DE69333807T2

DE69333807T2 - Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür

Info

Publication number: DE69333807T2
Application number: DE69333807T
Authority: DE
Inventors: S. James HUSTON; L. L. Houston; B. David RING; Hermann Oppermann
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1992-02-06
Filing date: 1993-02-05
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2013-02-06
Also published as: WO1993016185A2; US5534254A; JP2003284577A; AU675929B2; US7138497B2; DE69334351D1; JP2008289500A; JP2007228979A; ATE503496T1; EP0625200A1; EP1997894A3; AU3612293A; US5753204A; US5877305A; EP0625200B1; CA2372813A1; ATE419355T1; US20060147444A1; EP1514934B1; ATE295420T1

Description

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen neue biosynthetische Zusammensetzungen von Substanzen und speziell biosynthetische Antikörperbindungsstellen (BABS)-Proteine und deren Konjugate. Erfindungsgemäße Zusammensetzungen sind zum Beispiel bei der Zielfindung bei Arzneistoffen und Toxinen, der Bildgebung, in der immunologischen Behandlung verschiedener Krebse und in spezifischen Bindungstests, Affinitätsreinigungsverfahren und in der Biokatalyse nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Brustkrebs ist die häufigste bösartige Erkrankung bei Frauen in Nordamerika mit 130000 neuen Fällen in 1987. Annähernd eine von 11 Frauen entwickelt in ihrer Lebenszeit Brustkrebs, was diese bösartige Erkrankung zur zweitwichtigsten Ursache von Krebstod, nach Lungenkrebs, bei Frauen in den Vereinigten Staaten macht. Obwohl die Mehrheit der Frauen mit Brustkrebs sich mit einer vollständig resezierbaren Erkrankung vorstellt, bleibt die Metastasierung ein enormes Hindernis für die Heilung. Die Verwendung von adjuvanter Chemotherapie oder hormoneller Therapie hat eindeutig einen positiven Effekt auf das erkrankungsfreie Überleben und das Gesamtüberleben in ausgewählten Untergruppen von Frauen mit vollständig reseziertem primärem Brustkrebs, aber ein wesentlicher Anteil der Frauen erleidet noch einen Rückfall durch eine Metastasierung (siehe zum Beispiel Fisher et al., J. Clin. Oncol. 4 (1986), 929 – 941; "The Scottish trial", Lancet 2 (1987), 171 – 175). Trotz der regelmäßig in entsprechend ausgewählten Patienten durch Chemotherapie und hormoneller Therapie induzierten objektiven Antworten wurde eine Heilung von metastasierendem Brustkrebs nicht erreicht (siehe zum Beispiel Aisner et al., J. Clin. Oncol. 5 (187), 1523 – 1533). Zu diesem Zweck wurden viele innovative Behandlungsprogramme, einschließlich der Verwendung neuer Wirkstoffe, von Kombinationen von Wirkstoffen, der Hochdosistherapie (Henderson, ebenda) und einer erhöhten Dosisstärke (Kernan et al., Clin. Invest. 259 (1988), 3154 – 3157), zusammengestellt. Obwohl Verbesserungen beobachtet wurden, kam eine regelmäßige Erlangung von Vollremissionen von Metastasierungen, dem ersten Schritt in Richtung Heilung, nicht vor. Es bleibt ein dringender Bedarf nach neuen Ansätzen zur Behandlung.
Das Fv-Fragment eines Immunglobulinmoleküls aus IgM und in seltenen Fällen IgG oder IgA wird durch proteolytische Spaltung erzeugt und schließt ein nicht-covalentes V_H-V_L-Heterodimer ein, welches eine intakte Antigenbindungsstelle darstellt. Ein Einzelketten-Fv(sFv)-Polypeptid ist ein covalent verbundenes V_H-V_L-Heterodimer, welches von einer Genfusion, die V_H- und V_L-codierende Gene, verbunden durch einen ein Peptid codierenden Linker, einschließt, exprimiert wird. Siehe Huston et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 85 (1988), 5879, hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen.
Das US-Patent 4,753,894 offenbart murine monoclonale Antikörper, welche selektiv an menschliche Brustkrebszellen binden und, wenn sie an die Ricin-A-Kette konjugiert sind, eine TCID 50 % von weniger als etwa 10 nM gegenüber mindestens einer der MCF-7-, CAMA-1-, SKBR-3- oder BT-20-Zellen zeigen. Die SKBR-3-Zelllinie wird spezifisch durch den monoclonalen Antikörper 520C9 erkannt. Der als 520C9 bezeichnete Antikörper wird von einem murinen Hybridom sezerniert und ist nun bekannt dafür c-erbB-2 zu erkennen (Ring et al., Molecular Immunology 28 (1991), 915).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung zeigt die Synthese einer Klasse von neuen Proteinen, die als Einzelketten-Fv(sFv)-Polypeptide bekannt sind, welche biosynthetische Einzel-Polypeptidketten-bindungsstellen (BABS) einschließen und eine Bindungsstelle definieren, welche die immunologischen Bindungseigenschaften eines Immunglobulinmoleküls zeigt, welches c-erbB-2 oder ein mit c-erbB-2 verwandtes Tumor-Antigen bindet.
Das sFv schließt mindestens zwei Polypeptid-Domänen ein, welche durch einen Polypeptid-Linker verbunden sind, der den Abstand zwischen dem Carboxy-(C)-Terminus der einen Domäne und dem Amino-(N)-Terminus der anderen Domäne überbrückt, wobei die Aminosäuresequenz von jeder der Polypeptid-Domänen einen Satz von Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) umfasst, der in einen Satz von Framework-Regionen (FRs) eingeschoben ist, wobei die CDRs die immunologische Bindung an c-erbB-2 oder an ein mit c-erbB-2 verwandtes Tumor-Antigen bedingen.
In ihrer weitesten Ausdehnung zeigt diese Erfindung Einzelketten-Fv-Polypeptide einschließlich biosynthetischer Antikörperbindungsstellen, replizierbare Expressionsvektoren, die durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden und welche DNA-Sequenzen, die diese Polypeptide codieren, enthalten und fähig sind diese zu exprimieren, Verfahren zur Herstellung dieser Polypeptide, Verfahren zur Darstellung eines Tumors, der c-erbB-2 oder ein mit c-erbB-2 verwandtes Tumor-Antigen exprimiert, und Verfahren zur Behandlung eines Tumors unter Verwendung von zum Ziel lenkbaren therapeutischen Wirkstoffen mittels Konjugaten oder Fusionen mit diesen Polypeptiden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "immunologische Bindung" oder "immunologisch reaktiv" auf die nicht-covalenten Interaktionen jener Art, die zwischen einem Immunglobulinmolekül und einem Antigen, für welches das Immunglobulinmolekül spezifisch ist, auftreten; "c-erbB-2" bezieht sich auf ein Proteinantigen, welches auf der Oberfläche von Tumorzellen wie Brust- und Eierstock-Tumorzellen exprimiert wird, welches ein saures Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von annähernd 200000 ist, einen isoelektrischen Punkt von etwa 5,3 hat und die in SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellte Aminosäuresequenz einschließt. Ein „mit cerbB-2 verwandtes Tumor-Antigen" ist ein Protein, welches sich auf der Oberfläche von Tumorzellen wie Brust- und Eierstock-Tumorzellen befindet, welches bezüglich der Antigeneigenschaften mit dem c-erbB-2-Antigen verwandt ist, das heißt durch ein Immunglobulin gebunden wird, welches fähig ist, das c-erbB-2-Antigen zu binden, wobei Beispiele für solche Immunglobuline die 520C9-, 741F8- und 454C11-Antikörper sind; oder welches eine Aminosäuresequenz hat, die mindestens zu 80 %, bevorzugt zu 90 % mit der Aminosäuresequenz von c-erbB-2 homolog ist. Ein Beispiel für ein mit c-erbB-2 verwandtes Antigen ist der Rezeptor für den epidermalen Wachstumsfaktor.
Eine sFv-CDR, welche "im Wesentlichen homolog mit" einer Immunglobulin-CDR ist, behält mindestens 70 %, bevorzugt 80 % oder 90 % der Aminosäuresequenz der Immunglobulin-CDR bei und behält ebenfalls die immunologischen Bindungseigenschaften des Immunglobulins bei.
Der Ausdruck "Domäne" bezieht sich auf die Sequenz eines Polypeptids, die sich in ihrer nativen Konformation in eine einzelne globuläre Region faltet und abgegrenzte Bindungs- oder funktionelle Eigenschaften aufweisen kann. Der Aus druck "CDR" oder Komplementaritäts-bestimmende Region bezieht sich, wie hier verwendet, auf Aminosäuresequenzen, welche zusammen die Bindungsaffinität und Bindungsspezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulin-Bindungsstelle oder eines synthetischen Polypeptids, welches diese Funktion nachbildet, definieren. CDRs sind typischerweise nicht vollständig homolog zu den hypervariablen Regionen von natürlichen Fvs, sondern sie können eher auch spezifische Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen enthalten, welche die hypervariablen Regionen flankieren und vordem als Framework, welches nicht direkt Komplemetaritäts-bestimmend ist, angesehen wurden. Der Ausdruck "FR" oder Framework-Region bezieht sich, wie hier verwendet, auf Aminosäuresequenzen, welche natürlicherweise zwischen den CDRs in Immunglobulinen vorgefunden werden.
Einzelketten-Fv-Polypeptide, welche erfindungsgemäß hergestellt werden, schließen biosynthetisch hergestellte, neue Sequenzen von Aminosäuren ein, welche Polypeptide definieren, die dazu ausgelegt sind an ein vorher ausgewähltes c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen-Material zu binden. Die Struktur dieser synthetischen Polypeptide ist gegenüber der von natürlich vorkommenden Antikörpern, deren Fragmenten oder bekannten synthetischen Polypeptiden oder "chimären Antikörpern" dadurch verschieden, dass die Regionen des Einzelketten-Fv, die für die Spezifität und Affinität der Bindung (analog zu den variablen Regionen (V_H/V_L) nativer Antikörper) verantwortlich sind, selbst chimär sein können, zum Beispiel Aminosäuresequenzen einschließen, die aus Abschnitten von mindestens zwei verschiedenen Antikörpermolekülen aus der gleichen oder aus verschiedenen Spezies abgeleitet oder zu ihnen homolog sind. Diese analogen V_H- und V_L-Regionen sind vom N-Terminus der einen bis zum C-Terminus der anderen durch ein über eine Peptidbindung gebundenes, biosynthetisches Linker-Peptid verbunden.
Die Erfindung stellt somit ein Einzelketten-Fv-Polypeptid bereit, welches mindestens eine vollständige Bindungsstelle definiert, die fähig ist c-erbB-2 oder ein mit c-erbB-2 verwandtes Tumor-Antigen zu binden. Eine vollständige Bindungsstelle schließt eine einzelne zusammenhängende Kette von Aminosäuren ein, welche zwei Polypeptid-Domänen, zum Beispiel V_H und V_L, verbunden durch eine Aminosäure-Linker-Region, hat. Ein sFv, welches mehr als eine vollständige Bindungsstelle hat, die zur Bindung von einem mit c-erbB-2 verwandten Antigen fähig ist, zum Beispiel zwei Bindungsstellen, wird eine einzelne, kontinuierliche Kette von Aminosäuren sein, die vier Polypeptid-Domänen hat, wobei jede kovalent durch eine Aminosäure-Linker-Region, zum Beispiel V_H1-Linker-V_L1-Linker-V_H2-Linker-V_L2, verbunden ist. Erfindungsgemäße sFvs können jede Zahl von vollständigen Bindungsstellen (V_Hn-Linker-V_Ln)_n enthalten, wo n > 1 ist, und können so eine einzelne, zusammenhängende Kette von Aminosäuren sein, welche n Antigenbindungsstellen und n × 2 Polypeptid-Domänen hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt das Einzelketten-Fv-Polypeptid CDRs ein, welche im Wesentlichen homolog mit mindestens einem Abschnitt der Aminosäuresequenz von CDRs aus einer variablen Region eines Immunglobulinmoleküls aus einer ersten Spezies sind, und schließt FRs ein, welche im Wesentlichen homolog mit mindestens einem Teil der Aminosäuresequenz von FRs aus der variablen Region von einem Immunglobulinmolekül aus einer zweiten Spezies sind. Bevorzugt ist die erste Spezies die Maus und die zweite Spezies ist der Mensch.
Die Aminosäuresequenz von jeder der Polypeptid-Domänen schließt einen Satz von CDRs ein, welcher zwischen einen Satz von FRs eingeschoben ist. Ein "Satz von CDRs" bezieht sich, wie hier verwendet, auf 3 CDRs in jeder Domäne und ein "Satz von FRs" bezieht sich auf 4 FRs in jeder Domäne. Wegen struktureller Erwägungen kann ein ganzer Satz von CDRs aus einem Immunglobulin verwendet werden, es können aber Substitutionen von bestimmten Resten wünschenswert sein, um die biologische Aktivität zu verbessern, zum Beispiel gründend auf der Beobachtung von konservierten Resten in den CDRs von Immunglobulinarten, welche das mit c-erbB-2 verwandte Antigen binden.
In einem anderen bevorzugten Aspekt der Erfindung haben die CDRs der Polypeptidkette eine Aminosäuresequenz, welche im Wesentlichen homolog mit den CDRs der variablen Region des monoclonalen Antikörpers 741F8 sind.
In einer weiteren Ausführungsform schließt die Polypeptid-Linker-Region die Aminosäuresequenz ein, die im Sequenzprotokoll als Aminosäurerest Nummern 123 bis 137 in SEQ ID NO: 3 und 4 und als Aminosäurereste 1 – 15 in SEQ ID NO: 11 und 12 dargestellt ist. In anderen Ausführungsformen hat die Linker-Sequenz die Aminosäuresequenz, die im Sequenzprotokoll als Aminosäurereste 410 – 424 in SEQ ID NO: 9 und 10 oder als die Aminosäuresequenz der Reste 1 – 15 in SEQ ID NO: 13 und 14 dargestellt ist.
Die einzelne, vorstehend beschriebene Polypeptidkette kann auch eine an sie gebundene, aus der Entfernung nachweisbare Einheit einschließen, um die Abbildung oder Radioimmuntherapie von Tumoren zu erlauben, die ein c-erbB-2- oder ein damit verwandtes Tumor-Antigen tragen. "Aus der Entfernung nachweisbare" Einheit bedeutet, dass die Einheit, welche an das sFv gebunden ist, durch zur Position der Einheit äußerliche und von ihr entfernte Mittel nachgewiesen werden kann. Bevorzugt schließen aus der Entfernung nachweisbare Einheiten zur Abbildung ein radioaktives Atom wie ⁹⁹Technetium (^99mTc), einen Gammastrahler, ein. Bevorzugte Nuklide für die Hochdosis-Radioimmuntherapie schließen radioaktive Atome wie ⁹⁰Yttrium (⁹⁰Yt),¹³¹Jod (¹³¹I) oder ¹¹¹Indium (¹¹¹In) ein.
Zusätzlich kann das sFv ein Fusionsprotein enthalten, welches von einer Fusion von Genen abgeleitet ist, so dass das exprimierte sFv-Fusionsprotein ein Hilfs-Polypeptid einschließt, welches über eine Peptidbindung mit dem Bindungstellen-Polypeptid verbunden ist. In einigen bevorzugten Aspekten hat der Abschnitt des Hilfs-Polypeptides auch eine Bindungsaffinität für ein c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen und kann eine dritte oder sogar eine vierte Polypeptid-Domäne einschließen, wobei jede eine Aminosäuresequenz umfasst, die zwischen FRs eingeschobene CDRs definiert, und welche zusammen eine zweite biosynthetische Einzel-Polypeptidketten-Bindungsstelle ähnlich der vorstehend beschriebenen ersten bilden.
In anderen Aspekten bildet die Hilfs-Polypeptidsequenz ein Toxin, welches mit dem N- oder C-Terminus des sFv verbunden ist, zum Beispiel mindestens ein toxischer Abschnitt des Pseudomonas-Exotoxins, Phytolaccins, Ricins, der Ricin-A-Kette oder des Diphtherie-Toxins oder anderer verwandter Proteine, die als Ricin-A-kettenartige, Ribosomen hemmende Proteine bekannt sind, das heißt Proteine, die fähig sind, die Proteinsynthese auf der Ebene der Ribosomen zu hemmen, wie das antivirale Protein der Kermesbeere, Gelonin und der ribosomale Proteininhibitor aus der Gerste. In noch einem weiteren Aspekt kann das sFv mindestens ein zweites Hilfs-Polypeptid oder eine Einheit, welche die Internalisierung des sFv fördert, einschließen.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung von sFv ein, welches die Schritte der Bereitstellung eines replizierbaren Expressionsvektors, welcher eine DNA-Sequenz, die eine einzelne Polypeptidkette codiert, enthält und exprimiert; der Transfektion des Expressionsvektors in eine Wirtszelle, um eine Transformante herzustellen; und der Züchtung der Transformante zur Produktion des sFv-Polypeptids einschließt.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Abbildung eines Tumors, welcher ein c-erbB-2- oder ein verwandtes Tumorantigen exprimiert, ein. Dieses Verfahren schließt die Schritte der Bereitstellung eines bildgebenden Stoffes, welcher ein wie vorstehend beschriebenes Einzelketten-Fv-Polypeptid einschließt, und eine daran gebundene, aus der Entfernung nachweisbare Einheit; der Verabreichung des bildgebenden Stoffes in einer Menge des bildgebenden Stoffes mit einem physiologisch verträglichen Träger, die ausreicht, um einen extrakorporalen Nachweis des Tumors zu erlauben, an einen den Tumor beherbergenden Organismus; und des Nachweises der Position der Einheit im Individuum nach Zulassung der Bindung des Stoffes an den Tumor und der ausreichenden Ausscheidung des ungebundenen Stoffes, um die Sichtbarmachung des Tumorbildes zu erlauben, ein.
Die Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Behandlung von Krebs durch Hemmung des in vivo-Wachstums eines Tumors, der ein c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen exprimiert, ein, wobei das Verfahren die Verabreichung einer den Tumor hemmenden Menge eines therapeutischen Wirkstoffes, welcher ein erfindungsgemäßes sFv und mindestens eine erste Einheit einschließt, die daran durch eine Peptidbindung gebunden ist und welche die Fähigkeit hat, die Vermehrung einer Tumorzelle zu begrenzen, an einen Krebs-Patienten einschließt.
Bevorzugt schließt die erste Einheit ein Toxin oder ein toxisches Fragment davon ein, zum Beispiel Ricin A; oder sie schließt ein Radioisotop, welches ausreichend radioaktiv ist, um die Vermehrung der Tumorzelle zu hemmen, ein, zum Beispiel ⁹⁰Yt, ¹¹¹In oder ¹³¹I. Der therapeutische Wirkstoff kann weiterhin mindestens eine zweite Einheit einschließen, die seine Wirksamkeit verbessert.
Die klinische Verabreichung des Einzelketten-Fv oder angemessener, erfindungsgemäßer sFv-Fusionsproteine, welche die Aktivität von nativen, relativ kleinen Fv des entsprechenden Immunglobulins zeigen, bietet eine Vielzahl von Vorteilen gegenüber der Verwendung von größeren Fragmenten oder ganzen Antikörpermolekülen. Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Fv- und sFv-Fusionsproteine bieten zirkulierenden proteolytischen Enzymen weniger Spaltstellen und bieten somit eine größere Stabilität. Sie erreichen ihr Zielgewebe schneller und werden schneller aus dem Körper ausgeschieden, was sie zu idealen bildgebenden Stoffen zum Nachweis von Tumoren und idealen radioimmuntherapeutischen Stoffen zur Abtötung von Tumoren macht. Sie haben auch im Vergleich zu murinen Immunglobulinen eine verringerte unspezifische Bindung und Immunogenität. Zusätzlich erleichtert ihre Expression durch einzelne Gene Anwendungen mit Zielfindung durch Fusion an andere Toxin-Proteine oder Peptidsequenzen, welche die spezifische Kopplung an andere Moleküle oder Arzneistoffe erlauben. Zudem haben einige erfindungsgemäße sFv-Analoga oder Fusionsproteine die Fähigkeit die Internalisierung von c-erbB-2 oder verwandten Antigenen, die auf der Oberfläche von Tumorzellen exprimiert werden, zu fördern, wenn sie zusammen auf der Zelloberfläche gebunden sind. Diese Verfahren erlauben die selektive Tötung von Zellen, die solche Antigene exprimieren, mit einer Einzelketten-Fv-Toxin-Fusion geeigneten Aufbaus. Erfindungsgemäße sFv-Toxin-Fusionsproteine besitzen eine 15 – 200-fach größere Aktivität bei der Tötung von Tumorzellen als Konjugate, welche ein Toxin einschließen, dass chemisch mit einem ganzen Antikörper oder einem Fab vernetzt ist.
Übermäßige Expression von c-erbB-2 oder verwandten Rezeptoren auf bösartigen Zellen erlaubt somit die zielgerichtete Lenkung von sFv-Arten auf die Tumorzellen hin, gleich ob der Tumor gut lokalisiert oder metastasiert ist. In den vorstehenden Fällen erlaubt die Internalisierung von sFv-Toxin-Fusionsproteinen die spezifische Zerstörung von Tumorzellen, welche das übermäßig exprimierte c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen tragen. In anderen Fällen, abhängig von den infizierten Zellen, der Art der bösartigen Erkrankung oder anderen Faktoren, die in einem gegebenen Individuum wirken, können das gleiche c-erbB-2 oder verwandte Rezeptoren nur schlecht internalisiert werden oder sogar eine statische Tumorantigen-Population darstellen. In diesem Fall können das Einzelketten-Fv und seine Fusionsproteine auch nutzbringend, jedoch in einer anderen Weise als dies bei der Internalisierung anwendbar ist, verwendet werden. Wo c-erbB-2-Rezeptor/sFv- oder sFv-Fusionsprotein-Komplexe schlecht internalisiert werden, sind Toxine wie die Ricin-A-Kette, welche cytoplasmatisch durch die Inaktivierung von Ribosomen wirkt, bei der Tötung von Zellen nicht effektiv. Nichtsdestotrotz ist das unfusionierte Einzelketten-Fv nützlich, zum Beispiel zur Abbildung oder Radioimmuntherapie und bispezifische Einzelketten-Fv-Fusionsproteine verschiedenen Aufbaus, das heißt, solche, die zwei gesonderte Bindungsstellen auf der gleichen Polypeptidkette haben, können dazu verwendet werden, eine zielgerichtete Lenkung mittels der zwei Antigene, für die das Molekül spezifisch ist, durchzuführen. Zum Beispiel kann ein bispezifischer Einzelketten-Antikörper eine Spezifität für sowohl das c-erbB-2- als auch das CD3-Antigen haben, wobei das letztere von beiden auf cytotoxischen Lymphocyten (CTLs) vorliegt. Dieses bispezifische Molekül könnte so Antikörper-abhängige, zelluläre Cytotoxizität (ADCC) vermitteln, die eine durch CTL ausgelöste Lyse der Tumorzellen ergibt. Ähnliche Ergebnisse könnten durch Verwendung eines bispezifischen Einzelketten-Fv, der spezifisch für c-erbB-2 und den Fcγ-Rezeptor Typ I oder II ist, erhalten werden. Andere bispezifische sFv-Formulierungen schließen Domänen mit c-erbB-2-Spezifität, gepaart mit einer Wachstumsfaktor-Domäne ein, welche für Hormone oder Wachstumsfaktorrezeptoren wie die Rezeptoren für Transferrin oder den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) spezifisch ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorangehenden und andere Aufgaben dieser Erfindung, deren verschiedene Eigenschaften sowie die Erfindung selbst können durch die folgende Beschreibung vollständiger verstanden werden, wenn diese zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
1A ist eine schematische Zeichnung eines DNA-Konstruktes, das ein erfindungsgemäßes sFv codiert, welche die V_H- und V_L-codierenden Domänen und die Linker-Region zeigt; 1B ist eine schematische Zeichnung der Struktur von Fv, welche V_H- und V_L-Domänen, von denen jede drei Komplemetaritäts-bestimmende Regionen (CDRs) und vier Framework-Regionen (FRs) umfasst, für den monoclonalen 520C9 darstellt, einen gut bekannten und charakterisierten monoclonalen murinen Antikörper, der spezifisch für c-erbB-2 ist.
2A – 2E sind schematische Darstellungen von erfindungsgemäßen Ausführungsformen, von denen jede ein biosynthetisches Einzelketten-Fv-Polypeptid umfasst, welches ein mit c-erbB-2 verwandtes Antigen erkennt: 2A ist ein sFv, welches eine anhängende Leader-Sequenz hat, 2B ist ein sFv-Toxin (oder ein anderes Hilfsprotein)-Konstrukt und 2C ist ein bivalentes oder bispezifisches sFv-Konstrukt; 2D ist ein bivalentes sFv, welches ein anhängendes Protein hat, das an das Carboxy-terminale Ende angehängt ist; 2E ist ein bivalentes sFv, welches anhängende Proteine, die sowohl am Amino- als auch am Carboxy-terminalen Ende angehängt sind, hat.
3 ist eine Darstellung der Konstruktion eines Plasmids, welches das 520C9-sFv-Ricin A-Immuntoxin-Fusionsgen codiert, als Diagramm; und
4 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse eines Kompetitionsversuchs, der die c-erbB-2-Bindungsaktivität des monoclonalen 520C9-Antikörpers (spezifisch für c-erbB-2), eines Fab-Fragmentes dieses monoclonalen Antikörpers (gefüllte Punkte) und von verschiedenen, affinitätsgereinigten Fraktionen der Einzelketten-Fv-Bindungsstelle für c-erbB-2, die aus den variablen Regionen des monoclonalen 520C9-Antikörpers konstruiert ist (gesamte sFv- Probe (+), sFv gebunden und eluiert von einer Säule aus der immobilisierten, extrazellulären Domäne von c-erbB-2 (Quadrate) und Durchlauf von sFv (ungebunden, *)) miteinander vergleicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es werden Einzelketten-Fvs und sFv-Fusionsproteine offenbart, die eine Affinität für ein mit c-erbB-2 verwandtes Antigen haben, welches hochgradig auf Brust- und Eierstockkrebszellen und genauso auf anderen Tumorzellen in bestimmten anderen Krebsformen exprimiert wird. Die Polypeptide sind durch eine oder mehrere Sequenzen von Aminosäuren charakterisiert, die eine Region bilden, welche als eine biosynthetische Antikörperbindungsstelle fungiert. Wie in 1 gezeigt, umfassen die Stellen Einzelketten aus der variablen Region der schweren Kette (V_H) 10 und der variablen Region der leichten Ketten (V_L) 14, worin V_H 10 und V_L 14 durch den Polypeptid-Linker 12 verbunden sind. Die Bindungsdomänen schließen die CDRs 2, 4, 6 und 2', 4', 6' von Immunglobulinmolekülen, die fähig sind ein mit c-erbB-2 verwandtes Tumorantigen zu binden, verbunden mit FRs 32, 34, 36, 38 und 32', 34', 36', 38', welche aus einem gesonderten Immunglobulin abgeleitet sein können, ein. Wie in 2A, 2B und 2C gezeigt, können die BABS-Einzelpolypeptidketten (V_H 10, V_L 14 und Linker 12) auch aus der Entfernung nachweisbare Einheiten und/oder andere Polypeptidsequenzen 16, 18 oder 22 einschließen, welche zum Beispiel als ein Enzym, ein Toxin, eine Bindungsstelle oder eine Stelle zur Bindung an eine immobilisierende Matrix oder ein radioaktives Atom fungieren. Es werden ebenfalls Verfahren zur Herstellung der Proteine und Verfahren zu ihrer Verwendung offenbart.
Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Fv-Polypeptide sind in dem Sinne biosynthetisch, als sie in einem zellulären Wirt synthetisiert und recloniert werden, der dazu gebracht wird, ein Protein zu exprimieren, das von einem Plasmid codiert wird, welches eine genetische Sequenz einschließt, die teilweise auf synthetischer DNA basiert, das ist, eine rekombinante DNA, die durch Ligierung von mehreren, chemisch synthetisierten und reclonierten Oligonucleotiden oder durch Ligierung von Fragmenten von DNA, welche aus dem Genom eines Hybridoms, reifen B-Zell-Clons oder einer cDNA-Genbank, abgeleitet aus solchen natürlichen Quellen, stammt, hergestellt wurde. Die erfindungsgemäßen Proteine sind insofern korrekt als "Antikörperbindungsstellen" charakterisiert, als diese synthetischen Einzelpolypeptidketten fähig sind, sich in eine 3-dimensionale Konformation zurückzufalten, die spezifisch dafür ausgelegt ist, eine Affinität für ein vorher ausgewähltes c-erbB-2- oder damit verwandtes Tumorantigen zu haben. Einzelketten-Fvs können, wie in der PCT-Anmeldung US88/01737 beschrieben, welche der USSN 342,449, eingereicht am 6.
Februar 1989 entspricht und Priorität aus der USSN 052,800, eingereicht am 21. Mai 1987, an Creative BioMolecules, Inc. übertragen, beansprucht, hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen, produziert werden. Die erfindungsgemäßen Polypeptide sind insofern Antikörper-artig, als ihre Struktur gemäß Regionen nativer Antikörpern geprägt ist, die dafür bekannt sind, für die Erkennung von mit c-erbB-2 verwandtem Antigen verantwortlich zu sein.
Noch spezifischer gesagt, ist die Struktur von diesen biosynthetischen Antikörper-Bindungsstellen (BABS) in der Region, welche dem Protein die Bindungseigenschaften verleiht, analog zu der Fv-Region eines natürlichen Antikörpers gegen ein c-erbB-2- oder ein damit verwandtes Antigen. Sie schließt eine Folge von Regionen ein, die aus Aminosäuren besteht, welche mindestens drei Polypeptidabschnitte definieren, welche zusammen die molekulare Tertiärstruktur bilden, die verantwortlich für die Affinität und Bindung ist. Die CDRs werden durch Polypeptidabschnitte in geeigneter Konformation gehalten, die analog zu den Framework-Regionen des Fv-Fragments natürlicher Antikörper sind.
Die CDR- und FR-Polypeptidabschnitte werden empirisch, basierend auf der Sequenzanalyse der Fv-Region von bereits existierenden Antikörpern, wie die in dem US-Patent Nr. 4,753,894, hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen, beschriebenen oder der DNA, die solche Antikörpermoleküle codiert, entworfen.
In einer Ausführungsform sind die Aminosäuresequenzen, welche die FRs der Einzelpolypeptidketten bilden, analog zu den FR-Sequenzen eines ersten, bereits existierenden Antikörpers, zum Beispiel eines menschlichen IgG. Die Aminosäuresequenzen, welche die CDRs bilden, sind analog zu den Sequenzen eines zweiten, unterschiedlichen, bereits existierenden Antikörpers, zum Beispiel den CDRs eines IgG aus einem Nagetier oder Menschen, welches c-erbB-2 oder damit verwandte Antigene, welche auf der Oberfläche von Eierstock- oder Brust-Tumorzellen exprimiert werden, erkennt. Alternativ können die CDRs und FRs in ihrer Gesamtheit aus einem einzelnen bereits existierenden Antikörper aus einer Zelllinie, welche instabil oder schwierig zu züchten sein kann, zum Beispiel einer ein sFv herstellenden Zelllinie, die auf einer einen murinen monoclonalen Antikörper, einen Antikörper aus Maus/Mensch oder Mensch produzierenden Zelllinie basiert, kopiert werden.
Die Anwendung der Erfindung ermöglicht den Entwurf und die Biosyn these von verschiedenen Stoffen, welche alle durch eine Region charakterisiert sind, die eine Affinität für ein vorher ausgewähltes c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen hat. Andere Regionen des biosynthetischen Proteins werden unter Berücksichtigung des speziellen, geplanten Nutzens des Proteins entworfen. Wenn der Stoff für die intravaskuläre Anwendung in Säugern entworfen wird, können somit die FRs Aminosäuresequenzen einschließen, die mindestens einem Teil der FR-Aminosäuren eines Antikörpers, der dieser Säugerart eigen ist, ähnlich oder dazu identisch sind. Andererseits können die Aminosäuresequenzen, welche die CDRs einschließen, analog zu einem Teil der Aminosäuresequenzen aus der hypervariablen Region (und bestimmten flankierenden Aminosäuren) eines Antikörpers sein, welcher eine bekannte Affinität und Spezifität für ein c-erbB-2- oder ein damit verwandtes Antigen hat und der zum Beispiel aus einer Maus oder einer Ratte oder einem bestimmten menschlichen Antikörper oder Immunglobulin stammt.
Andere Abschnitte nativer Immunglobulin-Proteinstruktur, zum Beispiel C_H und C_L, müssen nicht vorhanden sein und werden normaler Weise absichtlich bei den erfindungsgemäßen, biosynthetischen Proteinen weggelassen. Die erfindungsgemäßen Einzelpoylpeptidketten können jedoch zusätzliche Polypeptid-Regionen einschließen, die eine Leader-Sequenz oder eine zweite Polypeptidkette, die bioaktiv ist, zum Beispiel ein Cytokin, ein Toxin, einen Liganden, ein Hormon, Immunglobulindomäne(n) oder Enzyme oder eine Stelle, an die ein Toxin, ein Arzneistoff oder eine aus der Entfernung nachweisbare Einheit, zum Beispiel ein Radionuklid, gebunden werden kann, definieren.
Ein nützliches Toxin ist Ricin, ein Enzym aus dem Rizinusstrauch, das in hohem Maße toxisch ist, oder der Teil des Ricins, der Toxizität verleiht. Bei so niedrigen Konzentrationen wie 1 ng/ml hemmt Ricin effizient das Wachstum von Zellen in Kultur. Die Ricin-A-Kette hat ein Molekulargewicht von etwa 30000 und ist glycosyliert. Die Ricin-B-Kette hat eine größere Größe (ein Molekulargewicht von etwa 34000) und ist auch glycosyliert. Die B-Kette enthält zwei Galactose-Bindungsstellen, eine in jeder der zwei Domänen in der gefalteten Untereinheit. Die kristallographische Struktur von Ricin zeigt die Zeichnung des Rückgrats der A-Kette. Dort ist eine Spalte, welche wahrscheinlich das aktive Zentrum ist, das diagonal über dem Molekül verläuft. Es liegt auch eine Mischung von α-Helix, β-Strukturen und irregulären Strukturen im Molekül vor.
Die A-Kette inaktiviert enzymatisch die ribosomale 60S-Untereinheit eukaryontischer Ribosomen. Die B-Kette bindet an Galactose-basierte Kohlenhydratreste auf den Oberflächen von Zellen. Sie scheint notwendig zu sein, um das Toxin an die Zelloberfläche zu binden, und ermöglicht auch den Mechanismus des Eintritts des Toxins in die Zelle und ist an ihm beteiligt. Weil alle Zellen Galactose enthaltende Zelloberflächen-Rezeptoren haben, hemmt Ricin alle Arten von Säugerzellen mit einer annähernd gleichen Effizienz.
Die Ricin-A-Kette und die Ricin-B-Kette werden durch ein Gen codiert, das sowohl die A- als auch die B-Kette spezifiziert. Das von der von dem Gen transkribierten mRNA synthetisierte Polypeptid enthält Sequenzen der A-Kette, die durch ein "J" (für joining" – verbindend)-Peptid mit den Sequenzen der B-Kette verbunden sind. Das J-Peptid-Fragment wird durch posttranslationale Modifikation entfernt, um die A- und B-Ketten freizusetzen. Die A- und B-Ketten werden jedoch immer noch durch die zwischen den Ketten liegende Disulfidbindung zusammengehalten. Die bevorzugte Form des Ricins ist die rekombinante A-Kette, da diese vollkommen frei von B-Kette ist und, wenn in E. coli exprimiert, nicht glycosyliert ist und somit langsamer aus dem Blut ausgeschieden wird als die glycosylierte Form. Die spezifische Aktivität der rekombinanten Ricin-A-Kette gegen Ribosomen und die der nativen A-Kette, die aus Rizinusstrauch-Ricin isoliert ist, sind gleichwertig. Eine Aminosäuresequenz und eine entsprechende Nucleinsäuresequenz der Ricin-A-Kette ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 7 und 8 dargestellt.
Die rekombinante Ricin-A-Kette, die aus Pflanzen gewonnene Ricin-A-Kette, die deglycosylierte Ricin-A-Kette oder deren Abkömmlinge können mittels des erfindungsgemäßen Einzelketten-Fv-Polypeptids zielgerichtet auf eine Zelle gelenkt werden, die ein c-erbB-2- oder ein verwandtes Antigen exprimiert. Um dies zu tun, kann das sFv chemisch mit der Ricin-A-Kette oder einem aktiven Analogon davon vernetzt werden oder in einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Einzelketten-Fv-Ricin-A-Ketten-Immuntoxin durch Fusionierung des Einzelketten-Fv-Polypeptids an eine oder mehrere Ricin-A-Ketten durch die entsprechende Fusion der Gene gebildet werden. Durch Ersatz der B-Kette des Ricins mit einer Antikörper-Bindungsstelle gegen c-erbB-2 oder verwandte Antigene, wird die A-Kette zu solchen Antigenen auf der Zelloberfläche geführt. In dieser Weise kann die selektive Tötung von Tumorzellen, die diese Antigene exprimieren, erreicht werden. Diese Selektivität wurde in vielen Fällen gegenüber in Kultur gezüchteten Zellen gezeigt. Sie hängt von der Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigenen auf der Oberfläche der Zellen, gegen die das Immuntoxin gerichtet ist, ab.
Die Erfindung schließt die Verwendung von humanisierten Einzelketten-Fv-Bindungsstellen als Teil von Bildgebungsverfahren und Tumortherapien ein. Die Proteine können durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Wirksame Dosierungen für die Einzelketten-Fv-Konstrukte bei anti-Tumor-Therapien oder bei effektiver Darstellung von Tumoren können durch Routineexperimente unter Berücksichtigung der Zielsetzung der Behandlung bestimmt werden.
Die für die injizierbare Anwendung geeigneten pharmazeutischen Formulierungen schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Formulierung steril sein und sie muss flüssig sein, um einfach mit einer Spritze verabreichbar zu sein. Sie muss unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen geschützt sein. Dies kann zum Beispiel durch Filtration durch einen sterilen 0,22 Mikron-Filter und/oder Lyophilisierung, gefolgt von einer Sterilisierung mit einer Gammastrahlenquelle, erreicht werden.
Sterile, injizierbare Lösungen werden durch Aufnahme des erfindungsgemäßen Einzelkettenkonstruktes in der benötigten Menge in dem geeigneten Lösemittel wie Natriumphosphat-gepufferter Kochsalzlösung, gefolgt von einer Sterilfiltration hergestellt. Wie hier verwendet, schließt "ein physiologisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösemittel, Dispersionsmittel, antibakterielle und gegen Pilze gerichtete Wirkstoffe, die für den Menschen ungiftig sind, und ähnliches ein. Die Verwendung solcher Mittel und Wirkstoffe bei pharmazeutisch aktiven Stoffen ist im Fachgebiet gut bekannt. Das Mittel oder der Wirkstoff muss mit der Erhaltung der richtigen Konformation der Einzelpolypeptidketten und mit einer Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen vereinbar sein. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können den Zusammensetzungen ebenfalls zugesetzt werden.
Ein bispezifisches Einzelketten-Fv könnte auch an ein Toxin fusioniert werden. Zum Beispiel wäre ein bispezifisches sFv-Konstrukt mit Spezifität für c-erbB-2 und den Transferrin-Rezeptor, einer Zielstruktur, die schnell internalisiert wird, aufgrund der Internalisierung des Transferrin-Rezeptor/sFv-Toxin-Komplexes ein effektiver cytolytischer Wirkstoff. Ein sFv-Fusionsprotein kann auch mehrere Protein- Domänen auf der gleichen Poylpeptid-Kette einschließen, zum Beispiel EGF-sFv-Ricin A, wobei die EGF-Domäne die Internalisierung von Toxin bei Bindung des sFv durch Wechselwirkung mit dem EGF-Rezeptor fördert.
Die erfindungsgemäßen Einzel-Polypeptidketten können mit Radioisotopen wie zum Beispiel Jod-131, Indium-111 und Technetium-99m markiert werden. Beta-Strahler wie Technetium-99m und Indium-111 sind bevorzugt, weil sie mit einer Gammakamera nachweisbar sind und für die Bildgebung in vivo vorteilhafte Halbwertszeiten haben. Die Einzel-Polypeptidketten können zum Beispiel mit radioaktiven Atomen und wie bei Yttrium-90, Technetium-99m oder Indium-111 über einen konjugierten Metall-Chelator (siehe zum Beispiel, Khaw et al., Science, 209 (1980), 295; Gansow et al., US-Patent Nr. 4,472,509; Hnatowich, US-Patent Nr. 4,479,930) oder durch andere, dem Fachmann bekannte Standardverfahren der Isotop-Bindung an Proteine markiert werden.
Die Erfindung stellt somit intakte Bindungsstellen für c-erbB-2 oder damit verwandte Antigene bereit, die analog zu V_H-V_L-Dimeren sind und die über eine Polypeptidsequenz verbunden sind, um ein zusammengesetztes (V_H-Linker-V_L)_n- oder V_L-Linker-V_H)_n-Polypeptid zu erzeugen, wobei n gleich oder größer als 1 ist, welches im Wesentlichen frei vom Rest des Antikörpermoleküls sind und welches eine nachweisbare Einheit oder eine dritte Polypeptidsequenz, die entweder an V_H oder V_L gebunden ist, einschließen kann.
2A – 2E veranschaulichen Beispiele von Proteinstrukturen, die Ausführungsformen der Erfindung sind und durch Befolgen der hier offenbarten Lehre hergestellt werden können. Alle sind durch mindestens ein biosynthetisches sFv-Einzelkettensegment, welches eine Bindungsstelle definiert, und durch das Enthalten von Aminosäuresequenzen, die CDRs oder FRs einschließen, oft aus verschiedenen Immunglobulinen abgeleitet, oder durch Sequenzen, die zu einem Abschnitt von CDRs und FRs aus verschiedenen Immunglobulinen homolog sind, charakterisiert.
2A stellt die Einzel-Polypeptidkette sFv 100 dar, welche Polypeptid 10 umfasst, das eine Aminosäuresequenz hat, die analog zu der variablen Region der schweren Kette (V_H) eines gegebenen monoclonalen anti-c-erbB-2 Antikörpers ist, das durch sein carboxy-terminates Ende an den Polypeptid-Linker 12 gebunden ist, welcher seinerseits an das Polypetid 14 gebunden ist, welches eine Aminosäuresequenz hat, die analog zu der variablen Region der leichten Kette (V_L) des anti-c- erbB-2 monoclonalen Antikörpers ist. Selbstverständlich können die Domänen der leichten und schweren Kette in umgekehrter Anordnung vorliegen. Der Linker 12 sollte mindestens lang genug sein (zum Beispiel etwa 10 bis 15 Aminosäuren oder etwa 40 Angström), um es den Ketten 10 und 14 zu erlauben, ihre richtige Konformation und Wechselbeziehung zwischen den Domänen anzunehmen.
Der Linker 12 kann eine Aminosäuresequenz einschließen, die zu einer von der Art, in die sie eingebracht werden soll, als "Selbst" erkannten Sequenz homolog ist, wenn eine Verwendung als Arzneimittel beabsichtigt ist. Hydrophile Aminosäuresequenzen ohne Struktur sind bevorzugt. Solche Linker-Sequenzen werden im Sequenzprotokoll als Aminosäurereste der Nummern 116 bis 135 in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellt, welche einen Teil der Linker-Sequenzen von 15 Aminosäuren einschließen, die im Sequenzprotokoll in SEQ ID NO: 12 und 14 dargestellt sind.
Andere Proteine oder Polypeptide können entweder an den Amino- oder Carboxy-Terminus des Proteins in der Art, wie sie in 2A veranschaulicht ist, angehängt werden. Als Beispiel wird die Leader-Sequenz 16, die vom amino-terminalen Ende der V_H-Domäne 10 ausgeht, gezeigt.
2B stellt eine andere Art des Stoffes 200 dar, welcher eine Einzel-Polypeptidkette 100 und ein anhängendes Protein 18 einschließt. An das Carboxyl-Ende der Polypeptidkette 100 (welche die FR- und CDR-Sequenzen einschließt, die eine Immunglobulin-Bindungsstelle bilden) ist ein anhängendes Protein 18 gebunden, welches aus zum Beispiel einem Toxin oder einem toxischen Fragment desselben, einem bindenden Protein, einem Enzym oder aktiven Enzym-Fragment oder einer Stelle zur Bindung für einen bildgebenden Stoff (zum Beispiel, um mit einem radioaktiven Ion wie Indium-111 ein Chelat zu bilden) besteht.
2C veranschaulicht das Einzelketten-Polypeptid 300, welches das zweite, erfindungsgemäße Einzelketten-Polypeptid 110 einschließt, das die gleiche oder eine andere Spezifität hat und über den Peptid-Linker 22 mit der ersten Einzel-Polypeptidkette 100 verbunden ist.
2D veranschaulicht das Einzelketten-Poylpeptid 400, welches die Einzel-Polypeptidketten 110 und 100, die durch den Linker 22 miteinander verbunden sind, und das anhängende Protein 18 einschließt, welches an das Carboxyl-Ende der Kette 110 gebunden ist.
2E veranschaulicht die Einzel-Polypeptidkette 500, welche die Kette 400 der 2D und das anhängende Protein 20 (EGF), welches an den Amino-Terminus der Kette 400 gebunden ist, einschließt.
Wie aus den 2A – 2E hervorgeht, können die erfindungsgemäßen Einzelketten-Proteine durch das Einschließen mehrerer biosynthetischer Bindungsstellen Perlen auf einer Kette ähnlich sehen, wobei jede Bindungsstelle eine einzigartige Spezifität oder wiederholte Stellen der gleichen Spezifität hat, die die Avidität des Proteins steigern. Wie dies aus dem vorstehenden belegt ist, stellt die Erfindung eine große Familie von Stoffen bereit, die Proteine umfasst, von denen mindestens ein Abschnitt eine Bindungsstelle definiert, die gemäß der variablen Region oder Regionen von Immunglobulinen gegen c-erbB-2 oder damit verwandten Antigenen gemustert ist.
Die erfindungsgemäßen Einzelketten-Polypeptide werden auf der DNA-Ebene entworfen. Die synthetischen DNAs werden dann in einem geeigneten Wirtssystem exprimiert und die exprimierten Proteine gesammelt und falls nötig renaturiert.
Die Fähigkeit, die erfindungsgemäßen Einzelpolypeptidketten zu entwerfen, hängt von der Fähigkeit ab, interessierende monoclonale Antikörper zu identifizieren und dann die Sequenz der Aminosäuren in der variablen Region dieser Antikörper oder der diese codierenden DNA zu bestimmen. Die Hybridom-Technologie ermöglicht die Herstellung von Zelllinien, die Antikörper gegen im Grunde jede erwünschte Substanz sezernieren, die eine Immunantwort auslöst. Zum Beispiel beschreibt das US-Patent Nr. 4,753,894 einige monoclonale Antikörper von Interesse, welche mit c-erbB-2 verwandte Antigene auf Brustkrebs-Zellen erkennen, und erklärt, wie solche Antikörper gewonnen wurden. Ein monoclonaler Antikörper, der für diesen Zweck besonders nützlich ist, ist 520C9 (Bjorn et al., Cancer Res. 45 (1985), 124-1221; US-Patent Nr. 4,753,894). Dieser Antikörper erkennt spezifisch das c-erbB-2-Antigen, welches auf der Oberfläche von verschiedenen Tumor-Zelllinien exprimiert wird, und zeigt sehr wenig Bindung an normale Gewebe. Alternative Quellen für sFv-Sequenzen mit der gewünschten Spezifität können den Vorteil von Phagen-Antikörper- und kombinatorischen Genbank-Methoden nutzen. Solche Sequenzen würden auf der cDNA von Mäusen basieren, welche mit Tumorzellmembranen oder c-erbB-2 oder mit c-erbB-2 verwandten Antigenfragmenten oder Peptiden präimmunisiert wur den (siehe zum Beispiel Clackson et al., Nature 352 (1991), 624 – 628).
Das Verfahren des Entwurfs von DNA, welche die interessierende Einzel-Polypeptidkette codiert, kann wie folgt bewerkstelligt werden. Die leichten und schweren Ketten des gewünschten Immunglobulins codierende RNA kann aus dem Cytoplasma des Hybridoms gewonnen werden, welches das Immunglobulin herstellt. Die mRNA kann dazu verwendet werden, die cDNA für die nachfolgende Isolierung der V_H- und V_L-Gene durch im Fachgebiet bekannte PCR-Verfahrensweisen herzustellen (Sambrook et al., Hrsg., Molecular Cloning (1989), Cold Spring Harbor Laboratories Press, NY). Die N-terminale Aminosäuresequenz der H- und L-Kette kann unabhängig durch automatisierte Edman-Sequenzierung bestimmt werden; wenn nötig, können weitere Bereiche der CDRs und flankierender FRs durch Aminosäure-Sequenzierung der V-Region-Fragmente der H- und L-Ketten bestimmt werden. Eine solche Sequenzanalyse wird nun routinemäßig durchgeführt. Dieses Wissen erlaubt einem synthetische Primer zur Isolierung von V_H- und V_L-Genen aus Hybridom-Zellen, die monoclonale Antikörper herstellen, von denen bekannt ist, dass sie c-erbB-2 oder ein damit verwandtes Antigen binden, zu entwerfen. Diese V-Gene werden die Fv-Region codieren, die im parentalen Antikörper c-erbB-2 bindet.
Noch ein anderer Ansatz schließt den Entwurf und die Konstruktion von synthetischen V-Genen ein, die eine Fv-Bindungsstelle codieren werden, die spezifisch für c-erbB-2 oder verwandte Rezeptoren ist. Zum Beispiel kann man mit Hilfe eines Computerprogramms wie zum Beispiel Compugene und bekannten DNA-Sequenzen von variablen Regionen native oder annähernd native FR-Sequenzen eines ersten Antikörper-Moleküls und CDR-Sequenzen eines zweiten Antikörper-Moleküls entwerfen und direkt synthetisieren. Die vorstehend beschriebenen V_H- und V_L-Sequenzen sind miteinander durch eine Aminosäurekette oder einen Linker direkt verbunden, der den C-Terminus einer Kette mit dem N-Terminus der anderen verbindet.
Diese Gene können, einmal synthetisiert, mit oder ohne zusätzliche DNA-Sequenzen, die zum Beispiel ein Leader-Peptid codieren, welches die Sekretion oder intrazelluläre Stabilität eines Fusionspolypeptids fördert, oder eine Leader- oder nachfolgende Sequenz, die ein zweites Polypeptid codiert, cloniert werden. Die Gene können dann direkt in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden.
Durch direkte Sequenzierung eines Antikörpers gegen ein c-erbB-2- oder ein damit verwandtes Antigen oder durch Bezug der Sequenz aus der Literatur kann der Durchschnittsfachmann angesichts dieser Offenbarung einen Einzelketten-Fv herstellen, der jede gewünschte CDR und FR umfasst. Zum Beispiel kann unter Verwendung der DNA-Sequenz für den monoclonalen Antikörper 520C9, dargestellt im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3, ein Einzelketten-Polypeptid hergestellt werden, das eine Bindungsaffinität für ein mit c-erbB-2 verwandtes Antigen hat. Exprimierte Sequenzen können auf Bindung getestet werden und empirisch durch den Austausch ausgewählter Aminosäuren in vergleichsweise konservierten Regionen basierend auf Beobachtungen von Tendenzen in Aminosäuresequenzdaten und/oder Computermodell-Techniken verbessert werden. Eine ausgeprägte Flexibilität im Entwurf von V_H und V_L ist möglich, weil Änderungen in der Aminosäuresequenz auf der DNA-Ebene durchgeführt werden können.
Dementsprechend kann der Zusammenbau von DNAs, welche die erfindungsgemäßen Einzelketten-Fv und sFv-Fusionsproteine codieren, unter Verwendung bekannter Verfahren, welche die Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzymen, welche sequenzspezifische Spaltungen in der DNA bewirken, um glatte Enden oder kohäsive Enden zu erzeugen, von DNA-Ligasen, Techniken, welche die enzymatische Auffüllung von klebrigen Enden zu DNA mit glatten Enden ermöglichen, des Zusammenbaus von synthetischen DNAs durch Verbindung von Oligonucleotiden kurzer oder mittlerer Länge, von Verfahren der cDNA-Synthese und synthetischen Sonden zur Isolierung von Immunglobulin-Genen einschließen, durchgeführt werden. Verschiedene Promotor-Sequenzen und andere regulatorische RNA-Sequenzen, die zur Erreichung der Expression verwendet werden, und verschiedene Arten von Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und verfügbar. Herkömmliche Transfektionsverfahren und genauso herkömmliche Verfahren zur Clonierung und Subclonierung von DNA sind für die Umsetzung dieser Erfindung nützlich und dem Durchschnittsfachmann bekannt. Verschiedene Arten von Vektoren wie Plasmide und Viren, einschließlich tierspezifischer Viren und Bakteriophagen, können verwendet werden. Die Vektoren können verschiedene Markierungs-Gene nutzen, welche einer erfolgreich transfizierten Zelle eine nachweisbare phänotypische Eigenschaft verleihen, die dazu verwendet werden kann, festzustellen, welcher aus einer Familie von Clonen die rekombinante DNA des Vektors erfolgreich eingebaut hat.
Natürlich sind die Verfahren zur Manipulierung, Vervielfältigung und Rekombinierung von DNA, welche interessierende Aminosäuresequenzen codiert, im Allgemeinen im Fachgebiet wohl bekannt und deshalb hier nicht im Detail beschrieben. Verfahren zur Identifizierung der isolierten V-Gene, die interessierende Antikörper-Fv-Regionen codieren, sind gut verstanden und in der Patentliteratur und anderer Literatur beschrieben. Im Allgemeinen schließen die Verfahren die Auswahl von genetischem Material ein, das entsprechend dem genetischen Code bei reverser Transkription Aminosäuresequenzen codiert, welche die interessierenden CDRs und FRs definieren.
Ein Verfahren zur Gewinnung von das hier offenbarte Einzelketten-Fv codierender DNA erfolgt durch den Zusammenbau von synthetischen Oligonucleotiden, die in einem herkömmlichen, automatisierten Polynucleotid-Synthesegerät hergestellt wurden, gefolgt von der Ligierung mit geeigneten Ligasen. Zum Beispiel können überlappende, complementäre DNA-Fragmente, die 15 Basen umfassen, halbmanuell unter Verwendung einer Phosphoramidit-Chemie synthetisiert werden, wobei die Endabschnitte nicht-phosphoryliert belassen werden, um eine Polymerisierung während der Ligierung zu verhindern. Ein Ende der synthetischen DNA wird mit einem "klebrigen Ende" belassen, welches der Wirkungsstelle einer bestimmten Restriktionsendonuclease entspricht, und das andere Ende wird mit einem Ende belassen, welches der Wirkungsstelle einer anderen Restriktionsendonuclease entspricht. Alternativ kann dieser Ansatz voll automatisiert werden. Die das Einzelketten-Polypeptid codierende DNA kann durch Synthetisierung längerer Einzelstrang-Fragmente (zum Beispiel 50 – 100 Nucleotide lang) in zum Beispiel einem Biosearch-Oligonucleotid-Synthesegerät und nachfolgender Ligierung der Fragmente erzeugt werden.
Zusätzliche Nucleotidsequenzen, die zum Beispiel die Aminosäuren einer konstanten Region oder ein bioaktives Molekül codieren, können auch mit der Gensequenz verbunden werden, um ein bifunktionelles Protein herzustellen.
Zum Beispiel können die, wie vorstehend beschrieben, entworfenen, synthetischen Gene und DNA-Fragmente durch Zusammenbau chemisch synthetisierter Oligonucleotide hergestellt werden. 15 – 100mer-Oligonucleotide könne mit einem Biosearch DNA Model 8600 Synthesizer synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) in Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) aufgereinigt werden. Die DNA wird dann durch Elektroelution aus dem Gel eluiert. Überlappende Oligomere können durch die T4-Polynucleotid-Kinase phosphoryliert und zu größeren Blöcken ligiert werden, welche ebenfalls durch PAGE aufgereinigt werden können.
Die Blöcke oder die Paare längerer Oligonucleotide können unter Verwendung eines geeigneten Clonierungs-Vektors, zum Beispiel pUC, in E. coli cloniert werden. Anfänglich kann dieser Vektor durch Einzelstrang-Mutagenese verändert werden, um verbleibende, an sechs Basen veränderte Stellen zu entfernen. Zum Beispiel kann V_H in Form fünf ursprünglicher Blöcke, welche sich zwischen den folgenden Restritkionsschnittstellen erstrecken: (1) EcoRI zur ersten NarI-Stelle; (2) erste NarI zur XbaI; (3) XbaI zur SalI; (4) SalI zur NcoI; und (5) NcoI zur BamHI; synthetisiert und in pUC cloniert werden. Diese clonierten Fragmente können dann isoliert und durch mehrere Ligierungen dreier Fragmente und Clonierungsschritte in dem pUC8-Plasmid zusammengesetzt werden. Gewünschte, durch PAGE ausgewählte Ligierungen werden dann in zum Beispiel in den E. coli -Stamm JM83 transformiert und entsprechend Standardverfahren auf LB-Ampicillin + XGaI-Platten ausplattiert. Die Gen-Sequenz kann nach der Clonierung durch Supercoil-Sequenzierung oder nach einer Sub-Clonierung in M13 durch das Didesoxy-Verfahren nach Sanger (Molecular Cloning, Sambrook et al., Hrsg., 2. Ausgabe (1989), Band 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) bestätigt werden.
Die konstruierten Gene können in geeigneten prokaryontischen Wirten wie verschiedenen E. coli-Stämmen und in eukaryontischen Wirten wie Ovarzellen Chinesischer Hamster (CHO), Maus-Myelom-, Hybridom-, Transfectom- und menschlichen Myelomzellen exprimiert werden.
Wenn das Gen in E. coli exprimiert werden soll, kann es zuerst in einen Expressionsvektor cloniert werden. Dies wird bewerkstelligt, indem das konstruierte Gen stromabwärts von einer Promotorsequenz wie Trp oder Tac und einem Gen, welches ein Leader-Polypeptid wie das Fragment B (FB) des Proteins A der Staphylokokken codiert, positioniert wird. Das sich ergebende, exprimierte Fusionsprotein sammelt sich in lichtbrechenden Körperchen im Cytoplasma der Zellen und kann nach dem Aufbrechen der Zellen durch eine French-Presse oder Ultraschallbehandlung geerntet werden. Die lichtbrechenden Körperchen werden löslich gemacht und die exprimierten Fusionsproteine werden durch die bereits für viele andere rekombinante Proteine etablierten Verfahren (Huston et al., 1988, vorstehend) gespalten und rückgefaltet oder bei direkten Expressionsverfahren gibt es keinen Leader und die Einschlusskörperchen können ohne Spaltung rückgefaltet werden (Huston et al., Methods in Enzymology, Band 203 (1991), Seiten 46 – 88).
Zum Beispiel kann eine nachfolgende proteolytische Spaltung der isolierten sFv von ihren Leader-Sequenz-Fusionen durchgeführt werden, um freie sFvs zu ergeben, welche renaturiert werden können, um eine intakte biosynthetische Hybrid-Antikörper-Bindungsstelle zu erhalten. Die Spaltstelle ist bevorzugt unmittelbar benachbart zum sFv-Polypeptid und schließt eine Aminosäure oder Sequenz von Aminosäuren ein, die keine Aminosäure oder Aminosäuresequenz enthält, die in der Aminosäure-Struktur der Einzel-Polypeptidkette zu finden ist.
Die Spaltstelle ist bevorzugt für die spezifische Spaltung durch ein ausgewähltes Mittel entworfen. Endopeptidasen sind bevorzugt, obwohl nicht-enzymatische (chemische) Spaltmittel verwendet werden können. Viele nützliche Spaltmittel, zum Beispiel Cyanogenbromid, verdünnte Säure, Trypsin, Staphylococcus aureus-V-8-Protease, Post-Prolin-Spaltenzym, Blutgerinnungsfaktor Xa, Enterokinase und Renin, erkennen und spalten bevorzugt oder ausschließlich an bestimmten Spaltstellen. Ein zur Zeit bevorzugtes Peptidsequenz-Spaltmittel ist die V-8-Protease. Die zur Zeit bevorzugte Spaltstelle ist an einem Glu-Rest. Andere nützliche Enzyme erkennen mehrere Reste als eine Spaltstelle, zum Beispiel Faktor Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) oder Enterokinase (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys). Verdünnte Säure spaltet bevorzugt die Peptidbindung zwischen Asp-Pro-Resten und CNBr in Säure spaltet nach Met, sofern es nicht von Tyr gefolgt wird.
Wenn das konstruierte Gen in eukaryontischen Hybridom-Zellen, dem herkömmlichen Expressionssystem für Immunglobuline, exprimiert werden soll, wird es zuerst in einen Expressionsvektor eingefügt, der zum Beispiel den Immunglobulin-Promotor, ein Sekretionssignal, Immunglobulinenhancer und verschiedene Introns enthält. Dieses Plasmid kann auch Sequenzen enthalten, die ein anderes Polypeptid codieren, wie die gesamte oder einen Teil der konstanten Region, was die Expression eines gesamten Teils der schweren oder leichten Kette ermöglicht, oder wenigstens einen Teil eines Toxins, Enzyms, Cytokins oder Hormons. Das Gen wird über die etablierte Elektroporations- oder Protoplastenfusions-Verfahren in Myelom-Zellen transfiziert. So transfizierte Zellen können dann V_H-Linker-V_L oder V_L-Linker-V_H-Einzelketten-Fv-Polypeptide exprimieren, wobei jedes von ihnen in den verschie denen, vorstehend diskutierten Arten mit einer Proteindomäne, welche eine weitere Funktion (zum Beispiel Cytotoxizität) hat, verbunden sein kann.
Zum Zusammenbau einer einzelnen, zusammenhängenden Kette von Aminosäuren, welche mehrere Bindungsstellen spezifiziert, werden Restriktionsschnittstellen an den Grenzen von DNA, die eine einzelne Bindungsstelle (das heißt, V_H-Linker-V_L) codiert, verwendet oder geschaffen, wenn sie nicht bereits vorliegen. DNAs, die einzelne Bindungsstellen codieren, werden ligiert und in Shuttle-Plasmide cloniert, aus denen sie weiter zusammengesetzt und in das Expressionsplasmid cloniert werden können. Die Anordnung der Domänen wird variiert werden und die Spacer zwischen den Domänen stellen die für die unabhängige Faltung der Domänen benötigte Flexibilität bereit. Die optimale Architektur in Bezug auf Expressionsniveaus, Rückfaltung und funktionelle Aktivität wird empirisch bestimmt werden. Um bivalente sFvs herzustellen, wird zum Beispiel das Stoppcodon in dem die erste Bindungsstelle codierenden Gen zu einem offenem Leserahmen geändert und es werden am richtigen Platz mehrere Glycin- und Serincodons, einschließlich einer Restriktionsschnittstelle wie BamHI (die Gly-Ser codiert) oder XhoI (die Gly-Ser-Ser codiert), eingesetzt. Das zweite sFv-Gen wird an seinem 5'-Ende, die gleiche Restriktionsschnittstelle im gleichen Leserahmen erhaltend, ähnlich verändert. Die Gene werden an dieser Stelle kombiniert, um das bivalente sFv-Gen zu ergeben.
Linker, die den C-Terminus einer Domäne mit dem N-Terminus der nächsten verbinden, umfassen im Allgemeinen hydrophile Aminosäuren, welche in physiologischen Lösungen eine nicht-strukturierte Konfiguration annehmen und bevorzugt frei von Resten sind, die große Seitengruppen haben, welche mit der richtigen Faltung der V_H-, V_L- oder angehängter Ketten interferieren könnten. Ein nützlicher Linker hat die Aminosäuresequenz [(Gly)₄Ser]₃ (siehe SEQ ID NO: 9 und 10, Reste Nr. 410 – 424). Ein zur Zeit bevorzugter Linker hat die Aminosäuresequenz, welche 2 oder 3 Wiederholungen von [(Ser)₄Gly], wie [(Ser)₄Gly]₂ oder [(Ser)₄Gly]₃ (siehe SEQ ID NO: 3 und 4), umfasst.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden, nicht-begrenzenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
1. Antikörper gegen mit c-erbB-2 verwandte Antigene
Monoclonale Antikörper gegen Brustkrebs wurden unter Verwendung menschlicher Brustkrebszellen oder von Membran-Extrakten der Zellen für die Immunisierung von Mäusen, wie in Frankel et al., J. Biol. Resp. Modif. 4 (1985), 273-286 beschrieben, hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen, entwickelt. Es wurden Hybridome hergestellt und unter Verwendung einer Reihe von normalen und Brustkrebszellen auf die Herstellung von Antikörpern hin ausgewählt. Eine Reihe von 8 Normalgewebe-Membranen, eine Fibroblasten-Zelllinie und Gefrierschnitte von Brustkrebsgeweben wurden bei der Durchmusterung verwendet. Kandidaten, welche die erste Durchmusterung bestanden hatten, wurden auf 16 Schnitten von Normalgewebe, 5 Arten normaler Blutzellen, 11 Schnitten von nicht aus der Brust stammenden Neoplasmen, 21 Brustkrebsschnitten und 14 Brustkrebszelllinien weiter untersucht. Aus dieser Auswahl wurden 127 Antikörper ausgewählt. In Kontrollexperimenten wurden irrelevante Antikörper und nicht aus der Brust stammende Krebszelllinien verwendet.
Es wurde herausgefunden, dass nützliche monoclonale Antikörper 520C9, 454C11, (A.T.C.C. Nr. HB8696 bzw. HB8484) und 741F8 einschließen. In dieser Durchmusterung als für Brustkrebs selektiv identifizierte Antikörper waren gegen 5 verschiedene Antigene reaktiv. Die Größen der Antigene, welche die Antikörper erkennen, waren jeweils: 200 kD; eine Serie von Proteinen, die wahrscheinlich Abbauprodukte sind, mit Molekulargewichten von 200 kD, 93 kD, 60 kD und 37 kD; 180 kD (Transferrinrezeptor); 42 kD und 55 kD. Von den gegen die fünf Arten von Antigenen gerichteten Antikörpern sind die spezifischsten diejenigen, welche gegen das 200 kD -Antigen gerichtet sind, wobei 520C9 ein repräsentativer Antikörper gegen diese Art von Antigen ist. 520C9 reagiert mit weniger Brustkrebsgeweben (etwa 20 – 70 %, abhängig von den Versuchsbedingungen) und er reagiert mit der geringsten Zahl von Normalgeweben als jeder andere der Antikörper. 520C9 reagiert mit Nierentubuli (wie dies viele monoclonale Antikörper tun), aber, neben einigen der untersuchten Gewebe, nicht mit Pankreas, Ösophagus, Lunge, Colon, Magen, Hirn, Tonsillen, Leber, Herz, Ovar, Haut, Knochen, Uterus, Blase oder normalem Brustgewebe.
2. Herstellung einer den Antikörper 520C9 codierenden cDNA-Genbank
Polyadenylierte RNA wurde aus annähernd 1 × 10⁸ (520C9-Hybridom) Zellen unter Verwendung des "Fast Track" mRNA-Isolationskits von Invitrogen (San Diego, CA) isoliert. Das Vorhandensein von RNA der schweren Kette des Immunglobulins wurde durch eine Northern-Untersuchung (Sambrook et al., Hrsg., Molecular Cloning, 2. Auflage (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) unter Verwendung einer rekombinanten Sonde, welche die verschiedenen J-Regionen der genomischen DNA der schweren Kette enthält, bestätigt. Unter Verwendung von jeweils 6 μg RNA wurde cDNA unter Verwendung des Invitrogen-cDNA-Synthese-Systems mit entweder Zufalls- oder Oligo-dT-Primern präpariert. Der Synthese nachfolgend wurde die cDNA der Größe nach durch eine einer Agarosegel-Elektrophorese nachfolgenden Isolierung von 0,5 – 3,0 Kilobasen (Kb)-Fragmenten selektiert. Nach einer Optimierung des Verhältnisses von cDNA zu Vektor wurden diese Fragmente dann mit dem pcDNA II-Clonierungsvektor von Invitrogen ligiert.
3. Isolierung von V_H- und V_L-Domänen
Nach Transformierung der Bakterien mit Plasmid-Genbank-DNA wurde eine Hybridisierung der Kolonien unter Verwendung von Sonden für die konstante (C) Region und die Joining (J)-Region der Antikörper nach Genen entweder der leichten oder der schweren Kette durchgeführt. Siehe Orlandi, R., et al., Proc. Nat. Aca. Sci., 86 (1989), 3833. Die Sonde für die konstante Region der Antikörper kann aus jeder der Nucleotidsequenzen der leichten oder schweren Kette eines Immunglobulin-Gens unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen werden. Einige mögliche positive Clone wurde für die Gene der schweren und der leichten Kette identifiziert und diese wurden, nach Aufreinigung durch eine zweite Durchmusterungsrunde, sequenziert. Ein Clon (M207) enthielt die Sequenz einer nicht-funktionellen Kappa-Kette, welche ein Tyrosin enthält, das ein konserviertes Cystein ersetzt und auch vorzeitig aufgrund einer Deletion über 4 Basen, welche eine Mutation durch Verschiebung des Leserahmens im Übergang von der variablen zur J-Region bedingt, endet. Ein zweiter Clon der leichten Kette (M230) enthielt, außer den letzten 18 Aminosäuren der konstanten Region und annähernd der Hälfte der Signal-Sequenz, faktisch das gesamte Gen der leichten Kette von 520C9. Die variable Region der schweren Kette von 520C9 lag in einem Clon von annähernd 1100 Basenpaaren (F320) vor, welcher nahe dem Ende der CH2-Domäne endete.
4. Mutagenese von V_H- und V_L
Um das sFv zusammenzusetzen, wurden sowohl die variable Region der schweren als auch die der leichten Kette mutiert, um geeignete Restriktionsschnittstellen einzufügen (Kunkel, T. A., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1373). Der Clon der schweren Kette (F320) wurde mutiert, um eine BamHI-Stelle am 5'-Ende von V_H (F321) einzufügen. Die leichte Kette wurde ebenfalls durch gleichzeitiges Einfügen einer EcoRV-Stelle am 5'-Ende und einer PstI-Stelle mit einem Translations-Stoppcodon am 3'-Ende der variablen Region (M231) mutiert.
5. Seguenzierung
Die leichte und die schwere Kette codierende cDNA-Clone wurden unter Verwendung externer Standard-Primer für pUC und einiger spezifischer interner Primer, welche auf der Basis der für die schwere Kette erhaltenen Sequenzen hergestellt worden waren, sequenziert. Die Nucleotidsequenzen wurden in einer Genbank-Homologie-Suche (Nucscan-Programm von DNA-star) analysiert, um endogene Immunglobulin-Gene auszuschließen. Die Translation in Aminosäuresequenzen wurde mit Aminosäuresequenzen im von E. Kabat herausgegebenen NIH-Atlas überprüft.
Vom Immunglobulin 520C9 abgeleitete Aminosäuresequenzen bestätigten die Identität von diesen V_H- und V_L-cDNA-Clonen. Der Clon der schweren Kette pF320 begann 6 Nucleotide stromaufwärts vom ersten ATG-Codon und dehnte sich bis in die die CH2 codierende Region aus, es fehlten ihm aber die letzten 9 Aminosäure-Codons der konstanten Domäne CH2 und alle der die CH3 codierenden Region sowie die nicht-translatierte 3'-Region und der Poly-A-Schwanz. Von einem weiteren kurzen Clon der schweren Kette, der nur die CH2 und CH3 codierenden Regionen und den Poly-A-Schwanz enthielt, wurde anfänglich angenommen, dass er den fehlenden Teil der schweren Kette von 520C9 darstellte. Die Überlappung beider Sequenzen war jedoch nicht identisch. Der Clon (pF320) von 520C9 codiert die CH1- und CH2-Domäne des murinen IgG1, während der kurze Clon pF315 CH2 und CH3 von IgG2b codiert.
6. Entwurf von Genen
Eine Nucleinsäuresequenz, die eine zusammengesetzte 520C9 sFv-Region codiert, die eine Einzelketten-Fv-Bindungsstelle enthält, welche mit c-erbB-2 verwandte Tumorantigene erkennt, wurde mit Hilfe der Compugene-Software entworfen. Das Gen enthält Nucleinsäuresequenzen, welche die V_H- und V_L-Regionen des vorstehend beschriebenen 520C9-Antikörpers codieren, die miteinander durch ein doppelsträngiges, synthetisches Oligonucleotid verbunden sind, das ein Peptid mit der im Sequenzprotokoll als Aminosäurereste 116 bis 133 in SEQ ID NO: 3 und 4 dargestellten Aminosäuresequenz codiert. Dieses Linker-Oligonucleotid enthält die helfenden Clonierungsstellen EcoRI und BamHI und wurde so entworfen, dass es als Stellen für den Zusammenbau SacI und EcoRV in der Nähe seines 5'- beziehungsweise 3'-Endes enthält. Diese Stellen ermöglichen das Zusammenfügen und die Ligierung an die 3'- und 5'-Enden von 520C9-V_H bzw. -V_L, welche diese Stellen ebenfalls enthalten (V_H-Linker-V_L). Die Reihenfolge der Anbindung an das Oligonucleotid kann jedoch in diesem oder jedem erfindungsgemäßen sFv umgekehrt werden (V_L-Linker-V_H). Andere Restriktionsschnittstellen wurden in das Gen eingebaut, um alternative Stellen für den Zusammenbau bereitzustellen. Eine das FB-Fragment des Protein A codierende Sequenz wurde als Leader verwendet.
Die Erfindung beinhaltet auch ein humanisiertes Einzelketten-Fv, das heißt es enthält menschliche Framework-Sequenzen und CDR-Sequenzen, welche die Bindung an c-erbB-2 spezifizieren, zum Beispiel wie die CDRs des Antikörpers 520C9. Das humanisierte Fv ist somit fähig c-erbB-2 zu binden, während es eine geringe oder keine Immunantwort auslöst, wenn es einem Patienten verabreicht wird. Eine Nucleinsäuresequenz, die ein humanisiertes sFv codiert, kann wie folgt entworfen und zusammengesetzt werden. Zwei Strategien zum Entwurf eines sFv sind besonders nützlich. Es kann eine Suche nach Homologien in der Datenbank Gen-Bank nach den am nächsten verwandten menschlichen Framework-Regionen durchgeführt werden und die FR-Regionen des sFv können gemäß den in der Suche identifizierten Sequenzen durch Mutation verändert werden, um die entsprechende menschliche Sequenz zu reproduzieren; oder es kann die Information aus auf Röntgenstrukturen basierenden Modellen von Fab-Fragmenten im Computer verwendet werden (Amit et al., Science 233 (1986), 747 – 753; Colman et al., Nature 326 (1987), 358 – 363; Sheriff et al., Proc . Nat. Aca. Sci. 84 (1987), 8075 – 8079; und Satow et al., J. Mol. Biol. 190 (1986), 593 – 604, von denen alle hierbei durch Bezugnahme eingeschlossen sind). In einem bevorzugten Fall können die am stärksten homologen menschlichen V_H- und V_L-Sequenzen aus einer Sammlung von durch PCR clonierten menschlichen V-Regionen ausgewählt werden. Die FRs werden synthetisch hergestellt und an CDRs fusioniert, um schrittweise zunehmend vollständige V-Regionen durch auf PCR basierende Ligierung herzustellen, bis die vollständige humanisierte V_L und V_H fertig gestellt sind. Zum Beispiel kann ein humanisiertes sFv, welches ein Hybrid aus den CDRs des murinen Antikörpers 520C9 und den FRs des menschlichen Myelom-Proteins NEW ist, in der Art entworfen werden, dass jede variable Region die murine Bindungsstelle innerhalb eines menschlichen Frameworks aufweist (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4). Die Kristallstruktur des Fab NEW (Saul et al., J. Biol. Chem. 253 (1978), 585 – 597) kann auch dazu verwendet werden, die Position der FRs in den variablen Regionen vorherzusagen. Sind diese Regionen einmal vorhergesagt, kann die Aminosäuresequenz oder die entsprechende Nucleotidsequenz der Regionen bestimmt werden und die Sequenzen können synthetisiert und in ein Shuttle-Plasmid cloniert werden, aus dem heraus sie weiter zusammengesetzt und in ein Expressionsplasmid cloniert werden können; alternativ können die FR-Sequenzen des sFv 520C9 direkt durch Mutation verändert werden und die Veränderungen durch Supercoil-Sequenzierung mit internen Primern überprüft werden (Chen et al., DNA 4 (1985), 165 – 170).
7. Herstellung und Aufreinigung des sFv 520C9
A. Solubilisierung von Einschlusskörperchen
Das sFv 520C9-Plasmid, welches auf einem T₇-Promotor und Vektor basiert, wurde durch direkte Expression der fusionierten Gensequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, in E. coli hergestellt. Einschlusskörperchen (15,8 g) aus einer 2,0 Liter-Fermentation wurden mit 25 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8,0 (TE) und 1M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) gewaschen. Die Einschlusskörperchen wurden in TE, 6M GuHCl, 10 mM Dithiothreit (DTT), pH 9,0 solubilisiert und ergaben 3825 A₂₈₀-Einheiten Material. Dieses Material wurde mit Ethanol gefällt, mit TE, 3 M Harnstoff gewaschen, dann in TE, 8 M Harnstoff, 10 mM DTT, pH 8,0, resuspendiert. Dieser Fällungsschritt bereitete das Protein auf die Aufreinigung des denaturierten sFv durch einen Ionenaustauscher vor.
B. Ionenaustauscher-Chromatographie
Die solubilisierten Einschlusskörperchen wurden einer Ionenaustauscher-Chromatographie unterzogen, um dadurch die kontaminierenden Nucleinsäuren und die Proteine von E. coli vor der Renaturierung des sFv zu entfernen. Die solubilisierten Einschlusskörper in 8 M Harnstoff wurden mit TE auf eine Endkonzentration des Harnstoffs von 6 M verdünnt, dann durch 100 ml Fast-Flow-DEAE-Sepharose in einer Radial-Fluss-Säule geleitet. Das sFv wurde in der ungebundenen Fraktion gewonnen (69 % der Ausgangsprobe).
Der pH-Wert dieser sFv-Lösung (A₂₈₀ = 5,7; 290 ml) wurde mit 1 M Essigsäure auf 5,5 eingestellt, um sie für den Auftrag auf eine Fast-Flow-S-Sepharose-Säule vorzubereiten. Als sich der pH-Wert unter 6,0 bewegte, bildete sich jedoch ein Niederschlag in der Probe. Die Probe wurde geklärt; 60 % der Probe waren im Sediment und 40 % im Überstand. Der Überstand wurde durch 100 ml Fast-Flow-S-Sepharose geleitet und der sFv in der ungebundenen Fraktion gewonnen. Das Sediment wurde in TE, 6M GuHCl, 10 mM DTT, pH 9,0 resolubilisiert und es wurde herausgefunden, dass es auch hauptsächlich sFv in einer Ansammlung mit einem Volumen von 45 ml mit einer Absorption von 20 Absorptionseinheiten bei 280 nm enthielt. Mit diesem eingeengten sFv-Konzentrat wurden die verbleibenden Schritte der Aufreinigung durchgeführt.
C. Renaturierung des sFv
Die Renaturierung des sFv wurde unter Anwendung eines Disulfid-beschränkten Rückfaltungsansatzes, bei dem die Disulfide oxidiert wurden, während der sFv vollständig denaturiert war, gefolgt von der Entfernung des denaturierenden Agens und der Rückfaltung, bewerkstelligt. Die Oxidierung der sFv-Proben wurde in TE, 6 M GuHCl, 1 mM oxidiertem Glutathion (GSSG), 0,1 mM reduziertem Glutathion (GSH), pH 9,0 durchgeführt. Das sFv wurde in dem Oxidationspuffer auf eine End-A₂₈₀ = 0,075 des Proteins in einem Volumen von 4000 ml verdünnt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Oxidation über Nacht wurde diese Lösung gegen 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 500 mM Harnstoff, pH 8,0 (PENU) [4 × (20 Liter × 24 Stunden)] dialysiert. In der rückgefalteten Probe wur den niedrige Aktivitätsspiegel nachgewiesen.
D. Membranfraktionierung und Konzentrierung von aktivem sFv
Um aggregiertes und fehlgefaltetes Material vor jeglichem Konzentrationsschritt zu entfernen, wurde das dialysierte und rückgefaltete sFv 520C9 (5050 ml) durch eine 100K-MWCO-Membran (Ausschluss: Mol. Gew. 100000) (4 × 60 cm²) unter Verwendung eines Minitan-Ultrafiltrationsapparates (Millipore) filtriert. Dieser Schritt benötigte, hauptsächlich aufgrund der Bildung von Niederschlag im Rückstand und einem Verstopfen der Membran mit Zunahme der Konzentration im Rückstand, eine bemerkenswerte Zeitspanne (9 Stunden). 95 % des Proteins, mit 79 % in der Form nicht-löslichen Materials, in der zurückgefalteten Probe wurde durch die 100K-Membranen zurückgehalten. Das 100K-Rückstand hatte eine sehr geringe Aktivität und wurde verworfen.
Das 100K-Filtrat enthielt den Großteil der löslichen sFv-Aktivität bei der c-erbB-2-Bindung und es wurde als nächstes unter Verwendung von 10K-MWCO-Membranen (Ausschluss: Mol. Gew. 10000) (4 × 60 cm²) in dem Minitan auf ein Volumen von 100 ml (50 ×) konzentriert. Dieses Material wurde unter Verwendung einer YM10-10K-MWCO-Membran in einer gerührten 50ml-Amicon-Zelle auf ein Endvolumen von 5,2 ml (1000 ×) weiter konzentriert. Nur eine geringe Menge von Niederschlag bildete sich während der zwei 10K-Konzentrationsschritte. Die spezifische Aktivität dieses konzentrierten Materials wurde in Bezug auf die anfängliche dialysierte Rückfaltung wesentlich erhöht.
E. Größenausschluss-Chromatographie von konzentriertem sFv
Als das rückgefaltete sFv durch Größenausschluss-Chromatographie fraktioniert wurde, wurde bestimmt, dass die gesamte Aktivität des sFv 520C9 an der Position des gefalteten Monomers eluierte. Um eine Anreicherung aktiven Monomers durchzuführen, wurde die 1000 × konzentrierte sFv-Probe auf einer Sephacryl-S200-HR-Säule (2,5 × 40 cm) in PBSA (2,7 mM KCl, 1,1 mM KH₂PO₄, 138 mM NaCl, 8,1 mM Na₂HPO₄·7H₂O, 0,02 % NaN₃) + 0,5 M Harnstoff fraktioniert. Das Elutionsprofil der Säule und die SDS-PAGE-Untersuchung der Fraktionen zeigte zwei sFv-Monomer-Peaks. Die zwei Peak-Fraktionen der sFv-Monomere wurden vereinigt (insgesamt 10 ml) und zeigten Bindungsaktivität gegenüber c-erbB-2 in Kompetitionsversu chen.
F. Affinitätsreinigung des sFv 520C9
Die extrazelluläre Domäne (ECD) von c-erbB-2 wurde in mit Bacculoviren infizierten Insektenzellen exprimiert. Dieses Protein (ECD c-erbB-2) wurde auf einer Agarose-Affinitätsmatrix immobilisiert. Der Monomerpeak des sFv wurde gegen PBSA dialysiert um den Harnstoff zu entfernen und dann auf eine 0,7 × 4,5 cm ECD c-erbB-2-Agarose-Affinitätssäule in PBSA aufgetragen. Die Säule wurde bis auf die A₂₈₀-Grundlinie gewaschen, dann mit PBSA + 3 M LiCl, pH = 6,1 eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden vereinigt (4 ml) und gegen PBSA dialysiert, um das LiCl zu entfernen. 72 μg aufgereinigten sFv wurden aus 750 μg der S-200-Monomerfraktionen gewonnen. Die Aktivitätsmessungen mit den Säulenfraktionen wurden durch einen Kompetitionsversuch bestimmt. Kurz gesagt wurde den sFv-Fraktionen der Affinitätsreinigung und HRP-konjugierten Fab-Fragmenten von 520C9 erlaubt, um die Bindung an Membranen von SK-BR-3 zu konkurrieren. Eine erfolgreiche Bindung der sFv-Präparation hinderte das HRP-520C9-Fab-Fragment an der Bindung auf die Membranen und verringerte oder verhinderte somit auch die Verwendung des HRP-Substrates und so die Farbentwicklung (siehe nachstehend für Details des Kompetitionsversuchs). Die Ergebnisse zeigten, dass faktisch die gesamte sFv-Aktivität durch die Säule gebunden und im eluierten Peak gewonnen wurde (4). Wie erwartet wurde die spezifische Aktivität des eluierten Peaks im Vergleich zur Säulen-Probe gesteigert und schien im Wesentlichen, innerhalb des experimentellen Fehlers dieser Messungen, gleich mit der Kontrolle des parentalen Fab zu sein.
9. Ausbeute nach der Aufreinigung
Die Tabelle 1 zeigt die Ausbeute von verschiedenen Präparationen von 520C9 während des Aufreinigungsprozesses. Die Protein-Konzentration (μg/ml) wurde mit dem BioRad-Proteintest bestimmt. Unter "Gesamte Ausbeute" stellen 300 AU des denaturierten sFv-Vorrats 3,15 g Einschlusskörperchen aus 0,4 Litern aus der Fermentation dar. Der Oxidationspuffer war 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 6 M GdnHCl, 1 mM GSSG, 0,1 mM GSH, pH 9,0. Die Oxidation wurde bei Raumtemperatur über Nacht durchgeführt. Die oxidierte Probe wurde gegen 10 mM Natriumphosphat, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 500 mM Harnstoff, pH 8,0 dialysiert. Alle nachfolgenden Schritte wurden, mit Ausnahme der Affinitätschromatographie, welche in PBSA durchgeführt wurde, in diesem Puffer durchgeführt.
Tabelle 1
10. Zusammenbau eines Immuntoxins
Das das fusionierte Ricin A-520C9-Einzelketten-Immuntoxin (SEQ. ID NO: 7) codierende Gen wurde durch die Isolierung des das Ricin A codierenden Gens auf einem HindIII- bis BamHI-Fragment aus pPL229 (Cetus Corporation, Emeryville, CA) und dessen Verwendung stromaufwärts des sFv 520C9 in pH777, wie in 3 gezeigt, zusammengesetzt. Diese Fusion enthält den natürlichen Linker mit 122 Aminosäuren, der zwischen den A- und B-Domänen des Ricins vorliegt. Im originalen Expressionsvektor pRAP229 war jedoch das Codon für Aminosäure 268 des Ricins zu einem TAA-Stoppcodon der Translation umgewandelt worden, so dass die Expression des sich ergebenden Gens nur Ricin A ergibt. Deshalb wurde, um das Stoppcodon der Translation zu entfernen, eine zielgerichtete Mutation durchgeführt, um das TAA zu entfernen und das natürliche Serin-Codon wiederherzustellen. Dieses erlaubt dann der Translation, sich über das gesamte Immuntoxin-Gen fortzusetzen.
Um das Immuntoxin zurück in die Expressionsvektoren pPL229 und pRAP229 einzusetzen, musste die PstI-Stelle am Ende des Immuntoxin-Gens zu einer Sequenz umgewandelt werden, die mit der BamHI-Stelle im Vektor kompatibel war. Ein synthetischer Oligonucleotid-Adapter, welcher eine zwischen PstI-Enden platzierte BclI-Stelle enthielt, wurde eingefügt. BclI- und BamHI-Enden sind kompatibel und können zu einer hybriden BclI/BamHI-Stelle kombiniert werden. Da die BclI-Nulcease empfindlich gegenüber einer dam-Methylierung ist, wurde das Konstrukt zuerst in einen dam (–) E. coli-Stamm, Gm48, transformiert, um die Plasmid-DNA mit BclI (und HindIII) zu spalten, dann das gesamte Immuntoxin-Gen auf einem HindIII/BclI-Fragment zurück in beide mit HindIII/BamHI gespaltene Expressionsvektoren einzufügen.
Wenn das native 520C9-IgG1 mit der nativen Ricin A-Kette oder der rekombinanten Ricin A-Kette konjugiert wird, ist das sich ergebende Immuntoxin fähig, die Proteinsynthese bei einer Konzentration von etwa 0,4 × 10^–9 M bei SK-Br-3-Zellen um 50 % zu hemmen. Zusätzlich zur Reaktivität mit SK-Br-3-Brustkrebszellen hemmt natives 520C9-IgG1-Immuntoxin auch eine Eierstockkrebszelllinie, OVCAR-3, mit einer ID₅₀ von 2,0 × 10^–9 M.
Im vorstehend beschriebenen Ricin A-sFv-Fusionsprotein wirkt Ricin als Leader für die Expression, das heißt, es ist an den Amino-Terminus des sFv fusio niert. Der direkten Expression folgend wurde für das lösliche Protein gezeigt, dass es mit Antikörpern gegen natives Fab 520C9 reagiert und auch die enzymatische Aktivität der Ricin A-Kette zeigt.
In einem anderen Entwurf ist die Ricin A-Kette an den Carboxy-Terminus des sFv fusioniert. Das sFv 520C9 kann mittels der Signalsequenz PelB sezerniert werden, wobei die Ricin A-Kette mit dem C-Terminus des sFv verbunden ist. Für dieses Konstrukt werden Sequenzen, welche die Signalsequenz PelB, sFv und Ricin codieren, in einem Bluescript-Plasmid über eine HindIII-Stelle, die dem sFv direkt folgt (in unseren Expressionsplasmiden), und die dem Ricin-Gen vorausgehende HindIII-Stelle in einer Zusammensetzung dreier Teile (RI-HindIII-BamHI) verbunden. Eine neue PstI-Stelle, die dem Ricin-Gen folgt, wird über den Polylinker des Bluescript gewonnen. Die Mutation dieser DNA entfernt das Stoppcodon und die ursprüngliche PstI-Stelle am Ende des sFv und setzt einige Serin-Reste zwischen die Gene des sFv und des Ricins. Diese neue Fusion von Genen, Signalsequenz PelB/sFv/Ricin A, kann als EcoRI/PstI-Fragment in Expressionsvektoren eingefügt werden.
In einem anderen Entwurf wird das zu der Ricin A-Kette analoge Exotoxin aus Pseudomonas, PE40, mit dem Carboxy-Terminus des anti-c-erbB-2-741F8-sFv fusioniert (SEQ ID NO: 15 und 16). Das sich ergebende 741F8-sFv-PE40 ist ein Einzelketten-Fv-Toxin-Fusionsprotein, welches mit einem 18 Reste kurzen FB-Leader zusammengesetzt wurde, der am Anfang an dem Protein belassen wurde.
Die Expression dieses Proteins in E. coli ergab Einschlusskörperchen, die in einem 3 M Harnstoff-Glutathion/Redox-Puffer rückgefaltet wurden. Von dem sich ergebenden sFv-PE40 wurde gezeigt, dass es vollständiger und mit offensichtlich besserer Cytotoxizität als das entsprechende quervernetzte Immuntoxin spezifisch cerbB-2 tragende Zellen in Kultur abtötet. Das sFv-Toxin-Protein ebenso wie das sFv 741 F8 können mit guten Ausbeuten durch diese Verfahren hergestellt werden und können als therapeutische oder diagnostische Wirkstoffe für Tumoren, die das c-erbB-2- oder damit verwandte Antigene tragen, wie Brust- und Eierstockkrebs, verwendet werden.
11. Experimente
A. Kompetitions-ELISA
Extrakt aus SK-Br-3 wird als Quelle für das c-erbB-2-Antigen wie folgt präpariert. Die Brustkrebszellen SK-Br-3 (Ring et al., Cancer Research 49 (1989), 3070-3080) werden bis fast zur Konfluenz in Iscove-Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.) mit 5 % fötalem Rinderserum und 2 mM Glutamin gezüchtet. Das Medium wird abgesaugt und die Zellen werden mit 10 ml fötalem Rinderserum (FBS) mit Calcium und Magnesium gespült. Die Zellen werden mit einem Gummischaber in 10 ml FBS mit Calcium und Magnesium abgeschabt und die Flasche wird mit weiteren 5 ml dieses Puffers ausgespült. Die Zellen werden dann bei 100 UpM zentrifugiert. Der Überstand wird abgesaugt und die Zellen werden zu 10⁷ Zellen/ml in 10 mM NaCl, 0,5 % NP40, pH 8 (TNN-Puffer) resuspendiert und auf- und abpipettiert, um das Sediment aufzulösen. Die Lösung wird dann bei 1000 UpM zentrifugiert, um Zellkerne und andere unlösliche Trümmer zu entfernen. Der Extrakt wird durch 0,45 Millex HA- und 0,2 Millex Gv-Filter filtriert. Der TNN-Extrakt wird in Aliquots in Wheaton-Einfrierröhrchen bei –70°C gelagert.
Ein frisches Röhrchen des TNN-Extrakts von SK-Br-3 wird aufgetaut und 200-fach in entionisiertem Wasser verdünnt. Unmittelbar danach werden 40 μg pro Vertiefung in eine PVC-Platte von Dynatech mit 96 Vertiefungen gegeben, welche über Nacht in einem Trockeninkubator bei 37 °C belassen wird. Die Platten werden viermal mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1 % Magermilch, 0,05 % Tween 20 gewaschen.
Die unspezifischen Bindungsstellen werden wie folgt blockiert. Wenn die Platte trocken ist, wird 100 μg PBS, das 1 % Magermilch enthält, pro Vertiefung zugefügt und die Inkubation wird für eine 1 Stunde bei Raumtemperatur laufen gelassen.
Die Testproben des Einzelketten-Fv und Standardverdünnungen des ganzen Antikörpers 520C9 werden dann wie folgt zugefügt. Der Antikörper 520C9 und die Testproben werden in einem Verdünnungspuffer (PBS + 1 % Magermilch) in Serie mit anfangs 50 μg/ml mit 2-fach Schritten verdünnt, wobei mindestens 10 Verdünnungen für den Standard 520C9 gemacht werden. Eine Kontrolle, die nur Verdünnungspuffer enthält, wird eingeschlossen. Die verdünnten Proben und Standards werden mit 50 μl pro Vertiefung zugefügt und über 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die 520C9-Meerrettich-Peroxidase (HRP)-Sonde wird wie folgt zugefügt. Das 520C9-HRP-Konjugat (Zymed Labs., Süd-San Francisco, Kalifornien) wird auf 14 μg/ml mit 1 % Magermilch im Verdünnungspuffer verdünnt. Die optimalen Verdünnungen müssen für jede neue Charge des Peroxidase-Konjugates bestimmt werden, ohne die vorangehenden Schritte wegzulassen. Pro Vertiefung wurden 20 μl der Sonde zugefügt und über 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird dann viermal mit PBS gewaschen. Das Peroxidase-Substrat wird dann zugefügt. Die Substratlösung sollte für jede Anwendung durch eine Verdünnung der Tetramethylbenzidin-Vorratslösung (TMB; 2 mg/ml in 100 % Ethanol) 1 : 20 und der 3%igen Wasserstoffperoxid-Vorratslösung 1:2200 in Substratpuffer (10 mM Natriumacetat, 10 mM Na-EDTA, pH 5,0) frisch hergestellt werden. Dies wird über 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen werden dann mit 100 μl 0,8 M H₂SO₄ pro Vertiefung gestoppt und die Absorption bei 150 nm abgelesen.
4 vergleicht die Bindungsfähigkeit des parentalen, rückgefalteten, aber nicht aufgereinigten monoclonalen Antikörpers 520C9, der Fab-Fragmente von 520C9 und der sFv-Einzelketten-Bindungsstelle von 520C9 nach Bindung und Elution von einer Affinitätssäule (eluiert) oder der ungebundenen Durchlauffraktion (durchgelaufen). In 4 zeigt der vollständig aufgereinigte sFv 520C9 eine Affinität für c-erbB-2, die von dem parentalen monoclonalen Antikörper, innerhalb des Fehlers der Messung der Proteinkonzentration, nicht zu unterscheiden ist.
B. Testung in vivo
Immuntoxine, die starke Hemmstoffe der Proteinsynthese bei in Kultur gezüchteten Brustkrebszellen sind, können auf ihre Wirksamkeit in vivo getestet werden. Das Experiment in vivo wird typischerweise in einem Nacktmaus-Modell unter Verwendung von Xeno-Transplantaten menschlicher MX-1-Brustkrebszellen durchgeführt. Den Mäusen werden entweder PBS (Kontrolle) oder verschiedene Konzentrationen des sFv-Toxin-Immuntoxins injiziert und eine konzentrationsabhängige Hemmung des Tumorwachstums wird beobachtet werden. Es wird erwartet, dass höhere Dosen des Immuntoxins eine bessere Wirkung hervorbringen werden.
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne deren Geist oder Umfang zu verlassen. Die vorliegenden Ausführungsformen sind deshalb in allen Gesichtspunkten als veranschaulichend und nicht als beschränkend zu verstehen, wobei der Umfang der Erfindung vielmehr durch die anhängenden Ansprüche als durch die vorausgegangene Beschreibung aufgezeigt wird, und es ist beabsichtigt, dass alle Änderungen, die innerhalb der Äquivalenzbedeutung und des Äquivalenzumfangs der Ansprüche aufkommen, darin umfasst sein sollen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Einzelketten-Fv (sFv)-Polypeptid, das eine Bindungsstelle definiert, an welche ein c-erbB-2-Tumor-Antigen bindet, wobei das Fv mindestens zwei Polypeptid-Domänen umfasst, die durch einen Polypeptid-Linker verknüpft sind, der den Abstand zwischen dem C-Terminus der einen Domäne und dem N-Terminus der anderen überbrückt, wobei die Aminosäuresequenz von jeder der Polypeptid-Domänen einen Satz von Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) umfasst, welche mindestens 70 % der Aminosäuresequenz der CDRs eines c-erbB-2-bindenden monoclonalen Antikörpers 741 F8 beibehalten.
Einzelketten-Fv (sFv)-Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) mindestens 90 % der Aminosäuresequenz der CDRs eines c-erbB-2-bindenden monoclonalen Antikörpers 741 F8 beibehalten.
Einzelketten-Fv (sFv)-Polypeptid nach Anspruch 2, wobei die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) 100 % der Aminosäuresequenz der CDRs eines c-erbB-2-bindenden monoclonalen Antikörpers 741 F8 beibehalten.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Polypeptid-Linker die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie im Sequenzprotokoll als Aminosäurereste Nummern 116 bis einschließlich 133 in SEQ ID NO: 4 dargestellt ist.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Polypeptid-Linker eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Sequenzen dargestellt als Aminosäurereste 122-135 in SEQ ID NO: 15 und den Aminosäuresequenzen wie dargestellt in SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 14.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiterhin eine daran gebundene, aus der Entfernung nachweisbare Einheit umfasst, um die Darstellung einer Zelle, die das c-erbB-2-Tumor-Antigen trägt, zu ermöglichen.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach Anspruch 6, wobei die aus der Entfernung nachweisbare Einheit ein radioaktives Atom umfasst.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das weiterhin, verknüpft mit dem N- oder C-Terminus der verknüpften Domäne, eine dritte Polypeptid-Domäne umfasst, die eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zwischen Framework Regionen (FRs) eingeschobenene CDRs und eine zweite immunologisch aktive Stelle definiert.
Einzelketten-Fv-Polypeptid nach Anspruch 8, das weiterhin eine vierte Polypeptid-Domäne umfasst, wobei die dritte und vierte Polypeptid-Domäne gemeinsam eine zweite Stelle umfassen, welche ein c-erbB-2-Tumor-Antigen immunologisch bindet.
DNA-Sequenz, die die Polypeptidkette nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert.
Verfahren zur Herstellung eines Einzelketten-Polypeptids, das Spezifität für ein c-erbB-2-Tumor-Antigen aufweist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Transfizieren der DNA nach Anspruch 10 in eine Wirtszelle zur Herstellung einer Transformante; und (b) Züchten der Transformante zur Herstellung des Einzelketten-Polypeptids.
Wirtszelle, transfiziert mit einer DNA nach Anspruch 10.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung in einem Diagnoseverfahren.
Verwendung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Herstellung eines bildgebenden Stoffes zur Darstellung eines c-erbB-2-Antigenexprimierenden Tumors.