TW202202620A - 經修飾之哺乳動物細胞 - Google Patents

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Abstract

本揭示涉及製造所關注之產物（例如重組蛋白質）之方法、細胞及組成物。特定而言，本揭示提供經改善之表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等細胞（例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞）具有某些宿主細胞蛋白質之經減少或消除之活性（例如，表現），該等宿主細胞蛋白質為例如酵素，其包括但不限於某些脂肪酶 (lipase)、酯酶 (esterase) 及/或水解酶。

Description

經修飾之哺乳動物細胞
本揭示涉及具有減少或消除某些宿主細胞蛋白（例如，宿主細胞酵素，其包括但不限於某些脂肪酶、酯酶及/或水解酶）活性之經修飾之哺乳動物細胞（例如，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞）、用於製備此等細胞的方法，以及使用此等細胞生產所關注之產物（例如，重組蛋白質）的方法。
哺乳動物細胞（例如 CHO 細胞）表現許多對細胞生長、存活及/或生產力非必要之蛋白質。然而，這些宿主細胞蛋白質的表現消耗相當多細胞的能量及 DNA/蛋白質建構單元。減少或消除此等蛋白質的表現可使細胞生長更有效率。此外，在細胞用於生產所關注之產物的情況下，例如重組蛋白質，這些蛋白質中的一些可以與所關注之產物共純化，從而導致與額外之純化過程相關的成本增加及/或所得產物的保存期限降低。例如，與所關注之產物共純化之某些殘留的宿主細胞蛋白質，可降解最終藥物產物中作為界面活性劑的聚山梨糖醇酯，並導致顆粒形成（Dixit 等人，J Pharm Sci, 2016, 第 105 卷，第 5 期，第 1657–1666 頁）。因此，本領域需要用於製造所關注之產物（例如重組蛋白質）的方法、細胞和組成物，其中表現所關注之產物的細胞已經減少或消除某些對細胞生長、存活及/或生產力非必要的宿主細胞蛋白質之活性（例如表現），該宿主細胞蛋白質為例如酵素，其包括但不限於某些脂肪酶、酯酶及/或水解酶。例如，減少殘餘之 CHO 宿主細胞蛋白質（其與 mAb 共純化且後續在藥物產物中降解聚山梨糖醇酯）水解活性的研究引起脂蛋白脂酶 (LPL) 的識別：剔除 LPL 的 CHO 細胞株使得細胞培養收獲物的聚山梨糖醇酯降解比野生型對應物少 41-57%（Chiu 等人，Biotechnol Bioeng, 2017, 第 114 卷，第 5 期，第 1006-1015 頁）。藉由減少或消除此等酵素的表現，可以減輕相關酵素活性的負面影響（例如，藥物產物中的聚山梨糖醇酯被殘留的水解酶水解降解）。然而，該研究並未確定在細胞培養收獲期觀察到之 LPL 剔除的益處是否透過下游處理而得以維持。重要的是，測試從剔除之細胞株所生成的純化物質，來證明純化後可獲得益處，從而轉化為藥物產物的益處。
本揭示涉及具有減少或消除某些宿主細胞蛋白（例如，宿主細胞酵素，其包括但不限於某些脂肪酶、酯酶及/或水解酶）活性之經修飾之哺乳動物細胞（例如，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞）、用於製備此等細胞的方法，以及使用此等細胞生產所關注之產物（例如，重組蛋白質）的方法。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除一種或多種酵素之活性。在某些實施例中，該一種或多種酵素係選自由下列所組成之群組：脂蛋白脂酶 (LPL)；磷脂酶 B 結構域含蛋白 2 (PLBL2/PLBD2)；脂肪酶 A（胞溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶，脂肪酶）(LIPA)；磷脂酶 A-2 活化蛋白 (PLAA)；磷脂酶 D3 (PLD3)；磷脂酶 A2 第 XV 類 (LPLA2)；磷脂酶 C β 1 (PLCB1)；磷脂酶 C δ 1 (PLCD1)；DDHD 結構域含蛋白 1（片段）(DDHD1)；類溶磷脂酶蛋白 1 (LYPLAL1)；磷脂酶 A2 第 XIIA 類 (PLA2G12A)；過氧化物氧化還原蛋白 6 (PRDX6)；神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SMPD1)；棕櫚醯基蛋白硫酯酶 1 (PPT1)；乙酸異戊酯水解酯酶 1（推定）(IAH1)；OTU 去泛素酶，泛素醛結合 1 (OTUB1)；溶磷脂酶 2（醯基蛋白硫酯酶 2）(LYPLA2)；醯基輔酶 A 硫酯酶 13 (ACOT13)；脂肪酸合成酶 (FASN)；磷脂酶 A2 第 VII 類 (PLA2G7)；泛素特異性肽酶 5 (USP5)；N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1（酸神經醯胺酶）(ASAH1)；脂肪酶成熟因子 1 (LMF1)；載脂蛋白-CII (APOC2)；醯基肉鹼水解酶 (HACH)；羧酸酯酶 1F (CES1F) 或類肝臟羧酸酯酶 B-1 (CES-B1L)；溶磷脂酶 1 (LYPLA1)；羧酸酯酶 1 (CES1)；磷脂酶 A1 成員 A (PLA1A)；以及唾液酸乙酸酯酶 (SIAE)。
在某些實施例中，以下之活性在重組宿主細胞中經減少或消除：a) PPT1； b) LPLA2、LPL 及 LIPA；c) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1；d) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A；e) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SPD1；f) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13；g) LPLA2、LPL 及 PPT1；h) LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1；i) HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；j) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；k) SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；l) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；m) LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；n) LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；o) LMF1 及 APOC2。
在某些實施例中，重組宿主細胞中的該一種或多種酵素之活性是藉由下列方式來減少或消除：(a) 敲落該酵素之表現；(b) 或剔除該酵素之表現；或 (c) 修改編碼該酵素之核酸序列。
在某些實施例中，本揭示針對一種重組宿主細胞，其包含一個或多個經修改之酵素基因。在某些實施例中，該一個或多個經修改之酵素基因不具有可偵測之酵素活性。在某些實施例中，該重組宿主細胞包含編碼所關注之產物之核酸序列。在某些實施例中，該核酸序列經嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。在某些實施例中，該重組宿主細胞進一步包含編碼該所關注之產物之核酸，該核酸隨機嵌入在該哺乳動物細胞的細胞基因體中。在某些實施例中，該經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供包含如本揭示所述之重組宿主細胞的組成物。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得下列者之活性減少：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含選擇具有下列者之活性減少之細胞：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含修改編碼下列中之一者或多者的基因：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼下列中之一者或多者之核酸序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A 及/或 SIAE，而使下列中之一者或多者具有經減少或消除之酵素活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物的哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物的哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其包含一個或多個經修改之酵素基因。在某些實施例中，該一個或多個經修改之酵素基因是藉由破壞編碼區域來修改。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因修改包含雙等位 (biallelic) 修改。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因修改包含刪除 1 個或更多個鹼基對、2 個或更多個鹼基對、3 個或更多個鹼基對、4 個或更多個鹼基對、5 個或更多個鹼基對、6 個或更多個鹼基對、7 個或更多個鹼基對、8 個或更多個鹼基對、9 個或更多個鹼基對、10 個或更多個鹼基對、11 個或更多個鹼基對、12 個或更多個鹼基對、13 個或更多個鹼基對、14 個或更多個鹼基對、15 個或更多個鹼基對、16 個或更多個鹼基對、17 個或更多個鹼基對、18 個或更多個鹼基對、19 個或更多個鹼基對、或 20 個或更多個鹼基對。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因為下列者：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統選自由下列所組成之群組：CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統為 CRISPR/Cas9 系統。
在某些如上所述之實施例中，該 CRISPR/Cas9 系統包含：(a) Cas9 分子，以及 (b) 一個或多個導引 RNA (gRNA)，其包含與編碼下列者之基因中的標靶序列互補之靶定序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統包含選自由下列所組成之群組之 RNA：短髮夾 RNA (shRNA)、小干擾 RNA (siRNA) 及微小 RNA (miRNA)，其中該 RNA 與藉由下列基因中之一者或多者所表現的 mRNA 之一部分互補：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統為鋅指核酸酶 (ZFN) 系統或類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統。
在某些如上所述之實施例中，以下之活性在哺乳動物細胞中經減少或消除：a) PPT1； b) LPLA2、LPL 及 LIPA；c) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1；d) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A；e) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SPD1；f) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 或 g) LPLA2、LPL 及 PPT1；h) LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1；i) HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；j) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；k) SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；l) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；m) LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；n) LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；o) LMF1 及 APOC2。
在某些如上所述之實施例中，在本揭示中所提供之方法進一步包含純化該所關注之產物、收獲該所關注之產物及/或調製該所關注之產物。
在某些如上所述之實施例中，聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) 之降解是經減少的。在某些如上所述之實施例中，聚山梨糖醇酯 20（PS20 或 Tween 20）之降解是經減少的。在某些如上所述之實施例中，聚山梨糖醇酯 80（PS80 或 Tween 80）之降解是經減少的。
在某些如上所述之實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在某些如上所述之實施例中，該哺乳動物細胞為 CHO 細胞。
在某些如上所述之實施例中，該細胞表現所關注之產物。在某些如上所述之實施例中，藉由該等哺乳動物細胞所表現的該所關注之產物藉由核酸序列而被編碼。在某些如上所述之實施例中，該核酸序列經嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。在某些如上所述之實施例中，藉由該等細胞所表現的該所關注之產物進一步由隨機嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的核酸序列所編碼。
在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含蛋白質、病毒顆粒或病毒載體。在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含重組蛋白質。在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含抗體或其抗原結合片段。在某些如上所述之實施例中，該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些如上所述之實施例中，該抗體由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。在某些如上所述之實施例中，該抗體為嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。在某些如上所述之實施例中，該抗體為單株抗體。
在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL 及 LIPA。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL 及 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LMF1 及 APOC2。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL 及 LIPA 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL 及 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LMF1 及 APOC2 酵素之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 LIPA 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL 及 LIPA 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL 及 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LMF1 及 APOC2 的活性減少。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LMF1 及 APOC2 活性減少之細胞。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 PPT1 的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL 及 LIPA 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL 及 PPT1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LMF1 及 APOC2 中之一者或多者的基因。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 LIPA 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 PPT1 之核酸序列，而使該 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL 及 LIPA 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL 及 LIPA 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之核酸序列，而使該 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之核酸序列，而使該 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL 及 PPT1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL 及 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 及 PPT1 之核酸序列，而使該 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LMF1 及 APOC2 之核酸序列，而使該 LMF1 及 APOC2 具有經減少或消除之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LMF1 及 APOC2 之經減少或消除之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LMF1 及 APOC2 之經減少或消除之活性。
相關申請之交叉引用
本申請主張 2020 年 3 月 26 日申請的美國臨時申請案第 63/000,464 號、2020 年 12 月 21 日申請的美國臨時申請案第 63/128,419 號、以及 2021 年 3 月 1 日申請的美國臨時申請案第 63/155,225 號的利益；彼等之內容以引用方式全部併入本文中。
為求清楚，但不作為限制，將本揭示之標的的詳細描述分為以下小節： 定義、調節酵素活性、包含基因─特異性修飾的細胞、細胞培養方法；及產物。
定義
在本揭示之上下文以及在使用每個術語的特定上下文中，本說明書中使用的術語通常具有本領域中的普通含義。某些術語在下文或說明書的其他部分進行討論，以描述本揭示之組成物和方法以及如何製備和使用它們，為從業人員提供額外的指導。
如本文所用，「一」(a 或 an) 一字在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包含」結合使用時，可表示「一個」(one)，但這也和「一個或多個」、「至少一個」及「一個或多於一個」的含義一致。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變體意欲為不排除其他行為或結構之可能性之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。本揭示亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
術語「約」或「大約」係指特定值處於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所確定之可接受的誤差範圍內，其部分地取決於如何量測或確定該值，即 ，取決於量測系統的局限性。例如，按照本發明所屬技術領域中的實務，「約」意指 3 倍或 3 倍以上的標準偏差。可替代地，「約」意指給定值的至多 20%、最佳至多 10%、更佳至多 5% 並且更佳至多 1% 的範圍。可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，最佳地在數值的 5 倍以內，並且更佳地在數值的 2 倍以內。
術語「細胞培養基」及「培養基」係指用於生長哺乳動物細胞的營養液，通常可提供以下一種或多種類別的至少一種成分： 1) 一種能源，通常以碳水化合物（諸如葡萄糖）的形式； 2) 所有必要的胺基酸，通常是基本一組之二十個胺基酸加半胱胺酸； 3) 所需低濃度的維生素及/或其他有機化合物； 4) 游離的脂肪酸；及 5) 微量元素，其中微量元素定義為無機化合物或天然存在的元素，所需濃度通常非常低（通常在微莫耳範圍內）。
營養液可以視情況補充以下類別的一種或多種成分： 1) 激素和其他生長因子，例如胰島素、轉鐵蛋白和表皮生長因子； 2) 鹽和緩衝劑，例如鈣、鎂和磷酸鹽； 3) 核苷和鹼基，諸如腺苷、胸苷和次黃嘌呤；及 4) 蛋白質和組織水解產物。
「培養」細胞係指在適合於細胞存活及/或生長及/或增殖的條件下，使細胞與細胞培養基接觸。
「批式培養」係指在培養過程開始時，將用於細胞培養的所有成分（包括細胞和所有培養營養物）供應至培養生物反應器的培養。
如本文所用，「饋料批式細胞培養」係指分批培養，其中先將細胞和培養基供給至培養生物反應器，並在培養過程中向培養物中投入（連續地或以不連續的增量）額外的培養營養物，在培養終止前進行或不進行定期的細胞及/或產物收獲。
「灌注培養」有時也稱為連續培養，是藉由例如 過濾、包封、錨定至微載劑等將細胞限制在培養物中的培養，且培養基是連續地、逐步地或間歇地被導入（或這些的任意組合）並從培養生物反應器中移除。
如本文所用，術語「細胞」係指動物細胞、哺乳動物細胞、培養的細胞、宿主細胞、重組細胞及重組宿主細胞。這樣的細胞通常是從哺乳動物組織所獲得或衍生的細胞株，當置於含有適當營養及/或生長因子的培養基時，其能夠生長和存活。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」和「宿主細胞培養物」可互換使用，係指其中可能或已導入外源性核酸的細胞，包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，而與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量與親代細胞不需要完全相同，但可以含有突變。本文中包括具有與原始轉化細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。
術語「哺乳動物宿主細胞」或「哺乳動物細胞」係指衍生自哺乳動物的細胞株，其在被置於含有適當營養物和生長因子的培養基中進行單層培養或懸浮培養時，能夠生長和存活。特定細胞株所需的生長因子很容易根據經驗確定，無需進行過多的實驗，例如在哺乳動物細胞培養 (Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y.1984) 以及 Barnes 和 Sato, (1980) Cell, 22:649 中所描述的。通常而言，細胞能夠在培養基中表現和分泌大量所關注之特定蛋白質，例如 糖蛋白。在本揭示之範圍內，合適的哺乳動物宿主細胞的實例可以包括中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980)；dp12.CHO 細胞（公開於 1989 年 3 月 15 日的 EP 307,247）；CHO-K1 (ATCC, CCL-61)；SV40 轉化之猴子腎臟 CV1 株 (COS-7, ATCC CRL 1651)；人類胚胎腎細胞株（293 或用於在懸浮培養中生長之次選殖的 293 細胞，Graham 等人，J. Gen Virol., 36:59 1977）；嬰兒倉鼠腎細胞 (BHK, ATCC CCL 10)；小鼠賽特利細胞 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980)；猴子腎臟細胞 (CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎臟細胞 (VERO-76, ATCC CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL 2)；犬腎臟細胞 (MDCK, ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞 (BRL 3A, ATCC CRL 1442)；人類肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；人類肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤 (MMT 060562, ATCC CCL51)；TRI 細胞 (Mather 等人，Annals N.Y.Acad. Sci., 383:44-68 1982)；MRC 5 細胞；FS4 細胞；以及人類肝癌細胞株 (Hep G2)。在某些實施例中，該哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980)；dp12.CHO 細胞（公開於 1989 年 3 月 15 日的 EP 307,247）。
細胞培養的「生長期」係指呈指數性增長之細胞生長的時期（對數期），在此細胞通常迅速分裂。例如，細胞維持在生長期的持續時間可根據細胞類型、細胞的生長速率及/或培養條件而有不同。在某些實施例中，於此期，將細胞培養一段時間，通常在 1-4 天之間，並在使細胞生長最大化的條件下進行。無需過多實驗就即可設想，能針對特定宿主細胞確定宿主細胞的生長週期。「一段時間以及在使細胞生長最大化的條件下」等，係指對於特定細胞株而言，被確定為對於細胞生長和分裂最佳的那些培養條件。在某些實施例中，於生長期，細胞在含有必要添加劑的營養培養基中，通常在大約 30°C-40°C、潮濕、受控之大氣壓下培養，以使特定細胞株達到最佳的生長。在某些實施例中，細胞維持在生長期大約介於一天至四天之間的時間，通常介於二天至三天。
細胞培養的「生產期」係指細胞生長處於穩定狀態的一段時間。對數細胞生長通常在該期之前或期間減少，並由蛋白質生產接替。在生產期，對數細胞生長已經結束，並以蛋白質的生產為主。在這一段時間內，通常會補充培養基以支持繼續生產蛋白質，並獲得所需的糖蛋白產物。在此期，饋料批式及/或灌注細胞培養過程會補充細胞培養基或提供新鮮的培養基，以獲得及/或保持所需的細胞密度、生存力及/或重組蛋白質產物效價。生產期可以大規模執行。
如本文所用，關於蛋白質活性的術語「活性」係指蛋白質的任何活性，其包括但不限於酵素活性、配體結合、藥物轉運、離子運輸、蛋白質定位、受體結合及/或結構的活性。這種活性可以藉由減少或消除蛋白質的表現來調節（例如減少或消除），從而減少或消除蛋白質的存在。這種活性可以藉由修改編碼蛋白質之核酸序列來調節（例如減少或消除），因此，相對於野生型蛋白質，所得之經修飾的蛋白質表現出減少或消除的活性。
如本文所用，術語「表現」（expression 或 expresses）係指發生在宿主細胞內的轉錄及轉譯。產物基因在宿主細胞中的表現程度可以基於細胞中存在之相應的 mRNA 量或由細胞生產之產物基因編碼的蛋白質量來確定。例如，從產物基因轉錄的 mRNA 最好藉由北方雜交來定量。Sambrook 等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。由產物基因編碼的蛋白質，可藉由測定蛋白質的生物學活性或藉由採用獨立於此等活性之測定（諸如使用能與蛋白質反應之抗體的西方墨點法或放射性免疫測定法）來定量。Sambrook 等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。
如本文所用，「多肽」通常係指具有多於約十個胺基酸的肽或蛋白質。多肽可以與宿主細胞同源，或者優選地可以是外源的，這意指它們是異源的，即 對於所使用的宿主細胞而言是異物，諸如藉由中國倉鼠卵巢細胞生產的人類蛋白質，或者藉由哺乳動物細胞生產的酵母多肽。在某些實施例中，使用哺乳動物多肽（起初衍生自哺乳動物生物體的多肽），更優選地使用直接分泌到培養基中的多肽。
術語「蛋白」或「蛋白質」係指其鏈長足以產生較高級之三級及/或四級結構的胺基酸序列。這是為了與「肽」或其他不具有這種結構的小分子量藥物作區分。通常而言，本文之蛋白質將具有至少約 15-20 kD 的分子量，優選地至少約 20 kD。本文定義中涵蓋的蛋白質實例，其包括宿主細胞蛋白以及所有哺乳動物蛋白，特別是治療性和診斷性蛋白，諸如治療性和診斷性抗體，以及通常包含一個或多個二硫鍵的蛋白質，其包括包含一個或多個鏈間及/或鏈內二硫鍵的多鏈多肽。
術語「抗體」在本文中取最廣義的解釋，並涵蓋各種抗體結構，其包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體（例如 ，由單一重鏈序列和單一輕鏈序列所組成的抗體，其包括此類配對的多聚體）、多特異性抗體（例如 ，雙特異性抗體）和抗體片段，只要它們表現出所需的抗原結合活性即可。
如本文所用，抗體的「抗體片段」、「抗原結合部分」（或簡稱為「抗體部分」）或者抗體的「抗原結合片段」，係指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，與完整抗體所結合的抗原結合。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；從抗體片段所形成之雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子（例如 scFv 及 scFab）、單域抗體 (dAb) 及多特異性抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Holliger 及 Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)。
術語「嵌合」抗體係指其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類（同型 (isotype)），例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及 IgA2 。在某些實施例中，該抗體是屬 IgG1 同型。在某些實施例中，該抗體是屬 IgG2 同型。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
如本文所用，術語「效價」係指由細胞培養產生之重組表現抗體的總量，除以給定的培養基體積。效價通常以每毫升或每公升之培養基中抗體毫克數的單位（mg/ml 或 mg/L）表示。在某些實施例中，效價以每公升之培養基中抗體克數的單位 (g/L) 表示。效價可以根據相對的量測來表現或評估，諸如與在不同培養條件下所取得之蛋白質產物相比，效價的百分比增加。
術語「核酸」、「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基所構成，具體而言由嘌呤或嘧啶鹼基（即 ，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U)）、糖（即 ，去氧核糖或核糖）及磷酸基團所構成。通常，核酸分子藉由鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構（線性結構）。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋：脫氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如 互補 DNA (cDNA) 和基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以為線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的實例包括帶有衍生糖、磷酸骨架連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還涵蓋 DNA 和 RNA 分子，其適合作為用於在體外 及/或體內 （例如 在宿主或患者體內）直接表現本揭示之抗體的載體。此等 DNA（例如 ，cDNA）或 RNA（例如 ，mRNA）載體可以為未經修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而將 mRNA 注入受試者體內 以生成抗體（參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，2017 年 6 月 12 日在線上公開，doi:10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1）。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠運輸已與之連接的另一種核酸。
「人類抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或自利用人類抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人類抗體編碼序列之非人類來源衍生之抗體之胺基酸序列。人類抗體的該定義具體而言排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人類 CDR 之胺基酸殘基及來自人類 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些方面，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR 對應於非人類抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人類抗體之其等。人源化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體（例如 非人類抗體）之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
如本文所用，術語「超可變區」或「HVR」係指抗體可變域中序列高變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。
一般而言，抗體包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，及三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 超可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處（Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3) 處（Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第 5 版 Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991)）；及 (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處（MacCallum 等人J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）。
除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，也可以根據 Chothia 在上述文獻、McCallum 在上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名系統來確定 CDR 名稱。
「免疫共軛物」為與一個或多個異源分子共軛之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
如本文中所用，術語「單株抗體」係指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即 群體中包含的個別抗體係相同的及/或結合相同的表位，但不包括（例如 ）含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與通常包括針對不同決定位（表位）之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同源之抗體群體，並且不應解釋為需要藉由任何特定方法生產該抗體。例如，意欲根據本揭示標的之單株抗體可藉由多種技術來製造，其包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人類免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合之抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈（分別為 VH 及 VL）之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保守性框架區 (FR) 及三個互補決定區 (CDR)。（參見 ，例如 ，Kindt 等人，Kuby Immunology , 第 6 版，W.H. Freeman and Co., 第 91 頁 (2007)。）  單個 VH 或 VL 域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見 ，例如 ，Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。
如本文中所用，術語「細胞密度」係指在給定之培養基體積中細胞的數量。在某些實施例中，期望高細胞密度，因為其可以導向更高的蛋白質生產力。細胞密度可藉由本領域習知的技術來監測，其包含但不限於從培養物中提取樣本並在顯微鏡下分析細胞，使用商業上可取得之細胞計數裝置，或使用導入生物反應器本身之商業上可取得之合適探針（或進入一個循環，培養基和懸浮細胞通過該循環，然後返回到生物反應器中）。
如本文中所用，術語「重組細胞」係指從其衍生之原始親代細胞進行了一些遺傳修飾的細胞。這種基因的修飾可以是導入用於表現基因產物（例如 重組蛋白質）之異源基因的結果。
如本文中所用，術語「重組蛋白」通常係指肽及蛋白質，其包括抗體。這種重組蛋白是「異源的」，即 對於所使用的宿主細胞而言是異物，諸如藉由 CHO 細胞生產的抗體。
術語「PS20」係指聚山梨糖醇酯 20 或 Tween 20。術語「PS80」係指聚山梨糖醇酯 80 或 Tween 80。PS20 和 PS80 為具有脂肪酸酯部分和長聚氧乙烯鏈的聚山梨糖醇酯界面活性劑。
調節酵素活性
在某些實施例中，本揭示涉及調節一種或多種宿主細胞蛋白質活性的方法，例如酵素活性，其包含但不限於脂肪酶、酯酶或水解酶。例如，但不作為限制，調節宿主細胞中酵素活性（其包含但不限於脂肪酶、酯酶及/或水解酶蛋白質）的方法包括減少或消除細胞中相應之多肽的活性。在某些實施例中，重組宿主細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的蛋白質之活性而減少或消除一種或多種蛋白質之活性。在某些實施例中，脂蛋白脂酶 (LPL)；磷脂酶 B 結構域含蛋白 (PLBL2/PLBD2)；脂肪酶 A（胞溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶，脂肪酶）(LIPA)；磷脂酶 A-2 活化蛋白 (PLAA)；磷脂酶 D3 (PLD3)；磷脂酶 A2 群 (LPLA2)；磷脂酶 C β 1 (PLCB1)；磷脂酶 C δ 1 (PLCD1)；DDHD 結構域含蛋白 1（片段）(DDHD1)；類溶磷脂酶蛋白 1 (LYPLAL1)；磷脂酶 A2 第 XIIA 類 (PLA2G12A)；過氧化物氧化還原蛋白 6 (PRDX6)；神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SMPD1)；棕櫚醯基蛋白硫酯酶 1 (PPT1)；乙酸異戊酯水解酯酶 1 (IAH1)；OTU 去泛素酶，泛素醛結合 1 (OTUB1)；溶磷脂酶 2（醯基蛋白硫酯酶 2）(LYPLA2)；醯基輔酶 A 硫酯酶 13 (ACOT13)；脂肪酸合成酶 (FASN)；磷脂酶 A2 第 VII 類 (PLA2G7)；泛素特異性肽酶 5 (USP5)；N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1（酸神經醯胺酶）(ASAH1)；脂肪酶成熟因子 1 (LMF1)；載脂蛋白-CII (APOC2)；醯基肉鹼水解酶 (HACH)；羧酸酯酶 1F (CES1F) 或類肝臟羧酸酯酶 B-1 (CES-B1L)；溶磷脂酶 1 (LYPLA1)；羧酸酯酶 1 (CES1)；磷脂酶 A1 成員 A (PLA1A)；以及唾液酸乙酸酯酶 (SIAE) 的活性是經減少或消除的。
在某些實施例中，PPT1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL 及 LIPA 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SPD1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL 及 PPT1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性是經減少或消除的。在某些實施例中，LMF1 及 APOC2 的活性是經減少或消除的。
在某些實施例中，參考細胞為特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之活性未經調節（例如 ，減少或消除）的細胞，。在某些實施例中，參考細胞為包含至少一個或兩個編碼為以下蛋白質之基因的野生型等位基因細胞：BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE。例如，但不作為現制，參考細胞為具有兩個編碼為以下蛋白質之基因的野生型等位基因細胞：BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE。在某些實施例中，參考細胞為 WT CHO 細胞。
在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的小於約 90%、小於約 80%、小於約 70%、小於約 60%、小於約 50%、小於約 40%、小於約 30%、小於約 20%、小於約 10%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的小於約 90%、小於約 80%、小於約 70%、小於約 60%、小於約 50%、小於約 40%、小於約 30%、小於約 20%、小於約 10%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的至少約 90%、至少約 80%、至少約 70%、至少約 60%、至少約 50%、至少約 40%、至少約 30%、至少約 20%、至少約 10%、至少約 5%、至少約 4%、至少約 3%、至少約 2% 或至少約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的至少約 90%、至少約 80%、至少約 70%、至少約 60%、至少約 50%、至少約 40%、至少約 30%、至少約 20%、至少約 10%、至少約 5%、至少約 4%、至少約 3%、至少約 2% 或至少約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的不超過約 90%、不超過約 80%、不超過約 70%、不超過約 60%、不超過約 50%、不超過約 40%、不超過約 30%、不超過約 20%、不超過約 10%、不超過約 5%、不超過約 4%、不超過約 3%、不超過約 2% 或不超過約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的不超過約 40%。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的不超過約 90%、不超過約 80%、不超過約 70%、不超過約 60%、不超過約 50%、不超過約 40%、不超過約 30%、不超過約 20%、不超過約 10%、不超過約 5%、不超過約 4%、不超過約 3%、不超過約 2% 或不超過約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的介於約 1% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 1% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 1% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 1% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 1% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 1% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 1% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 1% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、介於約 1% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 30% 之間、介於約 5% 和約 40% 之間。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的介於約 1% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 1% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 1% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 1% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 1% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 1% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 1% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 1% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、介於約 1% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 30% 之間、介於約 5% 和約 40% 之間。
在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的介於約 5% 和約 40% 之間。在某些實施例中，在已經修飾以減少或消除多肽活性的細胞中，該多肽的活性為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽活性的介於約 5% 和約 40% 之間。該多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之活性在不同參考細胞（例如 包含至少一個或兩個相應之基因的野生型等位基因細胞）中的可以有所不同。
在某些實施例中，採用遺傳工程系統來調節（例如 ，減少或消除）特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 活性）之活性。各種本領域習知的遺傳工程系統可用於本文所揭示之方法。此等系統之非限制性實例包括 CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統，以及使用其他工具藉由基因緘默化來敲落蛋白質，諸如小干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA) 及微小 RNA (miRNA)。本領域已知之任何 CRISPR/Cas 系統（其包括傳統的、增強的或修飾的 Cas 系統）以及其他基於細菌之基因體切除工具（諸如 Cpf-1），都可以與本文揭示之方法一起使用。
在某些實施例中，基因之一部分（例如，編碼為 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽的基因）為經修飾以調節（例如 ，減少或消除）相應之多肽的活性。在某些實施例中，至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 的基因為經修飾的。在某些實施例中，不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85% 或不超過約 90% 的基因為經修飾的。在某些實施例中，介於約 2% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 2% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 2% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 2% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 2% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 2% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 2% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 2% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、 介於約 2% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間或介於約 2% 和約 5% 之間的基因為經修飾的。
在某些實施例中，本揭示涉及調節在宿主細胞中之一種或多種基因活性的方法，例如編碼為酵素的基因，其包含但不限於脂肪酶、酯酶或水解酶。例如，但不作為限制，用於調節一種或多種酵素基因（其包括但不限於宿主細胞中的脂肪酶、酯酶及/或水解酶基因）之活性的方法，其包括剔除或敲落細胞中相應之多肽表現。在某些實施例中，LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；(LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，PLBL2 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL 及 LIPA 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL 及 PPT1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的表現為經敲落或剔除的。在某些實施例中，LMF1 及 APOC2 的表現為經敲落或剔除的。如本文所用，剔除表現係指與參考細胞相比，消除細胞中特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）的表現。如本文所用，敲落表現係指與參考細胞相比，減少細胞中多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）的表現。
在某些實施例中，參考細胞為特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之表現未經調節（例如 ，減少）的細胞。在某些實施例中，參考細胞為包含至少一個或兩個編碼為以下蛋白質之基因的野生型等位基因細胞：BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE。例如，但不作為現制，參考細胞為具有兩個編碼為以下蛋白質之基因的野生型等位基因細胞：BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE。在某些實施例中，參考細胞為 WT CHO 細胞。
在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的小於約 90%、小於約 80%、小於約 70%、小於約 60%、小於約 50%、小於約 40%、小於約 30%、小於約 20%、小於約 10%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的小於約 90%、小於約 80%、小於約 70%、小於約 60%、小於約 50%、小於約 40%、小於約 30%、小於約 20%、小於約 10%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的至少約 90%、至少約 80%、至少約 70%、至少約 60%、至少約 50%、至少約 40%、至少約 30%、至少約 20%、至少約 10%、至少約 5%、至少約 4%、至少約 3%、至少約 2% 或至少約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的至少約 90%、至少約 80%、至少約 70%、至少約 60%、至少約 50%、至少約 40%、至少約 30%、至少約 20%、至少約 10%、至少約 5%、至少約 4%、至少約 3%、至少約 2% 或至少約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以敲落特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的不超過約 90%、不超過約 80%、不超過約 70%、不超過約 60%、不超過約 50%、不超過約 40%、不超過約 30%、不超過約 20%、不超過約 10%、不超過約 5%、不超過約 4%、不超過約 3%、不超過約 2% 或不超過約 1%。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的不超過約 40%。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的不超過約 90%、不超過約 80%、不超過約 70%、不超過約 60%、不超過約 50%、不超過約 40%、不超過約 30%、不超過約 20%、不超過約 10%、不超過約 5%、不超過約 4%、不超過約 3%、不超過約 2% 或不超過約 1%。
在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的介於約 1% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 1% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 1% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 1% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 1% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 1% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 1% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 1% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、介於約 1% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 30% 之間、介於約 5% 和約 40% 之間。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的介於約 1% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 1% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 1% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 1% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 1% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 1% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 1% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 1% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、介於約 1% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 30% 之間、介於約 5% 和約 40% 之間。
在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的介於約 5% 和約 40% 之間。在某些實施例中，在已經修飾以敲落多肽表現的細胞中，該多肽的表現為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應多肽表現的介於約 5% 和約 40% 之間。該多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之表現程度在不同參考細胞（例如 包含至少一個或兩個相應之基因的野生型等位基因細胞）中的可以有所不同。
在某些實施例中，採用遺傳工程系統來調節（例如 ，敲落或剔除）特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 表現）之表現。各種本領域習知的遺傳工程系統可用於本文所揭示之方法。此等系統之非限制性實例包括 CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統，以及使用其他工具藉由基因緘默化來敲落蛋白質，諸如小干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA) 及微小 RNA (miRNA)。本領域已知之任何 CRISPR/Cas 系統（其包括傳統的、增強的或修飾的 Cas 系統）以及其他基於細菌之基因體切除工具（諸如 Cpf-1），都可以與本文揭示之方法一起使用。
在某些實施例中，基因之一部分（例如編碼為 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽的基因）為經刪除以調節（例如 ，敲落或剔除）相應之多肽的表現。在某些實施例中，至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85% 或至少約 90% 的基因為經刪除的。在某些實施例中，不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85% 或不超過約 90% 的基因為經刪除的。在某些實施例中，介於約 2% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 2% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 2% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 2% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 2% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 2% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 2% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 2% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20% 之間、 介於約 2% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間或介於約 2% 和約 5% 之間的基因為經刪除的。
在某些實施例中，編碼為 BAX；BAK；LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE 多肽之基因的至少一個外顯子為至少經部分刪除的。如本文所用，「部分刪除」係指至少約 2%、至少約 5%、至少約 10%、至少約 15%、至少約 20%、至少約 25%、至少約 30%、至少約 35%、至少約 40%、至少約 45%、至少約 50%、至少約 55%、至少約 60%、至少約 65%、至少約 70%、至少約 75%、至少約 80%、至少約 85%、至少約 90%、至少約 95%、不超過約 2%、不超過約 5%、不超過約 10%、不超過約 15%、不超過約 20%、不超過約 25%、不超過約 30%、不超過約 35%、不超過約 40%、不超過約 45%、不超過約 50%、不超過約 55%、不超過約 60%、不超過約 65%、不超過約 70%、不超過約 75%、不超過約 80%、不超過約 85%、不超過約 90%、不超過約 95%、介於約 2% 和約 90% 之間、介於約 10% 和約 90% 之間、介於約 20% 和約 90% 之間、介於約 25% 和約 90% 之間、介於約 30% 和約 90% 之間、介於約 40% 和約 90% 之間、介於約 50% 和約 90% 之間、介於約 60% 和約 90% 之間、介於約 70% 和約 90% 之間、介於約 80% 和約 90% 之間、介於約 85% 和約 90% 之間、介於約 2% 和約 80% 之間、介於約 10% 和約 80% 之間、介於約 20% 和約 80% 之間、介於約 30% 和約 80% 之間、介於約 40% 和約 80% 之間、介於約 50% 和約 80% 之間、介於約 60% 和約 80% 之間、介於約 70% 和約 80% 之間、介於約 75% 和約 80% 之間、介於約 2% 和約 70% 之間、介於約 10% 和約 70% 之間、介於約 20% 和約 70% 之間、介於約 30% 和約 70% 之間、介於約 40% 和約 70% 之間、介於約 50% 和約 70% 之間、介於約 60% 和約 70% 之間、介於約 65% 和約 70% 之間、介於約 2% 和約 60% 之間、介於約 10% 和約 60% 之間、介於約 20% 和約 60% 之間、介於約 30% 和約 60% 之間、介於約 40% 和約 60% 之間、介於約 50% 和約 60% 之間、介於約 55% 和約 60% 之間、介於約 2% 和約 50% 之間、介於約 10% 和約 50% 之間、介於約 20% 和約 50% 之間、介於約 30% 和約 50% 之間、介於約 40% 和約 50% 之間、介於約 45% 和約 50% 之間、介於約 2% 和約 40% 之間、介於約 10% 和約 40% 之間、介於約 20% 和約 40% 之間、介於約 30% 和約 40% 之間、介於約 35% 和約 40% 之間、介於約 2% 和約 30% 之間、介於約 10% 和約 30% 之間、介於約 20% 和約 30% 之間、介於約 25% 和約 30% 之間、介於約 2% 和約 20% 之間、介於約 5% 和約 20% 之間、介於約 10% 和約 20% 之間、介於約 15% 和約 20%、介於約 2% 和約 10% 之間、介於約 5% 和約 10% 之間或介於約 2% 和約 5% 之間的區域（例如 外顯子）為經刪除的。
在某些非限制性實施例中，採用 CRISPR/Cas9 系統來調節多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之表現。簇狀規則性間隔的短迴文重複序列 (CRISPR) 系統為在原核細胞中發現的基因體編輯工具。當用於基因體編輯時，該系統包括 Cas9（一種能夠使用 crRNA 作為其導引來修飾 DNA 的蛋白質）、CRISPR RNA（crRNA，其包含 Cas9 用來導引其到達宿主 DNA 正確區段的 RNA，以及與 tracrRNA 結合的區域（通常以髮夾環圈形式），並與 Cas9 形成活性複合物）及反式活化 crRNA（tracrRNA，其與 crRNA 結合並與 Cas9 形成活性複合物）。術語「導引 RNA」及「gRNA」係指促進 RNA 導引的核酸酶（諸如 Cas9）與標靶序列（諸如細胞中的基因體或游離序列）特異性聯結（或「靶向」）的任何核酸。gRNA 可以為單分子的（其包含單個 RNA 分子，也可替代地稱為嵌合）或為模塊的（其包含一個以上，且通常為兩個獨立的 RNA 分子，諸如 crRNA 和 tracrRNA，它們通常相互聯結，例如通過雙鏈聯結）。
CRISPR/Cas9 策略可採用載體來轉染哺乳動物細胞。可以為每種應用設計導引 RNA (gRNA)，因為這是 Cas9 用來識別並直接結合細胞中標靶 DNA 的序列。多個 crRNA 和 tracrRNA 可以包裝在一起以形成單一導引 RNA（sgRNA）。可以將 sgRNA 與 Cas9 基因連接在一起並製成載體，以便轉染至細胞中。
在某些實施例中，用於調節一種或多種多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）表現的 CRISPR/Cas9 系統包含 Cas9 分子和一種或多種包含靶向域的 gRNA，該靶向域與編碼為所關注之多肽之基因的標靶序列互補。在某些實施例中，該標靶基因是編碼為所關注之多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之基因的區域。該標靶序列可以為基因內的任何外顯子或內含子區域。
在某些實施例中，gRNA 以單一載體投予至細胞，而 Cas9 分子以第二載體投予至細胞。在某些實施例中，gRNA 和 Cas9 分子以單一載體投予至細胞。可替代地，gRNAs 和 Cas9 分子可以獨立的載體投予。在某些實施例中，CRISPR/Cas9 系統可以核糖核蛋白複合物 (RNP) 的形式遞送到細胞中，該複合物包含與一種或多種 gRNA 複合的 Cas9 蛋白，例如 ，藉由電穿孔來遞送（例如 ，將 RNP 遞送至細胞的其他方法，請參見 DeWitt 等人，Methods 121-122:9-15 (2017)）。在某些實施例中，將 CRISPR/Cas9 系統投予至細胞，使得多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）之表現的剔除或敲落。
在某些實施例中，該遺傳工程系統為 ZFN 系統，其用於調節特定多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）在哺乳動物細胞中的表現。ZFN 可以作為限制酵素，其是藉由將鋅指 DNA 結合域與 DNA 切割域結合所生成。鋅指域可以經工程改造以靶向特定的 DNA 序列，其使鋅指核酸酶靶向基因體內所需的序列。個別之 ZFN 的 DNA 結合域通常包含複數個個別鋅指重複序列，並且每個都可以識別複數個鹼基對。生成新的鋅指域的最常見方法為組合已知特異性較小的鋅指「模塊」。ZFN 中最常見的切割域為來自第 II 型限制性核酸內切酶 FokI 的非特異性切割域。ZFN 藉由在標靶 DNA 序列中製造雙股裂縫 (DSB) 來調節蛋白質的表現，其將（在沒有同源模板的情況下）藉由非同源末端連接 (NHEJ) 進行修復。此類修復可使得鹼基對的缺失或插入，製造框移並阻止有害蛋白質的產生（Durai 等人，Nucleic Acids Res. ; 33 (18): 5978–90 (2005)）。多對 ZFN 還可用於完全去除基因體序列的整個大片段（Lee 等人，Genome Res. ; 20 (1): 81–9 (2010)）。
在某些實施例中，該遺傳工程系統為 TALEN 系統，其用於調節特定多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）在哺乳動物細胞中的表現。TALEN 為限制酵素，其可經工程改造以剪切特定的 DNA 序列。TALEN 系統的操作原理與 ZFN 相似。藉由結合類轉錄活化因子效應因子 DNA 結合域和 DNA 切割域來生成 TALEN。類轉錄活化因子效應因子 (TALE) 為由具有兩個可變位置之 33-34 個胺基酸重複模體所組成，該可變位置對特定核苷酸具有很強的識別能力。藉由組裝這些 TALE 的陣列，可以對 TALE DNA 結合域進行工程改造以結合所需的 DNA 序列，從而導引核酸酶剪切基因體中的特定的位置（Boch 等人，Nature Biotechnology ; 29(2):135-6 (2011)）。在某些實施例中，該標靶基因編碼為 BAX；BAK；LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，可以使用對相應之核酸（例如 mRNA）具有互補序列的寡核苷酸來敲落特定之多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE）的表現。此類寡核苷酸的非限制性實例包括小干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA) 和微小 RNA (miRNA)。在某些實施例中，此類寡核苷酸可與 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 核酸序列的至少一部分同源，其中該部分相對於相應之核酸序列的同源性百分比至少約 75% 或至少約 80% 或至少約 85% 或至少約 90% 或至少約 95% 或至少約 98%。在某些非限制性實施例中，互補部分可以構成至少 10 個核苷酸或至少 15 個核苷酸或至少 20 個核苷酸或至少 25 個核苷酸或至少 30 個核苷酸，以及反義核酸、shRNA、mRNA 或 siRNA 分子可以最多 15 個或最多 20 個或最多 25 個或最多 30 個或最多 35 個或最多 40 個或最多 45 個或最多 50 個或最多 75 個或最多 100 個核苷酸的長度。反義核酸、shRNA、mRNA 或 siRNA 分子可包含 DNA 或非典型或非天然存在的殘基，例如但不限於硫代磷酸酯殘基。
可以使用病毒載體（例如 反轉錄病毒載體，諸如 γ 反轉錄病毒載體和慢病毒載體）將本文揭示之遺傳工程系統遞送到哺乳動物細胞中。反轉錄病毒載體和適當之包裝株的組合是合適的，其中殼體蛋白將具有感染人類細胞的功能。已知多種製造兩性病毒的細胞株，其包括但不限於 PA12（Miller 等人 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437）、PA317（Miller 等人 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902）和 CRIP（Danos 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464）。非兩性顆粒也是合適的，例如 用 VSVG、RD114 或 GALV 套膜和任何其他本領域習知的來假型化之顆粒。可能的轉導方法還包括直接將細胞與生產細胞共培養，例如 藉由 Bregni 等人 (1992) Blood 80:1418-1422 的方法，或者僅使用病毒上清液或者含有或不含有適當生長因子和聚陽離子的濃縮載體原種進行培養，例如 藉由 Xu 等人 (1994) Exp. Hemat.22:223-230；及 Hughes 等人 (1992) J. Clin. Invest. 89:1817 的方法。
其他轉導病毒載體可用於修飾本文揭示之哺乳動物細胞。在某些實施例中，所選擇的載體呈現出高感染的效率以及穩定的嵌入和表現（參見，例如 ，Cayouette 等人，Human Gene Therapy 8:423-430, 1997；Kido 等人，Current Eye Research 15:833-844, 1996；Bloomer 等人，Journal of Virology 71:6641-6649, 1997；Naldini 等人，Science 272:263-267, 1996；及 Miyoshi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94:10319, 1997）。可以使用的其他病毒載體包括，例如，腺病毒、慢病毒及與腺相關的病毒載體、牛痘病毒、牛乳突狀瘤病毒或皰疹病毒，諸如 Epstein-Barr 病毒（同參見，例如，Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990；Friedman, Science 244:1275-1281, 1989；Eglitis 等人，BioTechniques 6:608-614, 1988；Tolstoshev 等人，Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991；Cornetta 等人，Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987；Anderson, Science 226:401-409, 1984；Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991；Miller 等人，Biotechnology 7:980-990, 1989；LeGal La Salle 等人，Science 259:988-990, 1993；及 Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995 中的載體）。反轉錄病毒載體發展得特別完善並已用於臨床環境（Rosenberg 等人，N. Engl. J. Med 323:370, 1990；Anderson 等人，U.S. Pat. No. 5,399,346）。
非病毒方法也可以用於本文所揭示之哺乳動物細胞的遺傳工程。例如，可以藉由在脂轉染（Feigner 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.84:7413, 1987；Ono 等人，Neuroscience Letters 17:259, 1990；Brigham 等人，Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989；Staubinger 等人，Methods in Enzymology 101:512, 1983）、去唾液酸血清類黏蛋白-聚離胺酸接合（Wu 等人，Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988；Wu 等人，Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）或在手術條件之下顯微注射（Wolff 等人，Science 247:1465, 1990）的情況下，投予核酸來將核酸分子導入哺乳動物細胞。用於基因轉移的其他非病毒手段包括使用磷酸鈣、DEAE 葡聚糖、電穿孔和原生質體融合在體外轉染。脂質體對於將核酸分子遞送到細胞中也可能為有益的。向受試者受影響之組織移植正常基因也可以藉由轉移正常核酸到可離體 培養之細胞類型（例如 自體或異源原代細胞或其子代細胞）中來完成，然後將細胞（或其子代）注射到標靶組織中或全身注射。
包含基因 ─ 特異性修飾的細胞
在一個方面，本揭示涉及細胞或組成物，其包含具有減少或消除之一種或多種多肽（例如一種或多種酵素，例如一種或多種脂肪酶、固醇酶及/或水解酶）活性的一種或多種細胞（例如 哺乳動物細胞）。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 PLBL2 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL 及 LIPA 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL 及 PPT1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 PPT1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之活性。在某些實施例中，該細胞已減少或消除 LMF1 及 APOC2 之活性。
如本文所用，消除活性係指與參考細胞相比，消除細胞中特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）的活性。如本文所用，降低活性係指與參考細胞相比，減少細胞中多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）的活性。
關於本揭示標的之有用之細胞的非限制性實例包括 CHO 細胞（例如 ，DHFR CHO 細胞）、dp12.CHO 細胞、CHO-K1 (ATCC, CCL-61)、SV40 轉化之猴子腎臟 CV1 株（例如 ，COS-7 ATCC CRL-1651）、人類胚胎腎細胞株（例如 ，293 或用於在懸浮培養中生長之次選殖的 293 細胞）、嬰兒倉鼠腎細胞（例如 ，BHK, ATCC CCL 10）、小鼠賽特利細胞（例如 ，TM4）、猴子腎臟細胞（例如 ，CV1 ATCC CCL 70）、非洲綠猴腎臟細胞（例如 ，VERO-76, ATCC CRL-1587）、人類子宮頸癌細胞（例如 ，HELA, ATCC CCL 2）、犬腎臟細胞（例如 ，MDCK, ATCC CCL 34）、水牛大鼠肝細胞（例如 ，BRL 3A, ATCC CRL 1442）、人類肺細胞（例如 ，W138, ATCC CCL 75）、人類肝細胞（例如 ，Hep G2, HB 8065）、小鼠乳腺腫瘤（例如 ，MMT 060562, ATCC CCL51）、TRI 細胞、MRC 5 細胞、FS4 細胞、人類肝癌細胞株（例如 ，Hep G2）、骨髓瘤細胞株（例如 ，Y0、NS0 及 Sp2/0）。在某些實施例中，該細胞為 CHO 細胞。CHO 宿主細胞的其他非限制性實例包括 CHO K1SV 細胞、CHO DG44 細胞、CHO DUKXB-11 細胞、CHOK1S 細胞和 CHO K1M 細胞。
在某些實施例中，本文所揭示之細胞表現所關注之產物。在某些實施例中，所關注之產物為重組蛋白質。在某些實施例中，所關注之產物為單株抗體。所關注之產物的其他非限制性實例提供於 5.5 節。
在某些實施例中，本文所揭示之細胞可用於生產商業上有用量之所關注之產物。在某些實施例中，相對於參考細胞（例如 WT CHO 細胞），本文所揭示之細胞（至少部分是）經由誘導降低生產過程中成分降解的程度，來促進商業上有用量之所關注之產物的生產。在某些實施例中，該生產過程中的該成分為含有脂質的成分。在某些實施例中，該含有脂質的成分為清潔劑。在某些實施例中，該清潔劑為含有聚山梨糖醇酯的成分。在某些實施例中，該含有聚山梨糖醇酯的成分為 PS20（聚山梨糖醇酯 20 或 Tween 20）。在某些實施例中，該含有聚山梨糖醇酯的成分為 PS80（聚山梨糖醇酯 80 或 Tween 80）。在某些實施例中，本文所揭示之細胞可以減少生產過程中成分的降解，例如觀察到 PS20 為參考細胞（例如 WT CHO 細胞）之相應 PS20 降解的小於約 90%、小於約 80%、小於約 70%、小於約 60%、小於約 50%、小於約 40%、小於約 30%、小於約 20%、小於約 10%、小於約 5%、小於約 4%、小於約 3%、小於約 2% 或小於約 1%。
在某些實施例中，本文所揭示之細胞包含編碼所關注之產物的核酸。在某些實施例中，該核酸可以一種或多種載體存在，例如 表現載體。一種載體的類型為「質體」，其係指環狀雙股 DNA 環圈，可在其中連接其他 DNA 片段。另一種載體的類型為病毒載體，其中其他 DNA 片段可連接至病毒基因體。某些載體能夠在它們導入的宿主細胞中自主複製（例如 ，具有細菌複製起始序列的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其他載體（例如 ，非附加型哺乳動物載體）在導入宿主細胞後經嵌入到宿主細胞的基因體中，從而與宿主基因體一起複製。此外，某些載體（表現載體）能夠指導與其可操作連接之基因的表現。通常來說，在重組 DNA 技術中有用的表現載體通常為質體（載體）的形式。用於本揭示中之表現載體的其他非限制性實例包括提供等效功能的病毒載體（例如 複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒）。
在某些實施例中，編碼所關注之產物的核酸可以導入本文所揭示之宿主細胞中。在某些實施例中，導入核酸至細胞中可以藉由任何本領域習知的方法來執行，本領域習知的方法包含但不限於轉染、電穿孔、顯微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌體載體感染、細胞融合、染色體媒介的基因轉移、微細胞媒介的基因轉移、球形質體融合等。在某些實施例中，該宿主細胞為真核的，例如 中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或淋巴樣細胞（例如 Y0、NS0、Sp20 細胞）。
在某些實施例中，編碼所關注之產物的核酸可以隨機地嵌入宿主細胞的基因體中（「隨機嵌入」或「RI」）。例如，但不作為限制，編碼所關注之產物的核酸可以隨機地嵌入已經調節以減少或消除特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性之細胞的基因體中。
在某些實施例中，編碼所關注之產物的核酸可以以靶向方式嵌入至宿主細胞的基因體中（「靶向嵌入」或「TI」）。例如，但不作為限制，編碼所關注之產物的核酸可以以靶向方式嵌入已經調節以減少或消除特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性之細胞的基因體中。「嵌入位點」包含在宿主細胞基因體內插入外源核苷酸序列的核酸序列。在某些實施例中，嵌入位點在宿主細胞基因體的兩個相鄰核苷酸之間。在某些實施例中，嵌入位點包含一段核苷酸序列。在某些實施例中，嵌入位點位於 CHO 宿主細胞基因體的特定基因座內。在某些實施例中，嵌入位點在 CHO 宿主細胞的內源基因內。任何本領域習知的嵌入位點均可與本文所揭示之標的一起調整和使用。該靶向嵌入可以藉由本領域習知的方法和系統來調節。例如，但不作為限制，2018 年 12 月 21 日提交的國際申請案號 PCT/US18/067070 中所揭示之方法和系統可用於靶向嵌入，其全部內容藉由引用併入本文。
在某些實施例中，編碼所關注之產物的核酸可以使用基於轉位酶的嵌入 (transposase-based integration) 來嵌入至宿主細胞的基因體中。例如，基於轉位酶的嵌入技術揭示於 Trubitsyna 等人，Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017)、Li 等人，PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013) 及 WO 2004/009792，其全部內容藉由引用併入本文。
在某些實施例中，編碼所關注之產物的核酸可以隨機地嵌入宿主細胞的基因體中（「隨機嵌入」或「RI」）。在某些實施例中，該隨機嵌入可以藉由任何本領域習知的方法或系統來調節。在某些實施例中，該隨機嵌入為藉由 MaxCyte STX® 電穿孔系統來調節。
在某些實施例中，靶向嵌入可以與隨機嵌入組合。在某些實施例中，該靶向嵌入之後可以進行隨機嵌入。在某些實施例中，隨機嵌入之後可以進行靶向嵌入。例如，但不作為限制，編碼所關注之產物的核酸可以隨機地嵌入已經調節以減少或消除特定多肽（例如 BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性之細胞的基因體中，而編碼相同之所關注之產物的核酸可以以靶向方式嵌入該細胞之基因體中。
在某些實施例中，本文所揭示之宿主細胞包含一個或多個經修改之酵素基因。在某些實施例中，酵素基因的修改減少或消除了該酵素的活性。在某些實施例中，本文所揭示之宿主細胞包含一個或多個經修改的 LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE 基因。在某些實施例中，經修改之 LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE 基因的後續轉錄物，編碼具有降低或消除活性的蛋白質。在某些實施例中，該一個或多個經修改之酵素基因是藉由破壞編碼區域來修改。在某些實施例中，該基因修改包含雙等位 (biallelic) 修改。在某些實施例中，該酵素基因修改包含刪除 1 個或更多個鹼基對、2 個或更多個鹼基對、3 個或更多個鹼基對、4 個或更多個鹼基對、5 個或更多個鹼基對、6 個或更多個鹼基對、7 個或更多個鹼基對、8 個或更多個鹼基對、9 個或更多個鹼基對、10 個或更多個鹼基對、11 個或更多個鹼基對、12 個或更多個鹼基對、13 個或更多個鹼基對、14 個或更多個鹼基對、15 個或更多個鹼基對、16 個或更多個鹼基對、17 個或更多個鹼基對、18 個或更多個鹼基對、19 個或更多個鹼基對、或 20 個或更多個鹼基對。
細胞培養方法
在一個方面，本揭示提供一種用於製造所關注之產物的方法，其包含培養本文所揭示之細胞。本領域習知對哺乳動物細胞適合的培養條件可以用於培養本文的細胞 (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234)，或者可以由熟習的技術人員容易地確定（例如，參見 Animal Cell Culture: A Practical Approach 第 2 版，Rickwood, D. 及 Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992)）。
哺乳動物細胞培養基可以在適合於所培養之特定細胞的培養基中製備。商業上可取得之培養基，諸如 Ham’s F10 (Sigma)、最低必需培養基 (MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma) 及 Dulbecco's 修飾的 Eagle's 培養基 (DMEM, Sigma)，為例示性營養溶液。另外，Ham 及 Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44；Barnes 及 Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255；美國專利號 4,767,704、4,657,866、4,927,762、5,122,469 或美國專利號 4,560,655；國際公開號 WO 90/03430 及 WO 87/00195（其全部揭示藉由引用併入本文）中描述的任何培養基，都可以用作細胞培養基。這些培養基中的任何一種均可根據需要來補充激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩衝劑（諸如 HEPES）、核苷（諸如腺苷和胸苷）、抗生素（諸如健他黴素）、微量元素（定義為最終濃度通常在微莫耳範圍內存在的無機化合物）、脂質（諸如亞麻油或其他脂肪酸）及其合適的載劑、以及葡萄糖或等效能源。也可以以本領域技術人員已知的適當濃度包括任何其他必要的補充劑。
在某些實施例中，該已經調節以減少及/或消除特定多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、LMF1、APOC2、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的哺乳動物細胞為 CHO 細胞。任何合適的培養基可用於培養 CHO 細胞。在某些實施例中，用於培養 CHO 細胞的合適培養基可以包含基礎培養基成分，諸如基於 DMEM/HAM F-12 的配方（關於 DMEM 和 HAM F12 培養基的組成，請參見 American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，第六版，1988，第 346-349 頁之培養基配方）（如美國專利號 5,122,469 中所述的培養基配方特別合適），其中之一些成分的濃度經修飾，諸如胺基酸、鹽、糖和維生素，並視情況包含甘胺酸、次黃嘌呤和胸苷；重組人類胰島素、水解蛋白腖，諸如 Primatone HS 或 Primatone RL (Sheffield, England) 或同等產品；細胞保護劑，諸如 Pluronic F68 或同等的 Pluronic 多元醇；健他黴素；和微量元素。
在某些實施例中，該已經調節以減少及/或消除特定多肽（例如，BAX、BAK、LPL、PLBL2/PLBD2、LIPA、PLAA、PLD3、LPLA2、PLCB1、PLCD1、DDHD1、LYPLAL1、PLA2G12A、PRDX6、SMPD1、PPT1、IAH1、OTUB1、LYPLA2、ACOT13、FASN、PLA2G7、USP5、ASAH1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、CES1、PLA1A 及/或 SIAE 多肽）活性的哺乳動物細胞為表現重組蛋白質的細胞。該重組蛋白質可以藉由在各種細胞培養條件下，培養表現所關注之產物的細胞來進行生產。例如，用於大規模或小規模生產蛋白質的細胞培養程序，在本揭示之內容內是潛在有用的。包括但不限於流化床生物反應器、中空纖維生物反應器、滾瓶培養、搖瓶培養或攪拌釜生物反應器系統在內的程序，（在後兩個系統中）可以在帶有或沒有微載劑的情況下使用，並且可以以批式、饋料批式或連續模式進行操作。
在某些實施例中，本揭示之細胞培養是以攪拌釜生物反應器系統執行，並採用饋料批式培養程序。在饋料批式培養中，先將哺乳動物宿主細胞和培養基供給至培養容器，並在培養期間向培養物中投入（連續地或以不連續的增量）額外的培養營養物，在培養終止前進行或不進行定期的細胞及/或產物收獲。例如，饋料批式培養包含半連續饋料批式培養，其中定期地移走整個培養物（包括細胞和培養基），並以新鮮的培養基取代。饋料批式培養不同於單純的批式培養，單純的批式培養是在培養過程開始時，將用於細胞培養的所有成分（包括細胞和所有培養營養物）供應至培養容器中的培養。饋料批式培養進一步與灌注培養做區分，因為在此過程中未從培養容器中除去上清液（在灌注培養中，藉由例如 過濾、包封、將細胞錨定在微載劑等，來限制細胞在培養物中，並且連續地或間歇地導入培養基並將其從培養容器中移出）。
在某些實施例中，可以根據適合於特定宿主細胞和所預期之特定生產計劃的任何方案或慣例，來增殖培養的細胞。因此，本揭示預期單步驟或多步驟培養程序。在單步驟培養中，將宿主細胞接種到培養環境，並且在細胞培養的單一生產期中採用本揭示之方法。可替代地，設想多期培養。在多期培養細胞中，可以分多個步驟或多個期培養細胞。例如，細胞可以在第一步或生長期的培養中生長，其中將可能從儲存庫中移出的細胞接種到適合促進生長和高生存力的培養基中。藉由將新鮮培養基添加到宿主細胞培養物中，可以將細胞維持在生長期持續一段合適的時間。
在某些實施例中，設計饋料批式或連續細胞培養條件，以在細胞培養的生長期中增強哺乳動物細胞的生長。在生長期，細胞在一定條件下生長一段時間，這對於生長是最大化的。諸如溫度、pH、溶氧 (dO2 ) 等培養條件，是與特定宿主一起使用的條件，並且對於具有通常知識者而言是顯而易見的。通常來說，使用酸（例如 CO2 ）或鹼（例如 Na2 CO3 或 NaOH）調整 pH 值介於約 6.5 和 7.5 之間的程度。對於培養諸如 CHO 細胞之哺乳動物細胞的合適溫度範圍，是介於約 30°C 和 38°C 之間，而合適的 dO2 是在空氣飽和的介於 5-90% 之間。
在特定期的細胞可用於接種細胞培養的生產期或步驟。可替代地，如上所述，生產期或步驟可以與接種或生長期或步驟連續。
在某些實施例中，本揭示中描述的培養方法可以進一步包括從細胞培養物中收獲產物，例如 從細胞培養物的生產期收獲產物。在某些實施例中，藉由本揭示之細胞培養方法生產的產物，可以從第三生物反應器（例如 生產生物反應器）中收獲。例如，但不作為限制，所揭示之方法可以包括在細胞培養之生產期完成時，收獲產物。可替代地或另外地，該產物可以在生產期完成之前收獲。在某些實施例中，一旦達到特定的細胞密度，就可以從細胞培養物中收獲產物。舉例來說，但不作為限制，在收獲前的細胞密度可以從約 2.0 x 107 細胞/mL 至約 5.0 x 107 細胞/mL。
在某些實施例中，從細胞培養物中收獲產物可以包括離心、過濾、聲波分離、絮凝和細胞去除技術中的一種或多種。
在某些實施例中，所關注之產物可以從宿主細胞分泌，或者可以是膜連、細胞溶質或核蛋白。在某些實施例中，可以從有條件的細胞培養基中純化多肽的可溶形式，並藉由從表現細胞製備總膜餾分來純化多肽的膜連形式，並用非離子型清潔劑諸如 TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, Calif.) 來萃取膜。在某些實施例中，細胞溶質或核蛋白可以藉由裂解宿主細胞（例如 ，通過機械力、音波處理及/或清潔劑）來製備，藉由離心去除細胞膜餾分並保留上清液。
產物
本揭示之細胞及/或方法可用於生產任何所關注之產物，其可藉由本文所揭示之細胞來表現。在某些實施例中，本揭示之細胞及/或方法可用於生產多肽，例如 哺乳動物多肽。在某些實施例中，本揭示之方法可用於生產病毒顆粒。在某些實施例中，本揭示之方法可用於生產病毒載體。此等多肽之非限制性實例包括激素、受體、融合蛋白、調節因子、生長因子、補體系統因子、酵素、凝血因子、抗凝血因子、激酶、細胞因子、CD 蛋白、白介素、治療性蛋白質、診斷性蛋白質及抗體。本揭示之細胞及/或方法對所產生的分子（例如 抗體）不具有特異性。
在某些實施例中，本揭示之方法可用於生產抗體，其包括治療性和診斷性抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，藉由本揭示之細胞及方法所生產的抗體可以為（但不限於）單特異性抗體（例如 由單一重鏈序列和單一輕鏈序列所組成的抗體，其包括這種配對的多聚體）、多特異性抗體及其抗原結合片段。例如，但不作為限制，該多特異性抗體可以為雙特異性抗體、雙表位抗體、T 細胞依賴性雙特異性抗體 (TDB)、雙重作用 FAb (DAF) 或其抗原結合片段。
多特異性抗體
在某些方面，藉由本文提供之細胞及方法所生產的抗體為多特異性抗體，例如 雙特異性抗體。「多特異性抗體」為對至少兩個不同位點（即 不同抗原上之不同表位（即 雙特異性）或同一抗原上之不同表位（即 雙表位））具有結合特異性的單株抗體。在某些方面，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。多特異性抗體可製成如本文所述之全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括但不限於重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（參見 Milstein 和 Cuello，Nature 305: 537 (1983)）和「杵臼」(knob-in-hole) 工程（參見例如 美國專利號 5,731,168，及 Atwell 等人，J. Mol. Biol. 270:26 (1997)）。多特異性抗體也可透過以下方法進行製備：用於製備抗體 Fc-異二聚體分子的工程改造靜電轉向效應（參見例如 WO 2009/089004）；交聯兩個或更多個抗體或片段（參見例如 美國專利號 4,676,980；及 Brennan 等人，Science，229: 81 (1985)）；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體（參見例如 Kostelny 等人，J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 及 WO 2011/034605）；使用常用輕鏈技術規避輕鏈錯配問題（參見例如 WO 98/50431）；使用「雙抗體」技術製備雙特異性抗體片段（參見例如 ，Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)）；以及使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體（參見例如 Gruber 等人，J. Immunol., 152:5368 (1994)）；以及按照例如 Tutt 等人 J. Immunol. 147: 60 (1991) 所述的製備三特異性抗體。
本文還包括具有三個或更多個抗原結合位點之工程化抗體，其包括例如「章魚抗體」(Octopus antibodies) 或 DVD-Ig（參見例如 WO 2001/77342 及 WO 2008/024715）。具有三個或更多個抗原結合位點之多特異性抗體的其他非限制性實例可參見 WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792 及 WO 2013/026831 中。該雙特異性抗體或其抗原結合片段也包括「雙重作用 FAb」或「DAF」（參見例如 ，US 2008/0069820 及 WO 2015/095539）。
多特異性抗體也可提供為不對稱形式，其包含在一個或多個具有相同抗原特異性之結合臂中交叉的域，即 透過交換 VH/VL 域（參見例如 WO 2009/080252 及 WO 2015/150447）、CH1/CL 域（參見例如 WO 2009/080253）或完整的 Fab 臂（參見例如 WO 2009/080251、WO 2016/016299，另見 Schaefer 等人，PNAS, 108 (2011) 1187-1191，及 Klein 等人，MAbs 8 (2016) 1010-20）實現。在某些實施例中，多特異性抗體包含 cross-Fab 片段。術語「cross-Fab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」 係指其中重鏈和輕鏈之可變區或恆定區發生交換的 Fab 片段。cross-Fab 片段包含由輕鏈可變區 (VL) 和重鏈恆定區 1 (CH1) 構成之多肽鏈以及由重鏈可變區 (VH) 和輕鏈恆定區 (CL) 構成之多肽鏈。還可透過將帶電荷或不帶電荷之胺基酸突變引入域界面引導正確 Fab 配對，從而設計不對稱之 Fab 臂。參見例如 ，WO 2016/172485。
用於多特異性抗體之各種其他分子形式為本技術領域中習知的並且包括在本文中（參見例如 Spiess 等人，Mol Immunol 67 (2015) 95-106）。
在某些實施例中，還包括於本文中的特定類型之多特異性抗體為雙特異性抗體，該雙特異性抗體被設計為同時結合至標靶細胞（例如 腫瘤細胞）上之表面抗原以及 T 細胞受體 (TCR) 複合物（諸如 CD3）之活化、不變成分，用於重靶向 T 細胞以殺死標靶細胞。
另一可用於此目的之雙特異性抗體形式的非限制性實例包括但不限於所謂「BiTE」(bispecific T cell engager) 分子，其中兩個 scFv 分子透過柔性連接基融合（參見例如 WO 2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261 及 WO 2008/119567；Nagorsen 和 Bäuerle，Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)）；雙抗體（Holliger 等人，Prot. Eng. 9, 299-305 (1996)）及其衍生物，諸如串聯雙抗體（「TandAb」；Kipriyanov 等人，J Mol Biol 293, 41-56 (1999)）；「DART」（雙親和性重靶向）分子，其基於雙抗體形式，但具有 C 端二硫鍵以供進一步穩定（Johnson 等人，J Mol Biol 399, 436-449 (2010)），以及所謂的 triomab，它們為完整的小鼠/大鼠 IgG 雜合分子（參見 Seimetz 等人的綜述：Cancer Treat.Rev. 36, 458-467 (2010)）。本文所包括之特定 T 細胞雙特異性抗體形式描述於：WO 2013/026833、WO 2013/026839、WO 2016/020309 及 Bacac 等人 Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498。
抗體片段
在某些方面，藉由本文提供之細胞及方法所生產的抗體為抗體片段。例如，但不作為限制，該抗體片段為 Fab、Fab’、Fab’-SH 或 F(ab’)2 片段，特別是 Fab 片段。木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈可變域（分別為 VH 和 VL）及輕鏈之恆定域 (CL) 和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，術語「Fab 片段」係指包含輕鏈（其包含 VL 域和 CL 域）及重鏈片段（其包含 VH 域和 CH1 域）之抗體片段。「Fab’ 片段」與 Fab 片段的區別在於在 CH1 域的羧基末端增加了殘基，其包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab')2 片段，該片段具有兩個抗原結合位點（兩個 Fab 片段）和一部分 Fc 區。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的體內 半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見 美國專利號 5,869,046。
在某些實施例中，抗體片段為雙抗體、三抗體或四抗體。雙抗體為具有兩個抗原結合位點（其可係二價或雙特異性的）之抗體片段。參見 例如 EP 404,097、WO 1993/01161、Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003) 及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中亦描述三抗體及四抗體。
在又一方面，抗體片段為單鏈 Fab 片段。「單鏈 Fab 片段」或「scFab」由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體重鏈恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接基組成，其中所述抗體域及所述連接基在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接基-VL-CL；b) VL-CL-連接基-VH-CH1；c) VH-CL-連接基-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接基-VH-CL。特定而言，所述連接基為至少 30 個胺基酸且較佳地 32 個至 50 個胺基酸組成之多肽。所述單鏈 Fab 片段藉由 CL 域與 CH1 域之間的天然二硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 片段可藉由插入半胱胺酸殘基生成鏈間二硫鍵而得到進一步穩定（例如 ，根據 Kabat 編號，在可變重鏈之位置 44 和可變輕鏈之位置 100 處插入）。
在另一方面，抗體片段為單鏈可變片段 (scFv)。「單鏈可變片段」或「scFv」為抗體之重鏈 (VH) 和輕鏈 (VL) 的可變域之融合蛋白，其藉由連接基連接。特定而言，連接基為 10 個至 25 個胺基酸組成之短多肽，並且通常富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解度，並且可將 VH 之 N 端與 VL 的之 C 端連接，反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接基，但是該蛋白仍保留了原始抗體的特異性。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 ：Pluckthün，收錄於 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 主編，(Springer-Verlag，New York)，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利號 5,571,894 及 5,587,458。
在另一方面，抗體片段為單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些方面，單域抗體為人類單域抗體（Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如 美國專利號 6,248,516 B1）。
抗體片段可由各種技術製造，其包括但不限於完整抗體的蛋白水解消化。
嵌合和人源化抗體
在某些方面，藉由本文提供之細胞及方法所生產的抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如 美國專利號 4,816,567；及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區（例如 ，衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物（諸如猴）之可變區）及人類恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些方面，嵌合抗體為人源化抗體。通常，非人類抗體為人源化抗體以降低對人類的免疫原性，同時保留親代非人類抗體之特異性及親和性。通常，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR（或其部分）來源於非人類抗體，並且 FR（或其部分）來源於人類抗體序列。人源化抗體視情況將包含人類恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人源化抗體中之一些 FR 殘基經來自非人類抗體（例如 衍生 CDR 殘基之抗體）之對應殘基取代，例如 以恢復或提高抗體特異性或親和性。
人源化抗體及其製備方法綜述於例如 Almagro 和 Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 中，並且進一步描述於例如 ：Riechmann 等人，Nature 332:323-329 (1988)；Queen 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；美國專利號 5,821,337、7,527,791、6,982,321 和 7,087,409；Kashmiri 等人，Methods 36:25-34 (2005)（具體描述了決定區 (SDR) 移植）；Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（描述了「表面重塑」）；Dall’Acqua 等人，Methods 36:43-60 (2005)（描述了「FR 改組」）；以及 Osbourn 等人，Methods 36:61-68 (2005)；及 Klimka 等人，Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（描述了 FR 改組的「導引選擇」法）。
可以用於人源化的人類框架區包括但不限於：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區（參見例如 Sims 等人 J. Immunol. 151:2296 (1993)）；衍生自輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體之一致序列的框架區（參見例如 Carter 等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及 Presta 等人J. Immunol., 151:2623 (1993)）；人類成熟（體細胞突變）框架區或人類生殖系框架區（參見例如 Almagro 及 Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)）；及衍生自篩選 FR 文庫之框架區（參見例如 Baca 等人J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 及 Rosok 等人J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)）。
人類抗體
在某些方面，藉由本文提供之細胞及方法所生產的抗體為人類抗體。可使用此領域中所公知的各種技術生產人類抗體。人類抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008)。
可藉由投予免疫原至基因轉殖動物來製備人類抗體，該基因轉殖動物經修飾以生產對抗原攻擊有反應之完整的人類抗體或具有人類可變區的完整抗體。此等動物通常包含全部或部分人類免疫球蛋白基因座，其取代內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機嵌入到動物的染色體中。在此等基因轉殖小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已被滅活。有關從基因轉殖動物中取得人類抗體之方法的綜述，參見 Lonberg，Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。另見例如 ：美國專利號 6,075,181 和 6,150,584（描述了 XENOMOUSETM 技術）；美國專利號 5,770,429（描述了 HUMAB® 技術）；美國專利號 7,041,870（描述了 K-M MOUSE® 技術）；及美國專利申請公開號 US 2007/0061900（描述了 VELOCIMOUSE® 技術）。由此類動物生成之完整抗體的人類可變區可進一步加以修飾，例如 藉由與不同人類恆定區組合。
人類抗體也可透過基於融合瘤的方法進行製備。用於生產人類單株抗體的人類骨髓瘤和小鼠-人類异源骨髓瘤細胞株已有描述。（參見例如 ：KozborJ. Immunol. , 133: 3001 (1984)；Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner 等人，J. Immunol., 147: 86 (1991)。）  透過人類 B 細胞融合瘤技術生成的人類抗體也描述於 Li 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) 中。另外的方法包括例如在美國專利號 7,189,826（描述從融合瘤細胞株生產單株人類 IgM 抗體）和 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（描述人類-人類融合瘤）中描述的那些方法。人類融合瘤技術（Trioma 技術）也描述於 Vollmers 和 Brandlein，Histology and Histopathology , 20(3):927-937 (2005) 以及 Vollmers 和 Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3):185-91 (2005)。
標靶分子
分子（其可被由本文揭示之細胞和方法所產生之抗體靶向）之非限制性實例包括可溶性血清蛋白及其受體和其他膜連蛋白（例如 ，粘附素 (adhesins)）。在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞和方法所生產的抗體，能夠結合一種、兩種或更多種選自以下細胞因子、細胞因子相關蛋白和細胞因子受體所組成之群組：8MPI、8MP2、8MP38 (GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (αFGF)、FGF2 (βFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1 (EPSELON)、FEL1 (ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA (TNF-β)、LTB、TNF (TNF-α)、TNFSF4 (OX40 配體)、TNFSF5 (CD40 配體)、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27 配體)、TNFSF8 (CD30 配體)、TNFSF9 (4-1 BB 配體)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、HGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP (瘦素)、PTN 及 THPO。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞和方法所生產的抗體，能夠結合選自以下細胞因子、細胞因子受體或細胞因子相關蛋白所組成之群組：CCLI (1-309)、CCL2 (MCP -1/MCAF)、CCL3 (MIP-Iα)、CCL4 (MIP-Iβ)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11 (伊紅趨素)、CCL 13 (MCP-4)、CCL 15 (MIP-Iδ)、CCL 16 (HCC-4)、CCL 17 (TARC)、CCL 18 (PARC)、CCL 19 (MDP-3b)、CCL20 (MIP-3α)、CCL21 (SLC/exodus-2)、CCL22 (MDC/ STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2 /eotaxin-2)、CCL25 (TECK)、CCL26 (eotaxin-3)、CCL27 (CTACK / ILC)、CCL28、CXCLI (GROI)、CXCL2 (GR02)、CXCL3 (GR03)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL 10 (IP 10)、CXCL 11 (1-TAC)、CXCL 12 (SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL 1 (SCYDI)、SCYEI、XCLI (lymphotactin)、XCL2 (SCM-Iβ)、BLRI (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61 )、CCRI (CKRI/HM145)、CCR2 (mcp-IRB IRA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EBII)、CCR8 (CMKBR8/ TER1/CKR- L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Rα)、IL8RB (IL8Rβ)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2 及 VHL。
在某些實施例中，藉由本文揭示之方法所生產的抗體（例如 ，多特異性抗體，諸如雙特異性抗體），能夠結合一種或多種選自以下標靶分子所組成之群組：0772P (CA125、MUC16) (即 卵巢癌抗原)、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；類澱粉蛋白 β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1 (天門冬胺酸 β-羥化酶結構域含蛋白 1；LOC253982)；AZGP1 (鋅-α-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R (B 細胞活化因子受體、BLyS 受體 3、BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI (MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B (GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B (骨型態發生蛋白 IB 型受體)；BMPR2；BPAG1 (plectin)；BRCA1；Brevican；C19orf10 (IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6/JAB61)；CCL1 (1-309)；CCL11 (eotaxin)；CCL13 (MCP-4)；CCL15 (MIP1δ)；CCL16 (HCC-4)；CCL17 (TARC)；CCL18 (PARC)；CCL19 (MIP-3β)；CCL2 (MCP-1)；MCAF；CCL20 (MIP-3α)；CCL21 (MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22 (MDC/STC-1)；CCL23 (MPIF-1)；CCL24 (MPIF-2/eotaxin-2)；CCL25 (TECK)；CCL26 (eotaxin-3)；CCL27 (CTACK/ILC)；CCL28；CCL3 (MTP-Iα)；CCL4 (MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8 (mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1 (CKRI / HM145)；CCR2 (mcp-IRβ/RA)；CCR3 (CKR/ CMKBR3)；CCR4；CCR5 (CMKBR5/ChemR13)；CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6)；CCR7 (CKBR7/EBI1)；CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9 (GPR-9-6)；CCRL1 (VSHK1)；CCRL2 (L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22 (B 細胞受體 CD22-B 同功型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A (CD79 α、免疫球蛋白相關 α、B 細胞特異性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1 (E-cadherin)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B (p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A (P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；殼糖酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7 (密連蛋白-7)；CLL-1 (CLEC12A、MICL 及 DCAL2)；CLN3；CLU (clusterin)；CMKLR1；CMKOR1 (RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；補體因子 D；CR2；CRP；CRIPTO (CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎上皮癌衍生的生長因子)；CSFI (M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3 (GCSF)；CTLA4；CTNNB1 (b-鏈蛋白)；CTSB (細胞自溶酵素 B)；CX3CL1 (SCYDI)；CX3CR1 (V28)；CXCL1 (GRO1)；CXCL10 (IP-10)；CXCL11 (I-TAC/IP-9)；CXCL12 (SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2 (GRO2)；CXCL3 (GRO3)；CXCL5 (ENA-78/LIX)；CXCL6 (GCP-2)；CXCL9 (MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5 (Burkitt 氏淋巴瘤受體 1、G 蛋白偶聯受體)；CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16 (LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2 (Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR (內皮素 B 型受體)；F3 (TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1 (Fc 受體樣蛋白 1)；FcRH2 (IFGP4、IRTA4、SPAP1A (SH2 結構域含磷酸酶錨定蛋白 1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1 (αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2 (bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3 (int-2)；FGF4 (HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7 (KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF (VEGFD)；FELl (EPSILON)；FILl (ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI (纖網蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1 (FRA-1)；FY (DARC)；GABRP (GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1 (GDNF 家族受體 α 1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2 (CCR10)；GPR19 (G 蛋白偶聯受體 19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54 (KISS1 受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81 (FKSG80)；GPR172A (G 蛋白偶聯受體 172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO (C10)；GRP；GSN (凝溶膠蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；組織胺及組織胺受體；HLA-A；HLA-DOB (第 II 型 MHC 分子的 β 次單元 (Ia 抗原)；HLA-DRA；HM74；HMOXI ；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2、ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST (糖蛋白 130)；流感 A；流感 B；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2 (免疫球蛋白超家族受體易位相關 2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6 (a6 整聯蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4 (b4 整聯蛋白)；α4β7 及 αEβ7 整聯蛋白異二聚體；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5 (GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19 (角蛋白 19)；KRT2A；KHTHB6 (頭髮特異性 H 型角蛋白)；LAMAS；LEP (瘦素)；LGR5 (富含白胺酸重複序列的 G 蛋白偶聯受體 5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA (TNF-b)；LTB；LTB4R (GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64 (淋巴球抗原 64 (RP105)、白胺酸富集重複序列 (LRR) 家族的第 I 型膜蛋白)；Ly6E (淋巴球抗原 6 複合物、locus E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D (淋巴球抗原 6 複合物、locus G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K (淋巴球抗原 6 複合物、locus K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG 或 OMgp；MAP2K7 (c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；midkine；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF (MPF、MSLN、SMR、巨核細胞增效因子、mesothelin)；MS4A1；MSG783 (RNF124、假定蛋白質 FLJ20315)；MSMB；MT3 (金屬硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1 (黏液蛋白)；MYC；MY088；Napi3b (又稱 NaPi2b) (NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質載劑家族 34 (磷酸鈉)、成員 2、第 II 型鈉依賴性磷酸運輸蛋白 3b)；NCA；NCK2；neurocan；NFKB1；NFKB2；NGFB (NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66 (Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1 (NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5 (嘌呤受體 P2X 配體閘控離子通道 5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4 (CXCL4)；PGF；PGR；phosphacan；PIAS2；PIK3CG；PLAU (uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17 (銀同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP (CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg (2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12 基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2 (COX-2)；PTN；RAC2 (p21 Rac2)；RARB；RET (ret 原致癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110 (ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2 (lipophilin B)；SCGB2A1 (mammaglobin2)；SCGB2A2 (mammaglobin 1)；SCYEI (內皮單核球活化的細胞因子)；SDF2；Sema 5b (FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin 5b Hlog、sema 域、七血小板活化素重複序列 (第 1 型和類第 1 型)、跨膜域 (TM) 和短細胞質域、(semaphorin) 5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5 (maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B (Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)；STEAP2 (HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關基因 1、前列腺癌相關蛋白 1、前列腺的六跨膜上皮抗原 2、六跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2 (推定跨膜蛋白多糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI (血小板反應素-1 )；THBS2；THBS4；THPO；TIE (Tie-1 )；TMP3；組織因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1 (具有類 EGF 的跨膜蛋白及二個類濾泡抑素域 1；Tomoregulin-1)；TMEM46 (shisa 同系物 2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2 (B94 )；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10 (TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12 (AP03L)；TNFSF13 (April)；TNFSF13B；TNFSF14 (HVEM-L)；TNFSF15 (VEGI)；TNFSF18；TNFSF4 (OX40 配體)；TNFSF5 (CD40 配體)；TNFSF6 (FasL)；TNFSF7 (CD27 配體)；TNFSFS (CD30 配體)；TNFSF9 (4-1 BB 配體)；TOLLIP；類鐸受體；TOP2A (拓樸異構酶 Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118 (環指蛋白、跨膜 2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4 (BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬態電位陽離子通道、亞家族 M、成員 4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪胺酸酶 (TYR；OCAIA；OCA1A；酪胺酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；versican；VHL C5；VLA-4；XCL1 (lymphotactin)；XCL2 (SCM-1b)；XCRI(GPR5/ CCXCRI)；YY1 及 ZFPM2。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞和方法所生產的抗體，能夠結合 CD 蛋白，諸如 CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21 (CR2 (補體受體 2) 或 C3DR (C3d/Epstein Barr 病毒受體) 或 Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72 (B 細胞分化抗原 CD72、Lyb-2)；CD79b (CD79B、CD79β、IGb (免疫球蛋白相關 β)、B29)；ErbB 受體家族的 CD200 成員，諸如 EGF 受體、HER2、HER3 或 HER4 受體；細胞黏著分子，諸如 LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7 整聯蛋白及 αv/β3 整聯蛋白，其包括其 α 或 β 次單元 (例如 ，抗 CD11a、抗 CD18 或抗 CD11b 抗體)；生長因子，諸如 VEGF-A、VEGF-C；組織因子 (TF)；α 干擾素 (αIFN)；TNFα、白介素，諸如 IL-1 β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL 17 AF、IL-1S、IL-13R α1、IL13R α2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血液群抗原；flk2/flt3 受體；肥胖 (OB) 受體；mpl 受體；CTLA-4；RANKL、RANK、RSV F 蛋白、蛋白 C 等。
在某些實施例中，本文提供之細胞和方法可用於生產抗體（或多特異性抗體，諸如雙特異性抗體），其特異性結合至補體蛋白 C5（例如 ，特異性結合至人類 C5 的抗 C5 促效劑抗體）。在某些實施例中，該抗 C5 抗體包含 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個 CDR，其選自 (a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 SSYYMA (SEQ ID NO:1) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO:26) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27) 的胺基酸序列；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 RASQGISSSLA (SEQ ID NO: 28) 的胺基酸序列；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 GASETES (SEQ ID NO: 29) 的胺基酸序列；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30) 的胺基酸序列。例如，在某些實施例中，抗 C5 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 SSYYMA (SEQ ID NO: 1) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 AIFTGSGAEYKAEWAKG (SEQ ID NO: 26) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 DAGYDYPTHAMHY (SEQ ID NO: 27) 的胺基酸序列；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 RASQGISSSLA (SEQ ID NO: 28) 的胺基酸序列；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 GASETES (SEQ ID NO: 29) 的胺基酸序列；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 QNTKVGSSYGNT (SEQ ID NO: 30) 的胺基酸序列。上述重鏈可變區之 CDR1、CDR2 及 CDR3 以及輕鏈可變區之 CDR1、CDR2 及 CDR3 的序列，分別揭示於 US 2016/0176954 的 SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123 及 SEQ ID NO: 125。（參見 US 2016/0176954 中的表 7 和表 8）
在某些實施例中，抗 C5 抗體分別包含 VH 和 VL 序列 QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 31) 和 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 32)，分別包括這些序列轉譯後的修飾。上述 VH 和 VL 序列分別揭示於 US 2016/0176954 的 SEQ ID NO: 106 及 SEQ ID NO: 111。（參見 US 2016/0176954 中的表 7 和表 8）  在某些實施例中，抗 C5 抗體為 305L015（參見 US 2016/0176954）。
在某些實施例中，藉由本文揭示之方法所生產的抗體，能夠結合 OX40（例如 ，特異性結合至人類 OX40 的抗 OX40 促效劑抗體）。在某些實施例中，該抗 OX40 抗體包含 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個 CDR，其選自 (a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 DSYMS (SEQ ID NO: 2) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 APRWYFSV (SEQ ID NO: 4) 的胺基酸序列；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5) 的胺基酸序列；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 YTSRLRS (SEQ ID NO: 6) 的胺基酸序列；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7) 的胺基酸序列。例如，在某些實施例中，抗 OX40 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 DSYMS (SEQ ID NO: 2) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 DMYPDNGDSSYNQKFRE (SEQ ID NO: 3) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 APRWYFSV (SEQ ID NO: 4) 的胺基酸序列；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(a) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 5) 的胺基酸序列；(b) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 YTSRLRS (SEQ ID NO: 6) 的胺基酸序列；及 (c) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 QQGHTLPPT (SEQ ID NO: 7) 的胺基酸序列。在某些實施例中，抗 OX40 抗體分別包含 VH 和 VL 序列 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 8) 和 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 9)，分別包括這些序列轉譯後的修飾。
在某些實施例中，該抗 OX40 抗體包含 1 個、2 個、3 個、4 個、5 個或 6 個 CDR，其選自 (a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 NYLIE (SEQ ID NO:10) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO:11) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 DRLDY (SEQ ID NO: 12) 的胺基酸序列；(d) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13) 的胺基酸序列；(e) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 HGTNLED (SEQ ID NO: 14) 的胺基酸序列；及 (f) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15) 的胺基酸序列。例如，在某些實施例中，抗 OX40 抗體包含重鏈可變域 (VH) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(a) 重鏈可變區 CDR1，其包含 NYLIE (SEQ ID NO: 10) 的胺基酸序列；(b) 重鏈可變區 CDR2，其包含 VINPGSGDTYYSEKFKG (SEQ ID NO: 11) 的胺基酸序列；(c) 重鏈可變區 CDR3，其包含 DRLDY (SEQ ID NO: 12) 的胺基酸序列；及/或輕鏈可變域 (VL) 序列，其包含一個、二個或三個 CDR，其選自：(a) 輕鏈可變區 CDR1，其包含 HASQDISSYIV (SEQ ID NO: 13) 的胺基酸序列；(b) 輕鏈可變區 CDR2，其包含 HGTNLED (SEQ ID NO: 14) 的胺基酸序列；及 (c) 輕鏈可變區 CDR3，其包含 VHYAQFPYT (SEQ ID NO: 15) 的胺基酸序列。在某些實施例中，抗 OX40 抗體分別包含 VH 和 VL 序列 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS (SEQ ID NO: 16) 和 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK (SEQ ID NO: 17)，分別包括這些序列轉譯後的修飾。
關於抗 OX40 抗體進一步的細節提供於 WO 2015/153513 中，其內容以引用方式全部併入本文。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞和方法所生產的抗體，能夠結合流感病毒 B 血球凝集素，即 「fluB」（例如 ，在體外及/或體內結合來自 B 型流感病毒 Yamagata 譜系之血球凝集素、結合來自 B 型流感病毒 Victoria 譜系之血球凝集素、結合來自 B 型流感病毒祖代譜系之血球凝集素，或者結合來自 B 型流感病毒 Yamagata 譜系、Victoria 譜系及祖代譜系之血球凝集素的抗體）。關於抗 FluB 抗體進一步的細節描述於 WO 2015/148806 中，其內容以引用方式全部併入本文。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞和方法所生產的抗體，能夠結合低密度脂蛋白受體相關蛋白 (LRP)-1 或 LRP-8 或轉鐵蛋白受體，以及至少一個標靶選自 β 分泌酶（BACE1 或 BACE2）、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、澱粉樣蛋白之前驅蛋白 (APP)、死亡受體 6 (DR6)、澱粉樣蛋白 β 肽、α-突觸核蛋白、Parkin、杭丁頓蛋白、p75 NTR、CD40 及凋亡蛋白酶-6 所組成之群組。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞及方法所生產的抗體為針對 CD40 的人類 IgG2 抗體。在某些實施例中，抗 CD40 抗體為 RG7876。
在某些實施例中，本揭示之細胞及方法可用於生產多肽。例如，但不作為限制，該多肽為標靶免疫細胞因子。在某些實施例中，該標靶免疫細胞因子為 CEA-IL2v 免疫細胞因子。在某些實施例中，CEA-IL2v 免疫細胞因子為 RG7813。在某些實施例中，該標靶免疫細胞因子為 FAP-IL2v 免疫細胞因子。在某些實施例中，FAP-IL2v 免疫細胞因子為 RG7461。
在某些實施例中，藉由本文提供之細胞或方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體），能夠結合 CEA 及至少一個其他的標靶分子。在某些實施例中，根據本文提供之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體），能夠結合腫瘤標靶細胞因子及至少一個其他的標靶分子。在某些實施例中，根據本文提供之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）為融合至 Il2v（即 白介素 2 變異體），並結合基於 IL1 的免疫細胞因子和至少一個其他的標靶分子。在某些實施例中，根據本文提供之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）為 T 細胞雙特異性抗體（即 雙特異性 T 細胞接合劑或 BiTE）。
在某些實施例中，根據本文提供之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體），能夠結合至少兩個選自以下的標靶分子：IL-1 α 及 IL- 1 β、IL-12 及 IL-1S；IL-13 及 IL-9；IL-13 及 IL-4；IL-13 及 IL-5；IL-5 及 IL-4；IL-13 及 IL-1β；IL-13 及 IL- 25；IL-13 及 TARC；IL-13 及 MDC；IL-13 及 MEF；IL-13 及 TGF-~；IL-13 及 LHR 促效劑；IL-12 及 TWEAK、IL-13 及 CL25；IL-13 及 SPRR2a；IL-13 及 SPRR2b；IL-13 及 ADAMS、IL-13 及 PED2、IL17A 及 IL17F、CEA 及 CD3、CD3 及 CD19、CD138 及 CD20；CD138 及 CD40；CD19 及 CD20；CD20 及 CD3；CD3S 及 CD13S；CD3S 及 CD20；CD3S 及 CD40；CD40 及 CD20；CD-S 及 IL-6；CD20 及 BR3、TNF α 及 TGF-β、TNF α 及 IL-1 β；TNF α 及 IL-2、TNF α 及 IL-3、TNF α 及 IL-4、TNF α 及 IL-5、TNF α 及 IL6、TNF α 及 IL8、TNF α 及 IL-9、TNF α 及 IL-10、TNF α 及 IL-11、TNF α 及 IL-12、TNF α 及 IL-13、TNF α 及 IL-14、TNF α 及 IL-15、TNF α 及 IL-16、TNF α 及 IL-17、TNF α 及 IL-18、TNF α 及 IL-19、TNF α 及 IL-20、TNF α 及 IL-23、TNF α 及 IFN α、TNF α 及 CD4、TNF α 及 VEGF、TNF α 及 MIF、TNF α 及 ICAM-1、TNF α 及 PGE4、TNF α 及 PEG2、TNF α 及 RANK 配體、TNF α 及 Te38、TNF α 及 BAFF,TNF α 及 CD22、TNF α 及 CTLA-4、TNF α 及 GP130、TNF a 及 IL-12p40、VEGF 及血管生成素、VEGF 及 HER2、VEGF-A 及 HER2、VEGF-A 及 PDGF、HER1 及 HER2、VEGFA 及 ANG2、VEGF-A 及 VEGF-C、VEGF-C 及 VEGF-D、HER2 及 DR5、VEGF 及 IL-8、VEGF 及 MET、VEGFR 及 MET 受體、EGFR 及 MET、VEGFR 及 EGFR、HER2 及 CD64、HER2 及 CD3、HER2 及 CD16、HER2 及 HER3；EGFR (HER1) 及 HER2、EGFR 及 HER3、EGFR 及 HER4、IL-14 及 IL-13、IL-13 及 CD40L、IL4 及 CD40L、TNFR1 及 IL-1 R、TNFR1 及 IL-6R 及 TNFR1 及 IL-18R、EpCAM 及 CD3、MAPG 及 CD28、EGFR 及 CD64、CSPG 及 RGM A；CTLA-4 及 BTN02；IGF1 及 IGF2；IGF1/2 及 Erb2B；MAG 及 RGM A；NgR 及 RGM A；NogoA 及 RGM A；OMGp 及 RGM A；POL-l 及 CTLA-4；以及 RGM A 及 RGM B。
在某些實施例中，根據本文提供之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）為抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體為 RG7802。在某些實施例中，該抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體包含以下 SEQ ID NO: 18-21 所示之胺基酸序列： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASAAVG TYVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRKRGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCHQ YYTYPLFTFG QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO: 18) QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCGSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAFRGLI GGTNKRAPGT PARFSGSLLG GKAALTLSGA QPEDEAEYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSC (SEQ ID NO: 19) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTKTGEATY VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDGGGGS GGGGSEVQLL ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVSRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNTLYLQM NSLRAEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP CRDELTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 20) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMG WINTKTGEATY VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMD YWGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTS GVHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVH NAKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTI SKAKGQPRE PQVCTLPPSRD ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFF LVSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (SEQ ID NO: 21)
關於抗-CEA/抗 CD3 雙特異性抗體進一步的細節提供於 WO 2014/121712 中，其內容以引用方式全部併入本文。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞及方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）為抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體為 Crossmab。在某些實施例中，該抗 VEGF/抗血管生成素雙特異性抗體為 RG7716。在某些實施例中，該抗 CEA/抗 CD3 雙特異性抗體包含以下 SEQ ID NO: 22-25 所示之胺基酸序列： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC RDELTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 22) QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYMHWVRQA PGQGLEWMGW INPNSGGTNY AQKFQGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARSP NPYYYDSSGY YYPGAFDIWG QGTMVTVSSA SVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVCTLPPS RDELTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO: 23) DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO: 24) SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYDD SDRPSGIPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHWVFG GGTKLTVLSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (SEQ ID NO: 25)
在某些實施例中，藉由本文揭示之方法所生產的多特異性抗體（諸如雙特異性抗體）為抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體。在某些實施例中，該抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體為 RG7221。在某些實施例中，該抗 Ang2/抗 VEGF 雙特異性抗體為 CAS 號碼 1448221-05-3。
可溶的抗原或其片段（視情況共軛至其他分子）可用於作為免疫原來生成抗體。此等跨膜分子（諸如受體）片段（例如 受體之胞外域）可用於作為免疫原。可替代地，表現跨膜分子的細胞可用於作為免疫原。這種細胞可以衍生自天然來源（例如 癌細胞株）或可以是已藉由重組技術轉化來表現跨膜分子的細胞。其他抗原或其形式有益於製備抗體對於本領域技術人員而言將是顯而易見的。
在某些實施例中，藉由本文揭示之細胞及方法所生產的多肽（例如 抗體），能夠結合進一步可共軛至化學分子，諸如染劑或細胞毒性劑（諸如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素（例如 來源於細菌、真菌、植物或動物酶活性毒素或其片段）或放射性同位素（即 放射性共軛物））。包含使用本文描述之方法所生產之抗體或雙特異性抗體的免疫共軛物，可包括共軛至僅一條重鏈或僅一條輕鏈之恆定區的細胞毒性劑。
抗體變異體
在某些方面，考慮到本文提供之抗體的胺基酸序列變異體，例如 提供於 5.5.5 節的抗體。例如，可能希望修改抗體的結合親和性及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾導入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如 抗原結合特徵。
取代、插入和缺失變異體
在某些方面，提供了具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異體。取代型誘變的所關注之位點包括 CDR 和 FR。保守取代列於表 1 之「優選取代」標題下。表 1 中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變更，並且下文將參考胺基酸側鏈類別進行進一步描述。胺基酸取代可導入至所關注之抗體中，且針對如下所需活性篩選產物：例如 保留/改善之抗原結合、降低之免疫原性或改善之 ADCC 或 CDC。
表 1
原始 殘基 例示性 取代 優選 取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據常見的側鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。
一種類型的取代型變異體涉及取代一個或多個親代抗體（例如 ，人源化或人類抗體）之超可變區殘基。一般而言，相對於親本抗體，選擇用於進一步研究之所得變異體將在某些生物學特性（例如 ，親和性提高、免疫原性降低）上具有修飾（例如 ，改善）及/或將實質上保留親本抗體之某些生物學特性。一種例示性取代型變異體為親和性成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和性成熟技術（例如 本文所述之技術）便利地生成。簡而言之，取代一個或多個。CDR 殘基發生突變，並且變異體抗體在噬菌體上呈現並篩選出特定的生物學活性（例如 ，結合親和性）。
可以在 CDR 中進行更改（例如 ，取代），例如 ，以改善抗體親和性。此等修改可以在 CDR「熱點」（即 由密碼子編碼的殘基在體細胞成熟過程中經歷突變（參見例如 Chowdhury，Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008)））及/或與抗原接觸的殘基中進行，並測試所得變異體 VH 或 VL 之結合親和性。藉由構建和從二級文庫中重選以實現親和性成熟，例如 在 Hoogenboom 等人，Methods in Molecular Biology 178:1-37（O’Brien 等人編輯，Human Press, Totowa, NJ, (2001)）中已有描述。在親和性成熟之某些方面，藉由多種方法（例如 ，易錯 PCR、鏈改組或寡核苷酸定向誘變）中之任一者將多樣性導入選擇用於成熟的可變基因中。然後創建第二文庫。然後篩選該文庫，以識別具有所需之親和性的任何抗體變異體。導入多樣性的另一種方法涉及 CDR 定向方法，其中將若干 CDR 殘基（例如 ，每次 4-6 個殘基）隨機化。可以特異性識別涉及抗原結合的 CDR 殘基，例如 使用丙胺酸掃描誘變或建模。特定而言，CDR-H3 和 CDR-L3 經常成為標靶。
在某些方面，在一個或多個 CDR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗體以結合抗原的能力即可。例如，可在 CDR 中進行實質上不降低結合親和性的保守修改（例如 ，本文所提供之保守取代）。例如，此等修改可能在 CDR 中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之某些 VH 和 VL 序列變異體中，每個 CDR 均未改變，或包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
如 Cunningham 和 Wells (1989)Science , 244:1081-1085 所述，識別可靶向誘變之抗體殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或標靶殘基組（例如 ，帶電荷的殘基，諸如 arg、asp、his、lys 和 glu），並用中性或帶負電荷的胺基酸（例如 ，丙胺酸或聚丙胺酸）取代以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。在對初始取代表露功能敏感性的胺基酸位置可進一步導入取代。可替代地或另外地，可使用抗原-抗體複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。可靶向或消除此等接觸殘基和鄰近殘基，作為用於取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之序列，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酵素（例如 ，對於 ADEPT（針對抗體之酵素前藥治療））或提高抗體血清半衰期之多肽。
糖基化變異體
在某些方面，本文提供經修改的抗體以增加或減少抗體發生糖基化之程度。可藉由修改胺基酸序列來便利地實現向抗體中添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點，以產生或移除一個或多個糖基化位點。
當抗體包含 Fc 區時，可修改與其相連的寡糖。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含支化的雙觸寡糖，其通常透過 N 鍵連接至 Fc 區 CH2 域之 Asn297。參見例如 Wright 等人TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如 甘露糖、N-乙醯基葡萄糖胺 (GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸寡糖結構之「主幹」中之 GlcNAc 的岩藻糖。在一些方面，可對本揭示之抗體中的寡糖進行修飾，以產生具有某些改善之特性的抗體變異體。
在一個方面，提供具有非岩藻糖基化寡糖的抗體變異體，即 缺少（直接或間接地）連接至 Fc 區的岩藻糖的寡糖結構。此等非岩藻糖基化寡糖（也稱為「去岩藻糖基化」寡糖）特定而言在雙觸寡糖結構的主幹中缺少與第一 GlcNAc 連接之岩藻糖殘基的 N-連接寡糖。在一個方面，提供了與天然或親本抗體相比在 Fc 區中具有增加比例的非岩藻糖基化寡糖的抗體變異體。例如，非岩藻糖基化寡糖的比例可以為至少約 20%、至少約 40%、至少約 60%、至少約 80% 或甚至約 100%（即 不存在岩藻糖基化寡糖）。非岩藻糖基化寡糖之百分比是缺少岩藻糖殘基之寡糖相對於連接至 Asn 297（例如復合物、雜合和高甘露糖結構）的所有寡糖的總和之（平均）量，該百分比透過 MALDI-TOF 質譜法測得，例如 WO 2006/082515 中所述。Asn297 係指位於 Fc 區中約位置 297（Fc 區殘基之 EU 編號）處之天冬醯胺殘基；然而，歸因於抗體之輕微序列變異，Asn297 亦可位於位置 297 上游或下游約 ±3 個胺基酸處，亦即 位置 294 與 300 之間。此等在 Fc 區中具有增加比例之非岩藻糖基化寡糖的抗體，可具有經改善的 FcγRIIIa 受體結合及/或改善的效應因子功能，特別是經改善的 ADCC 功能。參見例如 US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能夠製造具有減少之岩藻糖基化抗體之細胞株的實例，其包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之 Lec13 CHO 細胞（Ripka 等人，Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；US 2003/0157108；及 WO 2004/056312，尤其是在實例 11 中）；和剔除的細胞株，諸如剔除 α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8 的 CHO 細胞（參見例如 Yamane-Ohnuki 等人，Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)；Kanda, Y. 等人，Biotechnol. Bioeng ., 94(4):680-688 (2006)；及 WO 2003/085107）；或 GDP-岩藻糖合成或轉運蛋白活性降低或消失的細胞（參見例如 US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282）。
在另一個方面，提供具有二等分之寡糖的抗體變異體，例如 ，其中連接至抗體之 Fc 區的雙觸寡糖被 GlcNAc 平分。此等抗體變異體可具有如上文所述之減少的岩藻糖基化及/或改善的 ADCC 功能。此等抗體變異體之實例描述於例如 ：Umana 等人，Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)；Ferrara 等人，Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO 2003/011878。
還提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區之半乳糖殘基的抗體變異體。此等抗體變異體可具有改善的 CDC 功能。此等抗體變異體描述於例如 WO 1997/30087、WO 1998/58964 及 WO 1999/22764 中。
Fc 區變異體
在某些方面，可在本文所提供之抗體的 Fc 區中導入一個或多個胺基酸修飾，從而生成 Fc 區變異體。Fc 區變異體可包含人類 Fc 區序列（例如 ，人類 IgG1 、IgG2 、IgG3 或 IgG4 Fc 區），其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾（例如 ，取代）。
在某些方面，本揭示考慮了一種具有一些但非全部效應因子功能的抗體變異體，使其成為以下應用中所需之候選物：其中抗體在體內 的半衰期很重要，但某些效應因子功能（諸如補體依賴性細胞毒性 (CDC) 和抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)）是不必要或有害的。可實施體外 及/或體內 細胞毒性測定，以確認 CDC 及/或 ADCC 活性之下降/耗竭。例如，可實施 Fc 受體 (FcR) 結合測定，以確保抗體缺乏 FcγR 結合（因此可能缺乏 ADCC 活性），但保留 FcRn 結合能力。介導 ADCC 之原代細胞 NK 細胞僅表現 FcγRIII，而單核細胞則表現 FcγRI、FcγRII 及 FcγRIII。FcR 在造血細胞上之表現匯總於 Ravetch 和 Kinet 的論文 (Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)) 之第 464 頁的表 3 中。用於評估所關注之分子的 ADCC 活性的體外 測定方法，其非限制性實例的描述於美國專利號 5,500,362 中（參見例如 Hellstrom, I. 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83: 7059-7063 (1986)）和 Hellstrom, I 等人，Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)；5,821,337（參見 Bruggemann, M. 等人，J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987)）。可替代地，可採用非放射性測定方法（參見例如用於流式細胞測量術之 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定（Promega, Madison, WI）。用於此等測定的有用的效應因子細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及天然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在Proc. Natl Acad. Sci. USA 95: 652-656 (1998) 中揭示的動物模型中，在體內 評估所關注之分子的 ADCC 活性。還可實施 C1q 結合測定以確認該抗體無法結合 C1q 並因此缺乏 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中之 C1q 及 C3c 結合 ELISA。為了評估補體活化，可進行 CDC 測定（參見例如 Gazzano-Santoro等人 ，J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等人，Blood 101:1045-1052 (2003)；以及 Cragg, M.S. 及 M.J. Glennie，Blood 103:2738-2743 (2004)）。FcRn 結合和體內 清除率/半衰期測定也可使用此領域中所公知的方法進行（參見例如 Petkova, S.B. 等人，Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；WO 2013/120929 Al）。
效應因子功能下降的抗體包括一個或多個 Fc 區殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體（美國專利號 6,737,056）。此等 Fc 突變體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 突變體，其包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸取代（美國專利號 7,332,581）。
描述了某些與 FcR 的結合能力得到改善或減弱的抗體變異體。（參見例如 美國專利號 6,737,056；WO 2004/056312 及 Shields 等人，J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)。）
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代改善了 ADCC，例如 Fc 區的位置 298、333 及/或 334（殘基的 EU 編號）處之取代。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減弱了 FcγR 結合，例如 Fc 區的位置 234 和 235（殘基的 EU 編號）處之取代。在一個方面，取代為 L234A 和 L235A (LALA)。在某些方面，抗體變異體進一步包含 Fc 區中之 D265A 及/或 P329G，其來源於人類 IgG1 Fc 區。在一個方面，取代為 Fc 區中的 L234A、L235A 和 P329G (LALA-PG)，其來源於人類 IgG1 Fc 區。（參見例如 WO 2012/130831）。在另一方面，取代為 Fc 區中的 L234A、L235A 和 D265A (LALA-DA)，其來源於人類 IgG1 Fc 區。
在一些方面，在 Fc 區中進行修改，得到修改（即 改善或減弱）之 C1q 結合及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，例如 美國專利號 6,194,551、WO 99/51642 及 Idusogie 等人J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) 所述。
具有更長半衰期並改善了與新生兒 Fc 受體 (FcRn)（其負責將母體 IgG 轉移給胎兒，參見 Guyer 等人J. Immunol. 117:587 (1976) 和 Kim 等人J. Immunol. 24:249 (1994)）之結合的抗體描述於 US2005/0014934（Hinton 等人）中。那些抗體包含其中具有一個或多個取代之 Fc 區，其改善了 Fc 區與 FcRn 之結合。此等 Fc 變異體包括在一個或多個 Fc 區殘基上發生取代之 Fc 變異體：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424 或 434，例如 Fc 區殘基 434 之取代（參見例如 美國專利號 7,371,826；Dall'Acqua, W.F. 等人，J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524）。
藉由定點誘變已經識別出對小鼠 Fc-小鼠 FcRn 相互作用至關重要之 Fc 區殘基（參見例如 ，Dall’Acqua, W.F. 等人 J. Immunol 169 (2002) 5171-5180）。殘基 I253、H310、H433、N434 和 H435（EU 指數編號）參與相互作用（Medesan, C. 等人，Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。已發現殘基 I253、H310 和 H435 對於人類 Fc 與小鼠 FcRn 之相互作用至關重要（Kim, J.K. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819）。對人類 Fc-人類 FcRn 複合物的研究表明，殘基 I253、S254、H435 和 Y436 對於相互作用至關重要（Firan, M. 等人，Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604）。在 Yeung, Y.A. 等人 (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671) 中，已經報導並研究了殘基 248 至 259 及 301 至 317 及 376 至 382 及 424 至 437 的各種突變體。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 253、及/或 310、及/或 435（殘基的 EU 編號）處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 253、310 和 435 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區中之 I253A、H310A 和 H435A，其來源於人類 IgG1 Fc 區。參見例如 Grevys, A 等人，J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代減少 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 310、及/或 433、及/或 436（殘基的 EU 編號）處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 310、433 和 436 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區中之 H310A、H433A 和 Y436A，其來源於人類 IgG1 Fc 區。（參見例如 WO 2014/177460 Al）。
在某些方面，抗體變異體包含具有一個或多個胺基酸取代的 Fc 區，這些取代增加 FcRn 結合，例如 Fc 區之位置 252、及/或 254、及/或 256（殘基的 EU 編號）處之取代。在某些方面，抗體變異體包含 Fc 區，該 Fc 區具有在位置 252、254 和 256 處之胺基酸取代。在一個方面，取代為 Fc 區中之 M252Y、S254T 和 T256E，其來源於人類 IgG1 Fc 區。另請參見 Duncan & Winter，Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號 5,648,260；美國專利號 5,624,821；及 WO 94/29351，其中涉及 Fc 區變異體之其他實例。
如本文所報導之抗體的重鏈的 C 端可以是以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個優選方面，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 PG。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽（G446 和 K447，胺基酸位置的 EU 指數編號）。在本文所報告的所有方面中之一方面，一種包含重鏈的抗體包括本文所指定之 C 端 CH3 域，其包含 C 端甘胺酸殘基（G446，胺基酸位置的 EU 指數編號）。
半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些方面，可能希望創建半胱胺酸工程化抗體，例如 THIOMABTM 抗體，其中抗體之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定方面，取代殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分（例如藥物部分或連接基-藥物部分）共軛，以形成免疫共軛物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化抗體可按照例如 美國專利號 7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130 或 WO 2016040856 所述的方法生成。
抗體衍生物
在某些方面，可進一步修飾本文所提供之抗體，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚醣、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）以及右旋糖酐或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如 甘油）、聚乙烯醇及其混合物。由於聚乙二醇丙醛在水中之穩定性，它可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體之聚合物的數量可以有所不同，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量及/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療中等。
免疫共軛物
本揭示還提供包含如本文所揭示之抗體的免疫共軛物，其共軛（化學鍵合）至一種或多種治療劑，諸如細胞毒性劑、化學治療劑、藥物、生長抑製劑、毒素（例如 來源於細菌、真菌、植物或動物之蛋白毒素、酶活性毒素或其片段）或放射性同位素。
在一個方面，免疫共軛物為抗體-藥物共軛物 (ADC)，其中抗體與上述一種或多種治療劑共軛。通常使用連接基將抗體連接至一種或多種治療劑。ADC 技術概述（包括治療劑、藥物和連接基之實例）示於Pharmacol Review 68:3-19 (2016) 中。
在另一方面，免疫共軛物包括共軛至酶活性毒素或其片段的本文所述之抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈（來源於銅綠假單胞菌）、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白（PAPI、PAPII 和 PAP-S）、苦瓜抑制因子、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑製劑、白樹毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在另一方面，免疫共軛物包含共軛至放射性原子以形成放射性共軛物的本文所述之抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性共軛物。實例包括 At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。當放射性共軛物用於檢測時，它可包含用於閃爍顯像研究之放射性原子（例如 tc99m 或 I123）或用於核磁共振 (NMR) 成像（也稱為磁共振成像，mri）之自旋標記物，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之共軛物可使用多種雙功能蛋白耦聯劑進行製備，該雙功能蛋白耦聯劑諸如 N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物（諸如己二酸二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮化合物（諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯 2,6-二異氰酸酯）和雙活性氟化合物（諸如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人Science 238:1098 (1987) 所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸共軛至抗體的一種例示性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO 94/11026。連接基可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接基」。例如，可使用酸不穩定之連接基、對肽酶敏感之連接基、光不穩定之連接基、二甲基連接基或含二硫鍵之連接基（Chari 等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利號 5,208,020）。
本文之免疫共軛物或 ADC 明確考慮但不限於此等用交聯劑製得之共軛物，該交聯劑包括但不限於可商業尚可獲得（例如 從 Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A 獲得）之 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB（琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯）。
病毒顆粒
在某些實施例中，本揭示之方法可用於生產病毒顆粒。在某些實施例中，本揭示之方法可用於生產病毒載體。在某些實施例中，本揭示之方法可用於表現多肽，例如病毒多肽。此等多肽之非限制性實例包括病毒蛋白、病毒結構 (Cap) 蛋白、病毒包裝 (Rep) 蛋白、AAV 殼體蛋白及病毒輔助蛋白。在一些實施例中，該病毒多肽為 AAV 病毒多肽。
在某些實施例中，藉由本文描述的方法所生產之病毒顆粒，其所攜帶之所關注之基因的實例包括哺乳動物多肽，例如，諸如腎素；生長激素，其包括人類生長激素及牛生長激素；生長激素釋放因子；副甲狀腺素；甲狀腺刺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰島素 A-鏈；胰島素 B-鏈；胰島素原；濾泡刺激素；降鈣素；黃體成長激素；升糖素；瘦素；凝血因子，諸如因子 VIIIC、因子 IX、組織因子及馮威里氏因子；抗凝血因子，諸如蛋白 C；心房利尿鈉因子；肺界面活性劑；纖維蛋白溶酶原活化劑，諸如尿激酶或人類尿液或組織型纖維蛋白溶酶原活化劑 (t-PA)；鈴蟾素；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-α和-β；腫瘤壞死因子受體，諸如死亡受體 5 及 CD120；TNF 相關的誘導配體 (TRAIL)；B-細胞突變抗原 (BCMA)；B-淋巴球刺激劑 (BLyS)；增生誘導配體 (APRIL)；腦啡胜肽酶；RANTES (調節正常 T 細胞表現和分泌的活化)；人類巨噬細胞發炎蛋白 (MIP-1-α)；血清白蛋白，諸如人類血清白蛋白；Mueller 氏-抑制物質；鬆弛素 A-鏈；鬆弛素 B-鏈；鬆弛素原；小鼠性促素關連肽；微生物蛋白質，諸如 β-內醯胺酶；DNA 水解酶；IgE；胞毒型 T 淋巴球相關抗原 (CTLA)，諸如 CTLA-4；抑制素；活化素；血小板衍生內皮細胞生長因子 (PD-ECGF)；血管內皮生長因子家族蛋白 (例如 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D 及 P1GF)；血小板衍生生長因子 (PDGF) 家族蛋白 (例如，PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D 及其二聚體)；纖維母細胞生長因子 (FGF) 家族，諸如 aFGF、bFGF、FGF4 及 FGF9；表皮生長因子 (EGF)；對荷爾蒙或生長因子的受體，諸如 VEGF 受體 (例如 VEGFR1、VEGFR2 及 VEGFR3)、表皮生長因子 (EGF) 受體 (例如 ErbB1、ErbB2、ErbB3 及 ErbB4 受體)、血小板衍生生長因子 (PDGF) 受體 (例如 PDGFR-α 及 PDGFR-β) 及纖維母細胞生長因子受體；TIE 配體 (血管生成素、ANGPT1、ANGPT2)；血管生成素受體，諸如 TIE1 及 TIE2；蛋白 A 或 D；類風濕因子；神經滋養因子，諸如骨衍生神經滋養因子 (BDNF)、神經滋養因子-3、神經滋養因子-4、神經滋養因子-5 或神經滋養因子-6 (NT-3、NT-4、NT-5 或 NT-6) 或神經生長因子，諸如 NGF-b；轉形生長因子 (TGF)，諸如 TGF-α 及 TGF-β，其包括 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4 或 TGF-β5；類胰島素生長因子-I 及類胰島素生長因子-II (IGF-I 及 IGF-II)；des(1-3)-IGF-I (腦 IGF-I)、類胰島素生長因子結合蛋白 (IGFBP)；CD 蛋白，諸如 CD3、CD4、CD8、CD19 及 CD20；紅血球生成素；骨誘導性因子；免疫毒素；骨成形性蛋白質 (BMP)；趨化介素，諸如 CXCL12 及 CXCR4；干擾素，諸如干擾素-α、干擾素-β 及干擾素-γ；群落刺激因子 (CSF)，例如 M-CSF、GM-CSF 及 G-CSF；細胞因子，諸如白介素 (IL)，例如 IL-1 至 IL-10；midkine；超氧歧化酶；T 細胞受體；表面膜蛋白；衰退加速因子；病毒抗原，例如諸如 AIDS 套膜的一部分；轉運蛋白；歸路受體；位址素；調節蛋白；整聯蛋白，諸如 CD11a、CD11b、CD11c、CD18 及 ICAM、VLA-4 及 VCAM；ephrins；Bv8；類 δ 配體 4 (DLL4)；Del-1；BMP9；BMP10；濾泡抑素；肝細胞生長因子 (HGF)/散射因子 (SF)；Alk1；Robo4；ESM1；Perlecan；類 EGF 域、多重 7 (EGFL7)；CTGF 及其家族成員；thrombospondins，諸如 thrombospondin1 及 thrombospondin2；膠原蛋白，諸如膠原蛋白 IV 及膠原蛋白 XVIII；neuropilins，諸如 NRP1 及 NRP2；Pleiotrophin (PTN)；顆粒蛋白前體；Proliferin；刻痕蛋白，諸如 Notch1 及 Notch4；semaphorins，諸如 Sema3A、Sema3C 及 Sema3F；腫瘤相關抗原，諸如 CA125 (卵巢癌抗原)；免疫黏附素；以及任何以上所列之多肽與抗體的片段及/或變異體，例如包括任何以上所列之蛋白質。
在一些實施例中，藉由本文揭示之宿主細胞所生產之病毒顆粒，其所攜帶之所關注的基因可編碼蛋白，該蛋白結合至任何蛋白（或與之互相作用），其包括但不限於選自以下細胞因子、細胞因子相關蛋白和細胞因子受體所組成之群組：8MPI、8MP2、8MP38 (GDFIO)、8MP4、8MP6、8MP8、CSFI (M-CSF)、CSF2 (GM-CSF)、CSF3 (G-CSF)、EPO、FGF1 (αFGF)、FGF2 (βFGF)、FGF3 (int-2)、FGF4 (HST)、FGF5、FGF6 (HST-2)、FGF7 (KGF)、FGF9、FGF1 0、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFN81、IFNG、IFNWI、FEL1、FEL1 (EPSELON)、FEL1 (ZETA)、IL 1A、IL 1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL1 0、IL 11、IL 12A、IL 12B、IL 13、IL 14、IL 15、IL 16、IL 17、IL 17B、IL 18、IL 19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBb3、LTA (TNF-β)、LTB、TNF (TNF-α)、TNFSF4 (OX40 配體)、TNFSF5 (CD40 配體)、TNFSF6 (FasL)、TNFSF7 (CD27 配體)、TNFSF8 (CD30 配體)、TNFSF9 (4-1 BB 配體)、TNFSF10 (TRAIL)、TNFSF11 (TRANCE)、TNFSF12 (APO3L)、TNFSF13 (April)、TNFSF13B、TNFSF14 (HVEM-L)、TNFSF15 (VEGI)、TNFSF18、HGF (VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL 11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP (瘦素)、PTN 及 THPO。
在一些實施例中，藉由本文揭示之宿主細胞所生產之病毒顆粒，其所攜帶之所關注的基因可編碼蛋白，該蛋白結合至任何蛋白（或與之互相作用），其包括但不限於選自以下細胞因子、細胞因子相關蛋白和細胞因子受體所組成之群組：CCLI (1-309)、CCL2 (MCP -1/MCAF)、CCL3 (MIP-Iα)、CCL4 (MIP-Iβ)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP-3)、CCL8 (mcp-2)、CCL11 (伊紅趨素)、CCL 13 (MCP-4)、CCL 15 (MIP-Iδ)、CCL 16 (HCC-4)、CCL 17 (TARC)、CCL 18 (PARC)、CCL 19 (MDP-3b)、CCL20 (MIP-3α)、CCL21 (SLC/exodus-2)、CCL22 (MDC/ STC-1)、CCL23 (MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2 /eotaxin-2)、CCL25 (TECK)、CCL26 (eotaxin-3)、CCL27 (CTACK / ILC)、CCL28、CXCLI (GROI)、CXCL2 (GR02)、CXCL3 (GR03)、CXCL5 (ENA-78)、CXCL6 (GCP-2)、CXCL9 (MIG)、CXCL 10 (IP 10)、CXCL 11 (1-TAC)、CXCL 12 (SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4 (CXCL4)、PPBP (CXCL7)、CX3CL 1 (SCYDI)、SCYEI、XCLI (lymphotactin)、XCL2 (SCM-Iβ)、BLRI (MDR15)、CCBP2 (D6/JAB61 )、CCRI (CKRI/HM145)、CCR2 (mcp-IRB IRA)、CCR3 (CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5 (CMKBR5/ChemR13)、CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7 (CKR7/EBII)、CCR8 (CMKBR8/ TER1/CKR- L1)、CCR9 (GPR-9-6)、CCRL1 (VSHK1)、CCRL2 (L-CCR)、XCR1 (GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1 (RDC1)、CX3CR1 (V28)、CXCR4、GPR2 (CCR10)、GPR31、GPR81 (FKSG80)、CXCR3 (GPR9/CKR-L2)、CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA (IL8Rα)、IL8RB (IL8Rβ)、LTB4R (GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10 (C10)、EPO、FY (DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2 及 VHL。在一些實施例中，藉由本文揭示之宿主細胞所表現的多肽，可與以下結合或互相作用：0772P (CA125、MUC16) (即卵巢癌抗原)、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；類澱粉蛋白 β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1 (天門冬胺酸 β-羥化酶結構域含蛋白 1；LOC253982)；AZGP1 (鋅-α-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R (B 細胞活化因子受體、BLyS 受體 3、BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI (MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B (GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B (骨型態發生蛋白 IB 型受體)；BMPR2；BPAG1 (plectin)；BRCA1；Brevican；C19orf10 (IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2 (D6/JAB61)；CCL1 (1-309)；CCL11 (eotaxin)；CCL13 (MCP-4)；CCL15 (MIP1δ)；CCL16 (HCC-4)；CCL17 (TARC)；CCL18 (PARC)；CCL19 (MIP-3β)；CCL2 (MCP-1)；MCAF；CCL20 (MIP-3α)；CCL21 (MTP-2)；SLC；exodus-2；CCL22 (MDC/STC-1)；CCL23 (MPIF-1)；CCL24 (MPIF-2/eotaxin-2)；CCL25 (TECK)；CCL26 (eotaxin-3)；CCL27 (CTACK/ILC)；CCL28；CCL3 (MTP-Iα)；CCL4 (MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7 (MCP-3)；CCL8 (mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1 (CKRI / HM145)；CCR2 (mcp-IRβ/RA)；CCR3 (CKR/ CMKBR3)；CCR4；CCR5 (CMKBR5/ChemR13)；CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6)；CCR7 (CKBR7/EBI1)；CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9 (GPR-9-6)；CCRL1 (VSHK1)；CCRL2 (L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22 (B 細胞受體 CD22-B 同功型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A (CD79 α、免疫球蛋白相關 α、B 細胞特異性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1 (E-cadherin)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A (p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B (p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A (P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；殼糖酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7 (密連蛋白-7)；CLL-1 (CLEC12A、MICL 及 DCAL2)；CLN3；CLU (clusterin)；CMKLR1；CMKOR1 (RDC1)；CNR1；COL 18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；補體因子 D；CR2；CRP；CRIPTO (CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎上皮癌衍生的生長因子)；CSFI (M-CSF)；CSF2 (GM-CSF)；CSF3 (GCSF)；CTLA4；CTNNB1 (b-鏈蛋白)；CTSB (細胞自溶酵素 B)；CX3CL1 (SCYDI)；CX3CR1 (V28)；CXCL1 (GRO1)；CXCL10 (IP-10)；CXCL11 (I-TAC/IP-9)；CXCL12 (SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2 (GRO2)；CXCL3 (GRO3)；CXCL5 (ENA-78/LIX)；CXCL6 (GCP-2)；CXCL9 (MIG)；CXCR3 (GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5 (Burkitt 氏淋巴瘤受體 1、G 蛋白偶聯受體)；CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16 (LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2 (Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR (內皮素 B 型受體)；F3 (TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1 (Fc 受體樣蛋白 1)；FcRH2 (IFGP4、IRTA4、SPAP1A (SH2 結構域含磷酸酶錨定蛋白 1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1 (αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2 (bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3 (int-2)；FGF4 (HST)；FGF5；FGF6 (HST-2)；FGF7 (KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF (VEGFD)；FELl (EPSILON)；FILl (ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI (纖網蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1 (FRA-1)；FY (DARC)；GABRP (GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1 (GDNF 家族受體 α 1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-α-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2 (CCR10)；GPR19 (G 蛋白偶聯受體 19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54 (KISS1 受體；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81 (FKSG80)；GPR172A (G 蛋白偶聯受體 172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO (C10)；GRP；GSN (凝溶膠蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；組織胺及組織胺受體；HLA-A；HLA-DOB (第 II 型 MHC 分子的 β 次單元 (Ia 抗原)；HLA-DRA；HM74；HMOXI ；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2、ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21 R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST (糖蛋白 130)；流感 A；流感 B；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2 (免疫球蛋白超家族受體易位相關 2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6 (a6 整聯蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4 (b4 整聯蛋白)；α4β7 及 αEβ7 整聯蛋白異二聚體；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5 (GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19 (角蛋白 19)；KRT2A；KHTHB6 (頭髮特異性 H 型角蛋白)；LAMAS；LEP (瘦素)；LGR5 (富含白胺酸重複序列的 G 蛋白偶聯受體 5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA (TNF-b)；LTB；LTB4R (GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64 (淋巴球抗原 64 (RP105)、白胺酸富集重複序列 (LRR) 家族的第 I 型膜蛋白)；Ly6E (淋巴球抗原 6 複合物、locus E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D (淋巴球抗原 6 複合物、locus G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K (淋巴球抗原 6 複合物、locus K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG 或 OMgp；MAP2K7 (c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；midkine；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF (MPF、MSLN、SMR、巨核細胞增效因子、mesothelin)；MS4A1；MSG783 (RNF124、假定蛋白質 FLJ20315)；MSMB；MT3 (金屬硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1 (黏液蛋白)；MYC；MY088；Napi3b (又稱 NaPi2b) (NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶質載劑家族 34 (磷酸鈉)、成員 2、第 II 型鈉依賴性磷酸運輸蛋白 3b)；NCA；NCK2；neurocan；NFKB1；NFKB2；NGFB (NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66 (Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1 (NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5 (嘌呤受體 P2X 配體閘控離子通道 5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4 (CXCL4)；PGF；PGR；phosphacan；PIAS2；PIK3CG；PLAU (uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17 (銀同系物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP (CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg (2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKEN cDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12 基因)；PTAFR；PTEN；PTGS2 (COX-2)；PTN；RAC2 (p21 Rac2)；RARB；RET (ret 原致癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110 (ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2 (lipophilin B)；SCGB2A1 (mammaglobin2)；SCGB2A2 (mammaglobin 1)；SCYEI (內皮單核球活化的細胞因子)；SDF2；Sema 5b (FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、Semaphorin 5b Hlog、sema 域、七血小板活化素重複序列 (第 1 型和類第 1 型)、跨膜域 (TM) 和短細胞質域、(semaphorin) 5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5 (maspin)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B (Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP (前列腺的六跨膜上皮抗原)；STEAP2 (HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相關基因 1、前列腺癌相關蛋白 1、前列腺的六跨膜上皮抗原 2、六跨膜前列腺蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2 (推定跨膜蛋白多糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI (血小板反應素-1 )；THBS2；THBS4；THPO；TIE (Tie-1 )；TMP3；組織因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1 (具有類 EGF 的跨膜蛋白及二個類濾泡抑素域 1；Tomoregulin-1)；TMEM46 (shisa 同系物 2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2 (B94 )；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6 (Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10 (TRAIL)；TNFSF11 (TRANCE)；TNFSF12 (AP03L)；TNFSF13 (April)；TNFSF13B；TNFSF14 (HVEM-L)；TNFSF15 (VEGI)；TNFSF18；TNFSF4 (OX40 配體)；TNFSF5 (CD40 配體)；TNFSF6 (FasL)；TNFSF7 (CD27 配體)；TNFSFS (CD30 配體)；TNFSF9 (4-1 BB 配體)；TOLLIP；類鐸受體；TOP2A (拓樸異構酶 Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118 (環指蛋白、跨膜 2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4 (BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬態電位陽離子通道、亞家族 M、成員 4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪胺酸酶 (TYR；OCAIA；OCA1A；酪胺酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；versican；VHL C5；VLA-4；XCL1 (lymphotactin)；XCL2 (SCM-1b)；XCRI(GPR5/ CCXCRI)；YY1 及/或 ZFPM2。
根據本揭示之宿主細胞可以包裝許多其他病毒成分及/或其他所關注之基因，且以上列表並不意味著是限制性的。
可採用本揭示之方法以工業規模生產所關注之病毒顆粒。治療性蛋白質或其他蛋白質「工業規模」的生產，使用從約 400 L 至約 80,000 L 範圍的細胞培養基，取決於所生產的蛋白及需求。通常來說，這種工業規模生產使用從約 400 L 至約 25,000 L 大小的細胞培養基。在這個範圍內，可使用之具體的細胞培養基大小諸如 4,000 L、約 6,000 L、約 8,000、約 10,000、約 12,000 L、約 14,000 L 或約 16,000 L。
例示性實施例
本揭示涉及具有減少或消除某些宿主細胞蛋白（例如，宿主細胞酵素，其包括但不限於某些脂肪酶、酯酶及/或水解酶）活性之經修飾之哺乳動物細胞（例如，中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞）、用於製備此等細胞的方法，以及使用此等細胞生產所關注之產物（例如，重組蛋白質）的方法。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除一種或多種酵素之活性。在某些實施例中，該一種或多種酵素係選自由下列所組成之群組：脂蛋白脂酶 (LPL)；磷脂酶 B 結構域含蛋白 2 (PLBL2/PLBD2)；脂肪酶 A（胞溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶，脂肪酶）(LIPA)；磷脂酶 A-2 活化蛋白 (PLAA)；磷脂酶 D3 (PLD3)；磷脂酶 A2 第 XV 類 (LPLA2)；磷脂酶 C β 1 (PLCB1)；磷脂酶 C δ 1 (PLCD1)；DDHD 結構域含蛋白 1（片段）(DDHD1)；類溶磷脂酶蛋白 1 (LYPLAL1)；磷脂酶 A2 第 XIIA 類 (PLA2G12A)；過氧化物氧化還原蛋白 6 (PRDX6)；神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SMPD1)；棕櫚醯基蛋白硫酯酶 1 (PPT1)；乙酸異戊酯水解酯酶 1（推定）(IAH1)；OTU 去泛素酶，泛素醛結合 1 (OTUB1)；溶磷脂酶 2（醯基蛋白硫酯酶 2）(LYPLA2)；醯基輔酶 A 硫酯酶 13 (ACOT13)；脂肪酸合成酶 (FASN)；磷脂酶 A2 第 VII 類 (PLA2G7)；泛素特異性肽酶 5 (USP5)；N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1（酸神經醯胺酶）(ASAH1)；脂肪酶成熟因子 1 (LMF1)；載脂蛋白-CII (APOC2)；醯基肉鹼水解酶 (HACH)；羧酸酯酶 1F (CES1F) 或類肝臟羧酸酯酶 B-1 (CES-B1L)；溶磷脂酶 1 (LYPLA1)；羧酸酯酶 1 (CES1)；磷脂酶 A1 成員 A (PLA1A)；以及唾液酸乙酸酯酶 (SIAE)。
在某些實施例中，以下之活性在重組宿主細胞中經減少或消除：a) PPT1； b) LPLA2、LPL 及 LIPA；c) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1；d) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A；e) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SPD1；f) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13；g) LPLA2、LPL 及 PPT1；h) LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1；i) HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；j) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；k) SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；l) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；m) LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；n) LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；o) LMF1 及 APOC2。
在某些實施例中，重組宿主細胞中的該一種或多種酵素之活性是藉由下列方式來減少或消除：(a) 敲落該酵素之表現；(b) 或剔除該酵素之表現；或 (c) 修改編碼該酵素之核酸序列。
在某些實施例中，本揭示針對一種重組宿主細胞，其包含一個或多個經修改之酵素基因。在某些實施例中，該一個或多個經修改之酵素基因不具有可偵測之酵素活性。在某些實施例中，該重組宿主細胞包含編碼所關注之產物之核酸序列。在某些實施例中，該核酸序列經嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。在某些實施例中，該重組宿主細胞進一步包含編碼該所關注之產物之核酸，該核酸隨機嵌入在該哺乳動物細胞的細胞基因體中。在某些實施例中，該經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供包含如本揭示所述之重組宿主細胞的組成物。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得下列者之活性減少：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含選擇具有下列者之活性減少之細胞：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含修改編碼下列中之一者或多者的基因：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；及/或 ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其中該方法包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼下列中之一者或多者之核酸序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；及 ASAH1，而使下列中之一者或多者具有經減少或消除之酵素活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物的哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物的哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其包含一個或多個經修改之酵素基因。在某些實施例中，該一個或多個經修改之酵素基因是藉由破壞編碼區域來修改。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因修改包含雙等位 (biallelic) 修改。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因修改包含刪除 1 個或更多個鹼基對、2 個或更多個鹼基對、3 個或更多個鹼基對、4 個或更多個鹼基對、5 個或更多個鹼基對、6 個或更多個鹼基對、7 個或更多個鹼基對、8 個或更多個鹼基對、9 個或更多個鹼基對、10 個或更多個鹼基對、11 個或更多個鹼基對、12 個或更多個鹼基對、13 個或更多個鹼基對、14 個或更多個鹼基對、15 個或更多個鹼基對、16 個或更多個鹼基對、17 個或更多個鹼基對、18 個或更多個鹼基對、19 個或更多個鹼基對、或 20 個或更多個鹼基對。在某些實施例中，該一個或多個酵素基因為下列者：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統選自由下列所組成之群組：CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統為 CRISPR/Cas9 系統。
在某些如上所述之實施例中，該 CRISPR/Cas9 系統包含：(a) Cas9 分子，以及 (b) 一個或多個導引 RNA (gRNA)，其包含與編碼下列者之基因中的標靶序列互補之靶定序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統包含選自由下列所組成之群組之 RNA：短髮夾 RNA (shRNA)、小干擾 RNA (siRNA) 及微小 RNA (miRNA)，其中該 RNA 與藉由下列基因中之一者或多者所表現的 mRNA 之一部分互補：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。在某些如上所述之實施例中，該遺傳工程系統為鋅指核酸酶 (ZFN) 系統或類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統。
在某些如上所述之實施例中，以下之活性在哺乳動物細胞中經減少或消除：a) PPT1； b) LPLA2、LPL 及 LIPA；c) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SPD1；d) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A；e) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SPD1；f) BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 或 g) LPLA2、LPL 及 PPT1；h) LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1；i) HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；j) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；k) SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；l) LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE；m) LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；n) LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1；o) LMF1 及 APOC2。
在某些如上所述之實施例中，在本揭示中所提供之方法進一步包含純化該所關注之產物、收獲該所關注之產物及/或調製該所關注之產物。
在某些如上所述之實施例中，聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) 之降解是經減少的。在某些如上所述之實施例中，聚山梨糖醇酯 20（PS20 或 Tween 20）之降解是經減少的。在某些如上所述之實施例中，聚山梨糖醇酯 80（PS80 或 Tween 80）之降解是經減少的。
在某些如上所述之實施例中，該細胞為哺乳動物細胞。在某些如上所述之實施例中，該哺乳動物細胞為 CHO 細胞。
在某些如上所述之實施例中，該細胞表現所關注之產物。在某些如上所述之實施例中，藉由該等哺乳動物細胞所表現的該所關注之產物藉由核酸序列而被編碼。在某些如上所述之實施例中，該核酸序列經嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。在某些如上所述之實施例中，藉由該等細胞所表現的該所關注之產物進一步由隨機嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的核酸序列所編碼。
在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含蛋白質、病毒顆粒或病毒載體。在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含重組蛋白質。在某些如上所述之實施例中，該所關注之產物包含抗體或其抗原結合片段。在某些如上所述之實施例中，該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些如上所述之實施例中，該抗體由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。在某些如上所述之實施例中，該抗體為嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。在某些如上所述之實施例中，該抗體為單株抗體。
在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL 及 LIPA。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL 及 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1。在某些實施例中，本揭示之經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LMF1 及 APOC2。
在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL 及 LIPA 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL 及 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性為減少或消除 LMF1 及 APOC2 酵素之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 LIPA 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL 及 LIPA 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL 及 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LMF1 及 APOC2 的活性減少。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LMF1 及 APOC2 活性減少之細胞。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 PPT1 的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL 及 LIPA 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL 及 PPT1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。在某些實施例中，本揭示提供一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LMF1 及 APOC2 中之一者或多者的基因。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 LIPA 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 PPT1 之核酸序列，而使該 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL 及 LIPA 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL 及 LIPA 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之核酸序列，而使該 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之核酸序列，而使該 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL 及 PPT1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL 及 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 及 PPT1 之核酸序列，而使該 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。在某些實施例中，本揭示提供一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LMF1 及 APOC2 之核酸序列，而使該 LMF1 及 APOC2 具有經減少或消除之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物之哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有 LMF1 及 APOC2 之經減少或消除之活性。
在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL 及 LIPA 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、PLAA、IAH1、OTUB1、LYPLA2 及 PLA2G12A 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 及 SMPD1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 BAX、BAK、LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLBL2、PLD3、SMPD1、CLU、PRDX1、PLAA 及 ACOT13 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之經減少或消除之活性。在某些實施例中，本揭示提供一種培養表現所關注之產物之哺乳動物細胞群體的方法，其中該等哺乳動物細胞具有 LMF1 及 APOC2 之經減少或消除之活性。
實例
以下實例僅是對本文所揭示之標的的說明，且不應被視為以任何方式進行限制。
材料與方法
表現質體的構建
重鏈和輕鏈 cDNA 均受巨細胞病毒立即早期基因之啟動子和強化子 (CMV) 的控制。每個 CMV 轉錄起始位點後面都有剪接供體和受體序列，其定義了從最終轉錄物中刪除的內含子（Lucas 等人，1996）。
抗體質體 DNA 構建構形
為了構建單質體抗體構建體，將帶有抗體重鏈 (HC) 和輕鏈 (LC) 基因的片段選殖到含有 L3 和 2L 序列以及嘌呤黴素 N-乙醯基轉移酶 (pac ) 可篩選標記的載體中。為了構建雙質體抗體構建體，將抗體 HC 和 LC 基因的片段選殖到含有 L3 和 LoxFAS 序列的前載體中，並將 HC 和 LC 基因的片段選殖到含有 LoxFAS 和 2L 序列以及pac 可篩選標記的後載體中。在雙質體系統中，pac 的起始密碼子在前載體的末端，而pac 編碼序列的其餘部分在後載體之初。所有抗體基因之前均帶有 CMV 啟動子，其後是 SV40 poly(A) 序列。先前描述之 Cre 重組酶質體 (pOG231) 用於所有 RMCE 過程 (O'Gorman S, Dagenais NA, Qian M, Marchuk Y. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Dec 23;94(26):14602-7)。
L3 序列：5’ ATAACTTCGTATAAAGTCTCCTATACGAAGTTAT
LoxFAS 序列：5’ ATAACTTCGTATAGAAAGGTATATACGAAGTTAT
2L 序列：5’ ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
細胞培養基
CHO 細胞於 125 mL 搖瓶中，以專有 DMEM/F12 為基礎的培養基中，在 150 rpm、37o C 及 5% CO2 下培養。每三到四天以 3x105 /mL 的接種密度繼代細胞。
穩定的轉染及蛋白質生產
根據製造商的建議 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 使用 lipofectamine 2000 CD 轉染 CHO 細胞。將轉染的細胞離心並接種至具有各種甲硫胺酸磺醯亞胺 (MSX) 濃度之 DMEM/F-12 為基礎的選擇性（無谷胺酰胺）培養基中。在接種後約三週，將各個殖株挑入 96 孔板中。藉由將上清液用於 ELISA 分析來評估挑選之殖株的抗體生產。使用 14 天的饋料批式培養過程放大頂部殖株以生產抗體，其中第 3 天的溫度轉變為 35 度。
TI 穩定的細胞株開發
藉由 MaxCyte STX 電穿孔法 (MaxCyte, Gaithersburg, MD) 轉染表現質體。然後用嘌呤黴素和 1-(2'-去氧-2'-氟-1-β-D-阿拉伯糖呋喃糖基-5-碘) 尿嘧啶 (FIAU) (Moravek) 選擇轉染的細胞。在池篩選後，執行單細胞選殖 (SCC)。藉由 HTRF 測定篩選殖株的抗體效價，並放大最高效價的殖株用於進一步評估。
饋料批式生產測定細胞培養效能
饋料批式生產培養是在搖瓶或 ambr15 容器 (Sartorius Stedim) 中使用專有的化學成分確定的生產培養基進行的。在第 0 天以 1x106 細胞/ml 種入細胞，第 3 天將溫度從 37°C 轉換至 35°C。培養物在第 3 天、第 7 天和第 10 天接受專有的飼料培養基。使用 Vi-Cell XR 儀器 (Beckman Coulter) 在第 0 天、第 3 天、第 7 天、第 10 天和第 14 天量測培養物中的活細胞計數 (VCC) 和細胞生存力百分比。使用 Bioprofile 400 Analyzer (Nova Biomedical) 在第 7 天、第 10 天和第 14 天量測葡萄糖和乳酸濃度。使用蛋白質 A 親和性色譜和 UV 檢測來測定第 14 天的效價。
重組脂肪酶的表現和純化
用於表現酵素棕櫚醯基蛋白硫酯酶 1 (Uniprot 登錄 G3HN89)、N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1 (Uniprot 登錄 G3GZB2)、脂肪酶 A (Uniprot 登錄 G3HQY6)、磷脂酶 A2 群 15 (Uniprot 登錄 G3HKV9)、醯基肉鹼水解酶 (Uniprot 登錄 G3IIG1)、類肝臟羧酸酯酶 B-1 蛋白質 (Uniprot 登錄 A0A061IAA7)、溶磷脂酶 1 (Uniprot 登錄 A0A098KXH0)、神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (Uniprot 登錄 G3IMH4)、羧酸酯酶 1 (Uniprot 登錄 A0A061ID92)、磷脂酶 A1 成員 A (Uniprot 登錄 G3I1J5) 及唾液酸乙酸酯酶 (Uniprot 登錄 G3IIB1) 的質體，與 C 端 6xHis-或雙重 6xHis-Flag 表位融合並由哺乳動物巨細胞病毒 (CMV) 啟動子驅動 ，藉由基因合成後次選殖到 pRK5 表現載體中來產生。藉由 DNA 定序來驗證表現構建體並瞬時轉染到 CHO 細胞中。在轉染後第 10 天收獲分泌的重組脂肪酶，並藉由 Ni-NTA、粒徑篩析及抗 His 親和性層析來純化。透析經純化的脂肪酶至所需的緩衝液中並儲存於 -80 °C。
向外部供應商購買重組人類脂蛋白脂酶 (Uniprot 登錄 Q6IAV0) 來評估 (R&D Systems Catalog # 9888-LL-100)。
評估已識別的 HCP 亞群中的聚山梨糖醇酯降解的活性
將 mAb 2 原料藥物 (DS) 摻入棕櫚醯基硫酯酶 1 (PPT1)、重組人類脂蛋白脂酶 (rhLPL)、N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1 (ASAH1) 和脂肪酶 A (LIPA) 中至終濃度分別為 10 µg/mL、0.6 µg/mL、10 µg/mL 和 2.5 µg/mL。這些溶液在 Agilent 1200 自動採樣器中培養，溫度控制在 25°C。在 10-15 小時中選定的時間點採樣 20 µL 並注入具有 ELSD 之混合模式 HPLC 來測定 PS20 的含量。
將生物藥品的代表性配方緩衝液（醋酸組氨酸、pH 6.0、120 mM 蔗糖、含 0.02% 或 0.04% PS20 (w:v)）摻入經純化的酵素至以下濃度：0.5 µg/mL 磷脂酶 A2 群 15 (LPLA2)、5 µg/mL 醯基肉鹼水解酶 (HACH)、5 µg/mL 類肝臟羧酸酯酶 B-1 蛋白質 (CES-B1L)、0.5 µg/mL 溶磷脂酶 1 (LYPLA1)、52 µg/mL 神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SMPD1)、50 µg/mL 羧酸酯酶 1 (CES1)、31 µg/mL 磷脂酶 A1 成員 A (PLA1A) 及 70 µg/mL 唾液酸乙酸酯酶 (SIAE)。這些溶液在 Agilent 1200 自動採樣器中培養，溫度控制在 25°C。在 6-15 小時中選定的時間點採樣 20 µL 並注入具有 ELSD 之混合模式 HPLC 來測定 PS20 的含量。
使用 PS20 降解測定評估經純化的 mAb 上從 CHO 細胞剔除 (KO) 之脂肪酶 / 酯酶
將使用具有剔除脂肪酶/酯酶基因之製造重組 mAb 的 CHO 細胞株所生成的經純化 mAb 樣本，與沒有剔除基因之製造相應 mAb 的 CHO 細胞株所生成的那些相比較，來評估 KO 對聚山梨糖醇酯降解的影響。對於每種 mAb 使用相同的培養條件，在小規模 (2-L) 生物反應器中進行製造 mAb 之 CHO 細胞的製造培養。在生產生物反應器中大約兩週後，收獲並純化培養物。對於每種 mAb 透過相同的下游處理步驟（親和性和拋光層析法）和條件，取得培養物上清液以生成經純化的物質進行測試。以這種方式，對於給定的 mAb，經純化的樣本僅在 KO 細胞或對照細胞的使用上有所不同，因為上游和下游處理步驟和條件相同。重要的是對經純化的物質進行聚山梨糖醇酯 20 (PS20) 降解測定，而不是對細胞培養收獲物，因為經純化的物質更能代表在即時長期存儲過程中，可能發生聚山梨糖醇酯降解和顆粒形成的藥物產物。
為了進行 PS20 降解測定，將經純化的樣本摻入 PS20 (0.04% v/v) 和甲硫胺酸 (20 mg/ml)，並在 25°C 下培養大約 2 週，並在多個時間點採集樣本。在培養後，藉由定量從酵素切割所解釋放的游離脂肪酸（月桂酸），來分析樣本的 PS20 水解降解作用，如前所詳述（Cheng 等人，J Pharm Sci，2019，第 108 卷，第 9 期，第 2880-2886 頁）。月桂酸的釋放速率代表了對 PS20 降解的酵素活性。將具有脂肪酶/酯酶基因剔除之細胞（即，KO）的月桂酸釋放速率，與對照細胞（即，沒有 KO）的月桂酸釋放速率進行比較。藉由計算有基因剔除之 mAb 樣本相對於使用對照細胞之相應 mAb 樣本中，其在月桂酸釋放速率的降低百分比，來評估 KO 對抑制 PS20 降解的效果（圖 15）。例如，在 KO 細胞中完全抑制水解 PS20 降解將導致 PS20 降解活性降低 100%（以月桂酸釋放速率表示）。
實例 1 ：在三種單株抗體富集之樣本中發現 28 種酵素
圖 1 識別了從純化過程不同階段提取之富集的 mAb-1、mAb-2 和 mAb-3 樣本中，發現 28 種酵素。這 28 種酵素包括脂肪酶、酯酶和水解酶。在 mAb-1 樣本中發現 18 種酵素。在 mAb-2 樣本中發現 15 種酵素。另外地，在 mAb-3 樣本中發現八種酵素。
實例 2 ：多重 KO 方法用於空白 CHO 宿主細胞的生成
使用圖 2 中所示的方法，從親代 CHO 宿主細胞株中生成具有單個或多個剔除基因的空白 CHO 細胞株宿主。1X KO 宿主是由親代宿主生成的，其中 PLBL2 基因是經剔除的。為了從親代宿主生成 3X 宿主，同時剔除 LPLA2、LPL 和脂肪酶 A 基因。為了從 3X 宿主生成 7X 宿主，另外地剔除 PPT1、PLD3、PLBL2 和 SMPD1 基因。為了從 7X 宿主生成 12X 宿主，另外地剔除 PLAA、LAH1、OTUB1、LYPLA2 和 PLA2G12a 基因。藉由使用親代宿主並剔除 Bax 和 Bak 基因來生成 Bax-Bak KO 宿主。為了從 Bax-Bak KO 宿主生成 8X 宿主，另外地剔除 LPLA2、LPL、脂肪酶 A、PPT1、PLD3 和 SPD1 基因。為了從 8X KO 宿主生成 13X 宿主，另外地剔除 Clu、PRDX1、Plaa 和 Acot13 基因。每個 KO 宿主細胞株的剔除基因列於圖 3。
實例 3 ： PLBL2 KO 細胞具有與親代 CHO 宿主細胞株相當的細胞生長和生產力
使用標准或強化的饋料策略，將表現 mAb-A 之細胞株的培養種子訓練用於在生物反應器中獲得生產培養物。1X KO 和親代 CHO 細胞株的生長和生存力如圖 4A 和 4C 所示。1X KO 細胞株的效價（圖 4B）與親代 CHO 宿主細胞相當或更好。
實例 4 ：剔除 3- 脂肪酶 / 酯酶之 CHO 細胞株的細胞生長
評估剔除三種 (3X KO) 脂肪酶/酯酶對 CHO 細胞株生長和表現 mAb-B 的效果。將 3X KO 細胞株的細胞生長與親代 CHO 細胞株進行比較。在圖 5A 中描述了表現 mAb-B 之 3X KO 細胞株的生長（表示為活細胞計數的積分，IVCC）。效價和單位生產力 (Qp) 分別在圖 5B 和圖 5C 中顯示。
實例 5 ：剔除 7- 脂肪酶 / 酯酶之 CHO 細胞株的細胞生長
評估剔除七種 (7X KO) 脂肪酶/酯酶對 CHO 細胞株生長的效果。將 7X KO 細胞株的細胞生長與親代 CHO 細胞株進行比較，顯示 7X KO 細胞宿主的生長（表示為活細胞計數的積分，IVCC）與親代 CHO 細胞株相當（圖 6A）。7X KO 宿主的生存力和乳酸積聚分別在圖 6B 和圖 6C 中顯示。
實例 6 ：在 7X 剔除之 CHO 細胞株中生產 3 種不同抗體
還評估 7X KO 表現三種不同抗體的效果。三種不同抗體之 7X KO 細胞株的生長（圖 7A）、效價（圖 7B）和單位生產力（圖 7C）與親代 CHO 宿主細胞相當或更好。
實例 7 ：剔除 8- 脂肪酶 / 酯酶之 CHO 細胞株的細胞生長
評估剔除八種 (8X KO) 脂肪酶/酯酶對 CHO 細胞株生長的效果。將 Bax Bak KO 宿主和 8X KO 細胞株的細胞生長與親代 CHO 細胞株進行比較，顯示 8X KO 和 Bax Bak KO 細胞宿主的生長（表示為活細胞計數的積分，IVCC）與親代 CHO 細胞株相當（圖 8A）。8X KO 和 Bax Bak KO 宿主的生存力和乳酸積聚分別如圖 8B 和圖 8C 所示。
實例 8 ：剔除 12- 脂肪酶 / 酯酶之 CHO 細胞株的細胞生長
評估剔除十二種 (12X KO) 脂肪酶/酯酶對 CHO 細胞株生長的效果。將 12X KO 細胞株的第 13 天 (D13) 的細胞生長與親代 CHO 細胞株、3X KO 及 7X KO 宿主進行比較，顯示 12X KO 細胞宿主的生長（表示為活細胞計數的積分，IVCC）與親代 CHO 細胞株相當（圖 9A）。12X KO 宿主 D13 的生存力和乳酸積聚分別如圖 9B 和圖 9C 所示。
實例 9 ：在 7X 剔除之 CHO 細胞株中 mAb-2 的生產
還評估 7X KO 表現 mAb-2 的效果。用於 mAb-2 之 7X KO 細胞株的平均 D10 效價（圖 10A）、D10 和 D14 生長（圖 10B）、D10 單位生產力（圖 10C）和 D14 乳酸積聚（圖 10D），與親代 CHO 宿主細胞相當。
實例 10 ：在 7X 剔除之 CHO 細胞株中 mAb-1 的生產
還評估 7X KO 表現 mAb-1 的效果。用於 mAb-2 之 7X KO 細胞株的效價（圖 11A）、生長（圖 11B）和單位生產力（圖 11C），與親代 CHO 宿主細胞相當。
實例 11 ：在 7X 脂肪酶 / 酯酶剔除之 CHO 細胞株中 PS20 降解
在製造 mAb-B 之細胞株中評估剔除七種 (7X KO) 脂肪酶/酯酶對 PS20 降解的效果。這些細胞株是藉由轉染 7X KO CHO 宿主（圖 3）所生成以生產 mAb-B。在生物反應器中培養細胞後，透過親和性和拋光層析步驟處理細胞培養收獲物。與在下游處理結束時所取得之經純化物質中的親代 CHO 細胞株（圖 12）相比，在 7X KO 脂肪酶細胞株中 PS20 的降解降低 61%。降低 PS20 的降解可以實現顯著的純化過程優化，更重要的是，它可以降低藥物產物中顆粒形成的風險。
實例 12 ：重組 LIPA 、 ASAH1 、 LPL 、 PPT1 、 LPLA2 、 HACH 、 CES-B1L 、 SMPD1 、 CES1 、 PLA1A 及 SIAE 的特徵
考慮到 PS 水解酶的先前報導以及三酸甘油酯和聚山梨糖醇酯的結構相似性，選擇 LIPA、ASAH1、LPL 和 PPT1 來更詳細地評估聚山梨糖醇酯水解酵素的降解特徵。CHO LIPA、ASAH1、PPT1、LPLA2、HACH、CES-B1L、SMPD1、CES1、PLA1A 和 SIAE 在 CHO 細胞中表現為 His 標誌的構建體，並按方法小節中所述進行純化。每種酵素的 SDS-PAGE 顯示在圖 13 中，且藉由完整質量 MS（資料未顯示）證實所有酵素皆為所關注之蛋白。還應該提到的是，重組人類 LPL (rhLPL) 購自商業來源，而所有其他測試的酵素均購自C. Griseus 。
這些酵素進一步以降解聚山梨糖醇酯的能力為特徵。將每種酵素摻入含有聚山梨糖醇酯的 mAb 配方中。藉由量測聚山梨糖醇酯濃度來量測酵素活性作為時間函數。最終表明，如圖 14a 所示，PPT1、LIPA 和 rhLPL（分別為 10 µg/mL、10 µg/mL 和 0.6 µg/mL）能夠在 10-15 小時的測試時間內降解聚山梨糖醇酯，而 ASAH1 在 2.5 µg/mL 未顯示出可測得之降解。還顯示出，HACH、LYPLA1、CES-B1L 和 LPLA2（分別為 5 µg/mL、5 µg/mL、0.5 µg/mL 和 0.5 µg/mL）也能夠降解配方緩衝溶液中的聚山梨糖醇酯（圖 14b）。另一組水解酵素 PLA1A、SIAE、CES1 和 SMPD1（分別為 31 µg/mL、70 µg/mL、50 µg/mL 和 52 µg/mL）也能夠降解配方緩衝溶液中的聚山梨糖醇酯，但需要較高濃度之這些重組表現的酵素才能降解聚山梨糖醇酯（圖 14c）。
實例 13 ：在其他 7X 及 12X 脂肪酶 / 酯酶剔除之 CHO 細胞株中 PS20 降解
在另外 4 個製造 mAb 的細胞株中，評估在 CHO 細胞株中剔除七個 (7X KO) 和十二個 (12 X KO) 基因對 PS20 降解的效果。這些細胞株是藉由轉染 7X KO 或 12X KO CHO 宿主（圖 3）所生成以生產所需 mAb 。以 mAb W 和 mAb X 細胞株測試 7X KO 的效果，以 mAb Y 和 mAb Z 細胞株測試 12X KO 的效果。在生物反應器中培養細胞後，透過親和性和拋光層析步驟處理細胞培養收獲物。在所有情況下，純化結束時生成的物質顯示，相對於沒有剔除任何基因的對照細胞株，7X KO 和 12X KO 細胞株降低對 PS20 降解的酵素活性（圖 15）。降低 PS20 的降解可以實現顯著的純化過程優化，更重要的是，它可以降低藥物產物中顆粒形成的風險。
實例 14 ：剔除多個脂肪酶 / 酯酶基因的 mAb T 細胞株的 PS20 降解
評估在製造 mAb T 的重組 CHO 細胞株中，剔除脂肪酶/酯酶基因對 PS20 降解的效果。這些細胞株是藉由從製造重組 mAb T 的 CHO 細胞株中依次剔除脂肪酶/酯酶基因而生成的，首先測試 1X KO (LPLA2) 和 2X KO（LPLA2 和 LPL）對細胞株的效果。然後測試 3X KO（LPLA2、LPL 和 LIPA）和 6X KO（LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、PLD3 和 PLBL2）對細胞株的效果。在生物反應器中培養細胞後，透過親和性和拋光層析步驟處理細胞培養收獲物。在所有情況下，純化結束時生成的物質顯示，相對於沒有剔除任何基因的對照親代 mAb T 細胞株，1X KO、2X KO、3X KO 和 6X KO 細胞株降低對 PS20 降解的酵素活性（圖 16）。使用 3X KO 和 6X KO 細胞株之第二組實驗顯示，其 PS20 降解活性低於使用 1X KO 和 2X KO 細胞株的第一組實驗。綜上所述，這些結果表明剔除表現降解聚山梨糖醇酯酵素之多個相關脂肪酶/酯酶基因的潛在益處。降低 PS20 的降解可以實現顯著的純化過程優化，更重要的是，它可以降低藥物產物中顆粒形成的風險。
本申請所引用的所有圖式和所有參考文獻、專利和公開之專利申請案的內容以及登錄號，明確以引用方式併入本文。
圖 1. 表格示出在三種不同單株抗體的純化過程中，從各期採集到富集之樣本中所發現的酵素。圖 2. 一種用於生產空白 CHO 宿主細胞的多重剔除 (KO) 方法。圖 3. 表格示出每個空白 CHO 宿主中，已被調節或剔除的基因。圖 4A-4C . 與親代宿主細胞相比，PLBL2 KO 細胞具有相似或更好的效價。用活細胞濃度 (IVCC) 之積分表示的生長速率如圖 4A 所示。如圖 4B 所示，與親代宿主細胞相比，自 PLBL2-KO 宿主細胞株所衍生之 MAb-A 製造池的效價具有相若或更高的效價，這是由於其具有更高的單位生產力 (Qp)，如圖 4C 所示。圖 5A-5C. 與親代宿主細胞相比，3X KO 細胞具有相似或更好的單位生產力 (Qp)。生長速率如圖 5A 所示。自 3X KO 宿主細胞株所衍生之 MAb-B 製造池如圖 5B 所示。mAb-B 的單位生產力 (Qp) 如圖 5C 所示。圖 6A-6C. 7X KO 空白宿主的效能。用活細胞濃度 (IVCC) 之積分表示的細胞生長如圖 6A 所示。生存力和乳酸積聚分別如圖 6B 和 6C 所示。圖 7A-7C. 藉由 7X KO 宿主細胞生產三種不同抗體。表現三種不同 mAb（如 IVCC 所表現）之 7X KO 宿主細胞的生長如圖 7A 所示。藉由 7X KO 宿主細胞表現之三種不同 mAb 的效價如圖 7B 所示。mAb-B、mAb-C 及 mAb-D 的單位生產力 (Qp) 如圖 7C 所示。圖 8A-8C. 8X KO 及 Bax Bak KO 空白宿主的效能。用活細胞濃度 (IVCC) 之積分表示的細胞生長如圖 8A 所示。生存力和乳酸積聚分別如圖 8B 和 8C 所示。圖 9A-9C. 3X、7X 及 12X KO 空白宿主的效能。用活細胞濃度 (IVCC) 之積分表示的細胞生長如圖 9A 所示。生存力和乳酸積聚分別如圖 9B 和 9C 所示。圖 10A-10C. 藉由 7X KO 宿主細胞殖株生產 mAb-2。平均 D10 效價如圖 10A 所示。平均 D10 IVCCs 如圖 10B 所示。平均 D10 Qp 如圖 10C 所示。圖 11A-11C. 藉由 7X KO 宿主細胞殖株生產 mAb-1。效價如圖 11A 所示。IVCC 如圖 11B 所示。Qp 如圖 11C 所示。圖 12. PS20 降解。在製造 7X KO mAb-B 的 RMCE 池中觀察到低 PS20 降解。圖 13A-13K. SDS PAGE 用於純化酵素：a. PPT1；b. ASAH1；c. LIPA；d. LPLA1；e. HACH；f. CESB1L；g. LYPLA1；h. SMPD1；i. CES1；j.PLA1A；k.SIAE圖 14A-14C. a. 添加重組純化的水解酶酵素（PPT1、rhLPL、ASAH1、LIPA）後，在 30 mg/mL mAb 2 溶液中之 PS20 初始濃度（藉由具有 ELSD 之混合模式 HPLC 來量測）的百分比；b. 添加重組純化的水解酶酵素（HACH、LYPLA1、CES-B1L、LPLA2）後，在配方緩衝溶液中之 PS20 初始濃度（藉由具有 ELSD 之混合模式 HPLC 來量測）的百分比；c. 添加重組純化的水解酶酵素（PLA1A、SIAE、CES1、SMPD1）後，在配方緩衝溶液中之 PS20 初始濃度（藉由具有 ELSD 之混合模式 HPLC 來量測）的百分比。圖 15 . 在純化的 mAb 樣本中，脂肪酶／酯酶 KO 對聚山梨糖醇酯降解的影響。藉由 PS20 降解測定法評估在純化的樣本中，針對聚山梨糖醇酯降解之酵素活性。每個 mAb 中，藉由比較由 KO 細胞和對照細胞所生產之純化的物質，來評估 PS20 降解的降低。所有製造 KO mAb 的細胞是藉由以相應之 mAb 基因轉染 CHO 空白 KO 宿主（7X KO 或 12X KO，如圖 3 所示）所生成的。圖 16 . 在純化的 mAb T 樣本中，脂肪酶／酯酶 KO 對聚山梨糖醇酯降解的影響。藉由 PS20 降解測定法評估在純化的 mAb T 樣本中，針對聚山梨糖醇酯降解之酵素活性。藉由比較由 KO 細胞和對照細胞所生產之純化的物質，來評估 PS20 降解的降低。所有 KO 細胞（1X、2X、3X 及 6X）是藉由依序剔除在親代 mAb T 細胞株中之脂肪酶／酯酶基因所生成的。

Claims (117)

  1. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除一種或多種酵素之活性。
  2. 如請求項 1 之重組宿主細胞，其中該一種或多種酵素選自由下列所組成之群組：脂蛋白脂酶 (LPL)；磷脂酶 B 結構域含蛋白 2 (PLBL2/PLBD2)；脂肪酶 A（胞溶體酸性脂酶/膽固醇酯水解酶，脂肪酶）(LIPA)；磷脂酶 A-2 活化蛋白 (PLAA)；磷脂酶 D3 (PLD3)；磷脂酶 A2 第 XV 類 (LPLA2)；磷脂酶 C β 1 (PLCB1)；磷脂酶 C δ 1 (PLCD1)；DDHD 結構域含蛋白 1（片段）(DDHD1)；類溶磷脂酶蛋白 1 (LYPLAL1)；磷脂酶 A2 第 XIIA 類 (PLA2G12A)；過氧化物氧化還原蛋白 6 (PRDX6)；神經鞘磷脂磷酸二酯酶 (SMPD1)；棕櫚醯基蛋白硫酯酶 1 (PPT1)；乙酸異戊酯水解酯酶 1（推定）(IAH1)；OTU 去泛素酶，泛素醛結合 1 (OTUB1)；溶磷脂酶 2（醯基蛋白硫酯酶 2）(LYPLA2)；醯基輔酶 A 硫酯酶 13 (ACOT13)；脂肪酸合成酶 (FASN)；磷脂酶 A2 第 VII 類 (PLA2G7)；泛素特異性肽酶 5 (USP5)；N-醯基神經鞘胺醇醯胺水解酶 1（酸神經醯胺酶）(ASAH1)；脂肪酶成熟因子 1 (LMF1)；載脂蛋白 C-II (APOC2)；醯基肉鹼水解酶 (HACH)；羧酸酯酶 1F (CES1F) 或類肝臟羧酸酯酶 B-1 (CES-B1L)；溶磷脂酶 1 (LYPLA1)；羧酸酯酶 1 (CES1)；磷脂酶 A1 成員 A (PLA1A)；以及唾液酸乙酸酯酶 (SIAE)。
  3. 如請求項 2 之重組宿主細胞，其中下列者的活性： a)      PPT1； b)      LPLA2；LPL；和 LIPA； c)      LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；和 SMPD1； d)      LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；PLAA；IAH1；OTUB1；LYPLA2；和 PLA2G12A； e)      BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLD3；和 SMPD1； f)       BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；CLU；PRDX1；PLAA；和 ACOT13； g)      LPLA2；LPL；和 PPT1 h)      LPLA2；LPL；LIPA 和 PPT1 i)       HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 j)       LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 k)      SMPD1；CES1；PLA1A；和 SIAE l)       LPLA2；LPL、LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；SMPD1；CES1；PLA1A；和 SIAE m)     LPLA2；LMF1；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 n)      LPLA2；LMF1；APOC2；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 或 o)      LMF1 和 APOC2 經減少或消除。
  4. 如請求項 1 至 3 之重組宿主細胞，其中該一種或多種酵素之活性藉由下列者來減少或消除： (a)     敲落該酵素之表現； (b)     或剔除該酵素之表現；或 (c)     修改編碼該酵素之核酸序列。
  5. 如請求項 1 之重組宿主細胞，其中該細胞包含一個或多個經修改之酵素基因。
  6. 如請求項 5 之重組宿主細胞，其中該一個或多個經修改之酵素基因不具有可偵測之酵素活性。
  7. 如請求項 1 至 6 之重組宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  8. 如請求項 7 之重組宿主細胞，其中該細胞為 CHO 細胞。
  9. 如請求項 1 至 8 中任一項之重組宿主細胞，其包含編碼所關注之產物之核酸序列。
  10. 如請求項 9 之重組宿主細胞，其中該所關注之產物包含蛋白質、病毒顆粒或病毒載體。
  11. 如請求項 9 或 10 之重組宿主細胞，其中該所關注之產物包含重組蛋白質。
  12. 如請求項 9 至 11 中任一項之重組宿主細胞，其中該所關注之產物包含抗體或其抗原結合片段。
  13. 如請求項 12 之重組宿主細胞，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
  14. 如請求項 12 之重組宿主細胞，其中該抗體由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
  15. 如請求項 12 至 14 中任一項之重組宿主細胞，其中該抗體包含嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
  16. 如請求項 12 至 15 中任一項之重組宿主細胞，其中該抗體包含單株抗體。
  17. 如請求項 9 至 16 中任一項之重組宿主細胞，其中該核酸序列經嵌入在該哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。
  18. 如請求項 17 之重組宿主細胞，其進一步包含編碼該所關注之產物之核酸，該核酸隨機嵌入在該哺乳動物細胞的細胞基因體中。
  19. 如請求項 1 之重組宿主細胞，其中該經修飾之細胞不表現任何可偵測之 LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  20. 一種組成物，其包含如請求項 1 至 19 中任一項之重組宿主細胞。
  21. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  22. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得下列者之活性減少：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  23. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有下列者之活性減少之細胞：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  24. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼下列中之一者或多者的基因：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  25. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除下列者之表現：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  26. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼下列中之一者或多者之核酸序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；及 ASAH1，而使下列中之一者或多者具有經減少或消除之酵素活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  27. 如請求項 25 或 26 之方法，其中該遺傳工程系統選自由下列所組成之群組：CRISPR/Cas 系統、鋅指核酸酶 (ZFN) 系統、類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統及其組合。
  28. 如請求項 27 之方法，其中該遺傳工程系統為 CRISPR/Cas9 系統。
  29. 如請求項 28 之方法，其中該 CRISPR/Cas9 系統包含： (a)     Cas9 分子，及 (b)     一個或多個導引 RNA (gRNA)，其包含與編碼下列者之基因中的標靶序列互補之靶定序列：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；HACH；LMF1；APOC2；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  30. 如請求項 25 或 26 之方法，其中該遺傳工程系統包含選自由下列所組成之群組之 RNA：短髮夾 RNA (shRNA)、小干擾 RNA (siRNA) 及微小 RNA (miRNA)，其中該 RNA 與藉由下列基因中之一者或多者所表現的 mRNA 之一部分互補：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  31. 如請求項 25 或 26 之方法，其中該遺傳工程系統為鋅指核酸酶 (ZFN) 系統或類轉錄活化因子效應因子核酸酶 (TALEN) 系統。
  32. 如請求項 21 至 31 中任一項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  33. 如請求項 32 之方法，其中該哺乳動物細胞為 CHO 細胞。
  34. 如請求項 21 至 33 中任一項之方法，其中該細胞表現所關注之產物。
  35. 如請求項 34 之方法，其中藉由該等細胞所表現的該所關注之產物由核酸序列所編碼。
  36. 如請求項 35 之方法，其中該核酸序列經嵌入在該細胞的細胞基因體中的標的位置。
  37. 如請求項 34 至 36 中任一項之方法，其中藉由該等細胞所表現的該所關注之產物進一步由隨機嵌入在該哺乳動物細胞的細胞基因體中的核酸序列所編碼。
  38. 如請求項 34 至 37 中任一項之方法，其中該所關注之產物包含蛋白質。
  39. 如請求項 38 之方法，其中該所關注之產物包含重組蛋白質。
  40. 如請求項 34 至 39 中任一項之方法，其中該所關注之產物包含抗體或其抗原結合片段。
  41. 如請求項 40 之方法，其中該抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
  42. 如請求項 40 之方法，其中該抗體由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
  43. 如請求項 40 至 42 中任一項之方法，其中該抗體為嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
  44. 如請求項 40 至 43 中任一項之方法，其中該抗體為單株抗體。
  45. 一種製造所關注之產物之方法，其包含培養表現該所關注之產物的哺乳動物細胞，其中該等哺乳動物細胞表現該所關注之產物且具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SMPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  46. 一種培養表現所關注之產物的哺乳動物細胞群體之方法，其中該等哺乳動物細胞具有下列中之一者或多者之經減少或消除之活性：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；及 ASAH1。
  47. 如請求項 35 或 36 之方法，其中該活性之減少或消除為減少或消除該等哺乳動物細胞中的下列者之活性： a)      PPT1； b)      LPLA2；LPL；和 LIPA； c)      LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；和 SMPD1； d)      LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SMPD1；PLAA；IAH1；OTUB1；LYPLA2；和 PLA2G12A； e)      BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLD3；和 SMPD1； f)       BAX；BAK；LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；PLBL2；PLD3；SPD1；CLU；PRDX1；PLAA；和 ACOT13； g)      LPLA2；LPL；和 PPT1 h)      LPLA2；LPL；LIPA 和 PPT1 i)       HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 j)       LPLA2；LPL；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 k)      SMPD1；CES1；PLA1A；和 SIAE l)       LPLA2；LPL、LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；SMPD1；CES1；PLA1A；和 SIAE m)     LPLA2；LMF1；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 n)      LPLA2；LMF1；APOC2；LIPA；PPT1；HACH；CES1F/CES-B1L；和 LYPLA1 或 o)      LMF1 和 APOC2。
  48. 如請求項 45 至 47 中任一項之方法，其中該等哺乳動物細胞為 CHO 細胞。
  49. 如請求項 45 至 47 中任一項之方法，其中藉由該等哺乳動物細胞所表現的該所關注之產物藉由核酸序列而被編碼。
  50. 如請求項 49 之方法，其中該核酸序列經嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的標的位置。
  51. 如請求項 45 至 50 中任一項之方法，其中藉由該等細胞所表現的該所關注之產物進一步由隨機嵌入在該等哺乳動物細胞的細胞基因體中的核酸序列所編碼。
  52. 如請求項 45 至 51 中任一項之方法，其中該所關注之產物包含蛋白質、病毒顆粒或病毒載體。
  53. 如請求項 45 至 52 中任一項之方法，其中該所關注之產物包含重組蛋白質。
  54. 如請求項 45 至 53 中任一項之方法，其中該所關注之產物包含抗體或其抗原結合片段。
  55. 如請求項 54 之方法，其中抗體為多特異性抗體或其抗原結合片段。
  56. 如請求項 54 之方法，其中該抗體由單一重鏈序列及單一輕鏈序列或其抗原結合片段組成。
  57. 如請求項 54 至 56 中任一項之方法，其中該抗體為嵌合抗體、人類抗體或人源化抗體。
  58. 如請求項 54 至 57 中任一項之方法，其中該抗體為單株抗體。
  59. 如請求項 45 至 58 中任一項之方法，其進一步包含純化該所關注之產物、收獲該所關注之產物及/或調製該所關注之產物。
  60. 如請求項 21 至 58 中任一項之方法，其中聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) 之降解是經減少的。
  61. 如請求項 21 至 58 中任一項之方法，其中聚山梨糖醇酯 20（PS20 或 Tween 20）之降解是經減少的。
  62. 如請求項 21 至 58 中任一項之方法，其中聚山梨糖醇酯 80（PS80 或 Tween 80）之降解是經減少的。
  63. 一種重組宿主細胞，其包含一個或多個經修改之酵素基因。
  64. 如請求項 63 之重組宿主細胞，其中該一個或多個經修改之酵素基因是藉由破壞編碼區域來修改。
  65. 如請求項 63 之重組宿主細胞，其中該一個或多個酵素基因修改包含雙等位 (biallelic) 修改。
  66. 如請求項 65 之重組宿主細胞，其中該一個或多個酵素基因修改包含刪除 1 個或更多個鹼基對、2 個或更多個鹼基對、3 個或更多個鹼基對、4 個或更多個鹼基對、5 個或更多個鹼基對、6 個或更多個鹼基對、7 個或更多個鹼基對、8 個或更多個鹼基對、9 個或更多個鹼基對、10 個或更多個鹼基對、11 個或更多個鹼基對、12 個或更多個鹼基對、13 個或更多個鹼基對、14 個或更多個鹼基對、15 個或更多個鹼基對、16 個或更多個鹼基對、17 個或更多個鹼基對、18 個或更多個鹼基對、19 個或更多個鹼基對、或 20 個或更多個鹼基對。
  67. 如請求項 63 之重組宿主細胞，其中該一個或多個酵素基因為下列者：LPL；PLBL2/PLBD2；LIPA；PLAA；PLD3；LPLA2；PLCB1；PLCD1；DDHD1；LYPLAL1；PLA2G12A；PRDX6；SPD1；PPT1；IAH1；OTUB1；LYPLA2；ACOT13；FASN；PLA2G7；USP5；ASAH1；LMF1；APOC2；HACH；CES1F/CES-B1L；LYPLA1；CES1；PLA1A；及/或 SIAE。
  68. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 酵素之活性。
  69. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。
  70. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。
  71. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 酵素之活性。
  72. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。
  73. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的酵素之活性而減少或消除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 酵素之活性。
  74. 一種重組宿主細胞，其中該細胞經修飾以相對於未經修飾之細胞中的 LMF1 及 APOC2 之水平而減少或消除彼等之水平。
  75. 一種組成物，其包含如請求項 68 至 74 中任一項之重組宿主細胞。
  76. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。
  77. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  78. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  79. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。
  80. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  81. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  82. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
  83. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2；LPL；LIPA 及 PPT1 的活性減少。
  84. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。
  85. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。
  86. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 的活性減少。
  87. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。
  88. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 的活性減少。
  89. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含調節細胞培養過程及/或培養基組成物，其中調節細胞培養過程及/或培養基組成物使得 LMF1 及 APOC2 的活性減少。
  90. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 活性減少之細胞。
  91. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。
  92. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。
  93. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 活性減少之細胞。
  94. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。
  95. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 活性減少之細胞。
  96. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含選擇具有 LMF1 及 APOC2 活性減少之細胞。
  97. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 中之一者或多者的基因。
  98. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。
  99. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。
  100. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 中之一者或多者的基因。
  101. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。
  102. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 中之一者或多者的基因。
  103. 一種減少細胞中的酵素活性之方法，其包含修改編碼 LMF1 及 APOC2 中之一者或多者的基因。
  104. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之表現。
  105. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  106. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  107. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之表現。
  108. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  109. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之表現。
  110. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統敲落或剔除 LMF1 及 APOC2 之表現。
  111. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA 及 PPT1 具有經減少或消除之酵素活性。
  112. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。
  113. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。
  114. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 之核酸序列，而使該 LPLA2、LPL、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L、LYPLA1、SMPD1、CES1、PLA1A 及 SIAE 具有經減少或消除之酵素活性。
  115. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。
  116. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 之核酸序列，而使該 LPLA2、LMF1、APOC2、LIPA、PPT1、HACH、CES1F/CES-B1L 及 LYPLA1 具有經減少或消除之酵素活性。
  117. 一種減少或消除細胞中的酵素活性之方法，其包含將遺傳工程系統投予該細胞，其中該遺傳工程系統修改編碼 LMF1 及 APOC2 之核酸序列，而使該 LMF1 及 APOC2 具有經減少或消除之酵素活性。
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