特别设计的引物进行模板的体外转录(IVT)，然后进行polyA添加，以产生含有3'和5'非翻译序列(“UTR”)(例如，本文所述的3'和/或5'UTR)，5'帽(例如，本文所述的5'帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文描述的IRES)，待表达的核酸和多聚腺苷酸尾的构建体，所述多聚腺苷酸尾通常长度为50-2000个碱基(SEQ ID NO:32)。如此产生的RNA可以有效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，通过电穿孔将RNA CAR载体转导到细胞，例如T细胞或NK细胞中。
表18:CAR的各种组分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
实施例
实施例1
在幼稚T细胞(例如TSCM细胞)增殖和扩增中重要基因的鉴定。进行用条形码化的shRNA文库转导的T细胞的下一代测序以发现当通过shRNA抑制时促进幼稚T细胞例如mTSCM细胞的扩增的基因。在靶标上，LSD1作为基因出现，当其被抑制时，导致较幼稚的T细胞表型。如下所述，进一步研究LSD1抑制对T细胞(例如CAR T细胞)表型和/或功能的影响。
FL-LSD1LC-MS测定法
本公开的代表性化合物在DMSO中连续并单独稀释3倍以获得总共12个浓度。然后通过MosquitoTM将各浓度(每种100nL)的测试化合物转移到384孔Perkin ElmerProxiPlate 384plus板中，向孔中加入在反应缓冲液(40mM Tris-HCl，0.01％Triton-X100，10mM KCl，1mM DTT)中的0.8nM全长LSD1和0.5μM FAD的溶液(5μL)，然后与测试化合物温育30分钟。将在反应缓冲液中的1μM肽底物H3K4me1(组蛋白H3[1-21]-生物素)的5μL溶液加入到每个引发反应中。反应溶液中的最终组分包括0.4nM FL-LSD1，0.25μM FAD和0.5μM H3K4me1肽和具有不同浓度的化合物。在不存在测试化合物的情况下，阳性对照由酶，0.25μM FAD和0.5μM底物组成，并且阴性对照仅由0.5μM底物组成。将每个反应在室温下温育60分钟，然后通过加入3μL淬灭溶液(具有320nM d4-SAH的2.5％TFA)停止反应。将反应混合物在2000rpm离心(Eppendorf离心机5810，转子A-4-62)1分钟，并用与Prominence UFLC(Shimadzu)偶联的具Turbulon Spray(Applied Biosystem)的API 4000三重四极质谱上读数。假定这些肽的电离效率相同，H3K4me1底物与H3K4me0产物的转化率通过将H3K4me0肽的峰面积除以所有这两种肽的总峰面积来计算。然后使用程序Helios将数据拟合至剂量反应方程以获得测试化合物的IC50值。根据该方法测定的IC50值在表3中呈现。
实施例2
5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈(1)的制备:
中间体2-溴-1-(3-溴-4-氯苯基)乙酮(1b)的制备:
向在EtOAc(10mL)和CHCl3(10.00ml)的混合物中的1-(3-溴-4-氯苯基)乙酮(0.4g，1.713mmol)(1a)的溶液中加入溴化铜(II)(0.689g，3.08mmol)。将反应混合物加热回流并搅拌3小时。冷却至室温后，向混合物中加入10mL的NH4Cl(aq)，并用EtOAc(20mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(EA/PE＝0:100-3:100)纯化残留物，得到标题化合物(0.23g，50％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 4.39(s,2H)、7.52-7.65(m,1H)、7.79-7.96(m,1H)、8.14-8.37(m,1H)。
中间体4-(5-(3-溴-4-氯苯基)-3-氰基-1H-吡咯-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(1c)的制备:
向(E)-叔丁基4-(1-氨基-2-氰基乙烯基)哌嗪-1-甲酸酯(242mg，0.960mmol)的无水EtOH(6ml)溶液中加入2-溴-1-(3-溴-4-氯苯基)乙酮(300mg，0.960mmol)(1b)和碳酸氢钠(323mg，3.84mmol)。将反应混合物加热回流并搅拌3小时。冷却至室温后，将混合物用10mL的NH4Cl(aq)稀释，并用EtOAc(20mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(EA/PE＝0:100-20:80)纯化残留物，得到标题化合物(180mg，36％)。LC-MS:[M+H]+＝467.0。
中间体叔丁基4-(5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-3-氰基-1H-吡咯-2-基)哌嗪-1-甲酸酯(1d)的制备:
向叔丁基4-(5-(3-溴-4-氯苯基)-3-氰基-1H-吡咯-2-基)哌嗪-1-甲酸酯(50mg，0.107mmol)(1c)的水(0.050ml)和正丙醇(0.5ml)的混合物中加入4-(甲磺酰基)苯基硼酸(42.9mg，0.215mmol)，PdCl2(PPh3)(7.56mg，10.73μmol)，Na2CO3(28.4mg，0.268mmol)。将反应混合物在N2下用微波在100℃加热1小时。冷却至室温后，将混合物用5mL的NH4Cl(aq)稀释，并用EtOAc(10mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，用Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(EA/PE＝0:100-35:65)纯化残留物，得到标题化合物(40mg，62％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.47(s,9H)、3.08(s,3H)、3.33(br s,4H)、3.53(t,J＝4.89Hz,4H)、6.26-6.67(m,1H)、7.38-7.53(m,3H)、7.66(d,J＝8.28Hz,2H)、7.92(d,J＝8.28Hz,2H)、8.87-9.05(m,1H)。
5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈(1)的制备:
叔丁基4-(5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯-3-基)-3-氰基-1H-吡咯-2-基)哌嗪-1-甲酸酯(1d)(30mg，0.055mmol)和HCl在EtOAc(2ml，2.000mmol)中的混合物在25℃搅拌1小时。过滤沉淀并用EtOAc洗涤以提供目的产物(25mg，97％)。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δppm3.20(s,3H)、3.39-3.42(m,4H)、3.64-3.66(m,4H)、6.67(s,1H)、7.53(d,J＝8.68Hz,1H)、7.60-7.63(m,2H)、7.74-7.76(m,2H)、8.06(d,J＝8.20Hz,2H).LC-MS:[M+H]+＝441.1。
实施例3
N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(2)的制备:
中间体叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)哌啶-1-甲酸酯(2a)的制备:
叔丁基(4-溴苯基)哌啶-1-甲酸酯(510mg，1.499mmol)，4,4,4’,4’,5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂环戊硼烷)(761mg，3mmol)和KOAc(441mg，4.5mmol)在DME(20ml)中的混合物用N2脱气并加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2(122mg，0.15mmol)。所得混合物再次用N2脱气，并加热至80℃过夜。冷却至室温后，向混合物中加入10mL的NH4Cl(aq)，并用EtOAc(20mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。通过快速色谱法(EA/己烷＝0:100-1:5)纯化残留物，得到标题化合物(500mg，86％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 1.27(s,9H)、1.34(s,12H)、1.57-1.72(m,2H)、1.82(brd,J＝13.05Hz,2H)、2.66(br s,1H)、2.80(br t,J＝12.05Hz,2H)、4.25(br d,J＝12.80Hz,2H)、7.11-7.42(m,2H)、7.77(d,J＝8.03Hz,2H).LC-MS:[M+H-100]+＝288.2。
中间体1-((4-碘苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(2b)的制备:
向4-碘苯1-磺酰氯(2g，6.61mol)和N,N-二甲基哌啶-4-胺(0.848g，6.61mmol)的DCM(20ml)溶液中加入TEA(1.115ml，7.93mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。LC-MS指示反应完成。将混合物浓缩。通过快速色谱法(MeOH:DCM＝0:100至10:100)纯化残留物，得到呈白色固体的标题化合物(2.85g，98％)。1H-NMR(400MHz,MeOD-d4)δppm 1.38-1.61(m,2H)、1.86(br d,J＝11.80Hz,2H)、2.19-2.56(m,6H)、3.01(br d,J＝6.53Hz,3H)、3.61(brd,J＝11.80Hz,2H)、7.49(d,J＝8.53Hz,2H)、8.02(s,2H).LC-MS:[M+H]+＝394.9。
中间体1-((4-(4-溴-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(2c)的制备:
将1-((4-碘苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(2b)(550mg，1.255mmol)，4-溴-1H-吲唑(297mg，1.507mmol)和K2CO3(521mg，3.77mmol)在DMSO(10ml)中的混合物用N2脱气并加入L-脯氨酸(116mg，1.004mmol)和CuI(96mg，0.502mmol)。所得混合物再次用N2脱气，并加热至105℃达18小时。冷却至室温后，向混合物中加入10mL的NH4Cl(aq)，并用EtOAc(20mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，得到呈白色固体的标题化合物(170mg，29.2％)。LC-MS:[M+H]+＝463.0；[M+H+2]+＝465.0。
中间体叔丁基4-(4-(1-(4-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)苯基)-1H-吲唑-4-基)苯基)哌啶-1-甲酸酯(2D)的制备:
向叔丁基4-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苯基)哌啶-1-甲酸酯(2a)(251mg，0.647mmol)、1-((4-(4-溴-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)-N,N-二甲基哌啶-4-胺(2c)(200mg，0.432mmol)和K2CO3(179mg，1.295mmol)在二烷(8mL)和H2O(1.6mL)的混合物中的混合物在N2氛围加入PdCl2(dppf).CH2Cl2加合物(35.2mg，0.043mmol)。将反应混合物在微波炉中于100℃加热30分钟。冷却至室温后，向混合物中加入10mL的NH4Cl(aq)，并用EtOAc(20mL×2)提取。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，用Na2SO4(无水)干燥，过滤并减压浓缩。将残留物通过制备型HPLC纯化，得到呈白色固体的标题化合物(120mg，43.2％)。LC-MS:[M+H]+＝644.3。
N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺(2)的制备:
向叔丁基4-(4-(1-(4-((4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)磺酰基)苯基)-1H-吲唑-4-基)苯基)哌啶-1-甲酸酯(2d)(490mg，0.761mmol)在DCM(20mL)中的溶液加入在EtOAc中的1M HCl(10mL)。混合物在40℃搅拌3小时。浓缩混合物并真空干燥，得到标题化合物(486mg，96％)。1H NMR(400MHz,DMSO)δppm 1.67-1.78(m,2H)、1.87-2.15(m,6H)、2.37(t,J＝11.42Hz,2H)、2.66(d,J＝4.52Hz,6H)、2.89-3.11(m,3H)、3.19(br s,1H)、3.40(d,J＝12.55Hz,2H)、3.85(d,J＝11.54Hz,2H)、7.44(d,J＝7.78Hz,2H)、7.66(t,J＝7.91Hz,1H)、7.75(d,J＝8.03Hz,2H)、7.92-8.04(m,3H)、8.13(d,J＝8.53Hz,2H)、8.56(s,1H)8.73-8.89(m,1H)10.52(br s,1H).LC-MS:[M+H]+＝544.2。
实施例4-LSD1抑制剂的研究
CAR19慢病毒构建体的产生
基于抗CD19scFV序列(如WO2012/079000中所述)独立合成在实施例中评估的CAR19构建体中使用的scFv。将scFV以轻链至重链方向克隆到载体骨架中，所述scFV具有柔性接头连接的VL和VH结构域，所述载体骨架含有CD8铰链区、连同4-1BB分子和CD3ζ分子。
细胞系和细胞转导
用来自CAR19质粒DNA转染的293T细胞的慢病毒上清液通过离心培育(spinoculation)转导人T细胞。
癌细胞
根据供应商的建议，从ATCC获得NALM6和K562细胞系并保存在培养基中。为了产生用于T细胞杀伤测定法的生物发光模型，将所有细胞用萤光素酶慢病毒构建体转导并保持在抗生素选择下。
流式细胞术
从体外培养物中分离细胞，在MACS+0.5％BSA缓冲液中洗涤一次，并使用生物素化的蛋白L在冰上染色，随后与荧光染料缀合的链霉亲和素试剂或识别给定靶抗原的抗体温育。在所有分析中，基于正向vs侧向散射特征门控目的群体，然后进行单线门控，并对活细胞进行门控。流式细胞术在四激光Fortessa(Becton-Dickinson)上进行。
化合物处理
在所有情况下，取决于化合物的溶解度，将化合物重悬于水(H2O)或DMSO中。在所有情况下，于整个T细胞培养中加入化合物，并且在测定之前广泛地洗涤T细胞。使用的化合物和浓度为5ng/mL IL-7和5ng/mL IL-15(重组蛋白；Peprotech)，使用5μM TWS119(也称为GSK3bi或GSK3β-i)(GSK3-β抑制剂；CAS号601514-19-6Cayman)、1μM Akt I/IIi(也称为AKTi或AktI/II inh)(Akt抑制剂VIII，同功酶选择的，Akti-1/2；EMD Millipore)，100nMLSD1i-GSK(GSK-LSD1抑制剂，CAS号1431368-48-7，Sigma)，200nM LSD1i-EMD(LSD1抑制剂IV，RN-1，HCl；EMD Millipore)100nM化合物A(LSD1抑制剂；Novartis)，100nM化合物B(LSD1抑制剂；Novartis)或100nM化合物C(LSD1抑制剂；Novartis)。在附图中，“对照”是指不添加额外化合物的运载体。IL7/IL15，TWS119和Akt I/Iii是公开的本领域已知的扩增TSCM T细胞的化合物(IL7/IL15:Xu等人，Blood.2014；123(24):3750-9；AKTi:Crompton等人，CancerRes.2015；75(2):296-305和van der Waart等人，Blood,2014；124(23):3490-500；TWS119:Gattoni等人，Nature Medicine,2011；17(10):1290-129)。
杀伤测定
T细胞杀伤涉及稳定表达萤光素酶的表达CAR19的NALM6细胞系。使用未转导的细胞(UTD)和非靶向的同种型对照scFV CART(IsoCAR)来测定非特异性背景杀伤水平。测量CAR19的细胞溶解活性，表示为效应子:靶细胞比率为10:1和2倍向下稀释T细胞的滴定，其中效应子定义为总T细胞，并且通过加入UTD T细胞使携带CAR的T细胞的百分数归一化。通过将适量的T细胞数与恒定数目的靶细胞混合来启动测定。20小时后，在EnVision仪器上使用Bright-GloTM萤光素酶测定法测量萤光素酶信号。萤光素酶活性的丧失表明特异性杀伤。
细胞因子分泌
T细胞杀伤涉及稳定表达萤光素酶的表达CAR19的NALM6细胞系。使用未转导的细胞(UTD)和非靶向的同种型对照scFV CART(IsoCAR)来测定非特异性背景细胞因子水平。效应细胞和靶细胞在含有10％FBS的RPMI中以3:1的比率温育18小时。根据制造商的说明书(Invitrogen)通过3重阵列分析上清液。
增殖测定
测试CAR19 T细胞响应暴露于靶细胞上的抗原而增殖的能力。靶细胞包括NALM6，Raji和K5624细胞。使用未转导的T细胞(UTD)和非靶向的同种型对照scFV CART(IsoCAR)作为背景T细胞效应的非特异性对照。在测定当天(第0天)，计数靶细胞并以3e6个细胞/ml转移到50ml管中的6mL T细胞培养基中。靶细胞在冰上以10,000rad辐射。辐射后，将靶细胞在T细胞培养基中洗涤两次，计数并在冰上在T细胞培养基中重悬至5e5个细胞/ml。
将冷冻的转导T细胞解冻，在10mL完全T细胞培养基中洗涤，以300g离心10分钟，并在室温下轻轻重悬于3mL完全T细胞培养基中。然后将T细胞在细胞计数仪中计数并重悬于10mL培养基中至2.5e6/mL。在96孔U形底板中，将25,000个经辐照的靶细胞和25,000个转导的CAR T细胞(1:1比率)在两个复孔中合并。在单独的孔中，将100μl培养基中的75,000个抗CD3/CD28珠加入到25,000个转导的T细胞以产生1:3细胞-珠比例作为阳性对照；在另一个孔中，将100μl培养基单独添加至25,000个转导的T细胞作为仅培养基对照。细胞在37℃，5％CO2下温育4天。
第4天，收集细胞并通过移液将复孔合并，并将其转移至U底板上的同一孔中，用蛋白L对CD3和CAR染色，用于FACS。染色后，将细胞重悬于120μl MACS+0.5％BSA缓冲液中并将20μl/孔发光计数珠加入到每个孔中。将增殖测量为在用于计数2500个珠的时间段内检测到的FACS阳性细胞的数量。
结果
通过shRNA抑制LSD1促进TSCM细胞的扩增
通过负选择来分离T细胞并用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。在第1天，用共表达荧光蛋白mCherry的含有LSD1 shRNA靶向序列的慢病毒表达载体转导T细胞。扩增后，通过流式细胞术评估mCherry+T细胞的T细胞表型。相对于具有杂乱shRNA序列的对照，LSD1抑制显著提高了CD8+(图1)和CD4+(图2)T细胞中幼稚(Tn)和干细胞样记忆细胞(TSCM)细胞的百分数。
对于CD8+T细胞的结果显示在图1中。当CD8+T细胞正常扩增时，约10％的所得T细胞对于TSCM表型(CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)为阳性。相反，当用编码LSD1 1A，1B或2的shRNA分子的DNA转染CD8+T细胞时，得到的T细胞群富集TSCM(例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)，其中近50％的细胞具有TSCM(例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)表型。
在图2示出对于CD4+T细胞的结果。当CD4+T细胞正常扩增时，小于2％的所得T细胞对于TSCM表型(CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)为阳性。相反，当用编码LSD1 1A，1B或2的shRNA分子的DNA转染CD4+T细胞时，得到的T细胞群富集TSCM(例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)，在shRNA 1B的情形时，高达20％的T细胞具有TSCM(例如CD45RA+CD62L+CCR7+CD27+CD95+)表型。
表4
小分子对LSD1的抑制促进TSCM细胞的扩增
评估所示化合物产生给定表型的T细胞的能力。通过负选择来分离人幼稚T细胞，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比率扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过FACS染色测定T细胞表型。相对于对照和相对于本领域认为影响TSCM增殖的其他分子，LSD1抑制显著增强了TSCM细胞的百分数，并且限制了CD4+(图3A)和CD8+(图3B)T细胞中TEM细胞的百分数。
小分子对LSD1的抑制促进TSCM与TEM T细胞的优良比率
评估所示化合物产生给定表型的T细胞的能力。通过负选择来分离人幼稚T细胞，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过FACS染色测定T细胞表型。相对于对照和相对于本领域认为影响TSCM增殖的其他分子，LSD1抑制促进TSCM与TEM的比率与CD4+(图4A)和CD8+(图4B)T细胞中的优良T功能性一致。
在LSD1抑制存在下的T细胞扩增
评估T细胞在所示化合物存在下扩增的能力。通过负选择来分离人幼稚T细胞，并在指定化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，计数T细胞数并评估相对于第1天的倍数增加。相对于对照和本领域认为影响TSCM增殖的其他分子，LSD1抑制不显著损害T细胞扩增(图5)。
检查点受体在T细胞中的表达
不受理论的束缚，认为多个检查点受体的共表达与T细胞功能障碍相关。评估所示化合物减少T细胞上检查点受体表达的能力。通过负选择来分离人幼稚T细胞，并在所示化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过FACS染色测定T细胞表型。相对于对照，LSD1抑制减少T细胞上PD1，Tim3和LAG3的共表达(图6)。
LSD1抑制对CART19细胞表达没有影响
通过负选择来分离总人T细胞，并在指定化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过用蛋白质L进行FACS染色来测定CAR19表达。LSD1抑制对CAR19表达没有影响(图7)。
LSD1抑制对CD8+和CD4+T细胞比例没有影响
通过负选择来分离总人T细胞，并在指定化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过流式细胞术测定来评估CD4+和CD8+T细胞的百分数。在未转导的对照(UTD)或CAR19转导的T细胞中，LSD1抑制对CD4+和CD8+T细胞的百分数没有影响(图8)。
LSD1抑制对CART19细胞的扩增没有影响
通过负选择来分离总人T细胞，并在指定化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，计数T细胞数并评估相对于第1天的倍数增加。CAR19T细胞能够在LSD1抑制剂存在下离体扩增，表明LSD1抑制不显著损害在未转导对照(UTD)或CAR19转导的T细胞(图9)中的T细胞扩增。
LSD1抑制增强从CART19的细胞因子产生
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直到第10天功能测定之前洗掉，然后冷冻T细胞。解冻T细胞并用NALM6细胞温育20小时。收集上清液并通过细胞因子珠阵列分析。LSD1抑制显著增强从CAR19 T细胞的细胞因子产生(图10)。
LSD1抑制增强CART19细胞的增殖
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直到第10天功能测定之前洗掉，然后冷冻T细胞。然后解冻T细胞并与CD19+肿瘤细胞系NALM6和Raji以及CD19-肿瘤细胞系K562混合。辐射肿瘤细胞，并且以1:1的比例混合T细胞和肿瘤细胞。在温育后第4天，使用蛋白L染色T细胞的CAR，并使用发光计数珠通过FACS测定CAR+T细胞数。测量增殖为在计数2500个珠的时间段中检测到的FACS阳性细胞的数量。数据表示为无靶标对照(K562)的倍数。LSD1抑制增强CAR19 T细胞对CD19+肿瘤靶标的增殖能力(图11)。
LSD1抑制对CART19细胞杀伤能力的影响
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直到第10天功能测定之前洗掉，然后冷冻T细胞。将T细胞解冻并用指定的萤光化细胞系靶标温育20小时。通过分析剩余的萤光素酶活性来测定杀伤百分数。这些数据表明LSD1抑制可以在低E:T比率下增加CAR19T细胞的杀伤能力，但在较高E:T比率下对杀伤能力没有显著影响(图12)。
LSD1抑制促进体内增强CART19细胞功效
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。在第1天用抗CD19scFV转导T细胞。化合物每2天更新一次，直到第10天功能测定之前洗掉，然后冷冻T细胞。解冻T细胞并将其注射到携带已建立的萤光化NALM6肿瘤的小鼠中。指示的剂量代表注射的总CAR+细胞的数量。这些数据表明在体外扩增期间对LSD1的抑制可以显著增强体内CAR19T细胞的抗肿瘤效应子功能(图13)。
多种LSD1抑制剂促进TSCM细胞的扩增
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过流式细胞术测定T细胞表型。相对于对照，用多种抑制剂抑制LSD1可以显著增强CD4+(图14A)和CD8+(图14B)T细胞中TSCM细胞的百分数。
检查点受体在T细胞中的表达
通过负选择来分离T细胞，并且在指定化合物存在下或不进行处理(对照)下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物每2天更新一次。扩增后，通过流式细胞术测定T细胞检查点受体表达。相对于对照，多种LSD1抑制剂可以减少CD4+(图15A)和CD8+(图15B)T细胞上PD1，Tim3和LAG3的共表达。
实施例5
化合物93(“实施例93”)；在本文中也被称为“NVS化合物1”
反式-3-(3-氨基-2-甲基苯基)-1-(4-羟基环己基)-6-甲基-1H-吲哚-5-甲腈
中间体93.1:3-溴-6-甲基-1-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-基)-1H-吲哚-5-甲腈
将化合物74.1(960mg，3.07mmol)，化合物4(415mg，1.77mmol)和Cs2CO3(1.73g，5.31mmol)在DMF(10mL)中的混合物加热至100℃过夜。然后用水稀释并用EA提取三次。将合并的有机相用盐水洗涤并经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗产物，将其通过硅胶快速柱色谱(洗脱液:PE/EA，EA％＝10-20％)纯化，得到呈现白色固体的标题化合物(726mg)，纯度为80％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm 7.84(s,1H)、7.29(s,1H)、7.26(s,1H)、4.35-4.20(m,1H)、4.00(s,4H)、2.66(s,3H)、2.06(dd、4H)、1.93(d、2H)、1.84-1.76(m,2H).LC-MS:[M+H]+＝375.29、377.24。
中间体93.2:3-溴-6-甲基-1-(4-氧代环己基)-1H-吲哚-5-甲腈
将化合物93.1(480mg，1.28mmol)在AcOH(7.5mL)和H2O(1.5mL)的共溶剂中的混合物加热至60℃保持3.5小时。冷却至室温后，加入10mL水。将更多的固体沉淀，过滤沉淀并用水洗涤，得到呈现白色固体的标题化合物(357mg，84％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm 7.87(s,1H)、7.30(s,1H)、7.24(s,1H)、4.73(m,1H)、2.67(s,3H)、2.65-2.60(m,4H)、2.46-2.39(m,2H)、2.20(dd、2H).LC-MS:[M+H]+＝331.2。
中间体93.3:3-溴-1-(4-羟基环己基)-6-甲基-1H-吲哚-5-甲腈
在室温下，向化合物93.2(340mg，1.03mmol)在甲醇(10mL)中的混合物中以数次添加NaBH4(156mg，4.1mmol)。混合物逐渐变澄清并在室温下搅拌1小时。真空除去溶剂并将残留物溶于EA并用盐水洗涤两次。有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到呈现白色固体的标题化合物(345mg)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm 7.85(s,1H)、7.23(s,2H)、4.22(m,1H)、3.78(m,1H)、2.66(s,3H)、2.16(t、4H)、1.80(d、2H)、1.64(s,2H).LC-MS:[M+H]+＝333.2、335.3。
向化合物93.3(200mg，0.6mmol)和2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(168mg，0.72mmol)在i-PrOH/H2O(6mL，10:1)的共溶剂中的混合物中加入2N Na2CO3水溶液(1.8mL，3.6mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(42mg，0.06mmol)。通过微波反应器在N2气氛下将混合物在100℃搅拌30分钟。反应混合物用水稀释并用EA提取三次。将合并的有机相用盐水洗涤并经Na2SO4干燥，浓缩并通过硅胶柱色谱(PE:EA＝10:1-2:1)纯化，得到含有Ph3P＝O的粗产物。将其通过制备型HPLC(0.1％TFA/ACN/H2O)纯化并冻干，得到呈现粉红色固体的标题化合物(73.2mg，34％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.76(s,1H)、7.69(d、1H)、7.64(s,1H)、7.21(t、1H)、7.07(d、2H)、4.47(d、2H)、3.84(s,1H)、3.58(t、2H)、2.59(s,3H)、2.13(d、3H)、1.94(t、6H)、1.53-1.44(m,2H).LC-MS:[M+H]+＝360.3。
实施例6
为了测试LSD1抑制对T细胞上检查点蛋白质表达的影响，通过负选择分离人T细胞，并在指定化合物存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增7天。化合物每2天更新一次。扩增7天后，用针对CD4，CD8，PD1，Lag3和Tim3的抗体染色细胞，并通过流式细胞术分析。分析包括分别评估每种蛋白质的表达(图16，左图)或同时表达PD1和Lag3(PD1+Lag3+)或PD1、Lag3和Tim3(PD1+Lag3+Tim3+)(图16，右图)。不受理论的束缚，检查点标志物的表达，特别是多个检查点标志物的共表达被认为是更加消耗且更少多功能的T细胞的指示。数据表明，相对于对照，LSD1抑制剂可以单独降低T细胞上Tim3的表达，或者降低PD1和Lag3的共表达，或者降低PD1，Tim3和LAG3的共表达。(图16，左图和右图)。
接下来，响应于在存在或不存在LSD1抑制剂的情况下培养T细胞，评估CD4+或CD8+T细胞群体中检查点标志物表达以及Tscm T细胞的级分。简而言之，通过负选择分离T细胞，并在所示化合物以指定剂量存在下或没有处理下(对照)用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。化合物在珠添加后的天添加并每2天更新一次。扩增后，使用针对CD4，CD8，CD45RA，CD62L，CCR7，CD27和CD95的抗体通过流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞亚群中TSCM细胞的百分数。这些数据表明，相对于对照，LSD1抑制(用来自多个分子类别的多种LSD1抑制剂中的任何一种)可以显著增强CD4+(图17，左图)和CD8+(图17，右图)T细胞中TSCM细胞的百分数。同样，在扩增之后，使用针对CD4，CD8，Tim3，Lag3和PD1的抗体通过流式细胞术测定CD4+和CD8+T细胞亚群中的T细胞检查点受体表达。这些数据显示相对于对照，LSD1抑制(用来自多个分子类别的多种LSD1抑制剂中的任何一种)可以显著降低PD1，Tim3和Lag3在CD4+T细胞上(图18，左图)和在CD8+(图18，右图)T细胞上的共表达。
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。由于所给出的实施方案旨在仅用于阐述本发明的某些方面，并且任何功能上等同的构建物都在本发明的范围内，所以本发明的范围不受所给出的构建物的限制。本文中的材料保藏并不构成承认本文所包含的书面描述不足以实现本发明的任何方面的实践，包括其最佳模式，也不被解释为限制权利要求的范围。实际上，除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言从前面的描述中将变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
可以理解的是，根据本文所包含的教导，将本发明的教导应用于具体问题或情况将在本领域普通技术人员的能力范围内。
本说明书中每个引用的公开内容明确地通过引用并入本文作为参考。
实施例7-LSD1抑制剂的研究
BCMA-CAR慢病毒构建体的生成
基于BCMA-10的抗BCMA scFV序列(139109)(如WO2016/014565中所述)，独立地合成在实施例中评估的BCMA构建体中使用的scFv。将scFV以轻链至重链方向克隆到载体骨架中，所述scFV具有柔性接头连接的VL和VH结构域，所述载体骨架含有CD8铰链区、连同4-1BB分子和CD3ζ分子。
细胞系和细胞转导
通过用BCAM-CAR质粒DNA转染的293T细胞的慢病毒上清液通过离心培育转导人T细胞。
癌细胞
根据供应商的建议，从ATCC获得KMS11，NHICI929和NALM6细胞系并维持在培养基中。为了产生用于T细胞杀伤，细胞因子测定和体内功效研究的生物发光模型，将所有细胞用萤光素酶慢病毒构建体转导并保持在抗生素选择下。
流式细胞术
从体外培养物中分离细胞，在MACS+0.5％BSA缓冲液中洗涤一次，并使用生物素化的蛋白L在冰上染色，随后与荧光染料缀合的链霉亲和素试剂或识别给定靶抗原的抗体温育。在所有分析中，基于正向vs侧向散射特征门控目的群体，然后进行单线门控，并对活细胞进行门控。流式细胞术在5个激光Fortessa(Becton-Dickinson)上进行。使用R脚本(Novartis内部程序)和flowjo软件分析数据。使用的抗体列于下表5中(对于CD19 CAR检测，包括抗独特型CD19抗体，对于BCMA-CAR检测，包括蛋白L，随后链霉亲和素-PE染色)。
使用R脚本(novartis内部程序)分析数据并通过flowjo软件进行验证。研究了以下参数:
1.计算CD8/CD4的比率；
2.CD3+T细胞的％Tscm，Tem，Tcm；
3.计算CD3+T细胞的Tscm/Tem和Tscm/Tcm的比率；
4.计算CD8+或CD4+T细胞的％Tscm，Tem，Tcm；
5.计算CD8+或CD4+T细胞的Tscm/Tem和Tscm/Tcm的比率；和/或
6.在CAR+-T细胞的情况下，评估CD19-CAR+T和BCMA-10-CAR+T细胞的Tscm，Tem，Tcm的百分数。
在给定的总活CD3+或亚群CD4+或CD8+T细胞群体中，Tscm群体被评估为双CD45RA+CCR7+或三CD45RA+CCR7+CD62L+。Tem在给定的总活CD3+或亚群CD4+或CD8+T细胞群中呈现为双CD45RA-CCR7-并且Tcm-呈现为CD45RA-CCR7+(图19和图25说明了门控策略)。
化合物处理
在所有情况下，取决于化合物的溶解度，将LSD抑制剂化合物重新悬浮于水(H2O)和/或DMSO中。在所有情况下，于整个离体T细胞培养中添加化合物，并在测定之前充分洗涤T细胞。使用的化合物和浓度为1pM，10pM，100pM，1nM，10nM，100nM LSD1i-GSK(GSK-LSD1抑制剂，CAS号1431368-48-7，Sigma)；使用1pM，10pM，100pM，1nM，1.1nM，3.3nM，10nM，100nMNVS化合物93(LSD1抑制剂；Novartis)或100nM化合物B(LSD1抑制剂；Novartis)或100nM化合物A。在附图中，“对照”是指不添加LSD抑制剂化合物的运载体。对于Pan CD3+T细胞扩增实验，激活后4h或24h开始化合物处理；对于CART细胞生产，在病毒转导后48小时开始化合物处理，并且在所有条件下所有处理都在培养期间继续。
细胞因子分泌
T细胞杀伤涉及稳定表达萤光素酶的表达CAR19的NALM6细胞系或表达BCMA的KMS11或NHICI929细胞系。使用未转导的细胞(UTD)和非靶向的同种型对照scFV CART(IsoCAR)来确定非特异性背景细胞因子水平。将效应细胞和靶细胞在含有10％FBS的RPMI中以1.25:1的比率温育18小时。根据制造商的说明书(Invitrogen)通过3重阵列分析上清液。
增殖测定
测试CAR19 T或BCMA_CAR T细胞响应暴露于靶细胞上的抗原而增殖的能力。靶细胞包括NALM6，KMS11和NHICI929细胞。使用未转导的T细胞(UTD)和非靶向的同种型对照scFV CART(IsoCAR)作为背景T细胞效应的非特异性对照。在测定当天(第0天)，计数靶细胞并以3e6个细胞/ml转移到50ml管中的6mL T细胞培养基中。靶细胞以10,000rad在冰上辐射。辐射后，将靶细胞在T细胞培养基中洗涤两次，计数并在冰上在T细胞培养基中重悬至5e5个细胞/ml。
将冷冻的转导T细胞解冻，在10mL完全T细胞培养基中洗涤，在300g下离心10分钟，并在室温下轻轻悬浮于3mL完全T细胞培养基中。然后将T细胞在细胞计数仪中计数并重悬于10mL培养基中至2.5e6/mL。在96孔U形底板中，将25,000个经辐照的靶细胞和25,000个转导的CAR T细胞(1:1比率)在两个复孔中合并。在单独的孔中，将100μl培养基中的75,000个抗CD3/CD28珠加入到25,000个转导的T细胞以产生1:3细胞-珠比例作为阳性对照；在另一个孔中，将100μl培养基单独添加至25,000个转导的T细胞作为仅培养基对照。在一些情况下，针对靶细胞和CART细胞测试了30,000个细胞。细胞在37℃，5％CO2下温育4天。
第4天，收集细胞并通过移液将复孔合并，并将其转移至U底板上的相同孔中，用蛋白L对CD3和CAR染色，用于FACS。染色后，将细胞重悬于120μl MACS+0.5％BSA缓冲液中并向每孔中添加20μl/孔发光计数珠。测量增殖为在用于计数2500个珠的时间段中检测到的FACS阳性细胞的数量。
LSD1i调理的BCMA-CART细胞的体内功效研究
在存在或不存在LSD1抑制剂的情况下离体扩增的BCMA-CART细胞使用具有已建立的萤光化KMS11肿瘤(1e6个细胞/小鼠)的免疫受损NSG小鼠测试其体内消除肿瘤的能力；通过将萤光素注射到小鼠中，通过从酶底物(萤光素酶-萤光素)反应产生的生物发光强度信号来测量肿瘤负荷。
结果
LSD1抑制剂以剂量反应方式扩增Tscm，降低Tem。
为了测试LSD1抑制剂对T细胞表型的剂量反应，通过负选择分离来自两名健康受试者的人类Pan CD3+T细胞，并且从激活后4小时开始，将化合物93或LSD1i-GSK以从100nM开始，随后10X系列稀释至1pM的不同浓度存在下，用抗CD3/CD28珠以3:1的比例扩增10天。同时，也测试了在激活后24小时另外三种100nM的LSD1抑制剂化合物A和化合物B开始在一些细胞中维持Tscm细胞的能力。补充新鲜培养基时，化合物每2-3天更新一次。扩增10天后，收获T细胞并脱珠，并使用针对CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD62L，CD27和CD28的抗体加上活/死染料以排除死细胞群，通过流式细胞术分析它们的表型。数据显示:
1.响应于LSD1i剂量递增，化合物93和LSD1i-GSK可以显著增加CD8/CD4比率，意味着随着LSD1抑制剂剂量增加，在扩增的10天期间CD8扩增超过CD4，而不改变总细胞的总扩增速率。(图20A)。
2.在1nM至100nM之间观察到，化合物93和LSD1i-GSK都能以剂量反应的方式增加/维持CD3+Tscm，降低Tem；10nM和100nM显示出相似的诱导水平，而Tcm保持不变。化合物93和LSD1i-GSK诱导Tscm CD3+T细胞的EC50分别为2.59nM和1.085nM(图23A和图23B)；
3.相应地，CD3+T细胞的Tscm/Tem比率响应于剂量升高而增加，但Tscm/Tcm的比率在所有剂量下都保持不变。(图20B)。
4.在1nM至100nM之间观察到，化合物93和LSD1i-GSK可以以剂量反应的方式增加/维持CD8+Tscm和CD4+Tscm，降低Tem；10nM和100nM表现出相似的诱导水平，而Tcm保持不变。从这些结果观察，大部分Tscm群体来自CD8T细胞，而CD4+Tscm在100nM处为大约5％(其与对照相比也增加了，并且显示正剂量反应)(图21和22)。化合物93和LSD1i-GSK诱导Tscm CD8+T细胞的EC50分别为3.25nM和1.08nM(图23D和图23C)；
5.相应地，CD8+T细胞的Tscm/Tem比率响应于剂量升高而显著增加，但在CD4+群体中几乎没有观察到；此外，Tscm/Tcm的比例相对于对照大致保持不变。(图21和图22)。
6.化合物A和化合物B在100nM也能够维持总CD3+和CD8+T细胞亚群的Tscm并降低Tem，并且以远低于此的程度降低CD4+T细胞的Tem，这与图24所示的化合物93相当。
LSD1抑制以剂量依赖性方式扩增CART产物中的Tscm，降低Tem。
为了测试LSD1抑制剂对CART细胞表型的剂量反应，通过负选择分离来自一位健康受试者的人pan CD3+T细胞，并且从病毒转导后48小时开始，在浓度为100nM，10nM，3.3nM和1.1nM的化合物93存在下用抗CD3/CD28珠以3:1的比率扩增10天。当补充新鲜培养基时，不同浓度的化合物93每2-3天更新一次。在扩增10天后，收获CART产物并脱珠，并使用针对CD3，CD4，CD8，CD45RA，CCR7，CD62L，CD27，CD28，抗CD19独特型或蛋白L的抗体，通过流式细胞术，随后SA-PE染色加活/死染料以排除死细胞群体来分析它们的表型。数据显示了下面的要点:
·化合物93在不同测试剂量下的LSD1抑制不改变所有最终CART产物(UTD，CD19CART和BCMA-CART)中的总T细胞百分数(图26A)；
·不同测试剂量的化合物93不显著影响CD19-CAR或BCMA-CAR表达(图26B)。
·不同测试剂量的化合物93不影响CD8+CAR和CD4+CAR T细胞比例。(图26C)；
·通过化合物93的LSD1抑制以剂量依赖性方式增加最终CD19-CART和BCMA-CART细胞群体(包括CAR-和CAR+群体)中CD8+Tscm，减少CD8+Tem，并增加Tscm/Tem的比率，但在所有测试剂量下不改变Tcm(双CD45RA+CCR7+或者三CD45RA+CCR7+CD62L+)百分数(图27)；
·通过化合物93的LSD1的抑制以剂量依赖性方式维持CD19CAR+CD8 Tcm，减少CAR+Tem，但仅增加BCMA-CAR+CD8+Tscm，在所有测试剂量下CAR+CD8+Tcm百分数保持相似水平(图28)。
通过化合物93的LSD1抑制增强了CD19-CAR和BCMA-CART的细胞因子产生
将CD19-CART和BCMA-CART细胞与NALM6(CD19+但BCMA-)，KMS11和NHICI929(两种细胞均为CD19-BCMA+)细胞系以1.25:1的比率温育20小时。收集上清液并通过细胞因子珠阵列分析。以100nM的化合物93的LSD1抑制响应其特定靶标显著增强了CD19 CART和BCMA-CART细胞的细胞因子产生。(图29)。
通过化合物93抑制LSD1增强了CD19-CART和BCMA-CART细胞的增殖
在温育4天后，将经辐射的肿瘤系与T细胞以1:1的比例混合，使用蛋白L染色T细胞的CAR，并使用发光计数珠通过FACS测定CAR+T细胞数。测量增殖为在计数2500个珠的时间段中检测到的FACS阳性细胞的数量。以100nM的化合物93的LSD1抑制分别增强了CD19-CART和BCMA-CART细胞针对CD19+或BCMA+靶细胞的增殖能力，如图30-32以总CAR+CD3，CD8或CD4T细胞测量所示。
LSD1的抑制增强体内BCMA-CART细胞的功效
将具有或不具有离体LSD1i处理的未转导的T细胞和BCMA-CART细胞一次注射到携带已建立的萤光化KMS11肿瘤的小鼠中。总共625万个T细胞，包括16.7万个总CAR+细胞被注射。有趣的是，发现LSD1的抑制增加了CAR阴性T细胞的抗肿瘤活性。不受理论的束缚，这种活性可能是由于LSD1抑制导致Tscm细胞的级分增加的结果，其导致具有增加的细胞因子产生和增殖潜力的细胞群体。同样，LSD1的抑制增强了体内BCMA-CART细胞的功效。这些数据表明仅化合物93处理的未转导的T细胞在缓慢回归模式下随着时间显示出抗肿瘤活性。此外，与常规BCMA-CART相比，该化合物还可以显著增强BCMA CART细胞在急性期的抗原特异性抗肿瘤功能，而两种CART细胞(一种细胞用化合物93，一种细胞没有用化合物93)都对消除肿瘤生长具有持久效果(图33)。
本申请提交了序列表。就序列表与说明书中列举的任一序列之间存在任何差异而言，说明书中列举的序列应视为正确的序列。
参考引用
本文提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出为通过引用并入。在冲突的情况下，将以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
等同物
本领域技术人员将认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。虽然已经参考具体方面公开了本发明，但显而易见的是，在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下，本领域的其他技术人员可以设计出本发明的其他方面和变型。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变型。

Claims (75)

1.一种治疗受试者的方法，包括向所述受试者施用LSD1抑制剂和工程化表达CAR的免疫效应细胞群体。
2.如权利要求1所述的方法，其中:
a)在对受试者施用所述免疫效应细胞群体之前施用LSD1抑制剂；
b)将LSD1抑制剂与所述免疫效应细胞群体同时施用；
c)在对受试者施用所述免疫效应细胞群体之后施用LSD1抑制剂；或
d)a)，b)和/或c)的任何组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述LSD1抑制剂在所述受试者施用所述免疫效应细胞群体之前施用，并且其中在施用所述免疫效应细胞群体后，所述LSD1抑制剂的施用持续一段时间。
4.如权利要求3所述的方法，其中相对于不存在所述LSD1抑制剂施用的所述免疫效应细胞的等同群体而言，所述LSD1抑制剂的施用的量足以增加所述免疫效应群体的抗肿瘤效果。
5.一种提高工程化表达CAR的免疫效应细胞群体(例如CART19(例如CTL019))的治疗功效的方法，包括步骤：暂时或永久降低所述细胞中LSD1的活性或表达。
6.如权利要求5所述的方法，其中降低LSD1在所述细胞中的活性或表达的步骤包括使细胞与LSD1抑制剂接触。
7.如权利要求1-4或6中任一项所述的方法，其中所述LSD1抑制剂的施用或接触导致:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上两种或更多种的组合；
任选地与未接触LSD1抑制剂的细胞相比。
8.一种治疗受试者的方法，包括:
a)向受试者施用LSD1抑制剂；
b)在所述施用LSD1抑制剂后，从步骤a)的受试者收集免疫效应细胞群体；
c)离体提供所述免疫效应细胞群体；
d)将所述免疫效应细胞的离体群体与LSD1抑制剂接触，其中与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上两种或更多种的组合；
与未接触的免疫效应细胞的离体群体相比；和
e)将免疫效应细胞群体施用于受试者。
9.如权利要求8所述的方法，其中步骤e)还包括向步骤e)的受试者施用LSD1抑制剂。
10.如权利要求8或9所述的方法，还包括将编码CAR的核酸插入到免疫效应细胞的离体群体的细胞中的步骤。
11.一种制备免疫效应细胞群体的方法，包括:
a)使免疫效应细胞群体与LSD1抑制剂接触；
由此制备免疫效应细胞群体，
其中与未接触LSD1抑制剂的免疫效应细胞群体相比较，与LSD1抑制剂的接触引起以下一种或多种发生:
1)幼稚T细胞例如TSCM细胞的比例增加；
2)幼稚T细胞例如TSCM细胞的数量增加；
3)TEM细胞数量减少；
4)TEM细胞比例减少；
5)CD45RA+CD62L+T细胞的比例增加；
6)CD45RA+CD62L+T细胞的数量增加；
7)CD45RA+CCR7+T细胞的比例增加；
8)CD45RA+CCR7+T细胞的数量增加；
9)PD-1阳性免疫效应细胞的比例减少；
10)PD-1阴性免疫效应细胞/PD-1阳性免疫效应细胞的比率增加；
11)PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比例减少；
12)PD-1-/Lag3-/Tim3-免疫效应细胞与PD-1+/Lag3+/Tim3+免疫效应细胞的比率增加；
13)免疫效应细胞的增殖增加；
14)来自所述免疫效应细胞群体的细胞因子(例如IFNγ和/或IL-2)的产生增加；或
15)以上两种或更多种的组合。
12.如权利要求11所述的方法，还包括步骤b)将编码CAR的核酸插入免疫效应细胞群体的细胞中。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述步骤a)的接触发生在所述步骤b)的插入
1)之前；
2)同时；
3)之后；或
4)以上1)至3)中两个或更多个的任何组合。
14.如权利要求11-13中任一项所述的方法，其中步骤a)的接触和任选地步骤b)的插入是离体的。
15.通过权利要求11-14中任一项的方法制备的免疫效应细胞群体。
16.一种经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫效应细胞群体，其中所述CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，并且其中LSD1在所述细胞中的表达和/或功能已被减少或消除。
17.如权利要求16所述的免疫效应细胞群体，包含LSD1抑制剂。
18.如权利要求16所述的免疫效应细胞群体，其中所述免疫效应细胞群体已经与LSD1抑制剂接触。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述免疫效应细胞群体包含T细胞或NK细胞，例如由T细胞或NK细胞组成。
20.如权利要求19所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述免疫效应细胞群体包含T细胞，例如由T细胞组成。
21.如权利要求20所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或它们的组合。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述免疫效应细胞是人细胞。
23.如权利要求1-7，10，12-14或18-22中任一项所述的方法或权利要求15-22中任一项所述的免疫效应细胞群体，其中所述CAR包含抗原结合结构域(其任选地是抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(其任选地为包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
24.如权利要求23所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述抗原结合结构域结合选自以下的肿瘤抗原：TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、PSMA、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM,B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM,Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、邻乙酰基GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白酶、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活蛋白和端粒酶、PCTA-1/半乳凝素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
25.如权利要求24所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述肿瘤抗原是CD19或BCMA。
26.如权利要求25所述的方法或免疫效应细胞群体，其中:
抗原结合结构域是包含以下的抗体或抗体片段:
(i)根据表6-9的CD19结合结构域的氨基酸序列，例如根据表9的CTL019scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:957的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；
(ii)根据表6-9的人源化CD19结合结构域的氨基酸序列，例如根据表9的CAR2scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:898的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；或
(iii)根据表11A-11B的BCMA结合结构域的氨基酸序列，例如根据表11A的139109scFv结构域的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:967的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；或
其中所述CAR包含:
(i)根据表6-9的CD19CAR的氨基酸序列，例如根据表9的CTL019的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:956的氨基酸序列或与其至少95％同一的氨基酸序列；
(ii)根据表6-9的人源化CD19CAR的氨基酸序列，例如根据表9的CAR2的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:902的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列；或
(iii)根据表11A-11B的BCMA CAR的氨基酸序列，例如根据表11A的139109CAR的氨基酸序列或根据SEQ ID NO:971的氨基酸序列，或与其至少95％同一的氨基酸序列。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述跨膜结构域包含：
(i)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；或
(ii)SEQ ID NO:12的序列。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6或与其具有95-99％同一性的序列。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域，其中所述初级信号传导结构域包含选自CD3ζ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，共有的FcRγ(FCER1G)，FcRβ(FcεR1b)，CD79a，CD79b，FcγRIIa，DAP10或DAP12的蛋白质的功能信号传导结构域。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述初级信号传导结构域包含：
(i)具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；或
(ii)SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
31.如权利要求23-30中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域，或初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，其中所述共刺激信号传导结构域包含选自以下的蛋白的功能性信号传导结构域：CD27，CD28，4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异性结合CD83的配体，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8α，CD8β，IL2Rβ，IL2Rγ，IL7Rα，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244，2B4)，CD84，CD96(Tactile)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELPLG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46和NKG2D。
32.如权利要求23-31中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列中的至少一个、两个或三个修饰但不多于20、10或5个氨基酸修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。
34.如权利要求23-33中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述胞内结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列，以及SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同的框架中表达并且作为单一的多肽链表达。
35.如权利要求23-34中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述CAR包含前导序列，所述前导序列包含SEQ ID NO:2，例如由SEQ ID NO:2组成。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是:(1)靶向LSD1基因的一个或多个位点或其相应调控元件的基因编辑系统；(2)包含与LSD1基因的靶序列互补的序列的核酸(例如，siRNA或shRNA或反义寡核苷酸)；(3)蛋白质(例如显性失活LSD1，例如催化失活的LSD1或LSD1的显性失活结合配偶体)；(4)小分子；(5)编码(1)-(3)中任一项的核酸；或(6)(1)-(5)的任何组合。
37.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是shRNA或siRNA，所述shRNA或siRNA包含与表1中列出的LSD1基因的靶序列互补的序列，所述表1中列出的LSD1基因的靶序列例如选自SEQ ID NO:[43]至SEQ ID NO:[82]。
38.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是由核酸编码的shRNA，其包含编码表1的抗LSD1shRNA的任一序列，例如由包含选自SEQ ID NO:[83]至SEQ ID NO:[122]的序列的核酸编码的shRNA。
39.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是包含编码表1的抗LSD1shRNA的任一序列的核酸，例如选自SEQ ID NO:[83]至SEQ ID NO:[122]。
40.如权利要求39所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述核酸位于载体上。
41.如权利要求40所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述载体进一步包含有效连接至所述核酸的U6或H1启动子。
42.如权利要求40-41中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体、质粒、微环、纳质粒或RNA载体。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述载体进一步包含编码CAR的序列。
44.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是对LSD1基因(KDM1A)或其调控元件的序列特异的基因组编辑系统，所述基因组编辑系统选自CRISPR基因组编辑系统、锌指核酸酶基因组编辑系统、TALEN基因组编辑系统和大范围核酸酶基因组编辑系统。
45.如权利要求44所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是CRISPR基因组编辑系统，其包含gRNA分子，所述gRNA分子包含与LSD1基因(KDM1A)或其调节元件的序列互补的靶向结构域，例如所述gRNA分子包含SEQ ID NO:[132]至[862]中的任一个序列。
46.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是小分子。
47.如权利要求46所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述小分子是可逆的或不可逆的LSD1抑制剂。
48.如权利要求46或47所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是:
a)GSK2699537；
b)rel-2-[[(1R,2S)-2-[4-[(4-氯苯基)甲氧基]苯基]环丙基]氨基]-1-(4-甲基-1-哌嗪基)乙酮；
c)(R)-4-(5-(吡咯烷-3-基甲氧基)-2-(对甲苯基)吡啶-3-基)苄腈；
d)(1S,2R)-N-((2-甲氧基吡啶-3-基)甲基)-2-苯基环丙-1-胺；
e)N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺；
f)5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)-[1,1'-联苯基]-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈；
g)rel-N-[(1R,2S)-2-苯基环丙基]-4-哌啶胺；
h)2-(1R,2S)-2-(4-(苄氧基)苯基)环丙基氨基)-1-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酮；
i)反式-3-(3-氨基-2-甲基苯基)-1-(4-羟基环己基)-6-甲基-1H-吲哚-5-甲腈；或
j)前述任一种的可药用盐。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂缀合至抗体或其抗原结合片段。
50.如权利要求49所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述抗体或其抗原结合片段识别T细胞表面上的抗原。
51.如权利要求50所述的方法或免疫效应细胞群体，其中T细胞表面上的抗原是CD3。
52.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是蛋白质，例如是LSD1的显性失活结合配偶体(例如与LSD1相互作用的组蛋白脱乙酰酶(HDAC)或者Co-REST或AR共激活子复合物的其他成员)或编码LSD1的所述显性失活结合配偶体的核酸。
53.如权利要求36所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述LSD1抑制剂是蛋白质，例如是显性失活的(例如催化失活的)LSD1或编码所述显性失活LSD1的核酸。
54.一种治疗有需要的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求15-18中任一项的免疫效应细胞群体。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用LSD1抑制剂。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述受试者在施用所述免疫效应细胞群体之前接受LSD1抑制剂的预处理。
57.如权利要求55-56中任一项所述的方法，其中所述受试者接受用LSD1抑制剂和免疫效应细胞群体的同时治疗。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用免疫效应细胞群体后接受LSD1抑制剂的治疗。
59.如权利要求1-15或19-58中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如增殖性疾病、癌前病症、癌症和与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关的适应症。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述癌症是血液学癌，选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)，急性白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，B细胞急性淋巴细胞性白血病(B-ALL)，T细胞急性淋巴样白血病(T-ALL)，慢性粒细胞白血病(CML)，B细胞幼淋巴细胞白血病，浆细胞样树突状细胞瘤，伯基特淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，多毛细胞白血病，小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤，恶性淋巴增殖性病症，MALT淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，浆细胞淋巴瘤，浆细胞样树突细胞瘤，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症或白血病前期中的一种或多种。
61.如权利要求59所述的用途或方法，其中所述癌症选自结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头或颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛区癌症，胃癌，睾丸癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，内分泌系统癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，儿童实体肿瘤，膀胱癌，肾或输尿管癌，肾盂癌，中枢神经系统(CNS)赘生物，原发性CNS淋巴瘤，肿瘤血管生成，脊髓轴肿瘤，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，卡波西肉瘤，表皮样癌，鳞状细胞癌，T细胞淋巴瘤，环境诱发的癌症，所述癌症的组合和所述癌症的转移性病变。
62.前述权利要求中任一项所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述受试者是人。
63.如权利要求62所述的方法或免疫效应细胞群体，其中所述人患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如癌症。
64.一种化合物，选自N,N-二甲基-1-((4-(4-(4-(哌啶-4-基)苯基)-1H-吲唑-1-基)苯基)磺酰基)哌啶-4-胺和5-(6-氯-4'-(甲磺酰基)联苯基-3-基)-2-(哌嗪-1-基)-1H-吡咯-3-甲腈；或其可药用盐。
65.如权利要求64的化合物的可药用盐。
66.如权利要求64-65中任一项所述的化合物，用于治疗。
67.如权利要求64-65中任一项的化合物，用于权利要求1-14，19-36，46-51或54-63中任一项的方法中。
68.一种用于离体制备免疫效应细胞群体的组合物，其包含LSD1抑制剂。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述LSD1抑制剂是小分子。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述小分子的浓度范围为约0.001nM至约10mM，例如约0.001nM至约100nM。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述小分子的浓度在约0.1μM至约10μM的范围内。
72.如权利要求68-71中任一项所述的组合物，其中所述免疫效应细胞群体包含经工程化以表达CAR的细胞。
73.一种用于治疗受试者的LSD1抑制剂，其中所述受试者已经接受、正在接受或即将接受包含免疫效应细胞的治疗，所述免疫效应细胞例如经工程化以表达CAR的免疫效应细胞。
74.一种LSD1抑制剂，用于制备免疫效应细胞，例如经工程化以表达CAR的免疫效应细胞。
75.一种制备免疫效应细胞的方法，包括将编码CAR的核酸引入所述细胞，其中所述核酸整合到所述细胞基因组中的LSD1基因内，使得LSD1表达和/或功能降低。
CN201680082866.9A 2015-12-30 2016-12-30 具有增强功效的免疫效应细胞疗法 Pending CN109072195A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2015/099882 2015-12-30
CN2015099882 2015-12-30
PCT/CN2016/113612 WO2017114497A1 (en) 2015-12-30 2016-12-30 Immune effector cell therapies with enhanced efficacy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109072195A true CN109072195A (zh) 2018-12-21

Family

ID=59224653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680082866.9A Pending CN109072195A (zh) 2015-12-30 2016-12-30 具有增强功效的免疫效应细胞疗法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20190000880A1 (zh)
EP (2) EP3397756B1 (zh)
JP (1) JP2019500394A (zh)
KR (1) KR20180099768A (zh)
CN (1) CN109072195A (zh)
AU (1) AU2016382512A1 (zh)
BR (1) BR112018013074A2 (zh)
CA (1) CA3009709A1 (zh)
ES (1) ES2944597T3 (zh)
IL (2) IL260269B (zh)
MX (1) MX2018008106A (zh)
RU (1) RU2018127657A (zh)
SG (1) SG11201805451TA (zh)
WO (1) WO2017114497A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627903A (zh) * 2019-10-29 2019-12-31 河南大学 抗cd97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用
CN112521512A (zh) * 2020-12-14 2021-03-19 广州百暨基因科技有限公司 抗b7h3嵌合抗原受体及其应用
CN114410689A (zh) * 2022-03-29 2022-04-29 北京循生生物医学研究有限公司 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法
CN115612673A (zh) * 2022-12-14 2023-01-17 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 一种改善car-t细胞群的持久性的方法

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT2958943T (pt) 2013-02-20 2019-12-17 Novartis Ag Tratamento do cancro usando recetor de antigénios quiméricos anti-egfrviii humanizados
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
EP2970426B1 (en) 2013-03-15 2019-08-28 Michael C. Milone Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
CA3225453A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
JP6793902B2 (ja) 2013-12-20 2020-12-02 ノバルティス アーゲー 調節可能キメラ抗原受容体
EP4303229A3 (en) 2014-01-21 2024-04-17 Novartis AG Enhanced antigen presenting ability of car t cells by co-introduction of costimulatory molecules
WO2015109391A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Children's Hospital Of Eastern Ontario Research Institute Inc. Smc combination therapy for the treatment of cancer
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
TWI718992B (zh) 2014-07-21 2021-02-21 瑞士商諾華公司 使用cll-1嵌合抗原受體治療癌症
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
DK3194443T3 (da) 2014-09-17 2021-09-27 Novartis Ag Målretning af cytotoksiske celler med kimære receptorer i forbindelse med adoptiv immunterapi
SG11201702895SA (en) 2014-10-08 2017-05-30 Novartis Ag Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
WO2016115482A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Novartis Pharma Ag Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
WO2016126608A1 (en) 2015-02-02 2016-08-11 Novartis Ag Car-expressing cells against multiple tumor antigens and uses thereof
SI3280729T1 (sl) 2015-04-08 2022-09-30 Novartis Ag Terapije CD20, terapije CD22 in kombinacija terapij s celico, ki izraža himerni antigenski receptor CD19 (CAR)
JP7114457B2 (ja) 2015-04-17 2022-08-08 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア キメラ抗原受容体発現細胞の有効性および増殖を改善するための方法
AR105433A1 (es) 2015-07-21 2017-10-04 Novartis Ag Métodos para mejorar la eficacia y expansión de las células inmunes
EP3331913A1 (en) 2015-08-07 2018-06-13 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric cd3 receptor proteins
JP6905163B2 (ja) 2015-09-03 2021-07-21 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア サイトカイン放出症候群を予測するバイオマーカー
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
JP2019534317A (ja) * 2016-09-07 2019-11-28 ユニバーシティ・オブ・キャンベラＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｎｂｅｒｒａ リジン特異的ヒストンデメチラーゼ−１阻害剤及びその使用
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
WO2018059549A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
AR110676A1 (es) 2016-10-07 2019-04-24 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos
WO2018083189A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Oryzon Genomics, S.A. Biomarkers for determining responsiveness to lsd1 inhibitors
WO2018106984A1 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Constellation Pharmaceuticals, Inc. Markers for personalized cancer treatment with lsd1 inhibitors
WO2018132506A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 The General Hospital Corporation Chimeric antigen receptors based on alternative signal 1 domains
WO2018140725A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Novartis Ag Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
KR20190130608A (ko) 2017-03-22 2019-11-22 노파르티스 아게 면역종양학을 위한 조성물 및 방법
WO2019016360A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-24 Cellectis MODIFIED IMMUNE CELLS RESISTANT TO TUMOR MICRO-ENVIRONMENT
CA3069557A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Cellectis Engineered immune cells resistant to tumor microoenvironment
CN110996949A (zh) 2017-08-03 2020-04-10 奥瑞泽恩基因组学股份有限公司 用于治疗行为改变的方法
US11685782B2 (en) * 2017-10-23 2023-06-27 Children's Medical Center Corporation Methods of treating cancer using LSD1 inhibitors in combination with immunotherapy
EP3713584A1 (en) * 2017-11-20 2020-09-30 Prospect Chartercare RWMC LLC D/B/A Roger Williams Medical Center Compositions for improving car-t cell functionality and use thereof
AU2019225174A1 (en) * 2018-02-23 2020-09-03 Endocyte, Inc. Sequencing method for CAR T cell therapy
CN108753773B (zh) * 2018-05-03 2021-03-30 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 干扰IFN-gama表达的CD19-CAR-T细胞及其应用
WO2019241426A1 (en) 2018-06-13 2019-12-19 Novartis Ag Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3793578A4 (en) * 2018-06-22 2022-03-23 The General Hospital Corporation CHIMERA ANTIGEN RECEPTORS DIRECTED AGAINST CD37 AND CD19
WO2020061796A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Hrain Biotechnology Co., Ltd. Bcma-and-cd19-targeting chimeric antigen receptor and uses thereof
CA3119599A1 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Rapa Therapeutics, Llc Als treatment using induced regulatory t (itreg) cells
WO2020146345A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Children's Medical Center Corporation Methods of treating cancer using lsd1 inhibitors and/or tgf-beta inhibitors in combination with immunotherapy
CN113396230A (zh) 2019-02-08 2021-09-14 豪夫迈·罗氏有限公司 癌症的诊断和治疗方法
CA3130638A1 (en) 2019-03-20 2020-09-24 Oryzon Genomics, S.A. Methods of treating borderline personality disorder
CN113631164A (zh) 2019-03-20 2021-11-09 奥莱松基因组股份有限公司 使用kdm1a抑制剂如化合物伐菲德司他治疗注意缺陷多动症的方法
US20200323905A1 (en) * 2019-04-15 2020-10-15 Trustees Of Boston University Methods and compositions for modulating the immune system
JP2022546908A (ja) 2019-07-05 2022-11-10 オリゾン・ゲノミクス・ソシエダッド・アノニマ Ｋｄｍ１ａ阻害剤を使用した小細胞肺がんの個別化された処置のためのバイオマーカーおよび方法
JP2023503161A (ja) 2019-11-26 2023-01-26 ノバルティス アーゲー Ｃｄ１９及びｃｄ２２キメラ抗原受容体及びその使用
EP3904507A1 (en) * 2020-04-28 2021-11-03 Ospedale San Raffaele S.r.l. Method to produce t cells and uses thereof
EP4196612A1 (en) 2020-08-12 2023-06-21 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
BR112023015303A2 (pt) 2021-02-01 2023-11-14 Regenxbio Inc Método para tratar doença cln2 devido a deficiência de tpp1 em um sujeito
JP2024516230A (ja) 2021-04-30 2024-04-12 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療及び診断方法並びに組成物
TW202307210A (zh) 2021-06-01 2023-02-16 瑞士商諾華公司 Ｃｄ１９和ｃｄ２２嵌合抗原受體及其用途
CA3235307A1 (en) * 2021-10-26 2023-05-04 Yassine Taoufik T cell immunotherapy derived from highly functional autologous stem cell memory cells
WO2023220012A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Treating cancer
WO2023225634A2 (en) * 2022-05-20 2023-11-23 Imago Biosciences, Inc. Methods for the enhancement of therapeutic effect of car-t cells

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012107499A1 (en) * 2011-02-08 2012-08-16 Oryzon Genomics S.A. Lysine demethylase inhibitors for myeloproliferative or lymphoproliferative diseases or disorders
WO2014039044A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t memory stem cell populations
WO2014165707A2 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
WO2015181380A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Ieo - Istituto Europeo Di Oncologia S.R.L. Cyclopropylamine compounds as histone demethylase inhibitors

Family Cites Families (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4851332A (en) 1985-04-01 1989-07-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Choriocarcinoma monoclonal antibodies and antibody panels
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US5646253A (en) 1994-03-08 1997-07-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Recombinant human anti-LK26 antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
US5504048A (en) 1993-06-02 1996-04-02 Fina Technology, Inc. Addition of lithium compounds to Ziegler-Natta catalysts for increased molecular weight in polyolefins
US5843674A (en) 1993-11-16 1998-12-01 Pola Chemical Industries Inc. Anti-human tyrosinase monoclonal antibody
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
EP0756604A1 (en) 1994-04-22 1997-02-05 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Melanoma antigens
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
US6033876A (en) 1995-01-18 2000-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh Anti-CD30 antibodies preventing proteolytic cleavage and release of membrane-bound CD30 antigen
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
CA2241604C (en) 1996-01-05 2010-03-30 Ira Pastan Mesothelium antigen and methods and kits for targeting it
DE19608769C1 (de) 1996-03-07 1997-04-10 Univ Eberhard Karls Antikörper BV10A4H2
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
AU5158098A (en) 1996-10-25 1998-05-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions for inhibiting inflammation and angiogenesis compri sing a mammalian CD97 alpha subunit
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
ATE317437T1 (de) 1997-12-01 2006-02-15 Us Gov Health & Human Serv Antikörper, sowie fv moleküle, und immunkonjugate mit hoher bindungsaffinität für mesothelin und methoden für deren verwendung
US6183608B1 (en) 1998-02-05 2001-02-06 Wilbur A. Dammann Electrode positioning mechanism
US6803448B1 (en) 1998-07-22 2004-10-12 Vanderbilt University GBS toxin receptor
US6528481B1 (en) 1999-02-16 2003-03-04 The Burnam Institute NG2/HM proteoglycan-binding peptides that home to angiogenic vasculature and related methods
DK1210425T4 (en) 1999-08-17 2015-08-10 Apotech R & D Sa BAFF receptor (BCMA), an immunoregulatory agent
DE60038252T2 (de) 1999-09-30 2009-03-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Menschlicher Antikörper gegen Gangliosid GD3 für die Transplantationskomplentarität bestimmende Region und Derivate des Antikörpers gegen das Gangliosid GD3
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
WO2001062895A2 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
AU5003001A (en) 2000-03-06 2001-09-17 Univ Kentucky Res Found Methods to impair hematologic cancer progenitor cells and compounds related thereto
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
CN103224562B (zh) 2001-08-23 2017-09-08 Rsr有限公司 促甲状腺素受体的表位区域和针对该区域的抗体
EP1470159B1 (en) 2001-12-04 2013-08-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody to latent membrane proteins and uses thereof
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
EP1590034B1 (en) 2002-10-07 2014-05-14 Biovalve Technologies, Inc. Microneedle array patch
JP4744147B2 (ja) 2002-11-26 2011-08-10 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ゲーエムベーハー アフィニティー精製抗体を用いた甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体の同定
WO2004087758A2 (en) 2003-03-26 2004-10-14 Neopharm, Inc. Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use
CU23403A1 (es) 2003-04-23 2009-08-04 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos recombinantes y fragmentos que reconocen el gangliósido n-glicolil gm3 y su uso para diagnóstico y tratamiento de tumores
WO2005046573A2 (en) 2003-06-27 2005-05-26 Diadexus, Inc. Pro104 ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
JP5026072B2 (ja) 2003-07-01 2012-09-12 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 二重特異性抗体の多価キャリヤー
EP1651675A1 (en) 2003-08-05 2006-05-03 Morphotek, Inc. A variant cell surface molecule associated with cancer
WO2005035577A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
CA2555185C (en) 2004-02-06 2020-03-24 Morphosys Ag Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
WO2005118788A2 (en) 2004-05-27 2005-12-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
AU2006223301B2 (en) 2005-03-10 2010-11-04 Eisai, Inc. Anti-mesothelin antibodies
EP1726650A1 (en) 2005-05-27 2006-11-29 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
WO2006138315A2 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-igf1r antibody formulations
AU2006279943B2 (en) 2005-08-10 2012-02-16 The Johns Hopkins University Polyamines useful as anti-parasitic and anti-cancer therapeutics and as lysine-specific demethylase inhibitors
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
PT1960434E (pt) 2005-12-08 2012-10-02 Medarex Inc Anticorpos monoclonais humanos para fucosil-gm1 e métodos para a utilização de anti-fucosil-gm1
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
EP1996716B1 (en) 2006-03-20 2011-05-11 The Regents of the University of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting
ES2482145T3 (es) 2006-03-29 2014-08-01 King's College London Anticuerpos agonistas contra TSHR
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
JP2010505775A (ja) 2006-10-04 2010-02-25 クーベンハヴンス・ユニヴェルシテット Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体
FR2906808B1 (fr) 2006-10-10 2012-10-05 Univ Nantes Utilisation d'anticorps monoclonaux specifiques de la forme o-acetylee du ganglioside gd2 dans le traitement de certains cancers
WO2008101234A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti ganglioside gd3 antibodies and uses thereof
US7635753B2 (en) 2007-02-19 2009-12-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Prostate cancer and melanoma antigens
AU2008234530B2 (en) 2007-03-29 2013-03-28 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies, methods and kits for diagnosing and treating melanoma
WO2008127735A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Stemline Therapeutics, Inc. Il3ralpha antibody conjugates and uses thereof
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
AU2008282863A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Merck Sharp & Dohme Corp. IGF-1R specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
CN101951946B (zh) 2007-10-01 2014-12-10 百时美施贵宝公司 结合间皮素的人抗体及其应用
US9023351B2 (en) 2007-11-26 2015-05-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
AR071891A1 (es) 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
CA2737758C (en) 2008-09-19 2017-10-31 Soldano Ferrone Monoclonal antibodies for cspg4 for the diagnosis and treatment of basal breast carcinoma
EP2361242B1 (en) 2008-10-17 2018-08-01 Oryzon Genomics, S.A. Oxidase inhibitors and their use
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010084160A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oryzon Genomics S.A. Phenylcyclopropylamine derivatives and their medical use
WO2010126066A1 (ja) 2009-04-27 2010-11-04 協和発酵キリン株式会社 血液腫瘍治療を目的とした抗IL-3Rα抗体
US8859555B2 (en) 2009-09-25 2014-10-14 Oryzon Genomics S.A. Lysine Specific Demethylase-1 inhibitors and their use
EP2486002B1 (en) 2009-10-09 2019-03-27 Oryzon Genomics, S.A. Substituted heteroaryl- and aryl- cyclopropylamine acetamides and their use
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
CA2782333C (en) 2009-12-02 2019-06-04 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
US9023996B2 (en) 2009-12-23 2015-05-05 Synimmune Gmbh Anti-FLT3 antibodies
TW202348631A (zh) 2010-02-24 2023-12-16 美商免疫遺傳股份有限公司 葉酸受體１抗體類和免疫共軛物類及彼等之用途
WO2011159847A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
NZ603581A (en) 2010-06-19 2015-05-29 Sloan Kettering Inst Cancer Anti-gd2 antibodies
CA2805442C (en) 2010-07-21 2020-05-12 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of an hla locus
US9006449B2 (en) 2010-07-29 2015-04-14 Oryzon Genomics, S.A. Cyclopropylamine derivatives useful as LSD1 inhibitors
EP2614143B1 (en) 2010-09-08 2018-11-07 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of non-small lung cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
WO2012034116A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 The Johns Hopkins University Small molecules as epigenetic modulators of lysine-specific demethylase 1 and methods of treating disorders
WO2012071469A2 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Nevada Cancer Institute Histone demethylase inhibitors and uses thereof for treatment o f cancer
KR102062407B1 (ko) 2010-12-09 2020-01-03 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
MX347913B (es) 2011-03-25 2017-05-17 Glaxosmithkline Intellectual Property (No 2) Ltd Ciclopropilaminas como inhibidores de desmetilasa 1 especifica de lisina.
PE20141271A1 (es) 2011-04-01 2014-10-08 Sloan Kettering Inst Cancer Anticuerpos tipo receptor de celulas t especificos para un peptido wt1 presentado por hla-a2
EP2694549B1 (en) 2011-04-08 2018-08-15 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant iii chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
AR086044A1 (es) 2011-05-12 2013-11-13 Imclone Llc Anticuerpos que se unen especificamente a un dominio extracelular de c-kit y usos de los mismos
PT3415531T (pt) 2011-05-27 2023-09-12 Glaxo Group Ltd Proteínas de ligação a bcma (cd269/tnfrsf17
WO2013040557A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna engineered t cells for the treatment of cancer
EP3692794A1 (en) 2011-09-16 2020-08-12 Baylor College of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
DE102011114180A1 (de) 2011-09-22 2013-03-28 Weber Maschinenbau Gmbh Breidenbach Vorrichtung zum Aufschneiden von einem Lebensmittelprodukt und Vorrichtung mit einem Roboter
FR2980528B1 (fr) 2011-09-22 2013-08-30 IFP Energies Nouvelles Procede de controle de la combustion d'un moteur a combustion interne a injection directe d'essence, notamment a allumage commande
US9469597B2 (en) 2011-10-20 2016-10-18 Oryzon Genomics S.A. (Hetero)aryl cyclopropylamine compounds as LSD1 inhibitors
CN104203914B (zh) 2011-10-20 2017-07-11 奥瑞泽恩基因组学股份有限公司 作为lsd1抑制剂的(杂)芳基环丙胺化合物
ITMO20110270A1 (it) 2011-10-25 2013-04-26 Sara Caldrer Una cellula effettrice modificata per il trattamento di neoplasie esprimenti il disialonganglioside gd2
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
US9439768B2 (en) 2011-12-08 2016-09-13 Imds Llc Glenoid vault fixation
ES2774160T3 (es) 2012-02-13 2020-07-17 Seattle Childrens Hospital D/B/A Seattle Childrens Res Institute Receptores de antígenos quiméricos biespecíficos y usos terapéuticos de los mismos
CN104159909A (zh) 2012-02-22 2014-11-19 宾夕法尼亚大学董事会 产生用于癌症治疗的t细胞持续性群体的组合物和方法
AU2013235726B2 (en) 2012-03-23 2017-04-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
RU2014148162A (ru) 2012-05-01 2016-06-20 Дженентек, Инк. Анти-pmel17 антитела и их иммуноконъюгаты
EP4053162A1 (en) 2012-05-18 2022-09-07 Aptevo Research and Development LLC Bispecific scfv immunofusion (bif) binding to cd123 and cd3
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
WO2013192294A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Boston 3T Biotechnologies, Inc. Cellular therapies for treating and preventing cancers and other immune system disorders
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
AU2013305838A1 (en) 2012-08-20 2015-02-26 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
WO2014055442A2 (en) 2012-10-01 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting stromal cells for the treatment of cancer
US10117896B2 (en) 2012-10-05 2018-11-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US20140310830A1 (en) 2012-12-12 2014-10-16 Feng Zhang CRISPR-Cas Nickase Systems, Methods And Compositions For Sequence Manipulation in Eukaryotes
ES2576128T3 (es) 2012-12-12 2016-07-05 The Broad Institute, Inc. Modificación por tecnología genética y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias con dominios funcionales
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
ES2701749T3 (es) 2012-12-12 2019-02-25 Broad Inst Inc Métodos, modelos, sistemas y aparatos para identificar secuencias diana para enzimas Cas o sistemas CRISPR-Cas para secuencias diana y transmitir resultados de los mismos
EP2932421A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
CN113528577A (zh) 2012-12-12 2021-10-22 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化
ES2883590T3 (es) 2012-12-12 2021-12-09 Broad Inst Inc Suministro, modificación y optimización de sistemas, métodos y composiciones para la manipulación de secuencias y aplicaciones terapéuticas
JP6552965B2 (ja) 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
PT2958943T (pt) 2013-02-20 2019-12-17 Novartis Ag Tratamento do cancro usando recetor de antigénios quiméricos anti-egfrviii humanizados
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
US20160031996A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 Csl Limited Anti il-3r alpha agents and uses thereof
US20160046718A1 (en) 2013-03-14 2016-02-18 Csl Limited Agents that neutralize il-3 signalling and uses thereof
US11332719B2 (en) 2013-03-15 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Recombinant virus and preparations thereof
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
JP6670743B2 (ja) 2013-05-29 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場
RU2716420C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка и применение систем crispr-cas, векторов и композиций для целенаправленного воздействия и терапии в печени
RU2725502C2 (ru) 2013-06-17 2020-07-02 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, конструирование и оптимизация систем, способы и композиции для целенаправленного воздействия и моделирования заболеваний и нарушений постмитотических клеток
EP3725885A1 (en) 2013-06-17 2020-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
CA2915834A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
CN105492611A (zh) 2013-06-17 2016-04-13 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的优化的crispr-cas双切口酶系统、方法以及组合物
EP3011035B1 (en) 2013-06-17 2020-05-13 The Broad Institute, Inc. Assay for quantitative evaluation of target site cleavage by one or more crispr-cas guide sequences
CN105793425B (zh) 2013-06-17 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 使用病毒组分靶向障碍和疾病的crispr-cas系统和组合物的递送、用途和治疗应用
AU2014281398B2 (en) 2013-06-19 2018-10-04 University Of Utah Research Foundation Substituted (E)-N'-(1-phenylethylidene) benzohydrazide analogs as histone demethylase inhibitors
AU2014296059B2 (en) * 2013-08-02 2020-12-10 The Regents Of The University Of California Engineering antiviral T cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
US9556170B2 (en) 2013-08-30 2017-01-31 University Of Utah Research Foundation Substituted-1H-benzo[d]imidazole series compounds as lysine-specific demethylase 1 (LSD1) inhibitors
WO2015048577A2 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
CA3225453A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3392244A1 (en) 2014-02-13 2018-10-24 Incyte Corporation Cyclopropylamines as lsd1 inhibitors
AU2015217073B2 (en) 2014-02-13 2019-08-22 Incyte Holdings Corporation Cyclopropylamines as LSD1 inhibitors
US9527835B2 (en) 2014-02-13 2016-12-27 Incyte Corporation Cyclopropylamines as LSD1 inhibitors
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2015153514A1 (en) * 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
IL293603B2 (en) 2014-04-07 2024-03-01 Novartis Ag Cancer treatment using chimeric antigen receptor (CAR) against CD19
UY36071A (es) 2014-04-11 2015-11-30 Takeda Pharmaceutical Compuesto de ciclopropanamina y sus usos
CN106687483B (zh) 2014-07-21 2020-12-04 诺华股份有限公司 使用人源化抗-bcma嵌合抗原受体治疗癌症
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
TWI718992B (zh) 2014-07-21 2021-02-21 瑞士商諾華公司 使用cll-1嵌合抗原受體治療癌症
JP6706244B2 (ja) 2014-07-24 2020-06-03 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
WO2016025880A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
MY189028A (en) 2014-08-19 2022-01-20 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
WO2016210292A1 (en) * 2015-06-25 2016-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion, enrichment, and maintenance
EP3429603B1 (en) * 2016-03-15 2021-12-29 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to hematopoietic stem cell expansion
WO2018059549A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Novartis Ag Immune effector cell therapies with enhanced efficacy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012107499A1 (en) * 2011-02-08 2012-08-16 Oryzon Genomics S.A. Lysine demethylase inhibitors for myeloproliferative or lymphoproliferative diseases or disorders
WO2014039044A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t memory stem cell populations
WO2014165707A2 (en) * 2013-04-03 2014-10-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Effective generation of tumor-targeted t-cells derived from pluripotent stem cells
WO2015181380A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Ieo - Istituto Europeo Di Oncologia S.R.L. Cyclopropylamine compounds as histone demethylase inhibitors

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110627903A (zh) * 2019-10-29 2019-12-31 河南大学 抗cd97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用
CN110627903B (zh) * 2019-10-29 2021-09-21 河南大学 抗cd97单克隆抗体、其可变区与恒定区序列及应用
CN112521512A (zh) * 2020-12-14 2021-03-19 广州百暨基因科技有限公司 抗b7h3嵌合抗原受体及其应用
CN112521512B (zh) * 2020-12-14 2021-09-17 广州百暨基因科技有限公司 抗b7h3嵌合抗原受体及其应用
CN114410689A (zh) * 2022-03-29 2022-04-29 北京循生生物医学研究有限公司 一种增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤力的制备方法
CN115612673A (zh) * 2022-12-14 2023-01-17 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 一种改善car-t细胞群的持久性的方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180099768A (ko) 2018-09-05
CA3009709A1 (en) 2017-07-06
US20190000880A1 (en) 2019-01-03
BR112018013074A2 (pt) 2018-12-11
WO2017114497A1 (en) 2017-07-06
RU2018127657A (ru) 2020-01-31
IL260269B (en) 2021-09-30
IL286207A (en) 2021-10-31
EP3397756B1 (en) 2023-03-08
ES2944597T3 (es) 2023-06-22
EP4219689A3 (en) 2023-12-20
SG11201805451TA (en) 2018-07-30
AU2016382512A1 (en) 2018-07-12
MX2018008106A (es) 2019-03-14
EP3397756A4 (en) 2019-12-04
JP2019500394A (ja) 2019-01-10
EP4219689A2 (en) 2023-08-02
EP3397756A1 (en) 2018-11-07
RU2018127657A3 (zh) 2020-10-16
IL260269A (en) 2018-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109072195A (zh) 具有增强功效的免疫效应细胞疗法
JP6860623B2 (ja) キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
US20190298715A1 (en) Immune effector cell therapies with enhanced efficacy
CN108699557A (zh) 用于免疫肿瘤学的组合物和方法
TW202016139A (zh) Bcma 嵌合抗原受體及其用途
US20180298068A1 (en) Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
CN109069597A (zh) 间皮素嵌合抗原受体(car)和抗pd-l1抗体抑制剂联用于抗癌治疗
CN109476722A (zh) 用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法
CN109153714A (zh) 表达多重嵌合抗原受体(car)分子的细胞及其用途
CN108633287A (zh) 功效增强的car t细胞治疗
CN110267677A (zh) 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症
CN107922498A (zh) 具有整合可控功能的嵌合抗原受体
WO2019210153A1 (en) Car t cell therapies with enhanced efficacy
CN108473957A (zh) 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
CN107109419A (zh) 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
CN107580628A (zh) 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
JPWO2019241426A5 (zh)
US20180092968A1 (en) Compositions to disrupt protein kinase a anchoring and uses thereof
US20210123075A1 (en) Compositions and methods for immunooncology
US20200390811A1 (en) Compositions to disrupt protein kinase a anchoring and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181221