ES2399075T3 - Anticuerpos multiespecíficos - Google Patents

Abstract

Método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en el que la pareja de VH y VL juntos forman un sitio de unión a antígeno único capaz de unirse a un primer epítopo y un segundo epítopo, comprendiendo el método las etapas de: (1) diversificar la secuencia de aminoácidos de la VL, en el que antes de la diversificación, el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse sólo al primer epítopo, y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado en el que el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse al primer epítopo y al seguno epítopo.

Description

Anticuerpos multiespecíficos.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica en beneficio de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 60/841,350 solicitada el 30 de agosto de 2006 y la solicitud de Estados Unidos de número de serie 60/937,814, solicitada el 28 de junio de 2007.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a anticuerpos multiespecíficos y métodos de fabricación y utilización de dichos anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] Los anticuerpos son polipéptidos de inmunoglobulinas específicas producidos por el sistema inmune vertebrado en respuesta a la estimulación por proteínas, glicoproteínas, células exógenas u otras sustancias exógenas antigénicas. Una parte importante de este proceso es la generación de anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia exógena particular. La especificidad de unión de dichos polipéptidos a un antígeno particular es muy refinada y la multitud de especificidades capaces de ser generadas por el vertebrado individual es destacable en su complejidad y variabilidad. Miles de antígenos son capaces de producir respuestas, cada una dirigida casi exclusivamente al antígeno particular que la produjo.

[0004] El reconocimiento específico de antígenos es esencial para anticuerpos para funcionar en la respuesta inmune adaptiva. La asociación combinatoria de la cadena pesada (HC) y cadena pesada (LC) se conserva en todos los vertebrados en la generación del repertorio de anticuerpos. Sin embargo, existe una asimetría de la diversidad en las dos cadenas. El dominio variable de HC (VH) de HC (VH) contiene una diversidad de secuencia significativamente más elevada y contribuye en los determinantes de reconocimiento de antígeno más a menudo que el dominio variable de la LC (VL). El papel de la LC en la determinación de la especificidad de antígeno se indica por un proceso denominado edición del receptor. La recombinación en desarrollo de los genes de CL para editar el receptor de células B es el principal mecanismo para corregir los precursores de los anticuerpos autoreactivos, que parecen constituir una parte significativa del repertorio inicial ( 75%). La alteración de la cadena ligera demuestra que se extingue la especificidad de unión o multiespecificidad no deseada. [0005] La especificidad de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para un antígeno o antígenos particulares hace de los anticuerpos agentes terapéuticos deseables. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos se puedne utilizar para reconocer tejidos particulares, por ejemplo, un tumor, y de este modo, minimizar los efectos secundarios potenciales de reconocimiento no específico. Por tanto, existe una necesidad actual y continua para identificar y caracterizar anticuerpos terapéuticos, especialmente anticuerpos, fragmentos y derivados de los mismos, útiles en el tratamiento del cáncer y otros trastornos proliferativos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0006] La presente invención proporciona un método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende las etapas de (1) diversificar la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo, donde antes de la diversificación, el anticuerpo comprendía una VL y un dominio variable de cadena pesada (VH) capaz de unirse a un primer epítopo y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado capaz de unirse al primer epítopo y un segundo epítopo tal como se define en las reivindicaciones. Antes de la diversificación, el anticuerpo en la etapa 1 es monoespecífico. Según una realización, el VL/VH del anticuerpo después de utilizar los métodos de la presente invención, es biespecífico. En una realización, la secuencia de aminoácidos de VL se diversifica mediante la alteración de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el VL y la expresión del VL diversificado. En una realización adicional, la diversificación es mediante la alteración de un conjunto de posiciones de residuos de aminoácidos predeterminadas. Según una realización, los residuos se diversifican en base a la diversidad de un conjunto de secuencias de aminoácidos de cadena ligera naturales. Adicionalmente o alternativamente, los residuos se diversifican en base a la accesibilidad al disolvente. Según una realización, el VL diversificado se expresa en fagos con el VH durante la etapa de selección. Según una realización adicional, la afinidad de unión del anticuerpo multiespecífico se puede mejorar mediante el sometimiento del anticuerpo a maduración por afinidad (por ejemplo, rastreo de homólogos u otras mutaciones del VL y/o VH).

[0007] Según una realización, las posiciones de residuos diversificadas se seleccionan del grupo que consiste en:

(1) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-e y 93(a)-(b); (2) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f; (3) posiciones 28-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b; (4) posiciones 28, 30-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b; (5) posiciones 28-32, 50-53, 92-93; (6) posiciones 28-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en 30a-b (7) posiciones 28-32, 50-53,91-93, 94, opcionalmente en 30a-f y 93a-b; y (8) posiciones 29-32, 50-53, 66-67, 69-70, 92-93, 94, opcionalmente en 30a-f. Según una realización preferida, los residuos de VL se diversifican según una cualquiera de los diseños de biblioteca descritos en la figura 1.

[0008] Según una realización, la etapa de selección para unirse al primer epítopo o la selección para unirse al segundo epítopo tiene lugar en presencia de VL y VH diversificadas. Según otra realización, la VL y VH diversificadas se pueden unir al primer epítopo y al segundo epítopo de manera simultánea. En una realización alternativa, la VL y VH diversificadas se unen al primer epítopo y al segundo epítopo excluidos mutuamente. En una realización, el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de la misma molécula biológica. En otra realización, el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de una segunda molécula biológica. Según una realización, la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica son estructuralmente no similares.

[0009] Según una realización, se seleccionan parejas de primera molécula biológica y segunda molécula biológica del siguiente grupo de parejas: VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DR5, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, TNFalfa/TGF-beta, 1-NFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-11, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/receptor de MET, HER2/Fc, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFalfa/ICAM-1, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R y TNFR1/IL-18R. En realizaciones particulares, la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica son VEGF/HER2, HER2/DR5, o HER2/Fc.

[0010] Según una realización, una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la semivida del anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo. En otra realización, la molécula biológica es albúmina de suero o el receptor de Fc neonatal (FcRn).

[0011] Según otra realización, una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la función efectora de un anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo. En una realización, la molécula biológica se une a una proteína de la superficie celular en células asesinas naturales o macrófagos. La proteína de la superficie celular puede ser C1q o un receptor de Fc.

[0012] La presente invención también proporciona anticuerpos multiespecíficos fabricados mediante los métodos de la presente invención. Se contempla que un anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede comprender uno o un conjunto de los dominios VL/VH creados por los métodos de la presente invención solos o en combinación con los dominios hipervariables de anticuerpos no creados por los métodos de la presente invención. Un anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede existir en un conjunto de formas (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, multiméricos, etc). Según una realización, el anticuerpo multiespecífico es cualquiera de los anticuerpos de las figuras 5-10, 13-16, figura 34, figura 39, y la tabla 2. En una realización particular, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo bH1 de la figura 34 o un fragmento del mismo.

[0013] Los anticuerpos multiespecíficos producidos por los métodos de la presente invención se pueden utilizar de varias maneras, por ejemplo, terapias para tratar enfermedades, en investigación o en purificación. Por ejemplo, se pueden utilizar en un método de tratamiento de un tumor (por ejemplo, un tumor canceroso) en un sujeto. Este método implica la administración al sujeto del anticuerpo multiespecífico de cualquiera de los anticuerpos de las figuras 5-10, 13-16, figura 34, figura 39, y la tabla 2, un fragmento del mismo, un anticuerpo fabricado por los métodos de la presente invención, donde la administración es durante un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el tumor en el sujeto. En un método particular, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo bH1 de la figura 34 o un fragmento del mismo.

[0014] En otro aspecto, se puede utilizar un anticuerpo multiespecífico en un método de tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar un tumor. El método de la presente invención también es ventajoso en la reducción o prevención de la recurrencia de un tumor, por ejemplo, un tumor inactivo que persiste después de la eliminación del tumor primario o en la reducción o prevención de la aparición o proliferación de tumores metastáticos. Este método [0015] En un ejemplo adicional, se puede utilizar un anticuerpo multiespecífico en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o presenta el riesgo de desarrollar una enfermedad autoinmune. Este método implica la administración al sujeto del anticuerpo multiespecífico de cualquiera de los anticuerpos de las figuras 5-10, 13-16, figura 34, figura 39, y la tabla 2, un fragmento del mismo, o un anticuerpo fabricado por los métodos de la invención, donde la administración es durante un tiempo y en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la enfermedad autoinmune en el sujeto.

[0016] Además, se contemplan kits, composiciones y artículos de fabricación que comprenden los anticuerpos multiespecíficos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0017] La figura 1 muestra la diversidad diseñada en varias bibliotecas de LC. La figura 2 muestra un resumen de cuatro bibliotecas de cadena ligera utilizadas para alterar anticuerpos anti-VEGF

o anticuerpos anti-Her2 para unirse a una diana adicional. Los NNK y XYZ en cursiva se refieren a los grupos de codones. Ys, Ds, Ts y Ss se refieren a aleatorizaciones suaves al tener tirosina, ácido aspártico, treonina y serina, respectivamente, que aparecen el 50% del tiempo y cualquiera de los 20 aminoácidos que aparecen el otro 50% del tiempo. D/Ds y T/Ts se refieren a una aleatorización suave que tiene D o T, respectivamente, que aparecen el 75% del tiempo y cualquiera de los 20 aminoácidos que aparecen el otro 25% del tiempo.

La figura 3 muestra secuencia de residuos de CDR HC, LC de plantillas de cadena ligera (SEQ ID NOS:1-6 y 53-63). La figura 4 muestra las condiciones de separación y enriquecimiento de las bibliotecas C y D. La figura 5 muestra enlazadores de VEGF (SEQ ID NOS:64-105). Los residuos 28, 30, 30a, 31, 92, 93, y 93a eran

totalmente diversos. Los residuos 32, 50, 53, 91 y 94 estaban restringidos. Los residuos 29, 33, y 51 estaban limitados (lt;3).

La figura 6 muestra los enlazadores de DR5 (SEQ ID NOS: 106-216). La figura 7 muestra enlazadores de VEGF humanos, selección de placas combinadas y solución (SEQ ID NOS:4-6 y 217-231).

Las figuras 8A y 8B muestran clones que se unen tanto a VEGF como HER2 (SEQ ID NOS:232-421).

La figura 9 muestra clones que sólo se unen a VEGF y pierden la actividad de unión con HER2 (SEQ ID NOS:422499). La figura 10 muestra placas de enlazadores de DR5 separados directamente en HER2 (SEQ ID NOS:4-6 y 500-508). La figura 11 muestra clones que se unen a VEGF. Las figuras 12A y 12B muestran clones que bloquean la unión de VEGF a VEGFR1-D2 o D1. Las figuras 13A y 13B muestran las afinidades de enlazadores de VEGF (SEQ ID NOS:4-6 y 509-532) de la

biblioteca L1/L2/L3-C,D. La figura 14 muestra una resumen de enlazadores específicos de la biblioteca de LC (SEQ ID NOS:4-6 y 533-547). La figura 15 muestra clones que se pueden unir a (Figura 15A) hVEGF y HER2 o (Figura 15B) DR5 y HER2 (SEQ

ID NOS:4-6 y 548-563).

La figura 16 muestra los enlazadores de la biblioteca de LC utilizados en la formación de 2 scFv y la expresión en fagos (SEQ ID NOS:4-6 y 564-590). La figura 17 muestra la expresión de varios clones en forma de Fab o hIgG. Las figuras 18A y 18B muestran ELISAs de clones en forma de hIgG que se unen a hVEGF165. La figura 19 muestra ELISAs de clones en forma de hIgG que se une a dianas de proteínas inmovilizadas. La figura 20 muestra ELISAs competitivos de clones en fomra de hIgG en presencia de Her2 y VEGF o DR5.

La figura 21 muestra análisis Biacore de unión a VEGF o HER2. La figura 22 muestra la unión a ECD de HER2 o hVEGF con una IgG o Fab que tiene una cadena ligera obtenida de un clon de unión diferente.

Las figuras 23A y 23B muestran un anticuerpo anti-VEGF que bloquea la interacción de VEGF con VEGFR1 D 1-3 y KDR D1-7. La figura 24 muestra anticuerpos que bloquean la unión a B20-4.1 y VEGF.

La figura 25 muestra anticuerpos que bloquean la unión al anticuerpo Avastin® y VEGF. La figura 26 muestra la inhibición de la proliferación celular de HUVEC inducida por VEGF con anticuerpos anti- VEGF.

La figura 27 muestra la unión de anticuerpos específicos a HER2 expresados en células NR6.

La figura 28 muestra codones de H1 que se rastrearon por “shotgun”.

La figura 29 muestra un consorcio de bibliotecas (SEQ ID NOS:591-602).

La figura 30 muestra un clon de anticuerpo con mutaciones de rastreo por “shotgun” cribados mediante la unión a VEGF.

La figura 31 muestra un clon de anticuerpo con mutaciones de rastreo por “shotgun” cribadas mediante la unión a

HER2. La figura 32 muestra los resultados de un rastreo de alanina de bH1 por la unión a VEGF (Figure 32A) o la unión a

HER2 (Figura 32B) y los resultados de un rastreo de homólogo de bH1 por la unión de VEGF (Figura 32C) o la unión a HER2 (Figura 32D). La figura 33 muestra los resultados de rastreo de alanina de mutantes de bH1 o el anticuerpo Herceptin®. La figura 34 muestra secuencias de clones madurados por afinidad de VEGF de bH1 y la afinidad de unión por

VEGF o HER2 (SEQ ID NOS: 603-641). Las figuras 35A a 35D muestran estructuras cristalinas del Fab de bH1 biespecífico unido a HER2 o VEGF. Figure 35E is a graph showing that anti-VEGF antibodies block hVEGF binding to VEGF receptor 2 (VEGFR2). La figura 35F es una serie de gráficos de tortas que muestran las contribuciones de CDR individuales al parátopo

estructural para bH1. El tamaño del parátopo para VEGF es 730Å2 y para HER2 es 690Å2. Las CDR de cadena

pesada se indican en gris y las CDR de cadena ligera en blanco. Las figuras 36A a 36C muestran los sitios de unión energéticamente importantes de bH1 para la unión a VEGF y HER2.

Las figuras 37A y 37B muestran el rastreo de alanina y homólogos por “shotgun” de Fab de bH1 para la unión a

VEGF y HER2.

Las figuras 39A y 39B muestran las secuencias de clones de unión a antígeno específicos aisladas de la biblioteca de cadena ligera (LC).

La figura 39A muestra las secuencias de CDR de LC de clones de de fagos monoespecíficos que se unen a VEGF, DR5, y Fc (SEQ ID NOS:4-6 y 642-795), y la figura 39B muestra Fab biespecíficos que se unen a VEGF/HER2, DR5/HER2, y Fc/HER2 (SEQ ID NOS:4-6 y 796-897). Las secuencias de armazón de cadena ligera y cadena pesada corresponden a las del anticuerpo Herceptin® con la excepción de la sustitución del armazón de LC R66G.

La figura 40 es un gráfico que muestra la especificidad de unión de los anticuerpos derivados de la biblioteca de LC. Se muestran los resultados para los anticuerpos bH1; bH3, 3-1, bD1, bD2, 4-1, y 4-5. Los anticuerpos IgG unidos se detectaron espectrofotmétricamente (densidad óptica a 450 nm, eje y). Las proteínas incluidas en el ensayo eran (de izquierda a derecha para cada anticuerpo) factor A de crecimiento endotelial vascular humano (hVEGF-A), hVEGF-C, hVEGF-D, dominio extracelular de (ECD) de hHER2, dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento epidérmico (hEGFR), receptor 5 de muerte humano (hDR5), albúmina de suero bovino (BSA), caseína, suero bovino fetal (FBS), lisado celular WIL2 y lisado celular NR6.

La figura 41 muestra resultados de experimentos de maduración por afinidad que indican que las bibliotecas descritas aquí se pueden utilizar para mejorar la afinidad por VEGF y HER2.

La figura 42 muestra los resultados de experimentos de unión competitiva para bH1 a VEGF o HER2.

Las figuras 43A y 43B muestran que la IgG bH1 inhibe la proliferación celular mediada por HER2 y VEGF.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0018] La presente invención proporciona métodos de producción de anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpos, así como anticuerpos identificados utilizando estos métodos y su utilización. En general, los métodos de la invención implican diversificar el dominio variable de cadena ligera o el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo para generar variantes que se pueden expresar de forma estable en una biblioteca. Los anticuerpos diversificados que son capaces de unirse específicamente a dos epítopos se seleccionan a continuación de esta biblioteca y posteriormente se caracterizan.

[0019] Entre los anticuerpos de ejemplo identificados utilizando los métodos de la invención se incluyen anticuerpos que se unen a HER2 (receptor 2 de factor de crecimiento epitelial humano) y VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), así como anticuerpos que se unen a HER2 y DR5 (receptor 5 de muerte). En particular, los datos aquí descritos, por ejemplo, en los siguientes ejemplos, muestran que las mutaciones en las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera de un anticuerpo HER2 confieren capacidades de unión duales para antígenos de proteínas no relacionadas, así como HER2. Se caracteriza ampliamente un anticuerpo de HER2/VEGF de afinidad elevada biespecífico. Además, se muestran las estructuras cristalinas de este Fab biespecífico en complejo con HER2 y VEGF y se evalúa la contribución energética de los residuos de Fab mediante mutagénesis. Los sitios de unión para los dos antígenos se solapan ampliamente; la mayoría de los residuos de GDR que contactan con HER2 también se comprometen con VEGF. Sin embargo, energéticamente, los residuos de la cadena pesada dominan la especificad de HER2, mientras que la cadena ligera domina la especificidad de VEGF.

[0020] El anticuerpo biespecífico HER2/VEGF inhibe la proliferación celular mediada por Her2 y VEGF. Estos resultados demuestran que la alteración de la secuencia del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo puede generar anticuerpos con una especificidad y función dual. Por ejemplo, bH1 tiene el potencial de reconocer dos mecanismos de progresión del tumor: proliferación de células tumorales mediada por HER2 y angiogénesis tumoral mediada por VEGF.

I. Definiciones

[0021] El término quot;anticuerpo multiespecíficoquot; se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), donde la unidad VHVL tiene especificidad poliepitópica (es decir, es capaz de unirse a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o cada epítopo en una molécula biológica diferente). Dichos anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero sin limitación, anticuerpos de longitud completa, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diabodies, diabodies biespecíficos y triabodies, fragmentos de anticuerpos que se han unido covalentemente o no covalentemente. La “especificidad poliepitópica” se refiere a la capacidad de unirse específicamente a dos o más epítopos diferentes en la misma o diferente diana. “Mono específico” se refiere a la ca pacidad de unirse a sólo un epítopo. Según una realización, el anticuerpo multiespecífico en forma de IgG1 se une a cada epítopo con una afinidad de 5 M a 0,001

M a 0,001 pM, 1 M a 0,001 pM, 0,5 M a 0,001 pM o 0,1 M a 0,001pM.

[0022] La unidad básica del anticuerpo de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas (un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y, por tanto, contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J). En el caso de las IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150.00 daltons. Cada cadena L está unida a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí mediante uno o más enlaces disulfuro que dependen del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene

constante (CL) en su otro extremo. El VL está alineado con el VH y el CL está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El emparejamiento de un VH y un VL juntos forma un único sitio de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8ª Edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristam G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y capítulo 6.

[0023] La cadena L de cualquier especie vertebrada se puede asignar a uno de los dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Existen cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen las cadenas pesadas designadas α, δ, ε, γ, y , respectivamente. Las clases γ y α se dividen además en subclases en base a diferencias relativamente menores en la secuencia y la función de CH, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

[0024] El término “variable” se refiere al hecho de que ciertas partes de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos. El dominio V media en la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida uniformemente a lo largo del tramo de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones armazón (“framework”) (FRs) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas “regiones hipervariables” que tienen cada una de 9 a 12

aminoácidos de longitud. Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una configuración de lámina beta, conectadas mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen juntas de manera próxima mediante las FR y, con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

[0025] El término quot;región hipervariablequot;, cuando se utiliza en la presente invención, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión a antígeno. La región hipervariable comprende en

general residuos de aminoácidos de una “región determinante de complementariedad” o “CDR” (por ejemplo,

alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la VL, y alrededor de aproximadamente los residuos 26-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en la VH (en una realización, H1 es alrededor de aproximadamente los residuos 31-35); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un “bucle hipervariable” (por ejemplo, los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2), y 91-96 (L3) en la VL, y 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96101 (H3) en la VH; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

[0026] El término “anticuerpo monoclonal”, tal y como se utiliza en la presente invención, se refiere a un anticuerpo de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son sustancialmente similares y se unen al mismo epítopo u epítopos, a excepción de posibles variantes que pueden aparecer durante la producción del anticuerpo monoclonal, estando dichas variantes generalmente presentes en cantidades menores. Dicho anticuerpo monoclonal incluye habitualmente un anticuerpo que comprende una región variable que se une a una diana, donde el anticuerpo se obtuvo mediante un proceso que incluye la selección del anticuerpo de un conjunto de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un único clon de un conjunto de clones, tal como un grupo de clones de hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Debe entenderse que el anticuerpo seleccionado se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar el anticuerpo, para mejorar su producción en el cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de región variable alterada también es un anticuerpo monoclonal de la invención. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales son ventajosas en que habitualmente no están contaminadas por otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo al obtenerse de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no debe interpretarse que requiere una producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se pueden fabricar mediante un conjunto de técnicas, que incluyen el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)); mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.816.567), tecnologías de expresión en fagos (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101 (34):12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol. Methods 284(.1-2):119-132 (2004)) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o de tipo humano a partir de animals que tienen partes o todos los locus o genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, WO98/24893, WO/9634096, WO/9633735, y WO/91 10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patentes de Estados Unidos Nos. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm); 5,545,807; WO 97/17852, patente de Estados Unidos Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016, y Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

[0027] Un anticuerpo “intacto” es aquel que comprende un sitio de unión a antígeno, así como un CL y por lo menos los dominios constantes de cadena pesada CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa humana) o variantes en la secuencia de aminoácidos de los mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

[0028] Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región de unión a antígeno o variable del anticuerpo intacto. Entre los ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; diabodies; anticuerpos lineales (véase la Patente de Estados Unidos No. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La expresión “anticuerpos lineales” se refiere en general a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden una pareja de segmentos Fd en tándem (VH-CH1 -VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de cadena ligera complementaria, forman una pareja de regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

[0029] La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados

fragmentos “Fab”, y un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El

fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de la región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento F(ab’)2 grande que corresponde aproximadamente a dos fragmentos de Fab unidos por puentes disulfuro que tienen una actividad de unión a antígeno divalente y aún es capaz de reticular con el antígeno. Los

fragmentos Fab’ difieren de los fragmentos Fab por la adición de una serie de residuos en el extremo carboxi terminal del dominio CH1 que incluyen una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab’-SH es la denominación en la presente invención para Fab’ en el que el residuo o residuos de cisteína de los dominios constantes transportan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos F(ab’)2 se produjeron originalmente como parejas de fragmentos de Fab’ que tienen cisteínas bisagras entre ellos. También se conocen otros acoplamientos

químicos de fragmentos de anticuerpos.

[0030] El fragmento Fc comprende las partes carboxi terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas mediante enlaces disulfuro. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias en la región Fc, cuya región es también la parte reconocida por receptores Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de células.

[0031] quot;Fv” consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación estrecha no covalente. A partir del pliegue de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada una de las cadenas H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos para la unión a antígeno y que confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de una Fv que comprende sólo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a antígeno, aunque a menudo con una menor afinidad que el sitio de unión completo.

[0032] “Fv de cadena única”, también abreviado como “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo conectados en una única cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido sFv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, páginas 269-315 (1994); Borrebaeck 1995.

[0033] El término “diabodies” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados mediante la construcción de fragmentos sFv (véase el párrafo anterior) con enlazadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL, de manera que se consigue el emparejamiento de los dominios VH y VL entre cadenas, pero no el emparejamiento intracadenas de los dominios V, dando lugar a un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diabodies biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos de sFv de entrecruzamiento (“crossover”), donde los fragmentos VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. Los diabodies se describen más detalladamente en, por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

[0034] Las formas “humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. Para la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) donde los residuos de una región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo dador), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen la especificidad, afinidad y capacidad de anticuerpo

deseadas. En algunos casos, los residuos de la región armazón (“framework”) (FR) de la inmunoglobulina humana

se sustituyen por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo dador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente la acción del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una parte de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593596 (1992).

[0035] Tal como se utiliza aquí, quot;grupo de codonesquot; se refiere a un grupo de secuencias de tripletes de nucleótidos diferentes utilizadas para codificar aminoácidos variantes deseados. Se puede sintetizar un grupo de oliognucleótidos, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida, incluyendo secuencias que representan todas las posibles combinaciones de tripletes de nucleótidos proporcionados por el grupo de codones y que codificarán el grupo deseado de aminoácidos. Una forma estándar de la designación de codones es la del código IUB, que es conocida en la técnica y se describe en el presente documento. Un grupo de codones se representa habitualmente por 3 letras en mayúscula en cursiva, por ejemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK, y similares (por ejemplo, codón NKK se refiere a N = A/T/G/C en las posiciones 1 y 2 en el codón y K = G/T en proporción equimolar en la posición 3 para codificar los 20 aminoácidos naturales). Un “grupo de codones no aleatorios”, tal como se utiliza aquí, se refiere por tanto a un grupo de codones que codifica aminoácidos seleccionados que cumplen parcialmente, preferiblemente completamente, el criterio para la selección de aminoácidos tal como se describe aquí. La síntesis de

oligonucleótidos con la “degenerancia” de nucleótidos seleccionada en ciertas posiciones es conocida en la técnica,

por ejemplo, la estrategia TRIM (Knappek et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 1999); Garrard y Henner, Gene 128:103, 1993). Dichos grupos de oligonucleótidos que tienen ciertos grupos de codones se pueden sintetizar utilizando sintetizadores de ácidos nucleicos comerciales (disponible de, por ejemplo, Applied Biosystems, Foster City, CA), o se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Life Technologies, Rockville, MD). Por lo tanto, un grupo de oligonucleótidos sintetizados que tienen un grupo particular de codones incluirá habitualmente una pluralidad de oligonucleótidos con diferentes secuencias, las diferencias establecidas por el grupo de codones en la secuencia global. Los oligonucleótidos, tal como se utilizan en la presente invención, presentan secuencias que permiten la hibridación a una plantilla de ácidos nucleicos de dominio variable y también pueden, pero no necesariamente, incluir sitios de enzimas de restricción útiles para, por ejemplo, fines de clonación.

[0036] Un anticuerpo de la presente invención “que se une” a un antígeno de interés es aquel que se une al antígeno

con suficiente afinidad, de manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el reconocimiento de una proteína o una célula o tejido que expresan el antígeno, y no reacciona de forma cruzada significativamente con otras proteínas. En dichas realizaciones, el grado de unión del anticuerpo a una proteína “no diana” será inferior a aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo a su proteína diana particular determinado

mediante análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RIA) o

ELISA. Con respecto a la unión de un anticuerpo a una molécula diana, el término “unión específica” o “que se une específicamente a” o es “específico para” un polipéptido particular o un epítopo en un polipéptido diana particular significa la unión que es diferente de forma medible de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, mediante la determinación de la unión de una molécula comparada con la unión a una molécula de control. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar mediante la competición con una molécula de control que es similar a la diana, por ejemplo, un exceso de diana no marcada. En este caso, la unión específica se indica si la unión de la diana marcada a una sonda se inhibe competitivamente mediante un exceso de diana no

marcada. El término “unión específica” o “que se une específicamente a” o es “específico para” un polipéptido

particular o un epítopo en un polipéptido diana particular tal como se utiliza aquí se puede inhibir, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para la diana de por lo menos aproximadamente 10-4M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-5M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-6 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-7 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-8 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-9 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-10 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-11 M, alternativamente por lo menos aproximadamente 10-12 M, o superior. En una

realización, el término, “unión específica” se refiere a la unión cuando una molécula se une a un polipéptido

particular o epítopo en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a ningún otro polipéptido o epítopo de polipéptido.

[0037] quot;Biológicamente activoquot; y quot;actividad biológicaquot; y quot;características biológicasquot; con respecto a un polipéptido de la presente invención significa que tiene la capacidad de unirse de una molécula biológica, a excepción de que se especifique lo contrario.

[0038] quot;Molécula biológicaquot; se refiere a un ácido nucleico, una proteína, un carbohidrato, un lípido, y combinaciones de los mismos. En una realización, la molécula biológica existe en la naturaleza.

[0039] El término “aislado”, cuando se utiliza para describir los diversos anticuerpos descritos aquí, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del cual se expresó. Los componentes contaminantes de su medio natural son materiales que habitualmente interferirían con usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos

o no proteínicos. En realizaciones preferidas, se purificará el anticuerpo (1) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante la utilización de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta una homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye anticuerpos in situ en el interior de células recombinantes, ya que por lo menos un componente del medio natural del polipéptido no estará presente. Normalmente, sin embargo, el polipéptido aislado se preparará mediante por lo menos una etapa de purificación.

[0040] El término “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión a ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

[0041] Un ácido nucleico está “unido operativamente” cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o secuencia líder secretora está unido operativamente a ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma está unido operativamente a una secuencia codificante

si está situado para facilitar la traducción. Generalmente, “unido operativamente” significa que las secuencias de

ADN que se unen están contiguas y, en el caso de una secuencia líder secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza mediante la unión en los sitios de restricción convenientes. Si dichos sitios no existen, se utilizan los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional.

[0042] “Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias polipéptidicas

identificadas aquí se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de de aminoácidos en el polipéptido que se compara, después del alineamiento de las secuencias y la introducción de huecos, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, mediante la utilización de un programa informático de disponibilidad pública como el programa BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parámetros adecuados para cuantificar el alineamiento incluyendo cualquier algoritmo que se requiera para lograr el máximo alineamiento sobre la longitud completa de las secuencias que se compararan. Para los propósitos de la presente invención, sin embargo, los valores de identidad de secuencia de aminoácidos en % se obtienen mediante la utilización del programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue realizado por Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de U.S., Washington D.C., 20559, en donde se ha registrado con el No. TXU510087. El programa ALIGN-2 es de disponibilidad pública gracias a Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debería editarse para utilizarse en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias están determinados por el programa ALIGN-2 y no varían.

[0043] Las secuencias de aminoácidos aquí descritas son secuencias de aminoácidos contiguas a menos que se especifique lo contrario.

[0044] Moléculas biológicas “estructuralmente no similares” según la presente invención se refiere a moléculas biológicas que no están en la misma clase (proteína, ácido nucleico, lípido, carbohidratos, etc.), o, por ejemplo, cuando se refiere a proteínas, que tienen menos de un 60% de identidad de aminoácidos, menos de un 50% de identidad de aminoácidos, menos de un 40% de identidad de aminoácidos, menos de un 30% de identidad de aminoácidos, menos de un 20% de identidad de aminoácidos o menos de un 10% de identidad de aminoácidos en comparación entre sí.

[0045] La “rigurosidad” de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por un experto habitual en la materia, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para una hibridación más correcta, mientras que sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para rehibridarse cuando las cadenas complementarias están presentes en un medio por debajo de su temperatura de fusión. Cuanto mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia de hibridación, mayor es la temperatura relativa que se puede utilizar. Como resultado, se deduce que temperaturas relativas superiores tenderían a hacer las condiciones de reacción más rigurosas, mientras que temperaturas inferiores no tanto. Para detalles adicionales y explicaciones de la rigurosidad de las reacciones de hibridación, ver Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

[0046] Condiciones rigurosas” o “condiciones de rigurosidad elevada”, tal y como se definen en la presente invención, se pueden identificar por aquéllas que: (1) utilizan una fuerza iónica baja y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo, cloruro sódico 0,015 M/citrato sódico 0,0015 M/dodecil sulfato sódico al 0,1% a 50oC; (2) utilizan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0,1%/Ficol al 0,1%/polivinilpirrolidona al 0,1%/tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,5 con cloruro sódico 750 mM, citrato sódico 75 mM a 42oC; o (3) una hibridación durante la noche en una solución que utiliza formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato sódico 0,075 M), fosfato sódico 50 mM (pH 6,8), pirofosfato sódico al 0,1%, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 g/ml), SDS al [0047] Las “condiciones moderadamente rigurosas” se pueden identificar tal y como se describen en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen la utilización de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante toda la noche a 37oC en una solución que comprende: formamida al 20%, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado 20 mg/ml, seguido del lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50oC. El experto en la materia sabrá como ajustar la temperatura, la fuerza iónica, etc. necesarias para acomodar factores, tales como la longitud de la sonda y similares.

[0048] Las “funciones efectoras” de anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una región Fc de secuencia nativa o una región Fc de una variante en la secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente de complemento; la unión a receptor de Fc; citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; subregulación de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B); y la activación de células B.

[0049] “Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo” o “ADCC” se refieren a una forma de citotoxicidad en que la Ig secretada unida a receptores de Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas (“killer”) naturales (NK), neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y, posteriormente, eliminen la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos “arman” las células citotóxicas y son absolutamente necesarias para dicha eliminación. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan FcγRIII solo, mientras que los monocitos expresan FcγRI, FcγRII y FcγRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla

3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de Estados Unidos 5.500.362 ó 5.821.337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede determinar in vivo, por ejemplo en un modelo animal, tal como el descrito en Clynes et al. PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

[0050] Los términos “receptor Fc” o “FcR” describen un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es aquella que se une a un

anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcγRI, FcγRII, y FcγRIII, incluyendo variantes alélicas y formas alternativamente empalmadas (“spliced”) de estos receptores. Los receptores FcγRII incluyen FcγRIIA (un “receptor de activación”) y FcγRIIB (un “receptor de inhibición”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos. El receptor de activación FcγRIIA

contiene un motivo de activación del inmunoreceptor basado en tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El

receptor de inhibición FcγRIIB contiene un motivo de inhibición del inmunoreceptor basado en tirosina (ITIM) en su

dominio citoplásmico (revisado en Daëron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234 (1997)). Los FcRs se revisan en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo los que se identifiquen en el futuro, están comprendidos por el término “FcR” aquí. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976); y Kim et al., J. Immunol.,

24:249 (1994)).

[0051] “Células efectoras humanas” son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos FcγRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de

leucocitos humanos que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; prefiriéndose las células PBMCs y NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.

[0052] “Citotoxicidad dependiente del complemento” o “CDC” se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación del mecanismo de complemento clásico se inicia mediante la unión del primer componente del sistema de complemento (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su [0053] El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto. En el caso de un tumor (por ejemplo, un tumor canceroso), la cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo para HER2 y VEGF o HER2 y DR5) puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño de tumor primario; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; inhibir (es decir, ralentizar en cierto grado y preferiblemente detener) la metástasis tumoral; inhibir en cierto grado, el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Siempre que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo pueda prevenir el crecimiento y/o elimine las células cancerosas existentes, puede ser citostático o citotóxico. Para la terapia del cáncer, la eficacia in vivo se puede medir, por ejemplo, mediante la evaluación de la duración de la supervivencia, el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TTP), las velocidades de respuesta (RR), duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

[0054] Por quot;reducir o inhibirquot; se entiende la capacidad de causar una disminución global preferiblemente del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y lo más preferiblemente del 75%, 85%, 90%, 95%, o más. Reducir o inhibir pueden referirse a los síntomas del trastorno en tratamiento, la presencia o tamaño de la metástasis, el tamaño del tumor primario, o el tamaño o número de los vasos sanguíneos en trastornos angiogénicos.

[0055] Los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la enfermedad fisiológica en mamíferos que se caracterizan habitualmente por un crecimiento celular no regulado. Se incluyen en esta definición cánceres benignos y malignos. Por “cáncer de fase temprana” se entiende un cáncer que no es invasivo o metastático o está clasificado como un cáncer de Fase 0, I ó II.

[0056] El término quot;precancerosoquot; se refiere a una condición o un crecimiento que habitualmente precede o se desarrolla en cáncer.

[0057] Por quot;no metastásicoquot; se entiende un cáncer que es benigno o que permanece en el sitio primario y no ha penetrado en el sistema linfático o el sistema de vasos sanguíneos o en tejidos diferentes del sitio primario. En general, un cáncer no metastásico es cualquier cáncer que es un cáncer en la Fase 0, I o II y ocasionalmente un cáncer de Fase III.

[0058] Una quot;enfermedad autoimmune” en la presente invención es una enfermedad o trastorno que aparece y se

dirige contra un tejido propio del individuo o un cosegregado o manifestación del mismo o resultante de una patología del mismo. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero sin limitación, artritis (artritis reumatoide, tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriática, artritis vertebral, y artritis reumatoide de aparición juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades de piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis, tal como psoriasis de placas, psoriasis gutatte, psoriasis pustular, y psoriasis de las uñas, dermatitis que incluyen dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiformis, y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligado a X, urticaria, tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune urticaria, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémico), esclerosis, tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS), tal como MS espino óptica, MS progresiva primaria (PPMS), y MS remitente recidiva (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada, y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por el sistema inmune, colitis, tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis micrsocópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de distrés respiratorio, incluyendo síndrome de distrés respiratorio adulto o agudo (ARDS), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmune, espondilitis reumatoide, pérdida súbita de audición, enfermedades mediadas por IgE, tales como anafilaxis y rinitis alérgica y atópica, encefalitis, tal como la encefalitis de Rasmussen y la encefalitis límbica y/o del bulbo raquídeo, uveitis, tales como uveitis anterior, uveitis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveitis no granulomatosa, uveitis facoantigénica, uveitis posterior, o uveitis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con o sin síndrome nefrótico, tal como glomerulonefritis crónica o aguda, tal como GN primaria, GN mediada por el sistema inmune, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN membranoproliferativa o proliferativa membranosa (MPGN), incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, condiciones alérgicas, reacción alérgica, eczema que incluye eczema alérgica o atópica, asma, tal como asma bronquial, y asma autoinmune, patologías que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus eritematoso sistémico tal como SLE cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), lupus eritematoso diseminado, lupus (que incluyen nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extrarenal, discorde, alopecia), diabetes mellitus de aparición juvenil (tipo I), que incluyen diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) pediátrica, diabetes mellitus de aparición adulta (diabetes tipo II), diabetes autoinmune, diabetes idiopatíca insípida, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis que incluye granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, que incluye vasculitis (incluyendo vaculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (que incluyen enfermedad Kawasaki y poliarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vaculitis necrotizante, cutánea o por hipersensibilidad, vaculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune, que incluye anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica, tal como secundaria a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de antimembrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide, tal como penfigoide bulloso y penfigoide de la piel, pénfigo (que incluye pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide de membrana mucosa y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica, tal como polineuropatías de IgM

o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), que incluyen púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y tombocitopenia autoinmune o mediada por el sistema inmune, tal como púrpura trombicitopénica idiopática (ITP), que incluyen ITP crónica o aguda, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios, que incluyen orquitis autoinmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes, que incluyen tiroiditis, tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis subaguda, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares, tales como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, que incluyen síndromes paraneoplásicos neurológicos, tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o persona rígida, encefalomielitis, tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia gravis, tal comomiastenia gravis asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus o síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, pneumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterans (no transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumocistosis, síndrome de neteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, enfermedad coeliaca, celiaquía (enteropatía de gluten), enfermedad celíaca refractaria, enfermedad celíaca idiopática, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de arterias coronarias, enfermedad autoinmune de la audición, tal como enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida de audición autoinmune, síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS), policondritis, policondritis refractaria o recidivante, proteinosis pulmonar alveolar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de células B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significancia no determinada, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías, tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomerulosclerosis segmental focal (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveoretinitis, corioretinitis, trastornos hematológico autoinmune, fibromialgia, fallo endocrino múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes, tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunes, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia), infertilidad masculina y femenina autoinmune, enfermedad de tejido conectivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome postcardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de cuidador de aves, angeítis granulomatosa alérgica, angeitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitos tal como alveolitos alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción de transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, quipanosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, fascitis eosinofílica, Síndrome de Shulman, Síndrome de Felty, flariasis, ciclitos, tal como ciclitos crónica, ciclitos heterocrónica, iridociclitis, o ciclitos de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección por ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de rubeola, síndromes después de la vacunación, infección por rubeola congénita, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, fallo de las gónadas autoinmune, corea de Sydenham, nefritis postestreptococos, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftamopatía endocrina, pneumonitis por hipersensibilidad crónica, queeratoconjuntivitis sicca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión familiar y pos isquemia-reperfusión benigna, autoinmunidad retinal, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, silicosis, afta, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, aspermiogenese, hemólisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilactica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida auditiva sensorineural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopática primaria, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia escénica adquirida, infertilidad debida a anticuerpos antiespermatozoos, timoma no maligno, vitiligo, enfermedades asociadas a SCID y virus de Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA), enfermedad parasíticas, tales como Lesihmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento alimenticio, patologías que implican la infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas por citoquinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis de leucoticos, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de antimembrana basal glomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primaria, gastritis atrófica autoinmune, oftalmia simpatética, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitas, fallo poliendocrino, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio adulto (AOIH), alopecia total, cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bullosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulento o no purulento, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar o esferoide, un trastorno relacionado con eosinófilos, tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar trópica, aspergilosis broncopneumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis serongativos, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclera, episclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, trastornos isquémico de reperfusión, reducción en la respuesta a la presión sanguínea, disfunción vascular, antgiectasis, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad que acompaña la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de tejidos miocardiacos u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, inflamación aguda seria, inflamación crónica intratable, pielitis, pneumonocirrosis, retinopatía diabética, trastorno de arterias grandes diabéticas, hiperplasia de extremo arterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis.

[0059] Un quot;sujetoquot; es un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, animales de granja (tales como vacas), animales de eventos deportivos, animales domésticos (tales como gatos, perros y caballos), primates, ratones y ratas.

[0060] Se utilizaron los reactivos comercialmente disponibles referidos en los ejemplos según las instrucciones del fabricante, a menos que se indicara lo contrario. El origen de las células identificados en los siguientes ejemplos, y a lo largo de la memoria, por los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se indique lo contrario, la presente invención utiliza procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante, tales como los descritos aquí anteriormente y en los siguientes libros de texto: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

II. Usos terapéuticos

[0062] Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo aquí descritos que se unen a HER2 y VEGF (por ejemplo, bH1 o fragmentos de los mismos) o HER2 y DR5 se pueden utilizar para el tratamiento de tumores, incluyendo tumores precancerosos, no metastáticos, y cancerosos (por ejemplo, cáncer de fase temprana), para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, o para el tratamiento de un sujeto con riesgo de desarrollar cáncer, por ejemplo, cáncer de mama o una enfermedad autoinmune.

[0063] El término cáncer comprende una colección de trastornos proliferativos, que incluyen, pero sin limitación, crecimientos precancerosos, tumores benignos y tumores malignos, Los tumores benignos permanecen localizados en el punto de origen y no tienen la capacidad de infiltrarse, invadir o producir metástasis a puntos distantes. Los tumores malignos invadirán y dañarán otros tejidos alrededor de ellos. También pueden ganar la capacidad de desprenderse de donde empezaron y extenderse a otras partes del cuerpo (metástasis), normalmente a través del torrente sanguíneo o a través del sistema linfático donde se localizan los nódulos linfáticos. Los tumores primarios se calsifican por el tipo de tejido del que surgen; los tumores metastáticos se clasifican por el tipo de tejido del que derivan las células de cáncer. Con el tiempo, las células de un tumor maligno se vuelven más anormales y parecen menos como células normales. Este cambio en la aparición de células cancerosas se llama el grado del tumor y las células cancerosas se describen como bien diferenciadas, moderadamente diferenciadas, escasamente diferenciadas o no diferenciadas. Las células bien diferenciadas parecen bastante normales y se parecen a las células normales de las que se originan. Las células no diferenciadas son células que son ya tan anormales que ya no es posible determinar el origen de las células.

[0064] El tumor puede ser un tumor sólido o un tumor no sólido o de tejido blando. Ejemplos de tumores de tejido blando incluyen leucemia (por ejemplo, leucemia mielógena crónica, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda adulta, leucemia mielógena aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocítica crónica, leucemia prolinfocítica o leucemia de células pilosas), o linfoma (por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, linfoma de células T cutáneas, o enfermedad de Hodgkin). Un tumor sólido incluye cualquier cáncer de tejidos corporales diferentes de la sangre, médula ósea o el sistema linfático. Los tumores sólidos se pueden separar además en los de origen de células epiteliales y los de origen de células no epiteliales. Ejemplos de tumores sólidos de células epiteliales incluyen tumores del tractos gastrointestinal, colon, mama, próstata, pulmón, riñón, hígado, páncreas, ovario, cabella y cuello, cavidad oral, estómago, duodeno, intestino delgado, intestino grueso, ano, vesícula biliar, labio, nasofaringe, piel, útero, órgano genital masculino, órganos urinarios, vejiga y piel. Los tumores sólidos de origen no epitelial incluyen sarcomas, tumores del cerebro y tumores óseos.

[0065] Los cánceres epiteliales se desarrollan en general a partir de un tumor benigno a una fase preinvasiva (por ejemplo, carcinoma in situ), a un cáncer maligno, que ha penetrado en la membrana basal e invadido el estroma subepitelial.

[0066] Los anticuerpos multiespecíficos que se unen a VEGF y HER2 o DR5 y HER2 se utilizan de manera deseable para tratar el cáncer de mama.

[0067] Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero sin limitación, artritis (artritis reumatoide, tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriática, artritis vertebral, y artritis reumatoide de aparición juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva y espondilitis anquilosante), enfermedades de piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis, tal como psoriasis de placas, psoriasis gutatte, psoriasis pustular, y psoriasis de las uñas, dermatitis que incluyen dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica, dermatitis herpetiformis, y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM ligado a X, urticaria, tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria autoinmune urticaria, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémico), esclerosis, tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS), tal como MS espino óptica, MS progresiva primaria (PPMS), y MS remitente recidiva (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis diseminada, y esclerosis atáxica, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas por el sistema inmune, colitis, tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis micrsocópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino), pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, episcleritis), síndrome de distrés respiratorio, incluyendo síndrome de distrés respiratorio adulto o agudo (ARDS), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmune, espondilitis reumatoide, pérdida súbita de audición, enfermedades mediadas por IgE, tales como anafilaxis y rinitis alérgica y atópica, encefalitis, tal como la encefalitis de Rasmussen y la encefalitis límbica y/o del bulbo raquídeo, uveitis, tales como uveitis anterior, uveitis anterior aguda, uveitis granulomatosa, uveitis no granulomatosa, uveitis facoantigénica, uveitis posterior, o uveitis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con o sin síndrome nefrótico, tal como glomerulonefritis crónica o aguda, tal como GN primaria, GN mediada por el sistema inmune, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN membranoproliferativa o proliferativa membranosa (MPGN), incluyendo Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, condiciones alérgicas, reacción alérgica, eczema que incluye eczema alérgica o atópica, asma, tal como asma bronquial, y asma autoinmune, patologías que implican la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus eritematoso sistémico tal como SLE cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), lupus eritematoso diseminado, lupus (que incluyen nefritis, cerebritis, pediátrico, no renal, extrarenal, discorde, alopecia), diabetes mellitus de aparición juvenil (tipo I), que incluyen diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) pediátrica, diabetes mellitus de aparición adulta (diabetes tipo II), diabetes autoinmune, diabetes idiopatíca insípida, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis que incluye granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, que incluye vasculitis (incluyendo vaculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de vasos medianos (que incluyen enfermedad Kawasaki y poliarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, vasculitis del SNC, vaculitis necrotizante, cutánea o por hipersensibilidad, vaculitis necrotizante sistémica y vasculitis asociada con ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune, que incluye anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia o aplasia pura de glóbulos rojos (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis de leucocitos, trastornos inflamatorios del SNC, síndrome de lesión multiorgánica, tal como secundaria a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de antimembrana basal glomerular, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o enfermedad de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide, tal como penfigoide bulloso y penfigoide de la piel, pénfigo (que incluye pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide de membrana mucosa y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica, polineuropatías, neuropatía crónica, tal como polineuropatías de IgM

o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (desarrollada por pacientes con infarto de miocardio, por ejemplo), que incluyen púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y tombocitopenia autoinmune o mediada por el sistema inmune, tal como púrpura trombicitopénica idiopática (ITP), que incluyen ITP crónica o aguda, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios, que incluyen orquitis autoinmune y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes, que incluyen tiroiditis, tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis subaguda, enfermedad de la tiroides autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares, tales como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatía poliglandular), síndromes paraneoplásicos, que incluyen síndromes paraneoplásicos neurológicos, tales como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o persona rígida, encefalomielitis, tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia gravis, tal comomiastenia gravis asociada a timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, opsoclonus o síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, pneumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterans (no transplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis de IgA lineal, cirrosis biliar primaria, neumocistosis, síndrome de neteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, enfermedad coeliaca, celiaquía (enteropatía de gluten), enfermedad celíaca refractaria, enfermedad celíaca idiopática, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de arterias coronarias, enfermedad autoinmune de la audición, tal como enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida de audición autoinmune, síndrome de opsoclonus mioclonus (OMS), policondritis, policondritis refractaria o recidivante, proteinosis pulmonar alveolar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de células B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significancia no determinada, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías, tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomerulosclerosis segmental focal (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveoretinitis, corioretinitis, trastornos hematológico autoinmune, fibromialgia, fallo endocrino múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes, tales como enfermedades desmielinizantes autoinmunes, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia), infertilidad masculina y femenina autoinmune, enfermedad de tejido conectivo mixto, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón de granjero, eritema multiforme, síndrome postcardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de cuidador de aves, angeítis granulomatosa alérgica, angeitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitos tal como alveolitos alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción de transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, quipanosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetalis, fascitis eosinofílica, Síndrome de Shulman, Síndrome de Felty, flariasis, ciclitos, tal como ciclitos crónica, ciclitos heterocrónica, iridociclitis, o ciclitos de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección de virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infección por ecovirus, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de rubeola, síndromes después de la vacunación, infección por rubeola congénita, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, fallo de las gónadas autoinmune, corea de Sydenham, nefritis postestreptococos, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftamopatía endocrina, pneumonitis por hipersensibilidad crónica, queeratoconjuntivitis sicca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión familiar y pos isquemia-reperfusión benigna, autoinmunidad retinal, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias, silicosis, afta, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleróticos, aspermiogenese, hemólisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilactica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida auditiva sensorineural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileitis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema idiopática primaria, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia escénica adquirida, infertilidad debida a anticuerpos antiespermatozoos, timoma no maligno, vitiligo, enfermedades asociadas a SCID y virus de Epstein-Barr, síndrome de inmunodeficiencia adquirido (SIDA), enfermedad parasíticas, tales como Lesihmania, síndrome de choque tóxico, envenenamiento alimenticio, patologías que implican la infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retrasada mediadas por citoquinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis de leucoticos, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de antimembrana basal glomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primaria, gastritis atrófica autoinmune, oftalmia simpatética, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome nefrótico, insulitas, fallo poliendocrino, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio adulto (AOIH), alopecia total, cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bullosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulento o no purulento, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoide, frontal, maxilar o esferoide, un trastorno relacionado con eosinófilos, tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pneumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar trópica, aspergilosis broncopneumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis serongativos, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclera, episclera, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasia, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, trastornos isquémico de reperfusión, reducción en la respuesta a la presión sanguínea, disfunción vascular, antgiectasis, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad que acompaña la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión de tejidos miocardiacos u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otros trastornos del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citoquinas, inflamación aguda seria, inflamación crónica intratable, pielitis, pneumonocirrosis, retinopatía diabética, trastorno de arterias grandes diabéticas, hiperplasia de extremo arterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis.

III. Dosis y formulaciones

[0068] Las composiciones de anticuerpo (por ejemplo, bH1) o fragmento de anticuerpo se formularán, dosificarán y administrarán de acuerdo con las buenas prácticas médicas. Entre los factores de consideración en este contexto se incluyen el trastorno particular en tratamiento, el mamífero particular en tratamiento, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, la pauta de

administración y otros factores conocidos para los profesionales médicos, La “cantidad terapéuticamente eficaz” del

anticuerpo o fragmento de anticuerpo a administrar estará gobernada por dichas consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar un cáncer. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, aunque no es necesario, puede opcionalmente formularse con uno o más agentes utilizados actualmente para prevenir o tratar el cáncer o un riesgo de desarrollar un cáncer. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Se utilizan en general en las mismas dosis y con rutas de administración tal como se han utilizado antes aquí o aproximadamente de 1 a 99% de las dosis empleadas hasta la fecha. En general, el alivio o tratamiento de un cáncer implica la disminución de uno o más síntomas o problemas médicos asociados con el cáncer. Con la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco se consigue una o o una combinación de los siguientes hechos: reducir (en por lo menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más) el número de células cancerosas; reducir o inhibir el tamaño del tumor o la carga tumoral; inhibir (es decir, disminuir en cierto grado y/o detener) la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; reducir la secreción hormonal en el caso de adenomas; reducir la densidad de vasos; inhibir la metástasis tumoral; reducir o inhibir el crecimiento tumoral; y/o aliviar en cierto grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede utilizar para evitar la aparición o reaparición del cáncer en el sujeto.

[0069] El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se pueden utilizar para incrementar la duración de la supervivencia de un paciente humano susceptible de cáncer o diagosticado con un cáncer. La duración de la supervivencia se define como el tiempo desde la primera administración del fármaco hasta la muerte. La duración de la supervivencia también se puede medir mediante la proporción de peligro estratificado (HR) del grupo de tratamiento frente al grupo de control, que representa el riesgo de muerte para un paciente durante el tratamiento.

[0070] El tratamiento con anticuerpos producidos por lo métodos de la presente invención puede incrementar significativamente la tasa de respuesta en un grupo de pacientes humanos susceptibles o diagnosticados con un cáncer que se tratan con varias terapias anticáncer. La tasa de respuesta se define como el porcentaje de pacientes tratados que respondieron al tratamiento. El tratamiento de combinación de utilización de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y cirugía, terapia de radiación, o uno o más agentes quimioterapéuticos puede incrementar significativamente las tasas de respuesta en el grupo de pacientes tratados en comparación con el grupo tratado con cirugía, terapia de radiación o quimioterapia sola, teniendo el incremento una valor p en chi cuadrado inferior a 0,005.

[0071] Las mediciones adicionales de la eficacia terapéutica en el tratamiento de cánceres se describen en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos No. 20050186208.

[0072] Las formulaciones terapéuticas se preparan utilizando métodos estándar conocidos en la técnica mediante la mezcla del principio activo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition), ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA). Los portadores aceptables incluyen solución salina, o tampones como lo fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (inferiores a aproximadamente 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos como la glicina, la glutamina, la asparagina, la arginina o la lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, la manosa, o las dextrinas; los agentes quelantes como el EDTA; los alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol; los contraiones formadores de sales como el sodio; y/o los tensoactivos no iónicos como el TWEENTM, PLURONICSTM o PEG.

[0073] Opcionalmente, pero preferiblemente, la formulación contiene una sal farmacéuticamente aceptable, preferiblemente cloruro de sodio, y preferiblemente a concentraciones aproximadamente fisiológicas. Opcionalmente, las formulaciones pueden contener un conservante farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la concentración de conservante varía de 0,1 a 2,0%, habitualmente v/v. Los conservantes adecuados incluyen los conocidos en el sector farmacéutico. Los conservantes preferidos son alcohol bencílico, fenol, m-cresol, metilparaben y propilparaben. Opcionalmente, las formulaciones pueden incluir un tensoactivo farmacéuticamente aceptable a una concentración de 0,005 a 0,02%.

[0074] La formulación de la presente invención también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la patología particular a tratar, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no [0075] Los principios activos pueden también encapsularse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o

en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.

ed. (1980).

[0076] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de Estados Unidos 3.773.919), copolímeros de ácido Lglutámico y etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de acetato de vinilo-etileno, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tales como LUPRON DEPOTTM (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), y ácido poli-D-(-)3-hidroxibutírico. Mientras que polímeros tales como el acetato de vinilo-etileno y de ácido láctico–ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un tiempo prolongado, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37ºC, lo que da lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Deben idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de un enlace S-S intermolecular a través de un intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede lograrse modificando residuos sulfhidrilos, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones específicas de matrices poliméricas.

[0077] Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos aquí descritos (por ejemplo, bH1 o fragmentos de los mismos) se administran a un sujeto humano, según métodos conocidos, tales como administración intravenosa como bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, mediante rutas intramuscular, interaperitoneal, intracerobrospinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación. La administración local puede ser particularmente deseada si los extensos efectos secundarios o toxicidad están asociados con el antagonismo de VEGF, HER2, o DR5. Se puede utilizar también una estrategia ex vivo para aplicaciones terapéuticas. Las estrategias ex vivo implican la transfección o transducción de células obtenidas del sujeto con un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. A continuación, las células transfectadas o transducida se devuelven al sujeto. Las células pueden ser cualquiera de la amplia gama de tipos, que incluyen, sin limitación, células hematopoyéticas (por ejemplo, células de médula ósea, macrófagos, monocitos, células dendríticas, células T o células B), fibroblastos, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos o células musculares.

[0078] En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra localmente, por ejemplo, mediante inyecciones directas, cuando el trastorno o localización del tumor lo permite, y las inyecciones se pueden repetir de manera periódica. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se pueden liberar sistémicamente al sujeto o directamente a las células turmorales, por ejemplo, a un tumor o un lecho del tumor después de la escisión quirúrgica del tumor, a efectos de prevenir o reducir la recurrencia local o metástasis.

Artículos de fabricación y kits

[0079] La invención puede proporcionar un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes y cánceres o un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades de inmunodeficiencia. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado con el mismo. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón penetrable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo de la invención. La etiqueta o prospecto indica la composición que se utiliza para tratar la enfermedad particular. La etiqueta o prospecto [0080] El prospecto se refiere a instrucciones incluidas normalmente en envases comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las enfermedades, usos, dosificación, administración, contraindicaciones y/o avisos referentes a la utilización de dichos productos terapéuticos. En una realización, el prospecto indica que la composición se utiliza para tratar cáncer de mama.

[0081] Adicionalmente, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Se pueden incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

[0082] También se proporcionan kits que son útiles para varios fines, por ejemplo, para la purificación o inmunoprecipitación de VEGF, HER2 o DR5 de células. Para el aislamiento y purificación de VEGF, HER2, o DR5, el kit puede contener un anticuerpo VEGF/HER2 o HER2/DR5 acoplado a micropartículas (por ejemplo, micropartículas de sefarosa). Se pueden proporcionar kits que contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación de VEGF, HER2, o DR5 in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una transferencia Western. Como con el artículo de fabricación, el kit comprende un recipiente y un marcador o prospecto en o asociado con el recipiente. El recipiente contiene una composición que comprende por lo menos un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la invención. Se pueden incluir recipientes adicionales que contienen, por ejemplo, diluyentes o tampones o anticuerpos de control. La etiqueta o el prospecto puede proporcionar una descripción de la composición, así como instrucciones para el uso in vitro o de diagnóstico pretendido.

[0083] La descripción escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la materia realice la invención. Los siguientes ejemplos se ofrecen únicamente para fines ilustrativos, y no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la presente invención. De hecho, varias modificaciones de la invención adicionales a las mostradas y descritas aquí serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción y se encuentran en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Diseño y construcción de bibliotecas

[0084] El sitio de union a antígeno se forma mediante la asociación del dominio variable (VH, VL) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC), cada una con tres bucles de CDR para el reconocimiento de antígenos. En muchos casos, uno de los dos dominios variables, a menudo VH, determina la especificidad de antígeno. Los ratones con un repertorio HC transgénica, pero LC intacta, generan títulos de anticuerpo neutralizante (Senn et al., Eur. J. Immunol. 33:950-961, 2003). Se empezó a investigar cómo puede aparecer la biespecificidad de un anticuerpo y si la diferente utilización de los dominios VH y VL puede permitir la especificidad de unión dual a antígeno.

[0085] Se tomó una estrategia semiempírica para encontrar un diseño para diversificar la composición de aminoácidos y la longitud de CDR de la cadena ligera de anticuerpo y na plantilla de biblioteca que permitía la generación de una biblioteca de anticuerpos expresados en fagos funcionales, de la que se podía seleccionar anticuerpos que se unían específicamente a un antígeno de proteína. La diversidad de secuencia y longitud de las regiones CDR de aproximadamente 1500 secuencias de cadena ligera kappa humana, representadas en la base de datos Kabat, sirvió para guiar en el proceso de diseño de la biblioteca. Se marcaron los residuos expuestos a disolvente para la aleatorización. Se ajustó un subgrupo de las posiciones aleatorizadas para representar aminoácidos que son parte del repertorio natural en estos sitios, mientras que los sitios restantes se aleatorizaron para incluir los 20 aminoácidos naturales.

[0086] En particular, la plantilla de cadena ligera (dominio variable) establecida a continuación se modificó tal como se describe aquí (los residuos subrayados son aleatorios) (SEQ ID NO:19).

[0087] Se generaron cuatro grupos de bibliotecas en base a 3 plantillas de Fab y scFv humanas donde los grupos de posiciones distintas se reconocieron para la aleatorización (figura 1).

[0088] En todas las bibliotecas, la cadena pesada se mantuvo constante con su secuencia definida por la plantilla de biblioteca. La secuencia de la plantilla de cadena pesada (dominio variable) se establece a continuación (SEQ ID NO:20).

[0089] Todas las plantillas de biblioteca contenían un codón de parada (Sidhu et al., 2004) en la CDR L1 que evitaba la presencia de la cadena ligera de plantilla entre los miembros de la biblioteca de anticuerpos expresados en fagos. Las secuencias de CDR plantilla se resumen en la figura 3. Los diseños de las bibliotecas se resumen en las figuras 1 y 2.

[0090] En un ejemplo, se introdujeron mutaciones en el dominio variable de LC de un anticuerpo específico de Her2 para identificar variantes que se pueden unir a un antígeno de proteína diferente mientras se mantiene la especificidad de unión original. Se tomó una estrategia conservativa para aleatorizar las CDR de LC a efectos de generar variantes que se pueden expresar de manera estable. Se seleccionaron doce posiciones de CDR de LC expuestas para la aleatorización: cinco en CDR1 (28, 29, 30, 31, 32), tres en CDR2 (50, 51, 53) y cuatro en CDR3 (91, 92, 93, 94). Además, para guiar en el diseño de diversidad de aminoácidos en sitios elegidos, se examinó la diversidad natural de estas posiciones mediante el análisis de aproximadamente 1500 secuencias de CDR de LC kappa humanas (Johnson y Wu, Nucleic Acids Res. 28:214, 2000; Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901, 1987) (Figura 38). Algunas posiciones con una diversidad natural relativamente elevada (30, 31, 50, 92, 93) estaban totalmente aleatorizadas, mientras que otras posiciones estaban limitadas a como mínimo dos tipos de aminoácidos para mimetizar los anticuerpos naturales. La variación de longitud de CDR1 y CDR3 de LC naturales también se reflejaron en la biblioteca (figura 38). En la figura 38, X indica los tipos de aminoácidos diseñados a frecuencias bajas tal como se muestra. La diversidad de longitud se construye mediante la inserción de 1 a 5 residuos entre los residuos 30 y 31 y entre los residuos 93 y 94.

[0091] La biblioteca de LC es un repertorio productivo sin modificar (tabla 1). Se listan los resultados del cribado de 95 clones aleatorios al final de las cuatro rondas de selección. En particular, la selección para la nueva especificidad de unión se realizó tal como se describe en dianas inmovilizadas (VEGF, DR5, y Fc humana) (Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338:299, 2004). Después de cuatro rondas de selección, se analizaron 95 clones de fagos utilizando ELISA para la unión a la diana, HER2, y una proteína no diana, BSA, para asegurar la unión específica. Para enriquecer los clones de unión diana que mantenía la unión a HER2, se realizó una ronda final de selección en HER2. Se secuenciaron los clones positivos. Para identificar los enlazadores de mayor afinidad, se determinó la IC50 para la unión a antígeno mediante ELISA competitivo (Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338:299, 2004). Se muestra el número de clones únicos determinado mediante análisis de secuencia y el número de clones únicos que mantienen la unión a HER2 (clones biespecíficos). Estos clones muestran señales de unión base mínimas a antígenos irrelevantes, tales como BSA.

% Positivas

Sec. unica HER2 positivo

Fusión Fc humana

63 31 de 61 1

HVEGF

77 41 de 74 30 de 41

DR5 largo

85 5 de 82 2* de 5

Diana

Biespecífico, cribado Biespecífico, cribado

Fusión Fc humana

1 de 31 No determinado

HVEGF

30 de 41 94 de 94

DR5 largo

2* de 5 2 de 7*

* = señal de unión débil * = señal de unión débil Her2 ** = señal de unión débil DR5

5 [0092] La selección contra tres antígenos de proteínas: el factor de crecimiento endotelial vascular humano (hVEGF), el receptor de muerte 5 (DR5), y el fragmento de unión a complemento de IgG (Fc), generó muchos clones de unión (Figura 39A). Algunos clones perdieron la afinidad de unión para HER2, mientras que otros mantuvieron la unión a HER2 y eran de este modo biespecíficos. El análisis de secuencia de las 131 variantes únicas de Herceptin® con la nueva especificidad de unión identificó las sustituciones e inserciones de aminoácidos en

10 comparación con el anticuerpo Herceptin® (Figura 39B).

[0093-4] El número de mutaciones variaba de 3 a 17. Los clones que mantenían la unión a HER2 (los clones biespecíficos) contenían menos mutaciones de promedio que los que perdieron la unión a HER2. Se prefería mantener la secuencia CDR-L3 del anticuerpo Herceptin®, pero no era suficiente para conservar la unión a HER2.

15 Esto concuerda con la información de que la CDR-L3 del anticuerpo Herceptin® es la CDR LC más importante para la unión a HER2 (Kelley and O’Connell, Biochemistry 32:6828. 1993). Los clones de unión a VEGF y DR5 representativos se expresaron como proteínas Fab e IgG (Tabla 2).

[0095] Las afinidades de unión en equilibrio (KD) de los anticuerpos monoespcíficos derivados de la biblioteca LC variaban de 15 a 150 nM. Los anticuerpos biespecíficos se unían a nuevos antígenos (es decir, VEGF y DR5) con una afinidad de concentración (nM) elevada a baja ( M) y a HER2 con una afinidad de concentración (nM) baja (tabla 2). El anticuerpo bH mostró la afinidad biespecífica más elevada para los dos antígenos de proteínas diferentes VEGF (KD=300 nM) y HER2 (KD=26 nM).

Materiales

[0096] Las enzimas y el fago auxiliar M13-KO7 eran de New England Biolabs. XL1-blue de E. coli era de Stratagene. La albúmina de suero bovino (BSA), ovalbúmina y Tween 20 eran de Sigma. La neutravidina, caseína y Superblock eran de Pierce. La proteína G inmovilizada y la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada a anti-M13 eran de GE Healthcare (Piscataway, NJ). Las inmunoplacas Maxisorp eran de NUNC (Roskilde, Dinamarca). El sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) era de los laboratorios Kirkegaard y Perry (Gaithersburg, MD). Todos los antígenos de proteínas se generaron por grupos de investigación en Genentech, Inc. La degeneración del ADN se representó utilizando el código IUB y representan mezclas equimolares a menos que se indique lo contrario: N=A/C/G/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T, K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=G/C, W=A/T, Y=C/T.

[0097] Por ejemplo, en ciertas posiciones aleatorias, el codón natural se sustituyó por un codón NNK degenerado (N = A/T/G/C, K = G/T en una proporción equimolar) que codifica los 20 aminoácidos naturales. El codón XYZ se refiere a un codón con proporciones de nucleótidos no iguales en cada posición del triplete de codones. X contenía el 38% de G,19% de A, 26% de T y 17% de C; Y contenía el 31% de G, 34% de A, 17% de T y 18% de C; y Z contenía 24% de G y 76% de C.

Vectores fagémidos para la construcción de bibliotecas

[0098] Se utilizaron técncias de biología molecular estándar para la construcción de vectores. Se construyeron tres plantillas para la generación de bibliotecas. Todas las plantillas son derivados del plásmido pV0354 utilizado en bibliotecas de cadena pesada basadas en 4D5 humanizado modificado (versión 8) (Lee et al., 2004a).

[0099] Se construyó el fagémido pJB0290 de plantilla de Fab-C de 2C4 mediante la clonación del dominio variable de cadena pesada de 2C4 en un vector pV0354-Fab-C que contenía el promotor de fosfatasa alcalina (Lowman et al., 1991) la señal de secreción stII para la cadena ligera y pesada de Fab. Se diseña para contener una única cisteína en el extremo C-terminal del dominio variable 1 de cadena pesada para permitir la expresión en el fago M13 bivalente del Fab de 2C4 tal como se ha descrito previamente (Lee et al., 2004b). Las CDR de cadena ligera de 2C4 se incorporaron en el vector de Fab-C mediante mutagénsis dirigida de sitio utilizando el método de Juntel et al. (Kunkel et al., 1987). Se añadió un epítopo etiqueta (etiqueta gD) (Lasky y Dowbenko, 1984) en el extremo Nterminal de la cadena ligera para permitir la determinación del nivel de expresión descrito (Sidhu et al., 2004). Se creó la plantilla de la biblioteca Fab12-G pV1283 mediante la clonación de un dominio variable de cadena pesada altamente expresado en pV0354-Fab-C, y el dominio variable de cadena ligera se modificó para contener CDR-L3 de Fab-12 (A4.6.1 humanizado, un anticuerpo anti-VEGF). El VH altamente expresado se seleccionó de una biblioteca de Fab que aleatorizaba los residuos de CDR de cadena pesada de Fab G6 utilizando la mutagénesis de rastreo de alanina por “shotgun” (Liang et al., 2006; Vajdos et al., 2002) con CDR-L3 convertido a Fab-12 (Y91STVPW96) mediante el cribado en anticuerpo anti-gD inmovilizado. El diseño y construcción del fagémido pV1384, que expresa scFV de 4d5 (LCR66G) bivalentemente en la superficie de partículas de fago M13, se modificó de la plantilla pS2018 descrita previamente (Sidhu et al., 2004). El fragmento scFv contenía un epítopo etiqueta de gD en la región enlazadora entre la cadena ligera y la cadena pesada. El residuo Arg66 del armazón de LC se mutó a Gly66, que es el residuo prevalente en esta posición en casi el 95% de las cadenas ligeras kappa naturales. La mutación R66G reduce la afinidad de unión de Herceptin® a HER2 sólo ligeramente (lt;2 veces) tal como se describe en Kelley y Connell (Biochemistry 32:6828, 1993). Las secuencias de CDR de las plantillas de biblioteca se resumen en la figura 3.

Construción de bibliotecas

[0100] Se crearon bibliotecas expresadas en fagos utilizando mutagénesis dirigida de sitio tal como se ha descrito (Sidhu et al., 2004). Los vectores plantilla de la biblioteca contenían un codón de para (TAA) en la CDR-L1, que se reparó durante la reacción de mutagénesis utilizando oligonucleótidos degenerados que se hibridaban sobre las secuencias que codificaban CDR-L1, CDRL3 (todas las bibliotecas), CDR-L2 (L1/L2/L3-A, -B, -C, +L4-D) y el armazón 3 de cadena ligera (L1/L4 y L1/L2/L3+L4-D). Las reacciones de mutagénsis de la biblioteca se realizaron según el método de Kunkel et al (Kunkel et al., 1987). Los diseños de las CDR de cadena ligera se describen en la figura 1, que resume los cdones degenerados utilizados en cada posición para las diferentes bibliotecas. Se mezclaron tres o cuatro oligonucleótidos a ciertas proporciones para cada CDR para codificar la frecuencia deseada de tipos de aminoácidos en cada posición reconocida para la aleatorización (figura 38). Los oligonucleótidos se combinaron en proporciones diferentes para afinar la diversidad para reflejar la frecuencia de aminoácidos en las secuencias de cadena ligera kappa en posiciones seleccionadas. Para CDR1, se mezclaron tres oligonucleótidos que contenían codones para las posiciones 91-94: CAT NNK NNK RST (SEQ ID NO:43), KMT XYZ XYZ RST (SEQ ID NO:44), o DGG XYZ XYZ RST (SEQ ID NO:45) en las proporciones 1:3:1. XYZ es una variación de NNK que tiene proporciones iguales de las A/G/T/C para cada sitio para reducir la cobertura de aminoácidos hidrófobos alifáticos (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073, 2004). Para CDR2, se mezclaron cuatro oligonucleótidos que contenían codones para las posiciones 50-53: NNK GST TCC NNK (SEQ ID NO:46), TGG GST TCC NNK (SEQ ID NO:47), KGG GST TCC TMT (SEQ ID NO:48), o NNK GST TCC TMT (SEQ ID NO:49) en las proporciones 1:1:2:10. Para CDR3, cada longitud era una mezcla de tres oligonucleótidos que contenían codones para la posición 28-33: G70A70C70 RTT NNK NNK TAC STA (SEQ ID NO:50), G70A70C70 RTT NNK NNK DGG STA (SEQ ID NO:51), o G70A70C70 RTT NNK NNK NMT STA (SEQ ID NO:52) en las proporciones 1:1:2. G70A70C70 es un codón quot;blandoquot; que permite el 70% del nucleótidos designado y el 10% de cada uno de los otros tres, codificando el ~50% de Glu y el ~50% de los otros aminoácidos.

[0101] El análisis estructural de un conjunto de anticuerpos representativos con LC kappa muestra que la CDR1 presenta el rango más amplio de conformaciones, que probablemten es el resultado de la variación en longitudes en bucle (11-17 residuos entre la posición 24 y 34). De este modo, se incluyeron las longitudes de CDR-L1 diferentes (longitudes 11-16) en la biblioteca. La CDR-L3 natural varía en la longitud (longitudes de 7-10 residuos entre la posición 89 y 96), que se refleja por el diseño de la biblioteca (longitudes 8-10; figura 38).

[0102] La figura 1 muestra la comparación de la diversidad natural de cadena ligea y los diseños de bibliotecas reales. Se agruparon los productos de la mutagénesis en una reacción por biblioteca y se electroporaron en células

E. coli SS320 complementadas con fago auxiliar KO7 y se desarrollaron durante la noche a 30°C (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073, 2004). Se utilizaron ~1011 células y ~5-10 mg de ADN en cada reacción de electroporación. Se purificaron los fagos de bibliotecas (Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338:299,2004). El número de transformantes variaba de 109 a 1010. El nivel de expresión de los Fab o scFv intactos en la superficie del fago se determinó en un ensayo de unión ELISA donde se analizaron 96 clones seleccionados aleatoriamente de cada biblioteca por su capacidad de unirse al anticuerpo anti-gD. El nivel de expresión variaba de 5 a 25% (figura 2). El 25% de los clones que expresaban anticuerpo mantenían la unión a HER2. Se secuenciaron aproximadamente 150 clones expresantes para examinar la diversidad real de la biblioteca en comparación la diversidad del diseño. Una parte (~30%) de los miembros de la biblioteca expresados funcionalmente mantenían la secuencia de CDR-L2 y/o CDR-L3 de anticuerpo Herceptin® antibody debido a la mutagénsis incompleta (un codón de detención plantilla en CDR-1 aseguraba un 100% de mutación de esta CDR en scFv expresados). Se excluyeron del análisis de secuencia de la diversidad real de la biblioteca. En la mayoría de las posiciones aleatorizadas, la diversidad de la biblioteca expresada en fagos de los clones expresanes no se desviaba significativamente (pgt;0,05, prueba de proporción de posibilidades) de la diversidad diseñada. Las excepciones fueron la posición 29 de la CDR-L1 en la que se halló que Val estaba ligeramente sobrerepresentada en comparación con Ile (p=0,005) y las posiciones 51 y 53 de CDR-L2, donde Gly y Ser eran más prevalentes que Ala y Tyr, respectivamente (plt;0,01).

Ejemplo 2. Evaluación del rendimiento de la biblioteca

Clasificación y cribado de bibliotecas

[0103] Se consideró que una biblioteca era funcional cuando los anticuerpos que se unían específicamente a varios antígenos de proteínas se podía aislar después de 4-5 rondas de separación. Se sabía que muchas dianas de proteínas permitían la inmovilización funcional para el cribado de bibliotecas y se han generado anticuerpos específicos a partir de bibliotecas expresadas en fagos validadas (Fellouse et al., 2005) (Lee et al., 2004a). Para evaluar cada grupo de bibliotecas, se escogió un subgrupo de estas dianas para la selección (figura 2). Las bibliotecas se sometieron a una ronda inicial de selección por unión con anticuerpos anti-gD o proteína L como diana de captura para eliminar clones en que el gen de Fab/scFv se había eliminado, seguido de 4-5 rondas de selección de antígeno. Alternativmente, se sometieron directamente a selección por unión a diana sin preselección con anti-gD

o proteína L. Se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos NUNC durante la noche con antígeno (5 mg/ml) y se bloquearon durante 1 hora con agentes bloqueantes alternativos (Figura 4). Se añadieron soluciones de fago de 1013 fagos/ml a las inmunoplacas recubiertas en el primer ciclo de selección. Se disminuyó la concentración de fagos en cada ronda de selección. Después de la incubación de las soluciones de fagos en las inmunoplacas para permitir la unión al antígeno inmovilizado, las placas se lavaron con PBS, 0,5% Tween 20, repetidamente. Para incrementar la rigurosidad, se disminuyó el tiempo de incubación (4 horas para la 1ª ronda, 3 horas para la 2ª, 3 horas para la 3ª, 2 horas para la 4ª, 1,75 horas para la 5ª) y se incrementó el número de lavados en cada ronda de selección (Figura 4). Los fagos unidos se eluyeron con HCl 0,1 M durante 30 minutos y el eluyente se neutralizó con base Tris 1,0 M. La recuperación de fago por pocillo de inmunoplaca recubierta de antígeno se calculó y comparó con la de un pocillo bloqueado sin antígeno recubierto para estudiar el enriquecimineto de clones de fagos que expresan Fab o scFv que se unían específicamente al antígeno diana (Figura 4). Los fagos eluidos se amplificaron en E. Coli y se utilizaron para rondas de selección posteriores. Los clones aleatorios de las rondas 4 y 5 se seleccionaron para el cribado y se analizaron utilizando ELISA de fagos en que la unión a diana y anti-gD se comparó con la unión de una proteína no relevante (BSA) para comprobar la unión no específica. Los clones que se unieron al anticuerpo anti-gD y diana, pero no a la proteína no específica, se consideraron específicos positivos. Las bibliotecas L1/L3, L1/L4, L1/L2/L3-A, L1/L2/L3-B y L1/L2/L3-B2 no produjeron ningún clon positivo, mientras que las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D permitieron el aislamineto de anticuerpos específicos para los antígenos diana.

[0104] Por ejemplo, los clones aleatorios de la ronda cuatro se analizaron utilizando un ELISA de fagos donde se comparó la unión de los clones amplificados individualmente con la diana y HER2 con la unión de una proteína no diana (BSA) para analizar la especificidad de unión. Para enriquecer los clones de fagos que mantenían la unión a HER2, el fago eluido de la tercera y cuarta rondas de la selección de VEGF y DR5 se amplificaron y sometieron a otra ronda de selección en pocillos recubiertos con HER2. Las regiones de VL y VH de los clones positivos se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron.

[0105] La tasa satisfactoria para hFC, hVEGF y hDR5-1f, fue de 63, 77, y 85% respectivamente. Las regiones VL de los clones positivos se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron tal como se ha descrito (Sidhu et al., 2004). El análisis de las secuencias de ADN de los enlazadores específicos positivos reveló un porcentaje de clones únicos del 51% (hFC), 55% (hVEGF), y 6,1% (hDR5-1f). Las secuencias de los clones de unión únicos hVEGF, hDR5 y hFc se resumen en las figuras 5 y 6, respectivamente.

Selección de placas combinadas y solución de clones de unión a hVEGF

[0106] Se observó la diversidad elevada de los clones de unión a hVEGF después de cuatro rondas de clasificación. A efectos de identificar la afinidad elevada de los clones de unión a hVEGF, se tomó la estrategia de selección basada en una solución después de la clasificación basada en la cuarta placa. Se incubó hVEGF biotinilado 50 nM con el fago propagado desde la cuarta ronda de selección sobre antígeno inmovilizado. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente con agitación, el fago unido a hVEGF se capturó en inmunoplacas recubiertas con neutravidina y bloqueadas seguido de repetidos lavados. Los clones de fagos se eluyeron, se cribaron y se secuenciaron tal como se había descrito. Las secuencias de los clones de unión a hVEGF de la última etapa de selección de solución se encuentran en la figura 7.

Aislamiento de clones biespecíficos de las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D

[0107] La plantilla de biblioteca para las bibliotecas L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D era un fragmento de scFV modificado a partir del anticuerpo hu4D5 que se une a Her2 con afinidad elevada. El mapeo del paratopo funcional de hu4D5-5 para la unión a Her2 mediante mutagénsis de rastreo de alanina de las regiones de CDR mostró que los residuos de cadena pesada contribuyen a la mayoría de la energía libre la unión, mientras que residuos individuales de la cadena ligera contribuyen en un mayor grado. (Kelley y O’Connell, 1993). El análisis de la estructura atómica del Fab del anticuerpo Herceptin® en complejo con Her2-ECD humano demuestra que mientras que la cadena ligera está implicada en producir el contacto con antígeno, la cadena pesada proporciona la mayoría de la interfase estructural con el antígeno (Cho et al., Nature 421:756,2003). Se observó que algunos miembros de las bibliotecas de cadenas ligeras funcionales construidas sobre la plantilla de anticuerpo Herceptin® mantenían la capacidad de unión a Her2. En un intento por aislar fragmentos scFv biespecíficos de las bibliotecas funcionales L1/L2/L3-C y L1/L2/L3+L4-D, capaces de unirse a Her2, así como a un segundo antígeno, se aplicaron dos estrategias. En una estrategia, los clones positivos de la selección de antígeno diana descrita previamente se cribaron mediante ELISA por unos que retenían la unión a Her2. El porcentaje de clones positivos específicos capaces de unirse a Her2 variaban dependiendo de la especificidad del segundo antígeno. Sólo 1 de 61 clones positivos únicos específicos de hFc aún se unían a Her2 (1,6%), 30 de 41 clones únicos de unión a hVEGF se unían aún a Her2 (73%), y 2 de 5 enlazadores únicos de hDR5 aún se unían a Her2 (40%). Además, se realizó una estrategia basada en selección para aislar anticuerpos biespecíficos mediante la selección de enlazadores a Her2 del grupo de anticuerpos de unión a hVEGF y hDR5. La elución de la ronda 4 de la separación de antígenos diana se sometió a una ronda adicional de selección mediante la incubación de 2x1013 fagos/ml en inmunoplacas Maxisorp recubiertas con Her2 (5 g/ml) y bloqueadas con BSA durante 1 hora. Las placas se lavaron 15 veces con PBS, Tween 20 al 0,5% y fago eluido tal como se ha descrito previamente. Los clones aleatorios se seleccionaron un analizaron para Her2, anti-gD y la unión a diana y se compararon con la unión no específica a una proteína no relevante (BSA). Los 192 clones analizados se identificaron como positivos específicos y se secuenciaron tal como se ha descrito previamente. La secuenciación reveló 94 secuencias únicas. En resumen, este método generó 94 clones biespecíficos de Her2/hVEGF de los 94 clones únicos analizados (100%) (Figura 5). Las secuencias de todos los anticuerpos biespecíficos hVEGF/Her2 únicos aislados de ambas estrategias de aislamiento se resumen en la figura 8. Las secuencias de clones aislados que perdieron toda la unión detectable a Her2 se muestran en la figura 9. De los clones que tienen una especificidad dual, casi todos retuvieron la CDR-L3 del anticuerpo Herceptin®, haciendo que probablemente el mantenimiento de la CDR-L3 es importante para mantener la unión a HER2. En el caso de hDR5, 2 de los 7 clones únicos de unión a Her2 eran biespecíficos (29%, 12 clones secuenciados). Las secuencias de estos clones se resumen en la figura 10. Uno de los clones específicos duales tenía algunos cambios homólogos en CDR-L3.

Caracterización de alto rendimiento de clones de unión a hVEGF

[0108] Se utilizó un ELISA competitivo de puntos únicos de alto rendimiento en un formato de 96 pocillos (Sidhu et al., 2004) para cribar clones de afinidad elevada por hVEGF y para estudiar lor perfiles de bloqueo de VEGFR-1. Brevemente, se recubrieron inmunoplacas Maxisorp con 2 g/ml de hVEGF109, durante la noche a 4°C y se bloquearon con BSA al 1% (p/v) durant 1 hora. Se desarrollaron clones fagémidos en E-coli XL1-Blue en 150 l de caldo 2YT complementado con carbenicilina y fago auxiliar M13-K07; los cultivos se desarrollaron con agitación durante la noche a 37°C en un formato de 96 pocillos. Se diluyeron los sobrenadantes de cultivo que contenían fagos cinco veces en PBST (PBS con Tween 20 al 0,05% y BSA al 0,5% (p/v)) con o sin la adición de 100 nM de hVEGF109 para el cribado de afinidad. Para cribados de bloqueo de repcetores, se incubaron pocillos recubiertos con hVEGF con o sin Dominio 1-3 (D1-3) de VEGFR1 y Dominio 2 (D2) de VEGFR1 antes de la adición de sobrenadante de fago diluido cinco veces (Liang et al., 2006; Wiesmann et al., 1997). Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente (RT), las mezclas se transfirieron a las placas recubiertas con hVEGF109 y se incubaron durante 10 minutos. La placa se lavó con PBT (PBS con Tween 20 al 0,05%) y se incubó durante 30 minutos con conjugado de peroxidasa de rábano picante y anticuerpo anti-M13 diluido 5000 veces a 1 nM en PBST. Las placas se lavaron, se revelaron con sustrato TMB durante aproximadamente cinco minutos, se detuvo con H3PO4 1,0 M y se leyeron espectrofotométricamente a 450 nm. En el ensayo de afinidad de puntos únicos, la proporción de la absorbancia en presencia de hVEGF109 en fase solución con la absorbancia en ausencia de hVEGF109 en fase solución se utilizó como indicación de la afinidad. Una proporción baja indicaría que la mayoría de fagos de Fab se unieron a hVEGF109 en fase solución en la etapa de incubación inicial y, por lo tanto, no estaban disponibles para la captura por hVEGF109 inmovilizados. Los resultados del ensayo de afinidad de alto rendimiento de los primeros 41 clonos únicos se resumen en la figura 11. De manera similar, para el ensayo de bloqueo, una proporción baja indicaba que la unión de un clon a hVEGF109 se bloquea por la interacción de hVEGF109 - VEGFR1, indicando que algunos clones presentan un sitio de unión de solapamiento (epítopo) en VEGF con los fragmentos de receptor de VEGF respectivos (figura 12) y estos clones es probable que expresen los anticuerpos de bloqueo.

Caracterización de alto rendimiento de clones de hVEGF/Her2 biespecíficos

[0109] El mismo principio tal como se describe en la sección previa se aplicó para permitir el aislamiento de clones con afinidad elevada por hVEGF y Her2 para la caracterización posterior. Se utilizó un ELISA competitivo de punto único de alto rendimiento para cribar clones de afinidad elevada por hVEGF y Her2 mediante el recubrimiento de inmunoplacas Maxisorp con 2 g/ml de hVEGF109 y ECD de Her2 durante la noche a 4°C, seguido de bloqueo con BSA al 1% (p/v) durante 1 hora. Los clones de fagos que se identificaron como biespecíficos en el cribado con ELISA de punto único anterior se desarrollaron tal como se ha descrito previamente y se incubaron con y sin la adición de ECD de Her2 20 nM y hVEGF 50 nM. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las soluciones se aplicaron a las inmunoplacas recubiertas y se registraron las señales de unión y se analizaron tal como se describe en la sección previa. Los clones con una proporción baja para hVEGF y Her2 se seleccionaron para la caracterización posterior. Los clones de fagos específicos de hVEGF y biespecíficos de hVEGF/Her2 que dieron lugar a proporciones de señales mínimas en el ELISA competitivo de punto único se seleccionaron para la medición de afinidad mediante ELISA competitivo, así como los clones de fagos de unión a DR5 y biespecíficos de DRS/Her2 del cribado de ELISA de punto único inicial y clones de unión a VEGF de la selección de placas combinadas y solución. Los clons de fagos se propagaron desde una colonia única mediante el crecimiento n 25 ml de cultivo 2YT complementado con carbenicilina y fago auxiliar KO7 durante la noche a 30°C. Los fagos purificados mediante precipitaciónen PEG/NaCl se diluyeron primero en serie en PBST y se analizaron por la unión a una placa recubierta de antígeno. La dilución que produjo una señal de saturación de 50-70% se utilizó en el ensayo de unión a solución en que los fagos se incubaron primero con una concentración creciente de antígeno durante una a dos horas y a continuación se transfirieron a placas recubiertas de antígeno durante 10-15 minutos para capturar los fagos no unidos. Se calculó la IC50 como la concentración de antígeno en la fase de unión a solución que inhibía que el 50% de los fagos se uniera al antígeno inmovilizado (Lee et al., 2004a). La figura 13B representa las curvas de las que se calculó la IC50 para los clones de unión a hVEGF analizados a partir de la estrategia de clasificación de placas. Los valores de IC50 variaban de 22 nM a gt;1 mM (Figura 13B). Los valores de IC50 para los enlazadores a hVEGF aislados mediante la selección basada en placa combinada y solución variaba de 41 nM-226 nM (Figura 7). Los valores de IC50 de clones de unión de DR5 variaba de 20 nM a gt;1 M (Figura 14). Los valores de IC50 para clones biespecíficos de hVEGF/Her2 y DRS/Her2 se resumen en la figura 15A y la figura 15B. Los valores de IC50 para clones de unión a Fc no se han determinado.

Ejemplo 3. Caracterización de anticuerpos de la biblioteca de cadena ligera

Conversión de scFvs a Fabs

[0110] Para analizar si la conversión de los 2 scFv expresados en fagos en Fab afectaban en la afinidad de los clones de unión de la biblioteca, se eligieron 2 clones (3-7 anti-hVEGF y 4-1 anti-hDR5) para la conversión en Fab y expresarlos en fagos. La región de VL del ADN fagémido para fragmentos de hVEGF y scFv de DR5 seleccionados se digirieron con enzimas de restricción, que separaron el ADN en dirección 5’ de la región que codificaba la CDR-L1 (EcoRV) y en dirección 3’ de la región que codificaba CDR-L3 (KpnI). El fragmento de ADN digerido se ligó en un vector digerido de manera similar (pAP2009) diseñado para la expresión en fagos de Fab hu4D5 mediante la fusión al dominio C-terminal de la proteína de recubrimiento menor 3 del gen M13 (Lee et al., 2004b). El fagémido bicistrónico resultante contiene la cadena ligera fusionada a un epítopo etiqueta (gD) en el extremo C-terminal y la cadena pesada (VH y CH1) fusionada al gen para la proteína de recubrimiento menor de M13 (p3) en C-terminal bajo el control del promotor de fosfatasa alcalina. El primer marco de lectura abierto codificaba un polipéptido que consistía en la señal de secreción stII seguido de la cadena ligera de Fab4D5, con las CDR sustituidas por las de 2 scFv de 3-7 anti-hVEGF y 4-1 anti-hDR5, seguido de un epítopo etiqueta gD. El segundo marco de lectura abierto codificaba un polipéptido de fusión que consistía en lo siguiente: la señal de secreción stII, la cadena pesada de Fab4D5, un codón de parada de ámbar (TAG), una secuencia enlazadora de Gly/Ser y el dominio C-terminal de proteína g3 (cP3). La expresión en E. coli XL-1 Blue coinfectada con M13-KO7 daba lugar a la producción de bacteriófago M13 que expresa las versiones de Fab de 2scFv de 3-7 y 4-1. Se utilizaron ELISA de fago competitivo para estimar las afinidades de los scFv y Fab expresados en fagos para hVEGF y hDR5 como valores de IC50. Los datos de los dos formatos diferentes concordaban (datos no mostrados).

[0111] Para permitir la expresión de Fab de bH1 en la superficie del bacteriófago M13, se modificó el plásmido pAP2009 para codificar el Fab de bH1. Se utilizaron versiones del Fab de bH1 como plantillas de biblioteca que contenían codones de parada (TAA) en las tres CDR de LC o las tres CDR de HC para la biblioteca de LC y HC, respectivamente. Se construyeron bibliotecas separadas de cribado de alanina y homólogo de cadena pesada y cadena ligera tal como se ha descrito previamente (Vajdos et al., J. Mol. Biol. 320:415, 2002). La degeneración variaba de 1x105 a 1x108 y el tamaño de biblioteca real variaba de 6x109 a 4x1010. Las bibliotecas se construyeron tal como se ha descrito anteriormente. Se realizaron de dos a tres rondas de selección en dianas inmovilizadas (VEGF, ECD de HER2, proteína L, o mIgG anti-gD) (Vajdos et al., J. Mol. Biol. 320:415, 2002). Los clones de unión a diana se cribaron mediante ELISA de fago para la unión a diana seguido de la secuenciación de ADN y el alineamiento de secuencia para calcular las proporciones de tipo natural/mutación a cada posición. Las proporciones del análisis de secuencias de aproximadamente 100 secuencias únicas de clones de unión a VEGF y HER2 se corrigieron para la expresión y el efecto de plegado de proteínas mediante la división con las proporciones calculadas de las secuencias de más de 100 clones de unión anti-gD para producir los valores Fwt/mut. Como solo la cadena pesada de Fab se fusiona a la cubierta de fago, la expresión en fago de la etiqueta gD, que está fusionada a la cadena ligera, es indicativa del plegamiento adecuado y la asociación de cadena ligera y cadena pesada. Sistemáticamente, la unión de proteína L a un epítopo no lineal en la cadena ligera del Fab también dio lugar a proporciones similares de tipo natural/mutación como selecciones de etiqueta de gD. Los valores de Fwt/mut se convirtieron en ΔΔG utilizando la fórmula ΔΔG=Roln (Ka,wt/Ka,mut)=RTln(Fwt/mut) tal como se describe en Vajdos et al.

(J. Mol. Biol. 320:415, 2002).

Expresión de enlazadores de bibliotecas como Fab e IgG humanos libres

[0112] Para determinar de manera precisa la afinidad, especificidad y otras propiedades de los anticuerpos, se seleccionaron clones representativos de cada grupo de especificidad que mostraban la mayor afinidad en los experimentos de ELISA de competición por la expresión como Fab y hIgG libres (figura 16). El dominio variable de cadena ligera y cadena pesada se clonó en un vector diseñado previamente para la expresión de Fab en E. Coli o la expresión de IgG humana transitoria en células de mamífero (Lee et al., 2004a). La proteína Fab se generó mediante el crecimiento de las células de E. Coli 34B8 transformadas en medio C.R.A.P. completo a 30°C durante 26 horas tal como se ha descrito (Presta et al., 1997). Las hIgG se expresaron mediante transfección transitoria de células 293 y la hIgG se purificó con cromatografía de afinidad de proteína A. Las columnas se lavaron con PBS y se eluyó la proteína Fab con ácido acético 100 mM y se dializó frente a PBS. Se purificaron los 4 litros de cultivos de E. Coli en una columna de afinidad de proteína A, seguido de una cromatografía de intercambio catiónico tal como se ha descrito previamente (Muller et al., 1998). Las concentraciones de proteínas se determinaron espectrofotométricamente. El rendimiento final para Fab fue habitualmente de 0,8-15 mg/l purificado a partir del crecimiento a pequeña escala en un matraz de agitación.El rendimiento de la producción de IgG fue de medio a alto a 6,7-60 mg/l en un cultivo a pequeña escala (figura 17). Las proteínas purificadas se caracterizaron primero utilizando cromatografía de exclusión de tamaño y dispersión de la luz para asegurar que las proteínas no mostraban niveles significativos de agregación de proteínas (lt;5%).

[0113] Brevemente, los Fab y hIgG expresados se cribado mediante ELISA para la unión a sus respectivos antígenos. Se encontró que todas excepto una variante se unían a sus antígenos afines. El clon 4-6 perdió la capacidad de unión a hDR5 cuando se convirtió en Fab y hIgG. Se analizaron los clones anti-VEGF seleccionados, desarrollados contra la forma más corta hVEGF109, por la unión a hVEGF165 utilizando un ELISA estándar (H3, H4_N, H4_D hIgG), y ELISA competitivo (bH1, 3-1, 3-6, 3-7 hIgG). La hIgG G6 (Fuh et al., 2006) se utilizó como un control positivo (Figura 18). Como se esperaba, todos los clones se unieron a hVEGF165.

[0114] Para estudiar el grado de agregación de proteínas, se analizaron clones seleccionados mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) seguido de un análisis por disepersión de luz (LS) como Fab e IgG purificadas. Las muestras se analizaron en PBS a una concentración de 0,5 mg/ml (hIgG) y 1 mg/ml (Fab). Se observó un máximo de agregación del 5% para todas las muestras a la concentración determinada (figura 17), que está en el intervalo de lo que se ha observado previamente para otros anticuerpos derivados que se expresan en fagos. Los clones 3-6 y 3-7 no salieron en el punto de tiempo esperado, lo que sugería que estos IgG y Fab reformateados mostraban una agregación y una interacción no específica con la resina (datos no mostrados). Estos clones se sacaron del grupo de clones que experimentaron un análisis posterior.

[0115] Para descartar la reactividad cruzada y la unión no específica, se estudió la unión de hIgG seleccionada a concentración elevada (100 nM) a un panel de dianas proteicas inmovilizadas que incluyen los lisados de células completas, los antígenos afines y homólogos en un ensayo ELISA estándar. Además del antígeno, se inmovilizó una versión murina de hVEGF para analizar la reactividad cruzada de especies de los clones anti-hVEGF. En particular, se inmovilizó el panel de proteínas en placas Maxisorp y se bloquearon con BSA al 1% en PBS durante 1 hora. Las hIgG (o Fab) se diluyeron en PBST hasta una concentración de 100 o 500 nM y se transfirieron a las placas recubiertas. Después de 1 hora de incubación, las placas se lavaron e incubaron con proteína a conjugada a HRP. Las señales de unión se desarrollaron mediante la adición de sustrato de TMB durante aproximadamente 5 minutos, se detuvo con H3PO4 1 mM y se leyó espectrofotométricamente a A450. Las hIgG analizadas se unieron específicamente a sus antígenos. Los clones bH1 y 3-1 mostraron reactividad cruzada a VEGF murino (mVEGF) (figura 19).

[0116] Para analizar si los anticuerpos biespecíficos bH1, H3 (anti-hVEGF/Her2), y D1 (anti-hDR5/Her2) se podían unir simultáneamente a sus antígenos afines o si los antígenos competían por la unión a anticuerpo, se inmovilizaron hVEGF y hDR5 a una concentración de 2 g/ml. Se incubó una concentración fija de hIgG con diluciones en serie de ECD de Her2 seguido de la captura de la hIgG en el antígeno inmovilizado. En cada caso, se encontró que la unión a ECD de Her2 era competitiva con la unión a los otros antígenos (figura 20).

[0117] Para determinar de manera precisa la afinidad de IgG y Fab (es decir, Fab e IgG anti-hVEGF y antihVEGF/Her2 aislados de las bibliotecas) y para estudiar los perfiles de unión a tiempo real, se utilizó ensayos de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en una máquina BlAcore™-3000 (BIAcore, Uppsala, Suecia) con chips sensores CM5 de hVEGF, mVEGF, DR5, y ECD de Her2 inmovilizados en unidades de respuesta (RU) de 40-300 dependiendo del analito estudiado. La inmovilización se realizó tal como se ha descrito (Chen et al., 1999). Para minimizar efectos de avidez de los analitos de IgG bivalentes, se marcó una densidad inferior de ligando en el chip sensor en estos casos. Las muestras de concentraciones crecientes que variaban de una concentración de aproximadamente 10 veces por debajo a 10 veces por encima de la KD (en base a experimentos de ELISa de competición) se inyectaron a 22-30 ml/minuto y se corrigieron las respuestas de unión mediante la resta de RU de una celda de flujo de referencia. Además, las respuestas se referenciaron por duplicado para normalizar la deriva del instrumento mediante la resta de RU de la celda de flujo conjugada a ligando inyectada con tampón de muestra (PBS con Tween 20 al 0,05%). Para los análisis cinéticos de los Fab, se utilizó un modelo de unión de Langmuir 1:1 para calcular la kon y koff. Cuando era necesario (a concentraciones elevadas de analito), se aplicó un modelo de unión Langmuir 1:1 con limitación de transferencia de masa. Para los analitos de IgG, se utilizó un modelo de unión de analito bivalente con o sin limitación de transferencia de masa (BIAcore Evaluation Software 3.2). En el caso de H3 hIgG, H4_N Fab, y H4_D hIgG, el ajuste de respuestas a los modelos de unión cinética no era satisfactorio. Por lo tanto, se aplicó un análisis de unión en estado estacionario cuando la respuesta de equilibrio se representó frente a la concentración de analito. Se estimó la KD como la EC50. Un resumen del análisis de unión BIAcore se puede encontrar en la figura 21. Se encontró que la afinidad de los anticuerpos de unión a hVEGF 3-1, 3-6 y 3-7 estaban en el intervalo de nanomolar. Los anticuerpos biespecícos analizados (bH1, H3, H4_N, H4_D) mostraron afinidades de bajo micromoar a micromolar para hVEGF. N cambio, las afinidades para Her2 variaban de 8 a 59 nM (Fab).

[0118] Para determinar si la cadena ligera de enlazadores anti-hVEGF bH1, H3 y H4_N se podía unir a hVEGF independientemente de la secuencia de la cadena pesada asociada, los dominios variables de cadena ligera se injertaron sobre la Fab de 2C4 anti-Her2 mediante la clonación de los dominios variables de cadena ligera en un vector de expresión de Fab de 2C4 pJB0524, sustituyendo de este modo el dominio variable de cadena ligera de 2C4. Los Fab se expresaron tal como se ha descrito previamente. Los Fab quiméricos bH1/2C4 y H3/2C4 no se expresaban a niveles detectables. La proteína de Fab quimérica H4_N/2C4 se aisló y analizó por su unión a hVEGF (especificidad original de bH1) y Her2 (bH1, especificidad original de 2C4). No se detectó la unión a hVEGF y Her2 mediante un ensayo de unión ELISA estándar (figura 22). Los resultados indican que la cadena pesada de bH1 se requiere para la unión a antígeno.

Comparación de epítopos anti-hVEGF

[0119] En un intento por mapear aproximadamente los epítopos de los anticuerpos anti-hVEGF en hVEGF, se estudió la capacidad de estos anticuerpos anti-VEGF recientemente aislados para competir con otros anticuerpos de unión a hVEGF y receptores de VEGF con sitios de unión conocidos (Fuh et al., 2006; Muller et al., 1998; Wiesmann et al., 1997). Los ensayos se realizaron en un formato de ELISA competitivo donde el dominio 1-3 de VEGFR1 (Flt) y los anticuerpos anti-hVEGF Avastin® (IgG), B20-4.1 (IgG), G6 (Fab), y proteína de fusión Fc Dominio 1-7 KDR se inmovilizaron en inmunoplacas Maxisorp a 2 mg/ml. El ensayo de unión por competición de solución utilizó VEGF biotinilado equilibrado con diluciones en serie de proteínas IgG purificadas, y el VEGF-biotina no unido se capturó con Fab o IgG inmovilizado que recubría placas Maxisorb y se detectó con HRP conjugada a estreptavidina (Lee et al., J. Mol. Biol. 340:1073, 2004). Los anticuerpos que bloquean hVEGF de la unión a otros anticuerpos de unión a hVEGF o receptores de hVEGF es probable que compartan epítopos solpantes. Las concentraciones elevadas (mM) del anticuerpo biespecífico de unión a Her2/hVEGF, bH1, permitían el bloquo completo de la unión de hVEGF a sus receptores, VEGF1 y VEGFR2, sugiriendo que el epítopo bH1 se solapa suficientemente con VEGFR1 (figura 23) y VEGFR2 (figura 23). Además, bH1 bloquea la unión de hVEGF a B20-4.1 (Figura 24). H3, H4_N, y H4_D también bloquean la unión de hVEGF a ambos receptores, que señala a epítopos similares a bH1 (figura 23). Los perfiles de bloqueo incompletos son probablemente una consecuencia de su afinidad relativamente baja por hVEGF (figura 21). 3-1, en cambio, no bloquea hVEGF en la unión aVEGFR1, incluso a la concentración más elevada (0,5 mM) (Figura 23). Además, no se pudo detectar el bloqueo de hIgG 3-1 al anticuerpo Avastin® (Figura 25). Sin embargo, hIgG 3-1 bloquean la unión de hVEGF a VEGFR2 (KDR) (figura 23), así como a B20-4.1 (Figura 24). Estos resultados indican que 3-1 tienen un único epítopo en comparación con los otros anticuerpos.

Ejemplo 4. Estudios de estructura-función de anticuerpo bH1 biespecífico anti-hVEGF/Her2

[0120] Para elucidar la naturaleza de la interacción de bH1 con sus dos antígenos, VEGF y HER2, se realizaron estudios estructurales y funcionales. El anticuerpo Herceptin® y bH1 difieren en CDR-L1 (V29NTA32 vs. I29PRSISGY32) y CDRL2 (S50ASF53 vs. W50GSY53). El bH1 anti-VEGF/Her2 se eligió como representativo para la caracterización estructral basada en su naturaleza específica dual y su afinidad relativamente elevada por VEGF y Her2. A efectos de estudiar los epítopos funcionales y estructurales en VEGF y Her2, se cristalizó el Fab de bH! En complejo con VEGF109 y el dominio extracelular de hHer2 y se resolvieron las estructuras de los dos complejos mediante cristalografía de rayos X. Además, se realizarón análisis de rastreo de alanina y de homólogos por

“shotgun” utilizando bibliotecas combinatorias expresadas en fagos tal como se ha descrito (Vajdos et al., 2002).

Expresión, purificación y cristalización de Fab de bH1 y recogida de datos

[0121] La parte de unión a receptor de VEGF humano, que consistía en los residuos 8-109, se expresó, replegó y purificó tal como se ha descrito previamente (Christinger et al., 1996). El residuo 1-624 del dominio extracelular de Her2 se expresó y se purificó tal como se ha descrito previamente (Franklin et al., 2004; Hudziak y Ullrich, 1991).

[0122] Para la preparación de Fab de bH1 a gran escala, se obtuvo un residuo celular completo de una fermentación de E. coli de diez litros. Se descongelaron 220 gramos de pasta celular en 1 L de PBS, EDTa 25 mM, PMSF 1 mM. La mezcla se homogenizó y, a continuación, se pasó dos veces a través de un microfluidizador. A continuación, la suspensión se centrifugó a 12k en alícuotas de 250 ml durante 90 minutos. A continuación, la proteína se cargó sobre una columna de Proteína G (25ml) equilibrada con PBS a 5 ml/minuto. La columna se lavó con tampón de equilibrio y a continuación se eluyó con ácido acéitco al 0,58%. Las fracciones se analizaron mediante SDs PAGE (datos no mostrados). Las fracciones que contenían Fab de bH1 se agruparon y a continuación se cargaron en una columna de Sefarosa SP de Intercambio de Cationes de 50 ml (Pharmacia) equilibrada con MES 20 mM pH 5,5. El Fab se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio en el tampón de equlibrio. El gradiente fue lineal hasta NaCl 0,5 mM, Mes 20 mM pH 5,5. Las fracciones que contenían el Fab se identificaron mediante SD-PAGE (datos no mostrados) y se agruparon. El Fab de bH se eluyó a una concentración de NaCl de aproximadamente 0,5 M. La concentración de Fab se determinó midiendo la A280. El rendimiento final para Fab de bH1 fue de 67 mg/l de crecimiento de fermentador.

[0123] Se obtuvieron complejos mezclando el Fab de bH1 purificado y VEGF o ECD de Her2 en una proporción molar de 2:1 y se purificaron mediante cromatografía por exclusión de tamaño (SP-200, Pharmacia) en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 y cloruro de sodio 0,3 M para el complejo VEGFFab y contr Tris-HCl 25 mM, pH 8 y cloruro de sodio 0,15 M para el complejo ECD de Her2-Fab. La composición de los complejos resultantes se verificó mediante SDS-PAGE (datos no mostrados). El complejo de proteínas se concentró y se utilizó en pruebas de cristalización. Los experimentos iniciales de gota colgante utilizando el método de difusión por vapor a 19°C dieron lugar a cristales pequeños isomorfos de 14 enfermedades diferentes en 1 semana en el caso del complejo bH1-VEGF. Los cristales del complejo bH1-Her2 aparecieron en 4 enfermedades en una semana. Los cristales de una enfermedad se eligieron para una optimización posterior en cada caso.

[0124] Para la cristalización de bH1 Fab-VEGF (8-109), se mezclaron volúmenes iguales de solución de complejo de proteínas (10,6 mg/ml proteína, NaCl 300 mM, Tris-HCl 25 mM pH 7,5) y tampón de cristalización que contenía D,Lácido málico 0,15 M pH 7,0, PEG3350 al 20% y se equilibraron a 19°C. Después de 24 horas aparecieron cristales grandes que pertenecían al grupo espacial C2221 con una dimensiones de celda de a=100,6, b=198,0, c=77,7. Las formas cristalinas contenían 1 monómero de Fab y 1 monómero de VEGF en la unidad asimétrica. Antes de la recogida de datos, los cristales se crioprotegieron mediante la transferencia entre gotas que contenían glicerol al 5%, 10%, y 15% en solución madre artificial, seguido de una congelación súbita en nitrógeno líquido. Los datos serecogieron a 2,9 Å en la línea del haz 5.0.1 de la Advanced Light Source (Berkeley).

[0125] Los cristales de Fab-Her2(1-624) de bH1 se obtuvieron mediante la mezcla de la solución proteica (11 mg/ml, 25 mM Tris pH 8 y cloruro de sodio 150 mM) con tampón de cristalización que contenía PEG2000 al 25% p/v, Mes 0,1 M pH 6,5. Los cristales aparecieron después de 12 horas y pertenecían al grupo espacial P212121 con unas dimensiones de celda de a=62,3, b=115,1, c=208,2. Los cristales contenían un complejo Her2-Fab en la unida dsimétrica. Antes de la recogida de datos, los cristales se congelaron súbitamente en nitrógeno líquido con etilenglicol al 20% como crioprotector. Los datos se recogieron a 2,9 Å en la línea del haz 5.0.1 de la Advanced Light Source (Berkeley).

Procesado de datos, determinación de la estructura y refinamiento

[0126] Los datos se procesaron utilizando Denzo y Scalepack (Otwinowski, 1997). Las estructuras de los complejos de Fab de bH1 fueron resueltas por Phaser (L. C. Storoni, 2004; Read, 2001). El complejo bH1-Fab-VEGF(8-109) se resolvió utilizando las coordenadas de VEGF de un complejo VEGF-Fab (2FJG) descrito previamente y los fragmentos de Fab que contenían los dominios ariables VL/VH o los dominios constantes Ch1/CL del complejo Fab de anticuerpo Herceptin®-Her2. Se utilizaron los fragmentos de Her2 y el dominio variable del Fab del anticuerpo Herceptin® del complejo Her2-Fab 1N8Z como modelos de búsqueda cuando se resolvía la estructura bH1-Her2. El dominio constante del Fab de bH1 no se pudo encontrar utilizando la parte constante del Fab de anticuerpo Herceptin® como modelo de búsqueda (1N8Z) y tuvo que deducirse manualmente guiado por la estructura del complejo Fab del anticuerpo Herceptin®-Her2. La construcción del modelo y el refinamiento se realizaron utilizando los programas Refmac (Collaborative Computational Project, 1994) y Coot (Emsley y Cowtan, 2004), respectivamente. Los parámetros estereoquímicos se analizaron utilizando MolProbity (Lovell et al., Proteins 50:437 (2003)). Las estructuras se refinaron hasta Rvalue=0,22 y Rfree =0,27 para el complejo Fab-VEGF y Rvalue=0,25 y Rfree =0.31 para el complejo Fab-Her2. Se modeló una estructura cristalina de Fab de bH1 en el complejo conVEGF, así como ECD de Her2. Algunos residuos de Fab de bH1 estaban en 4,5, 4,0, y 3,5 Å de los antígenos. Los dos parátopos (el área en el anticuerpo que contacta con el antígeno) para los dos antígenos en el mismo anticuerpo se solapan significativamente y los residuos de la cadena ligera y la cadena pesada están implicados con la unión con ambos antígenos. bH1 se une a un epítopo similar en VEGF como en anticuerpo Avastin® , y el bH1 se une a Her2 en un epítopo esenscialmente idéntico al del anticuerpo Herceptin® .

[0127] Las estructuras cristalinas de Fab de bH1 unida al dominio extracelular (ECD) de HER2 (residuo 1-624) y al dominio de unión a receptor de VEGF (residuo 8-109) se determinaron a resoluciones de 2,9 Å y 2,6 Å, respectivamente (Figura 35A y Tabla 3). La figura 35A muestra la estructura cristalina de Fab/HER2 de bH1 superpuesta con el complejo de anticuerpo Herceptin®/HER2, y la estructura crstalina del complejo Fab de

5 bH1/VEGF.

Tabla 3. Estudios cristalográficos

Complejo Fab de bH1/VEGF

Complejo Fab de bH1/ECD de HER2

Estadísticas de recogida de datos

Grupo espacial

C2221 P212121

Celda unidad (Å)

a=100.6, b=198.0. c-77.7 a=62.3, b-115.1, c-208.2

Línea de luz, longitud de onda

ALS 5.0.1 ALS 5.0.1

Resolución (Å)

50,0-2,6 50,0-2,9

Rsym*

0,090 (0,66) 0,095 (0,66)

Número de observaciones

151689 192951

Reflejos únicos

24705 34149

Completaciones (%)*

99,8 (100) 100(100)

1/ (1)*

16,0 (3,0) 18,5 (2,6)

Estadísticas de refinamiento

Contenido de la unidad asimétrica

½ dímero de VEGF, 1 Fab 1 monómero de ECD de Her2, 1 Fab

Resolución (A)

30,0-2,6 30,0-2,9

Reflejo utilizado

22977 32277

Factor Rb, Rfree

0,19, 0,25 0,22, 0,28

Desviación RMS enlaces (A)

0,011 0,010

Desviación RMS ángulos (º)

1,3 1,3

Estadísticas Ramachandran

Regiones favorecidas (%)

96,5% 89,9%

Regiones permitidas (%)

99,4% 97,9%

Atípicos (%)

0,6% 2,1%

Número de residuos

528 1017

Número de aguas

49 0

Número de azúcares

0 2

Número de ligandos/iones

1 (glicerol) I (MES)

Rsyma=ΣI-lt;Igt; ΣI. lt;Igt; es la intensidad promedio de observaciones relacionadas con la sinmetría de un reflejo único. R Factorb= Σ F0-Fc ΣI F0. Rfree se calcula como R excepto para el 5% de los reflejos excluidos de todos los refinamientos. * Valores en paréntesis indican valores de la capa de resolución más elevada.

10 [0128] En el complejo bH1/HER2, el Fab se une al dominio IV de HER2 de manera similar al anticuerpo Herceptin® (Cho et al., Nature 421:756, 2003); los dos complejos se superponen con una desviación de la media cuadrática(r.m.s.d.) de posición Ch de 2,3 Å. En el complejo VEGF, bH1 reconoce un epítopo que se solapa con los sitios de unión de los receptores de VEGF, VEGFR1 y VEGFR2 ey de otros anticuerpos de VEGF (Wiesmann et al., Cell 91:695, 1997; Muller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:7192, 1997). Sistemáticamente, se observó el bloqueo de

15 bH1 de la unión de VEGF a sus receptores (Figura 35E). Para los datos mostrados en la Figura 35E, se equilibró el VEGF165 humano biotinilado con concentraciones crecientes de IgG (eje X). El hVEGF165 no unido se capturó en la fusión VEGFR2-ECD Fc inmovilizada y se detectó espectrofotométricamente (densidad óptica a 450 nm, eje y).

[0129] Tal como se muestra en la figura 35B, los sitios de unión para VEGF y HER2 en bH1 se solapan de manera

20 amplia. Doce de los catorce residuos que contactan con HER2 también contactan con VEGF. Ambos sitios de unión incluyen residuos de CDR de la HC, así como de la LC. En el complejo de HER2, las CDR de LC y HC constribuyen aproximadamente igual al área de contacto con el antígeno (53% y 47% respectivamente), mientras que en el complejo de VEGF, las CDR de LC constituyen casi el 70% de la superficie oculta (Figura 35F). El sitio de unión a HER2 en el anticuerpo Herceptin® y bH1 son similares y difieren sólo en las regiones CDR-L1 y CDR-L2, en las que

25 la secuencia del anticuerpo Herceptin® no se conserva en bH1 (Figura 35B). En la figura 35B, los residuos en el bH1

o la superficie de Fab del anticuerpo Herceptin® están sombreados según el grado de ocultación por VEGF o HER2 (sombreado oscuro y letras blancas gt;75 % oculto, sombreado intermedio y letras blancas 50-75% oculto, sombreado claro y letras negras 25-49% oculto). Los residuos subrayados difieren entre bH1 y el anticuerpo Herceptin®. La línea de puntos blanca representa la división de la cadena ligera y pesada.

[0130] La conformación de Fab de bH1 en el complejo con HER2 es notablemente smilar al del Fab unido a VEGF

(r.m.s.d. = 0,7Å, Cα). Las CDR de ambas estructuras de Fab de bH1 se superponen bien entre sí y con el Fv delanticuerpo Herceptin® parental y Fv de bH1 (HER2) r.m.s.d.= 0,6Å, el Fv del anticuerpo Herceptin® y Fv de bH1 (VEGF) r.m.s.d.= 1,2Å. La CDR-L1 es una excepción y difiere significativamente en las dos estructuas de complejos;la desviación es de 4,6 Å (Cα de residuos 27-32). La figura 35C muestra que las conformaciones de CDR de Fab de bH1 unido a VEGF son notablemente similares a bH1 unido a HER2 y al anticuerpo Herceptin®, con la excepción de la CDR-L1. La figura 35C es una superposición de los bucles de CDR como tubos de bH1 unido a VEGF (sombreado oscuro), bH1 unido a HER2 (blanco) y el anticuerpo Herceptin® unido a HER2 (sombreado claro). El bucle de CDR-L1 muestra conformaciones significativamente diferentes en las dos estructuras de bH1 (r.m.s.d.Cα=4.6 para residuos 27-32 de bH1) (figura 35D). En el complejo de HER2, la CDR-L1 está mínimamente implicada en la interacción con antígenos y parte del bucle (residuos 28-30b) parece flexible. Para la unión a VEGF, el bucle completo está bien estructurado y contribuye al 26% del área superficial oculto por VEGF.

[0131] Dos residuos en CDR-L1, Ile30c y Tyr32, tienen diferentes conformaciones y juegan diferentes papeles en la unión de bH1 a HER2 o VEGF. En el complejo de HER2, la cadena lateral de Ile30c está oculta en el núcleo hidrófobo formado por los residuos de CDR-L1 y CDR-L3. En el complejo de VEGF, esta cadena lateral forma

contactos hidrófobos con vEGF. El Cα de Tyr32 está en la misma posición en las dos estructuras, pero su cadena

lateral está girada ~130 grados. En el complejo de HER2, Tyr32 se empaqueta contra el receptor, mientras que en el complejo de VEGF, la cadena lateral, junto con Ile29, forman el núcleo hidrófobo y soportan la conformación de CDR-L1 y CDR-L3. La conformación de CDR-L1 se estabiliza adicionalmente mediante enlaces de hidrógeno entre Tyr32 y el residuo del armazón de LC Gly72. El análisis estructural confirma que la Tyr32 es crítica para la unión a VEGF ya que la mutación a alanina o fenilalanina no está tolerada. Contrario a la unión a VEGF, la mutación de Tyr32 a alanina (de vuelta en el residuo del anticuerpo Herceptin®) es preferida para la unión a HER2. La superposición de los dos complejos revela que el VEGF no se combinaría con Tyr32 o CDR-L1 en su estado de unión a HER2 (figura 35D). En la figura 35D, las cadenas laterales de residuos Tyr 32, Ile30c, Ile29 y GLy72 se muestran como barras. Los residuos con factores de temperatura superiores al promedio se muestran en el sombreado más oscuro (residuos 28-30b). El enlace de hidrógeno entre Tyr32 y Gly72 se ilustra mediante una línea de puntos.

[0132] Los resultados anteriores indican que la capacidad de redistribuir CDR-L1 es necesaria para la biespecificidad de bH1. Se ha observado que la flexibilidad conformacional similar de CDR-L1 juega un papel en el reconocimineto de antígenos de anticuerpos naturales (Jimenez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:92, 2003; Mylvaganam et al.,

J. Mol. Biol. 281:301, 1998). Las figuras 35A-35D y la figura 36C se generan a partir de las coordenadas de la estructura cristalina (códigos PDB, X, Y, 1N8Z) utilizando PYMOL (DeLano Scientfic, San Carlos, CA).

Rastreo por “shotgun” de bH1

[0133] Para estudiar los sitios de unión a antígeno de Fab de bH1, se realizó una mutagénesis combinatoria de rastreo por “shotgun” utilizando bibliotecas de Fab expresadas en fagos (Vajdos et al., J. Mol. Biol. 320:415, 2002; Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8950, 2000). Las selecciones de unión en los antígenos (hVEGF y ECD de Her2) para aislar clones funcionales, seguido de la secuenciación de ADN, permitió cálculos de las proporciones de tipo natural/mutante en cada posición variada (Vajdos et al., 2002). A continuación, se utilizaron estas proporciones para determinar la contribución de cada cadena laterla rastreada a la unión a VEGF y Her2. Los resultados permitían mapear el parátopo funcional para la unión de VEGF y Her2.

Diseño de biblioteca de bH1 por “shotgun”

[0134] Los residuos expuestos al disolvente en las CDR se rastrearon utilizando bibliotecas expresadas en fagos en que se permitió variar los residuos de tipo natural como alanina o tipo natural (rastreo de alanina) o como un residuo homólogo o tipo snatural (rastreo de homólogos). La naturaleza del código genético requería incluir algunas otras sustituciones en la biblioteca además de los residuos Wt(natural)/Alanina o Wt/Homólogo (Figura 28). Se construyeron bibliotecas separadas de rastreo de alanina y homólogos de cadena pesada y cadena ligera. Las bibliotecas se describen en la figura 29. La degeneración variaba de 1,3x105 a 1,3x108 y el tamaño real de la biblioteca de 6x109 a 4x1010.

Construcción de bibliotecas de rastreo por “shotgun”

[0135] Tal como se ha indicado anteriormente, para permitir la expresión de Fab de bH1 en la superficie del bacteriófago M13, se modificó un plásmido AP2009 descrito previamente diseñado para expresar hu4D5Fab en un fago fusionado al dominio C-terminal de la proteína de recubrimiento menor 3 del gen M13 para codificar el Fab de bH1 utilizando técnicas de biología molecular estándar. El extremo C-terminal de la cadena ligera contenía un

epítopo etiqueta (gD). Las versiones de la “plantilla de parada” del Fab de bH1 se utilizaron como plantilla de

biblioteca (Sidhu et al., 2004). La biblioteca de rastreo de alanina y homólogos de cadena ligera presentadab codones de parada en CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 y las bibliotecas de alanina y homólogos de cadena pasada

5 contenían codones de parada en cada CDR de cadena pesada. Las bibliotecas se construyeron mediante métodos descritos previamente (Sidhu et al., 2004) utilizando mutagénsis de Kunkel (Kunkel et al., 1987) en las plantillas de parada respectivas.

Selección de bibliotecas

10 [0136] Las imunoplacas Maxisorp de 96 pocillos NUNC se recubrieron con 5 mg/ml de diana de captura (hVEGF109, ECD de Her2 o mIgG antigD) y se bloquearon con BSA al 1% (p/v) en PBS. Los fagos de las bibliotecas descritas anteriormente se propagaron con fago auxiliar KO7 (NEB) tal como se ha descrito (Lee et al., 2004a). Se añadieron soluciones de fago a las placas recubiertas a una concentración de 1013 partículas de fagos/ml y se incubaron

15 durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 8 veces con PBST seguido de elución de fago unido con HCl 0,1 M durante 30 minutos. Se determinó el enriquecimiento después de cada ronda de selección tal como se ha desrito previamente. Después de 2 rondas de selección de diana, se observó un enriquecimiento de 501000 veces para todas las bibliotecas, a excepción de LC-Ala y LC-Hom separadas en hVEGF, que mostraron un enriquecimiento de 5-10 veces. Se seleccionó un conjunto de clones aleatorios de cada biblioteca que mostraban un

20 enriquecimiento de 50-1000 veces para la secuenciación tal como se ha descrito (Sidhu et al., 2004). La biblioteca de LC-Ala se cribó por la unión a hVEGF en ELISA de fago (Sidhu et al., 2000). Se seleccionaron para secuenciación clones que mostraban señales ELISA de hVEGF, como mínimo, dos veces sobre las señales en las placas de control con BSA. La biblioteca de LChom se sometió a 1 ronda adicional de selección en HVEGF seguido del cribado con ELISA de fagos y la secuenciación de clones de unión a VEGF.

Análisis de la secuencia de ADN

[0137] Las secuencias de calidad elevada de cada biblioteca de las diferentes selecciones de diana se tradujeron y alinearon (datos no mostrados). El número de secuencias de cada biblioteca sometidas a análisis se resumen en la

30 tabla 4 siguiente.

Tabla 4: Número de secuencias analizadas

Biblioteca

Secuencias totales

LCA-V2b

51

LCH-V3

79

LCA-H2

97

LCH-H2

50

LCA-gD

112

LCH-gD

120

LCA-pL

60

LCH-pL

65

HCA-V2

100

HCH-V2

96

HCA-H2

81

HCH-H2

96

HCA-gD

105

HCHgD

105

HCA-pI

102

HCHpI

99

35 Las proporciones Wt/Mut se calcularon en cada posición variada (figura 30 y figura 31), permitiendo así el cálculo de los valores Fwt/mut tal como se indican (figura 30 y figura 31) que se corrigen para la expresión mediante la división de las proporciones de la selección de dianas por las de la selección de expresión descrita (Vajdos et al., 2002). Un valor Fwt/mut superior a 1 indica que Wt es preferido en esta posición y Fwt/mut más pequeño de 1 indica que la mutación es preferida. Fwt/mut gt;5 indica su papel importante en la unión a antígeno. La importancia de cada residuo

40 de CDR rastreado se muestra en las figuras 32A-32D. El resultado demuestra que los residuos de la cadena pesada y la cadena ligera contribuyn energéticamente a la unión de ambos antígenos (Her2 y hVEGF). El impacto de residuos de cadena ligera y cadena pesada de bH1 en la unión a Her2 se comparó con la de su anticuerpo parental

hu4D5 (Kelley y O’Connell, 1993) (Figura 33).

[0138] La figura 37A y la figura 37B muestran el rastreo de alanina y homólogos por “shotgun” de Fab de bH1 para la

unión a VEGF y HER2. Los efectos de mutación de alanina (m1) o mutaciones adicionales (m2, m3; debido a las

limitaciones de los codones de alanina por “shotgun”) o a un aminoácido homólogo (m4) se calculan como la

proporción de aparición de tipo natural y mutantes (wt/mut) entre los clones que se unen a VEGF humano (Figura 37A) o HER2 (Figura 37B). En los casos en que sólo aparecía el residuo de tipo natural, las proporciones se muestran como mayores que quot;gt;quot; el recuento de tipo natural. La identidad de las sustituciones de aminoácidos (m1m4) se muestra como subperíndices en los valores F. Cuando el residuo de tipo natural es alanina, se sustituyó por

glicina (m1). El “*” indica la cantida de residuos de bH1 que están ocultos tras la formación de complejo de VEGF o

HER2 (*25-49% de área accesible oculta, **50-75% de área accesible oculta, ***más o igual al 75% de área accesible oculta).

[0139] Los residuos que contribuyen significaitvamente a las interacciones energéticas forman los parátopos funcionales, que constituyen un subgrupo de los sitios de unión estructural. A diferencia del solapamiento amplio entre los sitios de contacto de antígeno, los dos parátopos funcionales muestran un solapamiento limitado (figuras 36A-36C). En particular, en base a la mutagénesis de rastreo por “shotgun”, los valores ΔΔG (eje y, kcal/mol) se representan para cada mutación a alanina (barra negra) o un aminoácido homólogo (barra blanca) para la unión a VEGF (figura 36) o HER2 (figura 36B). El quot;†quot; representa un límite inferior, ya que no se observaron mutaciones en esta posición. El quot;*quot; indica la cantidad del área superficial de residuos de bH1 oculta tras la formación de complejos de VEGf o HER2. (*25-49% oculto, **50-75%, ***gt;75%). La interacción de unión a VEGF está mediada principalmente por las CDR de LC con Tyr32 de CDR-L1 e His91 de CDR-L3 como el punto clave del núcleo (ΔΔGwt/ala gt; 1,5 kcal/mol). La unión a HER2 está contribuida principalmente por CDR d HC. La figura 36C muestra estructuras cristalinas en las que los residuos de bH1 y el anticuerpo Herceptin® están sombreados en la superficie de Fab en base a su importancia funcional (sombreado oscuro y letras blancas, ΔΔG ≥1,5 kcal/mol; sombrado intermedio y letras negras, 1≤ΔΔGlt;1,5 kcal/mol; sombreado claro y letras negras, 0,5lt;ΔΔGlt;1 kcal/mol de mutación de alanina). La línea de puntos negra representa el área de contacto como en la figura 35B. La línea de puntos blanca representa la división de la cadena ligera y la cadena pesada.

[0140] Para la unión de VEGF y HER2, los residuos de parátopos funcionales se distribuyen a través de HC y LC significando la sinergia de las dos cadenas. El Trp95 de CDR-H3 es el residuo común clave para las dos interacciones (ΔΔGwt/alagt;1,5 kcal/mol). Tal como s ha indicado anteriormente, la interacción de unión a VEGF está mediada principalmente por las CDR de LC, mientras que la unión a HER2 está dominada por los CDR de HC. En comparación con el anticuerpo Herceptin®, el bH1 con una afinidad de unión a HER2 más débil (300 veces) mantiene los mismos residuos claves del núcleo para la unión a HER2 (Arg50, Trp95, y Tyr100a), mintras que se redistribuye la importancia de los residuos periféricos (Figura 36C). Globalmente, la mayoría de las cadenas laterales importantes en la cadena pesada que contribuyen a la unión a hu4D5/Her2 son áun importantes para la unión a bH1/Her2 (ΔΔGgt;1,5 kcal/mol). Existen algunos cambios. Los residuos de cadena ligera presentan más dispersidad en las contribuciones – algunos residuos se vuelven menos importantes y algunos más importantes. Globalmente, los sitios funcionales son parte de la interfase estructural de la estructura ristalina de los complejos bH1-VEGF y bH1-Her2.

[0141] Brevemente, la interacción de bH1 con las dos proteínas amplias estructuralmente no relacionadas se caracteriza por la unión de un grupo distinto de residuos de bH1 en la interacción energética con cada antígeno. Aunque la mayor parte de los dos sitios de unión ampliamente solapados para los dos antógenos diferentes muestran una única conformación, la flexibilidad de un bucle de CDR (L1) facilita la acomodación de HER2 y VEGF. El mecanismo es reminiscente de la versatilidad molecular observada en anticuerpos multiespecíficos que se unen a haptenos o péptidos pequeños no relacionados. Estudios previos describen una multiespecificidad mediada por el posicionamiento diferencial de los ligandos pequeños en regiones espacialmente distintas de una conformación única de anticuerpo (Sethi et al., Immunity 24:429, 2006) o por las múltiples conformaciones preexistentes del sitio de unión a antígeno (James et al., Science 299:1362, 2003). La versatilidad de las moléculas de anticuerpo en el reconocimiento de antígenos se destaca además por cómo las mutaciones limitadas de LC pueden ocasionar anticuerpos que se unen a dos antígenos proteicos no relacionados.

Maduración por afinidad de bH1

[0142] En un intento por investigar si la afinidad de unión a VEGF de bH1 se podía incrementar mediante la optimización de la secuencia de cadena ligera antes de disponer de los resultados estructurales y funcionales, se construyó una biblioteca en la que se diversificaron los residuos de CDR en posiciones altamente accesibles al disolvente basadas en la estructura cristalina de h4D542 Fab (Eigenbrot et al., 2001), que se cree que se parecen estrechamente a Fab de bH1. Los residuos marcados se dejaron variar como de residuos de tipo salvaje o como unos pocos residuos homólogos (Figura 29). La biblioteca se construyó tal como se describe en la sección “Construcción de bibliotecas de rastreo por “shotgun””. Se utilizó un método de selección de base solución para seleccionar los enlazadores de VEGF de mayor afinidad tal como se ha descrito. Se realizaron dos rondas de selección basada en solución. Se incrementó la rigurosidad en cada ronda de selección mediante la disminución de la concentración de VEGF biotinilado desde 50 mM en la primera ronda hasta 20 nM en la segunda ronda. Se secunciaron 138 clones de la útlima ronda de selección, Se encontró que la mayoría de los clones eran únicos. Se utilizó un ensayo ELISA de alto rendimiento con VEGF inmovilizado (8-109), anticuerpo anti-gD y ECD de Her2 para identificar clones que se unían a VEGF, ECD de Her2 y mIgG anti-gD, pero no a BSA. Las señales de unión de ELISA de VEGF se normalizaron mediante las señales de ELISA anti-gD para estimar la afinidad relativa de los clones de unión a VEGF. Los clones con proporciones elevadas de VEGF/anti-gD se seleccionaron para una caracterización posterior. La afinidad de los clones seleccionados para VEGF y Her2 se estimó mediante ELISA de competición como Fab expresados en fagos descrito previamente. Las variantes de bH1 muestran una afinidad de unión a VEGF mejorada en comparación con el clon de bH1 parental. De manera destacada, algunos clones mejoraron ligeramente los valores de IC50 para la unión a Her2, aun cuando esa selección basada en afinidad para Her2 no se realizó. Esto demuestra que es posible madurar por afinidad el clon de bH1 para la unión a VEGF sin afectar la capacidad de unión a Her2 de manera significativa. Existen algunos clones de afinidad de VEGF mejorados que mostraron la afinidad de unión a Her2 reducida en comparación con el clon de bH1 parental. Este resultado indica que la cadena ligera contribuye activamente a la capacidad de unión de bH1 a Her2, a pesar del hecho de que la cadena pesada es el principal contribuidor a la energía de unión basada en la estructura del complejo bH1-Her2 y el análisis de rastreo de alanina por “shotgun”. Las secuencias y valores IC50 de los clones cracterizados se resumen en la figura 34. El hallazgo de que la mayoría de secuencias eran únicas sugiere que la secuencia de cadena ligera de estas variantes no está totalmente optimizada para la unión a VEGF y que es posible mejorar adicionalmente por afinidad el clon de bH1 mediante rondas de selección adicionales.

[0143] Tal como se muestra en la figura 41, la mejora significativa en la afinidad de un Fab único para dos antígenos se puede conseguir y en general es aplicable. Por ejemplo, la KD de bH1 para VEGF se incrementó desde 300 a 16 nM y la KD de bH1 para Her2 se incrementó desde 26 a 1,2 nM.

Ejemplo 5. Análisis de la actividad de IgG en ensayos celulares

[0144] Para comprobar si los dos anticuerpos anti-hVEGF de afinidad más elevada, bH1 y 3-1, podían inhibir la proliferación inducida por hVEGF165 de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), se analizaron en un ensayo de proliferación. Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) (Cambrex, East Rutherford, NJ) se desarrollaron y analizaron tal como se ha descrito (Fuh et al., J. Biol. Chem. 273:11197, 1998). Se emplacaron aproximadamente 4000 HUVEC en cada pocillo de la placa de cultivo de células de 96 pocillos y se incubaron en medio de Eagle/F-12 modificado por Dulbecco (1:1) complementado con suero bovino fetal al 1,0% (v/v) (medio de ensayo) durante 18 horas. A continuación, se añadieron a las células medio de ensayo fresco con cantidades fijas de VEGF (concentración final 0,2 nM), que se valoró primero como el nivel de VEGF que puede estimular la síntesis de ADN submaximal, y concentraciones crecientes de anticuerpos anti-VEGF (por ejemplo, bH1). Después de la incubación a 37°C durante 18 horas, las células se pulsaron con 0,5 mCi/pocillo de [3H]Timidina Durante 24 horas y se recogieron para el recuento con el contador de Centelleo de Microplacas TopCount. Los resultados demuestran que tanto 3-1 como bH1 pueden inhibir el crecimiento inducido por VEGF de células HUVEC mediante la prevención de la señalización inducida por hVEGF y la posterior proliferación. El anticuerpo Avastin® (anti-VEGF) se utilizó como control positico y el anticuerpo Herceptin® como control negativo (Figura 26).

[0145] Para estudiar la unión de anticuerpos biespecíficos anti-Her2/VEGF a Her2 expresados en células de mamífero, se estudió la unión de los anticuerpos bH1 y H3 a las células de fibroblastos NR6 que sobreexpresan Her2 mediante Citometría de flujo. Se incubaron un millón de células NR6-Her2 con 100 mg/ml Fab e IgG durante 1 hora, seguido de la incubación con un anticuerpos IgG anti-humano murino conjugado a Alexa488 durante 1 hora. Como controles negativos, se estudió la unión de Fab e IgG a las células de NR6 no exprsantes. Tal como se demuestra en la figura 27, bH1 y H3 se unen específicamente a Her2 en células NR6 como Fab y como IgG.

[0146] La figura 42 muestra los resultados de experimentos de unión competitiva para bH1 a VEGF o HER2. El bH1 inhibía la proliferación inducida por VEGF de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con una IC50 de 200 nM, que es consistente con su afinidad de 300 nM, y la proliferación de la línea celular de cáncer de mama BT474 que expresa HER2 después de 5 días de incubación, sin embargo con una menor eficacia que el anticuerpo Herceptin® debido a su afinidad reducida (figura 43A y figura 43B) El anticuerpo IgG Herceptin® y bevacizumab (anti-VEGF) sirvieron como controles. En particular, las células de cáncer de mama BT474 se cultivaron en medio RPMI complementado con FBS al 10%. Para los ensayos, se emplacaron 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante toda la noche (18 horas) a 37°C. Se añadieron concentraciones crecientes de anticuerpo a las células. A continuación, las células se incubaron a 37°C durante cinco días, seguido de la adición de AlamarBlue al 10% (Biosource International, Camarillo, CA) según las instrucciones del fabricante. La inhibición dependiente de anticuerpo de la proliferación de las células que expresan HER2 se determinó midiendo la señal fluorescente.

[0147] Los resultados anteriores indican el potencial del bH1 bifuncional, o sus variantes mejoradas por afinidad, para inhibir dos mecanismos que son importantes para el crecimiento tumoral in vivo.

Referencias citadas:

[0148] Chen, Y., C. Wiesmann, G. Fuh, B. Li, H. W. Christinger, P. McKay, A. M. de Vos, and H. B. Lowman, 1999, Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen: J Mol Biol, v. 293, p. 865-81. Cho, H. S., K. Mason, K. X. Ramyar, A. M. Stanley, S. B. Gabelli, D. W. Denney, Jr., and D. J. Leahy, 2003, Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab: Nature, v. 421, p. 756-60. Christinger, H. W., Y. A. Muller, L. T. Berleau,-B. A. Keyt, B. C. Cunningham, N. Ferrara, and A. M. de Vos, 1996, Crystallization of the receptor binding domain of vascular endothelial growth factor: Proteins, v. 26, p. 353-7. Collaborative Computational Project, N., 1994: Acta Crystallogr. Section D. ’Biol.. Crystallogr., v. 50, p. 760-763. Emsley, P., and K. Cowtan, 2004, Coot: model-building tools for molecular graphics: Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, v. 60, p. 2126-32. Fellouse, F. A., B. Li, D. M. Compaan, A. A. Peden, S. G. Hymowitz, and S. S. Sidhu, 2005, Molecular recognition by a binary code: J Mol Biol, v. 348, p. 1153-62. Franklin, M. C., K. D. Carey, F. F. Vajdos, D. J. Leahy, A. M. de Vos, and M. X. Sliwkowski, 2004, Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2-pertuzumab complex: Cancer Cell, v. 5, p. 317-28. Fuh, G., B. Li, C. Crowley, B. Cunningham, and J. A. Wells, 1998, Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor: J Biol Chem, v. 273, p. 11197-204. Fuh, G., P. Wu, W. C. Liang, M. Ultsch, C. V. Lee, B. Moffat, and C. Wiesmann, 2006, Structure-function studies of two synthetic anti-vascular endothelial growth factor Fabs and comparison with the Avastin Fab: J Biol Chem, v. 281,

p.

6625-31. Hudziak, R. M., and A. Ullrich, 1991, Cell transformation potential of a HER2 transmembrane domain deletion mutant retained in the endoplasmic reticulum: J Biol Chem, v. 266, p. 24109-15. Kelley, R. F., and M. P. O’Connell, 1993, Thermodynamic analysis of an antibody functional epitope: Biochemistry, v. 32, p. 6828-35. Kunkel, T. A., J. D. Roberts, and R. A. Zakour, 1987, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection: Methods Enzymol, v. 154, p. 367-82.

L.

C. Storoni, A. J. M. a. R. J. R., 2004, Likelihood-enhanced fast rotation functions.: Acta Cryst., p. 432-438. Lasky, L. A., and D. J. Dowbenko, 1984, DNA sequence analysis of the type-common glycoprotein-D genes of herpes simplex virus types 1 and 2: DNA, v. 3, p. 23-9. Lee, C. V., W. C. Liang, M. S. Dennis, C. Eigenbrot, S. S. Sidhu, and G. Fuh, 2004a, High-affinity human antibodies from phage-displayed synthetic Fab libraries with a single framework scaffold: J Mol Biol, v. 340, p. 1073-93. Lee, C. V., S. S. Sidhu, and G. Fuh, 2004b, Bivalent antibody phage display mimics natural immunoglobulin: J Immunol Methods, v. 284, p. 119-32. Liang, W. C., X. Wu, F. V. Peale, C. V. Lee, Y. G. Meng, J. Gutierrez, L. Fu, A. K. Malik, H. P. Gerber, N. Ferrara, and G. Fuh, 2006, Cross-species vascular endothelial growth factor (VEGF)-blocking antibodies completely inhibit the growth of human tumor xenografts and measure the contribution of stromal VEGF: J Biol Chem, v. 281, p. 951-61. Lowman, H. B., S. H. Bass, N. Simpson, and J. A. Wells, 1991, Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display: Biochemistry, v. 30, p. 10832-8. Muller, Y. A., Y. Chen, H. W. Christinger, B. Li, B. C. Cunningham, H. B. Lowman, and A. M. de Vos, 1998, VEGF and the Fab fragment of a humanized neutralizing antibody: crystal structure of the complex at 2.4 A resolution and mutational analysis of the interface: Structure, v. 6, p. 1153-67. Otwinowski, Z., and Minor, W. , 1997, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.: Methods Enzymol., v. 276, p. 307-326. Presta, L. G., H. Chen, S. J. O’Connor, V. Chisholm, Y. G. Meng, L. Krummen, M. Winkler, and N. Ferrara, 1997, Humanization of an anti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of solid tumors and other disorders: Cancer Res, v. 57, p. 4593-9. Read, R. J., 2001, Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood.: Acta Cryst., v. D57,

p.

1373-1382.

Sidhu, S. S., B. Li, Y. Chen, F. A. Fellouse, C. Eigenbrot, and G. Fuh, 2004, Phage-displayed antibody libraries of synthetic heavy chain complementarity determining regions: J Mol Biol, v. 338, p. 299-310. Sidhu, S. S., H. B. Lowman, B. C. Cunningham, and J. A. Wells, 2000, Phage display for selection of novel binding peptides: Methods Enzymol, v. 328, p. 333-63.

5 Vajdos, F. F., C. W. Adams, T. N. Breece, L. G. Presta, A. M. de Vos, and S. S. Sidhu, 2002, Comprehensive functional maps of the antigen-binding site of an anti-ErbB2 antibody obtained with shotgun scanning mutagenesis: J Mol Biol, v. 320, p. 415-28. Wiesmann, C., G. Fuh, H. W. Christinger, C. Eigenbrot, J. A. Wells, and A. M. de Vos, 1997, Crystal structure at 1.7 A resolution of VEGF in complex with domain 2 of the Flt-1 receptor: Cell, v. 91, p. 695-704.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL), en el que la pareja de VH y VL juntos forman un sitio de unión a antígeno único capaz de unirse a un primer epítopo y un segundo epítopo, comprendiendo el método las etapas de:

   (1) diversificar la secuencia de aminoácidos de la VL, en el que antes de la diversificación, el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse sólo al primer epítopo, y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado en el que el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse al primer epítopo y al seguno epítopo.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de VL se diversifica mediante la alteración de la secuencia de ácido nucleico que codifica el VL y que expresa el VL diversificado.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1, en el que una pluralidad de posiciones de residuos de aminoácidos predeterminados están marcados para la diversificación.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que los residuos se diversifican en base a la diversidad de una pluralidad de secuencias de aminoácidos de cadena ligera naturales o en base a la accesibilidad al disolvente.

5. 5.

   Método según la reivindicación 1, en el que las posiciones diversificadas de residuos de VL se seleccionan del grupo que consiste en: (1) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-e y 93(a)-(b) de la secuencia de aminoácidos de VL; (2) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-f de la secuencia de aminoácidos de VL;

   (3) posiciones 28-32, 50-53, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b de la secuencia de aminoácidos de VL; (4) posiciones 28, 30-32, 50-53, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b de la secuencia de aminoácidos de VL; (5) posiciones 28-32, 50-53, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL; (6) posiciones 28-32, 50-53, 92-93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-b de la secuencia de aminoácidos de VL; (7) posiciones 2832, 50-53, 91-93, 94 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b de la secuencia de aminoácidos de VL; y (8) posiciones 29-32, 50-53, 66-67, 69-70, 92-93, 94 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posiciones 30a-f de la secuencia de aminoácidos de VL.

6. 6.

   Método según la reivindicación 1, en el que las posiciones de residuos de VL diversificadas se selecionan del grupo que consiste en: posiciones 28, 29, 30, 31, 32, 50, 51, 53, 91, 92, 93 and 94 de la secuencia de aminoácidos de VL.

7. 7.

   Método según la reivindicación 1, en el que los residuos de VL se diversifican según cualquiera de los diseños de biblioteca mostrados en la figura 1.

8. 8.

   Método según la reivindicación 1, en el que el VL diversificado se expresa en fagos con el VH durante la etapa de selección.

9. 9.

   Método según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo antes de la diversificación comprende:

   (i)

   una CDR-H1 que comprende IKDTYI (SEQ ID NO:1), una CDR-H2 que comprende ARIYPTNGYTRY (SEQ ID NO:2), y una CDR-H3 que comprende RWGGDGFY (SEQ ID NO:3), y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSTAV (SEQ ID NO:4), CDR-L2 que comprende SASF (SEQ ID NO:5) y una CDR-L3 que comprende HYTTPP (SEQ ID NO:6);

   (ii)

   una CDR-H1 que comprende FTDYTM (SEQ ID NO: 7), una CDR-H2 que comprende ADVNPNSGGSIY (SEQ ID NO:8), y una CDR-H3 que comprende RNLGPSF (SEQ ID NO:9), y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSIGV (SEQ ID NO: 10), CDR-L2 que comprende SASY (SEQ ID NO:11) y una CDR-L3 que comprende YYIYPY (SEQ ID NO: 12); o

   (iii) una CDR-H1 que comprende ISDSGI (SEQ ID NO: 13), una CDR-H2 que comprende AAIAPGAGSTYY (SEQ ID NO: 14), y una CDR-H3 que comprende RFVSAPPS (SEQ ID NO: 15), y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSTAV (SEQ ID NO: 16), CDR-L2 que comprende SASF (SEQ ID NO: 17) y una CDR-L3 que comprende YSTVPW (SEQ ID NO: 18).

10. 10.

    Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de selección para la unión al primer epítopo o la selección para la unión al segundo epítopo tiene lugar en presencia de VL y VH diversificados.

11. 11.

    Método según la reivindicación 1, en el que

    (i)

    los VL y VH diversificados se pueden unir al primer epítopo y al segundo epítopo simultáneamente, o

    (ii)

    los VL y VH diversificados se unen al primer epítopo y al segundo epítopo de forma mutuamente exclusiva.

12. 12. Método según la reivindicación 1, en el que

    (i)

    el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de la misma molécula biológica, o

    (ii)

    el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de una segunda molécula biológica.

13. 13.

    Método según la reivindicación 12(ii), en el que la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica se seleccionan del grupo que consiste en VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DRS, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF- A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, TNFalfa/TGF-beta, TNFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-1, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNF alfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNF alfa/IL-20, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, receptor VEGFRIMET, HER2/Fc, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFalfa/ICAM-1, TNFRIAL-IR, TNFR1/IL-6R, y TNFR1/IL-18R.

14. 14.

    Método según la revindicación 13, en el que dicha primera molécula biológica y segunda molécula biológica son:

    (i)

    VEGF/HER2;

    (ii)

    HER2/DR5; o

    (iii) HER2/Fc.

15. 15.

    Método según la reivindicación 12(ii), en el que una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la semivida del anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo.

16. 16.

    Método según la reivindicación 15, en el que la segunda molécula biológica es albúmina de suero o un receptor de Fc neonatal (FcRn).

17. 17.

    Método según la reivindicación 12(ii), en el que la segunda molécula biológica es una molécula que puede incrementar la función efectora de un anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo.

18. 18.

    Método según la reivindicación 17, en el que la segunda molécula biológica se une a una proteína de la superficie celular en células asesinas naturales o macrófagos, y en el que, opcionalmente, dicha proteína de la superficie celular en un receptor de Fc o C1q.

19. 19.

    Método según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo

    o al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-6 M.

20. 20.

    Método según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo o al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-9 M.

21. 21.

    Método según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo y al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-6 M.