CN115315512A - 具有降低的宿主细胞蛋白质的经修饰的哺乳动物细胞 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于生产目标产物例如重组蛋白的方法、细胞和组合物。特别地，本公开提供表达所述目标产物的改良哺乳动物细胞，其中所述细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)具有某些宿主细胞蛋白质，例如，酶，包括但不限于，某些脂肪酶、酯酶和/或水解酶的降低的或消除的活性，例如表达。

Description

具有降低的宿主细胞蛋白质的经修饰的哺乳动物细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月26日提交的美国临时申请号63/000,464、2020年12月21日提交的美国临时申请号63/128,419和2021年3月1日提交的美国临时申请号63/155,225的权益，这些临时申请的公开内容以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及修饰的哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，其具有降低的或消除的某些宿主细胞蛋白质(例如，宿主细胞酶，包括但不限于，某些脂肪酶、酯酶和/或水解酶)的活性，制备此类细胞的方法和使用此类细胞生产目标产物例如重组蛋白的方法。
背景技术
哺乳动物细胞，例如CHO细胞，表达许多对细胞生长、存活和/或生产力不是必需的蛋白质。然而，这些宿主细胞蛋白质的表达会消耗大量的细胞能量和DNA/蛋白质构件。降低或消除此类蛋白质的表达可以使细胞生长更有效。此外，在细胞用于生产目标产物(例如，重组蛋白)的情况下，这些蛋白质中的一些可以与目标产物共同纯化，导致与额外纯化过程相关的成本增加和/或缩短所得产物的保质期。例如，与目标产物共纯化的某些残留宿主细胞蛋白质可能降解最终药物产品中用作表面活性剂的聚山梨醇酯，并导致颗粒形成(Dixit等人，J Pharm Sci，2016年，第105卷，第5期，第1657-1666页)。因此，本领域需要用于生产目标产物例如重组蛋白的方法、细胞和组合物，其中表达目标产物的细胞具有降低的或消除的某些宿主细胞蛋白质的活性，例如表达，该蛋白质例如酶，包括但不限于某些脂肪酶、酯酶和/或水解酶，它们对于细胞生长、存活和/或生产力不是必需的。例如，降低与mAb共同纯化并随后降解药物产品中聚山梨醇酯的残留CHO宿主细胞蛋白质的水解活性的研究导致了脂蛋白脂肪酶(LPL)的鉴定：敲除LPL的CHO细胞系导致细胞培养收获物的聚山梨醇酯降解比其野生型对应物少41-57％(Chiu等人，Biotechnol Bioeng，2017年，第114卷，第5期，第1006-1015页)。通过降低或消除此类酶的表达，可以减轻相关酶活性的负面影响(例如，残留水解酶对药物产品中的聚山梨醇酯的水解降解)。然而，该研究并未确定在细胞培养收获阶段观察到的LPL敲除的益处是否通过下游加工得以维持。重要的是测试从敲除细胞系中产生的纯化材料，以证明纯化后实现的益处并因此转化为药物产品的益处。
发明内容
本公开涉及修饰的哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，其具有降低的或消除的某些宿主细胞蛋白质(例如，宿主细胞酶，包括但不限于，某些脂肪酶、酯酶和/或水解酶)的活性，制备此类细胞的方法和使用此类细胞生产目标产物例如重组蛋白的方法。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的一种或多种酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，该一种或多种酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶(LPL)；含磷脂酶B结构域2(PLBL2/PLBD2)；脂肪酶A(溶酶体酸性脂肪酶/胆固醇酯水解酶，脂肪酶)(LIPA)；磷脂酶A-2活化蛋白(PLAA)；磷脂酶D3(PLD3)；磷脂酶A2组XV(LPLA2)；磷脂酶Cβ1(PLCB1)；磷脂酶Cδ1(PLCD1)；含DDHD结构域蛋白1(片段)(DDHD1)；溶血磷脂酶样蛋白1(LYPLAL1)；磷脂酶A2组XIIA(PLA2G12A)；过氧化物氧还蛋白6(PRDX6)；鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)；棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)；乙酸异戊酯水解酯酶1(推定)(IAH1)；OTU去泛素化酶，泛素醛结合蛋白1(OTUB1)；溶血磷脂酶2(酰基蛋白硫酯酶2)(LYPLA2)；酰基辅酶A硫酯酶13(ACOT13)；脂肪酸合酶(FASN)；磷脂酶A2组VII(PLA2G7)；泛素特异性肽酶5(USP5)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(酸性神经酰胺酶)(ASAH1)；脂肪酶成熟因子1(LMF1)；载脂蛋白CII(APOC2)；酰基肉碱水解酶(HACH)；羧酸酯酶1F(CES1F)或肝羧酸酯酶B-1样(CES-B1L)；溶血磷脂酶1(LYPLA1)；羧酸酯酶1(CES1)；磷脂酶A1成员A(PLA1A)；和唾液酸乙酰酯酶(SIAE)。
在某些实施例中，重组宿主细胞中以下酶的活性被降低或消除：a)PPT1；b)LPLA2、LPL和LIPA；c)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1；d)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A；e)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SPD1；f)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13；g)LPLA2、LPL和PPT1；h)LPLA2、LPL、LIPA和PPT1；i)HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；j)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；k)SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；l)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；m)LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；n)LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；o)LMF1和APOC2。
在某些实施例中，重组宿主细胞中一种或多种酶的活性通过以下方式降低或消除:(a)敲低该酶的表达；(b)或敲除该酶的表达；或(c)改变编码该酶的核酸序列。
在某些实施例中，本公开涉及一种重组宿主细胞，其包含一种或多种改变的酶基因。在某些实施例中，该一种或多种改变的酶基因没有可检测的酶活性。在某些实施例中，重组宿主细胞包含编码目标产物的核酸序列。在某些实施例中，核酸序列在靶向位置处整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，重组宿主细胞进一步包含编码目标产物的核酸，该核酸随机整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，经修饰的细胞不表达任何可检测的LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供组合物，其包含本公开中描述的重组宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括敲低或敲除LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的降低的活性。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括选择具有LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的降低的活性的细胞。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括改变编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE中的一者或多者的基因。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其中该方法包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其中该方法包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE中的一者或多者的核酸序列，使得LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A、SIAE中的一者或多者具有降低的或消除的酶活性。
在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物且具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其包含一种或多种改变的酶基因。在某些实施例中，该一种或多种改变的酶基因通过编码区的破坏而得到改变。在某些实施例中，该一种或多种酶基因改变包括双等位基因改变。在某些实施例中，该一种或多种酶基因改变包括1个或更多个碱基对,2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对或20个或更多个碱基对的缺失。在某些实施例中，该一种或多种酶基因是LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些上述实施例中，基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及其组合。在某些上述实施例中，基因工程系统为CRISPR/Cas9系统。
在某些上述实施例中，CRISPR/Cas9系统包含：(a)Cas9分子，和(b)一种或多种包含靶向序列的向导RNA(gRNA)，该靶向序列与编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因中的靶序列互补。
在某些上述实施例中，基因工程系统包含选自由以下项组成的组的RNA：短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA)，其中该RNA与由LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE基因中的一者或多者表达的mRNA的一部分互补。在某些上述实施例中，基因工程系统为锌指核酸酶(ZFN)系统或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
在某些上述实施例中，哺乳动物细胞中以下酶的活性被降低或消除：a)PPT1；b)LPLA2、LPL和LIPA；c)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1；d)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A；e)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SPD1；f)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13；或g)LPLA2、LPL和PPT1；h)LPLA2、LPL、LIPA和PPT1；i)HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；j)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；k)SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；l)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；m)LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；n)LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；o)LMF1和APOC2。
在某些上述实施例中，本公开提供的方法进一步包括纯化目标产物、收获目标产物和/或配制目标产物。
在某些上述实施例中，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯的降解得到降低。在某些上述实施例中，聚山梨醇酯20(PS20或吐温20)的降解得到降低。在某些上述实施例中，聚山梨醇酯80(PS80或吐温80)的降解得到降低。
在某些上述实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在某些上述实施例中，哺乳动物细胞为CHO细胞。
在某些上述实施例中，细胞表达目标产物。在某些上述实施例中，由哺乳动物细胞表达的目标产物由核酸序列编码。在某些上述实施例中，核酸序列在靶向位置处整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些上述实施例中，由细胞表达的目标产物进一步由随机整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中的核酸序列编码。
在某些上述实施例中，目标产物包括蛋白质、病毒颗粒或病毒载体。在某些上述实施例中，目标产物包括重组蛋白。在某些上述实施例中，目标产物包括抗体或其抗原结合片段。在某些上述实施例中，抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些上述实施例中，抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。在某些上述实施例中，抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在某些上述实施例中，抗体为单克隆抗体。
在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL和LIPA。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL和PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LMF1和APOC2。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL和LIPA酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL和PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LMF1和APOC2的活性降低或消除它们的活性。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL和LIPA的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL和PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL和LIPA的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL和PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LMF1和APOC2的降低的活性。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL和LIPA的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL和PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LMF1和APOC2的降低的活性的细胞。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码PPT1的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL和LIPA中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL和PPT1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LMF1和APOC2中的一者或多者的基因。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL和LIPA的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL和PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码PPT1的核酸序列，使得PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL和LIPA的核酸序列，使得LPLA2、LPL和LIPA具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的核酸序列，使得BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的核酸序列，使得BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL和PPT1的核酸序列，使得LPLA2、LPL和PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA和PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE以及PPT1的核酸序列，使得SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LMF1和APOC2的核酸序列，使得LMF1和APOC2具有降低的或消除的活性。
在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL和LIPA活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LMF1和APOC2活性。
在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和LIPA活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LMF1和APOC2活性。
附图说明
图1.表格，其示出在三种不同单克隆抗体纯化过程的不同阶段采集的富集样品中发现的酶。
图2.用于产生空白CHO宿主细胞的多重敲除(KO)方法。
图3.表格，其示出在每个空白CHO宿主中已被调节或敲除的基因。
图4A至4C.与亲本宿主细胞相比，PLBL2 KO细胞具有相似的或更好的滴度。由活细胞浓度的积分(IVCC)表示的生长速率如图4A所示。与亲本宿主细胞相比，源自PLBL2-KO宿主细胞系的MAb-A生产池由于更高的比生产力(Qp)(如图4C所示)而具有相当的或更高的滴度(如图4B所示)。
图5A-5C.与亲本宿主细胞相比，3X KO细胞具有相似的或更好的比生产力(Qp)。生长速率如图5A所示。源自3X KO宿主细胞系的MAb-B生产池如图5B所示。mAb-B的比生产力(Qp)如图5C所示。
图6A-6C.7X KO空白宿主性能。由活细胞浓度的积分(IVCC)表示的细胞生长如图6A所示。活力和乳酸积累分别如图6B和6C所示。
图7A-7C.通过7X KO宿主细胞生产三种不同的抗体。表达三种不同mAb的7X KO宿主细胞的生长(如通过IVCC表示)如图7A所示。由7X KO宿主细胞表达的三种不同mAb的滴度如图7B所示。mAb-B、mAb-C和mAb-D的比生产力(Qp)如图7C所示。
图8A-8C.8X KO和Bax Bak KO空白宿主性能。由活细胞浓度的积分(IVCC)表示的细胞生长如图8A所示。活力和乳酸积累分别如图8B和8C所示。
图9A-9C.3X、7X和12X KO空白宿主性能。由活细胞浓度的积分(IVCC)表示的细胞生长如图9A所示。活力和乳酸积累分别如图9B和9C所示。
图10A-10C.通过7X KO宿主细胞克隆生产mAb-2。平均D10滴度如图10A所示。平均D10 IVCC如图10B所示。平均D10 Qp如图10C所示。
图11A-11C.通过7X KO宿主细胞克隆生产mAb-1。滴度如图11A所示。IVCC如图11B所示。Qp如图11C所示。
图12.PS20降解。在7X KO mAb-B生产RMCE池中观察到低PS20降解。
图13A-13K.纯化的酶的SDS PAGE：a.PPT1；b.ASAH1；c.LIPA；d.LPLA1；e.HACH；f.CESB1L；g.LYPLA1；h.SMPD1；i.CES1；j.PLA1A；k.SIAE
图14A至14C.a.在添加重组纯化的水解酶(PPT1、rhLPL、ASAH1、LIPA)后，30mg/mL的mAb 2溶液中的初始PS20浓度百分比，通过使用ELSD的混合模式HPLC测量；b.在添加重组纯化的水解酶(HACH、LYPLA1、CES-B1L、LPLA2)后，配制物缓冲液溶液中的初始PS20浓度百分比，通过使用ELSD的混合模式HPLC测量；c.在添加重组纯化的水解酶(PLA1A、SIAE、CES1、SMPD1)后，配制物缓冲液溶液中的初始PS20浓度百分比，通过使用ELSD的混合模式HPLC测量。
图15.脂肪酶/酯酶KO对纯化的mAb样品中聚山梨醇酯降解的效应。通过PS20降解测定法评估对于纯化的样品中聚山梨醇酯降解的酶活性。对于每个mAb，通过将KO细胞所产生的纯化的材料与对照细胞(即未进行KO)进行比较来评估PS20降解的减少。所有KO mAb生产细胞都是通过用相对应的mAb基因转染CHO空白KO宿主(7X KO或12X KO，如图3所示)产生的。
图16.脂肪酶/酯酶KO对纯化的mAb T样品中聚山梨醇酯降解的效应。通过PS20降解测定法评估对于纯化的mAb T样品中聚山梨醇酯降解的酶活性。通过将KO细胞所产生的纯化的材料与对照细胞(即未进行KO)进行比较来评估PS20降解的减少。所有KO细胞(1X、2X、3X和6X)都是通过依次敲除亲本mAb T细胞系中的脂肪酶/酯酶基因而产生的。
具体实施方式
为清楚起见，但不作为限制，当前公开的主题的详细描述分为以下小节：
5.1 定义；
5.2 调节酶活性；
5.3 包含基因特异性修饰的细胞；
5.4 细胞培养方法；和
5.5 产物。
5.1.定义
在本说明书中使用的术语在本公开的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中通常具有它们在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书的其他地方讨论，以在描述本公开的组合物和方法以及如何制造和使用它们时向从业者提供额外的指导。
如本文所用，当与权利要求和/或说明书中的术语“包含”结合使用时，“一个/种”或“一者”一词的使用可以表示“一个/一种/一者”，但也与“一个一种/一者或多个/多种/多者”、“至少一个/一种/一者”和“一个/一种/一者或超过一个/一种/一者”的含义一致。
本文所使用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”，“含有”及其变体旨在是开放式的过渡性短语、术语或词语，并不排除额外行为或结构的可能性。本公开还考虑其他实施例“包含/包括”本文所提出的实施例或元件、“由其构成”和“基本上由其构成”，无论是否明确提出。
术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，按照本领域中的实践，“约”可以意谓3个或多于3个标准偏差。另选地，“约”可以表示给定值的至多20％，优选地至多10％，更优选地至多5％，并且更优选地至多1％的范围。另选地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，更优选地在2倍以内。
术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于生长哺乳动物细胞的营养液，其通常提供来自以下一个或多个类别的至少一种成分：
1)能量来源，一般以碳水化合物(诸如葡萄糖)的形式存在；
2)所有必需氨基酸，且一般为二十种氨基酸加上半胱氨酸的基本组；
3)需求量在低浓度的维生素和/或其他有机化合物；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素，其中微量元素定义为无机化合物或天然存在的元素，其需求量通常在非常低的浓度，一般在微摩尔范围内。
营养液可以任选地补充有来自以下任何类别的一种或多种成分：
1)激素和其他生长因子，例如胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；
2)盐和缓冲剂，例如钙、镁和磷酸盐；
3)核苷和碱基，例如腺苷、胸苷和次黄嘌呤；和
4)蛋白质和组织水解物。
“培养”细胞是指在适合于细胞存活和/或生长和/或增殖的条件下使细胞与细胞培养基接触。
“分批培养”是指其中在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养生物反应器的培养。
如本文所用，“供料分批细胞培养”是指分批培养，其中首先将细胞和培养基供应至培养生物反应器，并且在培养过程期间将另外的培养营养物连续或以不连续的增量供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。
“灌注培养”，有时称为连续培养，是通过例如过滤、包囊、锚定至微载体等将细胞限制在培养物中的培养，并且连续地、逐步地或间歇地(或其任意组合)引入培养基并将其从培养生物反应器中去除。
如本文所用，术语“细胞”是指动物细胞、哺乳动物细胞、培养的细胞、宿主细胞、重组细胞和重组宿主细胞。此类细胞通常是从哺乳动物组织获得或源自哺乳动物组织的细胞系，当将其置于含有适当营养物质和/或生长因子的培养基中时能够生长和存活。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸可以或已经被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代不需要与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
术语“哺乳动物宿主细胞”或“哺乳动物细胞”是指源自哺乳动物的细胞系，当它们置于单层培养物中或含有适当营养物和生长因子的培养基中的悬浮培养物中时，能够生长和存活。特定细胞系的必需生长因子很容易凭经验确定而无需过度实验，例如MammalianCell Culture(Mather,J.P.编，Plenum Press,N.Y.1984)和Barnes与Sato,(1980)Cell,22:649中所述。通常，细胞能够表达大量特定目标蛋白质例如糖蛋白，并分泌到培养基中。在本公开的上下文中，合适的哺乳动物宿主细胞系的示例可包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub与Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15公开)；CHO-K1(ATCC，CCL-61)；通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.36:59 1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251 1980)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68 1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。在某些实施例中，哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub与Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980)；dp12.CHO细胞(EP 307,247，1989年3月15日公开)。
细胞培养的“生长期”是指细胞通常快速分裂的指数细胞生长期(对数期)。例如，细胞维持在生长期的持续时间可以根据细胞类型、细胞生长速率和/或培养条件而变。在某些实施例中，在这一期间，将细胞培养一段时间，一般在1至4天之间，并且在使细胞生长最大化的条件下。宿主细胞的生长周期的确定可以针对所设想的特定宿主细胞确定，而无需过度实验。“细胞生长最大化的时间段和此类条件下”等是指对于特定细胞系被确定为最适合细胞生长和分裂的那些培养条件。在某些实施例中，在生长期，细胞在含有必需添加剂的营养培养基中培养，通常在约30至40℃在潮湿的受控气氛中培养，从而实现特定细胞系的最佳生长。在某些实施例中，细胞在生长期维持约一天与四天之间的时间段，一般在二至三天之间。
细胞培养物的“生产期”是指细胞生长达到/已达到稳定的时期。对数细胞生长通常在这一时期之前或期间减少，且蛋白质生产接管。在生产期，对数细胞生长已经结束，且蛋白质生产是主要的。在此期间，通常补充培养基以支持持续的蛋白质生产并获得所需的糖蛋白产物。供料分批和/或灌注细胞培养过程补充细胞培养基或在此期间提供新鲜培养基以实现和/或维持所需的细胞密度、活力和/或重组蛋白产物滴度。生产期可以以大规模执行。
如本文所用的关于蛋白质活性的术语“活性”是指蛋白质的任何活性，包括但不限于酶活性、配体结合、药物转运、离子转运、蛋白质定位、受体结合和/或结构活性。这种活性可以通过降低或消除该蛋白质的表达来调节，例如降低或消除，从而降低或消除该蛋白质的存在。这种活性也可以通过改变编码该蛋白质的核酸序列来调节，例如降低或消除，使得所得修饰的蛋白质相对于野生型蛋白质表现出降低的或消除的活性。
本文使用的名称或动词形式的术语“表达”是指在宿主细胞内发生的转录和翻译。宿主细胞中产物基因的表达水平可以基于细胞中存在的相对应mRNA的量或由细胞产生的由产物基因编码的蛋白质的量来确定。例如，从产物基因转录的mRNA理想地通过northern杂交来定量。Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,pp.7.3-7.57(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。由产物基因编码的蛋白可以通过多种方法定量，例如，通过测定蛋白质的生物学活性或通过采用与这种活性无关的测定诸如使用能够与该蛋白质反应的抗体的蛋白质印迹法或放射免疫测定法。Sambrook等人，MolecularCloning:A Laboratory Manual,pp.18.1-18.88(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)。
如本文所用，“多肽”通常是指具有超过约十个氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以与宿主细胞同源或优选地可以是外源性的，这意味着对于所利用的宿主细胞而言，这些多肽是异源的，即，是外来的，诸如中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白质、或由哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在某些实施例中，使用哺乳动物多肽(最初源自哺乳动物生物体的多肽)，更优选那些直接分泌到培养基中的多肽。
术语“蛋白质”意为其链长足以产生更高水平的三级和/或四级结构的氨基酸序列。这是为了与“肽”或其他不具有此类结构的小分子量药物区分开。通常，本文的蛋白质将具有至少约15至20kD的分子量，优选至少约20kD。本文定义中涵盖的蛋白质的示例包括宿主细胞蛋白质以及所有哺乳动物蛋白质，特别是治疗性蛋白质和诊断性蛋白质，诸如治疗性抗体和诊断性抗体，并且一般是含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，“抗体片段”、抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)或抗体的“抗原结合片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合抗原的部分。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAb)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136(2005)。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些实施例中，抗体为IgG1同种型。在某些实施例中，抗体为IgG2同种型。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，该两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
如本文所用，术语“滴度”是指由细胞培养物产生的重组表达抗体的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每毫升或每升培养基中的抗体毫克数为单位(mg/ml或mg/L)。在某些实施例中，滴度以每升培养基中的抗体克数(g/L)表示。滴度可以根据相对测量来表示或评估，例如与在不同培养条件下获得蛋白质产物相比，滴度增加的百分比。
术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，其中所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本公开的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。这种DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见，例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，在线发表于2017年6月12日，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。
如本文所用，术语“载体”是指能够传送与其已经相连接的另一核酸的核酸分子。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体全套库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些方面，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR对应于非人抗体的CDR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域中在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在以下氨基酸残基处的高可变环：26至32(L1)、50至52(L2)、91至96(L3)、26至32(H1)、53至55(H2)和96至101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及
(c)出现在以下氨基酸残基处的抗原接触点：27c至36(L1)、46至55(L2)、89至96(L3)、30至35b(H1)、47至58(H2)，以及93至101(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外指明，否则CDR根据出处同上的Kabat等人所述的方法确定。本领域的技术人员将理解，CDR名称也可以根据出处同上的Chothia所述的方法、出处同上的McCallum所述的方法或者任何其他在科学上接受的命名系统来确定。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据目前公开的主题所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。)单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“细胞密度”是指给定体积培养基中的细胞数量。在某些实施例中，高细胞密度是合乎需要的，因为它可以导致更高的蛋白质生产力。可以通过本领域已知的任何技术监测细胞密度，包括但不限于从培养物中提取样品并在显微镜下分析细胞，使用可商购的细胞计数装置或通过使用可商购的合适的探针引入生物反应器本身(或进入一个循环，培养基和悬浮细胞通过该循环然后返回生物反应器)。
如本文所用，术语“重组细胞”是指具有来自它们所源自的原始亲本细胞的一些遗传修饰的细胞。这种遗传修饰可以是引入异源基因以表达基因产物(例如，重组蛋白)的结果。
如本文所用，术语“重组蛋白”通常是指肽和蛋白质，包括抗体。这种重组蛋白是“异源的”，即对于所利用的宿主细胞是外源的，诸如由CHO细胞产生的抗体。
术语“PS20”是指聚山梨醇酯20或吐温20。术语“PS80”是指聚山梨醇酯80或吐温80。PS20和PS80是具有脂肪酸酯部分和长聚氧乙烯链的聚山梨醇酯表面活性剂。
5.2.调节酶活性
在某些实施例中，本公开涉及用于调节一种或多种宿主细胞蛋白质的活性，例如酶活性的方法，该蛋白质包括但不限于脂肪酶、酯酶或水解酶。例如，但不限于，用于调节宿主细胞中酶活性(包括但不限于脂肪酶、酯酶和/或水解酶蛋白)的方法包括降低或消除相对应多肽的活性。在某些实施例中，重组宿主细胞经修饰以相对于未修饰细胞中一种或多种宿主细胞蛋白质的活性降低或消除该蛋白质的活性。在某些实施例中，脂蛋白脂肪酶(LPL)；含磷脂酶B结构域蛋白(PLBL2/PLBD2)；脂肪酶A(溶酶体酸性脂肪酶/胆固醇酯水解酶，脂肪酶)(LIPA)；磷脂酶A-2活化蛋白(PLAA)；磷脂酶D3(PLD3)；磷脂酶A2组(LPLA2)；磷脂酶Cβ1(PLCB1)；磷脂酶Cδ1(PLCD1)；含DDHD结构域的蛋白质1(片段)(DDHD1)；溶血磷脂酶样蛋白1(LYPLAL1)；磷脂酶A2组XIIA(PLA2G12A)；过氧化物氧还蛋白6(PRDX6)；鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)；棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)；乙酸异戊酯水解酯酶1(IAH1)；OTU去泛素化酶，泛素醛结合蛋白1(OTUB1)；溶血磷脂酶2(酰基蛋白硫酯酶2)(LYPLA2)；酰基辅酶A硫酯酶13(ACOT13)；脂肪酸合酶(FASN)；磷脂酶A2组VII(PLA2G7)；泛素特异性肽酶5(USP5)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(酸性神经酰胺酶)(ASAH1)；脂肪酶成熟因子1(LMF1)；载脂蛋白CII(APOC2)；酰基肉碱水解酶(HACH)；羧酸酯酶1F(CES1F)或肝羧酸酯酶B-1样(CES-B1L)；溶血磷脂酶1(LYPLA1)；羧酸酯酶1(CES1)；磷脂酶A1成员A(PLA1A)；和唾液酸乙酰酯酶(SIAE)的活性被降低或消除。
在某些实施例中，PPT1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL和LIPA的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的活性被降低或消除。在某些实施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SPD1的活性被降低或消除。在某些实施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL和PPT1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的活性被降低或消除。在某些实施例中，HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性被降低或消除。在某些实施例中，SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性被降低或消除。在某些实施例中，LMF1和APOC2的活性被降低或消除。
在某些实施例中，参考细胞为其中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性未经调节例如降低或消除的细胞。在某些实施例中，参考细胞为包含编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。例如，但不限于，参考细胞为具有编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的两个野生型等位基因的细胞。在某些实施例中，参考细胞为WT CHO细胞。
在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的不超过约90％、不超过约80％、不超过约70％、不超过约60％、不超过约50％、不超过约40％、不超过约30％、不超过约20％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的不超过约40％。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的不超过约90％、不超过约80％、不超过约70％、不超过约60％、不超过约50％、不超过约40％、不超过约30％、不超过约20％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞的相对应多肽活性的约1％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约1％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约1％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约1％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约1％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约1％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约1％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约1％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约1％与约10％之间、约5％与约10％之间、约5％与约20％之间、约5％与约30％之间、约5％与约40％之间。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞的相对应多肽活性的约1％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约1％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约1％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约1％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约1％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约1％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约1％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约1％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约1％与约10％之间、约5％与约10％之间、约5％与约20％之间、约5％与约30％之间、约5％与约40％之间。
在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的约5％与约40％之间。在某些实施例中，在已经过修饰以降低或消除多肽的活性的细胞中，该多肽的活性为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽活性的约5％与约40％之间。在不同的参考细胞(例如，包含相对应基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞)中，多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性可变。
在某些实施例中，基因工程系统用来调节(例如，降低或消除)特定多肽的活性(例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE活性)。本领域已知的各种基因工程系统可用于本文所公开的方法。此类系统的非限制性示例包括CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统以及使用通过基因沉默进行蛋白质敲低的其他工具，诸如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和microRNA(miRNA)。本领域已知的任何CRISPR/Cas系统，包括传统的、增强的或修饰的Cas系统，以及其他基于细菌的基因组切除工具诸如Cpf-1，都可以与本文所公开的方法一起使用。
在某些实施例中，基因例如编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的一部分经修饰以降低或消除相对应多肽的活性。在某些实施例中，至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％的该基因经修饰。在某些实施例中，不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％或不超过约90％的该基因经修饰。在某些实施例中，约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间的该基因经修饰。
在某些实施例中，本公开涉及用于调节宿主细胞中一种或多种基因(例如，编码酶的基因，该酶包括但不限于脂肪酶、酯酶或水解酶)的活性的方法。例如，但不限于，用于调节宿主细胞中一种或多种酶基因(包括但不限于脂肪酶、酯酶和/或水解酶基因)的活性的方法包括敲除或敲低该细胞中相对应多肽的表达。在某些实施例中，LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，PLBL2的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL和LIPA的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL和PPT1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH\CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH\CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH\CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达被敲低或敲除。在某些实施例中，LMF1和APOC2的表达被敲低或敲除。如本文所用，敲除表达是指，与参考细胞相比，消除细胞中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。如本文所用，敲低表达是指，与参考细胞相比，降低细胞中多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。
在某些实施例中，参考细胞为其中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达未经调节例如降低的细胞。在某些实施例中，参考细胞为包含编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。例如，但不限于，参考细胞为具有编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的两个野生型等位基因的细胞。在某些实施例中，参考细胞为WT CHO细胞。
在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞中相对应多肽表达的小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽表达的小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞中相对应多肽表达的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽表达的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以敲低特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞中相对应多肽表达的不超过约90％、不超过约80％、不超过约70％、不超过约60％、不超过约50％、不超过约40％、不超过约30％、不超过约20％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽表达的不超过约40％。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞中相对应多肽表达的不超过约90％、不超过约80％、不超过约70％、不超过约60％、不超过约50％、不超过约40％、不超过约30％、不超过约20％、不超过约10％、不超过约5％、不超过约4％、不超过约3％、不超过约2％或不超过约1％。
在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞的相对应多肽表达的约1％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约1％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约1％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约1％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约1％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约1％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约1％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约1％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约1％与约10％之间、约5％与约10％之间、约5％与约20％之间、约5％与约30％之间、约5％与约40％之间。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WTCHO细胞的相对应多肽表达的约1％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约1％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约1％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约1％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约1％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约1％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约1％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约1％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约1％与约10％之间、约5％与约10％之间、约5％与约20％之间、约5％与约30％之间、约5％与约40％之间。
在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽表达的约5％与约40％之间。在某些实施例中，在已经过修饰以敲低多肽的表达的细胞中，该多肽的表达为参考细胞例如WT CHO细胞中相对应多肽表达的约5％与约40％之间。在不同的参考细胞(例如，包含相对应基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞)中，多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达水平可变。
在某些实施例中，基因工程系统用来调节(例如，敲低)特定多肽的表达(例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE表达)。本领域已知的各种基因工程系统可用于本文所公开的方法。此类系统的非限制性示例包括CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统以及使用通过基因沉默进行蛋白质敲低的其他工具，诸如小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和microRNA(miRNA)。本领域已知的任何CRISPR/Cas系统，包括传统的、增强的或修饰的Cas系统，以及其他基于细菌的基因组切除工具诸如Cpf-1，都可以与本文所公开的方法一起使用。
在某些实施例中，基因例如编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因的一部分缺失以敲低或敲除相对应多肽的表达。在某些实施例中，至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％的该基因缺失。在某些实施例中，不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％或不超过约90％的该基因缺失。在某些实施例中，约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％之间、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间的该基因缺失。
在某些实施例中，编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的基因的至少一个外显子至少部分地缺失。如本文所用，“部分地缺失”是指，例如，外显子的至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、不超过约2％、不超过约5％、不超过约10％、不超过约15％、不超过约20％、不超过约25％、不超过约30％、不超过约35％、不超过约40％、不超过约45％、不超过约50％、不超过约55％、不超过约60％、不超过约65％、不超过约70％、不超过约75％、不超过约80％、不超过约85％、不超过约90％、不超过约95％、约2％与约90％之间、约10％与约90％之间、约20％与约90％之间、约25％与约90％之间、约30％与约90％之间、约40％与约90％之间、约50％与约90％之间、约60％与约90％之间、约70％与约90％之间、约80％与约90％之间、约85％与约90％之间、约2％与约80％之间、约10％与约80％之间、约20％与约80％之间、约30％与约80％之间、约40％与约80％之间、约50％与约80％之间、约60％与约80％之间、约70％与约80％之间、约75％与约80％之间、约2％与约70％之间、约10％与约70％之间、约20％与约70％之间、约30％与约70％之间、约40％与约70％之间、约50％与约70％之间、约60％与约70％之间、约65％与约70％之间、约2％与约60％之间、约10％与约60％之间、约20％与约60％之间、约30％与约60％之间、约40％与约60％之间、约50％与约60％之间、约55％与约60％之间、约2％与约50％之间、约10％与约50％之间、约20％与约50％之间、约30％与约50％之间、约40％与约50％之间、约45％与约50％之间、约2％与约40％之间、约10％与约40％之间、约20％与约40％之间、约30％与约40％之间、约35％与约40％之间、约2％与约30％之间、约10％与约30％之间、约20％与约30％之间、约25％与约30％之间、约2％与约20％之间、约5％与约20％之间、约10％与约20％之间、约15％与约20％、约2％与约10％之间、约5％与约10％之间或约2％与约5％之间的区缺失。
在某些非限制性实施例中，CRISPR/Cas9系统用来调节多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。成簇的规则间隔短回文重复(CRISPR)系统为在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(一种能够利用crRNA作为其向导来修饰DNA的蛋白质)、CRISPR RNA(crRNA，其含有：RNA，该RNA由Cas9使用以将其引导到宿主DNA的正确片段；以及一个区，该区结合至tracrRNA(通常以发夹环形式)，与Cas9形成活性复合物)，和反式活化crRNA(tracrRNA，其结合至crRNA并与Cas9形成活性复合物)。术语“向导RNA”和“gRNA”是指促进RNA引导的核酸酶(诸如Cas9)与靶序列(例如细胞中的基因组或游离序列)特异性缔合(或“靶向”)的任何核酸。gRNA可以是单分子的(包含单个RNA分子，且替代性地称为嵌合的)或模块化的(包含一个以上，通常是两个独立的RNA分子，诸如crRNA和tracrRNA，它们通常彼此缔合，例如通过双工化)。
CRISPR/Cas9策略可采用载体来转染哺乳动物细胞。向导RNA(gRNA)可以针对每种应用进行设计，因为这是Cas9用来鉴定并直接结合至细胞中靶DNA的序列。多个crRNA和该tracrRNA可以包装在一起以形成单向导RNA(sgRNA)。sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并制成载体，以便转染到细胞中。
在某些实施例中，用于调节一种或多种多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的CRISPR/Cas9系统包含Cas9分子和一个或多个gRNA，该gRNA包含与编码目标多肽的基因的靶序列互补的靶向结构域。在某些实施例中，靶基因是编码目标多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的基因的区。靶序列可以是基因内的任何外显子或内含子区。
在某些实施例中，将gRNA在单个载体中施用于细胞，并且将Cas9分子在第二载体中施用于细胞。在某些实施例中，将gRNA和Cas9分子在单个载体中施用于细胞。替代性地，每个gRNA和Cas9分子都可以通过独立的载体施用。在某些实施例中，CRISPR/Cas9系统可以作为包含与一种或多种gRNA复合的Cas9蛋白的核糖核蛋白复合物(RNP)递送至细胞，例如，通过电穿孔递送(参见，例如，DeWitt等人,Methods 121-122:9-15(2017)关于将RNP递送至细胞的其他方法)。在某些实施例中，将CRISPR/Cas9系统施用于细胞导致多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达的敲除或敲低。
在某些实施例中，基因工程系统为ZFN系统，其用于调节哺乳动物细胞中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。ZFN可以用作限制性内切酶，它是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域结合而产生的。可以对锌指结构域进行工程改造以靶向特定的DNA序列，从而使锌指核酸酶靶向基因组内的所需序列。各个ZFN的DNA结合结构域通常包括多个单独的锌指重复序列，并且每个锌指重复序列都可以识别多个碱基对。生成新锌指结构域的最常用方法是组合已知特异性的较小锌指“模块”。ZFN中最常见的切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。ZFN通过在靶DNA序列中产生双链断裂(DSB)来调节蛋白质的表达，在没有同源模板的情况下，双链断裂将会通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复。这种修复可导致碱基对的缺失或插入，产生移码并阻止有害蛋白质的产生(Durai等人,Nucleic Acids Res.；33(18):5978–90(2005))。多对ZFN也可用于完全去除基因组序列的整个大片段(Lee等人,Genome Res.；20(1):81–9(2010))。
在某些实施例中，基因工程系统为TALEN系统，其用于调节哺乳动物细胞中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。TALEN为限制性内切酶，其可以通过工程改造来切割特定的DNA序列。TALEN系统的运行原理与ZFN相似。TALEN是通过将转录活化因子样效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域相结合而产生的。转录活化因子样效应子(TALE)由33至34个氨基酸重复基序组成，具有两个可变位置，对特定核苷酸具有很强的识别能力。通过组装这些TALE的阵列，可以对TALE DNA结合结构域进行工程改造以结合所需的DNA序列，从而引导核酸酶在基因组中的特定位置切割(Boch等人,Nature Biotechnology；29(2):135-6(2011))。在某些实施例中，靶基因编码BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，可使用具有与相对应核酸(例如，mRNA)互补的序列的寡核苷酸来敲低特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的表达。此类寡核苷酸的非限制性示例包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微小RNA(miRNA)。在某些实施例中，此类寡核苷酸可以与BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE核酸序列的至少一部分同源，其中该部分相对于相对应核酸序列的同源性为至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％。在某些非限制性实施例中，该互补部分可构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少30个核苷酸，且反义核酸、shRNA、mRNA或siRNA分子的长度可至多15或至多20或至多25或至多30或至多35或至多40或至多45或至多50或至多75或至多100个核苷酸。反义核酸、shRNA、mRNA或siRNA分子可以包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如但不限于，硫代磷酸酯残基。
可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体诸如γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体)将本文所公开的基因工程系统递送到哺乳动物细胞中。逆转录病毒载体和适当的包装线的组合是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人类细胞的功能。各种生产两性病毒的细胞系是已知的，包括但不限于PA12(Miller,等人(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller,等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos,等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非两性颗粒也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜和本领域已知的任何其他颗粒假型化的颗粒。可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如，通过Bregni等人(1992)Blood 80:1418-1422的方法；或用单独的病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种培养，例如，通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22:223-230和Hughes,等人(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。
其他转导病毒载体可用于修饰本文所公开的哺乳动物细胞。在某些实施例中，所选择的载体表现出高效的感染以及稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等人,HumanGene Therapy 8:423-430,1997；Kido等人,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology 71:6641-6649,1997；Naldini等人,Science 272:263-267,1996；和Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，诸如Epstein-Barr病毒(也参见，例如，Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev等人,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet337:1277-1278,1991；Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等人,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle等人,Science259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:77S-83S,1995的载体)。逆转录病毒载体尤其得到充分开发并已用于临床环境(Rosenberg等人,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson等人，美国专利号5,399,346)。
非病毒方法也可用于本文所公开的哺乳动物细胞的基因工程。例如，可以通过以下方式将核酸分子引入哺乳动物细胞：在脂质转染存在下施用核酸(Feigner等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham等人,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger等人,Methods inEnzymology 101:512,1983)，去唾液酸糖粘蛋白-聚赖氨酸结合(Wu等人,Journal ofBiological Chemistry 263:14621,1988；Wu等人,Journal of Biological Chemistry264:16985,1989)，或通过在手术条件下微注射(Wolff等人,Science 247:1465,1990)。其他用于基因转移的非病毒方法包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可能有利于将核酸分子递送到细胞中。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过以下方式来完成：将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中，然后将该细胞(或其后代)注射到目标组织或全身注射。
5.3包含基因特异性修饰的细胞
一方面，本公开涉及细胞或包含一种或多种细胞(例如，哺乳动物细胞)的组合物，该细胞具有降低的或消除的一种或多种多肽(例如，一种或多种酶，例如，一种或多种脂肪酶、酯酶和/或水解酶)的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的PLBL2的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和LIPA的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和PPT1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的PPT1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的活性。在某些实施例中，细胞具有降低的或消除的LMF1和APOC2的活性。
如本文所用，消除的活性是指，与参考细胞相比，消除细胞中特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的消除。如本文所用，降低的活性是指，与参考细胞相比，降低细胞中多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的降低。
可与本公开主题关联使用的细胞的非限制性示例包括CHO细胞(例如，DHFR CHO细胞)、dp12.CHO细胞、CHO-K1(ATCC、CCL-61)、通过SV40转染的猴肾CV1系(例如，COS-7ATCCCRL-1651)、人胚肾系(例如，亚克隆以在悬浮培养中生长的293或293细胞)、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、小鼠支持细胞(例如TM4)、猴肾细胞(例如CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如VERO-76、ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如HELA、ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK、ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝细胞(例如，BRL 3A、ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138、ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如，Hep G2、HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤(例如，MMT 060562、ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝癌细胞系(例如Hep G2)、骨髓瘤细胞系(例如，Y0、NS0和Sp2/0)。在某些实施例中，细胞为CHO细胞。CHO宿主细胞的其他非限制性示例包括CHO K1SV细胞、CHO DG44细胞、CHO DUKXB-11细胞、CHOK1S细胞和CHOK1M细胞。
在某些实施例中，本文所公开的细胞表达目标产物。在某些实施例中，目标产物为重组蛋白。在某些实施例中，目标产物为单克隆抗体。目标产物的其他非限制性示例在第5.5节中提供。
在某些实施例中，本文所公开的细胞可用于生产商业上有用的量的目标产物。在某些实施例中，本文所公开的细胞至少部分地经由诱导生产过程的组分相对于参考细胞(例如，WT CHO)降低的降解水平来促进商业上有用的量的目标产物的生产。在某些实施例中，生产过程的组分为含脂质的组分。在某些实施例中，含脂质的组分为洗涤剂。在某些实施例中，洗涤剂为含聚山梨醇酯的组分。在某些实施例中，含聚山梨醇酯的组分为PS20(聚山梨醇酯20或吐温20)。在某些实施例中，含聚山梨醇酯的组分为PS80(聚山梨醇酯80或吐温80)。在某些实施例中，本公开的细胞可以将生产过程的组分例如PS20的降解降低至使用参考细胞(例如，WT CHO细胞)时观察到的相对应PS20降解的小于约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％。
在某些实施例中，本文所公开的细胞可包含编码目标产物的核酸。在某些实施例中，核酸可以存在于一种或多种载体(例如，表达载体)中。载体的一种类型是“质粒”，其是指另外的DNA链段可以连接到其中的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA链段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞(诸如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)中自主复制。在导入宿主细胞中之后，将其他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体(表达载体)能够引导与其可操作地连接的核酸的表达。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。用于本公开中的表达载体的其他非限制性示例包括起到等效功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在某些实施例中，可以将编码目标产物的核酸引入宿主细胞中，如本文所公开。在某些实施例中，可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞中，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施例中，宿主细胞为真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
在某些实施例中，编码目标产物的核酸可以随机整合到宿主细胞基因组中(“随机整合”或“RI”)。例如，但不限于，编码目标产物的核酸可以随机整合到细胞基因组中，该细胞已经过调节以具有降低的或消除的特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性。
在某些实施例中，编码目标产物的核酸可以以靶向方式整合到宿主细胞基因组中(“靶向整合”或“TI”)。例如，但不限于，编码目标产物的核酸可以以靶向方式整合到细胞基因组中，该细胞已经过调节以具有降低的或消除的特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性。“整合位点”包含宿主细胞基因组内的核酸序列，向其中插入外源核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点在宿主细胞基因组上的两个相邻核苷酸之间。在某些实施例中，整合位点包括一段核苷酸序列。在某些实施例中，整合位点位于CHO宿主细胞基因组的特定基因座内。在某些实施例中，整合位点在CHO宿主细胞的内源基因内。本领域已知的任何整合位点都可以经调节且与本文所公开的主题一起使用。靶向整合可由本领域中已知的方法和系统介导。例如但不限于，2018年12月21日提交的国际申请号PCT/US18/067070(其内容以其整体并入本文)中公开的方法和系统，可用于靶向整合。
在某些实施例中，可以使用基于转座酶的整合将编码目标产物的核酸整合到宿主细胞基因组中。例如，在Trubitsyna等人,Nucleic Acids Res.45(10):e89(2017)、Li等人,PNAS 110(25):E2279-E2287(2013)和WO2004/009792中公开了基于转座酶的整合技术，这些文献通过引用以其整体并入本文。
在某些实施例中，编码目标产物的核酸可以随机整合到宿主细胞基因组中(“随机整合”或“RI”)。在某些实施例中，随机整合可由本领域中已知的任何方法或系统介导。在某些实施例中，随机整合由MaxCyte
Figure BDA0003859258760000571
电穿孔系统介导。
在某些实施例中，靶向整合可与随机整合组合。在某些实施例中，靶向整合可在随机整合之后。在某些实施例中，随机整合之后可以是靶向整合。例如，但不限于，编码目标产物的核酸可以随机整合到细胞基因组中，该细胞已经过调节以具有降低的或消除的特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性，且编码相同目标产物的核酸可以以靶向方式整合到该细胞基因组中。
在某些实施例中，本文所公开的宿主细胞包含一种或多种改变的酶基因。在某些实施例中，对酶基因的改变降低或消除了该酶的活性。在某些实施例中，本文所公开的宿主细胞包含一种或多种改变的LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE基因。在某些实施例中，改变的LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE基因的后续转录物编码具有降低的或消除的活性的蛋白质。在某些实施例中，该一种或多种改变的酶基因通过编码区的破坏而得到改变。在某些实施例中，基因改变包括双等位基因改变。在某些实施例中，酶基因改变包括1个或更多个碱基对、2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对或20个或更多个碱基对的缺失。
5.4.细胞培养方法
一方面，本公开提供一种用于生产目标产物的方法，其包括培养本文所公开的细胞。本领域已知的用于哺乳动物细胞的合适培养条件可用于培养本文的细胞(J.Immunol.Methods(1983)56:221-234)或可由技术人员容易地确定(参见，例如，AnimalCell Culture:A Practical Approach 2nd Ed.,Rickwood,D.和Hames,B.D.编，OxfordUniversity Press,New York(1992))。
哺乳动物细胞培养物可以在适合被培养的特定细胞的培养基中制备。市售培养基诸如Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM，Sigma)是示例性的营养液。此外，Ham和Wallace,(1979)Meth.Enz.,58:44；Barnes和Sato,(1980)Anal.Biochem.,102:255；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、5,122,469或美国专利号4,560,655；国际公开号WO 90/03430和WO 87/00195(所有这些文献的公开内容通过引用并入本文)中描述的任何培养基可用作培养基。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素(正泰霉素))、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)、脂质(诸如亚油酸或其他脂肪酸)及其合适的载体以及葡萄糖或等效能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。
在某些实施例中，已经过修饰以降低和/或消除特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的哺乳动物细胞为CHO细胞。任何合适的培养基都可用于培养CHO细胞。在某些实施例中，用于培养CHO细胞的合适培养基可以含有基础培养基成分，诸如基于DMEM/HAM F-12的配制物(对于DMEM和HAM F12培养基的组成，参见American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines andHybridomas，第六版，1988年，第346至349页中的培养基配制物)(如美国专利号5,122,469中所述的培养基配制物特别合适)，改变一些组分诸如氨基酸、盐、糖和维生素的浓度，并且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤和胸苷；重组人胰岛素、水解蛋白胨，诸如Primatone HS或Primatone RL(Sheffield,England)或等效物；细胞保护剂，诸如Pluronic F68或等效的Pluronic多元醇；庆大霉素；和微量元素。
在某些实施例中，已经过修饰以降低和/或消除特定多肽例如BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE多肽的活性的哺乳动物细胞为表达重组蛋白的细胞。重组蛋白可以通过在多种细胞培养条件下培养表达目标产物的细胞来生产。例如，用于大规模或小规模蛋白质生产的细胞培养程序在本公开内容的范围内可能是有用的。在后两种系统中，可以使用包括但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养、摇瓶培养或搅拌罐生物反应器系统的程序，使用或不使用微载体，并且替代性地以分批、供料分批或连续模式操作。
在某些实施例中，本公开的细胞培养在搅拌罐生物反应器系统中进行并且采用供料分批培养程序。在供料分批培养中，最初将哺乳动物宿主细胞和培养基供应至培养皿，并且在培养期间将另外的培养营养物连续或以不连续的增量供料至培养物，在终止培养之前进行或不进行定期的细胞和/或产物收获。供料分批培养可以包括例如半连续供料分批培养，其中周期性地去除全培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基代替。供料分批培养与简单分配培养的区别之处在于，在供料分批培养中，在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应至培养皿。供料分批培养可以进一步与灌注培养区别开来，因为在供料分批培养过程中上清液没有从培养容器中去除(在灌注培养中，细胞通过例如过滤、封装、锚定到微载体等而被限制在培养物中，并且培养基连续或间歇地引入并从培养容器中去除)。
在某些实施例中，培养物中的细胞可以根据适用于特定宿主细胞和预期的特定生产计划的任何方案或程序进行增殖。因此，本公开预期了单步或多步培养程序。在单步培养中，将宿主细胞接种到培养环境中，并且在细胞培养的单个生产期内采用本公开的过程。替代性地，设想了一种多阶段培养。在多阶段培养中，细胞可以在多个步骤或时期内培养。例如，细胞可以在第一步或生长期培养中生长，其中将可能从储存中取出的细胞接种到适合促进生长和高活力的培养基中。通过向宿主细胞培养物中添加新鲜培养基，可以将细胞维持在生长期一段合适的时间。
在某些实施例中，设计供料分批或连续细胞培养条件以增强哺乳动物细胞在细胞培养的生长期内的生长。在生长期，细胞在使生长最大化的条件下生长一段时间。培养条件，诸如温度、pH、溶解氧(dO2)等，是那些与特定宿主一起使用的条件，且对普通技术人员而言将会是显而易见的。通常，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH值调节到约6.5与7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞诸如CHO细胞的合适温度范围为约30℃至38℃，合适的dO2为空气饱和度的5％-90％之间。
在特定阶段，细胞可用于接种细胞培养的生产期或步骤。替代性地，如上所述，生产期或步骤可以与接种或生长期或步骤连续。
在某些实施例中，本公开中描述的培养方法可以进一步包括从细胞培养物例如从细胞培养物的生产期收获产物。在某些实施例中，通过本公开的细胞培养方法生产的产物可以从第三生物反应器例如生产生物反应器中收获。例如，但不限于，所公开的方法可以包括在细胞培养物的生产期完成时收获产物。替代性地或另外地，可以在生产期完成之前收获产物。在某些实施例中，一旦达到特定的细胞密度，就可以从细胞培养物中收获产物。例如，但不限于，细胞密度在收获前可以是约2.0x107个细胞/mL至约5.0x107个细胞/mL。
在某些实施例中，从细胞培养物中收获产物可以包括离心、过滤、声波分离、絮凝和细胞去除技术中的一种或多种。
在某些实施例中，目标产物可以从宿主细胞分泌或者可以是膜结合蛋白、胞质蛋白或核蛋白。在某些实施例中，可溶形式的多肽可以从条件细胞培养基中纯化，并且膜结合形式的多肽可以通过从表达细胞制备总膜级分并用非离子洗涤剂诸如
Figure BDA0003859258760000611
X-100(EMD Biosciences,San Diego,Calif.)提取该膜来纯化。在某些实施例中，可以通过裂解宿主细胞(例如，通过机械力、超声处理和/或洗涤剂)、通过离心去除细胞膜级分并保留上清液来制备胞质蛋白或核蛋白。
5.5产物
本公开的细胞和/或方法可用于生产可由本文所公开的细胞表达的任何目标产物。在某些实施例中，本公开的细胞和/或方法可用于生产多肽，例如，哺乳动物多肽。在某些实施例中，本公开的方法可用于生产病毒颗粒。在某些实施例中，本公开的方法可用于生产病毒载体。此类多肽的非限制性实例包括激素、受体、融合蛋白、调节因子、生长因子、补体系统因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、细胞因子、CD蛋白、白介素、治疗性蛋白质、诊断蛋白质和抗体。本公开的细胞和/或方法对正在生产的分子(例如，抗体)不是特异性的。
在某些实施例中，本公开的方法可用于生产抗体，包括治疗性和诊断性抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，通过本公开的细胞和方法生产的抗体可以是但不限于单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括此类配对的多聚体)、多特异性抗体及其抗原结合片段。例如，但不限于，多特异性抗体可以是双特异性抗体、双表位抗体、T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)、双重作用FAb(DAF)或其抗原结合片段。
5.5.1多特异性抗体
在某些方面，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体为多特异性抗体，例如，双特异性抗体。“多特异性抗体”为单克隆抗体，其对于至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位)具有结合特异性(即，双特异性的)或对于相同抗原上的不同表位具有结合特异性(即，双表位的)。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。可以将多特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段，如本文所述。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature305:537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见，例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26(1997))。多特异性抗体也可通过以下方法来制备：工程化静电转向效应，以用于制备抗体Fc-异源二聚体分子(参见，例如，WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见，例如，WO 98/50431)；使用制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如Tutt等人J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见，例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他非限制性示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”(参见，例如，US2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见，例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见，例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见，例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS,108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在某些实施例中，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见，例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见，例如Spiess等人，Mol.Immunol.67(2015)95-106)。
在某些实施例中，本文还包括的一种特定类型的多特异性抗体是这样的双特异性抗体，该双特异性抗体设计用于同时结合靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原和T细胞受体(TCR)复合物的活化不变组分(诸如CD3)，以用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。
可用于此目标的双特异性抗体形式的其他非限制性示例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞接合子)分子，其中两个scFv分子通过柔性接头融合(参见，例如，WO2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261和WO 2008/119567；Nagorsen和
Figure BDA0003859258760000631
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人，Prot.Eng.9,299-305(1996))及其衍生物，诸如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人，J Mol Biol 293,41--56(1999))；“DART”(双重亲和力再靶向)分子，其基于双体抗体形式但特征是具有用于实现额外稳定化的C-末端二硫桥(Johnson等人，J Mol Biol 399,436-449(2010))，以及所谓的三功能抗体(triomab)，其是全杂交小鼠/大鼠IgG分子(综述于Seimetz等人,CancerTreat.Rev.36,458-467(2010)中)。本文所包含的特定的T细胞双特异性抗体形式描述于以下文献中：WO 2013/026833；WO 2013/026839；WO 2016/020309；Bacac等人，Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498。
5.5.2抗体片段
在某些方面，通过本文所提供的细胞和方法产生的抗体为抗体片段。例如，但不限于，抗体片段为Fab'、Fab'-SH或F(ab')2片段，特别是Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域(分别为VH和VL)以及轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，术语“Fab片段”是指包括VL结构域和CL结构域的轻链以及包括VH结构域和CH1结构域的重链片段的抗体片段。“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在CH1结构域的羧基端添加残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是Fab'片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，该片段具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，请参见美国专利号5,869,046。
在某些实施例中，抗体片段为双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”为具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO1993/01161；Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。
在另一个方面，抗体片段为单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中抗体结构域和接头在N末端至C末端方向上具有以下顺序中的一种：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1，或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸，优选地在32个与50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL结构域与CH1结构域之间的天然二硫键而稳定化。此外，这些单链Fab片段可以通过经由插入半胱氨酸残基(例如，根据Kabat编号的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键，而进一步稳定化。
在另一方面，抗体片段是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的融合蛋白，是通过接头连接的。特别地，接头为10个至约25个氨基酸的短多肽，并且通常富含甘氨酸以获得柔性，以及富含丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并且引入了接头，但该蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün,在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)中；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。
在另一方面，抗体片段是单结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者抗体的全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单结构域抗体为人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。
5.5.3嵌合抗体和人源化抗体
在某些方面，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体为嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如，美国专利号4,816,567和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中。在一个实例中，嵌合抗体包括非人可变区(例如，来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(诸如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体为其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些方面，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以减少对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中CDR(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在某些实施例中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源于的抗体)的相应残基取代，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面再塑”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述用于FR改组的“指导选择”方法)中。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见，例如，Sims等人J.Immunol.151:2296(1993))；来源于轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见，例如，Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；以及Presta等人J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro和Fransson，Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及来源于筛选FR文库的框架区(参见，例如，Baca等人，J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
5.5.4人抗体
在某些方面，通过本文提供的细胞和方法生产的抗体为人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr OpinPharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg，Curr Opin Immunol.20:450-459(2008)中。
可以通过以下方式来制备人抗体：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以响应于抗原激发而产生具有人可变区的完整人抗体或完整抗体。此类动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，所述全部或部分人免疫球蛋白基因座替代内源性免疫球蛋白基因座，或者在动物的染色体外存在或随机整合至动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0003859258760000661
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0003859258760000662
技术的美国专利号7,041,870，以及描述
Figure BDA0003859258760000671
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自由此类动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞系。(参见，例如Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；以及Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991)。)经由人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也如Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103:3557-3562(2006)中所述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(描述了人-人杂交瘤)中描述的那些方法。人杂交瘤技术(Trioma技术)描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中。
5.5.5靶分子
可通过本文公开的细胞和方法生产的抗体靶向的分子的非限制性示例包括可溶性血清蛋白及其受体和其他膜结合蛋白(例如，粘附素)。在某些实施例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的抗体能够结合至选自由以下项组成的组的一种、两种或更多种细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO.k
在某些实施例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的抗体能够结合至选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子相关蛋白质：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在某些实施例中，通过本文所公开的方法生产的抗体(例如，多特异性抗体诸如双特异性抗体)能够结合至选自以下的一种或多种靶分子：0772P(CA125、MUC16)即，卵巢癌抗原)；ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；淀粉样蛋白β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1(含有天冬氨酸β-水解酶结构域的蛋白质1；LOC253982)；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R(B细胞活化因子受体)；BLyS受体3，BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B(骨形态发生蛋白受体IB型)；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；短蛋白聚糖；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A(CD79α，免疫球蛋白相关α，一种B细胞特异性蛋白质)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(claudin-7)；CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)；CLN3；CLU(丛生蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；补体因子D；CR2；CRP；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子)；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种G蛋白偶联受体)；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16(LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR(B型内皮素受体)；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81(FKSG80)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DOB(II类MHC分子的β亚基(Ia抗原))；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2,ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；甲型流感；乙型流感；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；α4β7和αEβ7整合素异源二聚体；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC框BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦素)；LGR5(含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合体，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合体，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合体，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞强化因子、间皮素；MS4A1；MSG783(RNF124、假定蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3(metallothionectin-111)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MY088；Napi3b(也称为NaPi2b)(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质运载蛋白家族34(磷酸钠)成员2，II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；NCA；NCK2；神经粘蛋白；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸酶蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17(silver同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21 Rac2)；RARB；RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲质素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYEI(内皮单核细胞活化细胞因子)；SDF2；Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin 5bHlog、sema结构域、七血小板反应蛋白重复序列(1型和1样型)、跨膜结构域(TM)和短胞质结构域(semaphorin)5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP(前列腺六跨膜上皮抗原)；STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六跨膜上皮抗原2、六跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板反应蛋白1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1(具有EGF样结构域和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；TMEM46(shisa同源物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；versican；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和ZFPM2。
在某些实施例中，通过本文所公开的方法产生的抗体能够结合至CD蛋白质，诸如CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/爱泼斯坦-巴尔病毒受体)或Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29)；ErbB受体家族的CD200成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整合素和αv/β3整合素，包括其α亚基或β亚基(例如，抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(αIFN)；TNFα、白介素，诸如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F蛋白、蛋白C等。
在某些实施例中，本文所提供的细胞和方法可用于生产抗体(或多特异性抗体，诸如双特异性抗体)，该抗体特异性地结合至补体蛋白C5(例如，特异性地结合至人C5的抗C5激动剂抗体)。在某些实施例中，抗C5抗体包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含SSYYMA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含GASETES(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QNTKVGSSYGNT(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。例如，在某些实施例中，抗C5抗体包含重链可变结构域(VH)序列，该VH序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含SSYYMA(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含GASETES(SEQ IDNO:29)的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QNTKVGSSYGNT(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列。上述重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列在US 2016/0176954中分别公开为SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:121、SEQ IDNO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:125。(参见US 2016/0176954中的表7和表8。)
在某些实施例中，抗C5抗体包含分别为以下的VH和VL序列QVQLVESGGGLVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQVVLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS(SEQ ID NO:31)
以及DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK(SEQ ID NO:32)，包括这些序列的翻译后修饰。上述VH和VL序列在US 2016/0176954中分别公开为SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:111。(参见US 2016/0176954中的表7和表8。)在某些实施例中，抗C5抗体为305L015(参见US 2016/0176954)。
在某些实施例中，通过本文所公开的方法生产的抗体能够结合至OX40(例如，特异性地结合至人OX40的抗OX40激动剂抗体)。在某些实施例中，抗OX40抗体包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含DSYMS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含RASQDISNYLN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含YTSRLRS(SEQ IDNO:6)；的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。例如，在某些实施例中，抗OX40抗体包含重链可变结构域(VH)序列，该VH序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含DSYMS(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列；和(c)重链可变区CDR3，其包含APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)轻链可变区CDR1，其包含RASQDISNYLN(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR2，其包含YTSRLRS(SEQ IDNO:6)的氨基酸序列；和(c)轻链可变区CDR3，其包含QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。在某些实施例中，抗OX40抗体包含分别为以下的VH和VL序列
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSYNQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS(SEQ ID NO:8)
以及DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:9)，包括这些序列的翻译后修饰。
在某些实施例中，抗OX40抗体包含1、2、3、4、5或6个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含NYLIE(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包含DRLDY(SEQID NO:12)的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包含HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包含HGTNLED(SEQ ID NO:14)；的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包含VHYAQFPYT(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。例如，在某些实施例中，抗OX40抗体包含重链可变结构域(VH)序列，该VH序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)重链可变区CDR1，其包含NYLIE(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包含VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列；和(c)重链可变区CDR3，其包含DRLDY(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列；和/或轻链可变结构域(VL)序列，该VL序列包含一个、两个或三个选自以下的CDR：(a)轻链可变区CDR1，其包含HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR2，其包含HGTNLED(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列；和(c)轻链可变区CDR3，其包含VHYAQFPYT(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列。在某些实施例中，抗OX40抗体包含分别为以下的VH和VL序列
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYYSEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS(SEQ ID NO:16)
以及DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK(SEQ ID NO:17)，包括这些序列的翻译后修饰。
WO 2015/153513中提供了有关抗OX40抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体能够结合至乙型流感病毒血凝素，即“fluB”(例如，体外和/或体内结合来自Yamagata谱系的乙型流感病毒的血凝素、结合来自Victoria谱系的乙型流感病毒的血凝素或结合来自Yamagata谱系、Victoria谱系和祖先谱系的乙型流感病毒的血凝素的抗体)。WO 2015/148806中描述了有关抗FluB抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体能够结合至低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体以及选自由以下项组成的组的至少一种靶标：β-分泌酶(BACE1或BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、淀粉样前体蛋白(APP)、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白β、α-突触核蛋白、帕金蛋白、亨廷顿蛋白、p75NTR、CD40和半胱天冬酶-6。
在某些实施例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的抗体为抗CD40的人IgG2抗体。在某些实施例中，抗CD40抗体为RG7876。
在某些实施例中，本公开的细胞和方法可用于生产多肽。例如，但不限于，多肽为靶向免疫细胞因子。在某些实施例中，靶向免疫细胞因子为CEA-IL2v免疫细胞因子。在某些实施例中，CEA-IL2v免疫细胞因子为RG7813。在某些实施例中，靶向免疫细胞因子为FAP-IL2v免疫细胞因子。在某些实施例中，FAP-IL2v免疫细胞因子为RG7461。
在某些实施例中，通过本文所提供的细胞和方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至CEA和至少一种额外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至肿瘤靶向细胞因子和至少一种额外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法产生的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)融合至IL2v(即，白介素2变体)并且结合基于IL1的免疫细胞因子和至少一种额外的靶分子。在某些实施例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为T细胞双特异性抗体(即，双特异性T细胞接合子或BiTE)。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)能够结合至选自以下的至少两种靶分子：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CEA和CD3、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体、TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和血管生成素、VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体、EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGM A；POL-l和CTLA-4；以及RGM A和RGM B。
在某些实施例中，根据本文所提供的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在某些实施例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体为RG7802。在某些实施例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含以下提供的SEQ ID NO:18至21中列出的氨基酸序列：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASAAVG TYVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRKRGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCHQ YYTYPLFTFG QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC(SEQ ID NO:18)
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCGSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAFRGLI GGTNKRAPGTPARFSGSLLG GKAALTLSGA QPEDEAEYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLS SASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSC(SEQ ID NO:19)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTKTGEATYVEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDGGGGS GGGGSEVQLL ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMNWVRQAPGKGL EWVSRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNTLYLQM NSLRAEDTAV YYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECDKT HTCPPCPAPEAAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP CRDELTKNQV SLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:20)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMG WINTKTGEATYVEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMD YWGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVH NAKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRD ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K(SEQ ID NO:21)
WO 2014/121712中提供了有关抗CEA/抗CD3双特异性抗体的进一步细节，其全文以引用方式并入本文。
在某些实施例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体。在某些实施例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为Crossmab。在某些实施例中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体为RG7716。在某些实施例中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含以下提供的SEQ ID NO:22至25中列出的氨基酸序列：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTYAADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPC RDELTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK(SEQ ID NO:22)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYMHWVRQA PGQGLEWMGW INPNSGGTNYAQKFQGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARSP NPYYYDSSGY YYPGAFDIWG QGTMVTVSSASVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMASRTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK(SEQ ID NO:23)
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFN RGEC(SEQ ID NO:24)
SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYDD SDRPSGIPERFSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHWVFG GGTKLTVLSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSC(SEQ ID NO:25)
在某些实施例中，通过本文所公开的方法生产的多特异性抗体(诸如双特异性抗体)为抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体。在某些实施例中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体为RG7221。在某些实施例中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体为CAS编号1448221-05-3。
任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体、其片段(例如，受体的细胞外结构域)可以用作免疫原。可替代地，可以将表达跨膜分子的细胞用作免疫原。这样的细胞可以源自天然来源(例如，癌细胞系)，或者可以是已经通过重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域技术人员将是显而易见的。
在某些实施例中，通过本文所公开的细胞和方法生产的多肽(例如，抗体)能够结合至、可以进一步缀合至化学分子诸如染料或细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)。包含使用本文所述方法生产的抗体或双特异性抗体的免疫缀合物可含有缀合至仅一条重链或仅一条轻链的恒定区的细胞毒性剂。
5.5.6抗体变体
在某些方面，考虑了本文所提供的抗体的氨基酸序列变体，例如第5.5.5节中提供的抗体。例如，可能期望改变抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有期望特征，例如,抗原结合。
5.5.6.1取代、插入和删除性变体
在某些方面，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的感兴趣的位点包括CDR和FR。保守取代在表1中的“优选取代”标题下示出。更多实质性改变提供于表1的“示例性取代”标题下，并且在下文参考氨基酸侧链类别进行了进一步描述。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并对产物进行所需活性(例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC)筛选。
表1
Figure BDA0003859258760000841
可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将需要用这些类别中的一个的成员交换另一类别的成员。
一种类型的取代变体涉及置换亲本抗体(例如，人源化抗体或人抗体)的一个或多个高可变区残基。通常，为进一步研究而选择的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将在某些生物特性(例如，提高的亲和力、降低的免疫原性)上具有修饰(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简要地说，对一个或多个CDR残基进行突变并且将变体抗体展示在噬菌体上并针对特定生物学活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
例如，可在CDR中作出改变(例如，取代)，以改善抗体亲和力。此类改变可以发生于CDR“热点”中，即由体细胞成熟过程中发生高频突变的密码子编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或与抗原接触的残基(检测所得变体VH或VL的结合亲和力)。通过构建并自二级文库重新选择而实现的亲和力成熟已被例如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编，HumanPress,Totowa,NJ,(2001))中进行描述。在亲和力成熟的某些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任何一种将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建一个二级文库。随后对该文库进行筛选以鉴别具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中将若干CDR残基(例如，每次4至6个残基)随机化。参与抗原结合的CDR残基可以例如使用丙氨酸扫描突变或建模来特异性地鉴定。具体而言，常常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些方面，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的抗原结合能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基的外部。在上文提供的某些变体VH和VL序列中，每个CDR要么保持不变，要么包含不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science，244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。替代性地或另外地，可以使用抗原-抗体复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与增加抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT(抗体定向酶前药治疗))或多肽融合。
5.5.6.2糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或降低抗体糖基化的程度。糖基化位点向抗体的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或多个糖基化位点而方便地实现。
当抗体包含Fc区时，与其相连的寡糖可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的、双触角寡糖，该双触角寡糖通常通过N-键结连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸、以及附接于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些方面中，可对本公开的抗体中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的抗体变体。
一方面，提供了具有非岩藻糖基化的寡糖的抗体变体，即缺少(直接或间接地)连接在Fc区的岩藻糖的寡糖结构。这样的非岩藻糖基化的寡糖(也称为“去岩藻糖基化”的寡糖)特别是N-连接的寡糖，其缺少在双触角寡糖结构的茎中连接第一GlcNAc的岩藻糖残基。一方面，提供了与天然或亲本抗体相比在Fc区中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以为至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％或甚至约100％(即不存在岩藻糖基化寡糖)。非岩藻糖基化寡糖的百分比，如例如WO2006/082515中所述，如通过MALDI-TOF质谱法测量的，是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量相对于与Asn 297连接的所有寡糖(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)之和。Asn297是指位于Fc区中约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可以位于位置297上游或下游大约±3个氨基酸，即在位置294与300之间。在Fc区中具有非岩藻糖基化寡糖比例增加的此类抗体可具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，特别是改善的ADCC功能。参见，例如US 2003/0157108和US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖基化减少的抗体的细胞系的实例包括缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞(Ripka等人.Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312，尤其是在实例11中)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因，FUT8，敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人.Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)，或具有降低或取消的GDP-岩藻糖合成或转运蛋白活性的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在另一方面，抗体变体提供了二等分的寡糖，例如，其中连接至抗体的Fc区的双触角寡糖被GlcNAc二等分。如上所述，这样的抗体变体可以具有减少的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的实例描述于例如Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540,WO 2003/011878。
还提供了在连接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087、WO 1998/58964和WO 1999/22764中。
5.5.6.3Fc区变体
在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可以引入本文提供的抗体的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置上包含氨基酸修饰(例如，取代)。
在某些方面，本公开考虑具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为其中抗体的体内半衰期很重要而某些效应子功能(诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))不必要或有害的应用的理想候选者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性示例描述于美国专利号5,500,362(参见，例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。替代性地，可使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox
Figure BDA0003859258760000881
非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应子细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地，或另外地，可例如在诸如在Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以进行CDC测定法(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人.,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除率/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见，例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929 Al)。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在第265、269、270、297和327位氨基酸中两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的与FcR的结合的某些抗体变体。(参见，例如美国专利号6,737,056；WO 2004/056312；以及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的取代(残基的EU编号)。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如，Fc区的位置234处和位置235处的取代(残基的EU编号)。一方面，取代是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体进一步包含在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的D265A和/或P329G。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见，例如，WO 2012/130831)。在另一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。
在一些方面，在Fc区中进行导致改变(即，改善或减少)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642以及Idusogie等人.J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所描述。
具有延长的半衰期和改善的新生儿Fc受体(FcRn)结合、负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer,R.L.等人，J.Immunol.117:587(1976)，以及Kim,J.K.等人,J.Immunol.24:249(1994))的抗体描述于US 2005/0014934(Hinton等人)中。那些抗体包含这样的Fc区，所述Fc区中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代。此类Fc变体包括在以下Fc区残基中的一处或多处具有取代的Fc变体：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，对Fc区残基434的取代(参见，例如，美国专利号7,371,826；Dall'Acqua,W.F.等人.J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。
通过定点诱变已经鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见，例如，Dall’Acqua,W.F.等人.J.Immunol 169(2002)5171-5180)。相互作用涉及残基I253、H310、H433、N434和H435(EU索引编号)(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对于人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人，Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的研究已表明，残基I253、S254、H435和Y436对于该相互作用至关重要(Firan,M.等人，Int.Immunol.13(2001)993；Shields,R.L.等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中已经报道并且检查了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个减少FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置253、和/或310和/或435处的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置253、310和435位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是I253A、H310A和H435A。参见，例如Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个降低FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置310、和/或433和/或436处的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置310、433和436位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是H310A、H433A和Y436A。(参见，例如，WO 2014/177460Al)。
在某些方面，抗体变体包含具有一个或多个增加FcRn结合的氨基酸取代的Fc区，例如，在Fc区的位置252、和/或254和/或256处的取代(残基的EU编号)。在某些方面，抗体变体包含在位置252、254和256位具有氨基酸取代的Fc区。一方面，在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中，取代是M252Y、S254T和T256E。有关Fc区变体的其他实例，另外参见：Duncan和Winter，Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
如本文报道的抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端，在所述缩短的C末端中已经去除了一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面，重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文报道的所有方面中的一个方面，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，氨基酸位置的EU索引编号)。在本文报道的所有方面的一个方面中，如本文所指定的包含包括C末端CH3结构域的重链的抗体，包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)。
5.5.6.4半胱氨酸工程抗体变体
在某些方面，可能需要产生半胱氨酸工程化改造的抗体，例如THIOMABTM抗体，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于抗体的可接近位点。如本文进一步描述的，通过用半胱氨酸取代那些残基，从而将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点，并且可用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以产生免疫缀合物。半胱氨酸工程化改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130或WO 2016040856中所述产生。
5.5.6.5抗体衍生物
在某些方面，本文提供的抗体可以经进一步修饰以包括本领域已知且容易得到的额外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可具有支链或不具有支链。附接至抗体的聚合物的数目可变，并且如果附接了超过一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素测定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于抗体待改善的特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。
5.5.7免疫缀合物
本公开还提供了包含本文所公开的抗体的免疫缀合物，该抗体与一种或多种治疗剂如细胞毒性剂、化学治疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如，蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素缀合(化学键合)。
一方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体缀合至上述一种或多种治疗剂。通常使用接头将抗体连接至一种或多种治疗剂。Pharmacol Review 68:3-19(2016)中列出了ADC技术的概述，其包括治疗剂、药物和接头的实例。
在另一个方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的本文所述的抗体，该酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白质A链、相思豆毒蛋白质A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹黄素蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、姜黄素、巴豆素、肥皂草抑制剂、明胶、米托菌素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
在另一个方面，免疫缀合物包括与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于生产放射性缀合物。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可能包含用于闪烁显像研究的放射性原子，例如，tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)的自旋标记物，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白偶联剂，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨基酯的双官能衍生物(诸如己二酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)为一种示例性螯合剂，用于将放射性核苷酸缀合至抗体。参见WO 94/11026。接头可以为促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可以使用对酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、对光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari et al.,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
本文的免疫缀合物或ADC明确考虑但不限于用交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于市售的(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、磺基-SMPB和SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
5.5.6病毒颗粒
在某些实施例中，本公开的方法可用于生产病毒颗粒。在某些实施例中，本公开的方法可用于生产病毒载体。在某些实施例中，本公开的方法可用于表达多肽，例如，病毒多肽。此类多肽的非限制性示例包括病毒蛋白、病毒结构(Cap)蛋白、病毒包装(Rep)蛋白、AAV衣壳蛋白和病毒辅助蛋白。在一些实施例中，病毒多肽为AAV病毒多肽。
在某些实施例中，可由通过本文所述的方法生产的病毒颗粒携带的目标基因的示例包括哺乳动物多肽，诸如，例如，肾素；生长激素，包括人类生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激素；降钙素；促黄体素；胰高血糖素；瘦素；凝血因子诸如VIIIC因子、IX因子、组织因子和维勒布兰德氏(von Willebrands)因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心钠素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活剂，诸如尿激酶或人类尿或组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；肿瘤坏死因子受体诸如死亡受体5和CD120；TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)；B细胞成熟抗原(BCMA)；B淋巴细胞刺激因子(BLyS)；增殖诱导配体(APRIL)；脑啡肽酶；RANTES(调节正常表达和分泌的T细胞活化)；人类巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人类血清白蛋白；缪勒管(Muellerian)抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白，诸如β-内酰胺酶、DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血管内皮生长因子家族蛋白(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)；血小板衍生生长因子(PDGF)家族蛋白(例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其二聚体)；成纤维细胞生长因子(FGF)家族诸如aFGF、bFGF、FGF4和FGF9；表皮生长因子(EGF)；激素或生长因子的受体诸如VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3)，表皮生长因子(EGF)受体(例如，ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4受体)，血小板衍生生长因子(PDGF)受体(例如，PDGFR-α和PDGFR-β)，和成纤维细胞生长因子受体；TIE配体(血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受体诸如TIE1和TIE2；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5或神经营养蛋白-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子诸如NGF-b；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白诸如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；趋化因子诸如CXCL12和CXCR4；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；细胞因子诸如白介素(IL)，例如，IL-1至IL-10；中期因子；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原诸如，例如，AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；寻址蛋白；调节蛋白；整合素诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肝配蛋白；Bv8；δ样配体4(DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；卵泡抑素；肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)；Alk1；Robo4；ESM1；串珠素；EGF样结构域7(EGFL7)；CTGF及其家族成员；血小板反应蛋白诸如血小板反应蛋白1和血小板反应蛋白2；胶原蛋白诸如胶原蛋白IV和胶原蛋白XVIII；神经纤毛蛋白诸如NRP1和NRP2；多效生长因子(PTN)；颗粒蛋白原；多育曲菌素；Notch蛋白诸如Notch1和Notch4；导蛋白诸如Sema3A、Sema3C和Sema3F；肿瘤相关抗原诸如CA125(卵巢癌抗原)；免疫粘附素；以上列出的任何多肽以及抗体(包括抗体片段)的片段和/或变体与一个或多个蛋白(包括例如以上列出的任何蛋白)结合。
在一些实施例中，由通过本公开的宿主细胞生产的病毒颗粒携带的目标基因可编码蛋白质，该蛋白质结合至任何蛋白质或与其发生相互作用，这些蛋白质包括但不限于选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子相关蛋白质和细胞因子受体：8MPI、8MP2、8MP38(GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(αFGF)、FGF2(βFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1(EPSELON)、FEL1(ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL12B、IL 13、IL14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA(TNF-β)、LTB、TNF(TNF-α)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、HGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO.k。
在一些实施例中，由通过本公开的宿主细胞生产的病毒颗粒携带的目标基因可编码蛋白质，该蛋白质结合至选自由以下项组成的组的细胞因子、细胞因子受体或细胞因子相关蛋白质或与其发生相互作用：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL 11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL 1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRBIRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。在一些实施例中，由本公开的宿主细胞表达的多肽可结合至以下项或与其相互作用：0772P(CA125、MUC16)(即卵巢癌抗原)、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；淀粉样蛋白β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1(含有天冬氨酸β-水解酶结构域的蛋白1；LOC253982)；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R(B细胞活化因子受体、BLyS受体3、BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B(骨形态发生蛋白受体IB型)；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；短蛋白聚糖；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸细胞活化趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸细胞活化趋化因子2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22(B细胞受体CD22-B同种型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A(CD79α、免疫球蛋白相关α，一种B细胞特异性蛋白质)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙粘蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(密封蛋白7)；CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)；CLN3；CLU(丛生蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；补体因子D；CR2；CRP；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎瘤衍生生长因子)；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-连环蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，一种G蛋白偶联受体)；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16(LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR(内皮素B型受体)；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81(FKSG80)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DOB(II类MHC分子的β亚基(Ia抗原))；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2,ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；甲型流感；乙型流感；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；α4β7和αEβ7整合素异源二聚体；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC框BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(毛发特异性H型角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦素)；LGR5(含有富含亮氨酸的重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸的重复序列(LRR)家族的I型膜蛋白)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合体，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合体，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合体，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞强化因子、间皮素)；MS4A1；MSG783(RNF124、假定蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3(metallothionectin-111)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MY088；Napi3b(也称为NaPi2b)(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质运载蛋白家族34(磷酸钠)成员2、II型钠依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；NCA；NCK2；神经粘蛋白；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸酶蛋白聚糖；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17(silver同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21 Rac2)；RARB；RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYEI(内皮单核细胞活化细胞因子)；SDF2；Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin 5b Hlog、sema结构域、七血小板反应蛋白重复序列(1型和1样型)、跨膜结构域(TM)和短胞质结构域(semaphorin)5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP(前列腺六跨膜上皮抗原)；STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六跨膜上皮抗原2、六跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2(推定的跨膜蛋白聚糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板反应蛋白1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1(具有EGF样结构域和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；TMEM46(shisa同源物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118(环指蛋白，跨膜2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；versican；VHL C5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和/或ZFPM2。
根据本公开的宿主细胞可以封装许多其他病毒成分和/或其他目标基因，并且以上列表并非意在限制。
本公开的方法可用于以制造规模生产目标病毒颗粒。治疗性蛋白质或其他蛋白质的“制造规模”生产利用范围为约400L至约80,000L的细胞培养物，具体取决于生产的蛋白质以及需求。通常，此类制造规模生产利用约400L至约25,000L的细胞培养物。在该范围内，可利用诸如4,000L、约6,000L、约8,000L、约10,000L、约12,000L、约14,000L或约16,000L的特定细胞培养物。
6.示例性实施例
本公开涉及修饰的哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，其具有降低的或消除的某些宿主细胞蛋白质(例如，宿主细胞酶，包括但不限于，某些脂肪酶、酯酶和/或水解酶)的活性，制备此类细胞的方法和使用此类细胞生产目标产物例如重组蛋白的方法。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的一种或多种酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，该一种或多种酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶(LPL)；含磷脂酶B结构域2(PLBL2/PLBD2)；脂肪酶A(溶酶体酸性脂肪酶/胆固醇酯水解酶，脂肪酶)(LIPA)；磷脂酶A-2活化蛋白(PLAA)；磷脂酶D3(PLD3)；磷脂酶A2组XV(LPLA2)；磷脂酶Cβ1(PLCB1)；磷脂酶Cδ1(PLCD1)；含DDHD结构域蛋白1(片段)(DDHD1)；溶血磷脂酶样蛋白1(LYPLAL1)；磷脂酶A2组XIIA(PLA2G12A)；过氧化物氧还蛋白6(PRDX6)；鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)；棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)；乙酸异戊酯水解酯酶1(推定)(IAH1)；OTU去泛素化酶，泛素醛结合蛋白1(OTUB1)；溶血磷脂酶2(酰基蛋白硫酯酶2)(LYPLA2)；酰基辅酶A硫酯酶13(ACOT13)；脂肪酸合酶(FASN)；磷脂酶A2组VII(PLA2G7)；泛素特异性肽酶5(USP5)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(酸性神经酰胺酶)(ASAH1)；脂肪酶成熟因子1(LMF1)；载脂蛋白CII(APOC2)；酰基肉碱水解酶(HACH)；羧酸酯酶1F(CES1F)或肝羧酸酯酶B-1样(CES-B1L)；溶血磷脂酶1(LYPLA1)；羧酸酯酶1(CES1)；磷脂酶A1成员A(PLA1A)；和唾液酸乙酰酯酶(SIAE)。
在某些实施例中，重组宿主细胞中以下酶的活性被降低或消除：a)PPT1；b)LPLA2、LPL和LIPA；c)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1；d)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A；e)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SPD1；f)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13；g)LPLA2、LPL和PPT1；h)LPLA2、LPL、LIPA和PPT1；i)HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；j)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；k)SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；l)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；m)LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；n)LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；o)LMF1和APOC2。
在某些实施例中，重组宿主细胞中一种或多种酶的活性通过以下方式降低或消除:(a)敲低该酶的表达；(b)或敲除该酶的表达；或(c)改变编码该酶的核酸序列。
在某些实施例中，本公开涉及一种重组宿主细胞，其包含一种或多种改变的酶基因。在某些实施例中，该一种或多种改变的酶基因没有可检测的酶活性。在某些实施例中，重组宿主细胞包含编码目标产物的核酸序列。在某些实施例中，核酸序列在靶向位置处整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，重组宿主细胞进一步包含编码目标产物的核酸，该核酸随机整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些实施例中，经修饰的细胞不表达任何可检测的LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供组合物，其包含本公开中描述的重组宿主细胞。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括敲低或敲除LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的降低的活性。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括选择具有LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的降低的活性的细胞。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其中该方法包括改变编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE中的一者或多者的基因。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其中该方法包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5和/或ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的表达。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其中癌方法包括包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5和ASAH1中的一者或多者的核酸序列，使得所述LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE中的一者或多者具有降低的或消除的酶活性。
在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物且具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其包含一种或多种改变的酶基因。在某些实施例中，该一种或多种改变的酶基因通过编码区的破坏而得到改变。在某些实施例中，该一种或多种酶基因改变包括双等位基因改变。在某些实施例中，该一种或多种酶基因改变包括1个或更多个碱基对,2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对或20个或更多个碱基对的缺失。在某些实施例中，该一种或多种酶基因是LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE。
在某些上述实施例中，基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及其组合。在某些上述实施例中，基因工程系统为CRISPR/Cas9系统。
在某些上述实施例中，CRISPR/Cas9系统包含：(a)Cas9分子，和(b)一种或多种包含靶向序列的向导RNA(gRNA)，该靶向序列与编码LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE的基因中的靶序列互补。
在某些上述实施例中，基因工程系统包含选自由以下项组成的组的RNA：短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA)，其中该RNA与由LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A和/或SIAE基因中的一者或多者表达的mRNA的一部分互补。在某些上述实施例中，基因工程系统为锌指核酸酶(ZFN)系统或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
在某些上述实施例中，哺乳动物细胞中以下酶的活性被降低或消除：a)PPT1；b)LPLA2、LPL和LIPA；c)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SPD1；d)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A；e)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SPD1；f)BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13；或g)LPLA2、LPL和PPT1；h)LPLA2、LPL、LIPA和PPT1；i)HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；j)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；k)SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；l)LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE；m)LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；n)LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1；o)LMF1和APOC2。
在某些上述实施例中，本公开提供的方法进一步包括纯化目标产物、收获目标产物和/或配制目标产物。
在某些上述实施例中，聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯的降解得到降低。在某些上述实施例中，聚山梨醇酯20(PS20或吐温20)的降解得到降低。在某些上述实施例中，聚山梨醇酯80(PS80或吐温80)的降解得到降低。
在某些上述实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在某些上述实施例中，哺乳动物细胞为CHO细胞。
在某些上述实施例中，细胞表达目标产物。在某些上述实施例中，由哺乳动物细胞表达的目标产物由核酸序列编码。在某些上述实施例中，核酸序列在靶向位置处整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中。在某些上述实施例中，由细胞表达的目标产物进一步由随机整合到哺乳动物细胞的细胞基因组中的核酸序列编码。
在某些上述实施例中，目标产物包括蛋白质、病毒颗粒或病毒载体。在某些上述实施例中，目标产物包括重组蛋白。在某些上述实施例中，目标产物包括抗体或其抗原结合片段。在某些上述实施例中，抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些上述实施例中，抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。在某些上述实施例中，抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。在某些上述实施例中，抗体为单克隆抗体。
在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL和LIPA。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL和PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1。在某些实施例中，本公开的经修饰的细胞不表达任何可检测的LMF1和APOC2。
在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL和LIPA酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL和PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除该酶的活性。在某些实施例中，本公开提供一种重组宿主细胞，其中该细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LMF1和APOC2酶的活性降低或消除它们的活性。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL和LIPA的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL和PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL和LIPA的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL和PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LMF1和APOC2的降低的活性。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL和LIPA的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL和PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LMF1和APOC2的降低的活性的细胞。
在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码PPT1的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL和LIPA中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL和PPT1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。在某些实施例中，本发明提供一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LMF1和APOC2中的一者或多者的基因。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL和LIPA的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL和PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码PPT1的核酸序列，使得PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL和LIPA的核酸序列，使得LPLA2、LPL和LIPA具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1的核酸序列，使得BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13的核酸序列，使得BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL和PPT1的核酸序列，使得LPLA2、LPL和PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA和PPT1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE以及PPT1的核酸序列，使得SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的核酸序列，使得LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。
在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。在某些实施例中，本公开提供一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向该细胞施用基因工程系统，其中该基因工程系统改变编码LMF1和APOC2的核酸序列，使得LMF1和APOC2具有降低的或消除的活性。
在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL和LIPA活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种生产目标产物的方法，其包括培养表达该目标产物的哺乳动物细胞，其中该哺乳动物细胞表达该目标产物并且具有降低的或消除的LMF1和APOC2活性。
在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和LIPA活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12A活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和SMPD1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA和ACOT13活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1活性。在某些实施例中，本公开提供一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中该哺乳动物细胞具有降低的或消除的LMF1和APOC2活性。
7.实例
以下实例仅是对当前公开的主题的说明，不应以任何方式视为限制。
材料和方法
表达质粒的构建
重链和轻链cDNA两者均受巨细胞病毒即早期基因启动子和增强子(CMV)的控制。每个CMV转录起始位点之后是剪接供体和受体序列，这些序列定义了从最终转录物中移除的内含子(Lucas等人1996)。
抗体质粒DNA构建体构型
为构建单质粒抗体构建体，将带有抗体重链(HC)和轻链(LC)基因的片段克隆到含有L3和2L序列以及嘌呤霉素N-乙酰转移酶(pac)选择性标志物的载体中。为构建双质粒抗体构建体，将抗体HC和LC基因片段克隆到含有L3和LoxFAS序列的前载体以及含有LoxFAS和2L序列与pac选择性标志物的后载体中。在双质粒系统中，pac的起始密码子位于前载体的末尾，而pac编码序列的其余部分位于后载体的开头。所有抗体基因前面都有一个CMV启动子，后面是一个SV40 poly(A)序列。先前描述的Cre重组酶质粒(pOG231)用于所有RMCE过程(O'Gorman S,Dagenais NA,Qian M,Marchuk Y.Proc Natl Acad Sci U S A.1997 Dec23；94(26):14602-7)。
L3序列：5'ATAACTTCGTATAAAGTCTCCTATACGAAGTTAT
LoxFAS序列：5'ATAACTTCGTATAGAAAGGTATATACGAAGTTAT
2L序列：5'ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
细胞培养
在125mL摇瓶容器中，在150rpm以及37℃和5％CO2条件下，在基于DMEM/F12的专有培养基中培养CHO细胞。每三至四天，以3x105个细胞/mL的接种密度对细胞进行传代。
稳定的转染和蛋白质生产
根据制造商的建议(Invitrogen,Carlsbad,CA)，使用lipofectamine 2000 CD用转染CHO细胞。将转染的细胞离心并接种到具有不同浓度的甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的基于DMEM/F-12的选择性(无谷氨酰胺)培养基中。接种后约三周，将各个菌落挑入96孔板中。通过取上清液进行ELISA分析来评定挑选的菌落的抗体生产。使用14天供料分批培养过程放大顶部克隆以产生抗体，且第3天温度转变为35度。
TI稳定细胞系开发
通过MaxCyte STX电穿孔系统(MaxCyte,Gaithersburg,MD)转染表达质粒。然后用嘌呤霉素和1-(2'-脱氧-2'-氟-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基-5-碘)尿嘧啶(FIAU)(Moravek)选择经转染的细胞。池选择后，进行单细胞克隆(SCC)。通过HTRF测定法筛选克隆物的抗体滴度，并将最高滴度的克隆物放大用于进一步评定。
细胞培养物性能的供料分批生产测定
在摇瓶或ambr15容器(Sartorius Stedim)中，使用专有的化学成分确定的生产培养基进行供料分批生产培养。第0天，以1x106个细胞/mL的密度接种细胞；第3天将温度从37℃改变为35℃。在第3、7和10天，向培养物中添加专有的供料基质。在第0、3、7、10和14天，使用Vi-Cell XR仪器(Beckman Coulter)测量培养物中的活细胞计数(VCC)和细胞活力百分比。在第7、10和14天，使用Bioprofile 400分析仪(Nova Biomedical)测量葡萄糖和乳酸浓度。第14天的滴度使用具有UV检测的蛋白A亲和色谱确定。
重组脂肪酶的表达和纯化
通过基因合成创建融合至C末端6xHis或双6xHis-Flag表位并由哺乳动物巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的用于表达酶的质粒，然后亚克隆到pRK5表达载体中，该酶为棕榈酰蛋白硫酯酶1(Uniprot登录号G3HN89)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(Uniprot登录号G3GZB2)、脂肪酶A(Uniprot登录号G3HQY6)、磷脂酶A2组15(Uniprot登录号G3HKV9)、酰基肉碱水解酶(Uniprot登录号G3IIG1)、肝羧酸酯酶B-1样蛋白(Uniprot登录号A0A061IAA7)、溶血磷脂酶1(Uniprot登录号A0A098KXH0)、鞘磷脂磷酸二酯酶(Uniprot登录号G3IMH4)、羧酸酯酶1(Uniprot登录号A0A061ID92)、磷脂酶A1成员A(Uniprot登录号G3I1J5)和唾液酸乙酰酯酶(Uniprot登录号G3IIB1)。表达构建体通过DNA测序验证并瞬时转染到CHO细胞中。在转染后第10天收获分泌的重组脂肪酶，并通过Ni-NTA、体积排阻和抗His亲和色谱纯化。将纯化的脂肪酶透析到所需的缓冲液中并储存在-80℃。
重组人脂蛋白脂肪酶(Uniprot登录号Q6IAV0)购自外部供应商用于评定(R&DSystems目录#9888-LL-100)。
评定已鉴定的HCP亚组中的聚山梨醇酯降解活性
向mAb 2原料药(DS)中加入棕榈酰硫酯酶1(PPT1)、重组人脂蛋白脂肪酶(rhLPL)、N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(ASAH1)和脂肪酶A(LIPA)，最终浓度分别为10μg/mL、0.6μg/mL、10μg/mL和2.5μg/mL。这些溶液在温度控制在25℃的Agilent 1200自动进样器中孵育。在10至15小时的选定时间点，取样20μL并进样，以通过与ELSD联用的混合模式HPLC来确定PS20含量。
将具有生物药学代表性的配制物缓冲液(组氨酸-乙酸盐，pH 6.0，120mM蔗糖，含0.02％或0.04％PS20(w:v))与纯化的酶掺混至以下浓度：磷脂酶A2组15(LPLA2)为0.5μg/mL，酰基肉碱水解酶(HACH)为5μg/mL，肝羧酸酯酶B-1样蛋白(CES-B1L)为5μg/mL，溶血磷脂酶1(LYPLA1)为0.5μg/mL，鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)为52μg/mL，羧酸酯酶1(CES1)为50μg/mL，磷脂酶A1成员A(PLA1A)为31μg/mL，且唾液酸乙酰酯酶(SIAE)为70μg/mL。这些溶液在温度控制在25℃的Agilent 1200自动进样器中孵育。在6至15小时的选定时间点，取样20μL并进样，以通过与ELSD联用的混合模式HPLC来确定PS20含量。
使用PS20降解测定法，用来自CHO细胞的纯化mAb评定脂肪酶/酯酶敲除(KO)
KO对聚山梨醇酯降解的影响通过比较使用重组mAb生产CHO细胞系(其中脂肪酶/酯酶基因被敲除)与其相对应的mAb生产CHO细胞系(没有基因敲除)生成的纯化mAb样品来评定。对于每种mAb，mAb产生CHO细胞的生产培养是在小规模(2L)生物反应器中使用相同的培养条件进行的。在生产生物反应器中培养大约两周后，收获和纯化培养物。对于每种mAb，培养上清液经过相同的下游处理步骤(亲和与精制色谱色谱)和条件，以生成用于测试的纯化材料。以这种方式，对于给定的mAb，纯化的样品仅在使用KO细胞或对照细胞方面有所不同，因为上游和下游的处理步骤和条件是相同的。对纯化材料而不是细胞培养收获物进行聚山梨醇酯20(PS20)降解测定非常重要，因为纯化材料更能代表在实时长期储存期间可能发生聚山梨醇酯降解和颗粒形成的药物产品。
为了进行PS20降解测定，向纯化的样品中加入PS20(0.04％v/v)和甲硫氨酸(20mg/ml)并在25℃孵育约2周，并在多个时间点采样。孵育后，通过对从酶促裂解中释放的游离脂肪酸(月桂酸)定量来分析样品的PS20水解降解，如前所述(Cheng等人，J PharmSci，2019，第108卷，第9期，第2880至2886页)。月桂酸释放速率代表了对PS20降解的酶活性。将脂肪酶/酯酶基因被敲除的(即KO)细胞的月桂酸释放速率与对照细胞(即没有KO)的月桂酸释放速率进行比较。通过计算基因敲除的mAb样品中月桂酸释放速率相对于使用对照细胞的相对应mAb样品的百分比降低来评定KO抑制PS20降解的功效(图15)。例如，完全抑制KO细胞中的水解PS20降解将导致PS20降解活性降低100％(以月桂酸释放速率为代表)。
实例1：在三种单克隆抗体的富集样品中发现了28种酶
图1鉴定了从纯化过程的不同阶段采集的富集mAb-1、mAb-2和mAb-3样品中发现的28种酶。该28种酶包括脂肪酶、酯酶和水解酶。在mAb-1样品中发现了18种酶。在mAb-2样品中发现了15种酶。此外，在mAb-3样品中发现了八种酶。
实例2：用于生成空白CHO宿主细胞的多重KO方法
使用如图2所示的方法从亲本CHO宿主细胞系中生成具有单个或多个敲除基因的空白CHO细胞系宿主。1X KO宿主是从亲本宿主产生的，其中PLBL2基因被敲除。为了从亲本宿主产生3X宿主，同时敲除LPLA2、LPL和脂肪酶A基因。为了从3X宿主生成7X宿主，额外敲除PPT1、PLD3、PLBL2和SMPD1基因。为了从7X宿主生成12X宿主，额外敲除PLAA、LAH1、OTUB1、LYPLA2和PLA2G12a基因。Bax-Bak KO宿主是通过使用亲本宿主并通过敲除Bax和Bak基因而产生的。为了从Bax-Bak KO宿主生成8X宿主，额外敲除LPLA2、LPL、脂肪酶A、PPT1、PLD3和SPD1基因。为了从8X KO宿主生成13X宿主，额外敲除Clu、PRDX1、Plaa和Acot13基因。每个KO宿主细胞系的敲除基因列于图3。
实例3：PLBL2 KO细胞具有与亲本CHO宿主细胞系相当的细胞生长和生产力
使用标准或增强供料策略，使用培养的mAb-A表达细胞系种子世系(seed train)在生物反应器中获取生产培养物。1X KO和亲本CHO细胞系的生长和活力如图4A和4C所示。1X KO细胞系的滴度(图4B)与亲本CHO宿主细胞相当或更好。
实例4：3-脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系的细胞生长
评估了敲除三种(3X KO)脂肪酶/酯酶对CHO细胞系生长和mAb-B表达的效应。将3XKO细胞系的细胞生长与亲本CHO细胞系进行比较。图5A描述了表达mAb-B的3X KO细胞系的生长(表示为活细胞计数的积分，IVCC)。滴度和比生产力(Qp)分别如图5B和5C所示。
实例5：7-脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系的细胞生长
评定了敲除七种(7X KO)脂肪酶/酯酶对CHO细胞系生长的效应。将7X KO细胞系的细胞生长与亲本CHO细胞系进行比较，表明7X KO细胞宿主的生长(表示为活细胞计数的积分，IVCC)与亲本CHO细胞系相当(图6A)。7X KO宿主的活力和乳酸积累分别如图6B和6C所示。
实例6：在7X敲除CHO细胞系中生产3种不同的抗体
还评定了7X KO对三种不同抗体表达的效应。三种不同抗体的7X KO细胞系的生长(图7A)、滴度(图7B)和产物特异性(图7C)与亲本CHO宿主细胞相当或更好。
实例7：8-脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系的细胞生长
评定了敲除八种(8X KO)脂肪酶/酯酶对CHO细胞系生长的效应。将Bax Bak KO宿主和8X KO细胞系的细胞生长与亲本CHO细胞系进行比较，表明8X KO和Bax Bak KO细胞宿主的生长(表示为活细胞计数的积分，IVCC)与亲本CHO细胞系相当(图8A)。8X KO和Bax BakKO宿主的活力和乳酸积累分别如图8B和8C所示。
实例8：12-脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系的细胞生长
评定了敲除十二种(12X KO)脂肪酶/酯酶对CHO细胞系生长的效应。将12X KO细胞系的第13天(D13)细胞生长与亲本CHO细胞系、3XKO和7X KO宿主进行比较，表明12X KO细胞宿主的生长(表示为活细胞计数的积分，IVCC)与亲本CHO细胞系相当(图9A)。12X KO宿主的D13活力和乳酸积累分别如图9B和9C所示。
实例9：在7X敲除CHO细胞系中生产mAb-2
还评定了7X KO对mAb-2表达的效应。7X KO细胞系的针对mAb-2的平均D10滴度(图10A)、D10和D14生长(图10B)、D10时的产物特异性(图10C)和D14乳酸积累(图10D)与亲本CHO相当宿主细胞。
实例10：在7X敲除CHO细胞系中生产mAb-1
还评定了7X KO对mAb-1表达的效应。7X KO细胞系的针对mAb-2的滴度(图11A)、生长(图11B)和产物特异性(图11C)与亲本CHO宿主细胞相当。
实例11：7X脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系中的PS20降解
使用mAb-B生产细胞系评定了七种(7X KO)脂肪酶/酯酶敲除对PS20降解的效应。这些细胞系是通过转染7X KO CHO宿主(图3)以产生mAb-B而生成的。在生物反应器中培养细胞后，细胞培养收获物通过亲和与精制色谱步骤进行处理。在下游加工处理时获得的纯化材料中，与亲本CHO细胞系(图12)相比，7X KO脂肪酶细胞系中的PS20降解降低了61％。降低的PS20降解可以显著优化纯化过程，更重要的是，它降低了药物产品中颗粒形成的风险。
实例12：重组LIPA、ASAH1、LPL、PPT1、LPLA2、HACH、CES-B1L、SMPD1、CES1、PLA1A和 SIAE的表征
考虑到关于PS水解酶的先前报道以及甘油三酯和聚山梨醇酯的结构相似性，选择LIPA、ASAH1、LPL和PPT1来更详细地评估聚山梨醇酯水解酶的降解特征。CHO LIPA、ASAH1、PPT1、LPLA2、HACH、CES-B1L、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE在CHO细胞中表达为带His标签的构建体，并如方法章节所述进行纯化。每种酶的SDS-PAGE显示在图13中，并且所有酶都通过完整质量MS确认为目标蛋白质(数据未显示)。还应该提到的是，重组人LPL(rhLPL)是从商业来源购买的，而所有其他测试的酶都来自中国仓鼠(C.griseus)。
进一步表征这些酶降解聚山梨醇酯的能力。将每种酶加入到含有聚山梨醇酯的mAb制剂中。通过测量作为时间函数的聚山梨醇酯浓度来测量酶活性。最终，结果表明PPT1、LIPA和rhLPL(分别为10μg/mL、10μg/mL和0.6μg/mL)能够在所测试的时间范围内(10至15小时)降解聚山梨醇酯，而2.5μg/mL的ASAH1没有显示出可测量的降解，如图14a所示。结果还表明HACH、LYPLA1、CES-B1L和LPLA2(分别为5μg/mL、5μg/mL、0.5μg/mL和0.5μg/mL)也能够降解配制物缓冲溶液中的聚山梨醇酯(图14b)。额外一组水解酶PLA1A、SIAE、CES1和SMPD1(分别为31μg/mL、70μg/mL、50μg/mL和52μg/mL)也能够降解配制物缓冲溶液中的聚山梨醇酯，但需要更高浓度的这些重组表达的酶来降解聚山梨醇酯(图14c)。
实例13：其他7X和12X脂肪酶/酯酶敲除CHO细胞系中的PS20降解
在其他4种mAb生产细胞系中评定了敲除CHO细胞系中的七个(7X KO)和十二个(12X KO)基因对PS20降解的效应。这些细胞系是通过转染7X KO或12X KO CHO宿主(图3)以产生所需的mAb而生成的。用mAb W和mAb X细胞系测试7X KO的效应，用mAb Y和mAb Z细胞系测试12X KO的效应。在生物反应器中培养细胞后，细胞培养收获物通过亲和与精制色谱步骤进行处理。在所有情况下，相对于没有任何基因敲除的对照细胞系，7X KO和12X KO细胞系在纯化结束时生成的材料显示对PS20降解的酶活性降低(图15)。降低的PS20降解可以显著优化纯化过程，更重要的是，它降低了药物产品中颗粒形成的风险。
实例14：敲除多个脂肪酶/酯酶基因的mAbT细胞系中的PS20降解
评定了敲除重组mAb T生产CHO细胞系中的脂肪酶/酯酶基因对PS20降解的效应。这些细胞系是通过从重组mAb T生产CHO细胞系中顺序敲除脂肪酶/酯酶基因而产生的。首先测试1X KO(LPLA2)和2X KO(LPLA2和LPL)对细胞系的效应。然后测试3X KO(LPLA2、LPL和LIPA)和6X KO(LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3和PLBL2)对细胞系的效应。在生物反应器中培养细胞后，细胞培养收获物通过亲和与精制色谱步骤进行处理。在所有情况下，相对于未敲除任何基因的对照亲本mAb T细胞系，1X KO、2X KO、3X KO和6X KO细胞系在纯化结束时生成的材料显示对PS20降解的酶活性降低(图16)。使用3X KO和6X KO细胞系的第二组实验显示出比使用1X KO和2X KO细胞系的第一组实验更低的PS20降解活性。总之，这些结果指示敲除多个表达聚山梨醇酯降解酶的相关脂肪酶/酯酶基因的潜在益处。降低的PS20降解可以显著优化纯化过程，更重要的是，它降低了药物产品中颗粒形成的风险。
本申请全文引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请以及登录号的内容通过引用明确并入本文。

Claims (117)

1.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的一种或多种酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
2.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种酶选自由以下项组成的组：脂蛋白脂肪酶(LPL)；含磷脂酶B结构域2(PLBL2/PLBD2)；脂肪酶A(溶酶体酸性脂肪酶/胆固醇酯水解酶，脂肪酶)(LIPA)；磷脂酶A-2活化蛋白(PLAA)；磷脂酶D3(PLD3)；磷脂酶A2组XV(LPLA2)；磷脂酶Cβ1(PLCB1)；磷脂酶Cδ1(PLCD1)；含DDHD结构域蛋白1(片段)(DDHD1)；溶血磷脂酶样蛋白1(LYPLAL1)；磷脂酶A2组XIIA(PLA2G12A)；过氧化物氧还蛋白6(PRDX6)；鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD1)；棕榈酰蛋白硫酯酶1(PPT1)；乙酸异戊酯水解酯酶1(推定)(IAH1)；OTU去泛素化酶，泛素醛结合蛋白1(OTUB1)；溶血磷脂酶2(酰基蛋白硫酯酶2)(LYPLA2)；酰基辅酶A硫酯酶13(ACOT13)；脂肪酸合酶(FASN)；磷脂酶A2组VII(PLA2G7)；泛素特异性肽酶5(USP5)；N-酰基鞘氨醇酰胺水解酶1(酸性神经酰胺酶)(ASAH1)；脂肪酶成熟因子1(LMF1)；载脂蛋白C-II(APOC2)；酰基肉碱水解酶(HACH)；羧酸酯酶1F(CES1F)或肝羧酸酯酶B-1样(CES-B1L)；溶血磷脂酶1(LYPLA1)；羧酸酯酶1(CES1)；磷脂酶A1成员A(PLA1A)；和唾液酸乙酰酯酶(SIAE)。
3.根据权利要求2所述的重组宿主细胞，其中：
a)PPT1；
b)LPLA2；LPL和LIPA；
c)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3和SMPD1；
d)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；PLAA；IAH1；OTUB1；LYPLA2和PLA2G12A；
e)BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLD3和SMPD1；
f)BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；CLU；PRDX1；PLAA和ACOT13；
g)LPLA2；LPL和PPT1
h)LPLA2；LPL；LIPA和PPT1
i)HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
j)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
k)SMPD1；CES1；PLA1A和SIAE
l)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；SMPD1；CES1；PLA1A和SIAE
m)LPLA2；LMF1；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
n)LPLA2；LMF1；APOC2；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1；或
o)LMF1和APOC2的所述活性被降低或消除。
4.根据权利要求1至3所述的重组宿主细胞，其中通过以下项来降低或消除所述一种或多种酶的所述活性：
(a)敲低所述酶的表达；
(b)或敲除所述酶的表达；或
(c)改变编码所述酶的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述细胞包含一种或多种改变的酶基因。
6.根据权利要求5所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种改变的酶基因不具有可检测的酶活性。
7.根据权利要求1至6所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为CHO细胞。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组宿主细胞，其包含编码目标产物的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的重组宿主细胞，其中所述目标产物包括蛋白质、病毒颗粒或病毒载体。
11.根据权利要求9或10所述的重组宿主细胞，其中所述目标产物包括重组蛋白。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述目标产物包括抗体或其抗原结合片段。
13.根据权利要求12所述的重组宿主细胞，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求12所述的重组宿主细胞，其中所述抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述抗体包括单克隆抗体。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述核酸序列在靶向位置处整合到所述哺乳动物细胞的细胞基因组中。
18.根据权利要求17所述的重组宿主细胞，其进一步包含编码所述目标产物的核酸，所述核酸随机整合到所述哺乳动物细胞的所述细胞基因组中。
19.根据权利要求1所述的重组宿主细胞，其中经修饰的细胞不表达任何可检测的LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE。
20.一种组合物，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞。
21.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE的表达。
22.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE的降低的活性。
23.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE的降低的活性的细胞。
24.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE中的一者或多者的基因。
25.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE的表达。
26.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5和ASAH1中的一者或多者的核酸序列，使得LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE中的一者或多者具有降低的或消除的酶活性。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及其组合。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述基因工程系统为CRISPR/Cas9系统。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9系统包含：
(a)Cas9分子；和
(b)一种或多种包含靶向序列的向导RNA(gRNA)，所述靶向序列与编码LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；HACH；LMF1；APOC2；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE的基因中的靶序列互补。
30.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述基因工程系统包括选自由以下项组成的组的RNA：短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和microRNA(miRNA)，其中所述RNA与由所述LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE基因中的一者或多者表达的mRNA的一部分互补。
31.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述基因工程系统为锌指核酸酶(ZFN)系统或转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中所述细胞表达目标产物。
35.根据权利要求34所述的方法，其中由所述细胞表达的所述目标产物由核酸序列编码。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述核酸序列在靶向位置处整合到所述细胞的细胞基因组中。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中由所述细胞表达的所述目标产物进一步由随机整合到所述哺乳动物细胞的所述细胞基因组中的核酸序列编码。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述目标产物包括蛋白质。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述目标产物包括重组蛋白。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述目标产物包括抗体或其抗原结合片段。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
45.一种生产目标产物的方法，其包括培养表达所述目标产物的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞表达所述目标产物且具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE。
46.一种培养表达目标产物的哺乳动物细胞群的方法，其中所述哺乳动物细胞具有下列项中的一者或多者的降低的或消除的活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5和ASAH1。
47.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述活性的降低或消除为所述哺乳动物细胞中以下项的活性的降低或消除：
a)PPT1；
b)LPLA2；LPL和LIPA；
c)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3和SMPD1；
d)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；PLAA；IAH1；OTUB1；LYPLA2和PLA2G12A；
e)BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLD3和SMPD1；
f)BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SPD1；CLU；PRDX1；PLAA和ACOT13；
g)LPLA2；LPL和PPT1
h)LPLA2；LPL；LIPA和PPT1
i)HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
j)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
k)SMPD1；CES1；PLA1A和SIAE
l)LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；SMPD1；CES1；PLA1A和SIAE
m)LPLA2；LMF1；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1
n)LPLA2；LMF1；APOC2；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L和LYPLA1；或
o)LMF1和APOC2。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
49.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中由所述哺乳动物细胞表达的所述目标产物由核酸序列编码。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述核酸序列在靶向位置处整合到所述哺乳动物细胞的细胞基因组中。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的方法，其中由所述细胞表达的所述目标产物进一步由随机整合到所述哺乳动物细胞的所述细胞基因组中的核酸序列编码。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的方法，其中所述目标产物包括蛋白质、病毒颗粒或病毒载体。
53.根据权利要求45至42中任一项所述的方法，其中所述目标产物包括重组蛋白。
54.根据权利要求45至53中任一项所述的方法，其中所述目标产物包括抗体或其抗原结合片段。
55.根据权利要求54所述的方法，其中抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
57.根据权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述抗体为嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
58.根据权利要求54至57中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
59.根据权利要求45至58中任一项所述的方法，其进一步包括纯化所述目标产物，收获所述目标产物，和/或配制所述目标产物。
60.根据权利要求21至58中任一项所述的方法，其中聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯的降解得到降低。
61.根据权利要求21至58中任一项所述的方法，其中聚山梨醇酯20(PS20或吐温20)的降解得到降低。
62.根据权利要求21至58中任一项所述的方法，其中聚山梨醇酯80(PS80或吐温80)的降解得到降低。
63.一种重组宿主细胞，其包含一种或多种改变的酶基因。
64.根据权利要求63所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种改变的酶基因通过编码区的破坏而得到改变。
65.根据权利要求63所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种酶基因改变包括双等位基因改变。
66.根据权利要求65所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种酶基因改变包括1个或更多个碱基对、2个或更多个碱基对、3个或更多个碱基对、4个或更多个碱基对、5个或更多个碱基对、6个或更多个碱基对、7个或更多个碱基对、8个或更多个碱基对、9个或更多个碱基对、10个或更多个碱基对、11个或更多个碱基对、12个或更多个碱基对、13个或更多个碱基对、14个或更多个碱基对、15个或更多个碱基对、16个或更多个碱基对、17个或更多个碱基对、18个或更多个碱基对、19个或更多个碱基对或20个或更多个碱基对的缺失。
67.根据权利要求63所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种酶基因是LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A和/或SIAE。
68.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA和PPT1酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
69.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
70.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
71.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
72.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
73.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1酶的活性降低或消除所述酶的所述活性。
74.一种重组宿主细胞，其中所述细胞经修饰以相对于未修饰的细胞中的LMF1和APOC2的水平降低或消除所述酶的所述水平。
75.一种组合物，其包含根据权利要求68至74中任一项所述的重组宿主细胞。
76.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。
77.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
78.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
79.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。
80.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
81.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
82.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
83.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性。
84.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。
85.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。
86.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性。
87.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。
88.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性。
89.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括调节细胞培养过程和/或培养基组合物，其中调节细胞培养过程和/或培养基组合物导致LMF1和APOC2的降低的活性。
90.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的降低的活性的细胞。
91.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。
92.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。
93.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的降低的活性的细胞。
94.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。
95.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的降低的活性的细胞。
96.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括选择具有LMF1和APOC2的降低的活性的细胞。
97.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1中的一者或多者的基因。
98.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。
99.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。
100.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE中的一者或多者的基因。
101.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。
102.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1中的一者或多者的基因。
103.一种用于降低细胞中酶活性的方法，其包括改变编码LMF1和APOC2中的一者或多者的基因。
104.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的表达。
105.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
106.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
107.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的表达。
108.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
109.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的表达。
110.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统敲低或敲除LMF1和APOC2的表达。
111.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA和PPT1的核酸序列，使得所述LPLA2、LPL、LIPA和PPT1具有降低的或消除的酶活性。
112.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得所述HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。
113.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得所述LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。
114.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE的核酸序列，使得所述LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A和SIAE具有降低的或消除的酶活性。
115.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得所述LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。
116.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1的核酸序列，使得所述LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L和LYPLA1具有降低的或消除的酶活性。
117.一种用于降低或消除细胞中酶活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统改变编码LMF1和APOC2的核酸序列，使得所述LMF1和APOC2具有降低的或消除的酶活性。
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