KR102426802B1 - 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료 또는 안질환 치료의 수단으로써 혈관내피성장인자 및 태반성장인자에 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질을 포함하는 약학조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 융합단백질을 포함하는 약제학적 제형에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)은 (a) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; (b) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; 및 (c) 인간 IgG의 Fc 부위를 포함하는 폴리펩티드로서, VEGF 및 PlGF에 대해 높은 결합친화도를 갖는다. 또한, 본 발명의 재조합 융합단백질은 혈관내피세포의 이동 및 침윤억제효과가 우수하며, 다양한 암종 및 섬유아세포에 대해 현저히 우수한 증식억제효과를 갖는다. 따라서, 혈관신생에 의해 유발되는 암질환 및 안과질환의 치료제로써 유용하게 사용할 수 있다.

Description

혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 {A pharmaceutical composition comprising VEGFR fusion protein for preventing and treating angiogenesis related disease}
본 발명은 신생혈관형성 관련 질환의 예방, 치료 및/또는 억제를 위한 약물의 제조에 이용될 수 있는, 혈관내피성장인자 수용체 재조합 융합단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린유사 도메인의 Fc 부위에 VEGFR 세포외 도메인이 융합된 다가의 이중표적항체이다.
혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor, 이하 VEGF)는 신호전달단백질의 일종이며, 순환계형성 (vasculogenesis) 및 혈관신생 (angiogenesis)에 중요한 역할을 한다. VEGF는 혈액순환이 부적절할 경우 조직에 산소를 저장 및 공급하는 시스템의 일부로서 기능하는데, VEGF의 일반적인 기능은 배아발달, 부상 또는 운동 후의 근육, 경색된 혈관을 우회하는 혈관의 형성 등의 과정에서 새로운 혈관을 생성하는 것이다. 그러나 증가된 양의 VEGF는 비정상적인 혈관신생을 야기할 수 있다. 특히 혈관신생 또는 신생혈관형성은 종양발생에도 관련되어, 원발성 또는 전이성 종양의 발생에 수반되고, 혈관신생에 의해 원발성 암의 암세포가 혈관 내로 유입되면 암전이가 일어난다. 혈관신생은 천식, 호흡곤란, 자궁내막증; 죽상동맥경화증 및 조직부종과 같은 급성 및 만성 염증; 간염 및 카포시 육종과 같은 감염원의 질환; 당뇨병, 건선, 류마티스 관절염 및 갑상선염과 같은 자가면역질환; 및 당뇨병성망막증, 맥락막혈관신생증 (choroidal neovasularization, CNV), 노인성황반변성 (age-related macular degeneration, AMD) 및 혈관섬유종과 같은 질환 (Carmeliet, P. y Jain, RK. 2000. Nature 407: 249-257; Kuwano M, et al.2001. Intern Med 40: 565-572)을 유발하는 것으로 알려져 있다.
혈관신생에서 중요한 역할을 하는 VEGF는 주로 혈관내피를 구성하는 세포에 영향을 미친다. 시험관 내 (in vitro) 결과에 따르면, VEGF는 혈관내피세포의 분열 및 유주를 자극하고 미세혈관 투과성을 높인다. VEGF는 포유류에서 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 및 PLGF (PlGF, PGF, placenta growth factor)의 5종류로 분류된다. VEGF-A는 혈관신생, 혈관내피세포의 유주, 분열, 혈관내강 형성, 대식세포 및 과립세포 (granulocyte)의 주화성, 혈관확장 등을 촉진하고, VEGF-B는 배아의 혈관신생, 특히 심근조직의 형성을 촉진한다. VEGF-C는 림프관형성 (Lymphangiogenesis)을 촉진하며, VEGF-D는 폐 세기관지를 둘러싼 림프관의 발달에 필요하다. PlGF는 순환계형성 (Vasculogenesis), 허혈 (ischemia), 염증, 상처회복, 암에서의 혈관신생에 중요한 역할을 한다.
VEGF 수용체 (VEGF receptor, VEGFR)는 상기 VEGF를 리간드로 하는 수용체로서, VEGFR1 (flt-1), VEGFR2 (Kdr/flk-1) 및 VEGFR3 (flt-4) 등 3개 아형이 있고, 이들은 유전자의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 세포막 수용체 (membrane-bound VEGFR, mbVEGFR) 또는 수용성 수용체 (soluble VEGFR, sVEGFR) 형태로 존재한다. VEGF 수용체는 혈관내피세포에 일반적으로 존재하지만 신경세포, 카포시육종 (Kaposi's sarcoma) 및 조혈모세포 등에서 발현된다. VEGF가 VEGF 수용체에 결합되면 수용체 타이로신 (tyrosine) 잔기의 인산화와 함께 수용체 이중화 (dimerization) 작용으로 신호가 전달된다.
VEGF는 이의 수용체인 VEGFR1 및 VEGFR2에 대해 높은 친화도로 결합하고, 주로 VEGFR2을 통해 신호를 전달하여, 혈관내피세포의 증식과 이동 등 혈관신생과 관련된 기작을 유도한다. 따라서, VEGF 및 VEGFR2은 VEGF에 의해 유도되는 혈관신생 기작을 억제하기 위한 표적이 되어왔다 (Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al., Clin. Cancer Res., 13:5544s, 2007). 종래 개발된 융합단백질 계열의 anti-VEGF로서 이중표적항체 (bi-specific antibody) 또는 다중표적항체 (multi-specific antibody)는, i) VEGFR1 도메인2, VEGFR2 도메인3, 도메인4 및 IgG1 Fc로 구성된 콘베르셉트 (Conbercept), ii) VEGFR1 도메인2, VEGFR2 도메인3 및 IgG1 Fc로 구성된 VEGF-Trap (Aflibercept), 및 iii) VEGFR1 도메인2, 도메인3 및 IgG1 Fc로 구성된 VEGF-Grab 등이 있다.
본 발명자들은 혈관신생 억제를 통한 항암치료용 및 안과질환치료용 다중표적항체 개발을 위해 부단히 노력한 결과, 놀랍게도 VEGF-A, VEGF-B 및 PLGF에 높은 민감도와 특이도로 결합하고, in vitro 및 in vivo 에서 신생혈관형성 관련 질환에 대해 뛰어난 억제효과를 지닌, 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
Ellis and Hicklin, Nature Rev. Cancer, 8:579, 2008; Youssoufian et al., Clin. Cancer Res., 13:5544s, 2007
이와 같이, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는, 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하고, 혈관신생과 관련된 질환으로서 암질환 및 안질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는, 혈관신생과 관련된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 약제학적 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하고, 혈관신생과 관련된 질환으로서 암질환 및 안질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 제형을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 4가 다중표적항체로서 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제공한다. 본 발명의 융합단백질은 면역글로불린-유사 도메인의 재조합 융합단백질로서, (a) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인 및 (b) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되며, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합단백질을 엔코딩하는 분리된 핵산분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 재조합 발현벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성한다. 상기 재조합 발현벡터의 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp .), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속 (Staphylococcus sp .)과 같은 원핵세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속 (Aspergillus sp .)과 같은 진균, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속 (Schizosaccharomyces sp .) 및 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵세포일 수 있다. 또한 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 원숭이 신장세포7 (COS7:monkey kidney cells) 세포, NSO세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터난소 (CHO:chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터신장 (BHK:baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하다.
본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 방법을 포함하며, 숙주세포에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있다. 예를 들어, 엘렉트로포레이션 (electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 융합단백질을 발현시키기 위해 다양한 재조합 발현벡터/숙주세포 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-관련 바이러스 (adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현조절서열이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 세균숙주에 사용할 수 있는 발현벡터는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다 (phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모세포에 유용한 발현벡터는 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충세포에 유용한 벡터는 pVL941이다. 본 발명에서 재조합 발현벡터는 플라스미드, YAC (yeast artificial chromosome), YEp (yeast episomal plasmid), YIp (yeast integrative plasmid), 또는 재조합바이러스일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, (a) 상기 숙주세포를 융합폴리펩티드 생산이 가능한 조건 하에서 성장시키는 단계; 및 (b) 생산된 융합폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 숙주세포는 상기 융합 폴리펩티드를 암호화 하는 염기서열이 발현조절서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 포함한다. 상기 융합폴리펩티드는 상기 (a) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2 (immunoglobulin-like domain 2); (b) VEGFR1의 면역글로불린유사 도메인2; 및 (c) 인간 IgG의 Fc 영역 폴리펩티드를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 핵산분자를 포함하는 재조합 발현벡터를, 원핵 또는 진핵 발현시스템에서 발현시켜 생산될 수 있다. 상기 생산된 융합폴리펩티드는 생물학적으로 안정적인 단백질을 형성하는 일반적인 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 투석 (dialysis), 이온교환 크로마토그래피 (ion-exchange chromatography), 친화크로마토그래피 (affinity chromatography), HPLC (high pressure liquid chromatography), PAGE (polyacrylamide gel electrophoesis) 등의 정제방법이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 제조방법에 의하여 제조된 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 제공한다. 본 발명의 실시예 2 내지 4에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 타겟 리간드인 VEGF-A 및 PlGF에 대해, 선행기술인 애플리버셉트 (Afliberceptⓡ) 및 베바시주맙 (Bevacizumabⓡ)과 비교하여 현저히 우수한 결합력을 갖는다. 또한, 실시예 5에 따르면, 본 발명의 재조합 융합단백질 (KP-VR2)은, 이를 VEGF 관련 질환의 치료가 필요한 피험자에게 투여할 경우, 체내 VEGF와 매우 높은 민감도와 특이도로 결합하여 anti-VEGF 기능을 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예 6에 따르면, 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)은 선행기술인 애플리버셉트와 유사한 약동학적 (pharmacokinetic) 특성을 가지므로 기존에 상용화된 anti-VEGF를 대체하거나 이와 병용할 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 종양치료용 약학적 조성물 및 안구 내 혈관신생과 관련된 안질환치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 실시예 7에 따르면, 본 발명의 융합단백질은 혈관내피세포 (HUVEC) 및 혈관내피유래 세포주 (EA-hy923)의 이동 및 침윤을, 보다 적은 농도에서 보다 더 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 세포이동과 침윤은 혈관내피세포의 혈관형성에 중요한 과정이므로, 이로부터 본 발명의 융합단백질이 암 및 혈관신생관련 안질환을 포함하는 질환에서 혈관신생 억제제로서 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예 8 내지 10은, 본 발명의 융합단백질 (KP-VR2)이 in vitro 및 in vivo 에서 다양한 인간유래 암종과 섬유아세포 및 이들의 누드마우스로의 이종이식편의 성장을 억제하는 효과가 매우 우수함을 제시한다.
일 실시예에서, 본 발명의 융합단백질을 사용하여 치료할 수 있는 종양의 예로서 유피낭종 (epidermoid tumors), 머리 및 목에서와 같은 편평종양 (squamous tumors), 결장직장종양, 전립선, 유방, 폐 (소세포 및 비-소세포 종양 포함), 췌장, 갑상선, 난소 및 간, 카포시 육종, 중추신경계 이상증식 (신경아세포종, 모세혈관 혈관세포아종, 수막종 및 뇌 전이), 흑색종, 신장 암종, 위장관 종양, 횡문근육종, 신경교아세포종 및 평활근육종 등이 제시된다. 본 발명의 다른 일 실시예에서, 상기 “안구 내 혈관신생과 관련된 안질환”은 노인성 황반변성, 삼출성 노인성 황반변성, 맥락막혈관신생, 맥락막혈관병증, 병적 근시, 당뇨성 망막병증, 당뇨성 황반부종, 망막혈관폐쇄, 미숙아망막병증 또는 신생혈관성 녹내장일 수 있다. 또한, 상기 맥락막혈관신생은 근시성 맥락막혈관신생, 외상성 맥락막혈관신생, 포도막염에 의한 맥락막혈관신생, 안 히스토플라즈마증, 또는 특발성 맥락막혈관신생일 수 있다.
이와 관련된 본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 본 발명은 혈관내피성장인자와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 융합단백질로서, (a) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (b) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되며, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된, Fc 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물로서, 상기 Fc 융합단백질 대 VEGFR1 항원이 1:2 이상 결합하는 것인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이러한 범주에 속하는 본 발명의 다른 일시예에서, 신생혈관형성 관련 암질환은 직결장암, 자궁암, 위암, 간암, 흑색종, 폐암, 신장암, 췌장암, 방광암, 림프종 (lymphoma) 및 뇌암을 포함할 수 있으며, 신생혈관형성 관련 안과질환은 포도막 흑생종, 습성 황반변성 (wet age-related macular degeneration, AMD), 당뇨황반부종 (diabetic macular edema), 망막정맥폐쇄 (retinal vein occlusion), 또는 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 약리학적 유효성분으로서 혈관내피성장인자 (VEGF)와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 Fc 융합단백질 1 ~ 100 ㎎/㎖; (b) 용매로서 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v); 및 (c) 완충제 (buffer)로서 인산나트륨 5 ~ 50 mM, 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM, 또는 인산나트륨 5 ~ 50 mM 및 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM를 포함하고, pH가 6.5 ~ 7.5인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 Fc 융합 단백질은 (i) 2개의 중쇄가 이황화결합 (disulfied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (ii) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되고, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합된 것인, 신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 액상 또는 동결건조된 약제학적 제형을 제공한다.
이와 관련된 일 실시예에서, 상기 약제학적 제형은 수크로오스, 소르비톨, 글리세롤, 트리할로오스 및 만니톨로 구성된 군으로부터 하나 이상의 안정화제 1 ~ 10%(w/v); 및 등장화제 (isotonic agent) 10 ~ 150 mM를 더 포함할 수 있다. 이 범주에 속하는 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 25 ㎎/㎖, 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v), 상기 인산나트륨 10 mM, 상기 시트르산나트륨 10 mM 및 상기 수크로오스는 5%(w/v)를 포함할 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다. 또한, 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 25 ㎎/㎖, 및 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v)이 포함되고, 상기 등장제는 염화나트륨으로 40 mM 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 바람직하게는, 상기 Fc 융합단백질 20 ~ 100 ㎎/㎖, 상기 폴리소르베이트 0.03 %(w/v), 상기 인산나트륨 5 mM, 상기 시트르산나트륨 5 mM 및 상기 수크로오스 5%(w/v) 이고, 및 상기 등장제는 염화나트륨으로 40 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 범주에 속하는 또 다른 일 실시예에서, 상기 Fc 융합단백질은 가장 바람직하게는 15 ㎎/㎖ , 25 ㎎/㎖, 40 ㎎/㎖, 60 ㎎/㎖, 80 ㎎/㎖ 및 100 ㎎/㎖로 구성된 군으로부터 선택된 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에서, 상기 약학 조성물 또는 약제학적 제형을 포함하는 시린지가 제공되며, 상기 시린지는 정맥투여 (intravenous, iv), 피하투여 (subcutaneous, sc) 또는 복강 내 투여 (intraperitoneal, ip) 투여를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 치료하고자 하는 질환에 따라 동시에 또는 순차적으로 다른 치료와 분리하여 또는 병행하여 투여할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 유효성분과 상관없는 약학적으로 허용되는 부형제, 완충용액, 안정화제 또는 약학적 담체 또는 본 분야의 숙련자들에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비 독성이며 유효성분의 효능을 방해하지 않으며, 이들의 정밀한 성질은 경구, 점막, 또는 비경구(예를 들어, 정맥 내 주입)인 투여 경로에 따른다. 본 발명의 융합단백질은 투여량 0.001 ~ 5 ㎎/one eye 또는 1 ~ 10 ㎎/㎏으로 투여될 수 있다.
본 발명의 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질은 4가 항체인 면역글로불린-사 도메인의 융합단백질로서, 인간 IgG1 Fc 부위의 각 중쇄에 한쌍의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 융합된 구조를 가지며, VEGF 및 PlGF에 대한 결합친화성이 강하고, 혈관내피세포의 이동 및 침윤억제효과가 우수하며, 다양한 암종 및 섬유아세포에 대하여도 증식억제효과가 뛰어나다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 혈관내피성장인자의 과다발현에 의해 유발되는 암질환 및 혈관신생과 관련된 안질환의 치료제로서 개발 될 수 있다.
도 1은 본 발명의 융합단백질 컨스트럭트를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2a, 2b 및 도 3은 애플리버셉트의 구조 및 본 발명의 KP-VR2 (VEGFR 융합 단백질)을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 융합단백질 KP-VR2를 정제하고 SDS-PAGE 후 웨스턴 블럿을 수행하여 분자의 크기 확인 것이다.
도 5는 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 VEGF-A에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 6은 본 발명의 융합단백질, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 PlGF에 대한 결합친화력을 ELISA 시험으로 비교한 것이다.
도 7은 본 발명의 융합단백질 KP-VR2의 리간드 (VEGFA165, VEGFA121 또는 PlGF)에 대한 최대 결합력을 비교한 것이다.
도 8은 본 발명의 융합단백질과 애플리버셉트의 VEGF-A165에 대한 최대 결합력을 SPR 시험으로 확인한 것이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 융합단백질의 투여경로에 따른 약동력학적 특성을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 융합단백질이 제대유래 혈관내피세포 (HUVEC)의 이동 및 침윤을 억제하는 수준을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 융합단백질이 혈관내피세포주 (EA-hy926)의 이동 및 침윤을 억제하는 정도를 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 12a 및 도 12b는 본 발명의 융합단백질이 9종의 암종에 대해 세포분열을 억제하는 능력을 애플리버셉트와 비교한 것이다.
도 13 및 도 14는 anti-VEGF 내성 암종 및 섬유아세포에 대한 본 발명의 융합단백질의 세포분열 억제능력을 애플리버셉트와 비교하여 나타낸 것이다.
도 15 내지 도 17은 본 발명의 융합단백질 및 애플리버셉트의 누드마우스에 이종이식한 종양 (HT-29, LOVO, 및 SKUT1B)의 성장억제효과를 비교한 것이다.
도 18은 본 발명의 KP-VR2에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 19는 본 발명에서 제조한 KP-VR3에 대한 재조합발현벡터를 나타낸다.
도 20은 ASPC-1 (ATCCⓡ CRL-1682) 또는 MIA PaCa2세포 (ATCCⓡ CRL-1420) 등의 췌장암종들에서 종양 성장억제력을 비교한 결과이다.
도 21은 MKN 45 (KCLB No.80103), NCI-N87(ATCCⓡ CRL-25822™), MKN 28(KCLB No.80101), 또는 SNU 16 (KCLB No. 00016) 위암들에서 종양 성장 저해효과를 확인한 결과이다.
도 22는 HepG2 (ATCCⓡ HB-8065™), SNU423(ATCCⓡ CRL-2238, A549 (ATCCⓡ CCL-185™) 또는 B16F10(ATCCⓡ CRL-6475™) 성장의 저해효과를 확인한 결과이다.
도 23은 Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™) 또는 EL-4 (ATCCⓡ TIB-39) 암종들에 대한 세포분열 억제능력을 확인 한 결과이다.
도 24는 토끼의 안구에 레이저 (laser)를 조사하여 맥락막신생혈관 (choroidal neovascularization, CNV)를 유발하고, 시험물질을 투여한 후 시험물질의 효력을 평가한 결과이다.
도 25는 본 발명의 약제학적 제형을 냉장, 상온 및 40℃ 조건 하에서 보관하는 동안 생성된 불순물을 SE-HPLC로 확인한 결과이다.
도 26은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 냉장 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 27은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 상온 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 28은 본 발명의 약제학적 제형을 7일간 가혹조건에서 보관하는 동안, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 29는 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 냉장보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 30은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 상온에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
도 31은 본 발명의 약제학적 제형을 여러 pH를 갖도록 제조한 후, 7일간 가혹조건하에서 보관하면서, 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석한 결과이다.
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위한 것일 뿐, 이들 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: VEGFR 융합 단백질 KP -VR2의 생산
인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR2 도메인3 (KP-VR1); 인간 IgG1의 Fc 도메인 (서열번호: 2)에 융합된 인간 VEGFR1 도메인2 (KP-VR2) (서열번호: 1); 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR2 도메인 3 (서열번호: 3) 및 VEGFR1 도메인2 (KP-VR3); 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR1 도메인 2 및 VEGFR2 도메인 3 (KP-VR4, Aflibercept)를 각각 pCHO 1.0 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. KP-VR1 내지 KP-VR4 컨스트럭트로 CHO-S세포 (Invitrogen) 를 트랜스펙션하고 (리포펙타민 형질전환방법, Invitrogen사 제공), 트렌스펙션된 세포를 메토트렉세이트 (methotrexate)와 퓨로마이신(Puromycin)로 선별하였다. KP-VR2와 KP-VR4 (VEGF-Trap; Aflibercept; 상품명 Eylea)를 단백질 A-세파로스 친화 크로마토그래피를 통하여 정제하였다. 정제된 단백질을 HPLC 분석으로 정량하고, SDS-PAGE 후 웨스턴블럿 (western blot)을 수행하였다. 각각의 컨스트럭트를 도 1에 나타내었다. 웨스턴블럿의 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 인간 IgG1의 Fc 도메인에 융합된 인간 VEGFR1 도메인2 (KP-VR2)는 125 kDa 정도의 밴드사이즈를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 본 발명의 KP -VR2, 애플리버셉트 ( aflibercept ) 및 베바시주맙 ( bevacizumab )의 VEGF - A에 대한 결합 친화력 측정
VEGF-A 리간드에 대한 KP-VR2, KP-VR4(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 결합 친화도를 비교하였다. “BEVACIZUMAB Summary Validation Report” (February 28, 2014)의 지시에 따라 효소면역법 (ELISA)을 사용하였다. 먼저 96웰 플레이트(Nunc사)를 50 ng/㎖ VEGFA165(I) (R&D systems)로 코팅하고, KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 아바스틴(베바시주맙)을 단계적으로 증가된 양 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖)으로 가하였다. 플레이트를 세척한 후, 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 (peroxidase conj㎍ated) 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine) (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기 (spectrophotometer, Biorad)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
또한, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)의 VEGF-A에 대한 결합량을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2 또는 KP-VR4 애플리버셉트로 코팅하고, VEGF165(II) (R&D systems) 을 단계적으로 증가된 양 (0.03125 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig항체와 함께 반응시켰다.
다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 3: 본 발명의 KP -VR2, 애플리버셉트 또는 베바시주맙의 PlGF에 대한 중화작용 비교
PlGF (placental growth factor)에 대한 본 발명의 KP-VR2, KP-VR4(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 결합 친화도를 알아보기 위하여 효소면역법을 사용하였다. 먼저 96 웰 플레이트 (Nunc)를 50 ng/㎖ PlGF(I)로 코팅하고, KP-VR2 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖), 애플리버셉트 (0.390625 ~ 16,000 ng/㎖) 또는 베바시주맙 (0.0122 ~ 1,000 ng/㎖)을 단계적으로 증가된 양 (0.0122 ng/㎖ ~ 1 uM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후 퍼옥시다아제 컨쥬게이션 된 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 이후 3,3’, 5,5’- 테트라베틸벤지딘 (TMB) 용액(Roche)을 첨가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, KP-VR2 또는 KP-VR4의 PlGF에 대한 결합량을 비교하기 위하여, 96웰 플레이트 (Nunc)를 400 ng/㎖ KP-VR2 또는 KP-VR4로 코팅하고, PlGF을 단계적으로 증가된 양 (0.8 12,500 ng/㎖)으로 첨가하였다. 비오티닐화된-PlGF 항체와 1시간 반응시키고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션 (peroxidase conj㎍ated) 된 항-염소 Ig항체 (R&D systems)와 함께 반응시켰다. 이후 3,3’, 5,5’-테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, PlGF에 대한 KP-VR2 및 애플리버셉트의 결합 친화도를 비교하기 위하여, 96웰 플레이트를 50 ng/㎖ PlGF로 코팅하고, KP-VR2 또는 애플리버셉트와는 단계적으로 증가된 용량의 PlGF (2 ~ 31,250 ng/㎖)를 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-인간 Fc 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3,3’, 5,5’-테트라벤지딘 (TMB) 용액을 가하고, ELISA 리더기로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 PlGF 대한 역가가 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 약 42배까지 증가하였고, KP-VR2의 PlGF와의 최대 결합량은 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 약 200% 증가하였다 (도 6). 이는 KP-VR2이 현저히 높은 PlGF에 대한 결합력을 가지는 것을 제시한다. 한편, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)와 유사한 수준의 PlGF에 대한 결합력을 보였다.
실시예 4: 본 발명의 KP -VR2의 리간드 ( VEGFA165 또는 PlGF )에 대한 최대 결합값 비교
본 발명의 KP-VR2, KP-VR(애플리버셉트) 또는 베바시주맙의 VEGFA165 또는 PlGF에 대한 최대 결합값을 ELISA 시험을 통해 확인하고 그 결과를 하기 표 1 (KP-VR2, 애플리버셉트 및 베바시주맙의 VEGF 및 PlGF에 대한 결합 친화성 비교)에 나타내었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 애플리버셉트 보다 VEGFA에 대한 결합능력이 약 100% 높았고, PlGF에 대한 결합능력이 약 76% 높은 것으로 확인되었다.
　 리간드 결합력 　
　 리간드 Bmax (OD) 비고
KP-VR2 VEGF-A165 1.30±0.003 106% 증가
애플리버셉트 VEGF-A165 0.63±0.008
베바시주맙 VEGF-A165 0.55±0.051
KP-VR2 PLGF 1.60±0.03 75.8% 증가
애플리버셉트 PLGF 0.91±0.03
또한, 리간드 (ligands)와 약물의 결합력을 비교하기 위하여 Octet (Pall ForteBio) 시험을 수행했다. 먼저, 2 ㎍/㎖ 애플리버셉트와 8 ㎍/㎖ KP-VR2을 200 ㎕씩 플레이트에 분주하고, 애널라이트 (analyte)로서 VEGF-A (R&D systems)를 20 nM부터 0.315 (20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 및 0.3125) nM, PLGF (R&D systems)를 80 nM부터 2.5 nM (80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25) 까지 1/2씩 희석하고 200 ㎕씩 분주하여 준비하였다. 애플리버셉트를 2 ㎍/㎖, KP-VR2를 8 ㎍/㎖ 농도로 플레이트에 붙인 후 VEGF-A를 애널라이트로 하여 결합력을 측정하였다. 도 7의 A는 VEGF-A를 20 nM부터 1/2씩 희석하여 러닝하였다. Curve fit model은 1:1 바인딩 모델을 적용하였으나 KP-VR2 경우 에피토프가 2곳임을 가정하여 2:1 heterogeneous binding model (KP-VR2)을 적용하였다. 애플리버셉트의 KD값은 2.69 x 10- 12으로 측정되었다. 2:1 heterogeneous binding model에서 KP-VR2와 VEGF-A와의 결합에서 측정된 KD값에서 dissociation값에 의해 측정범위를 넘어선 KD값 (<1.00x10-12)과 4.75 x 10-12 수준의 KD값이 산출되었다 (표 2 및 표 3). 표 2는 VEGF-A에 대한 kinetic, 표 3은 PLGA에 대한 kinetc을 나타낸 것이다.
Fitting model (Octet) VEGF : Receptor KD(M) Kon(1/ms) Kdis(1/s)
1:1 Aflibercept 2.69x10-12 6.01x105 1.64x10-6
2:1 KP-VR2 <1.00x10-12 3.35x104 <1.00x10-7
4.75x10-12 6.44x104 3.30x10-7
Fitting model PLGF : Receptor KD(M) Kon(1/ms) Kdis(1/s)
1:1 Aflibercept 2.65x10-10 2.96x105 7.86x10-5
2:1 KP-VR2 7.49x10-10 2.16x105 1.62x10-4
4.85x10-8 1.41x105 6.85x10-3
실시예 5: 융합단백질 KP -VR2와 애플리버셉트의 VEGF -A165에 대한 최대 결합력 비교
리간드들 (ligands)과 약물들과의 최대 결합력을 비교하기 위하여 Octet (Pall ForteBio) 시험을 수행했다. 동일 농도 (8 μg/ml)의 애플리버셉트와 KP-VR2을 200 μl씩 센서 (ForteBio)에 분주하고, analyte로서 VEGF-A (R&D systems)를 40 nM부터 1.25 (40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25) nM까지 ½씩 희석하여 200 μl씩 분주하여 준비하였다. 애플리버셉트의 VEGF-A165의 최대 결합값은 ~ 0.2687 nm이고 KP-VR2의 VEGF-A165의 최대 결합값은 ~ 0.5332 nm 이었다. 그 결과를 도 8 및 표 4 (KP-VR2 및 KP-VR4의 VEGF에 대한 결합친화도)에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 VEGFA165 최대결합값은 ~0.5332 nm로 애플이버셉트의 최대 결합값 ~ 0.2687 nm 대비 ~ 98.4% 증가하였다 (표 4). 따라서, 본 발명의 KP-VR2이 KP-VR4 (애플리버셉트)와 비교하여 현저히 높은 수준의 VEGF-A 결합력을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
　 Kinetic binding parameters 　
　 리간드 Rmax(nm) 비고
KP-VR2 VEGF ~ 0.5332 98.4% 증가
애플리버셉트 VEGF ~ 0.2687
또한, 본 발명의 KP-VR2 및 KP-VR4 (애플리버셉트)의 VEGFA165, 또는 PlGF에 대한 최대 결합값을 ELISA 시험을 통해 확인하고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5는 KP-VR2, 애플리버셉트 또는 베바시주맙의 VEGF 및 PlGF에 대한 결합값 비교시험으로 표 5에 나타낸 바와 같이, KP-VR2는 애플리버셉트 또는 베바시주맙 보다 VEGFA에 대한 최대 결합량이 2배 높았고, PLGF 경우 애플리버셉트 보다 2배 더 많이 결합됨이 확인되었다. 애플리버셉트 또는 베바시주맙은 리간드에 1:1 결합하는 것으로 알려졌으며, KP-VR2는 1:2 리간드 결합할 수 있음이 확인되었다.
Molecule Stoichiometry of VEGF-A Stoichiometry of PLGF
Bevacizumab 1:1 -
Aflibercept 1:1 1:1
KP-VR2 1:2 1:2
Difference in anti-VEGF agents: higher avidity
실시예 6. 본 발명의 KP -VR2의 랫트에서의 약동력학 ( pharmacokinetic ) 특성
VR-2와 KP-VR4 (애플리버셉트)의 약동력학 (PK)을 확인하기 위하여, KP-VR2와 KP-VR4 (애플리버셉트)를 사용하여 랫트에서 IV (intravenous, 정맥 내) 투여와 SC (subcutaneous, 피하) 투여 2개 그룹으로 나누어 1 ㎎/㎏의 용량을 투여한 후 ELISA 시험을 수행하였다. 먼저 IV 투여 그룹은 각각 180 ~ 200 g으로 계량된 암컷 SD (Sprague-Dawley) 랫트 (오리엔트바이오, 6주령)에 KP-VR2 및 KP-VR4 (애플리버셉트)을 각각 꼬리정맥에 주사한 직후 (0H), 5분, 15분, 45분, 3시간, 5시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 및 168 시간 별로 랫트의 경정맥에서 혈액을 채취하여 투여된 물질의 변화량을 확인하였다 (VEGF-TRAP: A VEGF BIOCKER WITH POTENT ANTI TUMOR EFFECTS. PNAS. 2002, 99(17):139311398). 다음, SC 투여 군은 180 ~ 200 g으로 계량된 암컷 SD (오리엔트바이오, 6주령, Sprague-Dawley) 랫트에 시험물질 (KP-VR2, 애플리버셉트)을 랫트의 목 뒤쪽에 피하주사를 한 직후 (0H), 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 48시간, 96시간, 168시간, 240시간, 및 336 시간 별로 랫트의 경정맥에서 혈액을 채취하여 시험물질의 변화량을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)와 유사한 생체 내 반감기를 가지며 유사한 약동학적 특성을 나차냈다.
실시예 7: 혈관내피세포에서 KP -VR2에 의한 세포이동 및 침윤억제 분석
실시예 7-1. HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells)에서 KP -VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 베바시주맙 처리 후 VEGF-A로부터 유도된 세포침윤 억제력 측정
혈관내피세포의 KP-VR2에 의한 세포이동 및 침윤억제 정도를 측정하기 위하여 트랜스웰 (transwell) 시스템에서 화학주성 운동 분석법 (chemotactic motility assay)으로 세포이동을 측정하였다. 먼저 트랜스웰 시스템에서 성장감소인자인 마트리젤 (Matrigel, Millipore)을 코팅한 후, 침윤분석법 (invasion assay)으로 세포침윤을 측정하였다. 세포이동의 정량분석과, 세포침윤의 측정은 하기와 같이 수행하였다. 구체적으로 트랜스웰의 아랫면을 10 ㎕의 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 24시간 건조하였다. 세포침윤 어세이 (invasion assay)를 수행하기 위해, Corning사의 QCM 24-웰 세포 세포침윤 어세이 키트 (QCM 24-well cell invasion assay kit)을 사용하였다. 세포침윤 어세이 배지 (invasion medium) (endothelial cell basal medium, EBM, 0.1% FBS)로 탈착된 세포들을 수거한 후, 세포수를 5 x 104/300 μl 세포침윤 배지로 조절하여, 각각의 인서트 (insert)에 세포들을 분주하였다. 6웰은 KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) (Eylea, 상표명), 또는 베바시주맙 (Avastin, 상표명) 0 ~ 200 nM 처리하였다. 6웰의 VEGF (350 ng/㎖)를 처리하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 인서트에 남은 세포와 배지를 제거하고, 인서트를 새로운 웰로 옮겼다. 세포분리용액 225 ㎕에 인서트를 올리고 37℃ 배양기에서 30분 동안 배양했다. 남은 세포를 완전히 떼어내기 위해 인서트를 흔들고, 세포분리용액과 세포가 섞인 용액에 75 ㎕ 용해완충액 (lysis buffer)/ 염색용액 (dye solution)을 가한 후 상온에서 15분 방치했다. 200 μl의 용액을 96웰로 옮기고 595 nm 형광으로 읽었다. 결과를 도 10a, 도 10b, 및 표 6 (혈관내피세포에서 KP-VR2에 의한 세포 이동 및 침윤 억제 분석)에 나타내었다.
　 혈관내피세포 이동 억제도 　
VEGF 억제제 리간드 IC50 (nM) 비고
KP-VR2 VEGF-A165 11.00±1.40 　
애플리버셉트 VEGF-A165 20.08±3.95
베바시주맙 VEGF-A165 21.28±2.72
도 10a 및 도 10b에 나타낸 것과 같이, VEGF는 HUVEC (Lonza)에서 세포이동 및 침윤작용을 유도하고, KP-VR2, KP-VR4 (애플리버셉트) 또는 베바시주)은 이러한 세포이동 및 침윤을 억제하였으며, 본 발명의 KP-VR2는 같은 농도 (13 nM)에서 KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙 보다 세포이동 및 침윤 억제효과가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2의 IC50는 약 11 nM로서, KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙의 IC50이 각각 20 nM과 21 nM인 것과 비교하여 현저히 우수한 침윤억제 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 7-2. EA - hy926 세포주에서 KP -VR2, KP -VR4 ( 애플리버셉트 ) 또는 KP -VR3 ( 베바시주맙 ) 처리 후 VEGF -A로부터 유도된 세포침윤 억제력 측정
먼저 EA-hy926 세포주 (ATCCⓡ CRL-2922™)를 0.1 % FBS가 포함된 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma)가 있는 96웰 플레이트에 3.5 x 105 cell/㎖로 접종한 다음, KP-VR2 (1,500 ㎍/㎖), KP-VR4 (애플리버셉트) (3,000 ㎍/㎖), 및 베바시주맙 (3,000 ㎍/㎖)을 각각 처리하여 24시간 동안 반응시키고, 융합단백질을 처리하지 않은 배지를 음성대조군으로 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 그 결과를 도 11a 및 도 11b에 나타내었다. 도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2은 KP-VR4 (애플리버셉트) 및 베바시주맙과 비교하여 VEGF에 의해 유도된 EA-hy926 세포의 성장을 보다 더 적은 농도에서도 매우 효과적으로 억제하였다.
실시예 8: KP -VR2와 KP -VR4의 암종에 대한 세포분열 억제능력 비교
본 발명의 KP-VR2의 암종에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위하여 9가지 암종에 대하여 MTS 세포증식 어세이 (MTS cell proliferation colorimetric assay)를 수행하였다. 표 7은 본 실시예에서 이용한 9종의 암종에 대한 것이다.
종류 바이오마커 기원 구입처
HT29 VEGF positive Human colorectal adenocarcinoma ATCCⓡ HTB-38™
LoVo VEGF positive Human colorectal adenocarcinoma ATCCⓡ CCL-229™
PLGF positive
AGS PLGF positive Human gastric adenocarcinoma ATCCⓡ CRL-1739™
VEGF positive
SKUT1b VEGF positive Human uterine sarcoma ATCCⓡ HTB-115™
VEGFR1 positive
Caki-1 VEGF positive Renal Clear Cell carcinoma ATCCⓡ HTB-46™
VEGFR1 positive
Hy-926 VEGF positive Human Endothelial ATCCⓡ CRL-2922™　
VEGFR1 positive
HCT 116 VEGF positive Human colorectal carcinoma ATCCⓡ CCL-247™
PANC 02.03 VEGF positive Human Pancreas Adenocarcinoma ATCCⓡ CRL-2553™
SW480 VEGF positive Human colorectal adenocarcinoma ATCCⓡ CCL-228™
PLGF positive
PC-3 VEGF positive Human prostate adenocarcinoma ATCCⓡ CRL-1435™
PLGF positive
먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 9종류의 암종들 HT-29 (ATCCⓡ HTB-38™), LOVO (ATCCⓡ CCL-229™), HCT116 (ATCCⓡ CCL-247™), SKUT1b (ATCCⓡ HTB-115™), Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), AGS (ATCCⓡ CRL-1739™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), SW480 (ATCCⓡ CCL-228™), 및 PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음 이들 암종 세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)를 2, 4 또는 6 nM의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 마지막으로 MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 12a, 12b 및 표 8에 나타내었다. 도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 시험에 사용된 모든 암종에 대해 KP-VR4 (애플리버셉트) 보다 현저히 우수한 세포분열 억제효과를 나타내었다.
종류 접근 시험법 in vitro efficacy KP-VR4 in vitro efficacy KP-VR2
EA-hy926 in vitro efficacy ~ 17% 증식 억제 ~ 33% 증식 억제
HT29 in vitro efficacy - ~ 44% 증식 억제
LoVo in vitro efficacy ~ 35% 증식 억제 ~ 65% 증식 억제
HCT116 in vitro efficacy - ~ 44% 증식 억제
SKUT1b in vitro efficacy - ~ 26% 증식 억제
CaKi-1 in vitro efficacy - ~ 67% 증식 억제
PANC0203 in vitro efficacy - ~ 37% 증식 억제
SW480 in vitro efficacy - ~ 38% 증식 억제
AGS in vitro efficacy - ~ 34% 증식 억제
PC-3 in vitro efficacy - ~ 20% 증식 억제
또한, 표 8 (세포증식 억제 효과)에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 VEGF와 PlGF를 타겟으로 하는 9종의 암종에 대해 세포증식을 억제하는 활성이 우수하였다.
실시예 9: anti- VEGF 내성 암종 및 섬유아세포에 대한 KP -VR2와 애플리버셉트의 세포분열 억제능력 비교
본 발명의 KP-VR2의 암종에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위해 anti-VEGFA, 또는 anti-VEGFR에 대하여 내성을 지닌 암종 및 섬유아세포에 MTS 세포증식어세이를 수행하였다. 표 9은 본 실시예에서 사용한 4가지 암종 및 2가지 섬유아세포를 나타낸다.
종류 Biomarker Origin 접근시험법
(1단계) 		접근시험법
(2단계) 		구입처
CT26 A model resistant to anti-VEGFR Mouse Colon carcinoma in vitro efficacy Xenograft 시험 ATCCⓡ CRL-2638™
B16-F10 A model resistant to FOLFIRY(p38) Mouse Skin melanoma in vitro efficacy Xenograft 시험 ATCCⓡ CRL-6475™
EL4 Anti-VEGF-A refractory Mouse lymphoma in vitro efficacy Xenograft 시험 ATCCⓡ TIB-39™
LCC1 Anti-VEGF-A refractory Mouse lung carcinoma　 in vitro efficacy Xenograft 시험 ATCCⓡ CRL-1642™
NIH3T3 fibroblast Mouse embryo fibroblast in vitro efficacy 　 KCLB NO21658　
Hs27 fibroblast Human skin fibroblast in vitro efficacy 　 ATCCⓡ CRL-1634™　
먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 4종류의 암종들 (EL-4(ATCCⓡ TIB-39™), LLC1(ATCCⓡ TIB-39™), B16F10 (ATCCⓡ CRL-6475™), CT-26 (ATCCⓡ CRL-2638™) 및 섬유아세포 NIH3T3 (한국세포주은행(KCLB) No 21658)및 Hs27 (ATCCⓡ CRL-1634™)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음, 상기 암종 및 섬유아세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well 로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 KP-VR4 (애플리버셉트)를 2, 4, 또는 6 nM의 농도로 처리하고 72시간 배양하였다. MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 13, 도 14 및 표 10 (암종 및 섬유아세포)에 나타내었다.
종류 접근 시험법 KP-VR4 KP-VR2
CT26 In vitro efficacy - ~56% 증식 억제
B16-F10 In vitro efficacy - ~30% 증식 억제
EL4 In vitro efficacy ~49% 증식 억제 ~67% 증식 억제
LLC1 In vitro efficacy ~12% 증식 억제 ~70% 증식 억제
NIH3T3 In vitro efficacy ~41% 증식 억제 ~52% 증식 억제
Hs27 In vitro efficacy ~15% 증식 억제 ~25% 증식 억제
도 13, 도 14 및 표 10에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2는 KP-VR4 (애플리버셉트)에 비해 암세포 증식억제능력이 현저히 우수할 뿐만아니라 (실시예 8), anti-VEGF/VEGFR 내성 암종들 (EL-4, LLC1, B16F10, 및 CT-26)과 섬유아세포 (Hs27 및 NIH3T3)에 대해서도 뛰어난 증식억제 능력을 보였다.
실시예 10: KP -VR2와 애플리버셉트의 누드마우스에서의 종양성장억제 비교
KP-VR2의 종양성장억제 효과에 대한 in vivo 시험을 위하여, BALB/c 누드 마우스에서 여러 가지 종양의 이종이식모델을 사용하였다.
실시예 10-1. HT-29 in vivo 이종이식편 ( xenograft )
먼저 HT-29세포 (ATCCⓡ HTB-38™) 5 x 106 cells/0.2 ㎖를 누드 마우스 (오리엔트 바이오, 암컷 4주령)의 등에 피하주사하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (1 ㎎/㎏ 또는 2 ㎎/㎏)와 KP-VR4 (애플리버셉트) (2 ㎎/㎏ 또는 3 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하고, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양의 부피를 측정하고, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 HT-29 직결장암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 40% 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 1 ㎎/㎏ KP-VR2가 3 ㎎/㎏ 애플리버셉트 (KP-VR4)와 유사한 효과를 제시하였다.
실시예 10-2. LOVO in vivo 이종이식편
HT-29세포 대신 LOVO (ATCCⓡ CCL-229™)를 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 10-1와 동일하게 수행하였다. LOVO 5 x 106 cells/0.2 ㎖ 를 누드마우스 (샘타코, 암컷 4주령)의 등에 피하주사 하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (1 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (KP-VR4) (1 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종 42일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 16a 및 16b에 나타내었다. 도 16a 및 16b에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2가 LOVO 직장암종의 성장을 1 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 50 ~ 60% 증가된 저해 효과를 보였다 (P<0.05). 본 발명의 KP-VR2의 종양성장억제 효과는 투여초기부터 관찰되었으며, 그 차이가 점차 커지는 추세를 보였다. 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트에 비하여 약 50% 정도의 종양중량감소 효과를 나타내었다.
실시예 10-3. SKUT1B in vivo 이종이식편
본 발명의 KP-VR2의 항암활성을 추가로 확인하기 위하여, HT-29세포 대신 VEGFR1 양성 세포주인 SKUT1B (ATCCⓡ HTB-115™) 자궁암종을 누드마우스에 주입하였다. 먼저 SKUT1B 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스 의 등에 피하주사 하고 1일 경과후에 KP-VR2 (2 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (KP-VR4) (2 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회씩 32일이 될 때까지 투여하였으며, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS를 동일시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양부피를 측정하고, 최종 32일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 17a 및 17b에 나타내었다. 도 17a 및 17b에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2는 SKUT1B 자궁암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 60 ~ 70% 현저히 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 60%의 종양무게 감소효과를 나타냈다. 동일한 조건으로 반복시험을 수행하여 37일차까지의 결과를 재확인 하였다. 도 17C에서, SKUT1B 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 1주일 경과 후에 종양 크기가 200 ㎣이 되었을 때, KP-VR2 (4 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (4 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회씩 투여하였으며, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS를 동일시간 및 주기로 투여하였다. 본 발명의 KP-VR2는 SKUT1B 자궁암종의 성장을 동량의 애플리버셉트와 비교하여 현저히 증가된 저해효과를 보였다 (P<0.05). 그 유사한 시험결과들이 도 17d 17e에 나타내었다. 도 17d 및 도 17e에 제시된 것과 같이, 본 발명의 KP-VR2가 SKUT1B 자궁암종의 성장을 2 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 70 ~ 80% 증가된 현저히 우수한 저해 효과를 보였다 (P<0.05). 또한, 본 발명의 KP-VR2는 동량의 애플리버셉트 (KP-VR4)와 비교하여 약 70% 종양무게감소 효과를 나타냈다.
실시예 10-4: ASPC -1 ( ATCC ⓡ CRL -1682) 또는 MIA PaCa2세포 (ATCC ⓡ CRL -1420) 등의 췌장암종들에서 종양 성장억제력 비교시험
ASPC-1 (ATCCⓡ CRL-1682) 및 MIA PaCa2세포 (ATCCⓡ CRL-1420) 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드 마우스 (샘타코, 암컷 4주령)의 등에 피하주사하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자란 것을 확인한 다음, KP-VR2 (5 ㎎/㎏) 또는 베바시주맙주 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하고, 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline, Gibco)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양의 부피를 측정하고, 그 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 췌장암종들의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙주와 비교하여 두드러진 종양 성장 저해효과를 보였다 (P<0.001).
실시예 10-5: MKN 45 ( KCLB No.80103), NCI-N87( ATCC ⓡ CRL -25822™), MKN 28(KCLB No.80101), 또는 SNU 16 ( KCLB No. 00016) 위암들에서 성장 저해효과 확인 시험
MKN 45, NCI-N87, MKN 28 또는 SNU16 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 종양이 200 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (5 ㎎/㎏)와 베바시주맙 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 21에 나타내었다. 도 21B에서, NCI-N87 암종은 VEGF에 내성을 보이는 암종으로 보다 베바시주맙의 한계를 극복함을 보여준다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 MKN 45, NCI-N87, MKN28 또는 SNU16 위암종들의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙와 비교하여 우수한 암 성장의 저해효과를 보였다.
실시예 10-6: HepG2 ( ATCC ⓡ HB -8065 ™ ), SNU423 ( ATCC ⓡ CRL -2238™), A549 (ATCCⓡ CCL-185 ™ ) 또는 B16F10 ( ATCC ⓡ CRL -6475™) 성장의 저해효과 관찰
HepG2 (ATCCⓡ HB-8065), SNU423(ATCCⓡ CRL-2238) 및 A549 (ATCCⓡ CCL-185) 5 x 106 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사 하고 종양이 100 ㎣ 이상으로 자랐을 때 KP-VR2 (5 ㎎/㎏)와 베바시주맙 (5 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 22a, 도 22b 및 도 22c에 나타내었다. 도 22A에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 HepG2 간암의 성장을 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙 대비 주요하게 암 성장의 저해효과를 보였다. 도 22B에서도 본 발명의 KP-VR2가 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙과 대비하여 SNU423 간암의 성장을 저해한 것을 확인하였다. 또한, 도 22C에서도 본 발명의 KP-VR2가 5 ㎎/㎏의 용량에서 동량의 베바시주맙과 대비하여 A547 폐암의 성장을 저해한 것을 확인하였다. 도 22D에서, B16F10 (ATCC® CRL-6475) 1 x 107 cells/0.2 ㎖를 누드마우스의 등에 피하주사하고, 1일 후에 KP-VR2 (2 ㎎/㎏)와 애플리버셉트 (2 ㎎/㎏)를 각각 마우스의 복강으로 일주일에 2회 투여하였다. 음성대조군 마우스에는 복강에 동량의 PBS (phosphate buffered saline)를 동일 시간 및 주기로 투여하였다. 3 ~ 4일 주기로 종양 부피 변화를 측정하였고, 최종일차에는 종양을 적출하여 종양의 중량을 비교하였다. 그 결과를 도 22d에 나타내었다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2가 간암, 폐암 또는 흑색종에 대한 항암효과를 나타냈다.
실시예 10-7: Caki -1 ( ATCC ⓡ HTB -46™), Panc0203 ( ATCC ⓡ CRL -2553™), PC-3 ( ATCC ⓡ CRL -1435™) 또는 EL-4 ( ATCC ⓡ TIB -39) 암종들에 대한 세포분열 억제능력 관찰
도 23은 누드마우스에 접종시 종양이 형성되지 않은 암종들에서 KP-VR2의 암종들에 대한 세포분열 억제능력을 확인하기 위해서 MTS 세포증식 어세이 (MTS cell proliferation colorimetric assay)를 수행한 결과이다. 먼저 37℃, 5% CO2 조건 하에서 상기 4종류의 암종들 Caki-1 (ATCCⓡ HTB-46™), Panc0203 (ATCCⓡ CRL-2553™), PC-3 (ATCCⓡ CRL-1435™) 또는 EL-4 (ATCC® TIB-39)를 포화상태 (full confluency)에 도달하게 하였다. 다음 이들 암종 세포들을 수거하여 웰당 3 x 103 cells/well로 분주하고 37℃, 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 (Sigma) 배지에서 24시간 배양하였다. 다음, 배지를 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, KP-VR2 또는 애플리버셉트를 6 μM의 농도로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 마지막으로 MTS 시약 (Qiagen)을 가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 KP-VR2는 시험에 사용된 모든 암종에 대해 애플리버셉트 및 베바시주맙주 대비 현저히 우수한 세포분열 억제효과를 나타내었다.
실시예 10-8: 토끼의 안구에 레이저 (laser)를 조사하여 맥락막신생혈관 (choroidal neovascularization , CNV )를 유발하고, 시험물질을 투여한 후 시험물질의 효력을 평가
동물의 우측 안구에 산동제 (미드리아실 1 % 점안액)를 점안한 후, Zoletil 50 (VIRBAC, France) 및 xylazine (Rompunⓡ, Bayer AG, Germany)을 이용하여 마취를 실시한 뒤, 안구에 laser (Elite, Lumenis, USA)를 532 nm, power 150 mW, duration 0.1 sec의 조건으로 조사하며, optic nerve를 중심으로 약 6 시 방향에 6 개의 spot을 만들었다. 동물이 마취된 상태에서 시험물질 50 ㎕를 해당 동물의 우측 안구에 31 ga㎍e 주사바늘이 장착된 주사기를 이용하여 초자체내 투여하였다. Day 0, 3, 7, 10 및 14에 동물의 우측 안구에 산동제 (미드리아실 1 % 점안액)를 점안한 후, Zoletil 50 (VIRBAC, France) 및 xylazine (Rompunⓡ, Bayer AG, Germany)을 이용하여 마취를 실시한 뒤, 2% fluorescein sodium salt solution 약 1 ㎖을 정맥을 통해 주입한 뒤, 안저카메라 (TRC-50IX, TOPCON, Japan)를 이용하여 약 2분 이내에 촬영하였다. 망막 CNV 확인 및 약효 평가는 망막 형광 안저 사진을 이용하여 수행하였다. 이미지 분석은 ImageJ software (NIH, Bethesda, MD)를 이용하여, 조사부위의 형광 강도를 분석하였다 (도 24A). 망막 형광 강도 분석 결과, 레이저 조사 후 7일째 (Day 7)에 측정한 양성대조물질 투여군 (G2) 및 시험물질 고용량 투여군 (G4)의 망막 형광 강도 수준은 유발대조군 (G1)에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮은 것으로 나타났으며 (p<0.05), laser 조사 후 10 및 14 일째 (Day 10 및 14)에 측정한 G2 및 모든 시험물질 투여군 (G3-G4)의 망막 형광 강도 수준은 G1 대비 유의하게 낮았다 (p<0.01 또는 p<0.05). 도 24B는 약물투여 14일 후에 초자액에 남아있는 약물의 잔존량을 비교한 것으로서, 투여용량에 비례하여 약물이 남아있었다.
실시예 11: 제형 최적 조건 평가
실시예 11-1: 냉장, 상온 및 40℃ 보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평 가
본 실시예에서는 선행기술문헌 국제공개공보 WO2017188570에 개시된 내용에 따라 다음 제형의 제제를 제조하였다: a) KP-VR2의 아미노산 서열 포함하는 1 ~ 100 ㎎/㎖ 신규신생혈관생성 억제제; b) 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v) 용매; c) 10 ~ 100 mM 염화 나트륨 등장제; 및 d) 5 ~ 50 mM 인산나트륨 완충제 또는 5 ~ 50 mM citric 나트륨 완충제를 포함하고, 1 ~ 10%(w/v)의 안정화제로서 수크로오스가 선택적으로 추가로 포함되는 제제. 상기 혈관내피 성장인자 (VEGF) 길항제 제형에 대해 냉장, 상온 및 40℃의 보관조건에 따른 제제 안정성을 비교하였다. 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 액상 제제의 최적 pH를 확인하기 위하여 pH 5.0 ~ 7.5의 시료를 제조하였다. 표 11에 제형 및 저장조건을 나타낸다.
pH Storage compositions 저장 조건 분석 시험법
제형 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 - 20~100 ㎎/㎖ KP-VR2
- 5 mM sodiumphosphate
- 5 mM sodium citrate
- 40 mM sodium chloride
- 0.03% polysorbate 20
- 5% sucrose		 4℃
25℃
40℃		 - SE-HPLC
- SDS-PAGE
- ELISA
구체적으로, 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화 나트륨, 5 mM 시트르산 나트륨, 40 mM 소듐 나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 하여 냉장, 상온 및 40℃에서 7일간 보관하여 시간이 경과함에 따라 생성된 불순물을 SE-HPLC (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피) 분석을 수행하였다. SE-HPLC 분석에서, TSK gel G3000swxl column (일본TOSOH사)을 사용하여 고분자량 불순물인 응집물 (aggregation)들과 저분자량 불순물인 단편 (fragment)들을 합하여 계산하였다. 그 결과를 표 12 내지 표 14에 나타냈다. 표 12 (SE-HPLC, 4℃)의 보관조건에서는 D/A(%), dimer 및 응집들의 전체 %는 pH 조건 별로 큰 차이는 보이지 않았다. 그 중 pH 6.5, pH 7.0 및 pH 7.5 냉장 보관조건에서 aggregation함량이 낮았다. 표 13 (SE-HPLC, RT)의 상온 보관조건에서는 낮은 pH 완충액 보관조건에서 aggregation 함량이 특히 높았고, 상대적으로 pH 6.5, 7.0, 및 pH 7.5 상온 보관조건에서 aggregation 함량이 낮았다. 표 14 (SE-HPLC, 40℃)의 가혹 보관조건에서는 대다수의 시료의 aggregation 함량이 높았다. 그러나 그 중 6.5, 7.0 및 7.5 완충액 보관조건에서 aggregation 함량이 낮았다.
냉장 pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0 pH7.5
DAY 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7
Monomer
(%)		 97.12 96.75 96.2 96.6 97.25 96.84 97.47 97.33 97.63 96.78 97.91 97.44 98.1 97.99 97.61 98.3 98.21 98.02
D/A fragment (%) 2.88 3.25 3.8 3.4 2.75 3.16 2.53 2.67 2.37 3.22 2.09 2.56 1.9 2.01 2.39 1.7 1.79 1.98
상온 pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0 pH7.5
DAY 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7
Monomer
(%)		 97.12 59.79 32.69 96.6 91.73 63.99 97.47 95.43 92.71 96.78 96.81 96.19 98.1 96.9 96.57 98.3 97.3 97.1
D/A fragment (%) 2.88 40.21 67.31 3.4 8.27 36.01 2.53 4.57 7.29 3.22 3.19 3.81 1.9 3.1 3.43 1.7 2.7 2.9
가혹 pH5.0 pH5.5 pH6.0 pH6.5 pH7.0 pH7.5
DAY 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7 0 3 7
Monomer
(%)		 97.12 11.41 9.19 96.6 6.78 3.87 97.47 7.17 2.56 96.78 38.45 25.75 98.1 45.36 37.71 98.3 46.51 38.82
D/A fragment (%) 2.88 88.59 90.81 3.4 93.22 96.13 2.53 92.83 97.44 3.22 61.55 74.25 1.9 54.64 62.29 1.7 53.49 61.18
SE-HPLC 분석에서, TSK-gel G3000swxl (7.8 × 300 mm) 칼럼 (일본 TOSOH사)을 사용하여 0.02M 인산 나트륨 (pH 7.0), 0.4M NaCl 완충액을 0.5 ㎖/분의 속도로 흘려주고, 흡광도 280 nm에서 혈관내피성장인자 융합 단백질의 피크를 확인하였다. 도 25A의 보관조건에서, D/A(%), 이량체 (dimer) 및 응집들의 전체 %는 pH조건별로 큰 차이는 보이지 않았다. 이 중 pH 6.5, pH 7.0 및 pH 7.5 냉장 보관조건에서 응집체 함량이 낮았다. 도 25B에서, 상온 보관조건에서는 낮은 pH 완충액 보관조건에서 응집체 함량이 특히 높았고, 상대적으로 pH 6.5, 7.0, 및 pH 7.5 상온 보관조건에서 응집체함량이 낮았다. 도 25C에서, 가혹 보관조건 (40℃)에서는 대다수의 시료의 응집체 함량이 높았다. 그러나 그 중 6.5, 7.0 및 7.5 완충액 보관조건에서 응집체 함량이 낮았다.
실시예 11-2: 냉장, 상온 및 40℃ 보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 여러 제제들은 7일간 냉장보관하여 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 SDS-PAGE 분석을 수행하였다. 1 ㎎/㎖로 희석된 분석시료 20.0 ㎕에 5 x 샘플 완충액 5.0 ㎕를 첨가한 후 100℃에서 5분간 반응한 시료를 분석에 사용하였다. 최종 분석시료는 웰당 10 ㎕로 로딩하였다. 마커는 (HiMark Pre-stained Protein Standard, Invitrogen) 단백질 마커를 사용하였으며, 웰당 5 ㎕로 로딩하였다. Novex Tris-Acetate 3 ~ 8% 젤에 150 V로 1시간 전기영동하였다. 투마시블루 (coomassie blue, Merck)로 염색하였으며, 선명한 밴드가 나올 때까지 탈색하였다. SDS-PAGE분석결과, 냉장보관에서는 도 26 및 표 12 내지 14과 비교한 결과 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었다.
실시예 11-3: 상온보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 상온에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 상기 실시예와 동일하게 SDS-PAGE로 분석하였다. 도 27A 및 도 27B에서 비교한 결과, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간이 경과함에 따라 증가하였다. 그러나 특정 완충 pH 6.5, 7.0 및 7.5 제제들은 상온보관 1주일 경과 후에도 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간이 경과에 따라 크게 증가하지 않았다.
실시예 11-4: 가혹보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제제들을 7일간 가혹조건 (40℃) 하에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체 및 변형체를 SDS-PAGE로 분석하였다. 그 결과, 대조군 도 28A 및 28B에 나타낸 것과 같이, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 시간 경과에 따라 증가하였다. 그러나 특정 완충 pH 6.5, 7.0 및 7.5 제제들은 40℃ 하에서 보관한지 1주일 경과 후에도 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 상대적으로 적게 관찰되었다.
실시예 11-5: 냉장보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 냉장 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체의 ELISA 분석을 수행하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력 (avidity)을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 29A 및 29B에 나타내었다. 도 29a 및 29b에 나타낸 것과 같이, 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 냉장보관조건에서 억제되었다.
실시예 11-6: 상온보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5로 제조하였다. 이들 제조한 제제들을 7일간 상온에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체, 및 변형체를 ELISA 분석하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시키고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 30의 A 및 B에 나타내었다. 상온에서 7일 동안 보관한 결과, 완충액 pH 6.5, 7.0 및 7.5 조건에서 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었다.
실시예 11-7: 가혹보관조건에서 제제의 최적 완충액 조건 평가
혈관내피성장인자 수용체 융합단백질의 최종 농도는 60 ㎎/㎖가 되도록 하고, 5 mM 인산화나트륨, 5 mM 시트르산나트륨, 40 mM 소듐나트륨, 0.03% 폴리소르베이트 포함하며 pH를 각각 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5로 제조하였다. 이들 제조된 제제들을 7일간 가혹조건 (40℃) 하에서 보관하면서 시간 경과에 따른 단량체, 응집체 및 변형체를 ELISA 분석하였다. 완충액 pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5 제제들의 VEGF-A에 대한 친화력을 비교하기 위해, 96웰 플레이트 (Nunc사)를 2 nM KP-VR2로 코팅하고, VEGF165 (R&D systems)을 단계적으로 증가된 양 (0.0156 ~ 64 nM)으로 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 항-인간 VEGF 항체와 1시간 반응시켰고, 플레이트를 세척한 다음 퍼옥시다아제 컨쥬게이션된 항-염소 Ig 항체와 함께 반응시켰다. 다음, 3, 3’, 5,5’테트라메틸벤지딘 (TMB) 용액 (Roche사)을 가하고, ELISA 리더기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 31의 A 및 B에 나타내었다. 가혹 조건에서 7일 동안 보관한 결과, 완충액 pH 6.5, 7.0 및 7.5조건에서 불순물, 제제의 응집물 및 단편들의 생성이 억제되었으며, 특히 완충액 pH 7.0 조건에서 가장 불순물 함량이 적은 것으로 확인되었다.
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Claims (3)

  1. (a) 약리학적 유효성분으로서 혈관내피성장인자 (VEGF)와 결합하는 면역글로불린-유사 도메인의 Fc 융합단백질 1 ~ 100 ㎎/㎖; (b) 용매로서 폴리소르베이트 0.01 ~ 1%(w/v); 및 (c) 완충제로서 인산나트륨 5 ~ 50 mM, 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM, 또는 인산나트륨 5 ~ 50 mM 및 시트르산나트륨 5 ~ 50 mM를 포함하고 pH가 6.5 ~ 7.5인, 약학 조성물로서,
    상기 Fc 융합 단백질은 (i) 2개의 중쇄가 이황화결합 (dis㎕fied bond)으로 연결된 IgG1의 Fc 도메인, 및 (ii) 4개의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2로 구성되고, 상기 Fc 도메인의 각 중쇄에 상기 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2 및 다른 하나의 VEGFR1의 면역글로불린 도메인2이 순차적으로 융합되며,
    상기 Fc 융합단백질 대 VEGFR1 항원이 1 : 2 이상 결합하는 것인,
    신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
  2. 제1항에 있어서, 신생혈관생성 관련 질환이 암질환으로서 직결장암, 자궁암, 위암, 간암, 흑색종, 폐암, 신장암, 췌장암, 방광암, 림프종 또는 뇌암인 것인,
    신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 신생혈관생성 관련 질환이 안질환으로서, 포도막 흑생종, 습성 황반변성 (wet age-related macular degeneration, AMD), 당뇨황반부종 (diabetic macular edema), 망막정맥폐쇄 (retinal vein occlusion), 또는 당뇨망막병증 (diabetic retinopathy)인 것인,
    신생혈관생성 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
KR1020190172588A 2019-12-23 2019-12-23 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질을 포함하는 신생혈관형성 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 KR102426802B1 (ko)

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