CN109153714A - 表达多重嵌合抗原受体(car)分子的细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过施用包含结合B细胞抗原的嵌合抗原受体和结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体的细胞，治疗与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的疾病的组合物和方法。

Description

表达多重嵌合抗原受体(CAR)分子的细胞及其用途
相关申请
本申请要求2016年3月4日提交的美国临时专利申请号62/303,466的优先权。本申请的完整内容通过引用方式并入本文。
技术领域
本公开一般地涉及经工程化以表达靶向B细胞的嵌合抗原受体(CAR)和经工程化以表达下述CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病的用途，所述CAR靶向表达B细胞抗原之外的肿瘤抗原的细胞，例如，表达实体瘤抗原、髓系肿瘤抗原的细胞，或表达非B细胞来源的血液肿瘤的抗原的细胞。
发明背景
免疫疗法是有前景的肿瘤治疗方案。采用细胞的免疫治疗具有可以激发快速和持久的肿瘤免疫应答的定向疗法优点，所述细胞表达靶向肿瘤表达的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。CAR疗法已经在临床学上在治疗某些血液癌(如B细胞恶性肿瘤)方面显示有前景的结果(参见，例如，Sadelain等人,Cancer Discovery 3:388-398(2013))。鼠衍生的CART19(即，“CTL019”)的临床结果已经在CLL患者中以及儿童ALL中建立完全缓解方面显示出前景(参见，例如，Kalo等人,Sci Transl Med 3:95ra73(2011)；Porter等人,NEJM 365:725-733(2011)；Grupp等人,NEJM 368:1509-1518(2013))。但是，探索CAR疗法治疗其他癌的研究已经展示了可变的功效，这部分地归因于表达CAR的细胞体内持久性和增殖有限。
因此，需要在患者中功效增强(例如，增殖增强或持久性延长)的CAR细胞疗法。
发明概述
本公开的特征至少部分地在于使用免疫效应细胞(例如，T细胞)在受试者中治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病(例如，癌症)的方法和组合物，所述免疫效应细胞经工程化以表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原结合并且所述第二CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原之外的肿瘤抗原结合，例如，旨在增强表达CAR的免疫效应细胞疗法的功效(例如，患者中靶向肿瘤抗原的表达CAR的免疫效应细胞的持久性和/或增殖)。不希望受理论约束，例如，如与施用仅表达靶向肿瘤的CAR(例如，不表达靶向B细胞抗原的CAR)的免疫效应细胞相比，用表达靶向B细胞抗原的CAR和靶向肿瘤抗原的CAR的免疫效应细胞治疗例如，通过以下一种或多种方式，增强受试者中靶向肿瘤抗原表达的CAR的免疫效应细胞的抗肿瘤功效：增加所述表达CAR的免疫效应细胞的增殖和/或增加所述表达CAR的免疫效应细胞的体内持久性。在多个方面，B细胞抗原和B细胞抗原之外的肿瘤抗原不表达在相同的细胞上(例如，B细胞抗原不表达在表达肿瘤抗原的细胞(例如，肿瘤细胞)上)。
在一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含各自包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原结合并且所述第二CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原之外的肿瘤抗原结合。在本发明的多个方面，由第一CAR靶向的B细胞抗原和由第二CAR靶向的B细胞抗原之外的肿瘤抗原不表达在相同细胞上。
在实施方案中，第二CAR结合：(a)实体瘤抗原；(b)髓系肿瘤抗原；或(c)非B细胞谱系血液肿瘤的抗原。
在实施方案中，B细胞抗原选自CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、5、7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。
在实施方案中，B细胞抗原选自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138。
在一个方面，细胞包含第一嵌合抗原受体，所述第一嵌合抗原受体包含了结合作为BCMA的B细胞抗原的抗原结合结构域。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含在表12或表13中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域还包含在表12或表13中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含：(i)表12或表13中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有在表12或表13中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰；或(iii)与表12或表13中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含：(i)表12或表13中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有在表12或表13中提供的任何重链可变区的至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个氨基酸序列修饰；或(iii)与表12或表13中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表12或表13中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表12或表13中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:349；SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340；SEQ IDNO:341；SEQ ID NO:342；SEQ ID NO:343；SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ IDNO:353、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ IDNO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ IDNO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565或SEQ ID NO:566的序列。
在另一个方面，细胞包含第一嵌合抗原受体，所述第一嵌合抗原受体包含了结合作为CD19的B细胞抗原的抗原结合结构域。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含在表6、表7或表9中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域还包含在表6、表8或表9中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含：(i)表6或表9中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表6或表9中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表6或表9中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含：(i)表6或表9中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表6或表9中提供的任何重链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表6或表9中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表6或表9中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表6或表9中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。在实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:86；SEQ IDNO:87；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:112的序列。
在另一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞包含第二CAR，所述第二CAR包含结合髓系肿瘤抗原的抗原结合结构域，并且其中所述髓系肿瘤抗原选自CD123、CD33和CLL-1。
在另一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞包含第二CAR，所述第二CAR包含结合T细胞淋巴瘤抗原的抗原结合结构域。
在另一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞包含第二CAR，所述第二CAR包含结合实体瘤抗原的抗原结合结构域，例如，其中所述实体瘤抗原选自EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白(Legumain)、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、muthsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的肽。在实施方案中，实体瘤抗原选自CLDN6、间皮素和EGFRvIII。
在一个方面，细胞包含第二嵌合抗原受体，所述第二嵌合抗原受体包含了结合EGFRvIII的抗原结合结构域。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含在表5中列出的任何抗EGFRvIII重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域还包含在表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含：(i)表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表5中提供的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表5中提供的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含：(i)表5中列出的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表5中提供的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表5中提供的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列和表5中列出的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:71-79中任一者的序列。
在一个方面，细胞包含第二嵌合抗原受体，所述第二嵌合抗原受体包含了结合间皮素的抗原结合结构域。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含在表2或表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域还包含在表2或表4中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LCCDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含：(i)表2中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表2中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表2中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含：(i)表2中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个修饰的在表2中提供的任何重链可变区的氨基酸序列；或(iii)与表2中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表2中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表2中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。在实施方案中，所述第二AR的抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:46-70中任一者的序列。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一CAR的抗原结合结构域处于scFv形式。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第二CAR的抗原结合结构域处于scFv形式。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一或所述第二CAR的胞内信号传导结构域包含一个或多个(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR的胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一或所述第二CAR的胞内信号传导结构域包含一个或多个(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR的胞内信号传导结构域包含一个或多个(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，初级信号传导结构域包括(例如，如本文所述的)CD3-ζ刺激性结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，共刺激信号传导结构域是选自以下的共刺激蛋白的胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在本文所述的任何方法和组合物的一个实施方案中，第一CAR分子、第二CAR分子或第一CAR分子和第二CAR分子二者的跨膜结构域包含来自蛋白质的跨膜结构域，所述蛋白质选自：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施方案中，第一CAR、第二CAR或第一CAR和第二CAR二者的跨膜结构域包含了SEQ ID NO:12的氨基酸序列、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但是不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在实施方案中，第一CAR分子和第二CAR分子的跨膜结构域是相同的。在其他实施方案中，第一CAR分子和第二CAR分子的跨膜结构域是不同的。
在本文所述的任何方法和组合物的一个实施方案中，第一CAR分子的抗原结合结构域、第二CAR分子的抗原结合结构域或第一CAR分子和第二CAR分子二者的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:4，或与其具有95-99％同一性的序列。
在本文所述的任何方法和组合物的一个实施方案中、第一CAR分子、第二CAR分子或第一CAR分子和第二CAR分子二者的胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域、所述共刺激信号传导结构域包含从选自以下的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，共刺激结构域包含了SEQ ID NO:14的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但是不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和/或CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含了SEQ ID NO:14的氨基酸序列；和/或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列、或具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰但是不多于20、10或5个修饰的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:14的氨基酸序列和/或SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列，其中包含胞内信号传导结构域的氨基酸序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。
在一些实施方案中，第一CAR分子(例如，靶向B细胞抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域，但是不包含初级信号传导结构域。在其他实施方案中，第一CAR分子(例如，靶向B细胞抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域和(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在一些实施方案中，第二CAR分子(例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域，但是不包含初级信号传导结构域。在一些实施方案中，第二CAR分子(例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域，但是不包含共刺激信号传导结构域。在其他实施方案中，第二CAR分子(例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域和(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在一个优选实施方案中，第一CAR分子(例如，靶向B细胞抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域，但是不包含初级信号传导结构域，并且第二CAR分子(例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域和(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在一个优选实施方案中，第一CAR分子(例如，靶向B细胞抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域和(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域，并且第二CAR分子(例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子)包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激信号传导结构域和(例如，如本文所述的)初级信号传导结构域。
在本文所述的任何方法和组合物的一个实施方案中，第一CAR分子、第二CAR分子或第一CAR分子和第二CAR分子二者还包含前导序列，所述前导序列包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，所述第一和所述第二CAR二者的共刺激结构域包含(例如，如本文所述的)4-1BB的胞内结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，一个或多个所述共刺激结构域包括(例如，如本文所述的)CD28的胞内结构域。
在实施方案中，包括在任何的前述方面和实施方案中，第一或第二CAR包括二个共刺激结构域：(1)(例如，如本文所述的)4-1BB共刺激结构域；和(2)(例如，如本文所述的)CD28共刺激结构域。
在一个方面(包括在包含BCMA CAR的任何前述方面和实施方案中)，所述第一CAR的抗原结合结构域结合BCMA并且第一CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:949、SEQID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQID NO:998和SEQ ID NO:999的氨基酸序列。
在一个方面(包括在包含CD19 CAR的任何前述方面和实施方案中)，所述第一CAR的抗原结合结构域结合CD19并且第一CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:269、SEQID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280和SEQ ID NO:281的氨基酸序列。
在一个方面(包括在包括EGFRvIII CAR的任何前述方面和实施方案中)，所述第二CAR的抗原结合结构域结合EGFRvIII并且第二CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090和SEQ ID NO:1096的氨基酸序列。
在一个方面(包括在包括间皮素CAR的任何的前述方面和实施方案中)，所述第二CAR的抗原结合结构域结合间皮素并且第二CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305和SEQ ID NO:306的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明提供细胞，所述细胞包含CAR，例如，双特异性CAR(例如，如本文所述)，所述CAR包含结合(例如，如本文所述的)B细胞抗原的第一抗原结合结构域、结合(例如，如本文所述的)肿瘤抗原的第二抗原结合结构域、(例如，如本文所述的)跨膜结构域和(例如，如本文所述的)胞内信号传导结构域。在实施方案中，第一抗原结合结构域结合CD19，例如，包含本文所述的CD19结合结构域。在实施方案中，第一抗原结合结构域结合BCMA，例如，包含本文所述的BCMA结合结构域。在实施方案中，第二抗原结合结构域结合实体瘤抗原、髓系肿瘤抗原或非B细胞谱系血液肿瘤的抗原。在实施方案中，第二抗原结合结构域结合(例如，如本文所述的)实体瘤抗原。在实施方案中，第二抗原结合结构域结合EGFRvIII(例如，包含本文所述的EGFRvIII结合结构域)。在其他实施方案中，第二抗原结合结构域结合间皮素(例如，包含本文所述的间皮素结合结构域)。在实施方案中，CAR包含(例如，如本文所述的)针对CD19的第一抗原结合结构域和(例如，如本文所述的)针对EGFRvIII的第二抗原结合结构域。在实施方案中，CAR包含(例如，如本文所述的)针对BCMA的第一抗原结合结构域和(例如，如本文所述的)针对EGFRvIII的第二抗原结合结构域。在实施方案中，CAR包含(例如，如本文所述的)针对CD19的第一抗原结合结构域和(例如，如本文所述的)针对间皮素的第二抗原结合结构域。在实施方案中，CAR包含(例如，如本文所述的)针对BCMA的第一抗原结合结构域和(例如，如本文所述的)针对间皮素的第二抗原结合结构域。在实施方案中，CAR包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)CD3z初级信号传导结构域和(例如，如本文所述的)4-1BB共刺激信号传导结构域。在实施方案中，CAR包含胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)CD3z初级信号传导结构域和(例如，如本文所述的)CD28共刺激信号传导结构域。
在一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞衍生自经诊断患有髓系肿瘤或非B细胞谱系血液肿瘤的患者。
在一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，患者经诊断患有髓系肿瘤，所述髓系肿瘤表达选自CD123、CD33和CLL-1的抗原。
在一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞衍生自经诊断患有实体瘤的患者。在实施方案中，患者经诊断患有实体瘤，所述实体瘤表达选自EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB2、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸(Plysialic acid)、PLAC1、globoH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP和GFRα4的抗原。
在一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞是人细胞并且不衍生自经诊断患有肿瘤的患者。
在一个方面(包括在任何的前述方面和实施方案中)，细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或调节性T细胞。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中刺激T细胞介导针对髓系肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的细胞，例如，任何前述方面和实施方案的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中提供抗髓系肿瘤免疫力的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种治疗患有与表达髓系肿瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在各方面的实施方案中，涉及一种刺激哺乳动物中T细胞介导的对髓系肿瘤细胞的免疫应答的方法、一种在哺乳动物中提供抗髓系肿瘤免疫力的方法和/或一种治疗患有与表达髓系肿瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述髓系肿瘤表达选自CD123、CD33和CLL-1的抗原。在实施方案中，哺乳动物患有表征为急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞B细胞白血病(B细胞急性淋巴样白血病，BALL)、急性淋巴母细胞T细胞白血病(T细胞急性淋巴样白血病(TALL))、B细胞幼淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病(CML)、脊髓发育不良综合征、浆细胞骨髓瘤或其组合的肿瘤。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中刺激T细胞介导针对非B细胞谱系血液肿瘤(例如，T细胞淋巴瘤肿瘤细胞)的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的细胞，例如，任何前述方面和实施方案的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中提供针对非B细胞谱系血液肿瘤的免疫力(例如，抗T细胞淋巴瘤肿瘤免疫力)的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物患有与表达非B细胞谱系血液肿瘤的抗原(例如，T细胞淋巴瘤肿瘤抗原)相关的疾病，所述方法包括施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中刺激T细胞介导针对实体瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文所述的细胞，例如，任何前述方面和实施方案的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物中提供抗实体瘤免疫力的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在另一个方面，本发明提供一种治疗患有与表达实体瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效量的如本文(例如，在任何前述方面和实施方案中)所述的细胞。
在如下各方面的实施方案中：涉及一种刺激哺乳动物中T细胞介导对实体瘤细胞的免疫应答的方法、一种在哺乳动物中提供抗实体肿瘤免疫力的方法和/或一种治疗患有与表达实体瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述实体瘤细胞表达选自如下的抗原：EGFRvIII、间皮素、CS-1、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB2、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸(Plysialic acid)、PLAC1、globoH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP和GFRα4的抗原，例如，EGFRvIII或间皮素。在实施方案中，哺乳动物患有表征为胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、腺癌或间皮瘤的肿瘤。
在一些实施方案中，实体瘤抗原存在于间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌)、胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌或其任意组合或任何前述癌的转移灶中/其上。在本文所述的任何方法和组合物的一个实施方案中，与表达肿瘤抗原相关的疾病是胰腺癌，例如，转移性胰腺导管腺癌(PDA)。在一个实施方案中，胰腺癌处于接受至少一种既往标准疗法时已经进展的受试者中。在一个实施方案中，疾病是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)，例如，处于接受至少一种既往标准疗法时已经进展的受试者中。在一个实施方案中，疾病是卵巢癌，例如，浆液性卵巢上皮癌，例如，在接受至少一种既往标准疗法治疗方案后已经进展的受试者中。在一个实施方案中，疾病是间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、或大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、转移性胰腺癌、食管腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和膀胱癌或其任意组合。
在实施方案中，细胞相对于治疗的哺乳动物为自体。
在实施方案中，细胞相对于治疗的哺乳动物为同种异体。
在实施方案中，哺乳动物是人。
在另一个方面，本发明提供一种方法，包括任何前述方法，其中施用本发明(例如，如本文所述)的细胞，导致所述肿瘤细胞部分或完全消除，并且此后继续在所述受试者中，相比除缺少第一CAR之外是相同的细胞，以更高水平或更长时间长度延续该状态。
在本文所述方法的实施方案中，在施用所述细胞之前、与之同时或在其之后，向哺乳动物施用淋巴细胞清除疗法。
在本文所述方法的实施方案中，在施用所述细胞之前或与之同时，不向哺乳动物施用淋巴细胞清除疗法。
在本文所述的任何方法和组合物的实施方案中，该方法还可以包括施用淋巴细胞清除剂。在一个实施方案中，如与施用淋巴细胞清除剂之前的水平相比，淋巴细胞清除剂降低T细胞(例如，调节性T细胞)和/或调节性B细胞的水平。在一个实施方案中，淋巴细胞清除剂包括氟达拉滨、环磷酰胺、皮质类固醇类、阿伦珠单抗(alemtuzumab)或全身照射(TBI)或其组合。
本文所述的任何方法和组合物还可以包括施用治疗肿瘤抗原相关疾病的额外治疗药。在一个实施方案中，额外的治疗药是抗癌治疗剂。
在另一个方面，本发明提供核酸，所述核酸编码前述任一方面和实施方案(例如，如本文所述)的第一CAR和第二CAR。在实施方案中，所述第一CAR和所述第二CAR的序列由独立的核糖体进入位点、启动子元件或编码T2A、P2A、E2A或F2A元件的序列分隔。
在另一个方面，本发明提供载体，所述载体包含前述方面和实施方案(例如，如本文所述)的核酸。在实施方案中，载体是慢病毒载体。
在另一个方面，本发明提供一种包含第一核酸和第二核酸的组合物，所述第一核酸编码前述任一方面和实施方案的第一CAR(例如，(例如，如本文所述的)包含针对B细胞抗原结合结构域的CAR)，所述第二核酸编码前述任一方面和实施方案的第二CAR(例如，(例如，如本文所述的)包含针对肿瘤抗原结合结构域的CAR)。在实施方案中，第一和第二核酸包含于独立的载体内部。在实施方案中，载体是慢病毒载体。
在另一个方面，本发明提供一种产生前述任一方面和实施方案的细胞(例如，如本文所述的细胞)的方法，所述方法包括向所述细胞引入先前任一核酸方面和实施方案(例如，如本文所述)的核酸、先前任一载体方面和实施方案(例如，如本文所述)的载体或先前任一组合物方面和实施方案(例如，如本文所述)的组合物。
在另一个方面，本发明提供一种产生先前任一方面和实施方案的细胞的方法，所述方法包括向所述细胞引入第一载体，所述第一载体包含编码前述任一方面和实施方案(例如，如本文所述)的第一CAR的核酸，和向所述细胞引入第二载体，所述第二载体包含编码前述任一方面和实施方案(例如，如本文所述)的第二CAR的核酸。在实施方案中，所述第一载体和所述第二载体的引入是同时的。在实施方案中，所述第一载体和所述第二载体的引入是依次的。
在另一个方面，本发明提供包含核酸的细胞，所述核酸编码前述任一方面和实施方案(例如，如本文所述)的第一CAR和前述任一方面和实施方案(例如，如本文所述)的第二CAR。
在另一个方面，本发明提供本文所述的细胞用作药物，例如，表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原的CAR和表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原之外肿瘤抗原的CAR的细胞用作药物。在另一个方面，本发明提供本文所述的细胞，例如，表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原的CAR和表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原之外肿瘤抗原的CAR的细胞，用作治疗与表达B细胞抗原之外的肿瘤抗原相关的疾病的药物。在另一个方面，本发明提供本文所述的细胞，例如，表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原的CAR和表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原之外肿瘤抗原的CAR的细胞，用作治疗癌症(例如表达B细胞抗原之外的肿瘤抗原的癌症)的药物。在另一个方面，本发明提供本文所述的细胞，例如，表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原的CAR和表达(例如，本文所述的)结合B细胞抗原之外肿瘤抗原的CAR的细胞；本文所述的核酸；或本文所述的组合物；用于生产药物。
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管，类似于或等同于下述方法和材料也可用于本发明的实施和检测，但在此描述了适合的方法与材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，所述材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。标题、副标题或编号或字母编号的要素，例如，(a)、(b)、(i)等，仅为了易于阅读而展示。使用本文件中的标题或编号或字母编号的要素不要求步骤或要素按字母顺序进行并且该步骤或要素必然地彼此独立。本发明的其他特征、目的和优点将从本描述及附图并且从权利要求书中显而易见。
附图简述
图1显示用于双顺反子表达B细胞抗原CAR和实体瘤抗原CAR的核酸构建体的简图。上部构建体编码由P2A蛋白酶剪切位点分隔的CD19CAR(B细胞抗原CAR)和EGFRvIII CAR(实体瘤CAR)。下部构建体编码由P2A蛋白酶剪切位点分隔的CD19 CAR(B细胞抗原CAR)和间皮素CAR(实体瘤CAR)。
图2显示用于表达B细胞抗原CAR和实体瘤抗原CAR的一组核酸构建体的简图。第一构建体编码CD19 CAR(B细胞抗原CAR)并且第二构建体编码EGFRvIII CAR(实体瘤CAR)。构建体可以在独立的载体(例如，独立的慢病毒载体)中提供。细胞用该组构建体转染以表达B细胞抗原CAR和实体瘤抗原CAR两者。
发明详述
使用免疫效应细胞(例如，T细胞)在受试者中治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病(例如，癌症)的方法和组合物，所述免疫效应细胞经工程化以表达第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原结合并且所述第二CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原之外的肿瘤抗原结合，例如，旨在增强表达CAR的免疫效应细胞疗法的功效(例如，患者中表达CAR的免疫效应细胞的持久性和/或增殖)。不希望受理论约束，例如，如与施用仅表达靶向肿瘤的CAR(例如，不表达靶向B细胞抗原的CAR)的免疫效应细胞相比，用表达靶向B细胞抗原的CAR和靶向肿瘤抗原的CAR的免疫效应细胞治疗例如，通过以下一种或多种方式，增强受试者中表达CAR的免疫效应细胞的抗肿瘤功效：增加所述表达CAR的免疫效应细胞的增殖和/或增加所述表达CAR的免疫效应细胞的体内持久性。
定义
除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明相关领域的技术人员通常理解的相同意义。
术语“一个(a)”和“一种(an)”指该冠词的一个或多于一个(即，指至少一个)的语法对象。例如，“一个要素”意指一个要素或多于一个要素。
当指可度量值如数量、时间持续期等时，术语“约”意在涵盖距指定值±20％的变动或在一些情况下±10％的变动或在一些情况下±5％的变动或在一些情况下±1％的变动或在一些情况下±0.1％的变动，因为这类变动适于开展所公开的方法。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”指包含至少胞外抗原结合结构域、跨膜结构域；和胞质信号传导结构域(本文也称作“胞内信号传导结构域”)的重组多肽构建体，所述胞质信号传导结构域包含从如下文定义的刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域处在相同的多肽链中(例如，包含嵌合融合蛋白)。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中，如在如本文所述的RCAR中提供。
在一个方面，刺激性分子是与T细胞受体复合物缔合的ζ链。在一个方面，细胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一个方面，胞质信号传导结构域还包含从至少一种如下文定义的共刺激分子衍生的一个或多个功能性信号传导结构域。在一个方面，共刺激分子选自4 1BB(即CD137)，CD27，ICOS和/或CD28。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含从共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR包含嵌合融合蛋白，所述嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含至少两个从一种或多种共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域和从刺激性分子衍生的功能性信号传导结构域。在一个方面，CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N-ter)包含任选的前导序列。在一个方面，CAR还包含在胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原结合结构域(例如，scFv)切下。
包含靶向(例如结合至)特定肿瘤抗原X(例如本文所述的那些)的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR也称作XCAR、X-CAR或靶向X的CAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR称作CD19CAR。包含靶向(例如本文所述的那些)特定肿瘤抗原(TA)的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)的CAR也称作TA CAR。包含靶向特定B细胞抗原(BCA)的抗原结合结构域(例如，scFv或TCR)(如本文所述的那些)(例如与本发明组合物的第一CAR分子连接)的CAR也称作BCA CAR。
术语“信号传导结构域”指蛋白质的功能性部分，所述的功能性部分通过在细胞内部传输信息而发挥以下作用：通过产生第二信使或通过响应于这类信使作为效应子发挥功能，借助限定的信号传导途径调节细胞活性。在一些方面，本文所述的CAR的信号传导结构域衍生自本文所述的刺激性分子或共刺激分子，或是合成或工程化的信号传导结构域。
如本文所用，术语“抗体”指与抗原特异性结合的蛋白质或衍生自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子中的多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆、多链或单链或完整的免疫球蛋白并且可以衍生自天然来源或衍生自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。
术语“抗体片段”指完整抗体的至少一个部分或其重组变体，并且指足以引起抗体片段对靶(如抗原)的识别和特异性结合的抗原结合结构域，例如，完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(或者VL或VH)、驼类(camelid)VHH结构域、从抗体片段形成的多特异性抗体如包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段，和抗体的分离的CDR或其他表位结合片段。也可以将抗原结合片段并入单结构域抗体、大抗体(maxibody)、微型抗体、纳米体、胞内抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、v-NAR和双-scFv(参见，例如，Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology,23:1126-1136,2005)。也可以将抗原结合片段移植至基于多肽的支架如纤连蛋白III型(Fn3)(参见美国专利号6,703,199，其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链可变区的抗体片段和至少一个包括重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是经由短的柔性多肽接头邻接的，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如本文所用，scFv可以具有按任何顺序(例如，相对于多肽的N末端和C末端)的VL可变区和VH可变区，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”指在抗体可变区内部赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。例如，通常，在每个重链可变区中存在三种CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)并且在每个轻链可变区中存在三种CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。可以使用多种熟知方案的任一者确定给定CDR的精确氨基酸序列界限，所述熟知方案包括由Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)描述的那些或其组合。根据Kabat编号方案，在一些实施方案中，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将在轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia编号方案，在一些实施方案中，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将VL中的CDR氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。在合并的Kabat和Chothia编号方案中，在一些实施方案中，CDR对应于作为Kaba)CDR、Chothia CDR或二者之部分的氨基酸残基。例如，在一些实施方案中，CDR对应于VH(例如，哺乳动物VH，例如，人VH)中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)以及VL(例如，哺乳动物VL，例如，人VL)中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。
包含抗体或其抗体片段的本发明CAR的部分可以按多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为邻接多肽链的部分，例如包括scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(或者VL或VH)、驼类VHH结构域、人源化抗体、双特异性抗体、抗体缀合物(Harlow等人,1999,引自：Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY；Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science 242:423-426)。在一个方面，本发明CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在又一个方面，CAR包含了包括scFv的抗体片段。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”(本文也称作“抗靶(例如，CD19)结合结构域”)指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多个免疫球蛋白可变结构域序列的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第一表位的结合特异性并且多个免疫球蛋白可变结构域序列的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有针对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。
术语“抗体重链”指以天然构象存在的抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较大者，其在正常情况下决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”指以天然构象存在的抗体分子中存在的两种类型多肽链中的较小者。κ(κ)轻链和λ(λ)轻链指两个主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”指使用重组DNA技术生成的抗体，例如，通过噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。本术语应当还解释为意指已经通过合成编码抗体并且表达抗体蛋白的DNA分子或合成规定抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中已经使用本领域可获得的和熟知的重组DNA或氨基酸序列技术获得DNA或氨基酸序列。
术语“抗原”或“Ag”指激发免疫应答的分子。这种免疫应答可以涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞的活化、或这两者。技术人员将会理解，任何大分子(实际上包括全部蛋白质或肽)可以充当抗原。另外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将会理解，包含编码蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用术语那样的“抗原”，其中所述蛋白质激发免疫应答。另外，本领域技术人员将会理解，抗原不必完全由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本公开包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列并且这些核苷酸序列按多种组合布置以编码激发所需免疫应答的多肽。另外，技术人员将会理解，抗原完全不必要由“基因”编码。很明显，抗原可以生成或可以衍生自生物样品、或可能是除多肽之外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于具有其他生物学组分的组织样品、肿瘤样品、细胞或流体。
术语“抗肿瘤作用”或“抗肿瘤活性”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于，例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、转移灶数目减少、预期寿命增加、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少或与癌状况相关的多种生理症状改善。“抗肿瘤作用”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体防止肿瘤在首发位置出现的能力展示。
术语“自体的”指这样的任何物质，所述物质从稍后将向个体再次引入所述物质的相同个体衍生。
术语“同种异型的”指这样的任何物质，所述物质从与引入所述物质的个体相同的物种的不同动物衍生。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两位或更多位个体据称彼此是同种异型的。在一些方面，来自相同物种的个体的同种异型物质可以在遗传上明显地不相似以发生抗原性相互作用。
术语“异种的”指从不同物种的动物衍生的移植体。
如本文所用的术语“单采血液成分术(apheresis)”指这样的体外方法，其中供体或患者的血液通过该方法从供体或患者中移出并通过分离出选择的特定成分的装置并将其余部分，例如通过再输血返回供体或患者的循环。因此，在“单采血液成分术样品”的上下文中，是指使用单采血液成分术获得的样品。
术语“癌症”指异常细胞失控生长为特征的疾病。癌包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而无论组织病理学类型或侵袭力阶段。癌细胞可以局部地或通过血流和淋巴系统扩散到身体其他部分。本文中描述了各种癌症的例子并且它们包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
“衍生自”如该术语在本文中所用那样，表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常指第一分子和第二分子之间的结构相似性并且不暗示或不包括对衍生自第二分子的第一分子的过程限制或来源限制。例如，在衍生自CD3ζ分子的胞内信号传导结构域的情况下，胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，从而具有需要的功能，即，适宜条件下产生信号的能力。它不暗示或不包括对产生胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它不意指，为了提供胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列出发并且删除不想要的序列，或加以突变，以获得胞内信号传导结构域。
短语“与表达肿瘤抗原相关的疾病”包括但不限于与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的疾病或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的病状，例如，包括增生性疾病如癌症或恶性肿瘤或癌前期病状如脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达如本文所述的肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一个方面，与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的癌是血液癌。在一个方面，与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的癌是实体癌。与本文所述的肿瘤抗原表达相关的其他疾病例如包括但不限于与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前期病状或增生性疾病。与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病、(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。
术语“保守序列修饰”指未显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这类种保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体或抗体片段引入修饰。保守性氨基酸置换是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因而，可以将本发明CAR内部的一个或多个氨基酸残基替换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的CAR。
术语“刺激”指由刺激性分子(例如，TCR/CD3复合物或CAR)与其同族配体(或在CAR的情况下肿瘤抗原)的结合所诱导的初次应答，所述初次应答因而介导信号转导事件，如，但不限于借助TCR/CD3复合物的信号转导或借助适宜NK受体或CAR的信号传导结构域的信号转导。刺激可以介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
术语“刺激性分子”指由免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的提供胞质信号传导序列的分子，所述胞质信号传导序列相对于免疫效应细胞信号传导途径(例如，T细胞信号传导途径)的至少一些方面以刺激性方式调节免疫效应细胞的活化。在一个方面，信号是初级信号，所述初级信号例如通过TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合引发并且导致T细胞反应的调节，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激性方式发挥作用的初级胞质信号传导序列(也称作“初级信号传导结构域”)可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称作“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12、和CD66d的那些。在本发明的具体CAR中，本发明的任一种或多种CAR中的胞内信号传导结构域包含胞内信号传导序列，例如，CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是作为SEQ ID NO:18提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在本发明的具体CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是在SEQ IDNO:20中提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”指在其表面上展示与主要组织相容性复合体(MHC)复合的外来抗原的免疫系统细胞如辅助细胞(例如，B细胞、树突细胞等)。T细胞可以使用其T细胞受体(TCR)识别这些复合物。APC加工抗原并将它们呈递至T细胞。
如本文中所用那样，术语“胞内信号传导结构域”指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域产生信号，所述信号促进表达CAR的细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的免疫效应子功能。例如，在CART细胞或表达CAR的NK细胞中，免疫效应子功能的例子包括溶细胞活性和辅助活性，包括分泌细胞因子。尽管可以使用完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用完整链。可以以这样的程度使用胞内信号传导结构域的截短部分，从而可以使用这种截短的部分替代完整链，只要它传导效应子功能信号即可。术语“胞内信号传导结构域”因此意在包括胞内信号传导结构域的足以传导效应子功能信号的任何截短部分
在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括从负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子衍生的那些。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域可以包含共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括从共刺激信号或抗原非依赖性刺激衍生的那些。在一个实施方案中，将胞内信号传导结构域合成或工程化。例如，在表达CAR的免疫效应细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包含T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包含来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包含称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括但不限于衍生自CD3ζ、共同FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FcεRI CD66d、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或备选地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”定义为作为GenBan登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基，并且“ζ刺激性结构域”或备选地“CD3-ζ刺激性结构域”或“TCR-ζ刺激性结构域”定义为来自δ链胞质结构域的氨基酸残基，所述氨基酸残基足以在功能上传播T细胞活化必需的初始信号。在一个方面，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至残基164或作为其功能直向同源物的来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3-ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:18提供的序列。在一个方面，“ζ刺激性结构域”或“CD3-ζ刺激性结构域”是作为SEQ ID NO:20提供的序列。本文中还涵盖相对于本文所述的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:20)包含一个或多个突变的CD3ζ结构域。
术语“共刺激分子”指T细胞上与共刺激配体特异性结合，因而由T细胞介导共刺激反应(如但不限于增殖)的同族结合配偶体。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子包括但不限于I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
共刺激胞内信号传导结构域或共刺激信号传导结构域可以是共刺激分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包含从中衍生它的分子的完整胞内部分或完整天然胞内信号传导结构域或其功能性片段。
术语“4-1BB”指TNFR超家族成员，所述成员具有作为GenBank登录号AAA62478.2提供的氨基酸序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基；并且“4-1BB共刺激结构域”定义为GenBank登录号AAA62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。在一个方面，“4-1BB共刺激结构域”是作为SEQID NO:14提供的序列或来自非人类物种(例如，小鼠、啮齿类、猴、猿等)的等同残基。
如该术语在本文中所用那样，术语“免疫效应细胞”指涉及免疫应答，例如涉及促进免疫效应子反应的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如，α/β的T细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓源性吞噬细胞。
如该术语在本文中所用那样，“免疫效应子功能或免疫效应子反应”指例如免疫效应细胞的增强或促进免疫攻击靶细胞的功能或应答。例如，免疫效应子功能或应答指促进杀伤靶细胞或抑制靶细胞生长或增殖的T细胞或NK细胞特性。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应子功能或应答的例子。
术语“效应子功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。
术语“编码”指多核苷酸如基因、cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物学过程中充当合成具有限定核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的内在特性和因其产生的生物学特性。因此，如果与该基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码该蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和作为基因或cDNA转录的模板使用的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
除非另外说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此作为简并形式并编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的“核苷酸序列”还可以包括内含子到这样的程度，从而编码蛋白质的核苷酸序列可以在某个形式中含有内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中互换地使用并且指化合物、制剂、材料或组合物如本文所述那样有效实现特定生物学结果的量。
术语“内源”指来自生物、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
术语“外源”指从生物、细胞、组织或系统外部引入或在其外部产生的任何物质。
术语“表达”指受其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
术语“转移载体”指物质组合物，所述物质组合物包含分离的核酸并且可以用来向细胞的内部递送分离的核酸。众多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合结合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制型质粒或病毒。该术语还应当解释成进一步包括促进核酸转移入细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的例子包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”指一种包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。表达载体包含用于表达的足够顺式作用元件；其他表达用元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的全部那些表达载体，包括并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露或含于脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”指逆转录病毒科(Retroviridae)的一个属。慢病毒在逆转录病毒当中的独特之处在于能够感染非分裂性细胞；它们可以递送显著量的遗传信息至宿主细胞的DNA，从而它们是基因递送载体的最高效方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。
术语“慢病毒载体”指从慢病毒基因组的至少一部分衍生的载体，特别包括如Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)中提供的自我失活性慢病毒载体。可以在临床使用的慢病毒载体的其他例子例如包括但不限于来自Oxford BioMedica的基因递送技术、来自Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可获得的并且将是本领域技术人员已知。
术语“同源的”或“同一性”指两个聚合物分子之间(例如，在两个核酸分子(如，两个DNA分子或两个RNA分子之间)或在两个多肽分子之间)的次级单位序列同一性。当这两个分子中的次级单位位置被相同单体性次级单位占据时，例如，若两个DNA分子中每个分子中的某位置被腺嘌呤占据，则它们在该位置是同源或相同的。两个序列之间的同一性直接随匹配位置或同源位置的数目而变化，例如，如果两个序列中一半位置(例如长度为十个次级单位的聚合物中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个位置中9个位置)是匹配或同源的，则这两个序列是90％同源的。
非人类(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式是含有从非人免疫球蛋白衍生的最少序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其抗体片段(如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其他抗原结合子序列)。对大部分情况而言，人源化抗体及其抗体片段是这些人免疫球蛋白(受体抗体或抗体片段)，其中来自所述受体的互补决定区(CDR)中的残基替换为来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR中的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体/抗体片段可以包含既不在受体抗体中又不在输入的CDR或框架序列中存在的残基。这些修饰可以进一步修正和优化抗体或抗体片段性能。通常，人源化抗体或其抗体片段将基本上包含至少一个、并且一般二个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部的CDR区与非人类免疫球蛋白的那些CDR区对应并且全部或显著部分的FR区是具有人免疫球蛋白序列的那些FR区。人源化抗体或抗体片段还可以包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于其他细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。
“全人”指免疫球蛋白，如抗体或抗体片段，其中整个分子是人源的或由与抗体或免疫球蛋白的人类形式相同的氨基酸序列组成。
术语“分离的”意指从天然状态改变或取出。例如，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质分离的部分或完全的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以按基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境(例如宿主细胞)中。
在本公开的背景下，对常见出现的核酸碱基使用以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。
术语“有效连接”或“转录性控制”指调节序列和异源核酸序列之间导致异源核酸序列表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列有效连接。例如，如果启动子影响编码性序列的转录或表达，则启动子与编码序列有效连接。有效连接的DNA序列可以彼此邻接并且，例如，在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，处于相同的可读框中。
术语免疫原性组合物的“肠胃外”施用例如包括皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)或胸骨内注射、瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链形式或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且按照与天然存在核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，特定核酸序列也内在包括其保守方式修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，可以通过产生其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置用混合型碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列，实现简并密码子置换(Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081,(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608,(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes8:91-98,(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”互换使用并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸并且不限制可以构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，本术语指短链并且还指较长链，例如，所述短链还常见地在本领域称为肽、寡肽和寡聚体，所述较长链通常在本领域称为蛋白质，所述蛋白质存在许多类型。“多肽”例如包括多肽的生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”指由细胞合成装置或引入的合成装置识别、为多核苷酸序列特异性转录所需要的DNA序列。
术语“启动子/调节序列”指表达与启动子/调节序列有效连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，这个序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，这个序列还可以包含表达基因产物需要的增强子序列和其他调节元件。启动子/调节序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的那种。
术语“组成型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中在细胞的大部分或全部生理条件下产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子指与编码或规定基因产物的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上仅当细胞中存在对应于该启动子的诱导物时才产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子指与基因编码或规定的多核苷酸有效连接时，引起基因产物在细胞中基本上只有细胞是与该启动子相对应的组织型的细胞时才产生的核苷酸序列。
术语“B细胞抗原”或“B-细胞抗原”互换使用并且指这样的分子(一般是蛋白质、糖或脂质)，它们可以用与之结合的药物靶向，在B细胞的表面上偏好性和特异性表达。与哺乳动物的其他非B细胞组织，特定意义的B细胞抗原偏好表达在B细胞上。B细胞抗原可以表达在一个特定B细胞群体上，例如，表达在B细胞前体或成熟B细胞上，或表达在多于一个特定B细胞群体上，例如，表达在前体B细胞和成熟B细胞二者上。示例性B细胞表面标志物包括：CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、5、7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。特别优选的B细胞抗原包括CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138。在实施方案中，B细胞抗原是CD19。在实施方案中，B细胞抗原是CD20。在实施方案中，B细胞抗原是CD22。在实施方案中，B细胞抗原是BCMA。在实施方案中，B细胞抗原是FcRn5。在实施方案中，B细胞抗原是FcRn2。在实施方案中，B细胞抗原是CS-1。在实施方案中，B细胞抗原是CD138。
术语“癌相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指在癌细胞表面上完整或作为片段(例如，MHC/肽)表达并且可用于偏好性导引药理学物质至癌细胞的分子(一般是蛋白质、糖或脂质)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是正常细胞和癌细胞二者表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是这样的细胞表面分子，所述细胞表面分子与正常细胞相比，在癌细胞中过量表达，例如，与正常细胞相比，1倍过量表达、2倍过量表达，3倍或更多倍过量表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原是这样的细胞表面分子，所述细胞表面分子在癌细胞中不适宜地合成，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将排他地在癌细胞表面上完整或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且在正常细胞的表面上不合成或不表达。在一些实施方案中，本公开的CAR包括了包含与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，衍生自内源蛋白的肽填满主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的袋，并且由CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合体由全部有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合体代表用于免疫疗法的独特类别的细胞表面靶。已经描述了人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2背景下靶向从病毒或肿瘤抗原衍生的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.201185(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 20018(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，可以通过筛选文库，如人scFv噬菌体展示文库，鉴定TCR样抗体。因此，本公开提供包含抗原结合结构域的CAR，所述抗原结合结构域与选自WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1和RAGE-1的分子的MHC呈递肽结合。
术语“实体瘤抗原”或“实体瘤细胞抗原”指这样的分子(一般蛋白质、糖或脂质)，它们在可以用与之结合的药剂靶向的实体瘤细胞的表面上偏好性和特异性表达。与哺乳动物的其他非肿瘤组织相比，特定意义的实体瘤抗原偏好表达在实体瘤细胞上。实体瘤抗原可以表达在一个特定实体瘤细胞群体上，例如，表达在间皮瘤肿瘤细胞上，或表达在多于一个特定实体瘤细胞群体上，例如，表达在间皮瘤肿瘤细胞和卵巢癌细胞二者上。示例性实体瘤抗原包括：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的肽。特别优选实体瘤抗原包括：CLDN6、间皮素和EGFRvIII。
术语“髓系肿瘤抗原”或“髓系肿瘤细胞抗原”指这样的分子(一般蛋白质、糖或脂质)，它们在可以用与之结合的药剂靶向的髓系肿瘤细胞的表面上偏好性和特异性表达。与哺乳动物的其他非肿瘤组织相比，特定意义的髓系肿瘤抗原偏好表达在髓系肿瘤细胞上。髓系肿瘤抗原可以表达在一个特定髓系肿瘤细胞群体上，例如，表达在急性髓样白血病(AML)肿瘤细胞上，或表达在多于一个髓系肿瘤细胞群体上。示例性髓系肿瘤抗原包括：CD123、CD33和CLL-1。
术语“非B细胞谱系血液肿瘤的抗原”指这样的分子(一般蛋白质、糖或脂质)，它们在除B细胞来源之外的造血组织来源或淋巴组织来源的肿瘤或癌的表面上偏好性和特异性表达。这些包括髓系来源的肿瘤，例如，衍生自粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和/或肥大细胞来源或其任何前体细胞群体的肿瘤，和除B细胞来源之外的淋巴样来源(例如，T细胞、NK细胞和/或浆细胞来源)或其任何前体细胞群体的肿瘤。
如scFv的背景下所用的术语“柔性多肽接头”或“接头”指由氨基酸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其中单独或组合使用所述肽接头以将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头并且包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。例如，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5和n＝6，n＝7，n＝8，n＝9并且n＝10(SEQ ID NO:28)。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复序列(SEQ ID NO:31)。本发明的范围内还包括接头，其在通过引用方式并入本文的WO 2012/138475中描述。
如本文所用，5'帽(还称作RNA帽、RNA 7-甲基鸟苷帽或RNA m7G帽)是已经紧接在转录起点后添加至真核信使RNA“前端”或5'末端的修饰的鸟嘌呤核苷酸。5'帽由与第一个转录的核苷酸连接的端基组成。其存在对核糖体识别并保护免遭RNA酶作用至关重要。帽添加与转录偶联并且以共转录方式出现，从而每者影响另一者。在转录起始后不久，正在合成的mRNA的5'末端被结合于RNA聚合酶的帽合成复合物约束。这种酶促复合物催化mRNA加帽需要的化学反应。合成过程作为多步骤生物化学反应推进。可以修饰加帽部分以调节mRNA的功能，如其稳定性或翻译效率。
如本文所用，“体外转录的RNA”指已经在体外合成的RNA，优选地mRNA。通常，体外转录的RNA从体外转录载体产生。体外转录载体包括用来产生体外转录的RNA的模板。
如本文所用，“聚腺苷酸”是通过多聚腺苷化与mRNA连接的一系列腺苷。在瞬时表达构建体的优选实施方案中，聚腺苷酸数在50和5000之间(SEQ ID NO:34)、优选地大于64、更优选地大于100、最优选地大于300或400。可以化学或酶促地修饰聚腺苷酸序列以调节mRNA功能如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“多聚腺苷化”指聚腺苷酰基部分或其修饰变体与信使RNA分子的共价连接。在真核生物中，大部分信使RNA(mRNA)分子在3'末端聚腺苷酸化。3'聚腺苷酸尾是通过酶(聚腺苷酸聚合酶)的作用添加至前mRNA的长腺嘌呤核苷酸序列(经常几百个)。在高等真核生物中，聚腺苷酸尾添加到含有特定序列(多聚腺苷化信号)的转录物上。聚腺苷酸尾和与之结合的蛋白质协助保护mRNA免遭核酸外切酶降解。多聚腺苷化还对转录终止、mRNA从胞核输出和翻译重要。多聚腺苷化在DNA转录成RNA后立即在胞核中发生，但额外地还可以稍后在细胞质中发生。在转录已经终止后，mRNA链因与RNA聚合酶结合的核酸内切酶复合体的作用而切割。切割位点通常以切割位点附近存在碱基序列AAUAAA为特征。在已经切割mRNA后，腺苷残基被添加至切割位点处的游离3’末端。
如本文所用，“瞬时”指非整合的转基因表达数小时、数天或数周时间，其中表达时间段小于如果基因在宿主细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制子内部时该基因表达的时间段。
如本文所用，术语“治疗”、“疗法”和“治疗着”指因施用一种或多种疗法(例如，一种或多种治疗药如本发明的CAR)而减少或改善增殖性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增殖性病症一个或多个症状(优选地，一个或多个可察觉症状)。在具体实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指改善增殖性病症的并不必然由患者可察觉的至少一个可度量身体参数，如肿瘤生长。在其他实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指在身体上(例如，通过稳定可察觉症状)、生理上(例如，通过稳定身体参数)或这两方抑制增殖性病症的进展。在其他实施方案中，“治疗”、“疗法”和“治疗着”指肿瘤尺寸或癌细胞计数减少或稳定。
术语“信号转导途径”指在从细胞一个部分传播信号至细胞的另一个部分中发挥作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号和跨细胞膜传输信号的分子和分子复合物。
术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物、人)。
术语“基本上纯化的”细胞指基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其天然存在状态下通常与之结合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群体指均一的细胞群体。在其他情况下，这个术语单纯地指已经与其天然状态下天然与之结合的细胞分离的细胞。在一些方面，细胞在体外培养。在其他方面，细胞未在体外培养。
如本文所用的术语“治疗性”意指治疗。治疗作用通过减少、抑制、缓解或根除疾病状态而获得。
如本文所用的术语“耐受性”或“免疫耐受性”指这样的状态，其中受试者对正常情况下受试者与其响应的特定抗原或抗原组具有减少的免疫应答或不存在免疫应答。耐受在抑制免疫反应的条件下实现并且不仅仅是缺少免疫应答。在一个实施方案中，受试者中的耐受性可以用以下一项或多项表征：如与未治疗的受试者相比，(例如，由抗原特异性效应子T淋巴细胞、B淋巴细胞或抗体介导的)特异免疫应答水平降低；特异性免疫应答启动或进展延迟；或特异性免疫应答启动或进展的风险降低。
如本文所用的术语“预防”意指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
术语“转染”或“转化”或“转导”指借以将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和其后代。
术语“特异性结合”是指识别并结合样品中存在的同源结合配偶体蛋白(例如，T细胞上存在的刺激性和/或共刺激分子)的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
如本文所用，术语“可调节性嵌合抗原受体(RCAR)”指一组多肽，最简单的实施方案中一般指两种多肽，其中在免疫效应细胞中时，所述多肽为细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性及提供可调节性胞内信号生成。在一些实施方案中，RCAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称作“胞内信号传导结构域”)，所述胞质信号传导结构域包含从如本文在CAR分子背景下定义的刺激性分子和/或共刺激分子衍生的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，RCAR中的该组多肽彼此不邻接，例如，处于不同的多肽链中。在一些实施方案中，RCAR包含二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。在一些实施方案中，RCAR在如本文所述的细胞(例如，免疫效应细胞)(例如，表达RCAR的细胞(本文也称作“RCARX细胞”))中表达。在一个实施方案中，RCARX细胞是T细胞并且称作RCART细胞。在一个实施方案中，RCARX细胞是NK细胞并且称作RCARN细胞。RCAR可以向表达RCAR的细胞提供针对靶细胞(一般是癌细胞)的特异性，并提供可调节性胞内信号生成或增殖，所述多肽可以优化表达RCAR的细胞的免疫效应子特性。在实施方案中，RCAR细胞至少部分地依赖抗原结合结构域以提供针对靶细胞的特异性，所述靶细胞包含抗原结合结构域结合的抗原。
如该术语在本文中所用那样，“膜锚定物”或“膜束缚结构域”指足以锚定胞外或胞内结构域至质膜的多肽或部分，例如，肉豆蔻酰基。
如该术语在本文中所用那样，例如指RCAR时，“开关结构域”指存在二聚化分子时与另一个开关结构域缔合的实体，一般是基于多肽的实体。缔合导致与第一开关结构域连接(例如，融合)的第一实体和与第二开关结构域连接(例如，融合)的第二实体功能性偶联。第一开关结构域和第二开关结构域统称为二聚化开关。在实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此相同，例如，它们是具有相同一级氨基酸序列的多肽并统称为同型二聚化开关。在实施方案中，第一开关结构域和第二开关结构域彼此不同，例如，它们是具有不同一级氨基酸序列的多肽并统称为异二聚化开关。在实施方案中，开关是胞内的。在实施方案中，开关是胞外的。在实施方案中，开关结构域是基于多肽(例如，基于FKBP或FRB)的实体，并且二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素类似物(rapalogue)。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如，结合myc肽的scFv，并且二聚化分子是多肽、其片段、或多肽多聚体，例如，myc配体或与一个或多个myc scFv结合的myc配体多聚体。在实施方案中，开关结构域是基于多肽的实体，例如，myc受体，并且二聚化分子是抗体或其片段，例如，myc抗体。
如该术语在本文中所用那样，例如指RCAR时，“二聚化分子”指促进第一开关结构域与第二开关结构域缔合的实体。在实施方案中，二聚化分子不天然地出现在受试者中或不以将导致明显二聚化的浓度出现。在实施方案中，二聚化分子是小分子，例如，雷帕霉素或雷帕霉素类似物，例如RAD001。
术语“生物等效的”指除参比化合物(例如，RAD001)之外的物质的量，所述量是产生与参比剂量或参比量的参比化合物(例如，RAD001)所产生的效果等同的效果所需要的。在一个实施方案中，效果是mTOR抑制水平，例如，如通过P70S6激酶抑制作用所测量，例如，如在体内或体外测定法中评价，例如，如通过本文所述的测定法(例如，Boulay测定法)所测量、或通过蛋白质印迹法测量磷酸化S6水平。在一个实施方案中，效果是PD-1阳性/PD-1阴性T细胞的比率改变，如通过细胞分选法所测量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的P70S6激酶抑制水平的量或剂量。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的生物等效量或剂量是实现与参比剂量或参比量的参比化合物相同的PD-1阳性/PD-1阴性T细胞比率改变水平的量或剂量。
联系mTOR抑制剂(例如，变构性mTOR抑制剂，例如，RAD001或雷帕霉素、或催化性mTOR抑制剂)使用时，术语“免疫增强性低剂量”指(例如，如通过抑制P70S6激酶活性所测量)部分地但非完全抑制mTOR活性的mTOR抑制剂剂量。本文中讨论了用于(例如，通过抑制P70S6激酶)评价mTOR活性的方法。该剂量不足以导致完全的免疫抑制，但是足以增强免疫应答。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致PD-1阳性T细胞的数目下降和/或PD-1阴性T细胞的数目增加、或PD-1阴性T细胞/PD-1阳性T细胞的比率增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致原初T细胞的数目增加。在一个实施方案中，mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量导致以下一种或多种情况：
以下一种或多种标记物的表达增加：例如，在记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上的CD62Lhigh、CD127high、CD27+和BCL2；
记忆T细胞(例如，记忆T细胞前体)上KLRG1的表达减少；和
记忆T细胞前体的数目增加，所述记忆T细胞前体例如是具有以下特征的任一个或其组合的细胞：CD62Lhigh增加、CD127high增加、CD27+增加、KLRG1减少和BCL2增加；
其中例如，如与未处理的受试者相比，上文描述的任何变化出现，例如，至少暂时出现。
如本文所用的“难治性”，指不响应于治疗的疾病，例如，癌症。在实施方案中，难治性癌症可以在治疗开始前或在治疗开始时抵抗治疗。在其他实施方案中，难治性癌症可以在治疗期间变得耐药。难治性癌症也称作耐药性癌症。
如本文所用的“复发的”或“复发”指在改善或反应性阶段后(例如，在某疗法(例如，癌疗法)既往治疗后)后，疾病(例如，癌症)或疾病(例如，癌症)体征和症状返回或复现。反应性初始阶段可以涉及癌细胞水平降到某个阈值以下，例如，低于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。再出现可以涉及癌细胞水平升高到某个阈值以上，例如，高于20％、1％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。例如，在B-ALL的上下文中，再次出现可能涉及例如在完全应答之后在血液，骨髓(>5％)或任何髓外部位中胚细胞的再次出现。在这种情况下，完全的应答可能涉及<5％的BM胚细胞。更一般地，在一个实施方案中，应答(例如完全应答或部分应答)可以涉及不存在可检测的MRD(最小残留疾病)。在一个实施方案中，反应性的初始阶段持续至少1、2、3、4、5或6天；至少1、2、3或4周；至少1、2、3、4、6、8、10或12个月；或至少1、2、3、4或5年。
范围：在本公开各处，本发明的多个方面可以按范围样式展示。应当理解，以范围样式描述仅出于方便和简洁目的并且不应当解释为刚性限制本发明的范围。因此，范围的描述应当视为具有具体公开的全部可能子范围以及该范围内部的各个数值。例如，范围如从1至6的描述应当视为具有具体公开的如下子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内部的各个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一个例子，范围(如95-99％同一性)包括具有95％、96％、97％、98％或99％同一性的范围，并且包括子范围如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％和98-99％同一性。无论范围的宽度多大，这均适用。
发明详述
本文中提供了治疗疾病(如癌症)的组合物和使用方法，包括使用经工程化以表达靶向B细胞抗原的第一CAR分子(例如，BCA CAR)和靶向肿瘤抗原的第二CAR分子(例如，TACAR)的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，NK细胞或T细胞)。在一个实施方案中，疾病是癌症，如实体瘤、髓系肿瘤或非B细胞谱系血液肿瘤。在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤是髓系肿瘤。在一个实施方案中，肿瘤是非B细胞谱系血液肿瘤。
在实施方案中，本文所述的组合物和方法产生靶向肿瘤的表达CAR的免疫效应细胞，相对于不表达BCA CAR的相同细胞，所述免疫效应细胞具有增强的增殖和/或具有增加或延长的体内持久性。
不希望受理论约束，例如，如与施用仅表达TA CAR(例如，不表达BCA CAR)的免疫效应细胞相比，用细胞(例如，表达靶向B细胞抗原的CAR(BCA CAR)连同表达靶向肿瘤抗原的CAR(TA CAR)的免疫效应细胞)治疗例如通过以下一种或多种方式，增强受试者中表达TACAR的免疫效应细胞的抗肿瘤功效：增加所述表达CAR的免疫效应细胞的增殖和/或增加所述表达CAR的免疫效应细胞的体内持久性。不受理论约束，靶向例如实体瘤的CAR细胞疗法可以遭受缺少体内持久性困扰，因为表达CAR所靶向的肿瘤抗原的细胞变得不可接近，或数目减少，原因在于表达CAR的细胞的影响。与之相反，靶向B细胞抗原(如，例如，CD19)的CAR-T细胞疗法显示出快速和明显的体内扩充，随后是长期持久性。不受理论约束，对靶向B细胞抗原的CAR-T细胞疗法观察到的这些有益作用可以由B细胞的广泛(即，循环)可用性介导，其允许表达靶向B细胞抗原的CAR的细胞暴露于这种轻易可获得的细胞群体并受其刺激，并且还可以由B细胞/T细胞相互作用的天然免疫刺激作用增强。因此，在不受理论约束的情况下，纳入靶向B细胞抗原的CAR是有益的，在于它介导表达所述CAR的CART细胞的快速扩充和持久性，并且当CAR细胞还表达肿瘤抗原时，相对于仅表达靶向肿瘤抗原的CAR的CART细胞，这类细胞得益自那些作用，甚至当表达肿瘤抗原的细胞群体小、不可接近或不存在时也是如此，因而允许引发CART细胞，以介导改善的针对表达肿瘤抗原的细胞(例如，癌)的细胞毒性，并且允许贯穿整个缓解阶段持续，并且随后可以在不必再施用细胞的情况下，在复发阶段变得有效。因此，施用表达BCA CAR和TA CAR的细胞，例如，免疫效应细胞，可以增强表达TA CAR的细胞治疗疾病(例如，癌症)的功效。
本公开的细胞经基因工程化以表达第一CAR分子，其中第一CAR分子包含对B细胞抗原特异的抗原结合结构域，并且经基因工程化以表达第二CAR分子，其中第二CAR分子包含对肿瘤抗原特异的抗原结合结构域。在实施方案中，B细胞抗原不在表达肿瘤抗原的细胞上表达。抗原结合结构域与本文所述的B细胞抗原或本文所述的肿瘤抗原结合。与B细胞抗原结合的CAR分子在本文中也称作“BCA CAR”。与B细胞抗原之外的肿瘤抗原(例如，实体瘤抗原、髓系肿瘤抗原或非B细胞来源的血液肿瘤的抗原)结合的CAR分子在本文中也称作“TACAR”。CAR可以还包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域包含(例如，如本文所述的)共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。在一个实施方案中，BCACAR和/或TA CAR的胞内信号传导结构域包括但不限于CD3-ζ链、4-1BB、CD27、ICOS和CD28信号传导模块及其组合的一者或多者。
在一个方面，本发明提供经工程化以表达TA CAR和经工程化以表达BCA CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其中经工程化的免疫效应细胞显示抗肿瘤特性，例如，缩减肿瘤体积、刺激肿瘤消退、减少肿瘤负荷，或增加总生存期；与此同时，相对于不表达BCA CAR的相同细胞，具有增加的体内持久性或增加的增殖。
本文中还描述了使用所述经工程化以表达BCA CAR和TA CAR的细胞的方法。
本文中还描述了产生或选择经工程化以表达BCA CAR和TA CAR的细胞的方法、施用这些细胞治疗与肿瘤抗原相关的疾病的方法，和与本发明细胞配套使用的附加联合疗法。
嵌合抗原受体(CAR)
本公开涵盖包含一个或多个重组核酸构建体的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)，所述重组核酸构建体包含序列，所述序列编码与肿瘤抗原结合的CAR分子(例如，TACAR)和与B细胞抗原结合的CAR分子(例如，BCA CAR)，其中TA CAR包含与本文所述肿瘤抗原特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)并且BCA CAR包含与本文所述的B细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段、TCR或TCR片段)，例如，其中抗原结合结构域的序列与编码胞内信号传导结构域的核酸序列邻接并处于与之相同的可读框内。胞内信号传导结构域可以包含共刺激信号传导结构域和/或初级信号传导结构域，例如，ζ链。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的至少一部分的CAR部分。
在一个方面，本发明的CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，所述胞内信号传导结构域选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、CD3ζ信号结构域及其任意组合。在一个方面，本发明的CAR包含至少一个胞内信号传导结构域，其来自一种或多种选自CD137(4-1BB)、CD28、CD27或ICOS的共刺激分子。
表1中列出了可以是CAR分子(例如，本文所述的TA CAR或BCA CAR)的部分的多种组件的非限制性例子的序列，其中“aa”代表氨基酸，并且“na”代表编码相应肽的核酸。
表1.CAR的多种成分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
在具体方面，本发明的CAR构建体(与B细胞抗原结合的CAR或与肿瘤抗原结合的CAR)包含scFv结构域，其中scFv可以前置有如SEQ ID NO:2中提供的任选前导序列，并且后接如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10中提供的任选铰链序列、如SEQ ID NO:12中提供的跨膜区、包含SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:42或SEQID NO:44的胞内信号传导结构域和包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的CD3ζ序列，其中各结构域彼此邻接并处于相同的可读框以形成单个融合蛋白。
在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内刺激性结构域(例如，本文所述的胞内刺激性结构域)。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列(例如，本文所述的前导序列)、胞外抗原结合结构域(例如，本文所述的抗原结合结构域)、铰链区(例如，本文所述的铰链区)、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)、胞内共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或胞内初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域)。
将示例性前导序列作为SEQ ID NO:2提供。将示例性铰链区/间隔序列作为SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10提供。将示例性跨膜结构域序列作为SEQ ID NO:12提供。将4-1BB蛋白的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:14提供。将CD27的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:16提供。将CD28的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:42提供。将CD28的胞内信号传导结构域的示例性序列作为SEQ ID NO:44提供。将示例性CD3ζ结构域序列作为SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20提供。
可以使用本领域已知的重组方法获得编码所需分子的核酸序列，如，例如通过筛选来自表达核酸分子的细胞文库、通过从已知包括核酸分子的载体衍生该基因、或通过使用标准技术从含有该基因的细胞和组织直接分离。备选地，可以合成地产生目的核酸，而非克隆。
本公开包括表达可以直接转导入细胞中的CAR的逆转录病毒载体构建体和慢病毒载体构建体。本文中描述并且在本领域熟知用于病毒转导的方法。
本公开还包括可以直接转染至细胞中的RNA构建体。一种产生用于转染的mRNA的方法涉及用专门设计的引物在体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)(例如，本文所述的3’和/或5’UTR)、5’帽(例如，本文所述的5’帽)和/或内部核糖体进入位点(IRES)(例如，本文所述的IRES)、待表达的核酸和长度一般为50-2000碱基的聚腺苷酸化尾(SEQ ID NO:32)的构建体。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个实施方案中，模板包括CAR的序列。在一个实施方案中，将RNA CAR载体通过电穿孔转染至细胞(例如，T细胞或NK细胞)中。
抗原结合结构域
在一个方面，本发明的表达CAR的细胞包含靶特异性的结合元件，另外称为抗原结合结构域。部分的选择取决于定义靶细胞表面的配体的类型和数量。例如，可以选择或工程化抗原结合结构域以识别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标记物(例如，与特定癌症相关的肿瘤抗原)的配体(例如，与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域)。在其他实施方案中，选择或工程化抗原结合结构域以识别正常B细胞或B细胞亚群，以耗尽正常B细胞或目标B细胞群体(例如，与B细胞抗原结合的抗原结合结构域)。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、缀合的抗体、人抗体、人源化抗体和其功能性片段，包括但不限于单一结构域抗体，如驼类衍生型纳米体的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)，以及本领域已知的作为抗原结合结构域发挥作用的备选支架，如重组纤连蛋白结构域、T细胞受体(TCR)、亲和力增强的重组TCR或其片段，例如，单链TCR等。在一些情况下，从其中将会最终使用CAR的相同物种衍生抗原结合结构域是有益的。例如，对于人类中使用，包含抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人残基或人源化残基可能有益于CAR的抗原结合结构域。
肿瘤抗原
本公开提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其经工程化以含有指引免疫效应细胞至癌细胞的一种或多种CAR。这通过CAR上对肿瘤抗原特异的抗原结合结构域来实现。存在二类可以由本发明CAR靶向的肿瘤抗原(肿瘤抗原)：(1)表达在癌细胞表面上的肿瘤抗原；和(2)本身为细胞内，然而这类抗原(肽)的片段由MHC(主要组织相容性复合体)呈递在癌细胞表面上的肿瘤抗原。
在一个实施方案中，肿瘤抗原在正常细胞和癌细胞二者上表达，但是在正常细胞上以较低水平表达。在一个实施方案中，该方法还包括选择以这样的亲和力结合肿瘤抗原的TA CAR，所述亲和力允许经工程化以表达TA CAR的细胞结合并杀伤表达肿瘤抗原的癌细胞，但是少于30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少表达肿瘤抗原的正常细胞被杀伤，例如，如通过本文所述的测定法所测定。例如，可以使用杀伤测定法如基于Cr51CTL的流式细胞术。在一个实施方案中，选择的TA CAR具有这样的抗原结合结构域，其对靶抗原具有10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M的结合亲和力KD。在一个实施方案中，选择的抗原结合结构域具有至少五倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍小于参考抗体(例如，本文所述的抗体)的结合亲和力。
因此，本发明的细胞经工程化以表达，例如，表达，包含抗原结合结构域的TA CAR，所述抗原结合结构域可以靶向，例如，结合至任一个示例性肿瘤抗原(肿瘤抗原)：CD123、CD30、CD171、CS-1、CLL-1(CLECL1)、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、sTn Ag、Tn-O-糖肽、Stn-O-糖肽、PSMA、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、间皮素、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、PDGFR-β、PRSS21、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、EGFR、NCAM、Prostase、PAP、ELF2M、肝配蛋白B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、TSHR、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、豆荚蛋白、HPV E6、E7、MAGE-A1、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos-相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、存活素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ra突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、muthsp70-2、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1和呈递在MHC上的这些抗原的肽。
在实施方案中，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域靶向与实体瘤相关(例如，实体瘤细胞表达的)的肿瘤抗原，本文中称作实体瘤相关抗原，例如，与间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌或大细胞肺癌)、胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)、食管腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌和膀胱癌或其任意组合相关的抗原。在一个实施方案中，疾病是胰腺癌，例如，转移性胰腺导管腺癌(PDA)，例如，处于接受至少一种既往标准疗法时已经进展的受试者中。在一个实施方案中，疾病是间皮瘤(例如，恶性胸膜间皮瘤)，例如，处于接受至少一种既往标准疗法时已经进展的受试者中。在一个实施方案中，疾病是卵巢癌，例如，浆液性卵巢上皮癌，例如，处于接受至少一种既往标准疗法治疗方案后已经进展的受试者中。
实体瘤相关抗原(即，实体瘤抗原)的例子包括而不限于：EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如、ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPVE6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的肽。
在一个实施方案中，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与人间皮素结合。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人人间皮素结合的鼠scFv结构域，例如，SS1或SEQ ID NO:46。在一个实施方案中，抗原结合结构域是衍生自鼠SS1scFv的人源化抗体或抗体片段，例如scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人间皮素结合的人抗体或抗体片段。表2中提供与间皮素结合的示例性人scFv结构域(及其序列)和鼠SS1scFv。CDR序列加下划线。表2中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由接头接合，所述接头包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)(例如，如SS1scFv结构域中所显示)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:29)(例如，如M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23或M24scFv结构域中所显示)。表2中列出的scFv结构域为以下取向：VL-接头-VH。
表2.与间皮素结合的抗原结合结构域
对于表2中提供的间皮素抗原结合结构域的scFv结构域，其重链可变结构域的CDR序列显示在表3中，并且对于其轻链可变结构域的相应序列，在表4中显示。
表3.人抗间皮素scFvs的重链(HC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
表4.人抗间皮素scFvs的轻链(LC)CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列
例如来自已知抗体、双特异性分子或CAR的任何已知抗间皮素结合结构域可以适用于本发明的TA CAR中。例如，针对间皮素的抗原结合结构域是或可以衍生自例如PCT公开WO2015/090230中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL。在一个实施方案中，针对间皮素的抗原结合结构域是或衍生自例如PCT公开WO1997/025068、WO1999/028471、WO2005/014652、WO2006/099141、WO2009/045957、WO2009/068204、WO2013/142034、WO2013/040557或WO2013/063419中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含本文所述(例如，表2或表4中提供)的间皮素结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表2或表3中提供)的间皮素结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含如表4中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中一者、两者或全体；和如表3中提供的任何氨基酸序列的全部HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中一者、两者或三者。
在一个实施方案中，间皮素抗原结合结构域包含：
(i)(a)SEQ ID NO:184的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:209的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:234的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:115的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:159的HC CDR3氨基酸序列；
(ii)(a)SEQ ID NO:190的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:215的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:240的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:121的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:141的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:165的HC CDR3氨基酸序列；
(iii)(a)SEQ ID NO:204的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:229的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:254的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:132的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:154的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:179的HC CDR3氨基酸序列；
(iv)(a)SEQ ID NO:180的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:205的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:230的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:133的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:155的HC CDR3氨基酸序列；
(v)(a)SEQ ID NO:181的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:206的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:231的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:156的HC CDR3氨基酸序列；
(vi)(a)SEQ ID NO:182的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:207的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:232的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:113的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:134的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:157的HC CDR3氨基酸序列；
(vii)(a)SEQ ID NO:183的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:208的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:233的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:114的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:135的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:158的HC CDR3氨基酸序列；
(viii)(a)SEQ ID NO:186的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:210的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:235的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:116的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:136的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:160的HC CDR3氨基酸序列；
(ix)(a)SEQ ID NO:186的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:211的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:236的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:117的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:137的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:161的HC CDR3氨基酸序列；
(x)(a)SEQ ID NO:187的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:212的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:237的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:118的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:138的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:162的HC CDR3氨基酸序列；
(xi)(a)SEQ ID NO:188的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:213的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:238的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:119的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:139的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:163的HC CDR3氨基酸序列；
(xii)(a)SEQ ID NO:189的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:214的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:239的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:120的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:140的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:164的HC CDR3氨基酸序列；
(xiii)(a)SEQ ID NO:191的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:216的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:241的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:121的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:142的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:166的HC CDR3氨基酸序列；
(xiv)(a)SEQ ID NO:192的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:217的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:242的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:122的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:143的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:167的HC CDR3氨基酸序列；
(xv)(a)SEQ ID NO:193的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:218的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:243的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:123的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:144的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:168的HC CDR3氨基酸序列；
(xvi)(a)SEQ ID NO:194的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:219的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:244的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:145的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:169的HC CDR3氨基酸序列；
(xvii)(a)SEQ ID NO:195的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:220的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:245的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:146的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:170的HC CDR3氨基酸序列；
(xviii)(a)SEQ ID NO:196的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:221的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:246的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:124的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:146的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:171的HC CDR3氨基酸序列；
(xix)(a)SEQ ID NO:197的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:222的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:247的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:125的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:147的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:172的HC CDR3氨基酸序列；
(xx)(a)SEQ ID NO:198的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:223的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:248的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:126的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:148的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:173的HC CDR3氨基酸序列；
(xxi)(a)SEQ ID NO:199的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:224的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:249的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:127的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:149的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:174的HC CDR3氨基酸序列；
(xxii)(a)SEQ ID NO:200的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:225的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:250的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:128的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:150的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:175的HC CDR3氨基酸序列；
(xxiii)(a)SEQ ID NO:201的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:226的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:251的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:129的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:151的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:176的HC CDR3氨基酸序列；
(xxiv)(a)SEQ ID NO:202的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:227的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:252的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:130的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:152的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:177的HC CDR3氨基酸序列；或
(xxv)(a)SEQ ID NO:203的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:228的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:253的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:131的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:153的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:178的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含本文(例如，表2中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表2中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，间皮素结合结构域是包含表2中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，间皮素结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表2中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表2中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表2中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表2中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含选自SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:47；SEQ ID NO:48；SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:50；SEQ ID NO:51；SEQ ID NO:52；SEQ ID NO:53；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ IDNO:59；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:63；SEQ ID NO:64；SEQ IDNO:65；SEQ ID NO:66；SEQ ID NO:67,SEQ ID NO:68；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，间皮素结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表2中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表2中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，间皮素结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与人EGFRvIII结合。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人EGFRvIII结合的鼠scFv结构域，例如，mu310C。在一个实施方案中，抗原结合结构域是衍生自鼠mu310C scFv的人源化抗体或抗体片段，例如scFv结构域。表5中提供与EGFRvIII结合的示例性人源化scFv结构域(及其序列)和鼠SS1scFv。
在一个实施方案中，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与人紧密连接蛋白(claudin)6(CLDN6)结合。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CLDN6结合的鼠scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段。表5中提供与CLDN6结合的示例性scFv结构域(及其序列)。表5中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由包含序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:29)的接头例如按以下方向连接：VL-接头-VH。
表5.与肿瘤抗原EGFRvIII结合的抗原结合结构域
在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域包含本文所述(例如，表5中提供)的EGFRvIII结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表5中提供)的EGFRvIII结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域包含本文(例如，表5中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表5中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域是包含表5中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表5中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表5中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表5中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表5中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域包含选自SEQ ID NO:71；SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:73；SEQ ID NO:74；SEQ ID NO:75；SEQ ID NO:76；SEQ ID NO:77；SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表5中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表5中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，EGFRvIII结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含本文所述(例如，表5中提供)的EGFRvIII结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表5中提供)的紧密连接蛋白-6结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含本文(例如，表5中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表5中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域是包含表5中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表5中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表5中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表5中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表5中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含选自SEQ ID NO:98；SEQ IDNO:99和SEQ ID NO:100的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表5中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表5中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，紧密连接蛋白-6结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
在一个实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是在例如Mujoo等人,CancerRes.47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res 45(6):2642-2649(1985)；Cheung等人,J Clin Oncol 5(9):1430-1440(1987)；Cheung等人,J Clin Oncol 16(9):3053-3060(1998)；Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother 35(3):199-204(1992)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是选自mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1和8H9的抗体的抗原结合部分，参见，例如WO2012033885、WO2013040371、WO2013192294、WO2013061273、WO2013123061、WO2013074916和WO201385552。在一些实施方案中，针对GD2的抗原结合结构域是在美国公开号20100150910或PCT公开号WO 2011160119中描述的抗体的抗原结合部分。
在一个实施方案中，针对Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽抗原或sTn-O-糖肽抗原的抗原结合结构域是在例如US 2014/0178365、WO2015/120180、US8,440,798、EP 2083868A2、Brooks等人,PNAS107(22):10056-10061(2010)和Stone等人,OncoImmunology1(6):863-873(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对PSMA的抗原结合结构域是在例如Parker等人,ProteinExpr Purif 89(2):136-145(2013)、US 20110268656(J591ScFv)；Frigerio等人,EuropeanJ Cancer 49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAb 3/A12、3/E7和3/F11)和单链抗体片段(scFv A5和D7)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CD97的抗原结合结构域是在例如US6,846,911；de Groot等人,J.Immunol 183(6):4127-4134(2009)中描述的抗体的或来自R&D的抗体MAB3734的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对TAG72的抗原结合结构域是在例如Hombach等人,Gastroenterology 113(4):1163-1170(1997)中描述的抗体和Abcam ab691的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CD44v6的抗原结合结构域是在例如Casucci等人,Blood122(20):3461-3472(2013)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CEA的抗原结合结构域是在例如Chmielewski等人,Gastoenterology 143(4):1095-1107(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见，例如，clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对KIT的抗原结合结构域是在例如US7915391、US20120288506和几种商业目录抗体中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是在例如WO2008/146911、WO2004087758、几种商业目录抗体和WO2004087758中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CD171的抗原结合结构域是在例如Hong等人,JImmunother 37(2):93-104(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对PSCA的抗原结合结构域是在例如Morgenroth等人,Prostate 67(10):1121-1131(2007)(scFv 7F5)；Nejatollahi等人,J of Oncology 2013(2013),article ID 839831(scFv C5-II)；和美国专利公开号20090311181中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是在例如PMID:2450952；US7635753中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或在US20120009181；US4851332、LK26：US5952484中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对NCAM的抗原结合结构域是抗体克隆2-2B：MAB5324(EMDMillipore)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&DSystems)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对Fos-相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(NovusBiologicals)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(CellSignaling)或其他市售抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对ALK的抗原结合结构域是在例如Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res 16(5):1561-1571(2010)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对聚唾液酸的抗原结合结构域是在例如Nagae等人,J BiolChem 288(47):33784-33796(2013)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对PLAC1的抗原结合结构域是在例如Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem 2013doi:10.1002/bab.1177中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对GloboH的抗原结合结构域是抗体VK9的抗原结合部分或在例如，Kudryashov V等人,Glycoconj J.15(3):243-9(1998)；Lou等人,Proc Natl AcadSci USA 111(7):2482-2487(2014)中描述的抗体的抗原结合部分；Bremer E-G等人,JBiol Chem 259:14773–14777(1984)中描述MBr1的抗原结合部分。
在一个实施方案中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是在例如Jager等人,ApplImmunohistochem Mol Morphol 15(1):77-83(2007)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对精子蛋白17的抗原结合结构域是在例如Song等人,,Target Oncol 2013Aug 14(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol 29(4):2923-2931(2012)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对TRP-2的抗原结合结构域是在例如Wang等人,J ExpMed.184(6):2207-16(1996)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是在例如Maecker等人,Blood102(9):3287-3294(2003)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMDMillipore)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是抗体目录号LS-B95-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对肠道的羧基酯酶的抗原结合结构域是抗体4F12(目录号LS-B6190-50(Lifespan Biosciences))的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是抗体LifespanBiosciences：单克隆：目录号：LS-C133261-100(Lifespan Biosciences)的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是在例如PMID:2450952；US7635753中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含一个、二个、三个(例如，全部三个)来自上文所列抗体的重链CDR、HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或一个、二个、三个(例如，全部三个)来自上文所列抗体的轻链CDR、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含上文所列抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
髓系肿瘤抗原
本公开提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其经工程化以含有(除一种或多种BCA CAR分子之外的)靶向肿瘤抗原的一种或多种CAR分子。在一个方面，肿瘤抗原是表达在髓系肿瘤上的抗原(或者表面抗原或作为联合MHC的复合体(comple))，并且本发明的细胞包含识别髓系肿瘤抗原的CAR。
在一个实施方案中，髓系肿瘤抗原是在髓系肿瘤细胞表面上偏好或特异性表达的抗原。
本公开提供可以靶向以下髓系肿瘤抗原的CAR：CD123、CD34、Flt3、CD33和CLL-1。在实施方案中，髓系肿瘤抗原选自CD123、CD33和CLL-1。在实施方案中，髓系肿瘤抗原是CD123。在实施方案中，髓系肿瘤抗原是CD33。在实施方案中，髓系肿瘤抗原是CD34。在实施方案中，髓系肿瘤抗原是Flt3。在实施方案中，髓系肿瘤抗原是CLL-1。在实施方案中，抗原结合结构域靶向人抗原。
在一个实施方案中，可以如此选择TA CAR(例如，本发明细胞(例如，还表达BCACAR的细胞)表达的TA CAR)的抗原结合结构域，从而靶向髓系肿瘤群体。备选地，当需要靶向多于一个类型的髓系肿瘤时，可以选择靶向这样的髓系肿瘤抗原的抗原结合结构域，所述髓系肿瘤抗原由多于一种(例如，全部)待靶向的髓系肿瘤表达。
在一个方面，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与CD123(例如，人CD123)结合。可以在本发明中使用任何已知的CD123结合结构域。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2014/130635中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO/2016/028896中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL。在一个实施方案中，针对CD123的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO1997/024373、WO2008/127735(例如，26292、32701、37716或32703的CD123结合结构域)、WO2014/138805(例如，CSL362的CD123结合结构域)、WO2014/138819、WO2013/173820、WO2014/144622、WO2001/66139、WO2010/126066(例如，Old4、Old5、Old17、Old19、New102或Old6的任一者的CD123结合结构域)、WO2014/144622或US2009/0252742中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR。在实施方案中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CD123结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD123结合的人抗体或抗体片段。在实施方案中，抗原结合结构域是包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的scFv结构域。VL和VH可以由本文所述的例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)的接头连接，并且可以处于例如任何取向：VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一个方面，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与CD33(例如，人CD33)结合。可以在本发明中使用任何已知的CD33结合结构域。在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2016/014576中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL，所述文献的内容完整并入本文。在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是吉妥单抗(Gemtuzumab ozogamicin)的或衍生自其中的抗原结合部分(例如，包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含吉妥单抗(先前作为Mylotarg销售)的重链可变结构域的一个或多个(例如，一个、二个或三个)CDR和/或轻链可变结构域的一个或多个(例如，的一个、二个或三个)CDR或scFv序列的VH或VL或scFv序列)，例如，Bross等人,Clin Cancer Res 7(6):1490-1496(2001)(GemtuzumabOzogamicin,hP67.6)。在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是由GenBank参考号AM402974.1编码的scFv序列的或衍生自其中的抗原结合部分(例如，包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含重链可变结构域的一个或多个(例如，一个、二个或三个)CDR和/或轻链可变结构域的一个或多个(例如，一个、二个或三个)CDR，或VH或VL或scFv序列)(参见，Wang等人,Mol.Ther.,vol.23:1,pp.184-191(2015)，所述文献因而通过引用的方式并入)。在一个实施方案中，针对CD33的抗原结合结构域是在例如Caron等人,Cancer Res 52(24):6761-6767(1992)(林妥珠单抗(Lintuzumab)，HuM195)、Lapusan等人,Invest NewDrugs 30(3):1121-1131(2012)(AVE9633)、Aigner等人,Leukemia 27(5):1107-1115(2013)(AMG330，CD33BiTE)、Dutour等人,Adv hematol 2012:683065(2012)和Pizzitola等人,Leukemia doi:10.1038/Lue.2014.62(2014)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在实施方案中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CD33结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD33结合的人抗体或抗体片段。在实施方案中，抗原结合结构域是包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的scFv结构域。VL和VH可以由本文所述的例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)的接头连接，并且可以处于例如任何取向：VL-接头-VH或VH-接头-VL。
在一个方面，TA CAR(例如，本发明细胞表达的TA CAR)的抗原结合结构域与CLL-1(例如，人CLL-1)结合。可以在本发明中使用任何已知的CLL-1结合结构域。在一个实施方案中，针对CLL-1的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2016/014535中描述的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分，例如，CDR或VH和VL，所述文献的内容完整并入本文。在一个实施方案中，针对CLL-1的抗原结合结构域是从R&D、ebiosciences、Abcam可获得的抗体(例如PE-CLL1-hu目录号353604(BioLegend)；和PE-CLL1(CLEC12A)目录号562566(BD))的抗原结合部分，例如，CDR。在实施方案中，抗原结合结构域是或衍生自鼠抗人CLL-1结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CLL-1结合的人抗体或抗体片段。在实施方案中，抗原结合结构域是包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的scFv结构域。VL和VH可以由本文所述的例如包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)的接头连接，并且可以处于例如任何取向：VL-接头-VH或VH-接头-VL。
B细胞抗原
本公开提供免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，其经工程化以含有(除一种或多种TA CAR分子之外的)靶向B细胞抗原的一种或多种CAR分子。这通过CAR上对B细胞抗原特异的抗原结合结构域来实现。这种CAR可以在本文中称作BCA CAR。
在一个实施方案中，B细胞抗原是在B细胞表面上偏好或特异性表达的抗原。抗原可以表达在以下类型的B细胞的任一者的表面上：祖先B细胞(例如，前B细胞或原B细胞)，早期原B细胞、晚期原B细胞、大前B细胞、小前B细胞、不成熟B细胞，例如，初始B细胞、成熟B细胞、浆(plama)B细胞、浆母细胞、记忆型B细胞、B-1细胞、B-2细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞或调节性B细胞(Bregs)。
本公开提供可以靶向以下B细胞抗原的CAR：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD37、CD38、CD53、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、ROR1、BCMA、CD86和CD179b。可以由本文所述的CAR靶向的其他B细胞抗原包括：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD17、CD18、CD26、CD27、CD29、CD30、CD31、CD32a、CD32b、CD35、CD38、CD39、CD40、CD44、CD45、CD45RA、CD45RB、CD45RC、CD45RO、CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD49d、CD50、CD52、CD54、CD55、CD58、CD60a、CD62L、CD63、CD63、CD68CD69、CD70、CD85E、CD85I、CD85J、CD92、CD95、CD97、CD98、CD99、CD100、CD102、CD108、CD119、CD120a、CD120b、CD121b、CD122、CD124、CD125、CD126、CD130、CD132、CD137、CD138、CD139、CD147、CD148、CD150、CD152、CD162、CD164、CD166、CD167a、CD170、CD175、CD175s、CD180、CD184、CD185、CD192、CD196、CD197、CD200、CD205、CD210a、CDw210b、CD212、CD213a1、CD213a2、CD215、CD217、CD218a、CD218b、CD220、CD221、CD224、CD225、CD226、CD227、CD229、CD230、CD232、CD252、CD253、CD257、CD258、CD261、CD262、CD263、CD264、CD267、CD268、CD269、CD270、CD272、CD274、CD275、CD277、CD279、CD283、CD289、CD290、CD295、CD298、CD300a、CD300c、CD305、CD306、CD307a、CD307b、CD307c、CD307d、CD307e、CD314、CD315、CD316、CD317、CD319、CD321、CD327、CD328、CD329、CD338、CD351、CD352、CD353、CD354、CD355、CD357、CD358、CD360、CD361、CD362和CD363。
在另一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原选自CD19、BCMA、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、CS-1和CD138。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是CD19。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是CD20。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是CD22。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是BCMA。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是FcRn5。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是FcRn2。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是CS-1。在一个实施方案中，由BCA CAR靶向的B细胞抗原是CD138。
在一个实施方案中，可以如此选择BCA CAR(例如，本发明细胞(例如，还表达TACAR的细胞)表达的BCA CAR)的抗原结合结构域，从而靶向优选的B细胞群体。例如，在需要靶向调节性B细胞的一个实施方案中，选择这样的抗原结合结构域，其靶向在调节性B细胞上表达且不在其他B细胞群体(例如，血浆B细胞和记忆型B细胞)上表达的B细胞抗原。在调节性B细胞上表达的细胞表面标志物包括：CD19、CD24、CD25、CD38或CD86或在He等人,2014,J Immunology Research,Article ID 215471中描述的标志物。备选地，当需要靶向多于一个类型的B细胞时，可以选择靶向B细胞抗原的抗原结合结构域，所述B细胞抗原由全部待靶向的B细胞表达。
在一个实施方案中，BCA CAR(例如，本发明细胞表达的BCA CAR)的抗原结合结构域与CD19结合。CD19存在于原/前B细胞阶段至终末分化型浆细胞阶段的整个谱系分化期间的B细胞上。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD19(例如，CTL019)结合的鼠scFv结构域(例如，SEQ ID NO:95)。在一个实施方案中，抗原结合结构域是衍生自鼠CTL019scFv的人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人CD19结合的人抗体或抗体片段。表6中提供与CD19结合的示例性scFv结构域(及其序列，例如，CDR、VL和VH序列)。表6中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)的接头例如按以下方向连接：VL-接头-VH。
表6.结合B细胞抗原CD19的抗原结合结构域
对于重链可变结构域，表7中显示表6中提供的CD19抗原结合结构域的scFv结构域的CDR序列并且对于轻链可变结构域，在表8中显示相应序列。“ID”代表每个CDR的相应SEQID NO。
表7.重链可变结构域CDR
表8轻链可变结构域CDR
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含抗CD19抗体或其片段，例如，scFv。例如，抗原结合结构域包含表9中列出的可变重链和可变轻链。连接可变重和可变轻链的接头序列可以是本文所述的任何接头序列，或备选地，可以是GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:81)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
表9.额外的抗CD19抗体结合结构域
在一个实施方案中，CD19结合结构域包含本文所述(例如，表6或表7中提供)的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表6或表8中提供)的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，CD19结合结构域包含如通过引用方式并入本文的表8中提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中一者、两者或全体；和如表7中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中一者、两者或全体。
在一个实施方案中，CD19抗原结合结构域包含：
(i)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:256的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列
(ii)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:257的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列；
(iii)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:258的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列；或
(iv)(a)SEQ ID NO:261的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:262的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:263的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:255的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:259的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:260的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中，CD19包含本文(例如，表6或表9中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表6或表9中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，间皮素结合结构域是包含表3或表4中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，CD19结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表6或表9中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表6或表9中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表6或表9中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表6或表9中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，CD19结合结构域包含选自SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:84、SEQID NO:85；SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:112的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，CD19结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表6或表9中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表6或表9中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，CD19结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
本领域的任何已知CD19 CAR，例如，任何已知CD19 CAR的CD19抗原结合结构域，可以根据本发明用来构建CAR。例如，LG-740；在美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood 122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood,118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood 116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood 122(25):4129-39(2013)；和16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)(May 15-18,Salt Lake City)2013,Abst10中描述的CD19 CAR。在一个实施方案中，针对CD19的抗原结合结构域是在例如PCT公开WO2012/079000；PCT公开WO2014/153270；Kochenderfer,J.N.等人,J.Immunother.32(7),689-702(2009)；Kochenderfer,J.N.等人,Blood,116(20),4099-4102(2010)；PCT公开WO2014/031687；Bejcek,Cancer Research,55,2346-2351,1995；或美国专利号7,446,190中描述的CAR、抗体或其抗原结合片段的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，BCA CAR(例如，本发明细胞表达的BCA CAR)的抗原结合结构域与BCMA结合。发现BCMA偏好表达于成熟的B淋巴细胞中。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人BCMA结合的鼠scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是结合人BCMA的人源化抗体或抗体片段，例如，scFv结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域是与人BCMA结合的人抗体或抗体片段。表12、表13、表14和表15中提供与BCMA结合的示例性scFv结构域(及其序列，例如，CDR、VL和VH序列)。表12和表13中提供的scFv结构域序列包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。VL和VH由接头例如按以下方向连接：VH-接头-VL。
表12.结合B细胞抗原BCMA的抗原结合结构域
还提供每个scFv的可变重链序列和可变轻链序列的氨基酸序列。
在实施方案中，使用来自PCT公开WO2012/0163805的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2016/014565的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/122144的VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2016/014789的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/089335的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。在实施方案中，使用来自PCT公开WO2014/140248的CAR分子和/或VH和VL序列，生成额外的示例性BCMA CAR构建体(所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入)。
在实施方案中，也可以使用表13中存在的VH和VL序列生成额外的示例性BCMA CAR构建体。表13中还存在包含VH结构域和VL结构域及接头序列的示例性scFv结构域和全长CAR的氨基酸序列。
表13.额外的示例性BCMA结合结构域序列
对于重链可变结构域，在表14中显示scFv结构域的人CDR序列，并且对于轻链可变结构域，在表15中显示scFv结构域的人CDR序列。“ID”代表每个CDR的相应SEQ ID NO。CDR根据Kabat定义显示，然而，可以基于以上VH和VL序列轻易地推导出遵循其他惯例(例如，Chothi定义或联合Kabat/Chothi定义)的CDR。
表14：根据Kabat编号方案的重链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“sequencesof Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD)
表15：根据Kabat编号方案的轻链可变结构域CDR(Kabat等人(1991),“sequencesof Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD)
在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含本文所述(例如，表12、表13或表15中提供)的BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)、和/或本文所述(例如，表12、表13或表14中提供)的BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含如通过引用方式并入本文的表12提供的任何氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中一者、两者或全体；和如表12中提供的任何氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3中一者、两者或全体。
在一个实施方案中，BCMA抗原结合结构域包含：
(v)(a)SEQ ID NO:814的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:854的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:894的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:694的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:734的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:774的HC CDR3氨基酸序列
(vi)(a)SEQ ID NO:804的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:844的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:884的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:684的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:724的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:764的HC CDR3氨基酸序列
(vii)(a)SEQ ID NO:805的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:845的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:885的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:685的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:725的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:765的HC CDR3氨基酸序列
(viii)(a)SEQ ID NO:806的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:846的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:886的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:686的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:726的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:766的HC CDR3氨基酸序列
(ix)(a)SEQ ID NO:807的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:847的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:887的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:687的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:727的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:767的HC CDR3氨基酸序列
(x)(a)SEQ ID NO:808的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:848的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:888的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:688的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:728的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:768的HC CDR3氨基酸序列
(xi)(a)SEQ ID NO:809的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:849的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:889的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:689的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:729的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:769的HC CDR3氨基酸序列
(xii)(a)SEQ ID NO:810的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:850的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:890的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:690的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:730的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:770的HC CDR3氨基酸序列
(xiii)(a)SEQ ID NO:811的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:851的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:891的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:691的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:731的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:771的HC CDR3氨基酸序列
(xiv)(a)SEQ ID NO:812的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:852的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:892的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:692的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:732的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:772的HC CDR3氨基酸序列
(xv)(a)SEQ ID NO:813的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:853的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:893的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:693的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:733的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:773的HC CDR3氨基酸序列
(xvi)(a)SEQ ID NO:815的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:855的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:895的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:695的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:735的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:775的HC CDR3氨基酸序列
(xvii)(a)SEQ ID NO:816的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:856的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:896的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:696的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:736的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:776的HC CDR3氨基酸序列
(xviii)(a)SEQ ID NO:817的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:857的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:897的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:697的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:737的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:777的HC CDR3氨基酸序列
(xix)(a)SEQ ID NO:818的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:858的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:898的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:698的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:738的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:778的HC CDR3氨基酸序列
(xx)(a)SEQ ID NO:819的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:859的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:899的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:699的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:739的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:779的HC CDR3氨基酸序列
(xxi)(a)SEQ ID NO:820的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:860的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:900的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:700的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:740的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:780的HC CDR3氨基酸序列
(xxii)(a)SEQ ID NO:821的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:861的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:901的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:701的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:741的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:781的HC CDR3氨基酸序列
(xxiii)(a)SEQ ID NO:822的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:862的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:902的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:702的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:742的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:782的HC CDR3氨基酸序列
(xxiv)(a)SEQ ID NO:823的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:863的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:903的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:703的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:743的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:783的HC CDR3氨基酸序列
(xxv)(a)SEQ ID NO:824的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:864的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:904的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:704的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:744的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:784的HC CDR3氨基酸序列
(xxvi)(a)SEQ ID NO:825的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:865的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:905的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:705的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:745的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:785的HC CDR3氨基酸序列或
(xxvii)(a)SEQ ID NO:826的LC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:866的LC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:906的LC CDR3氨基酸序列；和
(b)SEQ ID NO:706的HC CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:746的HC CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO:786的HC CDR3氨基酸序列。
在一个实施方案中，BCMA包含本文(例如，表12或表13中)所述的轻链可变区和/或本文(例如，表12或表13中)所述的重链可变区。在一个实施方案中，BCMA结合结构域是包含表12或表13中列出的氨基酸序列的轻链和重链的scFv。在一个实施方案中，BCMA结合结构域(例如，scFv)包含：轻链可变区，所述轻链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表12或表13中提供的轻链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表12或表13中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，所述重链可变区包含下述氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少一个、两个或三个在表12或表13中提供的重链可变区的氨基酸序列的修饰(例如，置换，例如保守性置换)，但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如保守性置换)，或包含与表12或表13中提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含选自SEQ ID NO:349；SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340；SEQ ID NO:341；SEQ ID NO:342；SEQ ID NO:343；SEQ ID NO:344、SEQ IDNO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:353、SEQ ID NO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ IDNO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ ID NO:440、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ IDNO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:563、SEQ ID NO:564、SEQ ID NO:565和SEQ ID NO:566的氨基酸序列；或相对于前述任何序列具有至少一个、两个或三个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于30、20或10个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与前述任何序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，BCMA结合结构域是scFv，并且包含本文(例如，表12或表13中)所述的氨基酸序列的轻链可变区经接头(例如，本文所述的接头)与包含本文(例如，表12或表13中)所述的氨基酸序列的重链可变区连接。在一个实施方案中，BCMA结合结构域包含(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。scFv的轻链可变区和重链可变区可以例如处于以下任何取向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。
本领域的任何已知BCMA CAR，例如，任何已知BMC CAR的BMCA抗原结合结构域，可以根据本发明用来构建BCA CAR。例如，本文所述的那些。作为另一个例子，BCMA CAR包含例如在WO2016/094304、WO2016/014789或US9,034,324(例如，US9,034,324的C11D5)中描述的CAR或抗原结合结构域的抗BCMA结合结构域或其部分，例如，CDR，所述的每篇文献因而通过引用的方式完整并入。
在一个实施方案中，针对ROR1的抗原结合结构域是在例如Hudecek等人,ClinCancer Res 19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US20130101607中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。
在一个实施方案中，针对CD22的抗原结合结构域是在例如Haso等人,Blood,121(7):1165-1174(2013)；Wayne等人,Clin Cancer Res 16(6):1894-1903(2010)；Kato等人,Leuk Res 37(1):83-88(2013)；Creative BioMart(creativebiomart.net):MOM-18047-S(P)中描述的抗体的抗原结合部分，例如，CDR。在一个实施方案中，针对CD22的抗原结合结构域是例如在WO2016/164731中描述(例如，如WO2016/164731的表6A中描述)的抗原结合结构域或CAR的抗原结合部分(例如，CDR、VL和VH)或scFv，所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入。
在一个实施方案中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、维妥珠单抗或GA101或其衍生物的抗原结合部分，例如，CDR。在一方面，针对CD20的抗原结合结构域是例如在WO2016/164731中描述(例如，如WO2016/164731的表11A或表11B中描述)的抗原结合结构域或CAR的抗原结合部分(例如，CDR、VL和VH)或scFv，所述文献的内容因而通过引用方式完整地并入。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含一个、二个、三个(例如，全部三个)来自上文所列抗体的重链CDR、HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或一个、二个、三个(例如，全部三个)来自结合上文所列的肿瘤抗原或B细胞抗原的抗体的轻链CDR、LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含结合上文所列的肿瘤抗原或B细胞抗原的抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一个实施方案中，本文所述的CAR(例如，TA CAR和/或BCA CAR)的抗原结合结构域是scFv抗体片段。在一个方面，这类抗体片段是有功能的，在于它们保留等同的结合亲和力，例如，它们以可比的功效结合与衍生它的IgG抗体相同的抗原。在其他实施方案中，抗体片段具有较低的结合亲和力，例如，它以低于衍生它的抗体的结合亲和力结合相同的抗原，但是有功能，在于它提供本文所述的生物学反应。在一个实施方案中，CAR分子包含这样的抗体片段，其对靶抗原具有10-4M至10-8M，例如10-5M至10-7M，例如10-6M或10-7M的结合亲和力KD。在一个实施方案中，抗体片段具有至少五倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍小于参考抗体(例如，本文所述的抗体)的结合亲和力。
在一个实施方案中，抗原结合结构域包含非人类抗体或抗体片段，例如，小鼠抗体或抗体片段。
在另一个实施方案中，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人类抗体是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增加与人类中天然产生的抗体或其片段的相似性。在一个方面，与衍生它的抗体或抗体片段(例如，scFv)的鼠序列相比，抗原结合结构域是人源化的。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，所述技术包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，每份文献通过引用的方式完整并入本文)、镶饰或表面重塑(参见，例如，欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973，每份文献通过引用的方式完整并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利号5,565,332，所述文献通过引用的方式完整并入本文)和在例如以下文献中公开的技术：美国专利申请公开号US2005/0042664、美国专利申请公开号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号WO 9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002)、Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000)、Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000)、Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997)、Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996)、Couto等人,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995)、Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995)、Sandhu JS,Gene,150(2):409-10(1994)和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，每份文献通过引用的方式完整并入本文。经常地，框架区中的框架残基将用来自CDR供体抗体的相应残基置换以改变、例如改善抗原结合。这些框架置换由本领域熟知的方法鉴定，例如，通过将CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基并且进行序列比较以鉴定特定位置处的不寻常框架残基。(参见，例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，所述文献通过引用的方式完整并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有留在其中的来自非人类来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称作“输入”残基，它们一般取自“输入”可变结构域。如本文中提供，人源化抗体或抗体片段包含来自非人类免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和框架区，其中包含框架的氨基酸残基完全或大部分衍生自人种系。用于抗体或抗体片段人源化的多项技术是本领域熟知并且可以基本上按照Winter和合作者(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))的方法，通过将啮齿类CDR或CDR序列置换相应的人抗体序列(即，CDR移植)进行(EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在这类人源化抗体和抗体片段中，基本上小于完整人可变结构域的区域已经由来自非人类物种的相应序列置换。人源化抗体往往是其中一些CDR残基并且可能地一些FR残基由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。抗体和抗体片段的人源化也可以通过镶饰或表面重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；和Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
选择待用于产生人源化抗体的人可变结构域(重链和轻链可变结构域)降低抗原性。根据所谓“最佳配合”方法，针对已知的人可变结构域序列的完整文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。随后鉴定到与啮齿类序列最接近的人类序列并且接受它作为用于人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等人,J.Immunol,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。另一种方法使用从具有特定亚组重链或重链的全部人类抗体的共有序列中衍生的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(参见，例如，Nicholson等人,Mol.Immun.34(16-17):1157-1165(1997)；Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文)。在一些实施方案中，重链可变区的框架区(例如，全部四个框架区)衍生自VH4_4-59种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，置换，例如来自相应鼠序列处氨基酸的置换。在一个实施方案中，轻链可变区的框架区(例如，全部四个框架区)衍生自VK3_1.25种系序列。在一个实施方案中，框架区可以包含一个、两个、三个、四个或五个修饰，例如，置换，例如来自相应鼠序列处氨基酸的置换。
在一些方面，本发明CAR(例如，本文所述的TA CAR和/或BCA CAR)的包含抗体片段的部分是人源化的，保留对靶抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，使用亲本序列和人源化序列的三维模型，通过分析亲本序列和多种构思性人源化产物的过程，制备人源化抗体和抗体片段。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且是本领域技术人员熟悉的。说明并展示所选择候选免疫球蛋白序列的可能三维构象性结构的计算机程序是可获得的。对这些展示结果的检验允许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥作用中的可能角色，例如，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体序列和输入序列选出并且组合FR残基，从而实现想要的抗体或抗体片段特征，如对靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接并且基本上参与影响抗原结合作用。
人源化抗体或抗体片段可以保留与(例如，在本公开中的)原始抗体相似的抗原特异性，结合如本文所述的人肿瘤抗原的能力。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以具有改善的与如本文所述的肿瘤抗原或如本文所述的B细胞抗原结合的亲和力和/或特异性。在一些实施方案中，人源化抗体或抗体片段可以对如本文所述的肿瘤抗原或如本文所述的B细胞抗原的结合具有较低的亲和力和/或特异性。
在一个方面，本发明的抗原结合结构域以抗体或抗体片段的特定功能性特征或特性为特征。例如，在一个方面，本发明的包含抗原结合结构域的CAR部分特异性结合如本文所述的肿瘤抗原或如本文所述的B细胞抗原。
在一个方面，抗原结合结构域是片段，例如，单链可变片段(scFv)。在一个方面，如本文所述的抗肿瘤抗原结合结构域是Fv、Fab、(Fab')2、或双功能(例如双特异性)杂交分子抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.17,105(1987))。在一个方面，本发明的抗体及其片段以野生型的亲和力或增强的亲和力结合如本文所述的肿瘤抗原蛋白。
在一些情况下，scFv可以根据方法本领域已知的制备(参见，例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH区和VL区连接在一起产生scFv分子。ScFv分子包含长度和/或氨基酸组成优化的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以大大影响scFv的可变区怎样折叠并相互作用。实际上，如果使用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则防止链内折叠。还需要链间折叠以使这两个可变区一起形成有功能的表位结合位点。关于接头取向和大小的例子，参见，例如，Hollinger等人,1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448、美国专利公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，所述文献通过引用方式并入本文。
scFv可以在其VL区和VH区之间包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头序列包含成组的甘氨酸和丝氨酸重复序列如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一个实施方案中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ IDNO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变异性可以保留或增强活性，在活性研究中产生优越功效。
在另一个方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)、工程化的TCR或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。产生这类TCR的方法是本领域已知的。参见，例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy 7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther 11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.19(4):365-74(2012)(参考文献通过引用的方式完整并入)。例如，可以工程化scTCR为含有接头(例如，柔性肽)连接的来自T细胞克隆的Vα基因和Vβ基因。这种方法对本身为细胞内，然而这类抗原(肽)的片段由MHC呈递在癌细胞表面上的癌相关靶非常有用。
在一个方面，CAR的抗原结合结构域包含与本文所述的抗原结合结构域氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且抗原结合结构域保留本文所述的抗原结合结构域的所需功能特性。
在一个具体方面中，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在又一个方面，抗体片段包含scFv。在又一个方面，抗体片段仅包含可变重链(VH)。
在多个方面，CAR的抗原结合结构域通过以下方式工程化：修饰在一个或两个可变区(例如，VH和/或VL)内部，例如，一个或多个CDR区内部和/或一个或多个框架区内部的一个或多个氨基酸。在一个具体方面中，本发明的CAR组合物包含抗体片段。在又一个方面，抗体片段包含scFv。
本领域普通技术人员将理解，还可以修饰本发明的抗体或抗体片段，从而它们在氨基酸序列方面变动(例如，相对于野生型)，但是在所需的活性方面无变动。例如，可以对蛋白质进行额外的核苷酸替换，所述核苷酸替换导致“非必需”氨基酸残基处的氨基酸置换。例如，分子中的非必需氨基酸残基可以替换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在另一个实施方案中，一段氨基酸可以替换为侧链家族成员的顺序和/或组成方面不同的结构上相似的氨基酸段，例如，可以进行保守性置换，其中某个氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。
本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸家族，所述侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情境下，同一性百分数指相同的两个或更多个序列。如果在比较窗口或指定区域范围内为最大对应性而进行比较和比对时，如使用以下序列比较算法之一或通过手工比对和目视审查所测量，两个序列具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域范围内或当未指定时在整个序列范围内60％同一性，任选地70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性)，则这两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域内，或更优选地在长度100到500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域内。
对于序列比较，一般地一个序列充当与检验序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将检验序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定备选参数。基于程序参数，序列比较算法随后相对于参考序列计算检验序列的序列同一性百分数。用于比对序列以比较的方法是本领域熟知的。用于比较的最佳序列比对可以按如下方式进行，例如通过Smith和Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGenetics软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或通过手工比对和目视审查(参见，例如，Brent等人,(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分数的两个算法例子是BLAST算法和BLAST 2.0算法，它们分别在Altschul等人,(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402；和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中描述。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。
还可以使用采用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法，(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17)确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。此外，可以使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可获得)，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
在一个方面，本公开构思了产生功能上等同分子的起始抗体或片段(例如，scFv)氨基酸序列修饰。例如，可以修饰CAR中包含的针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的VH或VL，以保留针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域(例如，scFv)的起始VH或VL框架区的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。本发明构思对完整CAR构建体的修饰，例如，在CAR构建体的各种结构域的一种或多种氨基酸序列中的修饰，旨在产生功能上等同的分子。可以修饰CAR构建体以保留起始CAR构建体的至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
双特异性CAR
在一个实施方案中，多特异性抗体分子为双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子以针对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和针对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列为特征。在一个实施方案中，第一和第二表位在相同抗原(例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白的亚基))上。在一个实施方案中，第一和第二表位重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位不重叠。在一个实施方案中，第一和第二表位在不同抗原(例如，不同蛋白质(或多聚体蛋白的不同亚基))上。在一个实施方案中，双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序以及针对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半抗体和针对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段和针对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中双特异性抗体分子包含针对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段和针对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在某些实施方案中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。产生双特异性或异二聚抗体分子的方案是本领域已知的；包括但不限于，例如，“杵入臼”方案，例如在US 5731168中描述；静电导引Fc配对，例如，如WO 09/089004、WO 06/106905和WO2010/129304中所述；链交换工程化的结构域(SEED)异二聚体形成，例如，如WO 07/110205中所述；Fab臂交换，例如，如WO 08/119353、WO 2011/131746和WO 2013/060867中所述；双抗体缀合物，例如，使用具有胺反应基团和硫氢基反应基团的异双官能试剂，通过抗体交联以产生双特异性结构，例如，如US 4433059中所述；通过以下方式产生的双特异性抗体决定簇：借助两条重链之间二硫键的还原和氧化循环重组来自不同抗体的半抗体(重链-轻链对或Fab)，例如，如US 4444878中所述；三功能抗体，例如，通过巯基反应基团交联的三个Fab片段，例如，如US5273743中所述；生物合成性结合蛋白，例如，通过C末端尾部、优选地通过二硫键或胺反应性化学交联作用交联的一对scFvs，例如，如US5534254中所述；双功能抗体，例如，通过已经替换恒定结构域的亮氨酸拉链(例如，c-fos和c-jun)二聚化的具有不同结合特异性的Fab片段，例如，如US5582996中所述；双特异性和寡特异性单价和寡价受体，例如，经一种抗体的CH1区和另一种抗体的VH区(一般具有缔合的轻链)之间的多肽间隔团连接的两种抗体(两个Fab片段)的VH-CH1区域，例如，如US5591828中所述；双特异性DNA-抗体缀合物，例如，通过双链DNA片段交联抗体或Fab片段，例如，如中US5635602所述；双特异性融合蛋白，例如，在两个scFv和完整恒定区域之间具有亲水螺旋肽接头的含有两个scFv的表达构建体，例如，如US5637481中所述；多价和多特异性结合蛋白，例如，多肽的二聚体，所述多肽具有含有Ig重链可变区的结合区的第一结构域和含有Ig轻链可变区的结合区的第二结构域，总体上称作双体抗体(还涵盖产生双特异性、三特异性或四特异性分子的高级结构)，例如，如US5837242中所述；VL链和VH链连接的迷你抗体构建体，其还借助肽间隔团连接至抗体铰链区和CH3区，所述迷你抗体构建体可以二聚化以形成双特异性/多价分子，例如，如US5837821中所述；在任一个方向与短肽接头(例如，5或10个氨基酸)连接或根本没有接头的VH结构域和VL结构域，所述VH结构域和VL结构域可以形成二聚体以形成双特异性双体抗体；三聚体和四聚体，例如，如US5844094中所述；一系列通过肽键以可交联基团在C末端连接的VH结构域(或家族成员中的VL结构域)，所述结构域进一步与VL结构域缔合以形成一系列FV(或scFv)，例如，如US5864019中所述；和将VH结构域和VL结构域均通过肽接头连接的单一链结合多肽借助非共价交联或化学交联并入多价结构以使用scFV或双体抗体类型样式，形成例如同源双价、异源双价、三价和四价结构，例如，如US5869620中所述。额外的示例性多特异性和双特异性分子和产生这些分子的方法存在于例如以下申请中：US5910573，US5932448，US5959083，US5989830，US6005079，US6239259，US6294353，US6333396，US6476198，US6511663，US6670453，US6743896，US6809185，US6833441，US7129330，US7183076，US7521056，US7527787，US7534866，US7612181，US2002004587A1，US2002076406A1，US2002103345A1，US2003207346A1，US2003211078A1，US2004219643A1，US2004220388A1，US2004242847A1，US2005003403A1，US2005004352A1，US2005069552A1，US2005079170A1，US2005100543A1，US2005136049A1，US2005136051A1，US2005163782A1，US2005266425A1，US2006083747A1，US2006120960A1，US2006204493A1，US2006263367A1，US2007004909A1，US2007087381A1，US2007128150A1，US2007141049A1，US2007154901A1，US2007274985A1，US2008050370A1，US2008069820A1，US2008152645A1，US2008171855A1，US2008241884A1，US2008254512A1，US2008260738A1，US2009130106A1，US2009148905A1，US2009155275A1，US2009162359A1，US2009162360A1，US2009175851A1，US2009175867A1，US2009232811A1，US2009234105A1，US2009263392A1，US2009274649A1，EP346087A2，WO0006605A2，WO02072635A2，WO04081051A1，WO06020258A2，WO2007044887A2，WO2007095338A2，WO2007137760A2，WO2008119353A1，WO2009021754A2，WO2009068630A1，WO9103493A1，WO9323537A1，WO9409131A1，WO9412625A2，WO9509917A1，WO9637621A2，，WO9964460A1。上文所提及申请的内容是通过引用方式完整地并入本文。
在双特异性抗体分子的每种抗体或抗体片段(例如，scFv)内部，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)设置成其VH(VH1)在其VL(VL1)上游并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)设置成其VL(VL2)在其VH(VH2)上游，从而整个双特异性抗体分子具有布局VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施方案中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)设置成其VL(VL1)在其VH(VH1)上游并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)设置成其VH(VH2)在其VL(VL2)上游，从而整个双特异性抗体分子具有布局VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，接头设置在二个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如，如果构建体设置为VH1-VL1-VL2-VH2，则设置在VL1和VL2之间，或如果构建体设置为VL1-VH1-VH2-VL2，则设置在VH1和VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如，(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6、优选地4(SEQ ID NO:80)。通常而言，二个scFv之间的接头应当长到足以避免二个scFv的结构域之间错误配对。任选地，接头设置在第一scFv的VL和VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL和VH之间。在具有多个接头的构建体中，任何两个或更多个接头可以是相同或不同的。因此，在一些实施方案中，双特异性CAR按照如本文所述的布局包含多个VL、多个VH和任选地一个或多个接头。
在一个方面，本发明提供嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含双特异性抗原结合结构域、(例如，如本文所述的)跨膜结构域和(例如，如本文所述的)胞内信号传导结构域。在实施方案中，双特异性抗原结合结构域包含结合(例如，如本文所述的)B细胞抗原的第一免疫球蛋白可变结构域序列，例如，scFv(或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR)，例如，(本文(例如，在表6或表12中)所述的CD19结合结构域或BCMA结合结构域)，并包含对本文所述的一种或多种肿瘤抗原(例如，实体瘤抗原)具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列，例如，scFv(或包含来自本文所述的scFv的轻链CDR和/或重链CDR)，例如，例如包含如本文所述的scFv，例如包含(例如，如表2或表5中所述的)间皮素结合结构域或EGFRvIII结合结构域。在实施方案中，双特异性抗原结合结构域包含本文所述的CD19结合结构域和本文所述的间皮素结合结构域。在实施方案中，双特异性抗原结合结构域包含本文所述的BCMA结合结构域和本文所述的间皮素结合结构域。在实施方案中，双特异性抗原结合结构域包含本文所述的CD19结合结构域和本文所述的EGFRvIII结合结构域。在实施方案中，双特异性抗原结合结构域包含本文所述的BCMA结合结构域和本文所述的EGFRvIII结合结构域。在另一个方面，本发明提供例如本文所述的细胞(例如，细胞群体)，例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞，其经工程化以表达(例如，包含)如本文所述的双特异性CAR，例如，包含本文所述的B细胞抗原结合结构域和本文所述的肿瘤抗原(例如，实体瘤抗原)结合结构域的双特异性CAR。不受任何理论约束，认为表达这类双特异性CAR(例如，包含(例如，如本文所述的)B细胞抗原结合结构域和(例如，如本文所述的)肿瘤抗原结合结构域)的细胞可用于本文所述的方法和组合物中。
嵌合TCR
在一个方面，可以将本文所述的例如在本文各表中提供的抗原结合结构域，例如，抗体和抗体片段，移植到T细胞受体(“TCR”)链(例如，TCRα链或TCRβ链)的一个或多个恒定结构域，以产生对本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原具有结合特异性的嵌合TCR。不受理论束缚，相信嵌合TCR将在抗原结合后通过TCR复合物发出信号。例如，可以将如本文中公开的间皮素或CD19scFv或其片段，例如，VL结构域，或VH结构域，移植到TCR链(例如，TCRα链和/或TCRβ链)的恒定结构域，例如，胞外恒定结构域、跨膜结构域和胞质结构域的至少一部分。作为另一个例子，可以将抗体或抗体片段的CDR，例如，如本文提供的各表中所述的任何抗体或抗体片段的CDR，移植入TCRα链和/或β链，以产生与本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原特异性结合的嵌合TCR。例如，本文公开的LCDR可以移植到TCRα链的可变结构域中，并且本文公开的HCDR可以移植到TCRβ链的可变结构域，反之亦然。这样的嵌合TCR可以通过本领域已知的方法产生(例如，Willemsen RA等人,Gene Therapy 2000；7:1369–1377；Zhang T等人,Cancer Gene Ther 2004；11:487–496；Aggen等人,Gene Ther.2012Apr；19(4):365-74)。
跨膜结构域
就跨膜结构域而言，在多种实施方案中，CAR(例如，TA CAR和/或BCA CAR)可以旨在包含与CAR的胞外结构域(如，抗原结合结构域)连接的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括一个或多个与跨膜区毗邻的额外氨基酸，例如，一个或多个与衍生跨膜区的蛋白质的胞外区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个直至15个胞外区氨基酸)和/或一个或多个与衍生跨膜蛋白的蛋白质的胞内区相关的氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个至多15个胞内区氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与CAR的其他结构域之一缔合的结构域。例如，跨膜结构域来自与胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域)相同的蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最大限度减少与受体复合体的其他构件的相互作用。在一个方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞表面上的另一个CAR同型二聚化。在一个不同方面，可以修饰或置换跨膜结构域的氨基酸序列，从而最大限度减少与表达CAR的相同细胞中存在的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以衍生自天然来源或重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR已经与靶结合时，跨膜结构域就能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以包含例如以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情况下，跨膜结构域可以借助铰链区(例如，来自人蛋白质的铰链区)与CAR的胞外区(例如，CAR的抗原结合结构域)连接。例如，在一个实施方案中，铰链区可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链区，例如，IgG4铰链区，或CD8a铰链区。在一个实施方案中，铰链区或间隔团包含(例如，由其组成)SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个方面，跨膜结构域包含SEQ IDNO:12的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一个方面，铰链区或间隔区包含IgG4铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔团包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:6的铰链区。在一些实施方案中，铰链区或间隔团包含由SEQ ID NO:7的核苷酸序列编码的铰链区。在一个方面，铰链区或间隔区包含IgD铰链区。例如，在一个实施方案中，铰链区或间隔团包含具有氨基酸序列SEQ ID NO:8的铰链区。在一些实施方案中，铰链区或间隔团包含由SEQ ID NO:9的核苷酸序列编码的铰链区。
在一个方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下它将包含优势疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。在一个方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸三联体可以在重组跨膜结构域的每个末端存在。
任选地，2和10个氨基酸长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域和胞质区域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。例如，在一个方面，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)。在一些实施方案中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。
在一个方面，铰链区或间隔区包含KIR2DS2铰链区。
胞质结构域
CAR(例如，TA CAR和/或BCA CAR)的胞质结构域或区域包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域通常负责活化其中已经引入CAR的免疫细胞的多项正常效应子功能的至少之一。术语“效应子功能”指细胞的特化功能。T细胞的效应子功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”指传导效应子功能信号并且指导细胞执行特化功能的蛋白质部分。尽管通常可以使用完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下不需要使用完整链。使用胞内信号传导结构域的截短部分到这样的程度：从而可以使用这种截短的部分替代完整链，只要它传导效应子功能信号即可。术语“胞内信号传导结构域”因此意在包括胞内信号传导结构域的足以传导效应子功能信号的任何截短部分
用于本发明CAR中的胞内信号传导结构域的例子包括协同发挥作用以在抗原受体接合后启动信号转导的T细胞受体(TCR)和辅受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
已知单独通过TCR生成的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级和/或共刺激信号。因此，据称T细胞活化可以由两类不同的胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式发挥作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激性方式发挥作用的初级胞内信号传导结构域可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。
在本发明中特别有用的含有ITAM的主要胞内信号传导结构域的实例包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(也称为“ICOS”)、FcεRI、DAP10、DAP12和CD66d的那些。在一个实施方案中，本发明的CAR包含胞内信号传导结构域，例如，CD3-ζ(例如，本文所述的CD3-ζ序列)的初级信号传导结构域。
在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如，如与天然ITAM结构域相比具有改变(例如，增加或减少)的活性的突变ITAM结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含了含有修饰的ITAM的初级胞内信号传导结构域，例如，含有优化和/或截短的ITAM的初级胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个ITAM基序。
CAR的胞内信号传导结构域可以包含本身CD3-ζ信号传导结构域，或它可以与本发明CAR背景下有用的任何其他所需的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导结构域。共刺激信号传导结构域指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激性分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。这类分子的例子包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等。例如，CD27共刺激作用已经证实在体外增强人CART细胞的扩充、效应子功能和存活并且在体内增进人T细胞留存和抗肿瘤活性(Song等人,Blood.2012；119(3):696-706)。共刺激分子的其他例子包括I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、NK细胞活化受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。
在本发明CAR的胞质部分内部的胞内信号传导序列可以彼此按随机顺序或指定顺序连接。任选地，例如2个和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)长度之间的短寡聚物接头或多肽接头可以在胞内信号传导序列之间形成连接。在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作合适的接头。在一个实施方案中，单个氨基酸，例如，丙氨酸、甘氨酸，可以用作合适的接头。
在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域。在一个实施方案中，两个或更多个(例如，2、3、4、5或更多个)共刺激信号传导结构域由接头分子(例如，本文所述的接头分子)分隔。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施方案中，接头是丙氨酸残基。
在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一个方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一个方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。
在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个方面，CD27的信号传导结构域包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列。在一个方面，CD27的信号传导结构域由SEQ ID NO:17的核酸序列编码。
在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一个方面，CD28的信号传导结构域包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列。在一个方面，CD28的信号传导结构域由SEQ ID NO:45的核酸序列编码。
在一个方面，胞内信号传导结构域旨在包含CD3-ζ的信号传导结构域和ICOS的信号传导结构域。在一个方面，ICOS的信号传导结构域包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一个方面，ICOS的信号传导结构域由SEQ ID NO:43的核酸序列编码。
在一个方面，本发明(例如，本文所述)的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)包含TA CAR，其包含结合本文所述的靶肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，和BCA CAR，其包含结合本文所述的靶B细胞抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在其他方面，本发明(例如，本文所述)的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)包含TA CAR，其包含结合本文所述的靶肿瘤抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域、初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域，和BCA CAR，其包含结合本文所述的靶B细胞抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域，但是不包含初级信号传导结构域。不受理论约束，认为提供包含共刺激信号传导结构域、但是不包含初级信号传导结构域的BCA CAR可以允许本发明的细胞响应于循环型B细胞持续存在和或增殖，但是可以最大限度减少对所述B细胞的细胞毒性。
在一个方面，本文所述的表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)还可以包含另一个TA CAR，例如，另一个包含例如针对相同靶或不同靶(例如，除本文所述的肿瘤抗原或本文所述的不同肿瘤抗原之外的靶)的不同抗原结合结构域的TA CAR。例如，在其中本发明细胞表达第二TA CAR的一个实施方案中，第二TA CAR包含针对与第一TA CAR所靶向的肿瘤抗原相同的癌细胞类型所表达的靶的抗原结合结构域。在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含第一TA CAR，其靶向第一肿瘤抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但是不包含初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域，和第二TA CAR，其靶向第二种不同的肿瘤抗原并且包含具有初级信号传导结构域但是不包含共刺激信号传导结构域的胞内信号传导结构域。不希望受理论约束的同时，将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)安置到第一TA CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)安置在第二TA CAR上可以限制CAR对表达两种靶的细胞的活性。在一个实施方案中，本发明的细胞包含第一肿瘤抗原(TA)CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结构域、跨膜结构域和共刺激结构域，和第二TA CAR，其靶向不同抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的细胞包含(即，经基因工程化以表达)第一TA CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域，和第二TA CAR，其靶向除第一靶抗原之外的肿瘤抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。在另一个实施方案中，本发明的细胞包含(即，经基因工程化以表达)第一TA CAR，其包含结合本文所述靶抗原的抗原结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域，和第二TA CAR，其靶向除第一靶抗原之外的肿瘤抗原(例如，与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对该抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。在其中第一和第二TA CAR均包含共刺激信号传导结构域的实施方案中，第一TA CAR和第二TA CAR的共刺激信号传导结构域可以衍生自相同的蛋白质，例如，衍生自本文所述的共刺激蛋白，例如，4-1BB、CD28或ICOS。在其他实施方案中，第一TA CAR和第二TA CAR的共刺激信号传导结构域可以衍生自不同的蛋白质，例如，第一TA CAR包含本文所述(例如，4-1BB)的共刺激信号传导结构域，并且第二TA CAR包含本文所述(例如，CD28)的不同的共刺激信号传导结构域。
在一个实施方案中，表达CAR的细胞包含本文所述的TA CAR、本文所述的BCA CAR和抑制性CAR。在一个实施方案中，抑制性CAR包含结合抗原的结合结构域，所述抗原存在于正常细胞上，但不存在于癌细胞上，例如，存在于还表达TA CAR所靶向的肿瘤抗原的正常细胞上。在一个实施方案中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域，跨膜结构域和胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ的细胞内结构域。
在一个实施方案中，不同CAR(例如，TA CAR和BCA CAR)的抗原结合结构域可以是这样的，从而抗原结合结构域彼此不相互作用。例如，表达第一和第二CAR的细胞可以具有第一CAR的抗原结合结构域，例如，作为不与第二CAR的抗原结合结构域形成缔合的片段(例如，scFv)，例如，第二CAR的抗原结合结构域是VHH。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包含单结构域抗原结合(SDAB)分子，包括其互补决定区是单结构域多肽的一部分的分子。实例包括但不限于重链可变结构域，天然缺乏轻链的结合分子，衍生自常规4-链抗体的单结构域，工程化结构域和除抗体衍生的那些支架以外的单结构域支架。SDAB分子可以是现有技术的任何分子，或将来的任何单结构域分子。SDAB分子可以衍生自任何物种，包括但不限于小鼠，人，骆驼，骆马，七鳃鳗，鱼，鲨鱼，山羊，兔和牛。这个术语还包括来自骆驼和鲨鱼之外的物种中的天然存在的单结构域抗体分子。
在一个方面，SDAB分子可以衍生自鱼类中存在的免疫球蛋白的可变区，如，例如，从鲨鱼血清中存在的称作新抗原受体(NAR)的免疫球蛋白同种型衍生的那种可变区。产生从NAR可变区衍生的单结构域分子(“IgNAR”)的方法在WO 03/014161和Streltsov(2005)Protein Sci.14:2901-2909中描述。
根据另一个方面，SDAB分子是天然存在的单结构域抗原结合分子，称作缺少轻链的重链。这类单结构域分子例如在WO 9404678和Hamers-Casterman,C.等人,(1993)Nature363:446-448中公开。为了清楚起见，衍生自天然缺乏轻链的重链分子的这种可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体，以将其与四链免疫球蛋白的常规VH区分开。这种VHH分子可以衍生自骆驼属(Camelidae)物种，例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链分子；这类VHH处于本发明的范围内。
SDAB分子可以是重组的、经CDR移植、人源化、骆驼化、去免疫化和/或在体外生成(例如，通过噬菌体展示法选择)。
还已经发现，具有多个膜包埋嵌合受体(所述受体包含在所述受体的抗原结合结构域之间的相互作用的抗原结合结构域)的细胞可能是不期望，例如因为其抑制一种或多种抗原结合结构域结合其同源抗原的能力。因此，本文公开了具有第一和第二非天然存在的膜包埋嵌合受体的细胞，所述受体包含最大限度减少这种相互作用的抗原结合结构域。本文还公开了编码第一和第二非天然存在的膜包埋嵌合受体的核酸，所述受体包含最大限度减少这类相互作用的抗原结合结构域，以及制备和使用这些细胞和核酸的方法。在一个实施方案中，所述第一和所述第二非天然存在的膜包埋嵌合受体之一的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单个VH结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单一VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单一VH结构域。
在一些实施方案中，要求保护的发明包含第一和第二CAR(例如，TA CAR和BCACAR)，其中第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域不包含可变轻链结构域和可变重链结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域是scFv，并且另一个不是scFv。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含单一V H结构域，例如驼类、鲨鱼或七鳃鳗单一VH结构域，或衍生自人或小鼠序列的单一VH结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含单一VH结构域，例如骆类、鲨鱼或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单一VH结构域。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含纳米抗体。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR之一的抗原结合结构域包含scFv，并且另一个包含驼类VHH结构域。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面时，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合没有因第二CAR的存在而基本上不减少。在某些实施方式中，在第二CAR存在下，第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合作用是在第二CAR不存下第一CAR的抗原结合结构域与其同源抗原的结合作用的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在一些实施方案中，当存在于细胞表面上时，第一CAR和第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者均为scFv抗原结合结构域时的缔合。在某些实施方式中，所述第一CAR和所述第二CAR的抗原结合结构域彼此缔合少于如果两者都为scFv抗原结合结构域时的85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在另一个方面，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞的活性的物质。例如，在一个实施方案中，物质可以是抑制了抑制性分子的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，PD1)可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。
在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文所述的分子，例如，包含第一多肽(例如，抑制性分子)的物质，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，该物质包含例如抑制性分子的第一多肽，所述抑制性分子为例如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷和TGFβ或这些任何一种的片段(例如，这些任一个的细胞外结构域的至少一部分)，和第二多肽，其是本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，(例如，本文所述的)41BB、CD27或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该物质包含PD1或其片段(例如，PD1的胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，和本文所述的胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。PD1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞，T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人.1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示与PD1结合时，针对PD1、PD-L1和PD-L2的两种配体下调T细胞活化(Freeman等人,2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001 Nat Immunol 2:261-8；Carter等人,2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人.2003J Mol Med 81:281-7；Blank等人.2005CancerImmunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人.2004Clin Cancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。
在一个实施方案中，该物质包含抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD1))的胞外结构域(ECD)，其与跨膜结构域和胞内信号传导结构域如41BB和CD3ζ融合(本文也称作PD1CAR)。在一个实施方案中，与本文所述的XCAR组合使用时，PD1 CAR改善T细胞的留存。在一个实施方案中，CAR是PD1 CAR，其包含如SEQ ID NO:26中加下划线所示的PD1的胞外结构域。在一个实施方案中，PD1 CAR包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一个实施方案中，PD1CAR包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
在一个实施方案中，该物质包含编码PD1 CAR的核酸序列(例如，本文所述的PD1CAR)。在一个实施方案中，PD1 CAR的核酸序列作为表1中的SEQ ID NO:27显示，PD1 ECD的序列加下划线。
在另一个方面，本公开提供表达CAR的细胞群体。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群体包含表达不同CAR的细胞的混合物。例如，在一个实施方案中，CART细胞群体可以包含第一细胞，其表达具有针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，和第二细胞，其表达具有不同抗原结合结构域的CAR，所述不同抗原结合结构域例如针对本文所述的不同肿瘤抗原的抗原结合结构域，例如，针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域，该肿瘤抗原与由第一细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合的肿瘤抗原不同。作为另一个例子，表达CAR的细胞的群体可以包含第一细胞，其表达了包含针对如本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR；和第二细胞，其表达了包含针对如本文所述的肿瘤抗原之外的靶的抗原结合结构域的CAR。在一个实施方案中，表达CAR的细胞的群体包含表达下述CAR的第一细胞，所述CAR包含初级胞内信号传导结构域，和表达下述CAR的第二细胞，所述CAR包括次级信号传导结构域。
在另一个方面，本公提供这样的细胞群体，其中群体的至少一个细胞表达具有针对本文所述的肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，和这样的第二细胞，其表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。例如，在一个实施方案中，物质可以是抑制了抑制性分子的物质。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，PD-1)可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。在一个实施方案中，对抑制性分子抑制的物质例如是本文所述的分子，例如，包含第一多肽(例如，抑制性分子)的物质，所述第一多肽与提供正向信号给细胞的第二多肽(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)缔合。在一个实施方案中，该物质包含例如抑制性分子的第一多肽，所述抑制性分子例如为PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类，MHC II类，GAL9，腺苷和TGFβ或前者任一种的片段，和第二多肽，其是本文所述的胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，(例如，本文所述的)41BB、CD27、OX40或CD28)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的CD3ζ信号传导结构域)。在一个实施方案中，该物质包含PD-1或其片段的第一多肽和本文所述胞内信号传导结构域(例如，本文所述的CD28信号传导结构域和/或本文所述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
在一个方面，本公开提供这样的方法，所述方法包括与另一种物质(例如，激酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合施用表达CAR的细胞的群体，例如，表达不同CAR的细胞的混合物。在另一个方面，本公提供这样的方法，所述方法包括与另一种物质(例如，激酶抑制剂，如本文所述的激酶抑制剂)组合施用细胞的群体，其中该群体的至少一个细胞表达具有本文所述肿瘤抗原的抗原结合结构域的CAR，和这样的第二细胞，其表达另一种物质，例如，增强表达CAR的细胞活性的物质。
示例性CAR分子
在一个方面，BCA CAR包括这样的CAR分子，其包含与B细胞抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，BCA CAR包括了包含CD19抗原结合结构域(例如，与CD19特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。
表10中提供本文所述的BCA CAR的示例性CAR分子。表10中的CAR分子包含CD19抗原结合结构域，例如，表6中提供的任何CD19抗原结合结构域的氨基酸序列。
表10.示例性CD19 CAR分子
在一个实施方案中，BCA CAR的CAR分子包含如2014年3月15日提交的国际公开号WO2014/153270的表10中或表3中提供的氨基酸序列(例如，由其组成)；所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，BCA CAR的CAR分子包含SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:281的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280或SEQ ID NO:281的氨基酸序列的至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50、或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)；或与SEQ IDNO:269、SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ IDNO:280或SEQ ID NO:281的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，例如，由这些序列组成。
在一个方面，BCA CAR包括这样的CAR分子，其包含与B细胞抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，BCA CAR包括了这样的CAR分子，其包含BCMA抗原结合结构域(例如，与BCMA(例如，人BCMA)特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)。
在WO2016/014565的表16或表1中或如本文另外所述那样提供本文所述的BCA CAR的示例性CAR分子。表16中的CAR分子包含BCMA抗原结合结构域，例如，表12或表13中提供的任何BCMA抗原结合结构域的氨基酸序列。
表16：示例性BCMA CAR分子。提供具有前导序列的序列。
在一个实施方案中，BCA CAR的CAR分子包含WO2016/014565的表16或表1中或如本文另外所述那样提供的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一个实施方案中，BCA CAR的CAR分子包含(例如，由其组成)SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQ IDNO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQ IDNO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQ IDNO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998或SEQ ID NO:999的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998或SEQ ID NO:999的氨基酸序列的至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50、或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)；或与SEQ IDNO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ ID NO:956、SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ IDNO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ ID NO:982、SEQ ID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ IDNO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ ID NO:993、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ IDNO:997、SEQ ID NO:998或SEQ ID NO:999的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含这样的TACAR分子，其包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，TA CAR包括了包含间皮素抗原结合结构域(例如，与间皮素特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。
本文中描述并在表11中提供靶向间皮素的示例性TA CAR分子。表11中的CAR分子包含间皮素抗原结合结构域，例如，表2中提供的任何间皮素抗原结合结构域的氨基酸序列。前导序列为粗体及加下划线，CDR加下划线，并且抗原结合区的重链和轻链之间的接头序列加灰色阴影。
表11：示例性间皮素CAR分子
在一个实施方案中，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含结合间皮素的TA CAR分子，并且包含(例如，由其组成)如2014年12月19日提交的国际公开号WO2015/090230的表11和表2中提供的氨基酸序列；所述文献通过引用方式并入本文。在一个实施方案中，TA CAR分子包含(例如，由其组成)SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ IDNO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ IDNO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305或SEQ IDNO:306的氨基酸序列；或这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有SEQ ID NO:282、SEQ IDNO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ IDNO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ IDNO:305或SEQ ID NO:306的氨基酸序列的至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50、或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)；或与SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ IDNO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ ID NO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ IDNO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ ID NO:305或SEQ ID NO:306的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含这样的TACAR分子，其包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，TA CAR包括了包含EGFRvIII抗原结合结构域(例如，与EGFRvIII特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。
本文中描述并在WO/2014/130657的或如WO2016/014789中所述的表17中或表2中提供靶向EGFRvIII的示例性TA CAR分子。
表17.人源化EGFRvIII CAR构建体。序列设有前导序列，并且CDR加下划线。Nt代表核酸并且aa代表氨基酸
在一个实施方案中，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含结合EGFRvIII的TA CAR分子，所述分子包含(例如，由其组成)如表17中提供的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合EGFRvIII的TA CAR包含(例如，由其组成)SEQ ID NO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090或SEQ ID NO:1096的氨基酸序列；或具有SEQ IDNO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ IDNO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090或SEQ ID NO:1096的氨基酸序列中至少一个、二个、三个、四个、五个、10、15、20或30个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)但不多于60、50或40个修饰(例如，置换，例如，保守性置换)的氨基酸序列；或与SEQ IDNO:1043、SEQ ID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ IDNO:1073、SEQ ID NO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090或SEQ ID NO:1096的氨基酸序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。
在一个方面，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含这样的TACAR分子，其包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，TA CAR包括了包含CD123抗原结合结构域(例如，与CD123特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。
本文中描述并在WO2016/028896的表2、表6和表9中提供靶向CD123的示例性TACAR分子。WO/2014/130635(例如，WO/2014/130635的表1)中描述了靶向CD123的其他示例性TA CAR分子。WO/2014/144622中描述了靶向CD123的其他示例性TA CAR分子。
在一个方面，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含这样的TACAR分子，其包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，TA CAR包括了包含CD33抗原结合结构域(例如，与CD33特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。本文中描述并在WO2016/014576中(例如，在WO2016/014576的表2中)提供靶向CD33的示例性TA CAR分子。
在一个方面，本发明的细胞(例如，包含TA CAR和BCA CAR的细胞)包含这样的TACAR分子，其包含与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，TA CAR包括了包含CLL-1抗原结合结构域(例如，与CLL-1特异性结合的鼠、人或人源化抗体或抗体片段)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域和/或初级信号传导结构域的胞内信号传导结构域)的CAR分子。本文中描述并在WO/2016/014535中(例如，在WO2016/014535的表2中)提供靶向CLL-1的示例性TA CAR分子。
天然杀伤细胞受体(NKR)CAR
在一个实施方案中，本文所述的CAR分子，例如，靶向肿瘤抗原的CAR分子(TA CAR)或靶向B细胞抗原的CAR分子(BCA CAR)，包含天然杀伤细胞受体(NKR)的一种或多种组分，因而形成NKR-CAR。NKR组分可以是以下任何天然杀伤细胞受体的跨膜结构域，铰链结构域或细胞质结构域：杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)，例如KIR2DL1、KIR2DL2/L3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、DIR2DS5、KIR3DL1/S1、KIR3DL2、KIR3DL3、KIR2DP1和KIR3DP1；天然细胞毒性受体(NCR)，例如，NKp30、NKp44、NKp46；免疫细胞受体的信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族，例如CD48、CD229、2B4、CD84、NTB-A、CRACC、BLAME和CD2F-10；Fc受体(FcR)，例如CD16和CD64；和Ly49受体，例如LY49A、LY49C。本文所述的NKR-CAR分子可与衔接子分子或细胞内信号传导结构域，例如DAP12相互作用。包含NKR组分的CAR分子的示例性构型和序列描述在国际公开号WO2014/145252中，其内容通过引用并入本文。
分裂的CAR
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞，例如，表达BCA CAR和TA CAR的细胞，使用分裂的CAR。分裂CAR方法在公开WO2014/055442和WO2014/055657中有更详细的描述，其通过引用并入本文。简而言之，分裂的CAR系统包含细胞，所述细胞表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如，41BB)的第一CAR，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和胞内信号传导结构域(例如，CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被激活并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，胞内信号传导结构域被激活并且细胞杀伤活性开启。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原存在下完全活化。在实施方案中，第一抗原结合结构域识别本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原，例如，包含本文所述的抗原结合结构域，和第二抗原结合结构域识别第二抗原，例如，本文所述的第二肿瘤抗原或第二B细胞抗原。
调节嵌合抗原受体的策略
存在可以调节CAR活性的许多方式。在一些实施方案中，可以控制CAR活性的可调节CAR(RCAR)是期望的，以优化CAR疗法的安全性和功效。例如，使用例如与二聚化结构域融合的胱天蛋白酶(参见例如，Di等人,N Engl.J.Med.2011Nov.3；365(18):1673-1683)的诱导性凋亡可以在本发明的CAR疗法中用作安全开关。在另一个实例中，表达CAR的细胞还可以表达诱导型胱天蛋白酶-9(iCaspase-9)分子，其在施用二聚体药物(例如，rimiducid(也称为AP1903(Bellicum Pharmaceuticals)或AP20187(Ariad))时导致胱天蛋白酶-9的激活和细胞凋亡。iCaspase-9分子含有在CID存在下介导二聚化的二聚化(CID)结合结构域的化学诱导剂。这导致表达CAR的细胞的可诱导和选择性耗尽。在一些情况下，iCaspase-9分子由独立于编码CAR的载体的核酸分子编码。在一些情况下，iCaspase-9分子由与编码CAR的载体的相同核酸分子编码。iCaspase-9可以提供安全开关，以避免表达CAR的细胞的任何毒性。参见例如Song等人.Cancer Gene Ther.2008；15(10):667-75；Clinical TrialId.No.NCT02107963；和Di Stasi等人.N.Engl.J.Med.2011；365:1673-83。
用于调节本发明的CAR疗法的备选策略包括利用失活或关闭CAR活化的小分子或抗体，例如，通过缺失表达CAR的细胞，例如通过诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由能够诱导细胞死亡的分子识别的抗原，例如ADCC或补体诱导的细胞死亡。例如，本文所述的表达CAR的细胞也可以表达能够被抗体或抗体片段靶向的受体。这些受体的实例包括EpCAM、VEGFR、整联蛋白(例如整联蛋白ανβ3、α4、αΙ3/4β3、α4β7、α5β1、ανβ3、αν)、TNF受体超家族成员(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2)、PDGF受体、干扰素受体、叶酸受体、GPNMB、ICAM-1、HLA-DR、CEA、CA-125、MUC1、TAG-72、IL-6受体、5T4、GD2、GD3、CD2、CD3、CD4、CD5、CD11、CD11a/LFA-1、CD15、CD18/ITGB2、CD19、CD20、CD22、CD23/lgE受体、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD41、CD44、CD51、CD52、CD62L、CD74、CD80、CD125、CD147/basigin、CD152/CTLA-4、CD154/CD40L、CD195/CCR5、CD319/SLAMF7和EGFR及其截短形式(例如，保留一个或多个细胞外表位但缺少胞质结构域内一个或多个区域的形式)。
例如，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达截短的表皮生长因子受体(EGFR)，其缺少信号传导能力，但保留由能够诱导ADCC的分子(例如西妥昔单抗)识别的表位，使得施用西妥昔单抗诱导ADCC并随后消耗表达CAR的细胞(参见例如WO2011/056894和Jonnalagadda等人,Gene Ther.2013；20(8)853-860)。另一个策略包括表达高度紧密的标记/自杀基因，所述基因将来自本文描述的表达CAR的细胞中CD32抗原和CD20抗原的结合利妥昔单抗的靶表位组合，导致选择性耗尽表达CAR的细胞，例如通过ADCC(参见例如Philip等人,Blood.2014；124(8)1277-1287)。用于耗尽本文所述的表达CAR的细胞的其它方法包括施用CAMPATH，其是单克隆抗CD52抗体，该抗体选择性结合并靶向成熟淋巴细胞例如表达CAR的细胞，例如通过诱导ADCC进行破坏。在其它实施方案中，可以使用CAR配体例如抗独特型抗体选择性靶向表达CAR的细胞。在一些实施方案中，抗独特型抗体可以引起效应细胞活性，例如ADCC或ADC活性，从而减少表达CAR的细胞的数目。在其它实施方案中，CAR配体，例如抗独特型抗体可以偶联至诱导细胞杀伤的试剂，例如毒素，从而减少表达CAR的细胞的数量。或者，CAR分子本身可以如此配置，从而可以调节活性，例如开启和关闭活性，如下所述。
在其它实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞还可以表达由T细胞耗尽剂识别的靶蛋白。在一个实施方案中，靶蛋白是CD20，T细胞耗尽剂是抗CD20抗体，例如利妥昔单抗。在这样的实施方案中，一旦需要减少或消除表达CAR的细胞，例如减轻CAR诱导的毒性，则施用T细胞耗尽剂。在其他实施方案中，T细胞耗尽剂是抗CD52抗体，例如，阿伦珠单抗(alemtuzumab)。
在其他实施方案中，RCAR包含一组多肽，在最简单的实施方案中一般两种多肽，其中本文所述的标准CAR的组件(例如，抗原结合结构域和胞内信号传导结构域)分配在分离的多肽或构件上。在一些实施方案中，该套多肽包括二聚化开关，其中存在二聚化分子时，所述二聚化开关可以使多肽彼此偶联，例如，可以使抗原结合结构域与胞内信号传导结构域偶联。本文中并在国际公开号WO 2015/090229(其因而通过引用方式完整并入)中提供了这类可调节CAR的附加描述和示例性结构。
CAR与趋化因子受体的共同表达
在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)还包含趋化因子受体分子。T细胞中转基因表达趋化因子受体CCR2b或CXCR2增强了向分泌CCL2或分泌CXCL1的实体瘤(包括黑素瘤和神经母细胞瘤)的运输(Craddock等人,JImmunother.2010Oct；33(8):780-8和Kershaw等人,Hum Gene Ther.2002Nov 1；13(16):1971-80)。因此，不希望受理论束缚，认为在表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)中表达的趋化因子受体(其识别由肿瘤，例如实体瘤分泌的趋化因子)可以改善表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)归巢到肿瘤中、促进表达CAR的细胞浸润至肿瘤，并增强表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)的抗肿瘤功效。趋化因子受体分子可以包含天然存在的或重组的趋化因子受体或其趋化因子结合片段。适用于在本文所述的表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)中表达的趋化因子受体分子包括CXC趋化因子受体(例如CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6或CXCR7)、CC趋化因子受体(例如CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10或CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如CX3CR1)、XC趋化因子受体(例如XCR1)或其趋化因子结合片段。在一个实施方案中，基于肿瘤分泌的趋化因子选择要用本文所述的CAR表达的趋化因子受体分子。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)还包含(例如，表达)CCR2b受体或CXCR2受体。在一个实施方案中，本文所述的CAR(例如，表达TACAR和BCA CAR的细胞)和趋化因子受体分子处于相同载体上或处于二个不同的载体上。在本文所述的CAR和趋化因子受体分子处于相同载体上的实施方案中，CAR(例如，表达TA CAR和BCA CAR的细胞)和趋化因子受体分子各自处于二个不同的启动子控制下或处于相同启动子控制下。
编码CAR的核酸构建体
本公开还提供编码一个或多个靶向本文所述的肿瘤抗原和/或B细胞抗原的CAR构建体的核酸分子。在一个方面，核酸分子作为信使RNA转录物提供。在一个方面，核酸分子作为DNA构建体提供。
因此，在一个方面，本发明涉及一种编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中CAR包含与本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原结合的抗原结合结构域、跨膜结构域(例如，本文所述的跨膜结构域)和胞内信号传导结构域(例如，本文所述的胞内信号传导结构域)，所述胞内信号传导结构域包括刺激性结构域，例如，共刺激信号传导结构域(例如，本文所述的共刺激信号传导结构域)和/或初级信号传导结构域(例如，本文所述的初级信号传导结构域，例如，本文所述的ζ链)。在一个实施方案中，跨膜结构域是选自以下蛋白质的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域可以包括至少例如以下蛋白质的跨膜区：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C。
在一个实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，抗原结合结构域通过铰链区(例如，本文所述的铰链区)与跨膜结构域连接。在一个实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:10或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，分离的核酸分子还包含编码共刺激结构域的序列。在一个实施方案中，共刺激结构域是选自以下的蛋白质的功能性信号传导结构域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。这类共刺激分子的其他例子包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKG2D和NKG2C。在一个实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:16的序列或与其具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含4-1BB的功能性信号传导结构域和CD3ζ的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16、42或44的序列或与其具有95-99％同一性的序列和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列或与其具有95-99％同一性的序列，其中包含胞内信号传导结构域的序列在相同可读框中表达并作为单条多肽链表达。
在另一个方面，本发明涉及编码CAR构建体的分离的核酸分子，所述CAR构建体包含SEQ ID NO:2的前导序列、如本文所述的scFv结构域、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQID NO:8或SEQ ID NO:10(或与其具有95-99％同一性的序列)的铰链区、具有SEQ ID NO:12的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的跨膜结构域、具有SEQ ID NO:14的序列的4-1BB共刺激结构域、具有SEQ ID NO:16的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD27共刺激结构域、具有SEQ ID NO:42的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的ICOS共刺激结构域或具有SEQ ID NO:44的序列的CD28共刺激结构域，和具有SEQ ID NO:18或SEQ IDNO:20的序列(或与其具有95-99％同一性的序列)的CD3ζ刺激性结构域。
编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞筛选文库，通过从已知包含该基因的载体衍生基因，或使用标准技术通过从含有该基因的细胞和组织直接分离。或者，可以合成产生，而不是克隆目的基因。
本公开还提供其中插入本公开核酸的载体。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。慢病毒载体具有胜过衍生自癌-逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体的附加优点，在于它们可以转导非增殖性细胞，如肝细胞。它们还具有附加的低免疫原性优点。
在另一个实施方案中，包含编码本发明所需的CAR的核酸的载体是腺病毒载体(A5/35)。在另一个实施方案中，可以使用转座子如睡美人转座子、crisper、CAS9和锌指核酸酶完成编码CAR的核酸的表达。参见下文June等人,2009Nature Reviews Immunology9.10:704-716，所述文献通过引用方式并入本文。
简言之，一般通过将编码CAR多肽或其部分的核酸有效连接至启动子并将构建体并入表达载体中，实现编码CAR的天然或合成性核酸的表达。载体可以适合在真核生物中复制和整合。常见的克隆载体含有用于调节所需核酸序列的表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
使用标准基因递送方案，本公开的表达构建体也可以用于核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，所述文献通过引用的方式完整并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了一种基因治疗载体。
可以将核酸克隆入众多类型的载体中。例如，可以将核酸克隆入包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特定意义的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。
另外，可以将表达载体以病毒载体的形式向细胞提供。病毒载体技术是本领域熟知的并且例如在Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)中及在其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物中有功能的复制起点、启动子序列、便利限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发众多基于病毒的用于转移基因至哺乳动物细胞中的系统。例如，逆转录病毒提供了用于基因递送系统的便利平台。可以使用本领域已知的技术，将选择的基因插入载体并且包装在逆转录病毒粒子中。随后可以分离重组病毒并将其在体内或离体输送至受试者的细胞。众多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。众多腺病毒载体是本领域已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。一般，这些位于起始位点上游30-110bp的区域内，不过已经显示众多启动子也在起始位点下游含有功能性元件。启动子元件之间的间距往往灵活，从而当各元件反转或相对于彼此移动时，启动子功能保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间距可以增加至相隔50bp。取决于启动子，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用以激活转录。示例性启动子包括CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、遍在蛋白C启动子或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
能够在哺乳动物T细胞中表达CAR编码核酸分子的启动子的实例是EF1a启动子。天然EF1a启动子驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达，其负责酶促输送氨酰基tRNA至核糖体。EF1a启动子已被广泛用于哺乳动物表达质粒，并且已被证明能有效驱动克隆到慢病毒载体中的核酸分子的CAR表达。参见，例如，Milone等人,Mol.Ther.17(8):1453–1464(2009)。一方面，EF1a启动子包含作为SEQ ID NO:1提供的序列。
启动子的另一个例子是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的组成型强启动子序列。但是，也可以使用其他组成型启动子序列、包括但不限于猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。还构思诱导型启动子作为本发明的部分。诱导型启动子的用途提供了一种分子开关，所述分子开关能够在需要这类表达时启动与之有效连接的多核苷酸序列表达或在不需要这类表达时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
启动子的另一个例子是磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在实施方案中，可能需要截短的PGK启动子(例如，当与野生型PGK启动子序列比较时，具有一个或多个，例如1,2,5,10,100,200,300,或400个核苷酸缺失的PGK启动子)。示例性PGK启动子的核苷酸序列在下面提供。
WT PGK启动子
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT(SEQID NO:101)
示例性截短的PGK启动子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG(SEQ ID NO:102)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG(SEQ ID NO:103)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG(SEQ ID NO:104)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG(SEQ ID NO:105)
载体还可以例如包括促进分泌的信号序列、多聚腺苷化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、允许附加体型复制并且在原核生物中复制的元件(例如SV40复制起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和/或允许选择的元件(例如，氨苄青霉素耐药基因和/或zeocin标记)。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以含有选择标记基因或报道基因或这两者以促进从寻求用病毒载体转染或感染的细胞群体鉴定和选择出表达的细胞。在其他方面，选择标记可以在独立的DNA片段上携带并且在共转染法中使用。选择标记和报道基因可以旁侧分布有能够在宿主细胞中实现表达的适宜调节序列。可用的选择标记例如包括抗生素耐药性基因，如neo等。
报道基因用于确定可能转染的细胞及评价调节序列的功能。通常，报道基因是这样的基因，所述基因不存在于接受生物或组织中或不由接受生物或组织表达并且编码其表达由某种轻易可检测特性(例如，酶活性)展示的多肽。在DNA已经引入接受细胞之后的合适时间测定报道基因的表达。合适的报道基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的并且可以使用已知技术制备或商业地获得。通常，将显示最高报道基因表达水平的具有最少5'侧翼区的结构鉴定为启动子。这类启动子区可以与报道基因连接并用来评价多种物质调节启动子驱动型转录的能力。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的CAR分子(例如，TA CAR和/或BCA CAR)的核酸序列的载体还可以包含编码多肽(例如，增加CAR分子活性的物质)的第二核酸序列。在一些实施方案中，单个核酸分子或包含所述核酸分子的载体编码本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR。在一些实施方案中，编码TA CAR的核酸在不同于编码BCA CAR的核酸的分开的调节控制(例如，通过本文所述的启动子)下。在其他实施方案中，两个或更多个核酸序列由单个核酸分子在相同可读框中和作为单条多肽链编码。在这个方面，两种或更多种CAR(例如，TA CAR和BCA CAR)例如可以由一个或多个肽剪切位点(例如，自剪切位点或胞内蛋白酶的底物)分隔。肽剪切位点的例子包括以下者，其中GSG残基是任选的：
T2A：(GSG)E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:106)
P2A：(GSG)A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO:107)
E2A：(GSG)Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:108)
F2A：(GSG)V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO:109)
向细胞引入基因并表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，载体可以通过本领域的任何方法轻易地引入宿主细胞(例如，哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞)中。例如，表达载体可以通过物理手段、化学手段或生物学手段转移至宿主细胞中。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、粒子轰击法、微量注射法、电穿孔法等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人,2012,MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL,第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。用于引入多核苷酸至宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染法或电穿孔法。
用于引入目的多核苷酸至宿主细胞中的生物学方法包括使用DNA载体和RNA载体。病毒载体和尤其逆转录病毒载体已经具有变成使用最广泛的将基因插入哺乳动物(例如，人细胞)的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。
用于引入多核苷酸至宿主细胞中的化学手段包括胶态分散体系，如大分子复合物、纳米囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载具的示例性胶态体系是脂质体(例如，人工膜囊泡)。现有定向递送核酸的其他方法是可获得的，如用导引的纳米粒子或其他合适的亚微米尺度递送系统递送多核苷酸。
在其中利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载具是脂质体。构思使用脂质制剂以引入核酸至宿主细胞中(体外，离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封于脂质体的水质内部、散布在脂质体的脂质双层内部、借助与脂质体和寡核苷酸均结合的连接分与脂质体连接、包埋于脂质体中、与脂质体复合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为混悬液含于脂质中、含于胶束中或与胶束复合或否则与脂质结合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体结合的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以在双层结构中存在、作为胶束存在或以“塌陷”结构存在。它们还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集物。脂质是可以是天然存在脂质或合成性脂质的脂肪性物质。例如，脂质包括天然出现在细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂族烃及其衍生物如脂肪酸、醇类、胺、氨基醇类和醛的化合物类。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,MO获得；二鲸蜡醇磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories获得(Plainview、NY)；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的母液可以贮存在约-20℃。使用氯仿作为唯一溶剂，因为它比甲醇更易蒸发。“脂质体”是概况性术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集物所形成的多种单一和多层脂质载体。脂质体可以表征作为具有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有水介质分隔的多个脂质层。当磷脂在过量水溶液中悬浮时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构前发生自我重排并在脂质双层之间夹带水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991 Glycobiology 5:505-10)。但是，还涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以采取胶束结构或仅作为脂质分子的非均匀聚集物存在。还构思了脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
无论用来将外源核酸引入宿主细胞或以其他方式将细胞暴露于本发明抑制剂的方法是什么，为了确认宿主细胞中重组DNA序列的存在，可以进行多种测定法。这类测定法例如包括本领域技术人员熟知的“分子生物分析”，如DNA印迹和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”分析，如检测特定肽的存在或不存在，例如，通过免疫手段(ELISA法和蛋白质印迹法)或通过本文所述测定法鉴定属于本发明范围内的物质。
本公开还提供一种载体，所述载体包含编码CAR的核酸分子。在一个实施方案中，载体包含(例如，如本文所述)编码TA CAR的核酸分子。在一个实施方案中，载体包含(例如，如本文所述)编码BCA CAR的核酸分子。在一个实施方案中，载体包含编码BCA CAR的核酸分子和编码TA CAR的核酸分子。在一个方面，可以将一个或多个CAR载体(例如，包含编码TACAR的核酸分子的载体和包含编码BCA CAR的核酸分子的载体，或包含编码TA CAR的核酸和编码BCA CAR的核酸的载体)直接转导入细胞，例如，T细胞或NK细胞。在一个方面，载体是克隆载体或表达载体，例如，载体，包括但不限于一种或多种质粒(例如，表达质粒、克隆载体、微环、微载体、双微小染色体)、逆转录病毒构建体和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)中表达CAR构建体。
在其中需要TA CAR和/或BCA CAR稳定表达的一个实施方案中，将包含编码TA CAR和/或BCA CAR的核酸分子的载体转导至免疫效应细胞中。例如，使用慢病毒载体，可以生成稳定表达TA CAR和BCA CAR的免疫效应细胞。显示出TA CAR和BCA CAR稳定表达的细胞在转导后至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、3月、6月、9月或12个月表达TA CAR和BCACAR。
在其中需要TA CAR和/或BCA CAR瞬时表达的一个实施方案中，将编码TA CAR和/或BCA CAR的核酸分子转染至免疫效应细胞中。编码TA CAR-和/或BCA CAR的核酸分子可以是包含编码TA CAR-和/或BCA CAR的核酸分子的载体或体外转录的编码TA CAR和/或BCACAR的RNA。下文进一步描述用于转染至免疫效应细胞中的体外转录的RNA CAR和方法。显示出TA CAR和/或BCA CAR瞬时表达的细胞在转染后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天表达TA CAR和/或BCA CAR。
RNA转染
本文中公开了用于产生体外转录的RNA CAR(例如，体外转录的RNA TA CAR和/或体外转录的RNA BCA CAR)的方法。本公开还包括编码CAR的可以直接转染至细胞中的RNA构建体。一种产生用于转染的mRNA的方法可以涉及用专门设计的引物体外转录(IVT)模板，随后添加聚腺苷酸，以产生含有3’和5’非翻译序列(“UTR”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(IRES)、待表达核酸和聚腺苷酸化尾(长度一般为50-2000个碱基(SEQ ID NO:32))的构建体。如此产生的RNA可以高效地转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括CAR的序列。
在一个方面，本公开的CAR，例如，TA CAR和/或BCA CAR，由信使RNA(mRNA)编码。在一个方面，将编码本文所述的TA CAR和/或本文所述的BCA CAR的mRNA引入T细胞或NK细胞以产生表达TA CAR和BCA CAR二者的细胞。
在一个实施方案中，可以将体外转录的RNA CAR作为瞬时转染的形式引入细胞。使用聚合酶链反应(PCR)生成的模板，通过体外转录产生RNA。来自任何来源的目的DNA可以直接通过PCR转化成模板，以使用适宜引物和RNA聚合酶，体外合成mRNA。DNA的来源可以例如是基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成的DNA序列或任何其他适宜的DNA来源。用于体外转录的所需模板是本文所述的CAR。例如，RNA CAR的模板包含细胞外区域，其包含针对本文所述的肿瘤抗原或B细胞抗原的抗体的单链可变结构域；铰链区(例如，本文所述的铰链区)，跨膜结构域(例如本文所述的跨膜结构域，例如CD8a的跨膜结构域)；以及细胞质区域，其包括胞内信号传导结构域，例如本文所述的胞内信号传导结构域，例如包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方案中，待用于PCR的DNA含有可读框。DNA可以来自源于生物基因组的天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，核酸可以包括5'非翻译区和/或3'非翻译区(UTR)的一些或全部。核酸可以包括外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列。在另一个实施方案中，待用于PCR的DNA是人类核酸序列，包括5'UTR和3'UTR。DNA可以备选地是正常情况下在天然存在的生物中不表达的人工DNA序列。示例性人工DNA序列是含有各基因部分的人工DNA序列，其中所述的各基因部分连接在一起以形成编码融合蛋白的可读框。连接在一起的各DNA部分可以来自单种生物或来自多于一种生物。
PCR用来产生模板以便体外转录用于转染的mRNA。用于开展PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR中的引物旨在具有与待用作PCR模板的DNA的区域基本上互补的区域。如本文所用，“基本上互补”，指其中引物序列中的大部分或全部碱基互补或一个或多个碱基是非互补或错配的核苷酸序列。基本上互补的序列能够在用于PCR的复性条件下与预期的DNA靶复性或杂交。引物可以设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以旨在扩增正常情况下在细胞中转录的核酸部分(可读框)，包括5'和3'UTR。引物也可以旨在扩增编码特定目的结构域的核酸部分。在一个实施方案中，引物旨在扩增人cDNA的编码区，包括5'和3'UTR的全部或部分。可用于PCR的引物可以是通过本领域熟知的合成方法产生。“正向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列上游的核苷酸基本上互补的核苷酸区域。“上游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言5'的位置。“反向引物”是这样的引物，其含有与DNA模板上待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区域。“下游”在本文中用来指相对于编码链的对待扩增的DNA序列而言3'的位置。
可用于PCR的任何DNA聚合酶可以在本文中公开的方法中。试剂和聚合酶从众多来源可商业获得。
也可以使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构物。RNA优选地具有5'UTR和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR长度在1个和3000个核苷酸之间。待添加至编码区的5'UTR和3'UTR序列的长度可以通过不同方法改变，所述方法包括但不限于设计与UTR的不同区域复性的PCR用引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以调节为转染转录的RNA后实现最佳翻译效率所需要的5'UTR和3'UTR长度。
5'UTR和3'UTR可以是目的核酸的天然存在的、内源5'UTR和3'UTR。备选地，相对于目的核酸并非内源的UTR序列可以通过将该UTR序列并入正向引物和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰进行添加。相对于目的核酸并非内源的UTR序列的用途可以用于调整RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的AU丰富元件可以降低mRNA的稳定性。因此，基于本领域熟知的UTR特性，可以选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。
在一个实施方案中，5'UTR可以含有内源核酸的Kozak序列。备选地，当通过如上文所述的PCR正在添加相对于目的核酸并非内源的5'UTR时，可以通过添加5'UTR序列再设计共有Kozak序列。Kozak序列可以增加某些RNA转录物的翻译效率、但似乎不是令全部RNA有效翻译需要的。本领域已知许多mRNA需要Kozak序列。在其他实施方案中，5'UTR可以是其RNA基因组在细胞中稳定的RNA病毒的5’UTR。在其他实施方案中，多种核苷酸类似物可以用于3'或5'UTR中，以阻碍核酸外切酶降解mRNA。
为了能够在不需要基因克隆的情况下从DNA模板合成RNA，转录启动子应当在待转录序列上游与DNA模板连接。当作为RNA聚合酶启动子发挥作用的序列添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子并入待转录的可读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文他处描述。其他可用启动子包括但不限于T3RNA聚合酶启动子和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共有核苷酸序列是本领域已知的。
在一个优选实施方案中，mRNA具有在5'末端的帽和3'聚腺苷酸尾，其决定在细胞中核糖体结合、翻译起始和mRNA稳定性。在环状DNA模板，例如，质粒DNA上，RNA聚合酶产生不适于真核细胞中表达的长连环体(concatameric)产物。转录在3'UTR末端线性化的质粒DNA产生在真核转染中并非有效的大小正常的mRNA，即便转录后它发生聚腺苷酸化。
在线性DNA模板上，噬菌体T7RNA聚合酶可以延伸转录物的3’末端越过模板的最后碱基(Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。
整合聚腺苷酸/T片段至DNA模板中的常规方法是分子克隆。但是，整合入质粒DNA的聚腺苷酸/T序列可能造成质粒不稳定性，这是为何从细菌细胞获得的质粒DNA模板经常遭受缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆方法不仅繁琐和费时的，而且经常不可靠。这是为何迫切需要以下方法的原因：允许在不进行克隆情况下构建带聚腺苷酸/T3'片段的DNA模板。
可以在PCR期间通过使用含有聚胸苷酸尾(如100T尾(SEQ ID NO:35)(大小可以是50-5000T(SEQ ID NO:265)))的反向引物或在PCR后通过任何其他方法(包括但不限于DNA连接或体外重组)，产生已转录的DNA模板的聚腺苷酸/T区段。聚腺苷酸尾还向RNA提供稳定性并减少它们的降解。通常，聚腺苷酸尾的长度与转录的RNA的稳定性正相关。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾长在100个和5000个腺苷之间(SEQ ID NO:82)。
RNA的聚腺苷酸尾可以在体外转录后利用聚腺苷酸聚合酶(如大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(E-PAP))进一步延长。在一个实施方案中，聚腺苷酸尾的长度从100个核苷酸增加至300个和400个核苷酸之间(SEQ ID NO:38)导致RNA的翻译效率增加约两倍。另外，接合不同化学基团至3’末端可以增加mRNA稳定性。这种接合可以含有修饰/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，ATP类似物可以使用聚腺苷酸聚合酶并入聚腺苷酸尾中。ATP类似物还可以增加RNA的稳定性。
5'帽也向RNA分子提供稳定性。在一个优选实施方案中，通过本文所公开的方法产生的RNA包含5'帽。使用本领域已知和本文所述的技术提供5'帽(Cougot等人,Trends inBiochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun.,330:958-966(2005))。
通过本文所公开的方法产生的RNA还可以含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒序列、染色体序列或人工设计的序列，所述序列启动帽非依赖性核糖体结合至mRNA并促进翻译的起始。可以包含适于细胞电穿孔的任何溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和生存力的因子，如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
可以使用众多不同方法的任一者，将RNA引入靶细胞中，例如包括但不限于以下的市售方法：电穿孔法(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,德国))、(ECM830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、Multiporator(Eppendort,Hamburg德国)、使用脂质体转染的阳离子脂质体介导转染法、聚合物囊化法、肽介导的转染法或生物射弹粒子递送系统如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。
非病毒递送方法
在一些方面，非病毒方法可以用来递送编码本文所述的CAR(例如，TA CAR和/或BCA CAR)的核酸至细胞或组织或受试者中。在一些实施方案中，非病毒方法包括利用转座子(也称作转座元件)。在一些实施方案中，转座子是可以将本身插入基因组中的某位置处的一段DNA，例如，能够自我复制并将其副本插入基因组中的一段DNA或可以是从较长核酸剪接出来并插入基因组中的另一个位置的一段DNA。例如，转座子包含由反向重复序列组成的DNA序列，所述反向重复序列在用于换位的基因旁侧分布。
使用转座子递送核酸的示例性方法包括睡美人转座子系统(SBTS)和piggyBac(PB)转座子系统。参见，例如，Aronovich等人,Hum.Mol.Genet.20.R1(2011):R14-20；Singh等人,Cancer Res.15(2008):2961–2971；Huang等人,Mol.Ther.16(2008):580–589；Grabundzija等人,Mol.Ther.18(2010):1200–1209；Kebriaei等人,Blood.122.21(2013):166；Williams.Molecular Therapy 16.9(2008):1515–16；Bell等人,Nat.Protoc.2.12(2007):3153-65；和Ding等人,Cell.122.3(2005):473-83，所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS包括两个组分：1)含有转基因的转座子和2)转座酶来源。转座酶可以令转座子从载体质粒(或其他供体DNA)转置到靶DNA，如宿主细胞染色体/基因组。例如，转座酶与载体质粒/供体DNA结合，从质粒切下转座子(包含转基因)并将它插入宿主细胞的基因组中。参见，例如，Aronovich等人,上文。
示例性转座子包括基于pT2的转座子。参见，例如，Grabundzija等人,NucleicAcids Res.41.3(2013):1829-47；和Singh等人,Cancer Res.68.8(2008):2961–2971，所述文献均通过引用的方式并入本文。示例性转座酶包括Tc1/水手型转座酶，例如，SB10转座酶或SB11转座酶(可以例如从巨细胞病毒启动子表达的过度活跃性转座酶)。参见，例如，Aronovich等人；Kebriaei等人；和Grabundzija等人,所述文献均通过引用的方式并入本文。
SBTS的使用允许高效整合和表达转基因，例如，编码本文所述CAR的核酸。本文中提供例如使用转座子系统如SBTS，产生稳定表达本文所述CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)的方法。
根据本文所述的方法，在一些实施方案中，将一种或多种含有SBTS组分的核酸(例如，质粒)递送至细胞(例如，T细胞或NK细胞)。例如，通过标准核酸(例如，质粒DNA)递送方法(例如，本文所述的方法，例如，电穿孔法、转染法或脂质体转染法)递送核酸。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子。在一些实施方案中，核酸含有包含转基因(例如，编码本文所述CAR的核酸)的转座子以及编码转座酶的核酸序列。在其他实施方案中，向系统(例如，双质粒系统)提供两种核酸，例如，其中第一质粒含有包含转基因的转座子和第二质粒含有编码转座酶的核酸序列。例如，将第一核酸和第二核酸共递送入宿主细胞中。
在一些实施方案中，通过使用采取SBTS的基因插入法和采取核酸酶(例如，锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系统或工程化大范围核酸酶(meganucleases)、再工程化归巢核酸内切酶)的遗传编辑法的组合，生成表达本文所述的TA CAR和BCA CAR的细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
在一些实施方案中，非病毒递送方法的使用允许再编程细胞(例如，T细胞或NK细胞)和直接输注细胞至受试者中。非病毒载体的优点包括但不限于便利和成本相对低地产生满足患者群体所需要的足够量、储存期间稳定性和缺少免疫原性。
细胞来源
在扩充和基因修饰之前，例如，为了表达本文所述的TA CAR和BCA CAR二者，可以从受试者获得细胞源，例如，T细胞或NK细胞。术语“受试者”意在包括其中可以激发免疫应答的活生物(例如，哺乳动物)。受试者的例子包括人、犬、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。T细胞可以从众多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本公开的某些方面，可以使用本领域可获得的任何数目的T细胞系。在本公开的某些方面，T细胞可以从使用技术人员已知的任何种类的技术(如FicollTM分离)从受试者采集的血液成分中获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术获得来自个体循环血液的细胞。单采产物一般含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核的白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞，以除去血浆级分并且以将细胞置于后续加工步骤的适宜缓冲液或培养基中。在本发明的一个方面，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在备选方面，洗涤液缺少钙并且可以缺少镁或可以缺少许多(若非全部)二价阳离子。在钙不存在情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将轻易领会，可以通过本领域技术人员已知的方法，如根据制造商说明通过使用半自动化“通流”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver 5)，完成洗涤步骤。在洗涤后，细胞可以重悬于多种生物相容缓冲液中，如，例如，无Ca、无Mg的PBS、PlasmaLyte A或含有或没有缓冲剂的其他盐水溶液。备选地，可以移除单采样品的不想要组分并且将细胞直接重悬于培养基中。
认识到，施加方法可以利用包含5％或更少(例如2％)人AB血清的培养基条件并利用已知的培养基条件和组合物，例如在Smith等人,“Ex vivo expansion of human Tcells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune CellSerum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中描述的那些。
一方面，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过正向或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个方面，通过与抗CD3/抗CD28(例如，3x28)缀合的珠(如M-450 CD3/CD28T)温育一段足够正选择所需T细胞的时间，分离T细胞。在一个方面，该时间段是约30分钟。在又一个方面，该时间段范围从30分钟至36小时或更长和二者之间的全部整数值。在又一个方面，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个优选的方面，该时间段是10至24小时。在一个方面，温育时间时间是24小时。较长的温育时间可以用来在其中如与其他细胞类型相比存在少量T细胞的任何情况下分离T细胞，如用于从肿瘤组织或从免疫受损个体分离肿瘤浸润型淋巴细胞(TIL)。另外，使用较长的温育时间可以增加捕获CD8+T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长该时间，允许T细胞与CD3/CD28珠结合和/或通过增加或减少珠对T细胞的比率(如本文进一步所述那样)，可以在培养伊始或在培养过程期间的其他时间点偏好地选择T细胞亚群。额外地，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养伊始或在其他所需的时间点偏好地选择T细胞亚群。技术人员将认识到也可以在本发明的情境下使用多轮选择。在某些方面，可能想要在激活和扩充过程中执行该选择程序并使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可以经历其他轮次的选择。
用针对负向选择的细胞独有的表面标记物的抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物一般包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些方面，可能想要富集或正向选择一般表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。备选地，在某些方面，通过抗C25缀合珠或其他相似的选择方法耗尽调节性T细胞。
本文所述的方法可以例如包括例如使用(例如，本文所述的)负选择技术，选择特定免疫效应细胞(例如，T细胞)亚群，所述亚群是调节性T细胞耗尽的群体、CD25+耗尽的细胞。优选地，调节性T细胞耗尽的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一个实施方案中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段或CD25-结合配体与基材(例如，珠)缀合、或否则包被在基材(例如，珠)上。在一个实施方案中，抗CD25抗体或其片段与如本文所述的基材缀合。
在一个实施方案中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗尽试剂从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一个实施方案中，细胞/CD25耗尽试剂的比率是1e7个细胞/20uL、或1e7个细胞/15uL、或1e7个细胞/10uL、或1e7个细胞/5uL、或1e7个细胞/2.5uL、或1e7个细胞/1.25uL。在一个实施方案中，例如，对于耗尽调节性T细胞，例如，CD25+而言，使用大于500百万个细胞/ml。在又一个方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一个实施方案中，待耗尽的免疫效应细胞群体包含约6x 109个CD25+T细胞。在其他方面，待耗尽的免疫效应细胞群体包含约1x 109个至1x 1010个和二者之间任何整数值个CD25+T细胞。在一个实施方案中，所产生的调节性T细胞耗尽的群体具有2x 109个调节性T细胞，例如，CD25+细胞、或更少(例如，1x 109、5x 108、1x 108、5x 107、1x 107个或更少的CD25+细胞)。
在一个实施方案中，使用具有耗尽管路套件，例如，管路162-01的CliniMAC系统，从群体移除调节性T细胞，例如，CD25+细胞。在一个实施方案中，CliniMAC系统在耗尽设定(如，例如，DEPLETION2.1)上运行。
不希望受具体理论约束，在单采血液成分术之前或在产生表达CAR的细胞产物期间降低受试者中免疫细胞的负向调节物水平(例如，减少不想要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数目)可以降低受试者复发风险。例如，耗尽TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗尽、及其组合。
在一些实施方案中，生产方法包括在产生表达CAR的细胞之前减少(例如，耗尽)TREG细胞的数目。例如，生产方法包括使与样品(例如，单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25-结合配体)接触，例如，以在产生表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产品之前耗尽TREG细胞。
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用减少TREG细胞的一种或多种疗法预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用以下一种或多种：环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗尽或其组合中一者或多者可以在输注表达CAR的细胞产品之前、其期间或之后进行。
在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用环磷酰胺预治疗，因而相对于表达CAR的细胞治疗，降低受试者复发风险。在一个实施方案中，在采集细胞以产生表达CAR的细胞产品之前，将受试者用抗GITR抗体预治疗，因而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一个实施方案中，待移除的细胞群体既不是调节性T细胞，也不是肿瘤细胞，而是否则不利影响CART细胞的扩充和/或功能的细胞，例如，表达CD14、CD11b、CD33、CD15或由潜在免疫阻抑性细胞表达的其他标记的细胞。在一个实施方案中，构思将这类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞同时、或在所述耗尽后或按另一个顺序移除。
本文所述的方法可以包括多于一个选择步骤，例如，多于一个耗尽步骤。可以例如，用针对负向选择的细胞独有的表面标记物的抗体的组合，通过负选择过程完成T细胞群体的富集。一种方法是借助负向磁力免疫粘附法或流式细胞术分选和/或选择细胞，所述负向磁力免疫粘附法或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标记物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过负向选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
本文所述的方法还可以包括从表达肿瘤抗原(例如，不包括CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体移除细胞，旨在因而提供适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)的调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞和肿瘤抗原耗尽的细胞)的群体。在一个实施方案中，将表达肿瘤抗原的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同基质(例如，珠)，或抗CD25抗体或其片段或者抗肿瘤抗原抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠可以用来移除细胞的混合物。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达肿瘤抗原的细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
还提供这些方法，所述方法包括从群体移除表达检查点抑制蛋白(例如，本文所述的检查点抑制蛋白)的细胞，例如，PD1+细胞、LAG3+细胞和TIM3+细胞中的一者或多者，因而提供调节性T细胞耗尽(例如，CD25+耗尽的细胞)和检查点抑制蛋白耗尽的细胞(例如，PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗尽的细胞)的群体。示例性检查点抑制蛋白包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一个实施方案中，将表达检查点抑制蛋白的细胞与调节性T细胞(例如，CD25+细胞)同时移除。例如，抗CD25抗体或其片段和抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至可以用来移除细胞的相同珠，或抗CD25抗体或其片段或者抗检查点抑制蛋白抗体或其片段可以连接至分立的珠，所述分立的珠的混合物可以用来移除细胞。在其他实施方案中，移除调节性T细胞(例如，CD25+细胞)和移除表达检查点抑制蛋白表达细胞是依次进行的，并且可以例如按任何顺序进行。
在一个实施方案中，可以选择表达以下一者或多者的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B和穿孔素、或其他适宜的分子，例如，其他细胞因子。可以例如通过PCT公开号WO 2013/126712中描述方法，确定用于筛选细胞表达的方法。
为了通过正向或负向选择分离所需的细胞群体，细胞和表面(例如，粒子如珠)的浓度可以变动。在某些方面，可能想要明显减少其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞浓度)以确保细胞和珠最大限度接触。例如，在一个方面，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩充。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)、或来自其中存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)中的细胞。这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个相关方面，可能想要使用较低的细胞浓度。通过大幅度稀释T细胞和表面(例如，粒子如珠)的混合物，粒子和细胞之间的相互作用最小化。这选出表达高量待与粒子结合的所需抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28并且在稀释的浓度比CD8+T细胞被更高效地捕获。在一个方面，细胞使用浓度是5X 10e6/ml。在其他方面，所用的浓度可以是约1x 105/ml至1x 106/ml和其间的任何整数值。
在其他方面，可以将细胞在2-10℃或在室温在摇床上按不同的速度温育长度不同的时间。
待刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论约束，通过移除细胞群体中的粒细胞和一定程度移除单核细胞，冷冻和后续解冻步骤提供更均匀的产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤后，细胞可以悬浮于冷冻液中。尽管许多冷冻液和参数是本领域已知的并且将用于这种环境下，一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基或例如含有Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，细胞随后以1°/分钟的速率冷冻至-80℃并且存储在液氮储罐的蒸气相中。也可以使用其他受控冷冻方法，以及立即在-20℃或在液氮中不受控冷冻。
在某些方面，将冷冻的细胞如本文所述那样解冻和洗涤并允许在室温静置一小时，之后使用本公开的方法活化。
在本发明背景下还构思，在可能需要如本文所述的已扩充细胞时之前的某个时间段从受试者采集血液样品或单采产品。就这一点而论，待扩充的细胞来源可以在需要的任何时间点采集，并且所需的细胞(如T细胞)可以分离并冷冻供稍后用于将从T细胞疗法获益的任何种类的疾病或病状(如本文所述的那些)的T细胞疗法中。在一个方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者。在某些方面，血液样品或单采物取自总体上健康的受试者，所述受试者面临形成疾病的风险、但是尚未形成疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供稍后使用。在某些方面，可以将T细胞扩充、冷冻并在稍后时间使用。在某些方面，样品从诊断如本文所述的特定疾病后不久、但在任何治疗之前的患者采集。在又一个方面，在任何数目的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物分离细胞，所述的治疗模式包括但不限于药物治疗，如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒药、化疗、辐射、免疫抑制剂，如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸盐和FK506、抗体、或其他免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷氮芥、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228和照射。
在本本公开的又一个方面，在留给受试者有功能的T细胞的治疗后马上从患者获得T细胞。在这个方面，已经观察到在某些癌症治疗、尤其用损伤免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久在患者正常情况下将从治疗中恢复的时间期间，获得的T细胞的质量可能就其离体扩充能力而言最佳或改善。同样地，在使用本文所述的方法离体操作后，这些细胞可以处于移植和体内扩充增强的优选状态。因此，在本本公开的情境范围内构思，在这个恢复阶段期间采集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。另外，在某些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和条件化方案可以用来在受试者中产生这样的条件，其中有利于特定细胞类型再增殖、再循环、再生和/或扩充，特别在治疗后的限定时间窗口期间有利。示意性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是二酰甘油激酶(DGK)缺陷的。DGK缺陷性细胞包括不表达DGK RNA或蛋白质或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。可以通过遗传方法产生DGK缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止DGK表达的RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理，产生DGK缺陷性细胞。
在一个实施方案中，T细胞群体是Ikaros缺陷的。Ikaros缺陷性细胞包括不表达Ikaros RNA或蛋白质或Ikaros活性降低或抑制的细胞。可以通过遗传方法产生Ikaros缺陷性细胞，例如，施用减少或阻止Ikaros表达的RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)。备选地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺)处理，产生Ikaros缺陷性细胞。
在实施方案中，T细胞群体是DGK缺陷的和Ikaros缺陷的，例如，不表达DGK和Ikaros、或具有减少或抑制的DGK活性和Ikaros活性。这类DGK和Ikaros缺陷性细胞可以通过本文所述任何方法产生。
在一个实施方案中，NK细胞从受试者获得。在另一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest)。
同种异型CAR免疫效应细胞
在本文所述的实施方案中，免疫效应细胞可以是同种异型免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞。例如，细胞可以是同种异型T细胞，例如，缺少功能性T细胞受体(TCR)和/或人白细胞抗原(HLA)(例如，HLA I类和/或HLA II类)表达的同种异型T细胞。
缺少功能性TCR的T细胞可以例如如此工程化，从而它不在其表面上表达任何功能性TCR，如此工程化，从而它不表达构成功能性TCR的一个或多个亚基，或如此工程化，从而它在其表面上产生非常少的功能性TCR。备选地，T细胞可以表达大幅度受损的TCR，例如，通过表达突变或截短形式的一个或多个TCR亚基。术语“大幅度受损的TCR”意指这种TCR将不在宿主中激发不良免疫反应。
本文所述的T细胞例如可以如此工程化，从而它不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所述的T细胞可以如此工程化，从而HLA(例如，HLA I类和/或HLA II类)的细胞表面表达下调。
在某些实施方式中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA(例如I类HLA和/或II类HLA)。
可以通过任何合适的手段(包括敲除或敲减TCR或HLA的一个或多个亚基)，获得缺少功能性TCR和/或HLA表达的修饰的T细胞。例如，T细胞可以包括使用siRNA、shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲减的TCR和/或HLA。
在一些实施方案中，同种异型细胞可以是例如因本文所述的任何方法而不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞。例如，细胞可以是不表达或以低水平表达抑制性分子的细胞，例如，可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力的细胞。抑制性分子的例子包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。对抑制性分子的抑制(例如，通过在DNA、RNA或蛋白质水平抑制)可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，可以使用抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)，例如，如本文所述。
抑制TCR或HLA的siRNA和shRNA
在一些实施方案中，可以使用靶向编码TCR和/或HLA和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的核酸的siRNA或shRNA，抑制细胞例如T细胞中的TCR表达和/或HLA表达。
例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第649段和第650段中描述了用于siRNA和shRNA以及示例性shRNA的表达系统，所述文献通过引用的方式完整并入。
抑制TCR或HLA的CRISPR
如本文所用的“CRISPR”或“针对TCR和/或HLA的CRISPR”或“抑制TCR和/或HLA的CRISPR”指一组成簇规律间隔的短回文重复序列或一个包括这种重复序列组的系统。如本文所用，“Cas”指CRISPR相关蛋白。
“CRISPR/Cas”系统指衍生自CRISPR和Cas的系统，所述系统可以用来沉默或突变细胞(例如，T细胞)中的TCR和/或HLA基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)。
例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第651-658段中描述了CRISPR/Cas系统及其用途，所述文献通过引用的方式完整并入。
抑制TCR和/或HLA的TALEN
“TALEN”或“针对HLA和/或TCR的TALEN”或“TALEN抑制HLA和/或TCR”指一种转录激活物样效应核酸酶，即可以用来编辑细胞(例如T细胞)中的HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的人工核酸酶。
例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第659-665段中描述了TALEN系统及其用途，所述文献通过引用的方式完整并入。
抑制HLA和/或TCR的锌指核酸酶
“ZFN”或“锌指核酸酶”或“针对HLA和/或TCR的ZFN”或“抑制HLA和/或TCR的ZFN”指一种锌指核酸酶，即可以用来编辑细胞(例如T细胞)中的HLA和/或TCR基因和/或本文所述的抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ)的人工核酸酶。
例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第666-671段中描述了ZFN系统及其用途，所述文献通过引用的方式完整并入。
端粒酶表达
尽管不希望受任何具体理论约束，在一些实施方案中，治疗性T细胞在患者中具有短期留存，原因在于T细胞中端粒缩短；因此，用端粒酶基因转染可以延长T细胞的端粒并改善T细胞在患者中的持久性。参见Carl June,“Adoptive T cell therapy for cancer inthe clinic”,Journal of Clinical Investigation,117:1466-1476(2007)。因此，在一个实施方案中，免疫效应细胞(例如，T细胞)异位表达端粒酶亚基，例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基。在一些方面，本公开提供一种产生表达CAR的细胞的方法，包括使细胞与编码端粒酶亚基(例如，端粒酶(例如，TERT，例如，hTERT)的催化性亚基)的核酸接触。细胞可以在接触编码CAR的构建体之前、与之同时或之后与核酸接触。
在一个方面，本公开内容描述了制备免疫效应细胞(例如，T细胞，NK细胞)群的方法。在一个实施方案中，该方法包括：提供免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)群，将免疫效应细胞群与编码CAR的核酸接触；和将免疫效应细胞群与编码端粒酶亚基例如，hTERT的核酸在允许CAR和端粒酶表达的条件下接触。
在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸是DNA。在一个实施方案中，编码端粒酶亚基的核酸包含能够驱动端粒酶亚基表达的启动子。
在一个实施方案中，hTERT具有如下的GenBank Protein ID AAC51724.1的氨基酸序列(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic SubunitGene,Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell第90卷，第4期，1997年8月22日，第785–795页)：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDPAAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFALLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFVLVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPAPGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPARPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYSSGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPLFLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQLLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQELTWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLGLDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYCVRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSLNEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGIRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEALGGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRRKLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPTFFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVTYVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD(SEQ ID NO:110)
在一个实施方案中，hTERT具有与SEQ ID NO:110的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个实施方案中，hTERT具有SEQ ID NO:110的序列。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或这两者处包含缺失(例如，不多于5、10、15、20、或30个氨基酸的缺失)。在一个实施方案中，hTERT在N末端、C末端或这两者处包含转基因氨基酸序列(例如，不多于5、10、15、20、或30个氨基酸的转基因氨基酸序列)。
在一个实施方案中，hTERT由如下GenBank登录号AF018167的核酸序列编码(Meyerson等人,“hEST2,the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene,IsUp-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization”Cell Volume 90,Issue4,22August 1997,Pages 785–795)：
在一个实施方案中，hTERT由下述核酸编码，所述核酸具有与SEQ ID NO:111的序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个实施方案中，hTERT由SEQ ID NO:111的核酸编码。
免疫效应细胞(例如，T细胞)的活化和扩充
通常可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利公开号20060121005中所述的方法活化和扩充免疫效应细胞如T细胞。
通常，免疫效应细胞(例如，T细胞)的群体可以通过与连接有刺激CD3/TCR复合体相关的信号的剂和刺激免疫效应细胞(例如，T细胞)表面上的共刺激性分子的配体的表面接触进行扩充。特别地，可以如本文所述那样刺激T细胞群体，如通过与固定在表面上的抗CD3抗体或其抗原结合片段或抗CD2抗体接触，或通过与蛋白激酶C激活物(例如，草苔虫内酯)连同钙离子载体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群体可以在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的例子包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,France)，可以如本领域共知的其他方法可能那样使用(Berg等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等人,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些方面，T细胞的初级刺激性信号和共刺激信号可以由不同方案提供。例如，提供每种信号的物质可以处于溶液中或与表面偶联。与表面偶联时，物质可以与相同表面(即，处于“顺式”形式)偶联或与分立的表面偶联(即，处于“反式”形式)。备选地，一个物质可以与表面偶联并且另一种物质处于溶液中。在一个方面，提供共刺激信号的物质与细胞表面结合并且提供初级激活信号的物质处于溶液中或与表面偶联。在某些方面，两种化学物质均可以处于溶液中。在一个方面，物质可以处于可溶性形式，并且随后交联至表面，如表达将会与该物质结合的Fc受体或抗体或其他结合物的细胞。在这个方面，关于本公开中构思用于活化和扩充T细胞的人工抗原呈递细胞(aAPC)，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810。
在一个方面，两种物质固定在珠上、固定在相同的珠上、即，“顺式”，或固定至分立的珠上、即，“反式”。例如，提供初级活化信号的物质是抗CD3抗体或其抗原结合片段并且提供共刺激信号的物质是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种物质均以等同的分子数量共同固定至相同珠上。在一个方面，对于CD4+T细胞扩充和T细胞生长，使用与珠结合的每种抗体的1:1比率。在本公开的某些方面，如此使用与珠结合的抗CD3:CD28抗体的比率，从而如与使用比率1:1时观察到的扩充相比，观察到T细胞扩充增加。在一个特定方面中，如与使用比率1:1时观察到的扩充相比，到观察约1倍至约3倍的增加。在一个方面，与珠结合的CD3:CD28抗体的比率是从100:1至1:100和其间的全部整数值。在本公开的一个方面，比抗CD3抗体更多的抗CD28抗体与粒子结合、即，CD3:CD28的比率小于1。在本发明的某些方面，与珠结合的抗CD28抗体对抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定的方面中，使用1:100与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:75与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用1:50与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:30与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个优选的方面，使用1:10与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在一个方面，使用1:3与珠结合的CD3:CD28抗体比率。在又一个方面，使用3:1与珠结合的CD3:CD28抗体比率。
粒子对细胞比率1:500至500:1和其间任何整数值可以用来刺激T细胞或其他靶细胞。如本领域普通技术人员可以轻易地领会，粒子对细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。例如，小规格珠仅可能结合一些细胞，而较大的珠可能结合许多细胞。在某些方面，细胞对粒子的比率范围从1:100至100:1和其间的任何整数值，并且在其他方面中，该比率包含1:9至9:1和其间的任何整数值、也可以用来刺激T细胞。导致刺激T细胞的抗CD3偶联粒子和抗CD28偶联粒子对T细胞的比率可以如上文所示变动，然而某些优选的值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，一个优选的比率是每个T细胞至少1:1粒子。在一个方面，使用1:1或更小的粒子对细胞比率。在一个特定方面，优选的粒子：细胞比率是1:5。在其他方面，粒子：细胞比率可以根据刺激的日期变动。例如，在一个方面，粒子：细胞比率在第1天是1:1至10:1，并且此后每日或每隔1日添加额外粒子至细胞持续至多10天，最终比率1:1至1:10(基于添加日时的细胞计数)。在一个特定方面，粒子：细胞比率在第1刺激日是1:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:5。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:5。在一个方面，粒子：细胞比率在第1刺激日是2:1并且在第三刺激日和第五刺激日调节至1:10。在一个方面，基于每日或每隔1日添加粒子至第1刺激日时的最终比率1:1，并且在第三刺激日和第五刺激日添加粒子至最终比率1:10。本领域技术人员将理解，多种其他比率可以在本公开中适用。特别地，比率将根据粒度和细胞尺寸和类型变动。在一个方面，使用的最常见比率在第1天接近1:1、2:1和3:1。
在本公开的其他方面，细胞(如T细胞)与物质包被的珠组合，随后分离珠和细胞，并且随后培养细胞。在备选方面，在培养之前，不分离物质包被的珠和细胞，而是在一起培养。在又一个方面，首先通过应用某种力(如磁力)浓缩珠和细胞、导致细胞表面标记物的连接增加，因而诱导细胞刺激作用。
例如，可以通过使得与抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3x28珠)接触T细胞，连接细胞表面蛋白。在一个方面，将细胞(例如，104个至109个T细胞)和珠(例如，M-450 CD3/CD28 T顺磁珠按比率1:1)在缓冲液例如PBS(不含二价阳离子如钙和镁)中合并。再次，本领域普通技术人员可以轻易地领会，可以使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可能在样品中非常稀少并仅占样品的0.01％或整个样品(即，100％)可能包含目的靶细胞。因此，任何细胞数目均属于本公开的情景范围内。在某些方面，可能想要明显减少其中粒子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)以确保细胞和粒子最大限度接触。例如，在一个方面，使用约20亿个细胞/ml的浓度。在一个方面，使用大于1亿个细胞/ml。在又一个方面，使用1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5千万个细胞/ml的细胞浓度。在又一个方面，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在其他方面，可以使用1.25亿或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩充。另外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可能微弱表达目的靶抗原的细胞，如CD28阴性T细胞。在某些方面，这类细胞群体可能具有治疗价值并且将希望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择正常情况下具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一个实施方案中，扩充用编码CAR(例如，本文所述的CAR)的核酸转导的细胞，例如，通过本文所述的方法扩充。在一个实施方案中，将细胞在培养下扩充几小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一个实施方案中，将细胞扩充4至9天时间。在一个实施方案中，将细胞扩充8天或更短(例如，7、6或5天)时间。在一个实施方案中，将细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)在培养下扩充5天并且所产生的细胞比相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞更有效力。效力可以例如由T细胞的多种功能定义，例如增殖、靶细胞杀伤作用、细胞因子产生、活化、移行、或其组合。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，培养扩充5天的细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)显示在抗原刺激时细胞倍增作用增长至少一、二、三或四倍。在一个实施方案中，将表达本文所述的CAR的细胞培养扩充5天，并且与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，所产生的细胞显示出更高的促炎细胞因子产量，例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平。在一个实施方案中，与相同培养条件下培养扩充9天的相同细胞相比，扩充5天的细胞(例如，本文所述的表达CAR的细胞)显示以pg/ml计的促炎细胞因子产量(例如，IFN-γ水平和/或GM-CSF水平)增长至少一、二、三、四、十倍或更多倍。
在本公开的一个方面，可以将混合物培养几小时(约3小时)至约14天或其之间的任何整数小时值。在一个方面，可以将混合物培养21天。在本发明的一个方面，将珠和T细胞在一起培养约8天。在一个方面，将珠和T细胞在一起培养2-3天。也可能需要几轮刺激，从而T细胞培养时间可以是60天或更长。适于T细胞培养的条件包括适宜的培养基(例如，极限基本培养基或RPMI培养基1640或、X-vivo 15、(Lonza))，所述培养基可以含有增殖和生存力必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加物。细胞生长的其他添加物包括但不限于表面活性剂、plasmanate和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包含RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer、连同添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有足以生长和扩充T细胞的适宜量的血清(或血浆)或限定的成组激素和/或某种量的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素仅包含于实验性培养物中，不包含于待输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞在支持生长所必需的条件下维持，例如，适宜的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气外加5％CO2)。
在一个实施方案中，将细胞在适宜的培养基(例如，本文所述的培养基)中扩充，所述培养基包括导致细胞在14天扩充时间内增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)(例如，如通过本文所述的方法(如流式细胞术)所测量)的一种或多种白介素。在一个实施方案中，将细胞在IL-15和/或IL-7(例如IL-15和IL-7)存在下扩充。
在实施方案中，本文描述的方法，例如，表达CAR的细胞的制造方法，包括例如从细胞群体除去调节性T细胞，例如，用抗CD25抗体或其片段，或CD25-结合配体IL-2除去CD25+T细胞。本文中描述了从细胞群体移除调节性T细胞(例如，CD25+T细胞)的方法。在实施方案中，方法(例如，生产方法)还包括：使细胞群体(例如，其中调节性T细胞(如CD25+T细胞)已经耗尽的细胞群体；或先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)与IL-15和/或IL-7接触。例如，将细胞群体(例如，先前已经接触过抗CD25抗体、其片段或CD25结合配体的细胞群体)在IL-15和/或IL-7存在下扩充。
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触，所述组合物包含白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15)的组合。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者组合的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。在实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在产生表达CAR的细胞期间(例如，离体)接触。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含hetIL-15的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与包含IL-15多肽和IL-15Ra多肽二者的组合物在离体扩充期间接触。在一个实施方案中，接触过程导致淋巴细胞亚群(例如，CD8+T细胞)存活和增殖。
在一个实施方案中，在包含血清的培养基中培养细胞(例如扩充、刺激和/或转导)。血清可以是例如人AB血清(hAB)。在一些实施方案中，hAB血清以约2％，约5％，约2-3％，约3-4％，约4-5％或约2-5％存在。2％和5％血清各自是允许多倍扩增T细胞的合适水平。此外，如Smith等人,“Ex vivo expansion of human T cells for adoptiveimmunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement”Clinical&Translational Immunology(2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31中所示，含有2％人AB血清的培养基适用于T细胞的离体扩充。
已经暴露于变动的刺激时间的T细胞可以显示出不同的特征。例如，常见的血液或单采外周血单核细胞产物具有比细胞毒T细胞或阻抑T细胞群体(TC、CD8+)更大的辅助T细胞群体(TH、CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩充T细胞产生了在约第8-9天之前由TH细胞优势组成的T细胞群体，而约第8-9天之后，T细胞群体包含日益更大的TC细胞群体。因此，取决于治疗目的，向受试者输注由TH细胞优势组成的T细胞群体可能是有利的。类似地，如果已经分离TC细胞的抗原特异性亚群，可能有益的是更大程度地扩充这个亚群。
另外，除CD4和CD8标记物之外，其他表型标记也显著地变动，但是在细胞扩充过程期间大多可重复地变动。因此，这种重现性使得为特定目的而调整活化的T细胞产物的能力成为可能。
在一些实施方案中，可以基于例如CCL20、GM-CSF、IFNγ、IL-10、IL-13、IL-17a、IL-2、IL-21、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、TNFα和/或其组合中的一种或多种的蛋白质表达水平来选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞用于施用。在一些实施方案中，可以基于例如CCL20，IL-17a，IL-6及其组合的蛋白质表达水平来选择用编码CAR(例如本文所述的CAR)的核酸转导的细胞用于施用。
一旦构建TA CAR，则各种测定法可以用来评价分子的活性，如但不限于抗原刺激后扩充T细胞的能力、在再次刺激不存在的情况下维持T细胞扩充的能力和适宜的体外模型和动物模型中的抗癌活性。例如2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第695-703段中更详细地描述了评价TA CAR或表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞(例如，本发明的细胞)的效果的测定法，所述文献通过引用的方式完整并入。
一旦构建BCA CAR，则各种测定法可以用来评价分子的活性，如但不限于在适宜的体外和动物模型中耗尽B细胞(或其他优选群体)的能力和暴露于B细胞时持续存在的能力。下文更详细地描述了评价BCA CAR或表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞(例如，本发明的细胞)的效果的测定法。
例如，可以修改上文描述的细胞毒性测定法，以体外评价表达BCA CAR的细胞(例如，表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞)的细胞毒活性。本发明的细胞(例如，表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞)可以与靶细胞(例如，表达BCA CAR靶向的B细胞抗原的细胞)按不同的效应子对靶(E:T)比率混合。在允许细胞介导的细胞裂解的充分温育后，收获来自每种比率下样品的上清液并且随后测量释放的51Cr。为了监测细胞介导的持久性或增殖，可以例如通过流式细胞术监测本发明的细胞。
另外，可以向与上述那些相似的动物模型施用本发明的细胞(例如，表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞)，以评价细胞的能力，包括相比不表达BCA CAR的相同细胞，其更大程度或更长时间持续存在和/或增殖的能力。
治疗性应用
采用CAR疗法治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病的一些方法已经取得程度不一的成功，这部分归因于刺激受试者对表达CAR的细胞的免疫应答可以导致后续对表达CAR的细胞的排斥和/或对表达CAR的细胞的不利应答。
在一个方面，本公开提供通过施用本发明的细胞(例如，表达BCA CAR和TA CAR二者的细胞)，治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病(例如，本文所述的癌症)方法。在一些实施方案中，采用本发明细胞的疗法前置有或伴随淋巴细胞清除疗法。在其他实施方案中，采用本发明细胞的疗法未前置有或伴随淋巴细胞清除疗法，例如，在施用本发明的细胞之前1年、9个月、6个月、3个月、2个月、1个月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天、1日或比前述任一者更少的月数、周数或天数，不向受试者施用淋巴细胞清除疗法。淋巴细胞清除药物的合适例子包括但不限于氟达拉滨和环磷酰胺，并且在名为“联合疗法”的章节中进一步描述。
在另一个方面，本公开提供通过施用如本文所述的免疫效应细胞治疗癌症(例如，本文所述的实体瘤)的方法，所述免疫效应细胞包含(例如，经工程化以表达)TA CAR，例如，间皮素CAR(如本文所述)或EGFRvIII CAR(如本文所述)，并且包含(例如，经工程化以表达)BCA CAR，例如，CD19 CAR(如本文所述)或BCMA CAR(如本文所述)。在实施方案中，细胞疗法可以随本文所述的抗癌治疗剂一起施用。在一个实施方案中，抗癌治疗剂是化疗药，例如，其如名为“联合疗法”的章节中所述。在另一个实施方案中，抗癌治疗剂是治疗实体瘤的治疗药。
在另一个方面，本公开提供通过施用如本文所述的免疫效应细胞治疗癌症(例如，本文所述的髓系肿瘤)的方法，所述免疫效应细胞包含(例如，经工程化以表达)TA CAR，例如，CD123 CAR(如本文所述)、CD33 CAR(如本文所述)或CLL-1 CAR(如本文所述)，并且包含(例如，经工程化以表达)BCA CAR，例如，CD19 CAR(如本文所述)或BCMA CAR(如本文所述)。在实施方案中，细胞疗法可以随本文所述的抗癌治疗剂一起施用。在一个实施方案中，抗癌治疗剂是化疗药，例如，其如名为“联合疗法”的章节中所述。在另一个实施方案中，抗癌治疗剂是治疗髓系肿瘤的治疗药。
如本文所用，“组合”施用意指，在受试者罹患病症期间向受试者递送两种或更多种不同治疗，例如，在受试者已经诊断患有该病症后并且在该病症已经治愈或消除或治疗已经出于其他原因而停止之前，递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始递送第二治疗时，一种治疗的递送仍然正在进行，从而就施用而言存在重叠。这有时在本文中称作“同时”或“同步递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在开始递送第二种治疗前结束。在任一种情况的一些实施方案中，治疗因为联合施用而更有效。例如，第二治疗是更有效的，例如，在第二治疗较少时观察到等效作用，或第二治疗减少症状到更大程度，大于如果第二治疗在第一治疗不存在时施用所见的程度、或采用第一治疗时观察到类似的情况。在一些实施方案中，如此递送，从而与该病症相关的症状或其他参数的减少大于一种治疗在另一种治疗不存在下递送情况下将会观察到的减少。两种治疗药的效果可以部分加合、完全加合或超过加合。递送可以是这样的，从而当递送第二治疗药时，仍然可检测第一治疗药的效果。
抗癌疗法
在一个方面，本公开提供通过向有需要的受试者提供本发明细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，治疗疾病(例如，癌症)的方法，所述免疫效应细胞包含(例如，经工程化以表达)本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR，其中患病细胞，例如，癌细胞，表达肿瘤抗原，例如，TA CAR靶向的肿瘤抗原。
不希望受任何具体理论约束，由本发明的表达CAR的细胞激发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动免疫应答、或备选地可以归因直接与间接免疫应答。在一个方面，本发明的表达CAR的细胞显示出响应于表达如本文所述的肿瘤抗原的人癌细胞的特异性促炎细胞因子分泌和强力溶细胞活性、抵抗本文所述的可溶性肿瘤抗原所致的抑制作用、介导旁观者杀伤作用并且介导建立的人肿瘤消退。例如，在抗原阳性肿瘤细胞的不均一视野内部抗原较少的肿瘤细胞可能对事先已经与毗邻抗原阳性肿瘤细胞反应的表达CAR的本发明细胞的间接破坏作用敏感。
在一个实施方案中，本公开提供用于抑制表达本文所述肿瘤抗原的癌细胞群体增殖或减少该群体的方法，所述方法包括使表达本文所述肿瘤抗原的癌细胞群体与本发明的细胞(例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞))接触，所述细胞包含(例如，经工程化以表达)与表达本文所述肿瘤抗原的细胞结合的本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR。在某些实施方案中，相对于阴性对照，包含(例如，经工程化以表达)本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR的本发明细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)在癌症受试者或动物癌症模型中减少细胞和/或癌细胞的量、数目、数量或百分数至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少65％、至少75％、至少85％、至少95％或至少99％，所述癌症与如本文所述的肿瘤抗原表达相关。在一个方面，受试者是人。
本公开还提供用于预防、处理和/或管理与本文所述的肿瘤抗原相关的疾病的方法。这些方法包括向有需求的受试者施用本发明的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，所述细胞包含(例如，经工程化以表达)与表达肿瘤抗原的细胞结合的本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR。
本公开提供用于防止与如本文所述的肿瘤抗原相关的癌症复发的方法，所述方法包括向有需求的受试者施用本发明的细胞，例如，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，所述细胞包含(例如，经工程化以表达)与表达肿瘤抗原的细胞结合的本文所述的TA CAR和本文所述的BCA CAR。不受理论约束，认为相比不表达BCA CAR的相同细胞，本发明细胞上BCACAR的表达允许细胞在体内更长时间持续存在或在体内更大程度增殖，因而允许产生持续存在的表达TA CAR的细胞群体，这可以在没有另一次施用本发明细胞的情况下有效地治疗复发。
在一个方面，这些方法包括与有效量的另一种治疗药(例如，施用名为“联合疗法”的章节中所述的治疗药)组合，向有需求的受试者施用有效量的本文所述的表达CAR的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR二者的细胞)，所述细胞与表达肿瘤抗原的细胞结合。
在实施方案中，施用本发明的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR二者的细胞)导致(例如，由TA CAR靶向的)所述肿瘤细胞部分或完全消除，并且此后继续在所述受试者中，相比缺少BCA CAR的否则相同的细胞，以更高水平或更长时间长度延续该状态。
本发明的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR二者的细胞)可以稳定表达靶向肿瘤抗原的TA CAR分子和/或BCA CAR分子。备选地，本发明的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR二者的细胞)可以瞬时表达靶向肿瘤抗原的TA CAR分子和/或BCA CAR分子。在瞬时表达TA CAR或BCA CAR或者瞬时表达TA CAR和BCA CAR二者的实施方案中，可能需要多次依序输注(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10次输注)本发明的细胞以有效地治疗或管理与表达肿瘤抗原相关的疾病。在一些实施方案中，稳定表达BCA CAR和TA CAR二者可能对长期抗肿瘤活性为优选。在多个方面，本发明的细胞或其后代在施用细胞后持续存在于受试者中至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。在实施方案中，这种持久性实质地长于不表达BCA CAR的否则相同的细胞的持久性，例如，长于不表达BCA CAR的否则相同的细胞的持久性至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。
在一个方面，本发明的细胞可以是在哺乳动物中用于离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。在一个方面，哺乳动物是人。
对于离体免疫，在施用细胞至哺乳动物之前在体外进行至少一种以下操作：i)扩充细胞、ii)引入编码CAR的核酸至细胞或iii)冷冻保存细胞。
离体程序是本领域熟知的并且在下文更充分地讨论。简而言之，将细胞从哺乳动物(例如，人)分离并用本文公开的表达CAR的载体进行基因修饰(即，在体外转导或转染)。可以将CAR修饰的细胞施用至哺乳动物受体以提供治疗益处。哺乳动物受体可以是人并且CAR修饰的细胞可以相对于受体是自体的。备选地，细胞可以相对于受体是同种异型、同基因的或异种的。
在通过引用方式并入本文的美国专利号5,199,942中描述了离体扩充造血干细胞和祖先细胞的方法，可以应用于本公开的细胞。其他合适的方法是本领域已知的，因此，本公开不限于离体扩充细胞的任何具体方法。简而言之，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的离体培养和扩充包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体采集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖先细胞；和(2)离体扩充这类细胞。除美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其他因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体可以用于细胞的培养和扩充。
本文进一步描述示例性靶向肿瘤抗原的表达CAR(例如，表达实体瘤CAR或髓系肿瘤CAR)的细胞。本发明的示例性细胞表达与本文所述的肿瘤抗原(例如，实体瘤相关抗原，髓系肿瘤抗原)或非B细胞来源的血液肿瘤结合的CAR分子，并且还表达结合本文所述的B细胞抗原的BCA CAR分子。
在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向间皮素的TA CAR和如本文所述的靶向CD19的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向间皮素的TA CAR和如本文所述的靶向BCMA的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向EGFRvIII的TA CAR和如本文所述的靶向CD19的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向EGFRvIII的TA CAR和如本文所述的靶向BCMA的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CD123的TA CAR和如本文所述的靶向CD19的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CD123的TA CAR和如本文所述的靶向BCMA的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CD33的TA CAR和如本文所述的靶向CD19的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CD33的TA CAR和如本文所述的靶向BCMA的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CLL-1的TA CAR和如本文所述的靶向CD19的BCA CAR。在一个实施方案中，本发明的细胞包含(例如，经工程化以表达)如本文所述的靶向CLL-1的TA CAR和如本文所述的靶向BCMA的BCA CAR。本文中也描述了其他实施方案。
与表达肿瘤抗原相关的疾病
本文所述的方法涉及治疗与表达肿瘤抗原相关的疾病。与表达肿瘤抗原相关的疾病可以是与表达肿瘤抗原相关的癌症或其他增生性疾病，如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、或癌前期病状，例如，增生、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期。与表达如本文所述的肿瘤抗原相关的非癌症相关适应症例如包括但不限于自身免疫疾病(例如，狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。
本文所述的方法可以用来治疗以下任何癌：
消化道/胃肠道癌如直肠癌；胆管癌；肝外胆管癌；阑尾肿瘤；类癌瘤、胃肠道癌；结肠癌；结直肠癌，包括儿童结直肠癌；食管癌，包括儿童食管癌；胆囊癌；胃(胃)癌，包括儿童胃(胃)癌；肝细胞性(肝)癌，包括成人(原发性)肝细胞(肝)癌和儿童(原发性)肝细胞性(肝)癌；胰腺癌，包括儿童胰腺癌；肉瘤、横纹肌肉瘤；胰岛细胞胰腺癌；直肠癌；和小肠癌；
内分泌癌如胰岛细胞癌(内分泌胰)；肾上腺皮质癌，包括儿童肾上腺皮质癌；胃肠道类癌瘤；甲状旁腺癌；嗜铬细胞瘤；垂体肿瘤；甲状腺癌，包括儿童甲状腺癌；儿童多发性内分泌腺瘤综合征；和儿童类癌瘤；
眼癌如眼球内黑素瘤；和视网膜母细胞瘤；
肌肉骨骼癌如Ewing肿瘤家族；骨的骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；软组织肉瘤，包括成人和儿童软组织肉瘤；腱鞘的透明细胞肉瘤；和子宫肉瘤；
乳腺癌如乳腺癌，包括儿童和男性乳腺癌和妊娠；
神经系统癌如儿童脑干胶质瘤；脑肿瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童室管膜瘤；儿童髓母细胞瘤；儿童松果体和幕上原发性神经外胚瘤；儿童视路和下丘脑胶质瘤；其他儿童脑癌；肾上腺皮质癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；神经母细胞瘤；颅咽管瘤；脊髓肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤；中枢神经系统胚胎瘤；和儿童幕上原始神经外胚层肿瘤和垂体肿瘤；
泌尿生殖系统癌症如膀胱癌，包括儿童膀胱癌；肾细胞(肾)癌；卵巢癌，包括儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢低度潜在恶性肿瘤；阴茎癌；前列腺癌；肾细胞癌，包括儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管、移行细胞癌；睾丸癌；尿道癌；阴道癌；外阴癌；宫颈癌；Wilm肿瘤和其他儿童肾肿瘤；子宫内膜癌；和妊娠滋养细胞肿瘤；
生殖细胞癌如儿童颅外胚细胞瘤；性腺外生殖细胞肿瘤；卵巢生殖细胞肿瘤；和睾丸癌；
头颈癌如唇和口腔癌；口腔癌，包括儿童口腔癌；下咽癌；喉癌，包括儿童喉癌；转移性鳞状颈癌伴未知原发性；口腔癌；鼻腔及鼻旁窦癌；鼻咽癌，包括儿童鼻咽癌；口咽癌；甲状旁腺癌；咽癌；唾液腺癌，包括儿童唾液腺癌；喉癌；和甲状腺癌；
血液癌如白血病或淋巴瘤；包括但不限于，例如，一种或多种急性白血病，包括但不限于例如，B细胞急性淋巴细胞白血病(BALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(TALL)、急性淋巴样白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于，例如，慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。额外的血液癌，例如包括但不限于B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、多毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症和“白血病前期”，其是依据髓样血细胞无效产生(或异型增生(dysplasia))而统一的血液学疾病的多样性集合等。
肺癌如非小细胞肺癌；和小细胞肺癌；
呼吸系统癌如成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童胸腺瘤；胸腺癌；支气管腺瘤/类癌，包括儿童支气管腺瘤/类癌；胸膜肺母细胞瘤；非小细胞肺癌；和小细胞肺癌；
皮肤癌如Kaposi肉瘤；Merkel细胞癌；黑素瘤；和儿童皮肤癌；
AIDS相关恶性肿瘤；
其他儿童癌、不常见的儿童癌和原发部位未知的癌症；
并且也可以根据本文所述的方法治疗或预防前述癌的转移灶。可以使用本文所述的方法实现对转移性癌(例如，表达PD-L1的转移性癌)(Iwai等人,(2005)Int.Immunol.17:133-144)的治疗。可以抑制其生长的示例性癌包括一般响应于免疫疗法的癌。另外，可以使用本文所述的分子治疗难治性或复发性恶性肿瘤。
在一个实施方案中，本公开提供本文所述的疗法，其中施用本发明的细胞或组合物以治疗实体瘤，例如，抑制实体瘤生长。在实施方案中，细胞包含了靶向(例如，结合于)实体瘤中细胞或细胞群体上存在的肿瘤抗原的TA CAR分子。可以用本文所公开的方法治疗的实体瘤的例子包括多个器官系统的恶性肿瘤，例如，肉瘤、腺癌和癌，如侵袭胰、肝、肺、乳腺、卵巢、淋巴、胃肠道(例如，结肠)、生殖泌尿道(例如，肾、膀胱上皮细胞)、前列腺和咽的那些。腺癌包括恶性肿瘤如大部分结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、肺癌中的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。在一个实施方案中，实体瘤是间皮瘤。也可以使用本发明的方法和组合物治疗或预防前述癌的转移性病灶。
在一个实施方案中，施用本文所述的联合疗法以治疗CD19阴性癌症。CD19阴性癌症可以表征为CD19损失(例如，抗原损失突变)或降低CD19水平的其它CD19改变(例如，由CD19阴性克隆的克隆性选择引起)。应当理解，CD19-阴性癌症不需要100％的CD19损失，并且可以保留某种部分的CD19表达(例如，保留一些表达CD19的癌细胞)。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达EGFRvIIICAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EGFRvIII。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达间皮素CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达间皮素。在一个实施方案中，待治疗的癌症是间皮瘤、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、或大细胞肺癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、转移性胰腺癌、食管腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和膀胱癌或其任意组合。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达GD2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达GD2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达TnCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Tn抗原。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达sTnCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达sTn抗原。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、结肠癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达PSMACAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PSMA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达TAG72CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TAG72。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠道癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD44v6CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD44v6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是宫颈癌、AML或MM。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达EPCAMCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EPCAM。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠道癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达KITCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达KIT。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胃肠道癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达IL-13Ra2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达IL-13Ra2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD171CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD171。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤、卵巢癌、黑素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌或NSCLC(非小细胞肺癌)。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达PSCACAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PSCA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达LewisYCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达LewisY。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌或AML。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达PDGFR-βCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PDGFR-β。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、前列腺癌、GIST(胃肠道间质肿瘤)、CML、DFSP(隆突性皮肤纤维肉瘤)或胶质瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达SSEA-4CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达SSEA-4。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌或干细胞癌症。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达叶酸受体αCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达叶酸受体α。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、NSCLC、子宫内膜癌、肾癌或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达ERBB2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ERBB2(Her2/neu)。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、胃癌、结直肠癌、肺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达MUC1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MUC1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、肺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达EGFRCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达EGFR。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质母细胞瘤、SCLC(小细胞肺癌)、SCCHN(头颈鳞状细胞癌)、NSCLC或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达NCAMCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NCAM。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CAIXCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CAIX。在一个实施方案中，待治疗的癌症是肾癌、CRC、宫颈癌或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达HMWMAACAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达HMWMAA。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤、胶质母细胞瘤或乳腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达o-乙酰基-GD2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达o-乙酰基-GD2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是神经母细胞瘤或黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CLDN6CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CLDN6。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、肺癌或乳腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达TSHRCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TSHR。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌或多发性骨髓瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CD97CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CD97。在一个实施方案中，待治疗的癌症是B细胞恶性肿瘤、胃癌、胰腺癌、食管癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌或结直肠癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达聚唾液酸CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达聚唾液酸。在一个实施方案中，待治疗的癌症是小细胞肺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达PLAC1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达PLAC1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是HCC(肝细胞癌)。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达GloboHCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达GloboH。在一个实施方案中，待治疗的癌症是卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌或胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达NY-BR-1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NY-BR-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达MAD-CT-1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MAD-CT-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌或黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达MAD-CT-2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达MAD-CT-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是前列腺癌、黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达Fos-相关抗原1 CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达Fos-相关抗原1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是胶质瘤、鳞状细胞癌或胰腺癌。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达ML-IAPCAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达ML-IAPCAR。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达NA17CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达NA17。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达TRP-2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达TRP-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达CYP1B1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达CYP1B1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是乳腺癌、结肠癌、肺癌、食道癌症、皮肤癌、淋巴结癌症、脑癌或睾丸癌症。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达RAGE-1CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达RAGE-1。在一个实施方案中，待治疗的癌症是RCC(肾细胞癌)或其他实体瘤
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达人端粒酶逆转录酶CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达人端粒酶逆转录酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达肠羧基酯酶CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达肠羧基酯酶。在一个实施方案中，待治疗的癌症是甲状腺癌、RCC、CRC(结直肠癌)、乳腺癌或其他实体瘤。
在一个方面，本公开提供了通过向有需要的受试者提供经工程化以表达muthsp70-2CAR的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)来治疗癌症的方法，其中癌细胞表达muthsp70-2。在一个实施方案中，待治疗的癌症是黑素瘤。
联合疗法
本文所述的表达CAR的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)可以与其它已知的药剂和疗法联合使用。
本文所述的联合疗法(例如，包含本发明的细胞)可以与至少一种额外的治疗药剂联合施用。在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞和至少一种额外的治疗药剂可以在相同的组合物中或在分立的组合物中同时施用或依次施用。对于依次施用，本文所述的表达CAR的细胞可以首先施用并且额外的药剂可以接着施用，或施用顺序可以反转。
在其他方面，本文所述的表达CAR的细胞可以与手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫消融剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子、照射和肽疫苗组合用于治疗方案，如Izumoto等人2008JNeurosurg 108:963-971所述。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与淋巴细胞清除剂组合使用。在免疫治疗之前，示例性淋巴细胞清除剂减少或降低淋巴细胞，例如，B细胞淋巴细胞和/或T细胞淋巴细胞。示例性淋巴细胞清除剂包括氟达拉滨、环磷酰胺、皮质类固醇类、阿伦珠单抗(alemtuzumab)或全身照射(TBI)或其组合。例如，氟达拉滨和环磷酰胺的组合在施用本文所述的本发明细胞之前或与之同时施用。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与治疗B细胞再生障碍的药剂组合使用。顽固性B细胞再生障碍导致低丙球蛋白血症并且可以升高感染风险。治疗B细胞再生障碍的药物包括静脉用免疫球蛋白(IVIG)，例如，FLEBOGAMMATM、和
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与化学治疗药剂组合使用。示例性化疗药剂包括蒽环类(例如，多柔比星(例如，脂质体多柔比星))；长春碱类生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)；烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；免疫细胞抗体(例如，alemtuzamab、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗(tositumomab))；抗代谢物(包括，例如，叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如，氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂；蛋白酶体抑制剂(例如，阿克拉霉素A、胶霉毒素或硼替佐米)；免疫调节剂如沙立度胺或沙利度胺衍生物(例如，来那度胺)。
考虑用于联合疗法的一般化疗药包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射卡培他滨N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉立滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、嘧啶阿糖甙阿糖胞苷脂质体注射达卡巴嗪更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射剂地塞米松、多西紫杉醇盐酸多柔比星 依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(difluorodeoxycitidine)、羟基脲伊达比星异环磷酰胺伊立替康L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌米罗他(mylotarg)、紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、聚苯丙生20连同卡莫司汀植入物柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤、塞替派、替拉扎明注射用盐酸拓扑替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
示例性烷基化剂包括而不限于氮芥类、氮丙啶衍生物类、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类和三氮烯类)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen )、chlormethine环磷酰胺(RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三亚乙基蜜胺三乙烯硫代磷酰胺、替莫唑胺塞替派白消安卡莫司汀罗莫司汀链佐星和达卡巴嗪额外的示例性烷基化剂包括而不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(dactinomycin)(也称作放线菌素-D、)；美法仑(也称作L-PAM、L-沙可来新和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(HMM)、)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂罗莫司汀(也称作CCNU、)；顺铂(也称作CDDP、和-AQ)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称作DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称作六甲基三聚氰胺(HMM)、)；异环磷酰胺Prednumustine；丙卡巴肼二氯甲二乙胺(也称作氮芥、氮氯嗪和盐酸氮芥、)；链佐星塞替派(也称作thiophosphoamide、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺和苯达莫司汀HCl
mTOR抑制剂例如包括坦罗莫司；地磷莫司(正式称作deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669，并且在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:264)，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。
示例性免疫调节剂例如包括阿夫土珠单抗(afutuzumab)(从可获得)；PEG化非格司亭来那度胺(CC-5013、雷利米得)；沙立度胺actimid(CC4047)；和IRX-2(从IRXTherapeutics可获得的人细胞因子的混合物，包含白介素1、白介素2和干扰素γ、CAS 951209-71-5)。
示例性蒽环类例如包括多柔比星(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和柔红霉素盐酸盐(rubidomycin)、)；脂质体柔红霉素(柠檬酸柔红霉素脂质体、)；米托蒽醌(DHAD、)；表柔比星(EllenceTM)；伊达比星(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；近灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。
示例性长春碱类生物碱例如包括酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春地辛)；长春碱(也称作硫酸长春碱、长春花碱和VLB、和)；和长春瑞滨
示例性蛋白酶体抑制剂包括硼替佐米卡非佐米(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与贝伦妥单抗(brentuximab)组合施用至受试者。贝伦妥单抗是抗CD30抗体和单甲基澳瑞司他汀(auristatin)E的抗体-药物缀合物。在实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)，例如，复发性或难治性HL。在实施方案中，受试者包含CD30+HL。在实施方案中，受试者已经接受过自体干细胞移植(ASCT)。在实施方案中，受试者尚未接受ASCT。在实施方案中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与贝伦妥单抗和达卡巴嗪组合或与贝伦妥单抗和苯达莫司汀组合施用至受试者。达卡巴嗪是化学名称为5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)咪唑-4-甲酰胺的烷基化剂。苯达莫司汀是化学名称为4-[5-[双(2-氯乙基)氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]丁酸的烷基化剂。在实施方案中，受试者患有霍奇金淋巴瘤(HL)。在实施方案中，受试者先前尚未用癌疗法治疗过。在实施方案中，受试者是至少60岁，例如，60、65、70、75、80、85岁或较老。在实施方案中，达卡巴嗪按以下剂量施用：约300-450mg/m2(例如，约300-325、325-350、350-375、375-400、400-425或425-450mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，苯达莫司汀按以下剂量施用：约75-125mg/m2(例如，75-100或100-125mg/m2，例如，约90mg/m2)，例如，静脉内施用。在实施方案中，贝伦妥单抗按以下剂量施用：约1-3mg/kg(例如，约1-1.5、1.5-2、2-2.5、或2.5-3mg/kg)，例如，静脉内施用，例如，每3周施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与CD20抑制剂，例如，抗CD20抗体(例如，抗CD20特异性抗体或双特异性抗体)或其片段组合施用至受试者。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、维妥珠单抗、obinutuzumab、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、ocaratuzumab和Pro131921(Genentech)。参见，例如，Lim等人,Haematologica.95.1(2010):135-43。
在一些实施方案中，抗CD20抗体包括利妥昔单抗。利妥昔单抗是与CD20结合和造成CD20表达细胞的细胞裂解的嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，例如，如www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2010/103705s5311lbl.pdf中所述。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，将利妥昔单抗静脉内施用，例如，作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约500-2000mg(例如，约500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1100、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、或1900-2000mg)利妥昔单抗。在一些实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：150mg/m2至750mg/m2，例如，约150-175mg/m2、175-200mg/m2、200-225mg/m2、225-250mg/m2、250-300mg/m2、300-325mg/m2、325-350mg/m2、350-375mg/m2、375-400mg/m2、400-425mg/m2、425-450mg/m2、450-475mg/m2、475-500mg/m2、500-525mg/m2、525-550mg/m2、550-575mg/m2、575-600mg/m2、600-625mg/m2、625-650mg/m2、650-675mg/m2或675-700mg/m2，其中m2表示受试者的体表面积。在一些实施方案中，利妥昔单抗按至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，利妥昔单抗按至少0.5周(例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8周或更长)的给药间隔施用。在一些实施方案中，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少2周，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更长时间。例如，利妥昔单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至少4个剂量(例如，每个治疗周期至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多个剂量)。
在一些实施方案中，抗CD20抗体由奥法木单抗组成。奥法木单抗是分子量大约149kDa的抗CD20IgG1κ人单克隆抗体。例如，奥法木单抗使用转基因小鼠和杂交瘤技术生成并且从重组鼠细胞系(NS0)表达及纯化。参见，例如，www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2009/125326lbl.pdf；和临床试验识别号NCT01363128、NCT01515176、NCT01626352和NCT01397591。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与奥法木单抗组合施用至受试者。在实施方案中，受试者患有CLL或SLL。
在一些实施方案中，将奥法木单抗作为静脉内输注施用。例如，每次输注提供约150-3000mg(例如，约150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1200、1200-1400、1400-1600、1600-1800、1800-2000、2000-2200、2200-2400、2400-2600、2600-2800或2800-3000mg)奥法木单抗。在实施方案中，奥法木单抗按起始剂量约300mg、随后2000mg施用，例如，施用约11个剂量，例如，施用24周。在一些实施方案中，奥法木单抗按至少4天(例如，4、7、14、21、28、35天或更长)的给药间隔施用。例如，奥法木单抗按以下给药间隔施用：至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、26、28、20、22、24、26、28、30周或更长时间。在一些实施方案中，奥法木单抗抗按本文所述的剂量和给药间隔施用一段时间，例如，至少1周，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60周或更长时间，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间，或1、2、3、4、5年或更长时间。例如，奥法木单抗按本文所述的剂量和给药间隔施用每个治疗周期总计至少2个剂量(例如，每个治疗周期至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20个或更多个剂量)。
在一些情况下，抗CD20抗体包括奥瑞珠单抗。奥瑞珠单抗是人源化抗CD20单克隆抗体，例如，如临床试验识别号NCT00077870、NCT01412333、NCT00779220、NCT00673920、NCT01194570和Kappos等人,Lancet.19.378(2011):1779-87中所述。
在一些情况下，抗CD20抗体包括维妥珠单抗。维妥珠单抗是针对CD20的人源化单克隆抗体。参见，例如，临床试验识别号NCT00547066、NCT00546793、NCT01101581和Goldenberg等人,Leuk Lymphoma.51(5)(2010):747-55。
在一些情况下，抗CD20抗体包括GA101。GA101(也称作obinutuzumab或RO5072759)是人源化和糖工程化的抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak.Curr.Opin.Investig.Drugs.10.6(2009):588-96；临床试验识别号：NCT01995669、NCT01889797、NCT02229422和NCT01414205；和www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2013/125486s000lbl.pdf。
在一些情况下，抗CD20抗体包括AME-133v。AME-133v(也称作LY2469298或ocaratuzumab)是针对的CD20的人源化IgG1单克隆抗体，与利妥昔单抗相比，所述单克隆抗体具有增加的FcγRIIIa受体亲和力和增强的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)活性。参见，例如，Robak等人,BioDrugs 25.1(2011):13-25；和Forero-Torres等人,Clin CancerRes.18.5(2012):1395-403。
在一些情况下，抗CD20抗体包括PRO131921。PRO131921是与利妥昔单抗相比，经工程化以具有更好的FcγRIIIa结合作用和增强的ADCC的人源化抗CD20单克隆抗体。参见，例如，Robak等人,BioDrugs25.1(2011):13-25；和Casulo等人,Clin Immunol.154.1(2014):37-46；和临床试验识别号NCT00452127。
在一些情况下，抗CD20抗体包括TRU-015。TRU-015是从针对CD20的抗体的结构域衍生的抗CD20融合蛋白。TRU-015比单克隆抗体小，但是保留Fc介导的效应子功能。参见，例如，Robak等人,BioDrugs25.1(2011):13-25。TRU-015含有与人IgG1铰链区连接的抗CD20单链可变片段(scFv)、CH2和CH3结构域，但是缺少CH1结构域和CL结构域。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD20抗体缀合于或否则结合至治疗药剂，例如，本文所述的化疗药剂(例如，环磷氮芥、氟达拉滨、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、去甲基化剂、肽疫苗、抗肿瘤抗生素、酪氨酸激酶抑制剂、烷基化剂、抗微管或抗有丝分裂剂)、抗过敏药剂、抗恶心药剂(或镇吐药)、止疼药或细胞保护药剂。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与B细胞淋巴瘤2(BCL-2)抑制剂(例如，venetoclax，也称作ABT-199或GDC-0199)和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与venetoclax和利妥昔单抗组合施用至受试者。Venetoclax是抑制抗凋亡蛋白BCL-2的小分子。下文显示venetoclax(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4.4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧)苯甲酰胺)的结构。
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有复发性CLL，例如，先前已经向受试者施用癌疗法。在实施方案中，venetoclax按以下剂量施用：约15-600mg(例如，15-20、20-50、50-75、75-100、100-200、200-300、300-400、400-500或500-600mg)，例如，每日一次施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用，例如，每月一次施用。
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与溶瘤病毒组合施用。在实施方案中，溶瘤病毒能够选择性地复制并触发癌细胞的死亡或减缓癌细胞的生长。在某些情况下，溶瘤病毒对非癌细胞没有影响或影响最小。溶瘤病毒包括但不限于溶瘤性腺病毒，溶瘤性单纯疱疹病毒，溶瘤性逆转录病毒，溶瘤性细小病毒，溶瘤性痘苗病毒，溶瘤性辛比斯病毒，溶瘤性流感病毒或溶瘤性RNA病毒(例如，溶瘤性呼肠孤病毒，溶瘤性新城疫病毒(NDV)，溶瘤性麻疹病毒或溶瘤性水疱性口炎病毒(VSV))。
在一些实施方案中，溶瘤性病毒是US2010/0178684A1中描述的病毒，例如，重组溶瘤性病毒，所述文献通过引用方式完整并入本文。在一些实施方案中，重组溶瘤性病毒包含编码免疫应答或炎症反应抑制剂的核酸序列(例如，异源核酸序列)，例如，如US2010/0178684A1中所述，所述文献通过引用方式完整并入本文。在实施方案中，重组溶瘤性病毒(例如，溶瘤性NDV)包含凋亡前体蛋白(例如，凋亡素(apoptin))、细胞因子(例如，GM-CSF、干扰素-γ、白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α)、免疫球蛋白(例如，针对ED-B纤连蛋白的抗体)、肿瘤相关抗原、双特异性衔接头蛋白(例如，针对NDV HN蛋白和T细胞共刺激受体(如CD3或CD28)的双特异性抗体或抗体片段；或在人IL-2和针对NDV HN蛋白的单链抗体之间的融合蛋白)。参见，例如，Zamarin等人,Future Microbiol.7.3(2012):347-67，所述文献通过引用方式完整并入本文。在一些实施方案中，溶瘤性病毒是US 8591881B2、US 2012/0122185A1或US 2014/0271677A1中描述的嵌合溶瘤性NDV，所述文献各自通过引用方式完整地并入本文。
在一些实施方案中，溶瘤性病毒包含旨在癌细胞中排他性复制的条件复制型腺病毒(CRAd)。参见，例如，Alemany等人,Nature Biotechnol.18(2000):723-27。在一些实施方案中，溶瘤性腺病毒包含在通过引用方式完整并入本文的Alemany等人的第725页上表1中描述的一种病毒。
示例性溶瘤性病毒包括但不限于以下：
B组溶瘤性腺病毒(ColoAd1)(PsiOxus Therapeutics Ltd.)(参见，例如，临床试验识别码：NCT02053220)；ONCOS-102(之前称CGTG-102)，其是包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的腺病毒(Oncos Therapeutics)(参见，例如，临床试验识别码：NCT01598129)；VCN-01，其是编码人PH20透明质酸酶的基因修饰的溶瘤性人腺病毒(VCNBiosciences，S.L.)(参见，例如，临床试验识别码：NCT02045602和NCT02045589)；条件复制型腺病毒ICOVIR-5，其是衍生自野生型人腺病毒血清型5(Had5)的病毒，已经修饰成在视网膜母细胞瘤/E2F途径失调的癌细胞中选择性复制(Institutd'Oncologia)(参见，例如，临床试验识别码：NCT01864759)；Celyvir，其包含骨髓衍生的经溶瘤性腺病毒ICOVIR5感染的自体间充质干细胞(MSC)(Hospital Infantil UniversitarioJesús,Madrid,Spain/Ramon Alemany)(参见，例如，临床试验识别码：NCT01844661)；CG0070，其是条件复制型溶瘤性血清型5腺病毒(Ad5)，其中人E2F-1启动子驱动必需E1a病毒基因表达，因而限制病毒复制和对Rb途径缺陷的肿瘤细胞的细胞毒性(Cold Genesys,Inc.)(参见，例如，临床试验识别码：NCT02143804)；或DNX-2401(以前命名为Δ-24-RGD)，其是一种腺病毒，所述腺病毒已经过工程化以在视网膜母细胞瘤(Rb)途径缺陷的细胞中选择性复制并且感染更高效表达某些RGD结合性整联蛋白细胞(Clinica Universidad de Navarra,Universidad de Navarra/DNAtrix,Inc.)(参见，例如，临床试验识别码：NCT01956734)。
在一些实施方案中，通过注射，例如，皮下、动脉内、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射，施用本文所述的溶瘤性病毒。在实施方案中，将本文所述的溶瘤性病毒瘤内、经皮、经粘膜、经口、鼻内或借助肺施用法施用。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与减少Treg细胞群的分子组合施用于受试者。减少Treg细胞的数量(例如，耗尽)的方法在本领域中是已知的，并且包括，例如，CD25耗尽，环磷酰胺给药，调节GITR功能。不希望受理论的束缚，但相信在单采血液成分术前或施用所述的表达CAR的细胞前，降低受试者中Treg细胞的数目减少了肿瘤微环境中不希望的免疫细胞(例如，Treg细胞)的数目并降低了受试者复发的风险。
在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与靶向GITR和/或调节GITR功能的分子，如GITR激动剂和/或耗尽调节性T细胞(Treg)的GITR抗体组合施用至受试者。在一个实施方案中，将GITR结合分子和/或调节GITR功能的分子(例如，GITR激动剂和/或耗尽Treg的GITR抗体)在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。示例性GITR激动物例如包括GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如，双价抗GITR抗体)，如，例如，以下文献中描述的GITR融合蛋白；美国专利号6,111,090、欧洲专利号090505B1、美国专利号8,586,023、PCT公开号WO 2010/003118和2011/090754，或例如以下文献中描述的抗GITR抗体：美国专利号7,025,962、欧洲专利号1947183B1、美国专利号7,812,135、美国专利号8,388,967、美国专利号8,591,886、欧洲专利号EP 1866339、PCT公开号WO 2011/028683、PCT公开号WO 2013/039954、PCT公开号WO2005/007190、PCT公开号WO 2007/133822、PCT公开号WO2005/055808、PCT公开号WO 99/40196、PCT公开号WO 2001/03720、PCT公开号WO99/20758、PCT公开号WO2006/083289、PCT公开号WO 2005/115451、美国专利号7,618,632和PCT公开号WO 2011/051726。
在一个实施方案中，将本文所述表达CAR的细胞与mTOR抑制剂(例如，本文所述的mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素类似物如依维莫司)组合施用至受试者。在一个实施方案中，mTOR抑制剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，mTOR抑制剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述表达CAR的细胞与GITR激动剂(例如，本文所述GITR激动剂)联合施用给受试者。在一个实施方案中，GITR激动剂在表达CAR的细胞之前施用。例如，在一个实施方案中，GITR激动剂可以在细胞的单采血液成分术之前施用。在一个实施方案中，受试者患有CLL。
在一个实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂(例如，本文所述的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-1抑制剂，例如，本文所述的SHP-1抑制剂，例如，葡萄糖酸锑钠。在一个实施方案中，蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂是SHP-2抑制剂。
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞可以与激酶抑制剂组合使用。在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，本文所述的CDK4抑制剂，例如，CDK4/6抑制剂，如，例如，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮盐酸盐(也称作palbociclib或PD0332991)。在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，本文所述的BTK抑制剂，如，例如，依鲁替尼。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，本文所述的mTOR抑制剂，如，例如，雷帕霉素、雷帕霉素类似物、OSI-027。mTOR抑制剂可以例如是mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂，例如，本文所述的mTORC1抑制剂和/或mTORC2抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是MNK抑制剂，例如，本文所述的MNK抑制剂，如，例如，4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制剂可以例如是MNK1a、MNK1b、MNK2a和/或MNK2b抑制剂。在一个实施方案中，激酶抑制剂是本文所述的双重PI3K/mTOR抑制剂，如，例如，PF-04695102。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的CDK4抑制剂：aloisine A；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(3S,4R)-3-羟-1-甲基-4-哌啶基]-4-色烯酮；克里唑替尼(PF-02341066)；2-(2-氯苯基)-5,7-二羟基-8-[(2R,3S)-2-(羟甲基)-1-甲基-3-吡咯烷基]-4H-1-苯并吡喃-4-酮、盐酸盐(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；indisulam(E7070)；roscovitine(CYC202)；palbociclib(PD0332991)；dinaciclib(SCH727965)；N-[5-[[(5-叔丁基噁唑-2-基)甲基]硫代]噻唑-2-基]哌啶-4-甲酰胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并吖庚因-2-基]氨基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羧酸N-(哌啶-4-基)酰胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲磺酰基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)和XL281(BMS908662)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是CDK4抑制剂，例如，palbociclib(PD0332991)，并且palbociclib以约50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如，75mg、100mg或125mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期的14-21天，或21天周期的每日施用持续7-12天。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的palbociclib。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4或6抑制剂(例如，本文所述的CDK4抑制剂或CDK6抑制剂)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与CDK4/6抑制剂(例如，靶向CDK4和CDK6二者的抑制剂)(例如，本文所述的CDK4/6抑制剂)组合施用至受试者。在一个实施方案中，受试者患有MCL。MCL是对目前可用疗法反应不良的侵袭性癌症，即，基本上不可治愈。在许多的MCL病例中，细胞周期蛋白D1(CDK4/6的调节物)在MCL细胞中表达(例如，归因于涉及免疫球蛋白和细胞周期蛋白D1基因的染色体转位)。因此，在不受理论约束的情况下，认为MCL细胞对CDK4/6抑制高度敏感，特异性高(即，对正常免疫细胞的影响最小)。单独的CDK4/6抑制剂在治疗MCL方面具有某种功效，但是仅已经实现部分缓解，复发率高。示例性CDK4/6抑制剂是下文显示其结构的LEE011(也称作ribociclib)。
不受理论约束，认为联合CDK4/6抑制剂(例如，本文所述的LEE011或其他CDK4/6抑制剂)施用本文所述的表达CAR的细胞可以实现更高的反应性，例如，缓解率更高和/或复发率更低，例如，与单一CDK4/6抑制剂相比。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的BTK抑制剂：依鲁替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。在一个优选实施方案中，BTK抑制剂不减少或不抑制白介素-2诱导型激酶(ITK)的激酶活性，并且选自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；和LFM-A13。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是BTK抑制剂，例如，依鲁替尼(PCI-32765)。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与BTK抑制剂(例如，依鲁替尼)组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与依鲁替尼(也称作PCI-32765)组合施用至受试者。下文显示依鲁替尼(1-[(3R)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]哌啶-1-基]丙-2-烯-1-酮)的结构。
在实施方案中，受试者患有CLL、套细胞淋巴瘤(MCL)、或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失(del(17p))(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没有del(17p)。在实施方案中，受试者患有复发的CLL或SLL，例如，先前已经向受试者施用癌疗法(例如，先前向其施用过一次、两次、三次或四次既往癌疗法)。在实施方案中，受试者患有难治性CLL或SLL。在其他实施方案中，受试者患有滤泡淋巴瘤，例如，复发性或难治性滤泡淋巴瘤。在一些实施方案中，将依鲁替尼按约300-600mg/天(例如，约300-350、350-400、400-450、450-500、500-550或550-600mg/天，例如，约420mg/天或约560mg/天)的剂量施用，例如，口服施用。在实施方案中，将依鲁替尼以约250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如，250mg、420mg或560mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依鲁替尼。
在一些实施方案中，依鲁替与利妥昔单抗组合施用。参见，例如，Burger等人(2013)Ibrutinib In Combination With Rituximab(iR)Is Well Tolerated andInduces a High Rate Of Durable Remissions In Patients With High-Risk ChronicLymphocytic Leukemia(CLL):New,Updated Results Of a Phase II Trial In40Patients，摘要675，展示于55th ASH Annual Meeting and Exposition,New Orleans,LA7-10Dec。不受理论约束，认为添加依鲁替尼增强了T细胞增殖性应答并且可以将T细胞从T-辅助-2(Th2)移向T-辅助-1(Th1)表型。Th1和Th2是辅助T细胞的表型，其中Th1与Th2指导不同的免疫应答途径。Th1表型与促炎反应相关，例如，杀伤细胞，如胞内病原体/病毒或癌细胞，或永续自身免疫应答。Th2表型与嗜酸性粒细胞堆积和抗炎反应相关。
在本文的方法，用途和组合物的一些实施方案中，BTK抑制剂是国际申请WO/2015/079417中描述的BTK抑制剂，其全部内容通过引用并入本文。例如，在一些实施方案中，BTK抑制剂是式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；
其中，
R1是氢、任选由羟基取代的C1-C6烷基；
R2是氢或卤素；
R3是氢或卤素；
R4是氢；
R5是氢或卤素；
或R4和R5彼此连接并代表键，-CH2-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-；-CH2-CH＝CH-；或-CH2-CH2-CH2-；
R6和R7彼此独立地表示H、任选由羟基取代的C1-C6烷基、任选由卤素或羟基取代的C3-C6环烷基或卤素；
R8、R9、R、R’、R10和R11彼此独立地代表H或任选由C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；或R8、R9、R、R’、R10和R11中的任何两个与它们所结合的碳原子一起可以形成3-6元饱和碳环；
R12是氢或任选由卤素或C1-C6烷氧基取代的C1-C6烷基；
或R12和R8、R9、R、R’、R10或R11中的任何一个与它们所结合的原子一起可以形成4、5、6或7元的氮杂环，该环可以任选地由卤素，氰基、羟基、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代；
n为0或1；和
R13是任选由C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或N,N-二-C1-C6烷基氨基取代的C2-C6烯基；任选由C1-C6烷基或C1-C6烷氧基取代的C2-C6炔基；或任选由C1-C6烷基取代的C2-C6环氧烷基(alkenyl oxide)。
在一些实施方案中，式I的BTK抑制剂选自：N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-3-基)氧代)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-烯酰)吖丁啶-3-基)氧代)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰吖丁啶-3-基)氧代)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吖丁啶-3-基)氧代)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-4-基)氧代)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙炔酰氨基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(E)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(4-甲氧基-N-甲基丁-2-烯酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰胺基)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(4-环丙基-2-氟苯甲酰胺基)-5-氟-2-甲基苯基)嘧啶-5-基)氧代)乙基)-N-甲基环氧乙烷-2-甲酰胺；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-8-氟-1-氧异喹啉基-2(1H)-基)苯基)嘧啶-5-基)氧代)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(2-丙烯酰胺乙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-乙基丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-(2-氟乙基)丙烯酰胺)乙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-((1-丙烯酰胺基环丙基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-(2-丙烯酰胺基丙氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(丁-2-炔酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丙烯酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-(2-(N-甲基丁-2-炔酰胺基)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(3-(N-甲基丙烯酰胺)丙氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-(丁-2-炔酰基)吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉基-1(2H)-酮；N-(2-((4-氨基-6-(3-(6-环丙基-1-氧-3,4-二氢异喹啉基-2(1H)-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)嘧啶-5-基)氧代)乙基)-N-甲基丙烯酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；2-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉基-1(2H)-酮；N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4S)-1-(丁-2-炔酰基)-4-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(6-氨基-5-(((2S,4R)-1-(丁-2-炔酰基)-4-氟吡咯烷-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-N-(3-(6-氨基-5-((1-丙炔酰吖丁啶-2-基)甲氧基)嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(S)-2-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-(羟甲基)苯基)-6-环丙基-3,4-二氢异喹啉基-1(2H)-酮；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰吖丁啶-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；(R)-N-(3-(5-((1-丙烯酰哌啶-3-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2R,3S)-1-丙烯酰-3-甲氧基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；N-(3-(5-(((2S,4R)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺；或N-(3-(5-(((2S,4S)-1-丙烯酰-4-氰基吡咯烷-2-基)甲氧基)-6-氨基嘧啶-4-基)-5-氟-2-甲基苯基)-4-环丙基-2-氟苯甲酰胺。
除非另外提供，上文在描述式I的BTK抑制剂中使用的化学术语根据它们如国际申请WO/2015/079417中所述的意思使用，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的mTOR抑制剂：坦罗莫司；地磷莫司(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧-11,36-二氧杂-4-偶氮三环并[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧环己基二甲基次膦酸酯，也称作AP23573和MK8669；依维莫司(RAD001)；雷帕霉素(AY22989)；塞马莫德(simapimod)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰甘氨酰-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-(SEQ ID NO:264)内盐(SF1126)；和XL765。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR双重抑制剂：2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹噁啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，雷帕霉素，并且雷帕霉素以约3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如，6mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续21天周期，或每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的雷帕霉素。在一个实施方案中，激酶抑制剂是mTOR抑制剂，例如，依维莫司，并且依维莫司以约2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如，10mg)的剂量每日施用一段时间，例如，每日施用持续28天周期。在一个实施方案中，施用1、2、3、4、5，6、7、8、9、10、11、12或更多个周期的依维莫司。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的MNK抑制剂：CGP052088；4-氨基-3-(对-氟苯基氨基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢酰胺；ETC-1780445-2；和4-氨基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂(例如，本文所述的PI3K抑制剂，例如，idelalisib或duvelisib)和/或利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与idelalisib和利妥昔单抗组合施用至受试者。在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与duvelisib和利妥昔单抗组合施用至受试者。idelalisib(也称作GS-1101或CAL-101；Gilead)是阻断PI3Kδ同工型的小分子。下文显示idelalisib(5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(7H-嘌呤-6-基氨基)丙基]-4(3H)-喹唑酮)的结构。
Duvelisib(也称作IPI-145；Infinity Pharmaceuticals and Abbvie)是阻断PI3K-δ,γ的小分子。下文显示duvelisib的结构(8-氯-2-苯基-3-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-1(2H)-异喹啉酮)。
在实施方案中，受试者患有CLL。在实施方案中，受试者患有复发的CLL，例如，先前已经向受试者施用过一种癌疗法(例如，先前施用过抗CD20抗体或先前施用过依鲁替尼)。例如，受试者在第17染色体短臂中具有缺失(del(17p))(例如，在白血病细胞中)。在其他实例中，受试者没有del(17p)。在实施方案中，受试者包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在其他实施方案中，受试者不包含在免疫球蛋白重链可变区(IgVH)基因中包含突变的白血病细胞。在实施方案中，受试者在第11染色体长臂中具有缺失(del(11q))。在其他实施方案中，受试者没有del(11q)。在实施方案中，idelalisib按以下剂量施用：约100-400mg(例如，100-125、125-150、150-175、175-200、200-225、225-250、250-275、275-300、325-350、350-375、或375-400mg)，例如，BID施用。在实施方案中，duvelisib按以下剂量施用：约15-100mg(例如，约15-25、25-50、50-75、或75-100mg)，例如，一日2次施用。在实施方案中，利妥昔单抗按以下剂量施用：约350-550mg/m2(例如，350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、或475-500mg/m2)，例如，静脉内施用。
在一个实施方案中，激酶抑制剂是选自以下的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和mTOR双重抑制剂：2-氨基-8-[反-4-(2-羟乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基-2-{4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；apitolisib(GDC-0980，RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮马来酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-吗啉基吡啶并[3',2':4,5]呋喃并(furo)[3,2-d]嘧啶-2-基]酚(PI-103)；5-(9-异丙基-8-甲基-2-吗啉代-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584，SB2343)；和N-[2-[(3,5-二甲氧苯基)氨基]喹噁啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧苯基)羰基]氨基苯磺酰胺(XL765)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与间变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂组合施用至受试者。示例性ALK激酶抑制剂包括但不限于克里唑替尼(Pfizer)、色瑞替尼(Novartis)、艾乐替尼(alectinib)(Chugai)、brigatinib(也称作AP26113；Ariad)、entrectinib(Ignyta)、PF-06463922(Pfizer)、TSR-011(Tesaro)(参见，例如，临床试验识别编号NCT02048488)、CEP-37440(Teva)和X-396(Xcovery)。在一些实施方案中，受试者患有实体癌，例如，本文所述的实体癌，例如，肺癌。
克里唑替尼的化学名称是3-[(1R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-(1-哌啶-4-基吡唑-4-基)吡啶-2-胺。色瑞替尼的化学名称是5-氯-N2-[2-异丙氧基-5-甲基-4-(4-哌啶基)苯基]-N4-[2-(异丙基磺酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。艾乐替尼的化学名称是9-乙基-6.6-二甲基-8-(4-吗啉代哌啶-1-基)-11-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[b]咔唑-3-甲腈。Brigatinib的化学名称是5-氯-N2-{4-[4-(二甲基氨基)-1-哌啶基]-2-甲氧苯基}-N4-[2-(二甲基磷酰基)苯基]-2,4-嘧啶二胺。Entrectinib的化学名称是N-(5-(3,5-二氟苄基)-1H-吲唑-3-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)苯甲酰胺。PF-06463922的化学名称是(10R)-7-氨基-12-氟-2,10,16-三甲基-15-氧代-10,15,16,17-四氢-2H-8,4-(甲桥)吡唑并[4,3-h][2,5,11]-苯并噁二氮杂十四(熳)环-3-甲腈。CEP-37440的化学结构是(S)-2-((5-氯-2-((6-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)-1-甲氧基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]环庚烯-2-基)氨基)嘧啶-4-基)氨基)-N-甲基苯甲酰胺。X-396的化学名称是(R)-6-氨基-5-(1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基)-N-(4-(4-甲基哌嗪-1-羰基)苯基)哒嗪-3-甲酰胺。
也可以使用抑制钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶的药物(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在又一个方面，本公开的细胞组合物可以连同骨髓移植、使用化疗药如氟达拉滨的T细胞消融疗法、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺和/或抗体如OKT3或CAMPATH一起(例如，在其之前、同时或在其后)施用至受试者。在一个方面，将本公开的细胞组合物在B细胞消融疗法如与CD20反应的物质(例如，Rituxan)后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以接受高剂量化疗标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受扩充的本公开免疫细胞输注。在一个额外的实施方案中，将扩充的细胞在手术前或在之后施用。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂组合施用至受试者。IDO是催化氨基酸L-色氨酸降解成犬尿氨酸的酶。许多癌过量表达IDO，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、颈部癌、胃癌、卵巢癌、头癌和肺癌。pDC、巨噬细胞和树突细胞(DC)可以表达IDO。不受理论约束，认为(例如，IDO催化)L-色氨酸减少通过诱导T细胞失能和凋亡而产生免疫抑制环境。因此，在不受理论约束的情况下，认为IDO抑制剂可以增强本文所述的表达CAR的细胞的效能，例如，通过减少对表达CAR的免疫细胞的抑制或其死亡。在实施方案中，受试者患有实体瘤，例如，本文所述的实体瘤，例如，前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、颈癌、胃癌、卵巢癌、头癌或肺癌。示例性IDO抑制剂包括但不限于1-甲基-色氨酸、indoximod(NewLink Genetics)(参见，例如，临床试验识别号NCT01191216；NCT01792050)和INCB024360(Incyte Corp.)(参见，例如，临床试验识别号NCT01604889；NCT01685255)。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与髓样衍生阻抑细胞(MDSC)的调节物组合施用至受试者。MDSC在许多实体瘤的周围及其肿瘤部位积累。这些细胞抑制T细胞反应，因而妨碍表达CAR的细胞疗法的效能。不受理论约束，认为施用MDSC调节物增强本文所述的表达CAR的细胞的效能。在一个实施方案中，受试者患有实体瘤，例如，本文所述的实体瘤，例如，胶质母细胞瘤。示例性MDSC调节物包括但不限于MCS110和BLZ945。MCS110是针对巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的单克隆抗体(mAb)。参见，例如，临床试验识别号NCT00757757。BLZ945是集落刺激因子1受体(CSF1R)的小分子抑制剂。参见，例如，Pyonteck等人,Nat.Med.19(2013):1264-72。下文显示BLZ945的结构。
在实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与抑制或降低免疫抑制性浆细胞活性的物质组合施用至受试者。已经证实免疫抑制性浆细胞妨碍T细胞依赖性免疫原性化疗，如奥沙利铂(Shalapour等人,Nature 2015,521:94-101)。在一个实施方案中，免疫抑制的浆细胞可以表达IgA、白介素(IL)-10和PD-L1中的一种或多种。在一个实施方案中，药物是表达CD19 CAR的细胞或表达BCMA CAR的细胞。
在一些实施方案中，将本文所述的表达CAR的细胞与白介素-15(IL-15)多肽、白介素-15受体α(IL-15Ra)多肽或IL-15多肽和IL-15Ra多肽(例如，hetIL-15(AdmuneTherapeutics,LLC))二者的组合联合施用至受试者。hetIL-15是IL-15和IL-15Ra的异二聚体非共价复合物。hetIL-15例如在通过引用方式并入本文的美国8,124,084、美国2012/0177598、美国2009/0082299、美国2012/0141413和美国2011/0081311中描述。在实施方案中，皮下施用het-IL-15。在实施方案中，受试者患有癌症，例如，实体癌，例如，黑素瘤或结肠癌。在实施方案中，受试者患有转移性癌症。
在实施方案中，向患有本文所述的疾病(例如，血液疾病，例如，AML或MDS)的受试者施用与药物(例如，细胞毒药物或化疗药、生物治疗药(例如，抗体(例如，单克隆抗体)或细胞治疗药)或抑制剂(例如，激酶抑制剂))组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与细胞毒药物(例如，CPX-351(Celator Pharmaceuticals)、阿糖胞苷、柔红霉素、vosaroxin(Sunesis Pharmaceuticals)、sapacitabine(CyclacelPharmaceuticals)、伊达比星或米托蒽醌)组合的本文所述的表达CAR的细胞。CPX-351是按5:1摩尔比包含阿糖胞苷和柔红霉素的脂质体制剂。在实施方案中，向受试者施用与低甲基化药物(例如，DNA甲基转移酶抑制剂，例如，阿扎胞苷或地西他滨)组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与生物疗法，例如，抗体或细胞疗法，例如，225Ac-林妥珠单抗(lintuzumab)(Actimab-A；Actinium Pharmaceuticals)、IPH2102(InnatePharma/Bristol Myers Squibb)、SGN-CD33A(Seattle Genetics)或吉妥珠单抗奥加米星(Mylotarg；Pfizer)组合的本文所述的表达CAR的细胞。SGN-CD33A是包含与抗CD33抗体连接的吡咯并苯二氮卓二聚体的抗体-药物缀合物(ADC)。Actimab-A是用锕标记的抗CD33抗体(林妥珠单抗(lintuzumab))。IPH2102是靶向杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的单克隆抗体。在实施方案中，向受试者施用与FLT3抑制剂(例如，索拉非尼(Bayer)、米哚妥林(midostaurin)(Novartis)、奎扎替尼(quizartinib)(Daiichi Sankyo)、crenolanib(ArogPharmaceuticals)、PLX3397(Daiichi Sankyo)、AKN-028(Akinion Pharmaceuticals)或ASP2215(Astellas))组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与异柠檬酸脱氢酶(IDH)抑制剂(例如，AG-221(Celgene/Agios)或AG-120(Agios/Celgene))组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与细胞周期调节蛋白(例如，polo样激酶1(Plk1)的抑制剂，例如，volasertib(Boehringer Ingelheim)；或细胞周期蛋白依赖性激酶9(Cdk9)的抑制剂，例如，阿伏西地(Tolero Pharmaceuticals/SanofiAventis))组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与B细胞受体信号传导网络抑制剂(例如，B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)的抑制剂，例如，venetoclax(Abbvie/Roche)；或Bruton酪氨酸激酶(Btk)的抑制剂，例如，依鲁替尼(Pharmacyclics/Johnson&Johnson Janssen Pharmaceutical))组合的本文所述的表达CAR的细胞。在实施方案中，向受试者施用与M1氨基肽酶的抑制剂，例如，tosedostat(CTI BioPharma/Vernalis)；组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂，例如，pracinostat(MEI Pharma)；多重激酶抑制剂，例如，rigosertib(Onconova Therapeutics/Baxter/SymBio)；或肽类CXCR4反向激动剂，例如，BL-8040(BioLineRx)组合的本文所述的表达CAR的细胞。
在另一个实施方案中，受试者在细胞移植(例如，同种异型干细胞移植)前接受输注本发明的表达CAR的细胞或本发明的组合物。在一个优选实施方案中，例如，通过将编码BCA CAR和/或TA CAR的mRNA电穿孔，表达CAR的细胞瞬时表达BCA CAR和/或TA CAR，因而在输注供体干细胞之前任一种或两种CAR的表达终止以避免植入失败。
在施用期间或之后，一些患者可能对本公开的化合物和/或其他抗癌药出现过敏反应；因此，经常施用抗过敏药以最大限度降低过敏反应风险。合适的抗过敏药包括皮质类固醇类，如地塞米松(例如，)、倍氯米松(例如，)、氢化可的松(也称作可的松、氢化可的松琥珀酸钠、氢化可的松磷酸钠并且以商品名称磷酸氢化可的松、Hydrocort和@出售)、泼尼松龙(prednisolone)(以商品名称和出售)、泼尼松(以商品名称Liquid 和出售)、甲基泼尼松龙(也称作6-甲基泼尼松龙、醋酸甲泼尼龙、甲泼尼龙琥珀酸钠，以商品名称 和出售)；抗组胺药，如苯海拉明(例如，)、安泰乐和赛庚啶；及支气管扩张药，如β-肾上腺素能药受体激动剂、沙丁胺醇(albuterol)(例如，)和特布他林
在施用本公开的化合物和/或其他抗癌药期间或之后，一些患者可能出现恶心；因此，镇吐药用于预防恶心(反胃)和呕吐。合适的镇吐药包括阿瑞吡坦昂丹司琼格拉司琼HCl劳拉西泮地塞米松乙二磺酸卡索匹坦(和)及其组合。
经常开具减轻治疗阶段期间体验的疼痛的药物，以使患者更舒适。经常使用常见的非处方镇痛药，如但是，阿片类镇痛药如氢可酮/扑热息痛(paracetamol)或氢可酮/对乙酰氨基酚(例如，)、吗啡(例如，或)、羟考酮(例如，或)、盐酸羟吗啡酮和芬太尼(例如，)也可用于中度或重度疼痛。
在保护正常细胞免遭治疗毒性和限制器官毒性的工作中，可以使用细胞保护药(如神经保护药、自由基清除剂、心脏保护剂、蒽环类外渗中和剂、营养药等)作为辅助疗法。合适的细胞保护药包括氨磷汀谷氨酰胺、地美司钠(dimesna)美司钠(mesna)右雷佐生(或)、扎利罗登和亚叶酸(leucovovin)(也称作亚叶酸钙、嗜橙菌因子和亚叶酸)。
通过代码数字、类属或商标标示的活性化合物的结构可以是取自标准纲要“TheMerck Index”的实际版本或取自数据库，例如国际专利(例如IMS World Publications)。
可以如本领域(如上文援引的文档中)所述那样制备并施用上文提到的化合物，其可以与本公开的化合物组合使用。
在一个实施方案中，本公开提供药物组合物，所述药物组合物包含与适于单独或与其他抗癌药一起施用至人类或动物受试者的可药用载体在一起的本公开的至少一种化合物(例如，本公开的化合物)或其可药用盐。
在一个实施方案中，本公开提供治疗患有细胞增生性疾病(如癌症)的人类受试者或动物受试者的方法。本公开提供治疗需要这种治疗的人类或动物受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的单独或与其他抗癌药组合的本公开化合物(例如，本公开的化合物)或其可药用盐。
特别地，多种组合物将配制在一起作为联用治疗药或分别地施用。
在联合疗法中，本公开的化合物和其他抗癌药可以同时、同步或依次地施用，无具体的时间限值，其中这种施用在患者身体内提供两种化合物的治疗有效水平。
在一个优选实施方案中，本公开的化合物和其他抗癌药通常按任何顺序通过输注依次施用或经口施用。给药方案可以根据疾病阶段、患者身体健全度、各药物的安全特征和各药物的耐受性以及施用该组合的主治医生和医疗执业者熟知的其他标准变动。本公开的化合物和其他抗癌药可以取决于正在用于治疗的具体周期，彼此相隔数分钟、数小时、数日或甚至数周施用。此外，周期可能包括在治疗周期期间将一种药物比另一种药物更经常地施用及每次施用该药物时按不同剂量施用。
在本公开的另一个方面，提供试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种本公开的化合物和如本文中公开的联用配偶体。代表性试剂盒包括(a)本公开的化合物或其可药用盐，(b)至少一种联用配偶体，例如，如上文所示，因而这种试剂盒可以包含包装插页或其他包含施用说明的标示内容。
本公开的化合物也可以用来与已知的治疗方法组合例如促进激素或尤其照射的施用。本公开的化合物尤其可以用作放射增敏剂，尤其用于治疗对放疗显示敏感性差的肿瘤。
在一个实施方案中，可以向受试者施用减少或改善与施用表达CAR的细胞相关的副作用的药物。与施用表达CAR的细胞相关的副作用包括但不限于CRS和嗜血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)，又称作巨噬细胞活化综合征(MAS)。CRS的症状包括高热、恶心、一过性低血压、缺氧等。CRS可以包括临床组成型体征和症状，如发热、疲乏、厌食、肌痛、关节痛、恶心、呕吐和头痛。CRS可以包括临床皮肤体征和症状，如皮疹。CRS可以包括临床胃肠道体征和症状，如恶心、呕吐和腹泻。CRS可以包括临床呼吸系统体征和症状，如呼吸急促和低血氧症。CRS可以包括临床心血管体征和症状，如心动过速、脉压加宽、低血压、心输出量升高(早期)和心输出量潜在削弱(晚期)。CRS可以包括临床凝血体征和症状，如d-二聚体升高、低纤维蛋白原血症伴随或不伴随出血。CRS可以包括临床肾体征和症状，如氮质血症。CRS可以包括临床肝体征和症状，如转氨酶升高和高胆红素血症。CRS可以包括临床神病系统体征和症状，如头痛、精神状态改变、意识模糊、谵妄、找词困难或明显的失语症、幻觉、颤栗、辨距障碍、步态改变和癫痫发作。
因此，本文所述的方法可以包括施用本文所述的表达CAR的细胞至受试者并且进一步施用一种或多种药物以管理因表达CAR的细胞治疗产生的可溶性因子水平升高。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-6的一者或多者。在一个实施方案中，受试者中升高的因子是IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5和fraktalkine的一者或多者。因此，为治疗这种副作用所施用的物质可以是中和这些可溶性因子中一者或多者的物质。在一个实施方案中，中和这些可溶性形式中一者或多者的物质是抗体或其抗原结合片段。这类物质的例子包括但不限于类固醇(例如，皮质类固醇)、TNFα的抑制剂和IL-6的抑制剂。TNFα抑制剂的例子是抗TNFα抗体分子，如，英夫单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab)。TNFα抑制剂的另一个例子是融合蛋白如entanercept。TNFα的小分子抑制剂包括但不限于黄嘌呤衍生物(例如己酮可可碱)和安非他酮。IL-6抑制剂的例子是抗IL-6抗体分子如托珠单抗(tocilizumab)(toc)、sarilumab、elsilimomab、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301和FM101。在一个实施方案中，抗IL-6抗体分子是托珠单抗(tocilizumab)。基于IL-1R的抑制剂的例子是阿那白滞素。
在一些实施方案中，向受试者施用皮质类固醇，如，例如，甲基泼尼松龙、氢化可的松，连同其他。
在一些实施方案中，向受试者施用血管加压剂，如，例如，去甲肾上腺素、多巴胺、去氧肾上腺素、肾上腺素、加压素或其组合。
在一个实施方案中，可以向受试者施用解热药。在一个实施方案中，可以向受试者施用镇痛药。
在一个实施方案中，可以向受试者施用增强表达CAR的细胞的活性或健康的物质。例如，在一个实施方案中，该物质可以是抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子的物质。在一些实施方案中，调节或调控T细胞功能的分子是抑制性分子。在一些实施方案中，抑制性分子(例如，程序性死亡1(PD-1))可以降低表达CAR的细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子的例子包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷和TGFβ。例如通过在DNA、RNA或蛋白质水平的抑制作用而调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的抑制分子可以优化表达CAR的细胞性能。在实施方案中，例如，如本文所述的物质，例如，抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，抑制性核酸，例如，dsRNA，例如，siRNA或shRNA、成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)或锌指状物核酸内切酶(ZFN)，可以用来抑制表达CAR的细胞中抑制性分子的表达。在一个实施方案中，抑制剂是shRNA。
在一个实施方案中，调节或调控(例如抑制)T细胞功能的物质在表达CAR的细胞内被抑制。在这些实施方案中，抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子与编码CAR的组分(例如所有组分)的核酸连接。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子有效连接到启动子，例如H1-或U6衍生的启动子，使得抑制调节或调控例如抑制T细胞功能的分子表达的dsRNA分子被表达，例如在表达CAR的细胞内表达。参见，例如，Tiscornia G.,“Development ofLentiviral Vectors Expressing siRNA,”第3章，引自Gene Transfer:Delivery and Expression of DNA and RNA(编者Friedmann和Rossi).Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR等人(2002)Science 296:550–553；Miyagishi M等人,(2002)Nat.Biotechnol.19:497–500。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于相同的载体上，例如包含编码CAR的组件，例如所有组件的核酸分子的慢病毒载体上。在这样的实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子位于这样的载体上，例如慢病毒载体上，编码CAR的组件，例如所有组件的核酸的5’-或3’。编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子可以以与编码CAR的组件，例如所有组件的核酸相同或不同的方向转录。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子存在于除包含编码CAR的组件，例如所有组件的核酸分子的载体之外的载体上。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子在表达CAR的细胞内瞬时表达。在一个实施方案中，编码抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的核酸分子稳定地整合到表达CAR的细胞的基因组中。例如，在2014年12月19日提交的国际公开WO2015/090230的图47中提供随dsRNA分子一起表达CAR组分(例如所有组分)的示例性载体的布局，所述分子抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达，所述文献通过引用的方式并入本文。
可用于抑制调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子表达的dsRNA分子的例子包括靶向PD-1的RNAi剂，其中调节或调控(例如抑制)T细胞功能的分子是PD-1，例如，如2014年12月19日提交的国际公开WO2015/090230的段落[00489]和表16和表17中描述，所述文献通过引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，调节或调控(例如，抑制)T细胞功能的物质可以例如是与抑制性分子结合的抗体或抗体片段。例如，该物质可以是与PD-1、PD-L1、PD-L2或CTLA4结合的抗体或抗体片段(例如，伊匹木单抗(也称作MDX-010和MDX-101并且作为销售；Bristol-Myers Squibb；曲美木单抗(tremelimumab)(从Pfizer可获得的IgG2单克隆抗体，以前称作ticilimumab、CP-675,206))。在一个实施方案中，物质是与TIM3结合的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，物质是与LAG3结合的抗体或抗体片段。
PD-1是受体CD28家族的抑制性成员，所述家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞，T细胞和骨髓细胞上表达(Agata等人.1996Int.Immunol 8:765-75)。已经显示与PD-1结合时，针对PD-1、PD-L1和PD-L2的两种配体下调T细胞活化(Freeman等人,2000J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人,2001Nat Immunol 2:261-8；Carter等人,2002Eur J Immunol 32:634-43)。PD-L1在人类癌症中是丰富的(Dong等人.2003J Mol Med81:281-7；Blank等人.2005Cancer Immunol.Immunother 54:307-314；Konishi等人.2004Clin Cancer Res 10:5094)。可以通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用，逆转免疫抑制作用。PD-1、PD-L1和PD-L2的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本文所述的本公开car组合使用。例如，纳武单抗(nivolumab)(也称作BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)是特异性阻断PD-1的全人IgG4单克隆抗体。与PD-1特异性结合的纳武单抗(克隆5C4)和其他人单克隆抗体在US 8,008,449和WO2006/121168中公开。Pidilizumab(CT-011；Cure Tech)是与PD-1结合的人源化IgG1k单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD-1单克隆抗体在WO2009/101611中公开。派姆单抗(Pembrolizumab)(以前称作lambrolizumab并且又称作MK03475；Merck)是与PD-1结合的人源化IgG4单克隆抗体。派姆单抗和其他人源化抗PD-1抗体在US 8,354,509和WO2009/114335中公开。MEDI4736(Medimmune)是与PDL1结合的人单克隆抗体并且抑制配体与PD1的相互作用。MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化IgG1单克隆抗体。针对PD-L1的MDPL3280A和其他人单克隆抗体在美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中公开。其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链可变区和轻链可变区在WO2010/077634的SEQ ID NO:20和21中显示)和MDX-1 105(也称作BMS-936559和，例如，WO2007/005874中公开的抗PD-L1结合物)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，在WO2010/027827和WO2011/066342中公开)是阻断PD-1和B7-H1之间相互作用的PD-L2Fc融合可溶性受体。其他抗PD-1抗体包括AMP514(Amplimmune)，连同其他，例如，US 8,609,089、US2010028330和/或US 20120114649中公开的抗PD-1抗体。
在一个实施方案中，抗PD-1抗体或其片段是名为“针对PD-1的抗体及其用途(Antibody Molecules to PD-1and Uses Thereof)”的US2015/0210769(其通过引用的方式完整并入)中所述的抗PD-1抗体分子。在一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自抗体的重链与轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，所述抗体选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E中的任一者；或如US 2015/0210769的表1中描述，或由表1中核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如相同的或具有至少一个氨基酸改变，但是不多于两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在另一个实施方案中，抗PD-1抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个、两个、三个或四个可变区，抗体例如选自BAP049-hum01、BAP049-hum02、BAP049-hum03、BAP049-hum04、BAP049-hum05、BAP049-hum06、BAP049-hum07、BAP049-hum08、BAP049-hum09、BAP049-hum10、BAP049-hum11、BAP049-hum12、BAP049-hum13、BAP049-hum14、BAP049-hum15、BAP049-hum16、BAP049-Clone-A、BAP049-Clone-B、BAP049-Clone-C、BAP049-Clone-D或BAP049-Clone-E任一个的抗体；或如US 2015/0210769的表1所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。
TIM3(T细胞免疫球蛋白-3)还负向调节T细胞功能，特别在IFN-g分泌的CD4+辅助T细胞1和CD8+T细胞毒性1细胞中，并且在T细胞耗尽中发挥至关重要的作用。抑制TIM3和其配体(例如，半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂酰丝氨酸(PS)和HMGB1)之间的相互作用可以增加免疫应答。TIM3和其配体的抗体、抗体片段和其他抑制剂是本领域可获得的并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，靶向TIM3的抗体、抗体片段、小分子，或肽抑制剂与TIM3的IgV结构域结合以抑制与其配体的相互作用。抑制TIM3的抗体和肽在WO2013/006490和US20100247521中公开。其他抗TIM3抗体包括RMT3-23的人源化形式(Ngiow等人,2011,Cancer Res,71:3540-3551中公开)和克隆8B.2C12(Monney等人,2002,Nature,415:536-541中公开)。抑制TIM3和PD-1的双特异性抗体在US20130156774中公开。
在一个实施方案中，抗TIM3抗体或其片段是名为“针对TIM3的抗体及其用途(Antibody Molecules to TIM3and Uses Thereof)”的美国专利2015/0218274(其通过引用的方式完整并入)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自抗体的重链与轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，所述抗体选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23中的任一者；或如2015/0218274的表1-4中描述，或由表1-4中核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如相同的或具有至少一个氨基酸改变，但是不多于两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在另一个实施方案中，抗TIM3抗体分子包含来自本文所述抗体的至少一个、两个、三个或四个可变区，所述抗体例如选自ABTIM3、ABTIM3-hum01、ABTIM3-hum02、ABTIM3-hum03、ABTIM3-hum04、ABTIM3-hum05、ABTIM3-hum06、ABTIM3-hum07、ABTIM3-hum08、ABTIM3-hum09、ABTIM3-hum10、ABTIM3-hum11、ABTIM3-hum12、ABTIM3-hum13、ABTIM3-hum14、ABTIM3-hum15、ABTIM3-hum16、ABTIM3-hum17、ABTIM3-hum18、ABTIM3-hum19、ABTIM3-hum20、ABTIM3-hum21、ABTIM3-hum22、ABTIM3-hum23的任一个；或如US2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与前述任何序列基本相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性)的序列。
在其他实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质是CEACAM抑制剂(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5抑制剂)。在一个实施方案中，CEACAM的抑制剂是抗CEACAM抗体分子。示例性抗CEACAM-1抗体在WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO2014/059251和WO 2014/022332中描述，例如，单克隆抗体34B1、26H7和5F4；或其重组形式，例如，如US 2004/0047858、US 7,132,255和WO 99/052552中所述。在其他实施方案中，抗CEACAM抗体与CEACAM-5结合，如Zheng等人,PLoS One.2010Sep 2；5(9).pii:e12529(DOI:10:1371/journal.pone.0021146)中所述，或与CEACAM-1和CEACAM-5交叉反应，例如，如WO2013/054331和US 2014/0271618中所述。
不希望受理论约束，认为癌胚抗原细胞黏附分子(CEACAM)(如CEACAM-1和CEACAM-5)至少部分地介导对抗肿瘤免疫应答的抑制(参见，例如，Markel等人,J Immunol.2002Mar15；168(6):2803-10；Markel等人,J Immunol.2006Nov 1；177(9):6062-71；Markel等人,Immunology.2009Feb；126(2):186-200；Markel等人,Cancer ImmunolImmunother.2010Feb；59(2):215-30；Ortenberg等人,Mol Cancer Ther.2012 Jun；11(6):1300-10；Stern等人,J Immunol.2005Jun 1；174(11):6692-701；Zheng等人,PLoSOne.2010Sep 2；5(9).pii:e12529)。例如，已经将CEACAM-1描述为TIM-3的异嗜性配体及在TIM-3介导的T细胞耐受性和耗尽中发挥作用(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014)Nature doi:10.1038/nature13848)。在实施方案中，共同阻断CEACAM-1和TIM-3已经显示在异种移植物结直肠癌模型中增强抗肿瘤免疫应答(参见，例如，WO 2014/022332；Huang等人,(2014),上文)。在其他实施方案中，共同阻断CEACAM-1和PD-1降低T细胞耐受性，例如，如WO 2014/059251中所述那样。因此，CEACAM抑制剂可以与本文所述的其他免疫调节剂(例如，抗PD-1和/或抗TIM-3抑制物)一起使用，以增强针对癌(例如，黑素瘤、肺癌(例如，NSCLC)、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌以及如本文所述的其他癌)的免疫应答。
LAG3(淋巴细胞活化基因-3或CD223)是在活化的T细胞和B细胞上表达的细胞表面分子，其中已经显示所述细胞表面分子在CD8+T细胞耗尽中发挥作用。LAG3及其配体的抗体，抗体片段和其他抑制剂在本领域是可获得的，并且可以与本文所述的CD19 CAR组合使用。例如，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)是靶向LAG3的单克隆抗体。IMP701(Immutep)是拮抗剂LAG3抗体并且IMP731(Immutep和GlaxoSmithKline)是耗尽性LAG3抗体。其他LAG3抑制剂包括IMP321(Immutep)，所述IMP321是LAG3的可溶性部分和与MHC II类分子结合并激活抗原呈递细胞(APC)的Ig的重组融合蛋白。其他抗体例如在WO2010/019570中公开。
在一个实施方案中，抗LAG3抗体或其片段是名为“针对LAG3的抗体及其用途(Antibody Molecules to LAG3and Uses Thereof)”的美国专利2015/0259420(其全部内容通过引用并入本文)中所述的抗TIM3抗体分子。在一个实施方案中，抗LAG3抗体分子包含来自抗体的重链与轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR(或总体上全部CDR)，所述抗体选自BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J中的任一者；或如US 2015/0259420的表1中描述，或由表1中核苷酸序列编码；或与任一前述序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列；或密切相关的CDR，例如相同的或具有至少一个氨基酸改变，但是不多于两个、三个或四个改变(例如，置换、缺失或插入，例如，保守性置换)的CDR。
在又一个实施方案中，抗LAG-3抗体分子包含至少一个、两个、三个或四个可变区，所述可变区来自本文中描述的抗体，例如，选自以下任一者的抗体：BAP050-hum01、BAP050-hum02、BAP050-hum03、BAP050-hum04、BAP050-hum05、BAP050-hum06、BAP050-hum07、BAP050-hum08、BAP050-hum09、BAP050-hum10、BAP050-hum11、BAP050-hum12、BAP050-hum13、BAP050-hum14、BAP050-hum15、BAP050-hum16、BAP050-hum17、BAP050-hum18、BAP050-hum19、BAP050-hum20、huBAP050(Ser)(例如，BAP050-hum01-Ser、BAP050-hum02-Ser、BAP050-hum03-Ser、BAP050-hum04-Ser、BAP050-hum05-Ser、BAP050-hum06-Ser、BAP050-hum07-Ser、BAP050-hum08-Ser、BAP050-hum09-Ser、BAP050-hum10-Ser、BAP050-hum11-Ser、BAP050-hum12-Ser、BAP050-hum13-Ser、BAP050-hum14-Ser、BAP050-hum15-Ser、BAP050-hum18-Ser、BAP050-hum19-Ser或BAP050-hum20-Ser)、BAP050-克隆-F、BAP050-克隆-G、BAP050-克隆-H、BAP050-克隆-I或BAP050-克隆-J；或如US2015/0259420的表1中描述的抗体，或由表1中核苷酸序列编码的抗体；或来自与任一前述序列基本上相同(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高相同)的序列。在一些实施方案中，增强表达CAR的细胞活性的物质可以例如是包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中第一结构域是抑制性分子或其片段，并且第二结构域是与正向信号相关的多肽，例如，包含如本文所述的胞内信号(antracellular)传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与正向信号相关的多肽可以包含CD28、CD27、ICOS的共刺激结构域，例如，CD28、CD27和/或ICOS的胞内信号传导结构域和/或(例如，本文所述的)(例如，CD3ζ的)初级信号传导结构域。在一个实施方案中，融合蛋白是由表达CAR的相同细胞表达。在另一个实施方案中，融合蛋白由不表达本公开的CAR的细胞(例如，T细胞)表达。
在一个实施方案中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的物质是miR-17-92。
在一个实施方案中，增强本文所述的表达CAR的细胞活性的物质是细胞因子。细胞因子具有与T细胞扩充、分化、存活和稳态相关的重要功能。可以向接受本文所述的表达CAR的细胞的受试者施用的细胞因子包括：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-18和IL-21或其组合。在优选的实施方案中，施用的细胞因子是IL-7、IL-15、或IL-21或其组合。细胞因子可以施用一天一次或超过一天一次，例如，一天2次、一天3次、或一天4次。可以将细胞因子施用多于一天，例如将细胞因子施用2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周。例如，将细胞因子一天一次施用7天。
在实施方案中，细胞因子与表达CAR的T细胞组合施用。细胞因子可以与表达CAR的T细胞同时或同步施用，例如，在同一天施用。细胞因子可以配制在与表达CAR的T细胞相同的药物组合物中，或可以配制在分离的药物组合物中。备选地，细胞因子可以在施用表达CAR的T细胞后不久施用，例如，在施用表达CAR的T细胞后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用。在细胞因子按进行超过一天的给药方案施用的实施方案中，细胞因子给药方案的第1天可以在施用表达CAR的T细胞的同一天，或细胞因子给药方案的第1天可以是在施用表达CAR的T细胞后的1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在一个实施方案中，在第1天，将表达CAR的T细胞施用至受试者并且在第2天，将细胞因子一天一次施用接下来7天。在一个优选实施方案中，与表达CAR的细胞待组合施用的细胞因子是IL-7、IL-15或IL-21。
在其他实施方案中，将细胞因子在施用表达CAR的细胞后施用一个时间段，例如，在施用表达CAR的细胞后施用至少2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长时间。在一个实施方案中，将细胞因子在评估受试者对表达CAR的细胞的反应后施用。例如，根据本文所述的剂量和治疗方案，向受试者施用表达CAR的细胞。在施用表达CAR的细胞后2周、3周、4周、6周、8周、10周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、或1年或更长时间，使用本文所述任何方法，评估受试者对CART疗法的反应，包括对肿瘤生长的抑制、减少循环型肿瘤细胞、或肿瘤消退。可以向针对CART疗法未显示出足够反应的受试施用细胞因子。施用细胞因子至针对CART疗法具有次优反应的受试者改善了CART功效或抗肿瘤活性。在一个优选实施方案中，在施用表达CAR的细胞后施用的细胞因子是IL-7。
与低剂量mTOR抑制剂组合
在一个实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞与(例如，如PCT公开WO/2016/014530中所述的)免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂组合施用。
在另一个实施方案中，例如与未处理的表达CAR的细胞或未经治疗的受试者相比，施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂导致例如在培养物或受试者中表达CAR的细胞的增殖增加或延长。在实施方案中，增加的增殖与表达CAR的细胞数量的增加相关。实施例4和5中描述了用于测量增加或延长的增殖的方法。在另一个实施方案中，例如与未处理的表达CAR的细胞或未经治疗的受试者相比，施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂导致例如在培养物或受试者中表达CAR的细胞对癌细胞增加的杀伤。在实施方案中，癌细胞的增加的杀伤与肿瘤体积的减少有关。
在一个实施方案中，表达CAR分子(例如本文所述的CAR分子)的细胞与免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂(例如变构mTOR抑制剂，例如RAD001或催化mTOR抑制剂)组合施用。例如，施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂可以在施用本文所述的表达CAR的细胞之前开始，在施用本文所述的表达CAR的细胞之前完成；在施用本文所述的表达CAR的细胞的同时启动；与本文所述的表达CAR的细胞的施用重叠；或在施用本文所述的表达CAR的细胞后继续。
或者或另外，施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂可以优化待工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞。在这样的实施方案中，在从受试者收获待被工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞例如T细胞或NK细胞之前，开始或完成施用免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂，例如变构抑制剂，例如RAD001或催化抑制剂。
在另一个实施方案中，待工程化以表达本文所述的CAR分子的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞(例如在从受试者收获之后)，或表达CAR的免疫效应细胞，例如T细胞或NK细胞(例如，在施用于受试者之前)，可以在免疫增强性低剂量的mTOR抑制剂存在下培养。
如本文所用，术语“mTOR抑制剂”指在细胞中抑制mTOR激酶的化合物或配体、或其可药用盐。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是变构抑制剂。在一个实施方案中，mTOR抑制剂是催化性抑制剂。
变构性mTOR抑制剂包括中性三环状化合物雷帕霉素(西罗莫司(sirolimus))、雷帕霉素相关化合物，所述雷帕霉素相关化合是与雷帕霉素具有结构和功能相似性的化合物，例如包括，雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物(也称作雷帕霉素类似物)和抑制mTOR活性的其他大环内酯类化合物。
雷帕霉素是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生的已知大环内酯类抗生素，其具有式A中所示的结构。
其他合适的雷帕霉素类似物包括但不限于RAD001，另外称作依维莫司具有化学名称(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟乙氧基)-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂-三环并[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-五酮、西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素，AY-22989)、40-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称作坦罗莫司或CCI-779)和地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。b变构性mTor抑制剂的其他例子包括如其内容通过引用方式并入的US2005/0101624中所述的佐他莫司(zotarolimus)(ABT578)和乌米莫司(umirolimus)。2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第946段至第964段中描述了其他合适的mTOR抑制剂，所述文献通过引用的方式完整并入。2015年3月13日提交的国际公开WO2015/142675的第936至第945段和第965至第1003段中进一步描述了mTOR抑制剂的免疫增强性低剂量、与低剂量mTOR抑制剂相关的合适mTOR抑制水平、用于检测mTOR抑制水平的方法及其合适的药物组合物，所述文献通过引用的方式完整并入。
药物组合物和治疗
本公开的药物组合物可以包含与一种或多种药物或生理可接受载体、稀释剂或赋形剂组合的如本文所述的表达CAR的细胞，例如，多个表达CAR的细胞。这类组合物可以包含缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。在一个方面，配制本公开的组合物供静脉内施用。
可以以合适的方式把本公开的药物组合物施用到将要被治疗(或预防)的疾病。施用的量和频率将由这类因素决定，如患者的状况和患者疾病的类型和严重性，不过适宜的剂量可以通过临床试验确定。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如，不存在)可检测水平的杂质，例如，所述杂质选自内毒素、支原体(Mycoplasma)、有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残余抗CD3/抗CD28包被的珠、小鼠抗体、汇集的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是选自以下的至少一种：粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、白假丝酵母(Candida albicans)、大肠杆菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)A群。
当指出“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本公开组合物的精确量可以由医师在考虑年龄、体重、肿瘤尺寸、感染程度或转移和患者(受试者)状况的个体差异时确定。通常可以声称，本文所述的包含免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的药物组合物可以按104至109个细胞/kg体重，在一些情况下105至106个细胞/kg体重(包括这些范围内部的全部整数值)的剂量施用。T细胞组合物也可以按这些剂量施用多次。细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在一些实施方案中，本文所述的表达CAR的细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括至少约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x 106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x108、3x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括多达约1x 106、1.1x 106、2x 106、3.6x 106、5x106、1x 107、1.8x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108或5x 108个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括约1.1x 106–1.8x 107个细胞/kg。在一些实施方案中，CAR细胞(例如、包含(例如、经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括至少约1x 107、2x 107、5x107、1x 108、2x 108、3x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如、包含(例如、经工程化以表达)TA CAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括多达约1x 107、2x 107、5x 107、1x 108、2x 108、3x 108、5x 108、1x 109、2x 109、或5x 109个细胞。
在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TA CAR和BCACAR的细胞)的剂量包括多达约1x 107、1.5x 107、2x 107、2.5x 107、3x 107、3.5x 107、4x107、5x 107、1x 108、1.5x 108、2x 108、2.5x 108、3x 108、3.5x 108、4x 108、5x 108、1x 109、2x 109或5x 109个细胞。在一些实施方案中，CAR细胞(例如，包含(例如，经工程化以表达)TACAR和BCA CAR的细胞)的剂量包括多达约1-3x 107至1-3x108个细胞。在一些实施方案中，向受试者施用约1-3x 107个细胞。在其他实施方案中，向受试者施用约1-3x 108个细胞。
细胞可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术施用(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)。
在某些方面，可能想要将活化的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)施用至受试者并且随后回抽血液(或进行单采血液成分术)、根据本公开活化来自其中的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)并向患者回输这些活化和扩充的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。这个过程可以每数周实施多次。在某些方面，可以活化来自10cc至400cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在某些方面，活化来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc抽血的免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。
施用主题组合物可以按任何便利方式实施，包括气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、瘤内、淋巴结内(intranodally)、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹腔内施用至患者。在一个方面中，通过皮内或皮下注射向患者施用本公开的T细胞组合物。在一个方面，通过静脉内注射施用本公开的T细胞组合物。可以将免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的组合物直接注射至肿瘤、淋巴结或感染部位中。
在特定的示例性方面，受试者可以接受白细胞去除术，其中将白细胞收集、富集或离体耗尽以选择和/或分离目的细胞，例如，T细胞。可以通过本领域已知的方法扩充和处理这些T细胞分离物，从而可以引入本发明的一个或多个CAR构建体，因而产生本发明的CAR T细胞。有需求的受试者可以随后接受高剂量化疗标准治疗，接着进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植后或与移植同时地，受试者接受扩充的本公开CAR T细胞的输注。在一个额外的方面，将扩充的细胞在手术前或之后施用。
待施用至患者的上述疗法的剂量将随正在治疗的病症的确切性质和治疗的接受者变动。人类施用剂量的放大可以根据本领域接受的惯例进行。对于成年患者，CAMPATH的剂量例如通常将在1至约100mg范围内，通常每日施用1天和30天之间的时间。优选的每日剂量是1至10mg每日，不过在一些情况下，可以使用至多每日40mg的更大剂量(美国专利号6,120,766中所述)。
在一种实施方式中，把所述的CAR引入到免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)中,例如利用体外转录，并且所述的受试者(例如人)接受本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的初次施用，以及本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的一次或更多次随后的施用，其中所述的一次或更多次随后的施用是在先前的施用之后15天以内,例如14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,或2天内被施用的。在一种实施方式中，每周向所述的受试者(例如，人)超过一次施用本公开的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，例如每周施用2、3或4次本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)。在一种实施方式中,所述的受试者(例如人受试者)每周接受超过一次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用(例如每周2,3或4次施用)(在本文中也被称为循环),随后一个星期不施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),然后给所述的受试者施用一次或更多次CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的额外施用(例如每个星期超过一次的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)的施用)。在另一种实施方式中,所述的受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞),并且每个循环之间的时间少于10,9,8,7,6,5,4,或3天。在一种实施方式中，每隔一天施用CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，每个星期持续3次施用。在一种实施方式中，施用本发明的CAR免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)持续至少2、3、4、5、6、7、8周或更多周。
实施例
通过参考以下实验实施例进一步详述本发明。除非另外说明，否则仅出于说明目的提供这些实施例并且它们不意在起到限制作用。因此，本发明无论如何不应当解释为受以下实施例限制，反而应当解释为涵盖因本文提供的教授内容变得显而易见的任何和全部变型。
实施例1
从受试者取得人T淋巴细胞并且离体提供，使用抗CD3/CD28刺激，并用EF1a启动子控制下编码第二代CD19 CAR(包含CD19结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导及用EF1a启动子控制下编码第二代EGFRvIII CAR(包含EGFRvIII结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导。图2中显示使细胞工程化以表达CD19 CAR和EGFRvIII CAR二者的系统，如这个系统。同时，构建单一双顺反子慢病毒载体，其编码具有间插P2A位点的均处于EF1a启动子控制下的第二代CD19 CAR和第二代EGFRvIII CAR。图1中显示使细胞工程化以表达CD19 CAR和EGFRvIII CAR二者的这种构建体。通过用二种慢病毒载体(各自编码CD19 CAR或EGFRvIII CAR；图2)的混合物或用编码双顺反子构建体的单一慢病毒载体(图1)转导T细胞，提供表达第二代CD19 CAR和第二代EGFRvIII CAR二者的细胞，并且使用本文所公开(例如，如WO2014/130657中所述)的方法，对CD19+/EGFRvIII-细胞、CD19-/EGFRvIII+细胞、CD19+/EGFRVIII+细胞及包含CD19+/EGFRvIII-细胞和CD19-/EGFRvIII+细胞的细胞群体分析CAR T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，并且将活性与仅表达第二代EGFRvIII CAR的细胞比较。通过在具有建立的EGFRvIII U87vIII胶质瘤的异种免疫受损的NOD/SCID/共同-γ链-/-小鼠中静脉内施用细胞，进一步体内分析细胞(增殖、长期持久性和肿瘤毒性，例如，依据WO2014/130657中描述的方法)。将表达CD19的自体B细胞或永生化B细胞随CAR T细胞一起共输注，以增强CAR T细胞活化。对于临床应用，将自体T细胞转导以表达EGFRvIII CAR和CD19 CAR并施用至患有多形性胶质母细胞瘤(GBM)的患者。监测CART细胞持久性、增殖/扩充和抗肿瘤功效。在患者中，他们表达CD19的正常B细胞提供第二CAR的刺激源。
实施例2
从受试者取得人T淋巴细胞并且离体提供，使用抗CD3/CD28刺激，并用EF1a启动子控制下编码第二代BCMA CAR(包含BCMA结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导及用EF1a启动子控制下编码第二代EGFRvIII CAR(包含EGFRvIII结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导。提供表达第二代BCMA CAR和第二代EGFRvIII CAR二者的细胞，并且使用本文所公开(例如，如WO2014/130657中所述)的方法，对BCMA+/EGFRvIII-细胞、BCMA-/EGFRvIII+细胞、BCMA+/EGFRVIII+细胞及包含BCMA+/EGFRvIII-细胞和BCMA-/EGFRvIII+细胞的细胞群体分析CAR T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，并且将活性与仅表达第二代EGFRvIII CAR的细胞比较。通过在具有建立的EGFRvIII U87vIII胶质瘤的异种免疫受损的NOD/SCID/共同-γ链-/-小鼠中静脉内施用细胞，进一步体内分析细胞(增殖、长期持久性和肿瘤毒性，例如，依据WO2014/130657中描述的方法)。将表达BCMA的自体B细胞或永生化B细胞随CAR T细胞一起共输注，以增强CAR T细胞活化。对于临床应用，将自体T细胞转导以表达EGFRvIII CAR和BCMA CAR并施用至患有多形性胶质母细胞瘤(GBM)的患者。监测CART细胞持久性、增殖/扩充和抗肿瘤功效。在患者中，他们表达BCMA的正常B细胞提供第二CAR的刺激源。
实施例3
从受试者取得人T淋巴细胞并且离体提供，使用抗CD3/CD28刺激，并用EF1a启动子控制下编码第二代CD19 CAR(包含CD19结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导及用EF1a启动子控制下编码第二代间皮素(“Meso”)CAR(包含Meso结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导。同时，构建单一双顺反子载体，其编码具有间插P2A位点的均处于EF1a启动子控制下的第二代CD19 CAR和第二代间皮素CAR。通过用二种慢病毒载体(各自编码CD19 CAR或Meso CAR)的混合物或用编码双顺反子构建体的单一慢病毒载体转导T细胞，提供表达第二代CD19 CAR和第二代间皮素CAR二者的细胞，并且使用本文所公开(例如，如WO2015/090230中所述)的方法，对CD19+/Meso-细胞、CD19-/Meso+细胞、CD19+/Meso+细胞及包含CD19+/Meso-细胞和CD19-/Meso+细胞的细胞群体分析CAR T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，并且将活性与仅表达第二代Meso CAR的细胞比较。通过在异种免疫受损的NOD/SCID/共同-γ链-/-小鼠中静脉内施用细胞，进一步体内分析细胞(增殖、长期持久性和肿瘤毒性，例如，依据WO2015/090230中描述的方法)，所述小鼠具有建立的表达Meso的卵巢腺癌(OVCAR8)异种移植物。将表达CD19的自体B细胞或永生化B细胞随CAR T细胞一起共输注，以增强CAR T细胞活化。对于临床应用，将自体T细胞转导以表达Meso CAR和CD19 CAR并施用至患有表达间皮素的癌(如间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌)的患者。监测CART细胞持久性、增殖/扩充和抗肿瘤功效。在患者中，他们表达CD19的正常B细胞提供第二CAR的刺激源。
实施例4
从受试者取得人T淋巴细胞并且离体提供，使用抗CD3/CD28刺激，并用EF1a启动子控制下编码第二代BCMA CAR(包含BCMA结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导及用EF1a启动子控制下编码第二代间皮素(“Meso”)CAR(包含Meso结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的CAR，所述胞内信号传导结构域包含CD3z初级信号传导结构域和4-1BB共刺激信号传导结构域)的慢病毒载体转导。提供表达第二代BCMA CAR和第二代Meso CAR二者的细胞，并且使用本文所公开(例如，如WO2015/090230中所述)的方法，对BCMA+/Meso-细胞、BCMA-/Meso+细胞、BCMA+/Meso+细胞及包含BCMA+/Meso-细胞和BCMA-/Meso+细胞的细胞群体分析CAR T细胞增殖、细胞因子释放和细胞毒性，并且将活性与仅表达第二代Meso CAR的细胞比较。通过在异种免疫受损的NOD/SCID/共同-γ链-/-小鼠中静脉内施用细胞，进一步体内分析细胞(增殖、长期持久性和肿瘤毒性，例如，依据WO2015/090230中描述的方法)，所述小鼠具有建立的表达Meso的卵巢腺癌(OVCAR8)异种移植物。将表达BCMA的自体B细胞或永生化B细胞随CAR T细胞一起共输注，以增强CAR T细胞活化。对于临床应用，将自体T细胞转导以表达Meso CAR和BCMA CAR并施用至患有表达间皮素的癌(如间皮瘤、胰腺癌或卵巢癌)的患者。监测CART细胞持久性、增殖/扩充和抗肿瘤功效。在患者中，他们表达BCMA的正常B细胞提供第二CAR的刺激源。
等同物
本文引用的每份和每项专利、专利申请和出版物的公开内容因此通过引用的方式完整并入本文。尽管本发明已经参考具体方面公开，但显而易见本发明的其他方面和变型可以由本领域其他技术人员构思，而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意在解释成包括全部此类方面和等同变型。

Claims (85)

1.细胞，包含各自包含抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域的第一嵌合抗原受体(CAR)和第二CAR，其中所述第一CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原结合并且所述第二CAR的抗原结合结构域与B细胞抗原之外的肿瘤抗原结合，任选地其中B细胞抗原和B细胞抗原之外的肿瘤抗原不表达在相同的细胞上。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中第二CAR结合：
(a)实体瘤抗原；
(b)髓系肿瘤抗原；或
(c)非B细胞谱系的血液肿瘤的抗原。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的细胞，其中所述B细胞抗原选自CD5、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD34、CD37、CD38、CD40、CD53、CD69、CD72、CD73、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD123、CD135、CD138、CD179、CD269、Flt3、ROR1、BCMA、FcRn5、FcRn2、CS-1、CXCR4、5、7、IL-7/3R、IL7/4/3R和IL4R。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中所述B细胞抗原选自CD19、CD20、CD22、FcRn5、FcRn2、BCMA、CS-1和CD138。
5.根据权利要求3所述的细胞，其中所述B细胞抗原是BCMA。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含在表12或表13中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域还包含在表12或表13中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表12或表13中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表12或表13中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表12或表13中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表12或表13中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表12或表13中提供的任何重链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表12或表13中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表12或表13中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表12或表13中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:349；SEQ ID NO:339、SEQ ID NO:340；SEQ ID NO:341；SEQ IDNO:342；SEQ ID NO:343；SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、SEQ ID NO:346、SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:350、SEQ ID NO:351、SEQ ID NO:352、SEQ ID NO:353、SEQ IDNO:429、SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:431、SEQ ID NO:432、SEQ ID NO:433、SEQ ID NO:434、SEQ ID NO:435、SEQ ID NO:436、SEQ ID NO:437、SEQ ID NO:438、SEQ ID NO:439、SEQ IDNO:440、SEQ ID NO:441、SEQ ID NO:442、SEQ ID NO:443、SEQ ID NO:444、SEQ ID NO:445、SEQ ID NO:446、SEQ ID NO:447、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:449、SEQ ID NO:563、SEQ IDNO:564、SEQ ID NO:565或SEQ ID NO:566的序列。
12.根据权利要求3所述的细胞，其中所述B细胞抗原是CD19。
13.根据权利要求12所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含在表6、表7或表9中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
14.根据权利要求13所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域还包含在表6、表8或表9中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表6或表9中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表6或表9中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表6或表9中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求12-15中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表6或表9中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表6或表9中提供的任何重链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表6或表9中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表6或表9中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表6或表9中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:83；SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85；SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:87；SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:112的序列。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR结合髓系肿瘤抗原，并且其中所述髓系肿瘤抗原选自CD123、CD33和CLL-1。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR结合T细胞淋巴瘤抗原。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR结合实体瘤抗原，并且其中所述实体瘤抗原选自EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn抗原、sTn抗原、Tn-O-糖肽、sTn-O-糖肽、PSMA、CD97、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、leguman、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、MAD-CT-1、MAD-CT-2、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB(例如，ERBB2)、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、ML-IAP、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸、Fos-相关抗原、中性粒细胞弹性蛋白酶、TRP-2、CYP1B1、精子蛋白17、β人绒毛膜促性腺激素、AFP、甲状腺球蛋白、PLAC1、globoH、RAGE1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、肠羧基酯酶、mut hsp 70-2、NA-17、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、NY-ESO-1、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP、GFRα4和呈递在MHC上的这些抗原中任一者的肽。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述实体瘤抗原选自CLDN6、间皮素和EGFRvIII。
23.根据权利要求21所述的细胞，其中所述实体瘤抗原是EGFRvIII。
24.根据权利要求23所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含在表5中列出的任何抗EGFRvIII重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
25.根据权利要求24所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域还包含在表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表5中提供的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表5中提供的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表5中列出的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个修饰但是不多于20或10个在表5中提供的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表5中提供的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表5中列出的任何抗EGFRvIII轻链可变区的氨基酸序列和表5中列出的任何抗EGFRvIII重链可变区的氨基酸序列。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:71-79中任一者的序列。
30.根据权利要求21所述的细胞，其中所述实体瘤抗原是间皮素。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含在表2或表3中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。
32.根据权利要求31所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域还包含在表2或表4中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表2中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个但是不多于20或10个在表2中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表2中提供的任何轻链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
34.根据权利要求30-33中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含：
(i)表2中列出的任何重链可变区的氨基酸序列；
(ii)氨基酸序列，其具有至少一个、两个或三个但是不多于20或10个在表2中提供的任何重链可变区的氨基酸序列的修饰；或
(iii)与表2中提供的任何重链可变区的氨基酸序列具有95-99％同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求30-34中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有表2中列出的任何轻链可变区的氨基酸序列和表2中列出的任何重链可变区的氨基酸序列。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域包含多肽，所述多肽具有SEQ ID NO:46-70中任一者的序列。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的所述抗原结合结构域处于scFv形式。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的所述抗原结合结构域处于scFv形式。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR或所述第二CAR的所述胞内信号传导结构域包含一个或多个初级信号传导结构域。
40.根据权利要求39所述的细胞，其中所述第一CAR和所述第二CAR的所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR或所述第二CAR的所述胞内信号传导结构域包含一种或多种共刺激信号传导结构域。
42.根据权利要求41所述的细胞，其中所述第一CAR和所述第二CAR的所述胞内信号传导结构域包含一个或多个共刺激信号传导结构域。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的细胞，其中初级信号传导结构域包含CD3-ζ刺激性结构域。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的细胞，其中所述共刺激信号传导结构域是选自以下的共刺激蛋白的胞内结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
45.根据权利要求44所述的细胞，其中所述第一CAR和所述第二CAR的共刺激结构域包含4-1BB的胞内结构域。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的细胞，其中所述一个或多个所述共刺激结构域包含CD28的胞内结构域。
47.根据权利要求41-45中任一项所述的细胞，其中所述第一或第二CAR包含二个共刺激结构域：
(1)4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域；
(2)4-1BB共刺激结构域和ICOS共刺激结构域；或
(3)CD28共刺激结构域和ICOS共刺激结构域。
48.根据权利要求1-11和19-47中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的抗原结合结构域结合BCMA并且第一CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:949、SEQ ID NO:950、SEQ ID NO:951、SEQ ID NO:952、SEQ ID NO:953、SEQ ID NO:954、SEQ ID NO:955、SEQ IDNO:956、SEQ ID NO:957、SEQ ID NO:958、SEQ ID NO:959、SEQ ID NO:960、SEQ ID NO:961、SEQ ID NO:962、SEQ ID NO:963、SEQ ID NO:979、SEQ ID NO:980、SEQ ID NO:981、SEQ IDNO:982、SEQ ID NO:983、SEQ ID NO:984、SEQ ID NO:985、SEQ ID NO:986、SEQ ID NO:987、SEQ ID NO:988、SEQ ID NO:989、SEQ ID NO:990、SEQ ID NO:991、SEQ ID NO:992、SEQ IDNO:993、SEQ ID NO:994、SEQ ID NO:995、SEQ ID NO:996、SEQ ID NO:997、SEQ ID NO:998和SEQ ID NO:999的氨基酸序列。
49.根据权利要求1-4和12-47中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR的抗原结合结构域结合CD19并且第一CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:269、SEQ ID NO:270、SEQID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、SEQ ID NO:280和SEQ ID NO:281的氨基酸序列。
50.根据权利要求1-18、21-29和37-49中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的抗原结合结构域结合EGFRvIII并且第二CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:1043、SEQID NO:1049、SEQ ID NO:1055、SEQ ID NO:1061、SEQ ID NO:1067、SEQ ID NO:1073、SEQ IDNO:1079、SEQ ID NO:1085、SEQ ID NO:1090和SEQ ID NO:1096的氨基酸序列。
51.根据权利要求1-18、21、22和30-49中任一项所述的细胞，其中所述第二CAR的抗原结合结构域结合间皮素并且第二CAR包含多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:282、SEQ IDNO:283、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、SEQ ID NO:288、SEQ ID NO:289、SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:293、SEQ IDNO:294、SEQ ID NO:295、SEQ ID NO:296、SEQ ID NO:297、SEQ ID NO:298、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:302、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:304、SEQ IDNO:305和SEQ ID NO:306的氨基酸序列。
52.根据权利要求1-20和37-49中任一项所述的细胞，其中所述细胞衍生自诊断患有髓系肿瘤或非B细胞谱系血液肿瘤的患者。
53.根据权利要求52所述的细胞，其中所述患者经诊断患有髓系肿瘤，所述髓系肿瘤表达选自CD123、CD33和CLL-1的抗原。
54.根据权利要求118、21-51中任一项所述的细胞，其中所述细胞衍生自诊断患有实体瘤的患者。
55.根据权利要求54所述的细胞，其中所述患者经诊断患有实体瘤，所述实体瘤表达选自EGFRvIII、间皮素、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB2、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸(Plysialic acid)、PLAC1、globoH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP和GFRα4的抗原。
56.根据权利要求1-51中任一项所述的细胞，其中所述细胞是人细胞并且不衍生自诊断患有肿瘤的患者。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、细胞毒T淋巴细胞(CTL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)或调节性T细胞。
58.在哺乳动物中刺激T细胞介导针对实体瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-18、21-51和54-57中任一项所述的细胞。
59.在哺乳动物中提供抗实体瘤免疫力的方法，包括向哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-18、21-51和54-57中任一项所述的细胞。
60.治理患有与表达实体瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-18、21-51和54-57中任一项所述的细胞。
61.在哺乳动物中刺激T细胞介导针对髓系肿瘤细胞的免疫应答的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-19、37-49、52、53和56-57中任一项所述的细胞。
62.在哺乳动物中提供抗髓系肿瘤免疫力的方法，包括向哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-19、37-49、52、53和56-57中任一项所述的细胞。
63.治理患有与表达髓系肿瘤抗原相关的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括施用有效量的根据权利要求1-19、37-49、52、53和56-57中任一项所述的细胞。
64.根据权利要求58-60中任一项所述的方法，其中所述实体瘤表达选自如下的抗原：EGFRvIII、间皮素、CS-1、GD2、Tn Ag、PSMA、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、KIT、IL-13Ra2、GD3、CD171、IL-11Ra、PSCA、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、叶酸受体α、ERBB2、Her2/neu、MUC1、EGFR、NCAM、肝配蛋白B2、CAIX、LMP2、sLe、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、FAP、豆荚蛋白、HPV E6或E7、CLDN6、TSHR、GPRC5D、ALK、聚唾液酸(Plysialic acid)、PLAC1、globoH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、Ly6k、OR51E2、TARP和GFRα4。
65.根据权利要求58-60和64中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物患有表征为胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、腺癌或间皮瘤的肿瘤。
66.根据权利要求61-63中任一项所述的方法，其中所述髓系肿瘤表达选自CD123、CD33和CLL-1的抗原。
67.根据权利要求61-63和66中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物患有表征为急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞B细胞白血病(B细胞急性淋巴样白血病，BALL)、急性淋巴母细胞T细胞白血病(T细胞急性淋巴样白血病(TALL))、B细胞幼淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病(CML)、脊髓发育不良综合征、浆细胞骨髓瘤或其组合的肿瘤。
68.根据权利要求58-67中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于治疗的哺乳动物为自体。
69.根据权利要求58-67中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于治疗的哺乳动物为同种异体。
70.根据权利要求58-69中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
71.根据权利要求58-70中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述施用导致所述肿瘤细胞的部分或完全消除并且此后继续在所述受试者中，相比缺少所述第一CAR的否则相同的细胞，以更高水平或更长时间长度延续该状态。
72.根据权利要求58-71中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞之前、与之同时或在其之后，向所述哺乳动物施用淋巴细胞清除疗法。
73.根据权利要求58-71中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞之前或与之同时，不向所述哺乳动物施用淋巴细胞清除疗法。
74.核酸，编码根据权利要求1-51中任一项所述的第一CAR和第二CAR。
75.根据权利要求74所述的核酸，其中所述第一CAR和所述第二CAR的序列由独立的核糖体进入位点、启动子元件或编码T2A、P2A、E2A或F2A元件的序列分隔。
76.载体，包含根据权利要求74或75所述的核酸。
77.根据权利要求76所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。
78.组合物，包含编码根据权利要求1-51中任一项所述的第一CAR的第一核酸和编码前述第二CAR的第二核酸。
79.根据权利要求78所述的组合物，其中所述第一和所述第二核酸包含于独立的载体内部。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中所述载体是慢病毒载体。
81.产生根据权利要求1-57中任一项所述的细胞的方法，包括向所述细胞引入根据权利要求74-75中任一项所述的核酸、根据权利要求76-77中任一项所述的载体或根据权利要求78-80中任一项所述的组合物。
82.一种产生根据权利要求1-57中任一项所述的细胞的方法，包括向所述细胞引入第一载体，所述第一载体包含编码根据权利要求1-51中任一项所述的第一CAR的核酸，并且向所述细胞引入第二载体，所述第二载体包含编码根据权利要求1-51中任一项所述的第二CAR的核酸。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体的所述引入是同时的。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述第一载体和所述第二载体的所述引入是依次的。
85.细胞，包含编码根据权利要求1-51中任一项所述的第一CAR和根据权利要求1-51中任一项所述的第二CAR的核酸。
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