CN105848746B - 用于层析重复利用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于清洗或再生重复利用的层析材料的方法。本发明的方法可以用于清洗或再生重复利用于大规模制备多种多肽产物的层析柱。

Description

用于层析重复利用的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年9月5日提交的美国临时申请系列号61/874,305的优先权，该美国临时申请在此完整引入作为参考。
技术领域
本发明提供层析方法。
背景技术
重组单克隆抗体(mAb)用于医学和诊断学(Albrecht,H.等,Drugs Today 2009,45:199-211；Takimoto,C.H.；Principles of Oncologic Pharmacotherapy Calvo,E.InCancer Management:A Multidisciplinary Approach Medical,Surgical&RadiationOncolog,第11版；Pazdur,R.；Wagman,L.D.；Camphausen,K.A.；Hoskins,W.J.编辑CMPHealthcare Media LLC:Lawrence,KS,USA,2008)。在工业上，在活细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生物产生重组mAb(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.2001,18:301-327)。一旦产生，必须从用于其产生的细胞和培养基成分分离目的mAb。此纯化方法具有两个主要步骤：(a)初步分离过程，其后是(b)最终纯化过程。初步mAb分离过程在为目的mAb而收获细胞之后开始。一旦收获mAb，产物库即包含目的mAb以及细胞成分(培养基成分、蛋白质、DNA)和可以在mAb产生过程期间存在的病毒。在示例性分离方法的第一个层析步骤中，使产物库运行通过A蛋白亲和柱(步骤1)。A蛋白亲和步骤的目的是去除培养基成分、细胞碎片和假定的病毒。步骤1之后，进一步在离子交换柱(IEX，步骤2)上纯化含有mAb的产物库。步骤2用于去除其他污染物，如聚集体和DNA。IEX层析之后，初步分离过程的最后一步包括用病毒清除滤器去除病毒的步骤(步骤3)。通常，在步骤3之后，用第二离子交换步骤(步骤4)进行mAb的最终纯化，以去除任何残留的CHO蛋白质(CHOP)。最终纯化之后，进行超滤/渗滤(UF/DF，步骤5)来去除小分子，浓缩mAb，更换缓冲液来将纯化的mAb配制为最终制剂缓冲液。然后是确保mAb库的无菌性的原液过滤步骤(步骤6)。
在工业mAb纯化中使用A蛋白亲和层析很常见，因为它有效、可扩展(scalable)和可重复(Affinity Chromatography Principles and Methods,Amersham Biosciences,Uppsala,瑞典,2002,参见2012年7月13日登陆的www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-us/18102229；Fahrner,R.L.等,Bioprocess Eng.1999,22:287)。但是，A蛋白树脂成本高，构成MAb制备中的大部分原料成本(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30,121-128；Kelley,B.,Biotechnol.Prog.2007,23:995-1008)。树脂利用不充分进一步加剧了此消耗，使得单根装填的A蛋白柱仅使用了其潜在寿命的10％(在中试工厂中及在临床生产期间)。为了降低这些成本，希望将A蛋白树脂重复利用于多种不同的mAb产物。A蛋白树脂重复利用于多种产物不是常规做法，因为重复利用可以导致蛋白质携带(carryover)，不仅来自之前的运行，还来自之前纯化的产物。因此，有效的清洁方法可使得能够重复利用。这种方法不仅可以节约金钱、空间和时间，还可以是环境友好的。此外，从避免为所合成的每种新的mAb装柱获得了时间节约。A蛋白树脂的重复利用还对环境更清洁，因为浪费、保存或运输的A蛋白树脂更少。注意到典型的MabSelectTM SuRe树脂可以使用至多250个循环(次)(Fahrner,R.L.Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30,121-128；Kelley,B.,Biotechnol.Prog.2007,23:995-1008；MabSelectTM Sure resin；Application note 28-9872096AA；Lifetime performancestudy of MabSelectTM Sure LX during repeated cleaning-in-place；GE Healthcare,Piscataway,NJ.2011年2月。参见www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related％20Content/Files/1314807262343/litdoc28987296AA_20110831222625.pdf)。但是，在用于典型临床或毒理学运行的中试工厂规模，A蛋白柱仅使用了总计3-4次运行(18-30个循环)，在任何地方都浪费了220-232个循环(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.2001,18:301-327)。如本文所述，使得能够并优化了在实验室和中试规模将层析柱如MabSelectTM SuRe树脂层析柱重复利用于多种CHO产物。为了将来自之前的纯化的mAb携带水平降低至可接受的水平，开发并验证了将在mAb纯化运行之间使用的改进的A蛋白树脂清洗方法。这通过研究以下来达到：(a)定量从之前的纯化进入使用同一A蛋白树脂的后续纯化的清洗前蛋白质携带(如果存在)的量，和(b)鉴定在使用之前或之后清洗A蛋白亲和树脂的方法，使得可以在同一A蛋白树脂上纯化多种产物而蛋白质携带有限且无安全顾虑。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，完整引入作为参考。
发明概述
本发明提供清洗或再生重复利用的层析材料例如层析树脂的方法。层析材料可以清洗和/或再生用于相同的产物或用于不同的产物。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟至约30分钟的时间；c)使约2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2个或多个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约4个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1NNaOH，，且为约pH 13。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，，且为约pH2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1NNaOH，，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；f)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mMNaCl，，且为约pH 7.1；b)静态保持该材料在平衡缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料；d)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，，且为约pH 2.8；e)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；f)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；g)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含0.1N NaOH、pH 13；h)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；i)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使约4个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mMNaCl，，且为约pH 7.1；b)进行包含以下步骤的6个循环：i)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.8；ii)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟；iii)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；iv)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13；v)静态保持该材料在再生缓冲液中约10分钟；vi)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，其包括步骤：a)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH2.8；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约15分钟；c)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；d)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1NNaOH，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料；g)使约3个材料体积的保存缓冲液通过该材料，其中该保存缓冲液包含约100mM乙酸钠、约2％苯甲醇，且为约pH 5.0；e)静态保持该材料在保存缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的保存缓冲液通过该材料。
在以上方面的一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析材料是亲和材料。在其他实施方案中，该亲和材料是A蛋白亲和材料，例如但不限于MabSelect材料、MAbSelect SuRe材料或MAbSelect SuRe LX材料。在以上方面的一些实施方案中，该层析材料用于大规模生产多肽。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约3个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约40mM乙酸钠，且为约pH5.5；b)使约2个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；c)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；d)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；和e)静态保持该材料在约0.5NNaOH中约10分钟；f)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料。
在以上方面的一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析材料是离子交换材料。在一些实施方案中，该离子交换材料是阳离子交换材料，例如POROS HS50材料。在一些实施方案中，该层析材料用于大规模产生抗体。
在一些方面，本发明提供清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约3个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约50mM Tris、85mM乙酸钠，且为约pH 8.8和约8.6mS/cm；b)使约2个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；c)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；d)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；和e)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；f)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料。
在以上方面的一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析材料是离子交换材料。在一些实施方案中，该离子交换材料是阴离子交换材料，例如QSFF材料。在一些实施方案中，该层析材料用于大规模产生抗体。
在任意以上方面的一些实施方案中，该缓冲液按约30个材料体积/小时、约20个材料体积/小时或约15个材料体积/小时通过该材料。在一些实施方案中，该缓冲液以下行方向或上行方向通过该材料。在一些实施方案中，通过在清洗层析材料后运行模拟洗脱来测量该层析材料的清洗。在一些实施方案中，包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项的模拟洗脱的洗脱物指示多产物使用材料的有效清洗。在一些实施方案中，该层析材料在碱中稳定。
在任意以上方面的一些实施方案中，该层析材料用于纯化多肽。在一些实施方案中，在纯化第一多肽后清洗该层析材料，且其中该层析材料在清洗后用于纯化第二多肽。在一些实施方案中，该多肽是抗体或免疫黏附素。在一些实施方案中，该抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，该单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在其他实施方案中，该单克隆抗体是IgG单克隆抗体。在一些实施方案中，该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双抗体、三链抗体。在其他实施方案中，多肽是酶、激素、融合蛋白质、含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子或白细胞介素。在一些实施方案中，该第一多肽是第一抗体或第一免疫黏附素，该第二多肽是第二抗体或第二免疫黏附素。
附图简述
图1显示来自在MabSelectTM SuRe柱上连续实验室规模纯化mAbA、mAbB和mAbC而无附加的树脂清洗的总蛋白质携带(完整IgG+Fc片段)作为洗脱样品循环的函数的图。图例：mAbB洗脱中的mAbA携带(黑灰色)、mAbC洗脱中的mAbB携带(灰色)和mAbC洗脱中的mAbA携带(黑色)。
图2显示在初始清洗循环中观察到的蛋白质去除作为洗脱缓冲液(0.15M乙酸)或再生缓冲液(0.1N NaOH)CV洗涤的函数。箭头指向30分钟静态保持。注意，在30分钟静态保持之后从柱洗掉的蛋白质的量增加5倍，用再生缓冲液静态保持后未检测到蛋白质。图例：方法4(表2)：黑色；方法5(表2)：黑灰色。
图3显示用方法6(黑色条，表2)和方法7(未检测到，表2)清洗后在MabSelectTMSuRe柱上进行“模拟运行”后检测到的完整IgG。用方法7(表2)进行了三次“模拟运行”，结果可重复。
图4显示按方法7清洗流程(表2)清洗MabSelectTM SuRe柱后的“模拟洗脱”的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)分析，94ng/mL模拟洗脱样品显示mAb超过90％完全完整。
图5显示使用方法7清洗流程(表2)的Akta层析图。“模拟洗脱”的层析图表明柱的有效清洗，如在对6个循环中的每一个进行从洗脱缓冲液(0.15M乙酸)至再生缓冲液(0.1NNaOH)的切换时UV强度中的峰所证明。蓝线＝UV 280nm；红线＝pH；洋红线＝电导率。
图6显示在“模拟运行”之前用优化的清洗流程(条目7，表2)实验室规模纯化mAbA来测定蛋白质携带的结果。A.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为洗脱缓冲液循环洗涤的函数；B.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为再生缓冲液循环洗涤的函数；C.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为“模拟运行”中的阶段的函数。完整IgG以黑色显示，Fc片段以灰色显示。
图7显示方法8表2中所列的具有保存缓冲液(100mM乙酸钠和2％苯甲醇(pH 5))的条件后总蛋白质携带作为清洗周期的函数的图。图例：洗脱循环(黑灰色)、再生循环(灰色)、保存缓冲液循环(黑色)。
图8是来自用优化的6循环清洗流程(条目7，表2)清洗柱后在MabSelectTM SuRe柱上3.23L中试规模纯化mAbZ的蛋白质携带作为样品的函数的图。完整IgG以黑色显示，Fc片段以灰色显示。
图9显示使用15分钟静态保持时间(A)和“模拟运行”(B)的优化清洗流程的示意图。平衡缓冲液为25mM Tris、25mM NaCl(pH 7.1)。洗脱缓冲液为0.15M乙酸钠(pH 2.9)。再生缓冲液为0.1N NaOH(pH 13)。
图10显示在“模拟运行”之前用清洗流程(图9)实验室规模纯化mAbC来测定蛋白质携带的结果。A.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为洗脱缓冲液循环洗涤的函数；B.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为再生缓冲液循环洗涤的函数；C.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为“模拟运行”中的阶段的函数。
图11显示在MabSelectTM SuRe柱的优化清洗流程(图9)的不同阶段采集的10％Tris-HCl凝胶。纯化mAbC后采集样品。浓缩再生样品(25倍)，泳道2、4、6、8、10和12包含15分钟静态保持后的样品。
图12显示在“模拟运行”之前用优化的清洗流程(条目7，表2)中试规模柱(3L)纯化mAbC来测定蛋白质携带的结果。A.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为洗脱缓冲液循环洗涤的函数；B.蛋白质携带(ng/mg蛋白质)作为再生缓冲液循环洗涤的函数。完整IgG以黑色显示，Fc片段以灰色显示。
图13显示模拟洗脱阳离子交换柱(POROS)和阴离子交换柱(QSFF)后检测的完整IgG携带的结果。之前已上样MAbA或MAbB，并从柱上洗脱。
图14A显示在原位清洗流程之前和之后模拟洗脱阳离子交换柱(POROS)和阴离子交换柱(QSFF)后检测的完整IgG携带的结果。之前已上样MAbA，并从柱上洗脱。
图14B显示在原位清洗流程之前和之后模拟洗脱阳离子交换柱(POROS)和阴离子交换柱(QSFF)后检测的完整IgG携带的结果。之前已上样MAbB，并从柱上洗脱。
图15显示在所选择的清洗流程步骤结束时从POROS或QSFF洗脱的完整IgG(MAbC)的量。
图16显示中试规模柱上清洗流程的不同步骤的MabD携带。
图17显示完整人IgG携带作为不同洗涤条件的函数的图。
图18显示蛋白质携带作为vA柱上不同缓冲液CV洗涤(树脂清洗努力)的函数的图。图例：6M盐酸胍：洋红色；19％乙醇：红色；2M盐酸精氨酸：棕色；20％己二醇：灰色；8M尿素/1M NaCl：橙色；平衡缓冲液：蓝色；1％v/v磷酸：黄色；0.1M咪唑/19％乙醇：黑色；0.1M乙酸：绿色；2M磷酸钾：青绿色。
图19是显示0.1M乙酸清洗溶液的五次连续模拟运行的层析图。
图20是显示多种清洗溶液连续模拟运行后的携带的图表。
图21是显示清洗溶液6M盐酸胍、2M盐酸胍或20％己二醇连续模拟运行后的携带的图表。
图22显示无柱清洗的产物洗脱的层析图(上图)。下图中显示每个级分中的携带。
图23显示整个脉冲清洗过程中的产物洗脱。
图24是显示有或无脉冲清洗的连续模拟运行的携带的图。
图25是显示使用下行或上行条件的连续模拟运行的携带的图。
图26显示整个脉冲清洗过程中的产物洗脱层析。黑色线显示下行条件，灰色线显示上行条件，浅灰色显示pH。
图27显示按30CV/小时和15CV/小时的流速连续模拟运行的携带。
图28显示平衡缓冲液或再生缓冲液单次静态保持的连续模拟运行的携带。正常脉冲表示无静态保持的样品。
图29显示平衡缓冲液多次静态保持的连续模拟运行的携带。正常脉冲表示无静态保持的样品。
图30显示层析图，其显示整个脉冲清洗过程中的产物洗脱。黑色线显示30CV/小时条件，灰色线显示15CV/小时条件，浅灰色显示pH。
图31显示层析图，其显示具有静态保持的整个脉冲清洗过程中的产物洗脱。黑色线显示正常脉冲，中灰色线显示平衡缓冲液保持条件，深灰色显示再生缓冲液保持条件，浅灰色线显示pH。
图32显示层析图，其显示具有单次或多次静态保持的整个脉冲清洗过程中的产物洗脱。黑色线显示正常脉冲，中灰色线显示1X平衡缓冲液保持条件，深灰色显示4X平衡缓冲液保持条件，浅灰色线显示pH。
图33显示循环持续时间减少对脉冲清洗条件下的携带的影响。
图34显示层析图，其显示循环持续时间减少的整个脉冲清洗过程中的产物洗脱。黑色线显示IgG，浅灰色线显示pH。
发明详述
本文提供清洗或再生重复利用的层析材料例如层析树脂的方法。层析重复利用是转换流程，其中清洗和/或再生层析材料用于相同的产物或不同的产物。本发明的方法可以用于再生大规模例如制备规模的层析材料。如果将树脂例如A蛋白树脂重复利用于多种产物，则可以显著节约成本。在一些实施方案中，清洗流程导致少于1ppm的完整蛋白质例如IgG携带入随后的纯化样品。在一些实施方案中，此低蛋白质携带是比安全限度中所设定的低103倍的蛋白质携带，证明同一树脂可以用于纯化多种产物。在一些实施方案中，该层析树脂在层析柱中。
I.定义
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，指任意长度的氨基酸聚合物。聚合物可以线性的或分枝的，它可以包含修饰氨基酸，它可以被非氨基酸打断。该术语还涵盖已天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任意其他操作或修饰，如与标记成分缀合。还包括在该定义内的是例如包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”明确涵盖抗体。
“纯化的”多肽(例如抗体或免疫黏附素)意指纯度已提高的多肽，使得它以比它在其天然环境中存在和/或最初在实验室条件下合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语，并非必然意指绝对纯度。
“结合”目的抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标)的多肽是这样的多肽，其以足够的亲和力结合抗原，使得该多肽可作为诊断剂和/或治疗剂用于靶向表达该抗原的细胞或组织，且不与其他多肽显著地交叉反应。在这类实施方案中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所测定，该多肽与“非靶标”多肽的结合程度将小于该多肽与其具体靶多肽的结合的约10％。
对于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合至”或对具体多肽或具体多肽靶标上的表位“特异”意指在测量上不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比，测定分子的结合来测量，该对照分子一般是不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如，可以通过与类似于靶标的对照分子(例如，过量的非标记靶标)竞争来测定特异性结合。在这种情况下，如果过量的未标记靶标竞争性抑制标记的靶标与探针的结合，则指示特异性结合。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要它们显示希望得到的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中可与抗体互换使用。
抗体是天然存在的免疫球蛋白分子，其具有全都基于免疫球蛋白折叠的不同结构。例如，IgG抗体具有通过二硫键键合形成功能性抗体的两条“重”链和两条“轻”链。每条重链和轻链本身包含“恒定”(C)区和“可变”(V)区。V区决定抗体的抗原结合特异性，而C区提供结构支持，并在与免疫效应物的非抗原特异性相互作用中发挥作用。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性是抗体特异性结合具体抗原的能力。
抗体的抗原结合特异性由V区的结构特征决定。可变性并非在可变结构域的110个氨基酸的跨度内均匀分布。相反，V区由15-30个氨基酸的称为构架区(FR)的相对不变的序列组成，该序列由长度各为9-12个氨基酸的称为“高变区”的极端可变的较短区域分隔开。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的部分的环。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
每个V区通常包含3个高变区(例如互补决定区(“CDR”)，其中每个CDR包含“高变环”)和4个构架区。因此，抗体结合部位(以实质性亲和力结合特定希望的抗原所需的最小结构单位)通常将包含3个CDR及散布其间来支持并以适当的构象呈递CDR的至少3个、优选4个构架区。经典的四链抗体具有通过相互协作的VH和VL结构域定义的抗原结合部位。某些抗体(如骆驼抗体和鲨鱼抗体)缺乏轻链，依赖于仅由重链形成的结合部位。可以制备单结构域改造免疫球蛋白，其中在缺乏VH和VL间协作的情况下由重链或轻链单独形成结合部位。
术语“可变的”指这样的事实，可变结构域的某些部分的序列在抗体间广泛不同，且用于各具体抗体对其具体抗原的结合和亲和力。但是，可变性并非在抗体的整个可变结构域内均匀分布。它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域二者中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各包含四个FR，四个FR主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，该高变区形成连接β-折叠结构且在一些情况下形成β-折叠结构的部分的环。各链中的高变区通过FR近距离保持在一起，并与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但显示多种效应子功能，如抗体在抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)中的参与。
在本文中使用时，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可以包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，VL中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，VH中的约31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)(Kabat等,Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.(1991)))和/或来自“高变环”的那些残基(例如VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，VH中的26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987)))。
“构架”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；串联双抗体(taDb)、线性抗体(例如美国专利号5,641,870，实施例2；Zapata等,Protein Eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微抗体、单链抗体分子；形成自抗体片段(例如，包括但不限于Db-Fc、taDb-Fc、taDb-CH3、(scFV)4-Fc、di-scFv、bi-scFv或串联(di,tri)-scFv)的多特异性抗体；及双特异性T细胞衔接物(BiTE)。
木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，各具有单个抗原结合部位)和残余的“Fc”片段(其名称反映了它易于结晶的能力)。胃蛋白酶处理产生F(ab’)2片段，其具有两个抗原结合部位，且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区域由紧密非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。各可变结构域的三个高变区正是在此构型中相互作用来定义VH-VL二聚体表面上的抗原结合部位。六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。但是，甚至单个可变结构域(或Fv的一半，其仅包含三个对抗原特异的高变区)也具有识别和结合抗原的能力，虽然亲和力低于整个结合部位。
Fab片段还包含轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同在于，在重链CH1结构域的羧基端加入了几个残基，其包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基具有至少一个自由巯基的Fab’的命名。F(ab’)2抗体片段最初作为其间具有铰合部半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其他化学偶联。
根据其恒定结构域的氨基酸序列，可以将来自任意脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”归置称为κ和λ的两个明显不同的类型之一。
取决于其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体归置不同种类。存在五个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的几个可以进一步划分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同种类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型众所周知。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。在一些实施方案中，Fv多肽进一步在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成希望的结构用于抗原结合。scFv的综述参见Plückthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约,269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合部位的小的抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL)。通过使用太短而不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，迫使结构域与另一条链上的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)中。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，且明确涵盖具有多表位特异性的抗体。这类多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单位具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单位结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三链抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶标上的两个或多个不同表位的能力。“单特异性”指仅结合一个表位的能力。根据一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。
表述“单结构域抗体”(sdAb)或“单可变结构域(SVD)抗体”一般指其中单个可变结构域(VH或VL)可以赋予抗原结合的抗体。换言之，该单可变结构域无需与另一可变结构域相互作用来识别靶抗原。单结构域抗体的实例包括衍生自骆驼(羊驼和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)的那些，以及来自人类和小鼠抗体的衍生自重组方法的那些(Nature(1989)341:544-546；Dev Comp Immunol(2006)30:43-56；Trend Biochem Sci(2001)26:230-235；Trends Biotechnol(2003):21:484-490；WO 2005/035572；WO 03/035694；Febs Lett(1994)339:285-290；WO00/29004；WO 02/051870)。
本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即除了可以在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该单个抗体的群体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆体的优势在于它们未受其他免疫球蛋白污染。修饰词“单克隆的”指抗体获自基本上同质的抗体群体的特征，而不解释为需要通过任意特定的方法来产生抗体。例如，待按照本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过最先由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。还可以用例如Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
本文的单克隆抗体明确包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或隶属于特定抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与衍生自另一物种或隶属于另一抗体种类或亚类的抗体中对应的序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们显示希望得到的生物活性(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包括“灵长类源化(primatized)”抗体，其包含衍生自非人灵长类(例如旧大陆猴，如狒狒、猕猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合抗体，其包含最少的衍生自非人免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中用来自具有希望得到的特异性、亲和力和容量的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的非人物种的高变区(供体抗体)的残基取代来自受体的高变区的残基。在一些情况下，用对应的非人残基取代人免疫球蛋白的构架区(FR)残基。此外，人源化抗体可以包含不见于受体抗体中或供体抗体中的残基。产生这些修饰来进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个(且通常为两个)可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，而除上文指出的一个或多个FR取代外，全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还将可选地包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的详情参见Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
为了本文的的目的，“完整抗体”是包含重链可变结构域和轻链可变结构域以及Fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是许多恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐(align)，轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链可变结构域和重链可变结构域之间的界面。
“裸抗体”是未与异源分子(如毒性部分或放射性标记)缀合的抗体(如本文所定义)。
在一些实施方案中，抗体“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后引起该靶细胞的裂解。用于介导ADCC的初级细胞(NK细胞)仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如美国专利号5,500,362或5,821,337中所述的ADCC测定。用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或此外，可以例如在动物模型中，如在Clynes等,PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目的分子的ADCC活性。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。在一些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；优选PBMC和NK细胞。
用术语“Fc受体”或“FcR”来描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，该FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似的氨基酸序列。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。本文的术语“FcR”涵盖了其他FcR，包括有待在将来鉴定的那些。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))。
本文关于层析所用的术语“顺次的”指在第一层析后进行第二层析。在该第一层析和第二层析之间可以包括附加的步骤。
本文关于层析所用的术语“连续的”指将第一层析材料和第二层析材料直接连接，或允许两种层析材料之间连续流动的某种其他机制。
本文所用的术语“分离的”指已从通常与之一起见于自然界或与之一起产生的至少一些成分分开的分子。例如，在将多肽从在其中产生它的细胞的至少一些成分分开时，将它称为“分离的”。在多肽表达后由细胞分泌时，认为从产生它的细胞物理上分开包含该多肽的上清是“分离”该多肽。类似地，在多核苷酸不是它在自然界中通常见于其中的更大的多核苷酸(例如，基因组DNA或线粒体DNA，在DNA多核苷酸的情况下)的部分，或从在其中产生它的细胞的至少一些成分分开(例如，在RNA多核苷酸的情况下)时，将它称为“分离的”。因此，可以将包含在宿主细胞内侧的载体中的DNA多核苷酸称为“分离的”。
本文所用的“可接受日暴露量(ADE)”是物质特异性剂量，如果个体一生中暴露于此剂量或暴露于更低的剂量，则不可能导致不良健康事件或不希望的生理作用(Teschner,W.等,Vox Sang.2007,92:42-55；2012年8月7日登陆的www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝1&ved＝0CE8QFjAA&url＝http％3A％2F％2Fwww.fda.gov％2Fdownloads％2FDrugs％2F...％2FGuidances％2FUCM078932.pdf&ei＝f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg＝AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frg上的Food andDrug Administration,HHS.Guidance for Industry Estimating the Maximum SafeStarting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult HealthyVolunteers.Rockville,MD.2005年7月；2012年8月7日登陆的www.ema.europa.eu/ema/index.jsp？curl＝pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid＝WC0b01ac0580029593上的European Medicines Agency.Impurities:Residual Solvents,Note for Guidance on Impurities:Residual Solvents(CPMP/ICH/283/95).伦敦,英国1997年9月)。除ADE外，根据每个剂量施用的IgG的量确定IgG的“估计日摄入量(EDI)”。
“污染物”指不同于希望得到的多肽产物的物质。污染物非限制性地包括：宿主细胞物质，如CHOP；浸出A蛋白；核酸；希望得到的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分等。在一些实施方案中，污染物可以是来自例如但不限于细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白质(HCP)。
本文提到的“约”某个值或参数包括(和描述)涉及该值或参数本身的变动。例如，提到“约X”的描述包括了“X”的描述。
除非文中清楚地另有说明，本文及所附权利要求中使用的单数形式“一”、“或”和“该”包括复数指代物。应理解，本文描述的本发明的方面和变通形式包括由该方面和变通形式组成和/或基本上由该方面和变通形式组成。
II.柱清洗的方法
(A)层析
本发明提供清洗或再生重复利用的层析材料的方法。在一些实施方案中，该层析材料用于多肽产物的大规模产生，例如制备规模产生。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟至约30分钟的时间；c)使约2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2个或多个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液是约0.1NNaOH、pH 13。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出(leached)A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约4个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液是约0.1N NaOH、pH 13。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mLCHO DNA中的一项或多项。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液是约0.1N NaOH，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；f)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris、约25mM NaCl，，且为约pH 7.1；b)静态保持该材料在平衡缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料；d)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.8；e)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；f)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；g)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液是约0.1N NaOH，，且为约pH13；h)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；i)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mLCZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约4个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris、约25mM NaCl，，且为约pH 7.1；b)进行包含以下步骤的6个循环：i)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液是约0.15M乙酸、pH 2.8；ii)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟；iii)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；iv)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中再生缓冲液是约0.1N NaOH，，且为约pH 13；v)静态保持该材料在再生缓冲液中约10分钟；vi)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤的6个循环：a)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液是约0.15M乙酸，，且为约pH 2.8；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约15分钟；c)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；d)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液是约0.1N NaOH，，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料；g)使约3个材料体积的保存缓冲液通过该材料，其中该保存缓冲液是约100mM乙酸钠、约2％苯甲醇，，且为约pH 5.0；e)静态保持该材料在保存缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的保存缓冲液通过该材料。在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料是A蛋白层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在本发明的一些方面，该层析材料是亲和层析材料。亲和层析材料的实例包括但不限于用A蛋白或蛋白G衍生的层析材料。亲和层析材料的实例包括但不限于Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus、Protein A sepharose fast flow、Tyopearl Protein A、MAbSelectTM、MAbSelectTM SuRe和MAbSelectTM SuRe LX。在以上的一些实施方案中，该亲和层析材料是亲和层析材料。在以上的一些实施方案中，该亲和层析材料是亲和层析膜。在一些实施方案中，该亲和层析材料是蛋白G层析材料。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。
在一些实施方案中，本发明提供清洗重复利用的离子交换层析材料的方法。在一些实施方案中，该方法包括步骤：a)使约3个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris、约25mM NaCl，，且为约pH 7.1；b)使约2个材料体积的约0.5NNaOH通过该材料；c)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；d)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；e)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；和f)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料。在一些实施方案中，该离子交换材料在层析柱中。在一些实施方案中，该层析柱用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，该层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施方案中，该清洗方法后的携带包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该层析材料是离子交换层析材料；例如，阴离子交换层析材料或阳离子交换层析材料。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该层析材料是阴离子交换材料。在一些实施方案中，该阴离子交换材料在层析柱中。在一些实施方案中，该阴离子交换层析材料是固相，该固相带正电荷，且具有用于与流过或通过该固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阴离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在一个实施方案中，该阴离子交换材料可以是树脂。在一些实施方案中，该阴离子交换材料可以包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、多胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换层析材料是阴离子交换层析材料。在以上的一些实施方案中，该阴离子交换层析材料是阴离子交换层析膜。在一些实施方案中，该阴离子交换层析材料用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该层析材料是阳离子交换材料。在一些实施方案中，该阳离子交换材料在层析柱中。在一些实施方案中，该阳离子交换材料是固相，该固相带负电荷，且具有用于与流过或通过该固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阳离子交换材料可以是膜、monolith或树脂。在一些实施方案中，该阳离子交换材料可以是树脂。该阳离子交换材料可以包含羧酸官能团或磺酸官能团，例如但不限于磺酸盐、羧酸、羧甲基磺酸、磺异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺酰氧乙基(sulphoxyethyl)或正磷酸盐。在以上的一些实施方案中，该阳离子交换层析材料是阳离子交换层析材料。在以上的一些实施方案中，该阳离子交换层析材料是阳离子交换层析膜。在本发明的一些实施方案中，该层析材料不是阳离子交换层析材料。在一些实施方案中，该阳离子交换层析材料用于多肽产物如抗体产物的大规模产生，例如制备规模产生。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该离子交换材料可以利用常规层析材料或对流层析材料。常规层析材料包括例如灌注性材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂)和扩散性材料(例如交联琼脂糖树脂)。在一些实施方案中，该聚(苯乙烯-二乙烯苯)树脂可以是Poros树脂。在一些实施方案中，该交联琼脂糖树脂可以是磺丙基-Sepharose FastFlow(“SPSFF”)树脂。对流层析材料可以是膜(例如聚醚砜)或monolith材料(例如交联聚合物)。该聚醚砜膜可以是Mustang。交联聚合物monolith材料可以是交联聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
阴离子交换材料的实例为本领域已知，其包括但不限于Poros HQ 50、Poros PI50、Poros D、Mustang Q、Q Sepharose FF和DEAE Sepharose。
阳离子交换材料的实例为本领域已知，其包括但不限于Mustang S、Sartobind S、SO3Monolith、S Ceramic HyperD、Poros XS、Poros HS50、Poros HS20、SPSFF、SP-Sepharose XL(SPXL)、CM Sepharose Fast Flow、Capto S、Fractogel Se HiCap、Fractogel SO3或Fractogel COO。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该阳离子交换材料是Poros HS50。在一些实施方案中，该Poros HS树脂可以是Poros HS 50μm或PorosHS 20μm颗粒。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该层析材料是包含能够执行一种或多种以下功能的官能团的混合模式材料：阴离子交换、阳离子交换、氢键键合和疏水相互作用。在一些实施方案中，该混合模式材料包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。该混合模式材料可以包含N-苯甲基-N-甲基乙醇胺、4-巯基-乙基-吡啶、己胺或苯丙胺作为配体或包含交联聚烯丙胺。混合模式材料的实例包括Capto Adhere树脂、QMA树脂、Capto MMC树脂、MEP HyperCel树脂、HEA HyperCel树脂、PPA HyperCel树脂或ChromaSorb膜或Sartobind STIC。在一些实施方案中，该混合模式材料是Capto Adhere树脂。在以上的一些实施方案中，该混合模式材料是混合模式层析材料。在以上的一些实施方案中，该混合模式材料是混合模式层析柱。在以上的一些实施方案中，该混合模式材料是混合模式膜。在一些实施方案中，该混合模式层析柱是大规模例如制备规模层析柱。
在本发明的一些方面，该层析材料是疏水相互作用层析材料。疏水相互作用层析(HIC)是根据疏水性分开生物分子的液相层析技术。HIC层析材料的实例包括但不限于Toyopearl hexyl 650、Toyopear butyl 650、Toyopearl phenyl 650、Toyopearl ether650、Source、Resource、Sepharose Hi-Trap、Octyl sepharose和Phenyl sepharose。在以上的一些实施方案中，该HIC层析材料是HIC层析柱。在以上的一些实施方案中，该HIC层析材料是HIC层析膜。在一些实施方案中，该HUC层析柱是大规模例如制备规模层析柱。
在本发明的一些方面，该层析材料是羟基磷灰石(HAP)层析材料。羟基磷灰石层析材料的实例包括但不限于HA Ultrogel和CHT羟基磷灰石。在以上的一些实施方案中，该HAP层析材料是HAP层析柱。在以上的一些实施方案中，该HAP层析材料是HAP层析膜。在一些实施方案中，该HAP层析柱是大规模例如制备规模层析柱。
在一些实施方案中，本发明提供清洗或再生碱稳定层析材料例如碱稳定层析柱的方法。
本发明提供用于本发明方法的缓冲液。洗脱缓冲液通常用于从层析材料去除物质，例如希望得到的物质或不希望得到的物质，如污染物。洗脱缓冲液的实例包括但不限于约pH 2.8-2.9的0.15M乙酸。再生缓冲液通常用于在层析流程之后补给(recharge)柱。例如，用于阴离子层析的再生缓冲液可以是约pH 13的约0.1N NaOH。平衡缓冲液用于使层析材料处于与样品相同的条件(盐浓度、pH等)之下。平衡缓冲液的非限制性实例是约pH 7.1的约25mM Tris和约25mM NaCl。保存缓冲液通常用于在不使用时维持层析材料；例如，用微代码(microcode)来防止污染。保存缓冲液的非限制性实例是约100mM乙酸钠、约2％苯甲醇，，且为约pH 5.0。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，流速小于约50个材料体积/小时、40个材料体积/小时或30个材料体积/小时中的任一个。流速可以约5在个材料体积/小时和50个材料体积/小时、10个材料体积/小时和40个材料体积/小时，或18个材料体积/小时和36个材料体积/小时中的任一个之间。在一些实施方案中，流速约是9个材料体积/小时、18个材料体积/小时、25个材料体积/小时、30个材料体积/小时、36个材料体积/小时或40个材料体积/小时中的任一个。
在一些实施方案中，该层析材料在层析柱中。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，流速小于约50 个柱体积(CV)/小时、40CV/小时或30CV/小时中的任一个。流速可以约在5CV/小时和50CV/小时、10CV/小时和40CV/小时，或18CV/小时和36CV/小时中的任一个之间。在一些实施方案中，流速约是9CV/小时、18CV/小时、25CV/小时、30CV/小时、36CV/小时或40CV/小时中的任一个。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，流速小于约100cm/小时、75cm/小时或50cm/小时中的任一个。流速可以约在25cm/小时和150cm/小时、25cm/小时和100cm/小时、50cm/小时和100cm/小时或65cm/小时和85cm/小时中的任一个之间。
床高是所使用的层析材料的高度。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，床高大于约3cm、10cm或15cm中的任一个。床高可以约在3cm和35cm、5cm和15cm、3cm和10cm，或5cm和8cm中的任一个之间。在一些实施方案中，床高为约3cm、5cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm中的任一个。在一些实施方案中，根据上样中多肽或污染物的量确定床高。在一些实施方案中，该层析材料在用于大规模产生，例如制备规模产生多肽的柱中。在一些实施方案中，该制备规模的层析材料具有约10cm、15、cm、20cm、25cm或30cm中的任一个的床高。
床直径是所使用的层析材料的直径。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，床直径大于约80cm、100cm或120cm中的任一个。在一些实施方案中，床直径是约50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、100cm、110cm、120cm、130cm、140cm、150cm、160cm、170cm、180cm、190或200cm中的任一个。在一些实施方案中，根据上样中多肽或污染物的量确定床直径。在一些实施方案中，该层析材料在用于大规模产生，例如制备规模产生多肽的柱中。在一些实施方案中，该制备规模的层析材料具有约50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、100cm、110cm、120cm、130cm、140cm、150cm、160cm、170cm、180cm、190或200cm中的任一个的床直径。
在一些实施方案中，该层析在体积大于约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、40mL、50mL、75mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL、1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L、10L、25L、50L、100L、200L、300L、400L、500L、600L、700L、800L、900L或1000L的容器的材料中。在一些实施方案中，该容器具有14cm的床高和80cm的床体积；例如大规模A蛋白柱。在一些实施方案中，该容器具有19cm的床高和100cm的床体积，例如大规模阴离子交换柱。在一些实施方案中，该容器具有30cm的床高和120cm的床体积，例如大规模阳离子交换柱。
本文所用的上样是上样至层析材料上的组合物。在一些实施方案中，该上样是上样至之前已用于分离不同多肽的层析材料上的多肽。上样缓冲液是用于将包含目的产物的组合物上样至层析材料上的缓冲液。可以在上样待纯化的组合物之前用平衡缓冲液平衡层析材料。在一些实例中，在将组合物上样至层析材料之后和从固相洗脱目的多肽之前使用洗涤缓冲液。但是，一些目的产物例如多肽可以通过洗涤缓冲液从层析材料去除(例如类似于流穿模式)。
本文所用的洗脱是从层析材料去除产物，例如多肽。在本发明的一些实施方案中，该洗脱是“模拟洗脱”，其中将洗脱流程应用于在最后一个清洗流程后未上样蛋白质的层析材料。在本发明的一些实施方案中，在本文所述的任意一个清洗流程之后将模拟洗脱流程应用于层析材料。在一些实施方案中，在确定实际生产运行期间是否可以存在携带物质(例如污染物)的努力中，该模拟洗脱模拟将用于洗脱将应用于该材料的蛋白质的洗脱。模拟洗脱可以用作评价清洗流程的功效的手段。
洗脱缓冲液是用于从层析材料洗脱多肽或其他目的产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有不同于上样缓冲液的物理特征。例如，洗脱缓冲液可以具有不同于上样缓冲液的电导率或不同于上样缓冲液的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液低的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液高的电导率。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液低的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有比上样缓冲液高的pH。在一些实施方案中，洗脱缓冲液具有不同于上样缓冲液的电导率和不同于上样缓冲液的pH。洗脱缓冲液可以具有较高或较低的电导率和较高或较低的pH的任意组合。
电导率指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子转运流动。因此，随着水溶液中存在的离子的量逐渐增加，溶液将具有更高的电导率。测量电导率的基本单位是Siemen(或mho)、mho(mS/cm)，且可以用电导率计测量，如多种型号的Orion电导率计。由于电解质电导率是溶液中的离子携带电流的能力，可以通过改变其中离子的浓度来改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度，以达到希望得到的电导率。优选地，改变多种缓冲液的盐浓度以达到希望得到的电导率。
(B)污染物
本发明提供用于重复利用大规模如制备规模使用的层析材料的方法。该方法提供了层析材料在多种多肽产物中的多种用途。例如，使用本发明的方法，可以在层析材料上工业规模纯化第一抗体，然后进行本文所述的清洗/再生层析材料的方法，然后工业规模纯化第二抗体产物。在一些实施方案中，本发明的方法用于减少之前用该层析材料纯化的产物的“携带”。在一些实施方案中，携带污染物包括但不限于全抗体、IgG片段、Fc和Fc片段。
在本文所述的任意方法的一些实施方案中，该至少一种污染物是以下的任意一种或多种：宿主细胞物质，如CHOP；浸出A蛋白；核酸；希望得到的多肽的变体、片段、聚集体或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基成分，羧肽酶B、庆大霉素等。在一些实施方案中，该污染物可以是来自例如但不限于细菌细胞如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白质(HCP)。
浸出A蛋白是从它所结合的固相脱附或洗下的A蛋白。例如，浸出A蛋白可以从A蛋白层析材料浸出。A蛋白的量可以例如通过ELISA测量。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，浸出A蛋白的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一个。浸出A蛋白的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。在一些实施方案中，浸出A蛋白的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中浸出A蛋白的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中浸出A蛋白的量相比较来确定该减少。
宿主细胞蛋白质(HCP)是来自在其中产生多肽的细胞的蛋白质。例如，CHOP是来自宿主细胞的蛋白质，即中国仓鼠卵巢蛋白质。CHOP的量可以通过酶联免疫吸附测定(“ELISA”)或Meso Scale Discovery(“MSO”)测量。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，洗脱物中HCP(例如CHOP)的量在模拟洗脱中最小。在一些实施方案中，将来自有清洗方法和无清洗方法或清洗方法之前和之后的模拟洗脱洗脱物中宿主细胞蛋白质的水平相比较。
测量DNA如宿主细胞DNA的方法为本领域已知，并描述于实施例章节中。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，DNA的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或90％中的任一个。DNA的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。DNA的量可以减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中DNA的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中DNA的量相比较来确定该减少。
片段多肽可以是低分子量(LMW)蛋白质。在一些实施方案中，片段多肽是目的多肽的片段。LMW蛋白质的实例包括但不限于Fab(片段抗原结合)、Fc(片段，可结晶)或二者的组合或目的抗体的任意随机片段部分。测量片段蛋白质(例如LMW蛋白质)的方法为本领域已知，并描述于实施例章节中。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，LMW蛋白质的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一个。LMW蛋白质的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。LMW蛋白质的量可以减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中片段蛋白质(例如LMW蛋白质)的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中片段蛋白质(例如LMW蛋白质)的量相比较来确定该减少。
聚集多肽可以是高分子量(HMW)蛋白质。在一些实施方案中，该聚集多肽是目的多肽的多聚体。HMW蛋白质可以是目的多肽的二聚体，至多8x单体，或更大。测量聚集蛋白质(例如HMW蛋白质)的方法为本领域已知。在一些实施方案中，模拟洗脱中HMW的水平最低；例如低于约5ppm、低于约4ppm、低于约3ppm、低于约2ppm或低于约1ppm。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，聚集蛋白质的量减少大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，或95％中的任一个。聚集蛋白质的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。聚集蛋白质的量可以减少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中聚集蛋白质(例如HMW蛋白质)的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中聚集蛋白质(例如HMW蛋白质)的量相比较来确定该减少。
细胞培养基成分指存在于细胞培养基中的成分。细胞培养基可以是收获细胞时的细胞培养基。在一些实施方案中，该细胞培养基成分是庆大霉素。庆大霉素的量可以通过ELISA测量。在本文所述的任意方法的一些实施方案中，细胞培养基成分的量减少大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一个。细胞培养基成分的量可以减少约10％和99％、30％和95％、30％和99％、50％和95％、50％和99％、75％和99％，或85％和99％中的任一个之间。在一些实施方案中，细胞培养基成分的量减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任一个。在一些实施方案中，通过将从一个或多个纯化步骤回收的组合物中细胞培养基成分的量与该一个或多个纯化步骤之前组合物中细胞培养基成分的量相比较来确定该减少。
(C)检测污染物的方法
本发明提供评价清洗可重复利用的层析材料的有效性的方法。例如，通过上文所述的本发明的方法之一来清洗之前已上样和洗脱多肽至少一次的层析材料。然后在该材料上运行模拟洗脱，其中在清洗流程之后未将附加的多肽上样在该材料上。模拟洗脱可以按照用在之前上样在该材料上的多肽的洗脱流程，或者洗脱流程可以按照用于将要在清洗流程后纯化的多肽的洗脱流程。在一些实施方案中，在模拟洗脱之前在该材料上运行模拟上样。除上样中不包含多肽外，模拟上样使用与将多肽上样在该材料上相同的流程。在一些实施方案中，将来自模拟洗脱的洗脱物收集在一个或多个级分中。在一些实施方案中，将模拟洗脱的洗脱物收集在单个级分中。在一些实施方案中，针对包括来自该层析材料之前的上样的携带多肽、IgG片段、浸出A蛋白、CHOP和CHO DNA的污染物分析洗脱物、或洗脱物的样品。
多肽定量
可以通过用UV-可见光分光光度计(8453model G1103A；Agilent Technologies；Santa Clara,CA,U.S.A.)或NanoDrop 1000model ND-1000(Thermo Fisher Scientific；Waltham,MA,U.S.A.)测定280nm和320nm吸光度来测定多肽如抗体的浓度。之前上样在可重复利用的层析材料上的多肽或上样在通过本发明的方法清洗的材料上的多肽之外的种类(即杂质)的浓度可以太低而对UV吸光度无可察觉的影响。根据需要，可以用适当的非干扰稀释剂将样品稀释至0.1-1.0个吸光度单位的范围之内。一式两份地进行样品制备和UV测量，并记录平均值。Mab吸收系数可以在从1.42至1.645/mg·ml·cm的范围内。
总蛋白质可以通过毛细管区带电泳/激光诱导荧光检测测定来测定。
IgG检测
完整人IgG和人IgG片段可以用完整人IgG特异性或IgG片段特异性ELISA检测。人Fc可以用人Fc特异性ELISA检测。
CHO宿主细胞蛋白质(CHOP)定量
ELISA可以用于定量称为CHOP的宿主细胞蛋白质的水平。将抗-CHOP抗体固定在微量滴定板孔上。在孔中孵育包含CHOP的样品、标准品和对照的稀释液，然后用缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗-CHOP抗体孵育。HRP酶活性可以用邻苯二胺检测，通过在酶标仪中读取490nm吸光度来定量CHOP。根据夹心ELISA的原理，过氧化物酶的浓度对应于CHOP浓度。ELISA的测定范围通常为5–320ng/ml，测定内变异<10％。CHOP值可以以ng/ml的单位报告。备选地，可以将CHOP值除以MAb浓度，并可以以ppm报告结果(百万分之几；例如，ng CHOP/mgMAb)。CHOP ELISA可以用于定量样品中的总CHOP水平，但不定量单种蛋白质的浓度。
CHO DNA定量
产物样品中的CHO DNA可以用实时PCR(TaqMan PCR)定量。首先用Qiagen的VirusBiorobot试剂盒提取来自样品和对照的DNA。然后用ABI的序列检测系统用PCR引物和探针在96孔板中对所提取的样品、对照和标准DNA进行TaqMan实时聚合酶链反应(PCR)。通过中国仓鼠(Cricetulus griseus)基因组中重复DNA序列的110碱基对区段来定义引物。探针在5’端用荧光报道分子标记，在3’端用猝灭染料标记。在探针完整时，猝灭剂抑制报道分子的发射光谱。聚合酶的5’核酸酶活性水解探针，释放报道分子，导致荧光发射增加。序列检测器定量与在DNA扩增期间连续测量的荧光发射的增加成正比的扩增产物。计算DNA扩增通过阈值(CT)的循环数用于标准曲线。可以生成1pg/mL-10,000pg/mL范围内的标准曲线，用该标准曲线定量样品中的DNA。
浸出A蛋白定量
A蛋白库中浸出A蛋白的水平可以通过夹心A蛋白ELISA来测定。将鸡抗-葡萄球菌A蛋白抗体固定在微量滴定板孔上。样品处理流程可以包括样品稀释及用微波辅助加热解离A蛋白/IgG复合物作为在夹心ELISA上运行样品之前的预处理步骤。如果存在于样品中，则A蛋白可以与包被的抗体结合。用缀合辣根过氧化物酶的抗-蛋白质抗体检测结合的A蛋白。用两个成分的TMB底物溶液定量辣根过氧化物酶的酶活性，该TMB底物溶液产生比色信号。
III.多肽
本发明的方法可以用于清洗用于纯化多种多肽的层析材料。在一些实施方案中，该层析材料用于多肽如抗体或其片段的大规模产生，例如制备规模产生。在一些实施方案中，层析材料用于纯化第一多肽，例如第一抗体，然后通过本发明的方法清洗该材料，然后该层析材料可以用于纯化第二多肽，如第二抗体。在一些实施方案中，该清洗是有效的，使得包含该第二纯化多肽的制备物基本上不含该第一多肽。在一些实施方案中，包含该第二纯化多肽(例如第二抗体)的制备物包含低于1ppm的该第一多肽(例如第一抗体)。在一些实施方案中，该第二纯化多肽包含低于1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm或100ppm中任一个的该第一多肽。
在一些实施方案中，本发明的方法用于重复利用用于纯化治疗性多肽的层析材料。在一些实施方案中，该多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，该多肽是激动剂。在一些实施方案中，该多肽是抗体。在一些实施方案中，该多肽带有附加表位。在一些实施方案中，该多肽保留生物学和/或免疫学活性。在一些实施方案中，该多肽是拮抗剂。在一些实施方案中，该多肽起始依赖补体的细胞毒性。在一些实施方案中，该多肽是抗体或免疫黏附素。
在一些实施方案中，该多肽(该第一多肽和/或该第二多肽)具有高于约5,000道尔顿、10,000道尔顿、15,000道尔顿、25,000道尔顿、50,000道尔顿、75,000道尔顿、100,000道尔顿、125,000道尔顿或150,000道尔顿中任一个的分子量。该多肽可以具有约50,000道尔顿至200,000道尔顿或100,000道尔顿至200,000道尔顿中任一个的分子量。备选地，用于本文的多肽可以具有约120,000道尔顿或约25,000道尔顿的分子量。
pI是等电点，且是特定分子或表面不携带净电荷的pH。在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，该多肽(例如该第一多肽和/或该第二多肽)的pI可以是约6至10、7至9或8至9中的任一个。在一些实施方案中，该多肽具有约6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中任一个的pI。
通常用重组技术来产生待用通过本文所述方法清洗的可重复利用的层析材料纯化的多肽。用于产生重组蛋白质的方法描述于例如美国专利号5,534,615和4,816,567中，该专利在此明确引入作为参考。在一些实施方案中，在CHO细胞中产生目的蛋白质(参见例如WO 94/11026)。在使用重组技术时，多肽可以在胞内、在周质间隙中产生，或直接分泌进入培养基中。
可以从培养基或从宿主细胞裂解物回收待用通过本文所述方法清洗的可重复利用的层析材料纯化的多肽。可以通过多种物理或化学手段来破碎用于表达多肽的细胞，如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。如果多肽在胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤来去除颗粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌周质间隙的多肽的方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌进入培养基中时，通常先用市售多肽浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含诸如PMSF的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白质水解，且可以包含抗生素来阻止外来污染物的生长。
可以用通过本文所述方法清洗的可重复利用的层析材料纯化的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫黏附素、抗体、酶、激素、融合蛋白质、包含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子和白细胞介素。多肽的实例包括但不限于哺乳动物蛋白质，如，例如肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、组织因子和von Willebrands因子；抗凝血因子，如C蛋白；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节活化正常T-细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白，如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；酶；微生物蛋白质，如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，如CTLA-4；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；A蛋白或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子，如NGF-b；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；细胞因子；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，即包含两种或多种异源多肽或其片段且由重组核酸编码的多肽；包含Fc的多肽，例如，包含与第二多肽融合的免疫球蛋白Fc区或其片段的融合蛋白质；免疫结合物；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，例如AIDS被膜的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，如CA125(卵巢癌抗原)或HER2、HER3或HER4受体；免疫黏附素；上列蛋白质中任一种的片段和/或变体；以及与包括例如上列蛋白质中任一种的蛋白质结合的抗体，包括抗体片段。
(A)抗体
在本文所述方法中任一种的一些实施方案中，可以用通过本文所述方法清洗的可重复利用的层析材料纯化的多肽(例如第一多肽、第二多肽或任意后续多肽)是抗体。
抗体的分子靶标包括CD蛋白及其配体，如，但不限于：(i)CD3、CD4、CD8、CD19、CD11a、CD20、CD22、CD34、CD40、CD79α(CD79a)和CD79β(CD79b)；(ii)ErbB受体家族的成员，如EGF受体，HER2、HER3或HER4受体；(iii)细胞黏附分子，如LFA-1、Mac1、p150,95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；(iv)生长因子，如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；C蛋白、BR3、c-met、组织因子、β7等；及(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(TAA)，如美国专利号7,521,541中所述的那些。
其他示例性抗体非限制性地包括选自以下的那些：抗-雌激素受体抗体、抗-孕酮受体抗体、抗-p53抗体、抗-HER-2/neu抗体、抗-EGFR抗体、抗-组织蛋白酶D抗体、抗-Bcl-2抗体、抗-E-钙黏蛋白抗体、抗-CA125抗体、抗-CA15-3抗体、抗-CA19-9抗体、抗-c-erbB-2抗体、抗-P-糖蛋白抗体、抗-CEA抗体、抗-成视网膜细胞瘤蛋白抗体、抗-ras癌蛋白抗体、抗-Lewis X抗体、抗-Ki-67抗体、抗-PCNA抗体、抗-CD3抗体、抗-CD4抗体、抗-CD5抗体、抗-CD7抗体、抗-CD8抗体、抗-CD9/p24抗体、抗-CD10抗体、抗-CD11a抗体、抗-CD11c抗体、抗-CD13抗体、抗-CD14抗体、抗-CD15抗体、抗-CD19抗体、抗-CD20抗体、抗-CD22抗体、抗-CD23抗体、抗-CD30抗体、抗-CD31抗体、抗-CD33抗体、抗-CD34抗体、抗-CD35抗体、抗-CD38抗体、抗-CD41抗体、抗-LCA/CD45抗体、抗-CD45RO抗体、抗-CD45RA抗体、抗-CD39抗体、抗-CD100抗体、抗-CD95/Fas抗体、抗-CD99抗体、抗-CD106抗体、抗-泛素抗体、抗-CD71抗体、抗-c-myc抗体、抗-细胞角蛋白抗体、抗-波形蛋白抗体、抗-HPV蛋白抗体、抗-κ轻链抗体、抗-λ轻链抗体、抗-黑素体抗体、抗-前列腺特异性抗原抗体、抗-S-100抗体、抗-tau抗原抗体、抗-纤维蛋白抗体、抗-角蛋白抗体和抗-Tn抗原抗体。
(i)多克隆抗体
在一些实施方案中，该抗体是多克隆抗体。优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来在动物中制备多克隆抗体。用双功能剂或衍生剂(例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基)将相关抗原与在待免疫的物种中具有免疫原性的多肽(例如匙孔槭血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可以是有用的。
通过将例如100μg或5μg的多肽或缀合物(分别对于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂组合，并在多个部位皮内注射该溶液来针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫动物。一个月后，通过在多个部位皮下注射来用弗氏完全佐剂中的初始量的1/5至1/10的肽或缀合物加强免疫动物。7至14天后，对动物进行采血，并测定血清的抗体效价。加强免疫动物，直至效价平台期。在一些实施方案中，用同一抗原的缀合物加强免疫动物，但该抗原与不同的多肽缀合和/或通过不同的交联剂缀合。缀合物还可以作为多肽融合物在重组细胞培养物中制备。另外，适宜地用诸如明矾的聚集剂来增强免疫应答。
(ii)单克隆抗体
在一些实施方案中，在通过本发明的方法清洗的可重复利用的层析材料上纯化的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上同质的抗体的群体，即除在产生单克隆抗体的过程中出现的可能的变体(这类变体通常以较小的量存在)外，包含该单个抗体的群体是相同的和/或结合相同的表位。因此，修饰词“单克隆的”指抗体不是不相关抗体的混合物或多克隆抗体的特征。
例如，单克隆抗体可以用最先由Kohler等,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤法制备，或者可以通过重组DNA法制备(美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤法中，按本文所述免疫小鼠或其他适宜的宿主动物(如仓鼠)来引诱淋巴细胞，该淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合用于免疫的多肽的抗体。备选地，可以体外免疫淋巴细胞。然后用适宜的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,59-103页(AcademicPress,1986))。
将这样制备的杂交瘤细胞接种和培养在适宜的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止缺乏HGPRT的细胞生长。
在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞是高效融合、通过所选择的产抗体细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对诸如HAT培养基的培养基敏感的那些。在这些中，在一些实施方案中，该骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如可从索尔克细胞销售中心(Salk InstituteCell Distribution Center),San Diego,California，美国获得的衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection),Rockville,Maryland，美国获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还针对人单克隆抗体的产生描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤(heteromyeloma)细胞系(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications 51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987))。
针对抗该抗原的单克隆抗体的产生测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基。在一些实施方案中，通过免疫沉淀或通过诸如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的体外结合测定来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可以例如通过Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。
鉴定出产生具有希望得到的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释法亚克隆该克隆，并通过标准方法培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103页(Academic Press,1986))。适合用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可以在动物中作为腹水肿瘤体内培养该杂交瘤细胞。
通过常规免疫球蛋白纯化方法(例如多肽A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)适宜地从培养基、腹水或血清分离该亚克隆分泌的单克隆抗体。
编码该单克隆抗体的DNA易于用常规方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施方案中，该杂交瘤细胞可作为这种DNA的来源。一旦分离，即可以将该DNA放入表达载体中，然后将该表达载体转染入诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其他方式产生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤细胞的宿主细胞中，以获得单克隆抗体在该重组宿主细胞中的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,Curr.Opinion inImmunol.5:256-262(1993)和Plückthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。
在另一实施方案中，可以从用描述于McCafferty等,Nature348:552-554(1990)中的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等,Nature 352:624-628(1991)和Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠抗体和人抗体。随后的出版物描述了通过链改组产生高亲和力(nM范围)人抗体(Marks等,Bio/Technology 10:779-783(1992))，以及作为构建非常大的噬菌体文库的策略的组合感染和体内重组(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是除传统单克隆抗体杂交瘤技术之外用于分离单克隆抗体的可行的选择。
还可以例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等,Proc.Natl Acad.Sci.USA 81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列共价连接来修饰DNA。
通常，这类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定区，或者它们取代抗体的一个抗原结合部位的可变结构域来产生嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原结合部位和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合部位。
在本文所述任意方法中的一些实施方案中，该抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。在一些实施方案中，该抗体是IgG单克隆抗体。
(iii)人源化抗体
在一些实施方案中，该抗体是人源化抗体。本领域中已描述了用于人源化非人抗体的方法。在一些实施方案中，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变结构域。基本上可以按照Winter及其同事的方法(Jones等,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science 239:1534-1536(1988))，通过用高变区序列取代对应的人抗体序列来进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中用对应的来自非人物种的序列取代了基本上少于完整的人可变结构域。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中用来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代了一些高变区残基，且可能取代一些FR残基。
用于产生人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对降低抗原性非常重要。按照所谓的“最佳适合”法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后接受最接近于啮齿动物序列的人序列作为该人源化抗体的人构架区(FR)(Sims等,J.Immunol.151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.196:901(1987))。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列的特定构架区。同一构架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285(1992)；Presta等,J.Immnol.151:2623(1993))。
保留对抗原的高亲和力和其他有利的生物学特性来人源化抗体也很重要。为了达到此目的，在该方法的一些实施方案中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常可得，并为本领域技术人员所熟悉。说明和显示所选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序也可得。这些显示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列选择和组合FR残基，使得达到希望得到的抗体特征，如增加的对一种或多种靶抗原的亲和力。通常，高变区残基直接且最实质性地涉及影响抗原结合。
(v)人抗体
在一些实施方案中，该抗体是人抗体。作为人源化之外的选择，可以产生人抗体。例如，现在可能产生转基因动物(例如小鼠)，其在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的所有组成成分。例如，已描述了嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转入这类种系突变体小鼠将导致在抗原攻击时产生人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature362:255-258(1993)；Bruggermann等,Year in Immuno.7:33(1993)；及美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。
备选地，可以用噬菌体展示技术(McCafferty等,Nature 348:552-553(1990))来在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体V结构域基因符合读框地克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外被多肽基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行；它们的综述参见例如Johnson,Kevin S.和Chiswell,David J.,Current Opinion inStructural Biology 3:564-571(1993)。可以将V基因区段的几个来源用于噬菌体展示。Clackson等,Nature352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠的脾的V基因的小的随机组合文库分离了一系列多样化的抗-恶唑酮抗体。可以构建来自未免疫的人供体的V基因库，且可以基本上按照Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffith等,EMBO J.12:725-734(1993)所述的技术分离抗一系列多样化抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
还可以通过体外活化B细胞来产生人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
(v)抗体片段
在一些实施方案中，该抗体是抗体片段。已发展了多种技术来产生抗体片段。通常，通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)和Brennan等,Science 229:81(1985))。但是，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。备选地，可以从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，并化学偶联来形成F(ab’)2片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。用于产生抗体片段的其他技术对熟练的从业者而言显而易见。在其他实施方案中，所选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。抗体片段还可以是描述于例如美国专利号5,641,870中的“线性抗体”。这类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。
在一些实施方案中，提供本文所述的抗体的片段。在一些实施方案中，该抗体片段是抗原结合片段。在一些实施方案中，该抗原结合片段选自Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、Fv和双抗体。
(vi)双特异性抗体
在一些实施方案中，该抗体是双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可以结合两个不同表位。备选地，双特异性抗体结合臂可以与结合白细胞上的触发分子(如T细胞受体分子(例如CD2或CD3)，或IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))的臂组合，以将细胞防御机制集中于该细胞。双特异性抗体可以作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)制备。
用于产生双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统产生基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性(Millstein等,Nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四价体杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤进行)非常麻烦，且产物产率低。WO93/08829和Traunecker等,EMBO J.,10:3655-3659(1991)中公开了类似的方法。
根据不同的方法，将具有希望得到的结合特异性(抗体-抗原结合部位)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在一些实施方案中，该融合是与包含至少部分铰链区、CH2区和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在一些实施方案中，包含轻链结合所必需的部位的第一重链恒定区(CH1)存在于该融合的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合和(如果希望)免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入适宜的宿主生物。在将不等比例的三条多肽链用于构建提供最佳产率时，这为在实施方案中调整三个多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。但是，在表达等比例的至少两种多肽链导致高产率时，或在该比例无特殊意义时，可能将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
在此方法的一些实施方案中，该双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此不对称结构便于从不想要的免疫球蛋白链组合分离希望得到的双特异性化合物，因为免疫球蛋白轻链仅存在于该双特异性分子的一半中提供了容易的分离方式。此方法公开于WO 94/04690中。产生双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methods inEnzymology 121:210(1986)。
根据美国专利号5,731,168中所述的另一种方法，可以改造抗体分子对间的界面来最大化从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比。在一些实施方案中，该界面包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在此方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一抗体分子的界面的一个或多个小的氨基酸侧链。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大的氨基酸侧链来在第二抗体分子的界面上产生与该一个或多个大的侧链相同或相似大小的补偿“凹陷”。这提供了增加异二聚体的产率超过其他不想要的终产物(如同二聚体)的机制。
双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一种与生物素偶联。例如，已提出这类抗体将免疫系统细胞靶向至不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)。可以用任意方便的交联方法产生异缀合物抗体。适宜的交联剂为本领域公知，并连同许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
还已在文献中描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以用化学连接制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)描述了蛋白酶解切割完整抗体来产生F(ab’)2片段的方法。在二巯基络合剂亚砷酸钠的存在下还原这些片段，以稳定邻位二巯基并阻止分子间二硫化物形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸盐(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原来将Fab’-TNB衍生物之一再转化为Fab’-巯基，并与等摩尔量另一Fab’-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。可以将产生的双特异性抗体用作用于选择性固定酶的试剂。
还已描述了用于直接从重组细胞培养物产生和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab’部分连接。在铰链区还原抗体同二聚体形成单体，然后再氧化形成抗体异二聚体。还可以利用此方法来产生抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)所述的“双抗体”技术提供了用于产生双特异性抗体片段的备选机制。片段包含通过接头与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)，该接头太短而不允许同一条链上的两个结构域间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一片段的互补的VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合部位。还已报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体来产生双特异性抗体片段的另一策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。
考虑超过二价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。
(vii)多价抗体
在一些实施方案中，该抗体是多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快地被表达该抗体所结合的抗原的细胞内化(和/或分解代谢)。本文提供的抗体可以是(除IgM种类外的)具有三个或多个抗原结合部位的多价抗体(例如四价抗体)，其可以容易地通过重组表达编码该抗体的多肽链的核酸来制备。该多价抗体可以包含二聚化结构域和三个或多个抗原结合部位。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在这种情况下，该抗体将包含Fc区及Fc区氨基端的三个或多个抗原结合部位。本文优选的多价抗体包含三个至约八个，但优选四个抗原结合部位(或由三个至约八个，但优选四个抗原结合部位组成)。该多价抗体包含至少一条多肽链(且优选两条多肽链)，其中该一条或多条多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，该一条或多条多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽连，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，该一条或多条多肽链可以包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两条(且优选四条)轻链可变结构域多肽。例如，本文的多价抗体可以包含约两条至约八条轻链可变结构域多肽。此处考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且可选地进一步包含CL结构域。
在一些实施方案中，该抗体是多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于：包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VHVL单位具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH结构域的抗体，每个VHVL单位结合不同的表位；具有两个或多个单可变结构域的抗体，每个单可变结构域结合不同的表位；全长抗体；抗体片段如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体、三链抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施方案中，该抗体具有多表位特异性；例如，特异性结合相同或不同靶标上的两个或多个不同表位的能力。在一些实施方案中，该抗体是单特异性的；例如，仅结合一个表位的抗体。根据一个实施方案，该多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合各表位的IgG抗体。
(viii)其他抗体修饰
可以希望就效应子功能修饰本文提供的抗体，例如，以增强该抗体的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或依赖补体的细胞毒性(CDC)。这可以通过在该抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来达到。备选地，或此外，可以在Fc区中引入一个或多个半胱氨酸残基，从而允许在此区域中形成链间二硫键。这样产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。参见Caron等,J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.,Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以用Wolff等,Cancer Research53:2560-2565(1993)中所述的异双功能交联剂来制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体。备选地，可以改造抗体，使其具有双Fc区，从而可以具有增强的补体介导的裂解和ADCC能力。参见Stevenson等,Anti-CancerDrug Design 3:219-230(1989)。
为了增加抗体的血清半衰期，可以按US 2006/0067930中所述在抗体中产生氨基酸改变，该专利在此以其整体引入作为参考。
(B)多肽变体和修饰
本文所述的多肽(包括抗体)的一个或多个氨基酸序列修饰可以用于通过本文所述方法清洗的可重复利用的层析材料。
(i)变体多肽
本文定义的“多肽变体”意指与该多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性的多肽，优选活性多肽。这类多肽变体包括例如这样的多肽，其中在全长天然氨基酸序列的N端或C端添加或缺失了一个或多个氨基酸残基。通常，TAT多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列、有信号肽或无信号肽的多肽胞外域具有至少约80％氨基酸序列同一性，备选地，具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％中任一个的氨基酸序列同一性。可选地，与天然多肽序列相比，变体多肽将具有不超过一个保守氨基酸取代，备选地，与天然多肽序列相比，具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一个的保守氨基酸取代。
例如与全长天然多肽相比，变体多肽可以在N端或C端截短，或者可以缺乏内部残基。某些变体多肽可以缺乏并非希望得到的生物学活性所必需的氨基酸残基。可以通过许多常规技术中的任一种来制备这些具有截短、缺失和插入的变体多肽。可以化学合成希望得到的变体多肽。另一适宜的技术涉及通过聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码希望得到的变体多肽的核酸片段。在PCR中的5’和3’引物上利用定义希望得到的核酸片段末端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文公开的天然多肽共有至少一种生物学和/或免疫学活性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至包含一百或更多个残基的多肽的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端蛋氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N端或C端与增加该抗体的血清半衰期的酶或多肽的融合。
例如，可以希望改善多肽的结合亲和力和/或其他生物学特性。通过在抗体核酸中引入适当的核苷酸改变或通过肽合成来制备多肽的氨基酸序列变体。这类修饰包括例如从多肽的氨基酸序列内缺失残基，和/或在多肽的氨基酸序列内插入残基，和/或取代多肽的氨基酸序列内的残基。产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终构建体，只要该最终构建体具有希望得到的特征。氨基酸改变还可以改变多肽(例如抗体)的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。
通过将多肽的序列与已知的同源多肽分子的序列相比较，并最小化在高同源性区域中产生的氨基酸序列改变的数目，可以发现确定可以插入、取代或缺失哪一个氨基酸残基而不负面影响希望得到的活性的指导。
如Cunningham和Wells,Science 244:1081-1085(1989)所述，用于鉴定多肽(例如抗体)的某些残基或区域作为优选的诱变位置的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定残基或靶残基组(例如带电荷残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并用中性氨基酸或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在取代位点或针对取代位点引入进一步的变体或其他变体来精炼对取代显示功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然预先确定引入氨基酸序列变异的位点，但无需预先确定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点上的突变的表现，在靶密码子或靶区域处进行丙氨酸扫描或随机诱变，并针对希望得到的活性筛选所表达的抗体变体。
另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对取代诱变而言，最有意义的位点包括高变区，但也考虑FR改变。下文表1在“优选的取代”的标题下显示保守取代。如果这类取代导致生物学活性的改变，则可以引入表1中命名为“示例性取代”或如下文参考氨基酸种类进一步描述的更实质性的改变，并筛选产物。
表1.示例性氨基酸取代
原残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
通过选择这样的取代来达到多肽的生物学特性的实质性修饰，该取代在其对维持以下的作用上显著不同：(a)取代区域的多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象；(b)该分子在靶位点处的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。可以根据其侧链性质的相似性来分组氨基酸(在A.L.Lehninger,Biochemistry第2版,73-75页,Worth Publishers,纽约(1975)中)：
(1)非极性氨基酸：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)；
(2)不带电荷的极性氨基酸：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)；
(3)酸性氨基酸：Asp(D)、Glu(E)；
(4)碱性氨基酸：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。
备选地，可以根据共同的侧链特性来对天然存在的残基进行分组：
(1)疏水性氨基酸：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性氨基酸：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性氨基酸：Asp、Glu；
(4)碱性氨基酸：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族氨基酸：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代必需将这些种类之一的成员换为另一种类。
还可以取代(通常用丝氨酸)不涉及维持抗体的正确构象的任意半胱氨酸残基来改善该分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可以向多肽中加入一个或多个半胱氨酸键来改善其稳定性(尤其是在该抗体是诸如Fv片段的抗体片段时)。
尤其优选的取代变体的类型涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，相对于它们所产生自的亲本抗体，所得到的选择用于进一步研发的一个或多个变体将具有改善的生物学特性。用于产生这类取代变体的方便的方式涉及使用噬菌体展示的亲和力成熟。简言之，突变几个高变区位点(例如6-7个位点)来产生各位点上所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体作为与包装在各颗粒内的M13的基因III产物的融合以单价形式从丝状噬菌体颗粒展示。然后按照本文所公开针对它们的生物学活性(例如结合亲和力)筛选噬菌体展示的变体。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定显著促成抗原结合的高变区残基。备选地，或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和靶标之间的接触点可以是有益的。这类接触残基和邻近残基是按照本文所述技术进行取代的候选残基。一旦产生这类变体，即可以按照本文所述对该系列变体进行筛选，并选择在一项或多项相关测定中具有较优特性的抗体用于进一步研发。
多肽的另一类氨基酸变体改变抗体的初始糖基化模式。多肽可以包含非氨基酸部分。例如，多肽可以是糖基化的。这种糖基化可以在在宿主细胞或宿主生物中表达多肽的过程中天然发生，或者可以是源自人为干预的故意修饰。改变意指缺失一个或多个见于该多肽中的糖类部分，和/或加入一个或多个不存在于该多肽中的糖基化位点。
多肽的糖基化通常是N联糖基化或O联糖基化。N联糖基化指糖类部分附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任意氨基酸)是糖类部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，这些三肽序列中的任一个在多肽中的存在将产生潜在的糖基化位点。O联糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列，使得它包含一个或多个上述三肽序列(对于N联糖基化位点)来方便地达到在多肽中加入糖基化位点。还可以通过向初始抗体的序列中加入一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代初始抗体的序列来产生改变(对于O联糖基化位点)。
可以通过化学方法或酶促方法或通过编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子的突变取代来达到去除存在于多肽上的糖类部分。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来达到多肽上的糖类部分的酶促切割。
其他修饰包括分别脱酰胺化谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基为对应的谷氨酰和天东氨酰残基，羟化脯氨酸和赖氨酸，磷酸化丝氨酰或苏氨酰残基的羟基，甲基化赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基，乙酰化N端胺，及酰胺化任意C端羧基。
(ii)嵌合多肽
可以以形成嵌合分子的方式修饰本文所述的多肽，该嵌合分子包含与另一异源多肽或氨基酸序列融合的多肽。在一些实施方案中，嵌合分子包含多肽与标记多肽的融合，该标记多肽提供抗-标记抗体可以选择性结合的表位。该表位标记通常放置在多肽的氨基端或羧基端。可以用抗该标记多肽的抗体来检测这类表位标记形式的多肽的存在。另外，表位标记的提供使得能够使用抗-标记抗体或另一类结合该表位标记的亲和基质，通过亲和纯化容易地纯化该多肽。
在备选实施方案中，该嵌合分子可以包含多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定区域的融合。该嵌合分子的二价形式称为“免疫黏附素”。
本文所用的术语“免疫黏附素”指抗体样分子，其将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合。在结构上，免疫黏附素包含不同于抗体的抗原识别和结合部位(即“异源的”)的具有希望得到的结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。免疫黏附素分子的黏附素部分通常是至少包含受体或配体的结合部位的连续的氨基酸序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以获自任意免疫球蛋白，如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型、IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。
Ig融合优选包含用可溶(跨膜结构域缺失或失活)形式的多肽取代Ig分子内的至少一个可变区。在尤其优选的实施方案中，该免疫球蛋白融合包含IgG1分子的铰合部、CH2和CH3，或铰合部、CH1、CH2和CH3区。
(iii)多肽缀合物
用于多肽制剂中的多肽可以与诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的具有酶活性的毒素，或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)的细胞毒剂缀合。
可以使用用于产生这类缀合物的化疗剂。此外，可以使用的具有酶活性的毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒A蛋白链、相思豆毒A蛋白链、塑莲根毒蛋白II A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白质、香石竹毒蛋白蛋白质、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、米托洁林(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。可获得多种放射性核素用于产生放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。用多种双功能蛋白质偶联剂产生多肽和细胞毒剂的缀合物，如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚胺基硫烷(IT)、亚胺酯的双功能衍生物(如己二酰亚氨酸二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、二-叠氮基化合物(如二(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、二-重氮基衍生物(如二-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以按Vitetta等,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳14标记的3-甲基二乙烯三胺五乙酸1-异硫氰基苄酯(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与多肽缀合的示例性螯合剂。
本文还考虑多肽和一种或多种小分子毒素(如棘孢霉素、美登木素生物碱、单端孢霉烯和CC1065及这些毒素的具有毒素活性的衍生物)的缀合物。
美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)。随后发现某些微生物也产生美登木素生物碱，如美登木醇和C-3美登木醇酯。还考虑合成的美登木醇及其衍生物和类似物。存在许多本领域已知的用于制备多肽-美登木素生物碱缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开的那些。该连接基团包括上述专利中所公开的二硫基、硫醚基、酸敏感基团、光敏感基团、肽酶敏感基团或酯酶敏感基团，优选二硫基和硫醚基。
取决于连接类型，接头可以在多种位置附着于美登木素生物碱分子。例如，可以使用常规偶联技术，通过与羟基反应来形成酯键。该反应可以发生在具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位和具有羟基的C-20位。在优选实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位形成连接。
另一目的缀合物包含与一个或多个棘孢霉素分子缀合的多肽。棘孢霉素家族的抗生素能够以低于皮摩尔的浓度产生双链DNA断裂。棘孢霉素家族的缀合物的制备参见例如美国专利号5,712,374。可以使用的棘孢霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰-γ1 I、PSAG和θ1 I。抗体可以缀合的另一抗肿瘤药物是抗叶酸剂QFA。棘孢霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易跨过质膜。因此，细胞通过多肽(例如抗体)介导的内化作用摄取这些药物大幅增强了的它们的细胞毒效应。
可以与本文所述多肽缀合的其他抗肿瘤剂包括BCNU、链脲菌素、长春花新碱和5-氟尿嘧啶(统称为LL-E33288复合体的药物家族)，以及埃斯波霉素(esperamicin)。
在一些实施方案中，该多肽可以是多肽和具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)间的缀合物。
还在另一实施方案中，该多肽(例如抗体)可以与“受体”(如链霉抗生物素蛋白)缀合用于肿瘤预寻靶，其中对患者施用该多肽受体缀合物，然后用清除剂从循环去除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。
在一些实施方案中，该多肽可以与前体药物活化酶缀合，该前体药物活化酶将前体药物(例如肽基化疗剂)转化为活性抗癌药物。该免疫缀合物的酶成分包括任意酶，该酶能够以这样的方式作用于前体药物，以将该前体药物转化为它的更具活性的细胞毒性形式。
有用的酶包括但不限于：用于将包含磷酸酯的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；用于将包含硫酸酯的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒性的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；用于将包含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如serratia蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；用于转化包含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；用于将糖基化的前体药物转化为游离药物的糖切割酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；用于将用β-内酰胺衍生化的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；及青霉素酰胺酶，如用于将分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基在其氨基氮处衍生化的药物转化为游离药物的青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。备选地，可以用具有酶活性的抗体(在本领域中也称为“抗体酶”)来将前体药物转化为游离活性药物。
(iv)其他
多肽的另一类共价修饰包括将多肽与多种非蛋白质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。多肽还可以包载在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素微囊或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗滴乳状液中。这类技术公开于Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Gennaro,A.R.,编辑,(1990)中。
IV.获得用于制剂和方法的多肽
可以用本领域公知的方法(包括重组方法)获得待用通过本文所述的方法清洗的可重复利用的层析材料纯化的多肽。以下章节提供关于这些方法的指导。
(A)多核苷酸
在本文中可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”指任意长度的核苷酸聚合物，且包括DNA和RNA。
编码多肽的多核苷酸可以获自任意来源，包括但不限于从被认为具有该多肽mRNA并以可检测的水平表达它的组织制备的cDNA文库。因此，编码多肽的多核苷酸可以方便地获自从人组织制备的cDNA文库。还可以从基因组文库或通过已知的合成方法(例如自动化核酸合成)获得编码多肽的基因。
例如，该多核苷酸可以编码整条免疫球蛋白分子链，如轻链或重链。完整的重链不仅包括重链可变区(VH)，还包括重链恒定区(CH)，该重链恒定区通常将包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3，及“铰链”区。在一些情况下，希望存在恒定区。
可以由多核苷酸编码的其他多肽包括结合抗原的抗体片段，如单结构域抗体(“dAb”)、Fv、scFv、Fab’和F(ab’)2及“微抗体”。微抗体(通常)是已从其切除了CH1和CK或CL结构域的二价抗体片段。由于微抗体比常规抗体小，它们应在临床/诊断使用中达到更好的组织穿透，但由于是二价，它们应保持比单价抗体片段(如dAb)高的结合亲和力。因此，除非文中另有说明，本文所用的术语“抗体”不仅涵盖全抗体分子，还涵盖上文所讨论的类型的结合抗原的抗体片段。优选地，相对于对应的人受体构架，存在于所编码的多肽中的每个构架区将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，相对于受体构架区，该构架区可以包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。
适宜地，可以分离和/或纯化本文所述的多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸是分离的多核苷酸。
术语“分离的多核苷酸”旨在表明该分子已从它的正常或天然环境移出或分离，或已以这样的方式产生，使得它不存在于它的正常或天然环境中。在一些实施方案中，该多核苷酸是纯化的多核苷酸。术语纯化的旨在表明至少已移出了一些污染分子或物质。
适宜地，该多核苷酸是基本上纯化的，使得相关多核苷酸构成存在于组合物中的优势(即丰度最高)多核苷酸。
(B)多核苷酸的表达
以下描述主要涉及通过培养用包含编码多肽的多核苷酸的载体转化或转染的细胞来产生多肽。当然，考虑可以利用本领域公知的备选方法来制备多肽。例如，可以使用固相技术(参见例如Stewart等,Solid-Phase Peptide Synthesis W.H.Freeman Co.,SanFrancisco,Calif.(1969)；Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154(1963))，通过直接肽合成来产生适当的氨基酸序列或其部分。可以使用手动技术或通过自动化来进行体外蛋白质合成。可以例如使用厂家的说明书用Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,Calif.)来达到自动化合成。可以分别化学合成多肽的多种部分并用化学方法或酶促方法组合来产生希望得到的多肽。
将本文所述的多核苷酸插入用于产生多肽的一个或多个表达载体中。术语“控制序列”指在特定宿主生物中表达有效连接的编码序列所必需的DNA序列。控制序列包括但不限于启动子(例如天然相关的启动子或异源启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。
在将它置于与另一多核苷酸序列的功能关系中时，多核苷酸“有效连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的核酸表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的核酸有效连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列有效连接；或者，如果放置核糖体结合位点以便于翻译，则它与编码序列有效连接。通常，“有效连接”意指所连接的核酸序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下是连续且符合读框的。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制位点处连接来达到连接。如果这类位点不存在，则按照常规实施使用合成的寡核苷酸衔接物或接头。
对于抗体，可以将轻链和重链克隆在相同或不同的表达载体中。编码免疫球蛋白链的核酸区段与该一个或多个表达载体中确保免疫球蛋白多肽的表达的控制序列有效连接。
可以通过公知的方法将包含多核苷酸序列(例如可变重链和/或可变轻链编码序列和可选的表达控制序列)的载体转入宿主细胞中，该方法取决于细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂转染、生物射弹或基于病毒的转染可以用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Press,第2版,1989)。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。对于转基因动物的产生，转基因可以显微注射入受精的卵母细胞，或者可以掺入胚胎干细胞的基因组，并将这类细胞的细胞核转入去核的卵母细胞。
(C)载体
术语“载体”包括表达载体和转化载体和穿梭载体。
术语“表达载体”意指能够在体内或在体外表达的构建体。
术语“转化载体”意指能够从一个实体转移至另一实体(其可以属于该物种或可以属于不同物种)的构建体。如果构建体能够从一个物种转移至另一物种(如从大肠杆菌质粒至如芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌)，则有时将该转化载体称为“穿梭载体”。它甚至可以是能够从大肠杆菌质粒转移至土壤杆菌属(Agrobacterium)至植物的构建体。
可以将载体转化入下文所述的适宜宿主细胞来提供多肽的表达。多种载体是公开可得的。载体可以是例如质粒、黏粒、病毒颗粒或噬菌体的形式。可以通过多种方法来将适当的核酸序列插入载体中。通常，用本领域已知的技术将DNA插入一个或多个适当的限制性内切核酸酶位点。包含一种或多种这些成分的适宜载体的构建利用技术人员已知的标准连接技术。
载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，其提供复制起点，可选地提供用于表达该多核苷酸的启动子，且可选地提供该启动子的调节基因。载体可以包含一个或多个本领域公知的选择标记基因。
这些表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的有机部分在宿主生物中复制。
(D)宿主细胞
宿主细胞可以是例如细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
可以用已进行了遗传操作的转基因多细胞宿主生物来产生多肽。该生物可以是例如转基因哺乳动物生物(例如转基因山羊或小鼠品系)。
适宜的原核生物包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌。多种大肠杆菌菌株是公开可得的，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31,446)、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC27,325)和K5 772(ATCC 53,635)。其他适宜的原核宿主细胞包括肠杆菌科，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(如地衣芽孢杆菌41P)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌；和链霉菌属(Streptomyces)。这些实例是说明性的而不是限制性的。菌株W3110是尤其优选的宿主或亲本宿主，因为它是进行重组多核苷酸产物发酵的常用宿主菌株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可以修饰菌株W3110来在编码宿主内源多肽的基因中产生遗传突变，这类宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整基因型tonA；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整基因型tonA ptr3；大肠杆菌W3110菌株27C7(ATCC 55,244)，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompTkan'；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169degP ompT rbs7ilvG kan'；大肠杆菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6；及具有突变周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。备选地，体外克隆方法，例如PCR或其他核酸聚合酶反应是适宜的。
可以在这些原核宿主中制备通常将包含与该宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)的表达载体。此外，将存在任意数目的多种公知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常将可选地用操纵基因序列控制表达，且具有用于起始和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。
可以用真核微生物来进行表达。诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于编码多肽的载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是常用的低等真核宿主微生物。其他宿主包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)(MW98-8C、CBS683、CBS4574)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)；和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。甲基营养酵母在本文中是适宜的，且包括但不限于选自汉森酵母属(Hansenula)、假丝酵母属、克勒克酵母属(Kloeckera)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和红酵母属(Rhodotorula)的能够在甲醇上生长的酵母。酵母属是优选的酵母宿主，适宜的载体具有希望的表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。
除微生物外，还可以用哺乳动物组织细胞培养物来表达和产生本文所述的多肽，且在一些情况下是优选的(参见Winnacker,From Genes to Clones VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987))。对于一些实施方案，可以优选真核细胞，因为本领域已开发了许多适宜的能够分泌异源多肽(例如完整的免疫球蛋白)的宿主细胞系，且包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一些实施方案中，该哺乳动物宿主细胞是CHO细胞。
在一些实施方案中，该宿主细胞是脊椎动物宿主细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或为在悬浮培养物中生长而亚克隆的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO或CHO-DP-12细胞系)；小鼠支持细胞；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。
V.示例性实施方案
在一些实施方案中，本发明提供以下：
1.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟至约30分钟范围内的时间；c)使约2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2个或多个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13。
2.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约4个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13。
3.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.9；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；和d)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；f)使约2.5个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
4.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl，且为约pH 7.1；b)静态保持该材料在平衡缓冲液中约30分钟；c)使约2个材料体积的平衡缓冲液通过该材料；d)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.8；e)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约30分钟；f)使约2个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；g)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含0.1NNaOH、pH 13；h)静态保持该材料在再生缓冲液中约30分钟；i)使约2个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
5.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约4个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约25mM Tris和约25mM NaCl，且为约pH 7.1；b)进行包含以下步骤的6个循环：i)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.8；ii)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约10分钟；iii)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；iv)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13；v)静态保持该材料在再生缓冲液中约10分钟；vi)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料。
6.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括以下步骤的6个循环：a)使约3个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料，其中该洗脱缓冲液包含约0.15M乙酸，且为约pH 2.8；b)静态保持该材料在洗脱缓冲液中约15分钟；c)使约1个材料体积的洗脱缓冲液通过该材料；d)使约3个材料体积的再生缓冲液通过该材料，其中该再生缓冲液包含约0.1N NaOH，且为约pH 13；e)静态保持该材料在再生缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的再生缓冲液通过该材料；g)使约3个材料体积的保存缓冲液通过该材料，其中该保存缓冲液包含约100mM乙酸钠、约2％苯甲醇，且为约pH5.0；e)静态保持该材料在保存缓冲液中约15分钟；f)使约1个材料体积的保存缓冲液通过该材料。
7.实施方案1-6中任一个的方法，其中该层析材料在层析柱中。
8.实施方案1-7中任一个的方法，其中该层析材料是亲和材料。
9.实施方案8的方法，其中该亲和材料是A蛋白亲和材料。
10.实施方案9的方法，其中该A蛋白亲和材料是MAbSelect材料、MAbSelect SuRe材料或MAbSelect SuRe LX材料。
11.实施方案1-10中任一个的方法，其中该层析材料用于大规模产生多肽。
12.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约3个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约40mM乙酸钠，且为约pH 5.5；b)使约2个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；c)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；d)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；和e)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；f)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料。
13.实施方案12的方法，其中该层析材料在层析柱中。
14.实施方案12或13的方法，其中该层析材料是离子交换材料。
15.实施方案14的方法，其中该离子交换材料是阳离子交换材料。
16.实施方案15的方法，其中该阳离子交换材料是POROS HS50材料。
17.实施方案12-16中任一个的方法，其中该层析材料用于大规模产生抗体。
18.清洗重复利用的层析材料的方法，该方法包括步骤：a)使约3个材料体积的平衡缓冲液通过该材料，其中该平衡缓冲液包含约50mM Tris、85mM乙酸钠，且为约pH 8.8和约8.6mS/cm；b)使约2个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；c)静态保持该材料在约0.5NNaOH中约10分钟；d)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料；和e)静态保持该材料在约0.5N NaOH中约10分钟；f)使约1个材料体积的约0.5N NaOH通过该材料。
19.实施方案18的方法，其中该层析材料在层析柱中。
20.实施方案18或19的方法，其中该层析材料是离子交换材料。
21.实施方案20的方法，其中该离子交换材料是阴离子交换材料。
22.实施方案21的方法，其中该阴离子交换材料是QSFF材料。
23.实施方案18-22中任一个的方法，其中该层析材料用于大规模产生抗体。
24.实施方案1-23中任一个的方法，其中该缓冲液按约30个材料体积/小时、约20个材料体积/小时或约15个材料体积/小时通过该材料。
25.实施方案1-24中任一个的方法，其中该缓冲液以下行方向或上行方向通过该材料。
26.实施方案1-25中任一个的方法，其中通过在清洗该层析材料后运行模拟洗脱来测量该层析材料的清洗。
27.实施方案26的方法，其中包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项的模拟洗脱的洗脱物指示多产物使用材料的有效清洗。
28.实施方案1-27中任一个的方法，其中该层析材料在碱中稳定。
29.实施方案1-28中任一个的方法，其中该层析材料用于纯化多肽。
30.实施方案1-29中任一个的方法，其中在纯化第一多肽后清洗该层析材料，且其中层析材料在该清洗后用于纯化第二多肽。
31.实施方案30的方法，其中该多肽是抗体或免疫黏附素。
32.实施方案31的方法，其中该多肽是免疫黏附素。
33.实施方案31的方法，其中该多肽是抗体。
34.实施方案33的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
35.实施方案34的方法，其中该单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
36.实施方案35的方法，其中该单克隆抗体是IgG单克隆抗体。
37.实施方案36的方法，其中该抗体是抗原结合片段。
38.实施方案37的方法，其中该抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双抗体或三链抗体。
39.实施方案38的方法，其中该多肽是酶、激素、融合蛋白质、含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子或白细胞介素。
40.实施方案30的方法，其中该第一多肽是第一抗体或第一免疫黏附素，该第二多肽是第二抗体或第二免疫黏附素。
本说明书中公开的所有特征可以以任意组合组合。本说明书中公开每一特征可以由用于相同、等同或相似目的的备选特征替换。因此，除非另有明确说明，所公开的每一特征仅是一系列等同或相似的特征的实例。
通过以下非限制性实施例来阐述本发明的其他细节。本说明书中所有参考文献的公开内容在此明确引入作为参考。
实施例
以下实施例旨在单纯示例本发明，因此不应认为以任何方式限制本发明。以下实施例和发明详述以说明的方式而不是以限制的方式提供。
实施例1.蛋白质携带
此实施例描述定量从样品至样品的蛋白质携带的努力，用标准A蛋白亲和材料(0.66×20cm)在实验室规模进行清洗前测试。此运行称为“模拟运行”，因为除用平衡缓冲液模拟上样循环外，按照标准纯化流程运行该方法。按照典型A蛋白方法收集洗脱库，并分析，以确定蛋白质的存在。分析显示，在缺乏任何附加的柱清洗的情况下，“模拟洗脱”中存在20-30ppm的蛋白质携带。用第二运行确认了该结果。
为了确定安全携带水平，进行了风险评估来确定mAb中可接受的免疫球蛋白(IgG)和蛋白质携带水平，并计算了IgG的物质特异性可接受日暴露量(ADE)。ADE与EDI相比较，得到“最坏情况”x倍安全限度(例如，参见2012年8月7日登陆的www.fda.gov/downloads/BiologicsBlood Vaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdf上的Product Approval Information Summary Basis of Approval5％.OCTAPHARMA Pharmazeutika:维也纳,奥地利，2002年8月)。“最坏情况”安全限度是所允许的来自之前的样品的IgG携带的最高值，将此值设为10μg mAb A/ml mAb B或1000ppm。在mAb A是携带的mAb，mAb B是希望得到的目的mAb时(Teschner,W.等,Vox Sang.2007,92:42-55；2012年8月7日登陆的www.google.com/url？sa＝t&rct＝j&q＝&esrc＝s&source＝web&cd＝1&ved＝0CE8Q FjAA&url＝http％3A％2F％2Fwww.fda.gov％2Fdownloads％2FDrugs％2F...％2FGuidances％2FUCM078932.pdf&ei＝f4QhUJv4K9Ov6gGQ-4DgAg&usg＝AFQjCNFbTE75U0nDbFpfdpxK85uWXT8frg上的Food and Drug Administration,HHS.Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose inInitial Clinical Trials for Therapeutics in Adult HealthyVolunteers.Rockville,MD.2005年7月；2012年8月7日登陆的www.ema.europa.eu/ema/index.jsp？curl＝pages/regulation/general/general_content_000431.jsp&mid＝WC0b01ac0580029593上的European Medicines Agency.Impurities:Residual Solvents,Note for Guidance on Impurities:Residual Solvents(CPMP/ICH/283/95).伦敦,英国，1997年9月；2012年8月7日登陆的www.fda.gov/downloads/BiologicsBlood Vaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm064955.pdf上的Product ApprovalInformation Summary Basis of Approval5％.OCTAPHARMAPharmazeutika:维也纳,奥地利，2002年8月)。
材料和方法
设备
AKTA explorer 100system：用来自GE Healthcare(Uppsala,瑞典)的标准explorer 100层析系统进行实验。用装填MabSelectTM SuRe(GE Healthcare)A蛋白介质的0.66cm直径×20cm床高柱(Omnifit)进行系统评价。用UNICORN软件(v 5.11)控制系统。亲和树脂：此项目中用MabSelectTM SuRe树脂(GE Healthcare,Uppsala,瑞士)作为所选择的树脂，因为它由刚性、高流速琼脂糖基质和碱稳定的A蛋白衍生配体组成。此配体提供了在用于原位清洗(CIP)流程的碱性条件下比常规基于A蛋白的介质更高的稳定性。可以用低成本试剂如氢氧化钠进行清洗，这可以帮助改善方法的经济性。
标准纯化流程(“模拟洗脱”)。用以下参数运行A蛋白循环：(a)具有30g/L树脂的载量的MabSelectTM SuRe树脂；(b)在15℃(12-18℃)(所有其他阶段在室温下)将所收获的细胞培养液(HCCF)上样在0.66×20cm柱上；(c)通过加入1.5M Tris碱来将库pH调节至pH5.0。所使用的缓冲液类似于用于分批方法的缓冲液。对于MabSelectTM SuRe，用25mM Tris和25mM氯化钠平衡柱，用0.4M磷酸钾洗涤，用0.1N乙酸(pH 2.9)洗脱，用0.1N氢氧化钠再生(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.2001,18:301-327；Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30:121-128；B.Kelley,Biotechnol.Prog.2007,23:995-1008；Trexlar-Schmidt,M.等,Biopharm.Intl.March 2,2009)。
缓冲液
使用以下缓冲液：
洗脱缓冲液：0.15M乙酸，pH 2.9
再生缓冲液：0.1M NaOH，pH 13
平衡缓冲液：25mM Tris，25mM NaCl，pH 7.1
保存缓冲液：100mM乙酸钠，2％苯甲醇，pH 5.0
清洗策略
按20CV/小时流速进行清洗流程。基于(a)pH循环和(b)静态保持时间两个因素开发清洗流程。
在无附加清洗的“模拟运行”中获得的清洗前的携带结果(20-30ppm)很好地低于通过风险评估设定的所确定的1000ppm的安全限度。但是，决定慎之又慎，因为临床制备的限度可低于1000ppm。本项目的目标是开发可以转移至临床制备的清洗流程；因此，鉴定清洗流程来将携带最小化至低于1ppm。在谨慎的优化之后，最佳清洗策略基于(a)静态保持和(b)pH循环。在清洗方法中加入静态保持流程允许在不使用额外缓冲液的情况下提供额外的保留时间。增加保留时间可能辅助质量转移，有效地将柱上的任何残留蛋白质提取入缓冲液。酸性和碱性缓冲液之间的改变称为pH循环，增强了蛋白质提取，从而有效地洗涤柱。最佳清洗条件包括已经用作洗脱和再生缓冲液的那些缓冲液。用于清洗的“洗脱缓冲液”为0.15M AcOH(pH 2.9)，“再生缓冲液”为0.1N NaOH(pH 13)。缓冲液的选择基于它们各自的特性。例如，用“洗脱缓冲液”(0.15M AcOH，pH 2.9)来从A蛋白树脂洗涤结合的IgG。氢氧化钠通过变性和将蛋白质切割为小片段来增溶蛋白质和核酸(产生过程的所有成分)。此外，氢氧化钠破坏内毒素，并再生树脂。由于这些条件没有一个与树脂不相容，且已经用于纯化内部(in house)mAb，它们的使用也是经济的。
树脂选择
选择MabSelectTM SuReA蛋白亲和树脂用于优化，因为它具有大的工作pH范围(pH3-12)，且在碱性条件下稳定，无结合能力丧失。因此，它与目前用于清洗的洗脱(0.15MAcOH)和再生(0.1N NaOH)缓冲液相容。
之前考察了其他树脂如vA。简言之，考察了几种不同的清洗剂来清洗vA柱。但是，大多数条件显示相似的表现。筛选多种缓冲液后进行标准纯化流程中所列的连续“模拟运行”，导致从样品至样品的蛋白质携带减少。提高洗脱流速也有效地清洗柱。此研究的主要发现是，与所测试的其他变量相比，静态保持和pH循环更显著地有助于减少蛋白质携带。虽然这些清洗流程中的一些确实减少了vA上的蛋白质携带，但该减少不足以保证其在中试规模或更大规模上的使用。然而，来自pH循环和静态保持实验的结果证明可用于优化MabSelectTM SuRe树脂上的清洗流程。
分析方法
用2.1×30cm POROS柱(Applied Biosystems,Foster City,CA)在Agilent1100HPLC(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上测定HCCF的抗体浓度。使用了缓冲液A(100mM磷酸钠、250mM氯化钠、pH 6.3)、缓冲液B(2％乙酸、100mM甘氨酸)和缓冲液C(0.1M磷酸、20％CAN(20％乙腈))，总运行时间为4.5分钟。用Agilent 8453(AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)分光光度计在280nm测量纯化库的蛋白质浓度。用多产物酶联免疫吸附测定法进行CHOP和浸出A蛋白分析。用TaqMan聚合酶链反应进行CHO DNA分析。用毛细管区带电泳/激光诱导荧光检测(CZE-LIF)测定测量总蛋白质。用一般ELISA测定测量完整抗体和片段化的抗体部分。在18％Tris-HCl凝胶上进行SDS/PAGE。
无清洗情况下的蛋白质携带的定量
用于测定mAb携带的实验流程如下：首先，按30g/L将18个上样循环的mAb上样至A蛋白亲和柱(0.66×20cm，体积＝6.8mL)上，并洗脱样品。随后按表2中所列的柱清洗流程之一清洗A蛋白亲和柱。清洗后，进行“模拟运行”。为了测定蛋白质或杂质携带的水平，在“模拟运行”期间的特定时间点或在柱洗涤流程期间采集分析样品。将所收集的分析样品调节至pH 5-5.5(1.5M Tris碱缓冲液)，然后用去垢剂(0.1％聚山梨酯、0.05％叠氮化钠)处理，以防止蛋白质表面附着(因为这可给出假阴性结果)。
在第一个实验中，首先测定了在无中间清洗的情况下在MabSelectTM SuReA蛋白柱上连续纯化的三种不同mAb(mAbA、mAbB和mAbC)的洗脱库中的携带。三个纯化循环按30g/L上样在A蛋白亲和柱(0.66×20cm，体积＝6.8mL)上，结果显示在图1中。将从前一运行携带的完整IgG蛋白质(ng携带/mg产物)的量作为洗脱的函数对数据作图。根据无中间清洗的图，三个上样循环的最高携带为30-40ppm(图1)。结果清楚地显示，为了保持低于1ppm的蛋白质携带，需要附加的清洗循环来再生柱。
MabSelectTM SuRe清洗流程(CP)的优化
在通过减少缓冲液消耗和清洗时间来简化清洗流程的尝试中，考察了缓冲液和运行时间的不同组合(表2，条目1-3)。由于携带水平从未落在1ppm的限度以下，很清楚，需要为MabSelectTM SuRe柱上的实验室规模再生鉴定更剧烈的清洗流程。更剧烈的清洗条件包括加入静态保持，其中使柱在缓冲液中保持确定的时期，并按零流速运行(表2，条目4-5)。发现静态保持有效地比用缓冲液冲洗从树脂洗下更多蛋白质。洗脱缓冲液静态保持之后，静态保持有效地使从柱洗下的完整IgG的量提高5倍，且再生缓冲液静态保持后未检测到完整IgG(图2)。此外，携带的量在“模拟洗脱”中显著降低至条目4(表2)的低于10ppm完整IgG和条目5(表2)的低于1ppm完整IgG携带。
表2.所考察的重复利用MabSelectTM SuRe柱a的清洗流程。
CV＝柱体积。a0.66×20cm。b再生缓冲液＝0.1N NaOH(pH 13)。c平衡缓冲液＝25mMTris、25mM NaCl(pH 7.1)。d洗脱缓冲液＝0.15M乙酸(pH 2.9)。e静态保持＝按0mL/分钟流速保持缓冲液在柱中。f在“模拟运行”中测定的携带。g保存缓冲液＝100mM乙酸钠和2％苯甲醇(pH 5)。
用条目6-7(表2)考察了具有静态保持时间的增加的清洗次数。很明显，具有附加清洗循环的静态保持时间比所有之前考察的条件更有效地清洗树脂。使得在进行“模拟运行”之后，检测到条目6(表2)的低于3ppm的携带和条目7(表2)的低于0.3ppm的携带(表2，图3)。pH循环的增加使得在尖锐的pH转换期间洗脱更多的蛋白质。但是，增加具有长静态保持的循环数增加了0.1N NaOH的聚集时间，这可以对树脂结合能力有害。由于对于30分钟和10分钟静态保持时间二者，大多数蛋白质都是在第一循环后洗脱(图3)，额外的静态保持时间具有有限的附加益处。因此，具有增加的循环的较短的静态保持时间优于较长的保持时间。除ELISA测定外，进行了毛细管电泳-十二烷基硫酸钠分析(CE-SDS)，来确保片段通过清洗循环清除。用条目7(表2)中所列流程清洗MabSelectTM SuRe柱后的“模拟洗脱”的94ng/mL“模拟洗脱”样品的CE-SDS分析显示，分离的mAb超过90％完全完整(图4)。
作为使用条目7(表2)中清洗流程的“概念验证”，“模拟洗脱”的Akta层析图(在纯化运行期间生成)表明，在进行从洗脱缓冲液(0.15M乙酸)至再生缓冲液(0.1N NaOH)的转化时达到柱的有效清洗。这为6个循环中每一个的此pH循环期间UV强度中的连续峰所证明(图5)。概括起来，pH循环和静态保持提供了理想的清洗流程。
缩放实验室规模优化的清洗流程(条目7，表2)用于在MabSelectTM SuRe Omni fit柱(0.66×20cm，体积＝6.7mL，30g/L的18个循环的HCCF)上纯化mAbA确实实际上最小化蛋白质携带(图6)。结果清楚地证明，在用6个循环的洗脱缓冲液(0.15M乙酸)清洗柱后，在每个循环后检测到显著更少的完整IgG或Fc片段，使得在第6个循环时检测到低于5ppm(图6)。类似地，在再生缓冲液(0.1M NaOH，图6)的6个循环洗涤的每一个之后，检测到甚至更少的完整IgG和Fc片段(<10ppm)。此外，在进行“模拟洗脱”时(在预洗脱、预再生和预平衡之后)，在“模拟洗脱”样品中检测到低于1ppm的蛋白质携带(图6)。
在清洗流程优化的过程期间，在保存在保存缓冲液(100mM乙酸钠、2％苯甲醇，pH5.0)中的时期之后，少量蛋白质从柱上掉下。此观察暗示，可能保存缓冲液也可以作为MabSelectTM SuRe树脂的有效的清洗缓冲液。但是，随后的保存缓冲液中间柱清洗之后的“模拟运行”未导致比之前优化的条件更有效的柱清洗(条目8，表2；图7)。此外，在方法中加入此清洗缓冲液可使总体方法更长而无附加的益处。因此，决定用现有的优化清洗流程进行。
然后在中试规模实施优化的清洗流程(条目7，表2)来纯化mAbZ(14×20，体积＝3.23L)，作为将该流程扩展至目的mAb之前的最后测试。结果如预期地有前景，在每次清洗之后检测到减少的完整IgG和Fc，使得在“模拟运行”的“模拟洗脱”中检测到低于1ppm的蛋白质携带。用mAbZ在之前已用于9个纯化循环的MabSelectTM SuRe柱上进行此具体的中试运行(图8)。
由于此清洗流程如此有效，在实施后清洗了总计5根中试规模柱。还进行了所有这些中试规模样品的进一步分析来测定其他杂质的量，以验证该方法在中试规模相似地进行，该其他杂质如浸出A蛋白(浸出A蛋白测定)(Zhu-Shimoni,J.等,JImmunol.Methods.2009,341:59-67)、其他蛋白质(CZE LIF-总蛋白质测定；D.Michels,(inpreparation)、中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP测定；Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30:121-128)和DNA(CHO DNA测定；用于CHO DNA分析的TaqMan聚合酶链反应)、抗体Fc片段(人Fc ELISA；用内部开发的通用夹心ELISA测量完整抗体和片段化抗体部分)和总抗体(完整人IgG ELISA；用内部开发的通用夹心ELISA测量完整抗体和片段化抗体部分)(表3)。如预期，所有检测的杂质都很好地低于可接受的限度，该清洗流程可以用于纯化mAb(条目6，表3)。
表3.来自使用优化的清洗的mAbZ的中试规模纯化的所有样品的分析。
结果
将之前优化的扩展的清洗条件(条目7，表2)略作修改用于后续研究，并入15分钟静态保持时间，而不是10分钟静态保持时间(图8)。清洗树脂的总体过程在20柱体积(CV)/小时流速下花费4.5小时，运行该过程6个循环(6次)。这些条件包括洗脱和再生缓冲液之间的pH循环及静态保持，以有效地洗涤柱。简言之，该流程在图9中详述。运行整个过程总计6个循环，以彻底清洗树脂。最后，用平衡缓冲液(3CV)洗涤树脂，然后保存在保存缓冲液(5CV，保存缓冲液)中。为了有效监测树脂清洗，在15分钟保持时间后收集样品，以分析每个循环时的携带，并测定在每个步骤和每个循环从树脂去除了多少蛋白质(图9)。
清洗树脂后，进行“模拟运行”来验证蛋白质携带(图9)。收集“模拟洗脱”并测定，以测定其他杂质的携带量和存在(Zhu-Shimoni,J.等,J Immunol.Methods.2009,341:59-67；Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30:121-128)。用毛细管区带电泳/激光诱导荧光检测(CZE-LIF)测定测量总蛋白质(D.Michaels等,in preparation)。用TaqMan聚合酶链反应进行CHO DNA分析。用通用夹心ELISA测量完整抗体和片段化抗体部分。这些其他杂质包括宿主细胞成分、蛋白质、病毒或DNA。这些测定包括使用ELISA的完整人免疫球蛋白(IgG)测试、另一ELISA中的人Fc片段、使用毛细管区带电泳/激光诱导荧光检测(CZE/LIF)的任意其他蛋白质、CHOP测定中的中国仓鼠卵巢蛋白质(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30:121-128)和浸出A蛋白测定(Zhu-Shimoni,J.等,JImmunol.Methods.2009,341:59-67)。在“完整人IgG ELISA”和“人Fc ELISA”中，定量柱上的整个抗体或抗体片段的量；其中前者结合片段抗原结合区(Fab)和片段可结晶(Fc)区二者，后者仅结合人Fc区。CZE-LIF测定可以通过定量样品中蛋白质的总量来确认那些结果。最后，已知A蛋白可以在运行期间或在剧烈清洗期间浸出树脂，不利地影响结合能力，因此测定浸出A蛋白的量很重要(Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Appl.Biochem.1999,30:121-128；Kelley,B.,Biotechnol.Prog.2007,23995-1008；D.Michaels,in preparation；Fahrner,R.L.等,Biotechnol.Genet.Eng.Rev.2001,18:301-327)。
为了测试清洗流程的效率，用AKTA Explorer 100(如2.2中所述)在MabSelectTMSuRe柱(0.66×20cm，体积＝6.8mL)上实验室规模纯化mAbC。测量了几个清洗循环期间和之后的蛋白质携带，结果证明蛋白质携带在每个清洗循环后减少(图10)。随后的“模拟运行”中mAbC的完整IgG蛋白质和Fc片段携带从洗脱缓冲液的第一个循环中的25ng/mg完整IgG和35ng/mg Fc片段减少至洗脱缓冲液的第6个循环之后的都小于5ng/mg(图10)。在再生(其在洗脱之后)期间和之后，达到显著更多的完整IgG和Fc片段从柱洗下直至第6个循环，其中水平累积性降低至小于5ng/mg携带。为了测试携带，进行了“模拟运行”(整个清洗循环之后的运行)，附加的IgG和Fc片段在预再生中从柱洗下，但在“模拟洗脱”过程开始时(其中预期第二mAb在重复利用过程中掉下)检测到低于1ppm的IgG和Fc片段(图10)。概括起来，这些结果确认，这些条件是有效的清洗条件，在使用此清洗流程后重新利用树脂时，从之前的运行携带的蛋白质的总量将低于1ppm。
为了更好地理解每个循环洗涤存在什么类型的蛋白质片段，在Tris-HCl凝胶(mAbC)上运行来自每个循环的样品(图11)(Trexlar-Schmidt,M.等,Biopharm.Intl.2009年3月2日)。从循环1至循环6，在每个连续的循环中观察到更少的蛋白质(每个泳道中减少的条带强度，图11)。此外，来自静态保持循环的样品泳道比循环1-6期间更集中，在每个静态保持循环之后去除了更多的蛋白质。这些结果证明，延长的保留时间有助于从柱去除残留蛋白质。
将此优化的清洗方法扩展至在MabSelectTM SuRe柱(13.8×20，体积＝3L)上中试规模纯化mAbX。结果类似于之前在实验室规模观察到的结果(图6)。如在实验室规模运行上所观察到，蛋白质杂质在初始清洗阶段从树脂去除，它们的总体浓度在每个洗脱和再生循环之后降低，直至达到第6个循环(图12)。在树脂再生期间，最初从柱洗下的蛋白质的量比第6个循环之后大得多，使得在达到第6个再生循环时，检测到低于1ppm的蛋白质杂质(图12)。
在MabSelectTM SuRe柱(20×20，体积＝6.28L)上纯化mAbY，随后用上述清洗流程(图9)进行柱清洗，然后进行“模拟运行”，导致模拟洗脱的第6个再生循环后低于1ppm的浸出A蛋白、小于0.25mg/mL(定量极限)CZE-LIF、低于0.5ppm CHOP和小于1.0pg/mL CHO DNA(表4)。所有杂质都与历史数据相当，且在可接受限度内。
表4.来自用优化的清洗流程在MabSelectTM SuRe柱上大规模柱(6.28L)纯化mAbY来验证最小携带的所有样品的分析。a
在优化的清洗流程(图9)的稳定性的最后测试中，用之前进行了153个多产物上样循环的6.28L MabSelectTM SuRe树脂来纯化目的mAb。将从之前使用过的树脂进入“模拟运行”(条目1，表5)的携带与从另外三个不同的MabSelectTM SuRe树脂观察到的携带相比较。结果在表5中列出。简言之，旧的MabSelectTM SuRe大规模多产物树脂(条目1和2，表5)表现得与新的mAb专用(不是多产物)MabSelectTM SuRe树脂(条目3，表5)和新的mAb专用实验室规模MabSelectTM SuRe树脂(条目4，表5)相当。根据结果，所有A蛋白树脂都以大于90％的产率、相当的CHOP、百分比聚集体和浸出A蛋白(ng/mg)提供mAb。概括起来，多产品树脂对产物纯度特征(profile)或步骤产率无负面影响。中试规模和实验室规模结果也相当(条目4，表5)。
除所显示的工作外，在用该流程清洗的多产物树脂上纯化了另外几种mAb。结果都很相似和可重复，总蛋白质水平低于0.25ppm(测定检测极限)(表6)。结果表明，优化的清洗流程是清洗、再生、重复利用和再循环多产物MabSelectTM SuReA蛋白树脂的有效、可重复和稳定的方式。MSSCCP清洗流程在中间A蛋白树脂清洗中的使用使蛋白质携带降至极低于确定的安全限度。
表5.使用优化的清洗流程之后的不同MabSelectTM SuRe柱的mAb产物产率和杂质特征的比较。a
a关于具体测定的信息参见支持信息。b柱A是之前用于153个上样循环的旧的MabSelectTM SuRe多产物柱。c柱B是较新的MabSelectTM SuRe柱上的实验室规模运行。d柱C是MabSelectTM SuRe mAb专用(非多产物)柱上的中试规模纯化。eExchg.＝交换。fag.＝聚集体。g柱D是较新的实验室规模mAb专用MabSelectTM SuRe柱。
开发了高效的MabSelectTM SuRe清洗方法，其允许将MabSelectTM SuReA蛋白树脂用于多产物纯化而对产物纯度无影响和/或树脂结合能力无丧失。来自实验室以及中试规模实验的数据表明，包括6个循环的0.15M乙酸(洗脱缓冲液)和0.1N氢氧化钠(再生缓冲液)洗涤和15分钟保持时间的清洗流程在此第一mAb清洗步骤中将MabSelectTM SuRe树脂清洗至低于5ppm的蛋白质携带。在中试规模的多产物A蛋白树脂(MabSelectTM SuRe)上成功实施了该方法，进一步证实了该策略的有用性。
表6.在多产物柱上在用优化的清洗流程清洗的A蛋白树脂上纯化的内部mAb的分析。
mAb 规模 CV<sup>b</sup>(mL) 总蛋白质(mg/mL)
1 实验室 6.8 <0.25
2 实验室 6.8 0.46
3 中试 3000 <0.25
4 中试 6280 <0.25
5 中试 6280 <0.25
6 中试 3230 <0.25
7 中试 6280 <0.25
8 中试 1730 <0.25
实施例2.用于多产物使用的离子交换柱的评价
进行研究来确定是否可开发相似的清洗方法用于离子交换层析。将来自A蛋白库的MAbA和MAbB上样至阳离子交换柱(POROS)或阴离子交换柱(QSFF)上。正常洗脱后，然后对柱进行“模拟洗脱”。用MabSelectSure测定针对MAbA和/或MAbB的存在分析级分，检测极限为0.82ng/mL。如图13中所见，模拟洗脱结果表明需要附加的柱清洗。
测试了以下原位清洗(CIP)流程。
I.3 CV平衡缓冲液
II.2 CV 0.5N NaOH
10分钟静态保持
III.1 CV 0.5N NaOH
10分钟静态保持
IV.1 CV 0.5N NaOH
V.清洗后模拟运行
用低浓度去垢剂(0.1％聚山梨醇酯20、0.05％叠氮化钠)调节样品，以防止样品粘附于容器壁。将样品调节至中性pH，然后上样在柱上。将MAbA和MAbB上样至阳离子交换柱(POROS)或阴离子交换柱(QSFF)上。正常洗脱后，用上述流程清洗柱。第二组柱用MabA或MAbB上样，但在洗脱后不用以上流程清洗。然后对所有柱进行“模拟洗脱”。通过ELISA分析针对完整IgG的存在分析模拟洗脱物。
如图14中所示，清洗方法显著减少POROS柱中MabA的蛋白质携带(图A)，并显著减少QSFF柱中MAbB的蛋白质携带(图B)。对于QSFF柱，甚至在无CIP步骤的情况下，也几乎观察不到MAbA携带(图A)，对于POROS柱，甚至在无CIP步骤的情况下，也几乎观察不到MAbB携带(图B)。
将第三抗体MAbC加至POROS和QSFF，并测量清洗流程的所选步骤结束时从柱洗脱的完整IgG的量(图15)，使得在CIP循环结束时，蛋白质携带的量低于0.1ppm。模拟洗脱库中的蛋白质携带也低于0.1ppm。
为了确定清洗流程在大规模离子交换层析柱上是否可以有效，在之前用MAbD上样的中试规模柱上进行了清洗流程。柱为7.22L POROS HS50柱和1.57L QSFF柱。上样并洗脱MAbD之后，在无清洗的情况下模拟平衡柱，然后模拟洗脱。然后按照上述CIP流程清洗柱，然后进行附加的模拟平衡和模拟洗脱。取出来自每个步骤的样品，并按上文所述分析完整IgG。结果显示在图16中。对于POROS HS50柱和QSFF柱二者，蛋白质携带小于约0.1ppm。
实施例3.用于多产物使用的ProSep A柱的评价
小规模评价了不同的清洗溶液，以评估哪些溶液在减少蛋白质携带上最有效。测试了几个不同种类的溶液，包括酸、离液剂、盐和有机溶剂。此研究设计为遵循标准A蛋白抗体方法，以最好地模拟通用方法条件，虽然实际处理条件可取决于所使用的具体产品而不同。
除清洗循环外，所有过程中将液流定向为以下行方向通过柱。在整个清洗循环中，将液流定向为上行通过柱，希望创造最佳情况清洗场景。由于原料在上样循环期间以下行方向通过柱，A蛋白柱的上部理论上将最脏。通过将清洗循环的液流定向为上行，理论是在柱上部建立的携带和其他杂质无需穿过整个柱长才洗脱出来。在此研究时，还不清楚在清洗柱上上行是否比下行更有益。为了本章节的目的，由于所有实验都一致地使用上行，虽然有此发现，但仍可以在不同清洗溶液之间进行比较。
材料和方法
A蛋白层析处理
用explorer 100层析系统(Amersham Pharmacia Biotech)和Unicorn5.10控制软件(GE Healthcare)进行A蛋白层析。用ProSep A树脂代替ProSep vA树脂。之前已显示两种树脂的表现是等同的。在0.66cm直径Omnifit玻璃柱中装填树脂至14cm的床高。为每次运行装填未用过的树脂。所有实验都在室温(20-30℃)进行。使用MAb1和mAb2收获细胞培养液(HCCF)。维持标准A蛋白抗体方法，流速30CV/小时、载量14g/L树脂，根据280nm UV吸光度从0.5OD收集至2CV的终体积。
洗脱和再生的预循环后进行由平衡、抗体上样、三次洗涤、洗脱/收集和再生组成的上样循环。连续运行了9个上样循环，以充分弄脏柱。随后是由延长的再生、平衡、10CV待测试的清洗剂和再生组成的清洗循环。用10CV/小时的较慢流速以上行方向运行此清洗循环。在整个清洗溶液模块中收集1CV级分。然后保存柱，然后运行一系列模拟运行(携带循环)来评价产物携带。在模拟运行后进行由预循环、正常上样循环和保存组成的完整性检验，以确保蛋白质产率不降低。每个实验都重复进行两次。
模拟运行定义为这样的运行，其中除上样阶段外，每个方法步骤的常见阶段都遵照进行，在上样阶段期间，未将蛋白质上样至柱上。相反，将磷酸缓冲盐溶液(PBS)上样至柱上(模拟上样)来模拟含有蛋白质的正常上样库的体积、pH和电导率。在将收集正常蛋白质洗脱库的相同起始体积处从模拟运行收集携带样品库(模拟库)。
总体方法流程总结如下：
预循环
洗脱 3CV
再生 3CV
上样循环(x9)
清洗循环
预循环
模拟运行
上样循环(PBS上样)
完整性检验
上样循环(HCCF上样)
保存
缓冲液成分显示在表7中。
表7.用于A蛋白层析处理的缓冲液的组成
缓冲液名称 缓冲液成分
平衡 25mM Tris、25mM NaCl、5mM EDTA，pH 7.1
洗脱 0.1M乙酸，pH 2.9
再生 0.1M磷酸
洗涤2 0.4M磷酸钾，pH 7.0
清洗 可变
模拟上样 磷酸缓冲盐溶液(PBS)
保存 2％苯甲醇、0.1M乙酸钠，pH 5.0
清洗剂组成显示在表8中。
表8.清洗剂的组成
A蛋白库的后处理
在洗脱3小时内，用聚山梨醇酯20和叠氮化钠调节清洗级分和携带库至0.1％聚山梨醇酯20和0.05％叠氮化钠的终浓度。聚山梨醇酯20是去垢剂，其阻止低水平的蛋白质吸附至样品容器壁上，叠氮化钠是防腐剂，其阻止细菌生长。用1.5M TRIS碱将A蛋白库(蛋白质和模拟二者)调节至pH 5.0，将清洗级分调节至pH 5.0-7.0之间。所有样品都保存在4℃，直至进行产物(完整IgG)分析。
分析
用UV分光光度计(Shimadzu)在280nm吸光度测定蛋白质库浓度。清洗和模拟库样品以一式两份或一式三份提交，并用完整人IgG ELISA分析产物。
用以下计算将来自完整人IgG ELISA的结果转化为携带值：
为了代表最坏情况携带，用来自每个实验的蛋白质库样品的最低产物浓度进行携带计算(表9)。
表9.用于携带计算的产物浓度
结果
来自清洗溶液筛选的携带结果总结在图17中。为了比较，进行了两次运行，其中所有处理步骤都一样，但未进行清洗循环。在与未清洗的柱相比时，所有暴露于清洗溶液的柱都显示显著减少的携带。在与未暴露于清洗循环的柱相比时，平均携带减少在65-93％之间。
最初包括平衡缓冲液作为清洗溶液的阴性对照，因为在暴露于平衡缓冲液时，蛋白质通常不从A蛋白柱洗脱。但是，平衡缓冲液在减少携带上表现得与任意其他溶液一样好。这表明，通过柱的缓冲液的附加流通有助于去除携带，无论实际溶液组成是什么。
观察到了许多不同清洗溶液的运行之间的高变异性。此变异性可以部分地由整个实验过程中两种不同原料的使用引起。MAb1HCCF用于来自以下样品的每一个的两次运行之一：无清洗、平衡缓冲液、6M盐酸胍、1％v/v磷酸、19％乙醇、0.1M咪唑/19％乙醇；mAb2HCCF用于所有其他运行。受限的原料可获得性阻止了在所有运行中使用一致的原料。但是，不一致的原料可解释不了所观察到的所有变异性，因为虽然在两次运行中都使用了mAb2HCCF，但2M磷酸钾样品显示高变异性(56.5％RSD)。
在每次运行的携带循环之后进行了附加的上样循环来评估清洗后的柱的表现。产物产率与在暴露于清洗剂之前的上样循环期间获得的产率一致(结果未显示)。
在清洗循环的整个清洗剂模块中收集级分，以评估在清洗中出来的抗体的量(图18)。因为一些清洗剂可对蛋白质具有变性作用，用结果来确定趋势而不是找到绝对量。所有清洗剂都很好地在10CV之内释放稳定于低、几乎恒定水平的抗体量。相反，在模拟循环期间洗脱出来的携带保持在高得多的浓度。甚至对于预期无蛋白质降解的缓冲液如平衡缓冲液，虽然从清洗释放出低水平的抗体，但也观察到较高水平的携带。这些发现表明，在使用此清洗流程时，简单地缩短或延长清洗持续时间将不会显著影响携带水平。
在所测试的每种溶液的清洗循环之后进行了几次连续的模拟运行。图19中的层析图重叠显示来自0.1M乙酸清洗的5次连续的模拟运行的UV280nm信号。对于所进行的每次连续的模拟运行，收集区中的尖峰逐渐减少。每个连续循环的携带的此减少不限于此具体柱。如图20中可见，所筛选的几乎每种清洗溶液都存在相同的趋势。甚至在不在柱上进行清洗时，携带也随着所进行的每次额外的模拟运行而显著减少。在图21中，6M盐酸胍样品缺失来自第2携带的数据，但观察到了相同的趋势。20％己二醇样品直至第5携带也显示相同的趋势。尚不确定第5携带的高值是反映了实际携带结果还是取样中的人为错位。
每次连续的模拟运行的携带的减少表明，用标准A蛋白缓冲液代替更专用的清洗剂(如所筛选的那些)可以减少携带。已有缓冲液的使用转化为更容易地在纯化中试工厂中实施这些清洗流程，因为将需要更少的制备时间来进行缓冲液分批，将存在关于化学药品对柱的影响的更少不确定性。
更重要地，这些结果还表明，模拟运行缓冲液的脉冲处理可作为A蛋白柱的备选清洗流程。由于来自连续模拟运行的携带比来自连续暴露于0.1M乙酸或1％v/v磷酸的携带减少得更多，模拟运行期间洗脱和再生缓冲液的低pH不能完全解释改善的清洗。相反，模拟运行期间高至低的pH转换可解释携带减少。
图21显示2M盐酸精氨酸不遵循携带减少趋势。系统电源中断导致柱在第3模拟运行之后和可能在第3模拟运行期间保持在缓冲液中。缓冲液暴露持续时间延长后增加的携带表明，单个携带结果可能不能完全指示有多少蛋白质保持在柱上。甚至在初始结果表明柱“清洁”后进一步携带洗脱的可能性是重要障碍。
筛选了10种不同清洗剂来鉴定将减少用ProSep A装填的A蛋白柱中的携带的适宜的清洗策略。所有清洗溶液都有助于减少携带；但是，由于变异性的问题，大多数试剂显示相似的表现。来自连续模拟运行的携带库的分析显示携带随所进行的每个附加模拟运行减少的趋势。
实施例4.高至低pH缓冲液的脉冲处理
进行研究来考察模拟运行缓冲液的脉冲处理作为减少产物携带的手段。一旦鉴定出基本策略，即用更大的小规模柱进行优化。优化参数包括液流方向性、流速和静态浸泡的分析。
材料和方法
产物洗脱的初步分析
用mAb3HCCF在15℃上样，按实施例2中所述的方法进行A蛋白层析。进行了9个上样循环，然后进行保存、预循环和两次模拟运行。未进行清洗。在每次模拟运行的整个过程中收集1CV级分，并按之前所述用TRIS碱、聚山梨醇酯20和叠氮化钠调节。通过完整人IgGELISA来分析级分。
pH脉冲处理和优化
所有实验都用mAb3HCCF在1.6cm直径柱上进行。床高保持在14cm。进行9个上样循环，然后进行由3CV平衡缓冲液和3CV再生缓冲液组成的清洗循环。进行10个清洗循环，然后进行保存、预循环和一系列模拟运行。在整个清洗过程中收集1CV级分。按之前所述调节和分析清洗级分和模拟库。
按30CV/小时以下行方向运行默认清洗流程10个循环。优化研究涉及改变流向和流速、检查静态浸泡条件和减少清洗持续时间。对于流向优化，以上行方向运行清洗循环。对于流速优化，按15CV/小时的流速运行清洗循环。通过在第4清洗循环期间保持柱平衡缓冲液或再生缓冲液中3小时来检查静态浸泡。对于静态浸泡的优化，在10个清洗循环中的4个循环期间保持柱在平衡缓冲液中3小时。对于清洗持续时间的优化，将清洗循环减少至2CV平衡缓冲液和2CV再生缓冲液。此外，对10个清洗循环中的5个循环进行平衡缓冲液中的静态浸泡。优化参数总结在表10中。
表10.脉冲清洗优化
结果
在弄脏的柱的前两个模拟运行循环中收集级分来考察产物实际上在模拟运行循环期间的什么时候洗脱出来。层析图和携带结果显示在图22中。大部分产物在洗脱缓冲液替换平衡缓冲液时的高至低pH转换处洗脱。产物还在再生缓冲液替换洗脱缓冲液时的下一个pH下降处以较低程度洗脱出来。用第二携带循环重复出了这些观察。携带结果确认，仅保持柱处于低pH将不能有效地清洗柱。如果唯一的要求是低pH，那么第二携带循环期间的峰应更小，更多蛋白质应在第一携带循环的整个洗脱和再生模块期间出来。
从pH下降洗脱和第二模拟运行期间的附加洗脱的组合强烈支持高至低pH的脉冲作为潜在的清洗策略。由于蛋白质洗脱在3个CV的洗脱缓冲液之内出峰，对于高和低pH缓冲液中的每一种，将缓冲液持续时间设为3个CV。选择平衡缓冲液(pH 7.1)作为高pH缓冲液，选择再生缓冲液(pH 1.7)作为低pH缓冲液。
pH脉冲处理
平衡和再生缓冲液的10个脉冲处理循环的产物洗脱显示在图23中。从柱洗脱的IgG峰出现在清洗的每个高至低pH转换处。对于每个后续循环，洗脱的蛋白质的量减少。
在脉冲清洗后进行了几次连续的模拟运行。来自5次连续的模拟运行的携带量显示在图24中。为了比较，还显示了来自未清洗的柱的连续携带。10个循环的pH脉冲清洗导致来自柱的携带减少86％，从484ng IgG/mg产物减少至68ng IgG/mg产物。虽然清洗导致携带的显著减少，但附加的模拟运行仍产生携带。需优化以进一步减少携带。
脉冲清洗的优化
比较了缓冲液在清洗循环期间上行和下行通过柱。5次连续模拟运行的携带显示在图25中。在与下行相比较时，上行导致初始携带增加54％(105ng IgG/mg产物对68ngIgG/mg产物)。所有后续携带也显示携带的增加。第4模拟运行期间的携带无效，因为错误地未将聚山梨醇酯20和叠氮化钠加至样品。图26显示上行和下行柱二者的整个清洗期间的产物洗脱。上行导致更多的模拟运行携带，同时它还导致整个10个清洗循环期间有更多蛋白质从柱洗脱下来，更彻底地有效清洗柱。由于在最后一个清洗循环期间仍有可观量的蛋白质从柱洗脱下来，无疑可以延长上行运行，以更多的循环来去除更多的作为携带洗脱下来的产物。
清洗期间的缓冲液低流速对模拟运行携带水平的影响显示在图27中。流速从30CV/小时减小一半至15CV/小时使初始携带减少近50％(从68ng IgG/mg产物至35ng IgG/mg产物)。虽然较慢的流速有效地使携带减半，但缺点是清洗时间加倍。
来自在清洗循环期间在缓冲液中静态浸泡柱的结果显示在图28中。保持柱在平衡缓冲液或再生缓冲液中3小时，并评估多种携带。在平衡缓冲液中浸泡柱表现得比在再生缓冲液中浸泡柱更好(19ng IgG/mg产物对28ng IgG/mg产物)。两种静态浸泡都从正常脉冲清洗柱显著改善至68ng IgG/mg产物。对于流速减小，需要权衡清洗时间增加的缺点和携带减少的优势。
通过将平衡缓冲液中单次3小时保持与多次3小时保持相比较来进一步评估了柱在缓冲液中的静态浸泡。在10个脉冲处理循环的4个循环中使柱保持静态浸泡，并评价携带(图29)。对于多次静态浸泡，携带从19ng IgG/mg产物下降至8ng IgG/mg产物。
评估了在每次优化运行的整个清洗循环期间收集的级分的产物洗脱，以确定最佳清洗持续时间(图23、26、30-32)。大多数清洗循环显示在第3个CV的平衡缓冲液和再生缓冲液二者期间几乎没有或没有产物洗脱。因此，每个清洗循环的持续时间减少至两个CV平衡缓冲液和两个CV再生缓冲液。清洗持续时间的此减少转化为更少的缓冲液和更短的清洗时间；但是，产物携带将保持相同或略为增加。为了进一步减少携带同时保持较小的缓冲液体积，将静态浸泡的次数从4次增加至5次。图33显示这些改变使携带从7.8ng IgG/mg产物轻微减少至6.7ng IgG/mg产物。整个柱清洗过程中的产物洗脱显示在图34中。在第10个清洗循环结束时，随最后一个柱体积的再生缓冲液洗脱出5.0ng IgG/mg产物。
实施例5.清洗的大规模表现
将在优化研究期间鉴定出的最优前景的pH脉冲清洗流程应用于之前使用过的中试规模柱。根据分子、尺寸和之前的蛋白质接触数选择用于研究的柱。由于只有Pharmaciaskids允许自动暂停持续时间，选择不超过skids的2L/分钟流速帽的柱。
材料和方法
从中试工厂冷室保存获得之前使用过的mAb4和mAb5A蛋白柱。mAb4柱测量直径为20cm，床高13.5cm，之前已使用了28个循环。Bioprocess skid 1538(AmershamBiosciences Pharmacia)用于清洗，skid1050(Millipore)用于模拟运行。mAb5柱(Pharmacia Index)测量直径为14cm，床高15cm，之前已使用了20个循环。Bioprocess skid1076(Amersham Pharmacia Biotech)用于所有mAb5方法。
进行了由2CV平衡缓冲液和2CV再生缓冲液组成的10个清洗循环。在10个脉冲处理循环的5个循环中使柱保持在平衡缓冲液中静态浸泡3小时。清洗，然后进行柱的保存、skid的卫生处理和模拟运行。对于mAb5柱，在卫生处理后立即在无柱的情况下进行附加的模拟运行，来获得系统携带的值。
模拟运行参数基于之前用于各具体分子的A蛋白处理的参数。对于mAb5柱，按照典型的mAb5A蛋白层析将洗涤3步骤延长至4个CV。模拟运行参数和用于参考的原始运行的总结在表11中列出。
表11.用于中试工厂规模模拟运行的参数
产物携带显示在表12中。清洗后，aIGF1R柱具有48.2ng IgG/mg产物的携带，而antiAbeta柱具有8.6ng IgG/mg产物的携带。之前的研究已显示，携带值随蛋白质接触的增加而增加。虽然mAb4柱暴露于蛋白质接触循环比mAb5柱多8次，但接触次数的增加单独并不显著至足以解释携带值的巨大不一致。
表12.来自中试规模携带研究的结果
在最后一个清洗循环结束时，对于两根柱，产物仍随清洗缓冲液洗脱出来。与在小规模优化期间观察到的来自最后一个清洗CV的5.0ng IgG/mg产物相比，中试规模的产物洗脱高于预期(对于aIGF1R和antiAbeta柱，分别为12.7和62.9ng IgG/mg产物)。
通过在skid卫生处理后在无柱在位的情况下进行模拟运行来分析了系统携带。系统携带表示可归因于skid而不是Prosep A树脂的携带的量。清洗流程和skid的卫生处理应已消除了所有系统携带，但在mAb5运行期间在系统模拟库中仍检测到了0.97ng IgG/mg产物。这些结果表明，虽然系统对携带的贡献极小，但可以有必要清洗skid本身，以确保无产物从一次运行携带至下一次运行。
将小规模优化期间所用的清洗流程应用于中试规模产生具有显著变异性的更高携带水平。产物以比之前在小规模观察到的水平高的水平继续洗脱直至清洗循环结束。发现甚至在无柱在位时，系统也促成低水平的携带。
发现从高至低pH的缓冲液的脉冲处理是在小规模减少携带的有效手段。使用1.6cm直径柱，携带减少至6.7ng IgG/mg产物。但是，将清洗流程应用于在之前的中试运行期间实际使用的柱产生高得多的携带值，到目前为止测量到的最高值在48.2ng IgG/mg产物。虽然预期携带水平将由于柱使用的差异而在柱之间有某种程度不同，但最终的清洗流程将需要无所不在地消除携带，无论任何给定柱的详情如何。此外，评价诸如长期柱表现和最小携带检测极限的附加参数将很重要。

Claims (43)

1.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.9；
b)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中10分钟至30分钟范围内的时间；
c)使2个或多个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；和
d)使2个或多个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1NNaOH，且为pH 13。
2.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.9；
b)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中30分钟；
c)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；和
d)使4个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1N NaOH，且为pH 13。
3.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.9；
b)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中30分钟；
c)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；和
d)使2.5个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1N NaOH，且为pH 13；
e)静态保持所述材料在再生缓冲液中30分钟；
f)使2.5个材料体积的再生缓冲液通过所述材料。
4.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使2个材料体积的平衡缓冲液通过所述材料，其中平衡缓冲液包含25mM Tris和25mMNaCl，且为pH 7.1；
b)静态保持所述材料在平衡缓冲液中30分钟；
c)使2个材料体积的平衡缓冲液通过所述材料；
d)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.8；
e)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中30分钟；
f)使2个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；
g)使2个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1N NaOH、pH13；
h)静态保持所述材料在再生缓冲液中30分钟；
i)使2个材料体积的再生缓冲液通过所述材料。
5.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使4个材料体积的平衡缓冲液通过所述材料，其中平衡缓冲液包含25mM Tris和25mMNaCl，且为pH 7.1；
b)进行包含以下步骤的6个循环：
i)使3个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.8；
ii)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中10分钟；
iii)使1个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；
iv)使3个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1N NaOH，且为pH 13；
v)静态保持所述材料在再生缓冲液中10分钟；
vi)使1个材料体积的再生缓冲液通过所述材料。
6.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤的6个循环：
a)使3个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料，其中洗脱缓冲液包含0.15M乙酸，且为pH 2.8；
b)静态保持所述材料在洗脱缓冲液中15分钟；
c)使1个材料体积的洗脱缓冲液通过所述材料；
d)使3个材料体积的再生缓冲液通过所述材料，其中再生缓冲液包含0.1N NaOH，且为pH 13；
e)静态保持所述材料在再生缓冲液中15分钟；
f)使1个材料体积的再生缓冲液通过所述材料；
g)使3个材料体积的保存缓冲液通过所述材料，其中保存缓冲液包含100mM乙酸钠、2％苯甲醇，且为pH 5.0；
e)静态保持所述材料在保存缓冲液中15分钟；
f)使1个材料体积的保存缓冲液通过所述材料。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料在层析柱中。
8.权利要求7的方法，其中层析材料是亲和材料。
9.权利要求8的方法，其中亲和材料是A蛋白亲和材料。
10.权利要求9的方法，其中A蛋白亲和材料是MAbSelect材料。
11.权利要求9的方法，其中A蛋白亲和材料是MAbSelect SuRe材料。
12.权利要求9的方法，其中A蛋白亲和材料是MAbSelect SuRe LX材料。
13.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料用于大规模产生多肽。
14.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使3个材料体积的平衡缓冲液通过所述材料，其中平衡缓冲液包含40mM乙酸钠，且为pH 5.5；
b)使2个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料；
c)静态保持所述材料在0.5N NaOH中10分钟；
d)使1个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料；和
e)静态保持所述材料在0.5N NaOH中10分钟；
f)使1个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料。
15.权利要求14的方法，其中层析材料在层析柱中。
16.权利要求14的方法，其中层析材料是离子交换材料。
17.权利要求16的方法，其中离子交换材料是阳离子交换材料。
18.权利要求17的方法，其中阳离子交换材料是POROS HS50材料。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中层析材料用于大规模产生抗体。
20.清洗重复利用的层析材料的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使3个材料体积的平衡缓冲液通过所述材料，其中平衡缓冲液包含50mM Tris、85mM乙酸钠，且为pH 8.8和8.6mS/cm；
b)使2个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料；
c)静态保持所述材料在0.5N NaOH中10分钟；
d)使1个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料；和
e)静态保持所述材料在0.5N NaOH中10分钟；
f)使1个材料体积的0.5N NaOH通过所述材料。
21.权利要求20的方法，其中层析材料在层析柱中。
22.权利要求20的方法，其中层析材料是离子交换材料。
23.权利要求22的方法，其中离子交换材料是阴离子交换材料。
24.权利要求23的方法，其中阴离子交换材料是QSFF材料。
25.权利要求20-24中任一项的方法，其中层析材料用于大规模产生抗体。
26.权利要求1-6中任一项的方法，其中缓冲液按30个材料体积/小时、20个材料体积/小时或15个材料体积/小时通过所述材料。
27.权利要求1-6中任一项的方法，其中缓冲液以下行方向或上行方向通过所述材料。
28.权利要求1-6中任一项的方法，其中通过在清洗所述材料后运行模拟洗脱来测量所述材料的清洗。
29.权利要求28的方法，其中包含<0.25mg/mL总蛋白质、<1ppm IgG片段、<1ppm浸出A蛋白、<1μg/mL CZE LIF、<1ppm CHOP和<1pg/mL CHO DNA中的一项或多项的模拟洗脱的洗脱物指示多产物使用材料的有效清洗。
30.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料在碱中稳定。
31.权利要求1-6中任一项的方法，其中层析材料用于纯化多肽。
32.权利要求31的方法，其中在纯化第一多肽后清洗所述层析材料，且其中层析材料在所述清洗后用于纯化第二多肽。
33.权利要求32的方法，其中多肽是抗体或免疫黏附素。
34.权利要求33的方法，其中多肽是免疫黏附素。
35.权利要求33的方法，其中多肽是抗体。
36.权利要求35的方法，其中抗体是单克隆抗体。
37.权利要求36的方法，其中单克隆抗体是人源化抗体或人抗体。
38.权利要求36的方法，其中单克隆抗体是嵌合抗体。
39.权利要求37或38的方法，其中单克隆抗体是IgG单克隆抗体。
40.权利要求35的方法，其中抗体是抗原结合片段。
41.权利要求40的方法，其中抗原结合片段是Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、scFv、di-scFv、bi-scFv、串联(di,tri)-scFv、Fv、sdAb、三功能抗体、BiTE、双抗体或三链抗体。
42.权利要求41的方法，其中多肽是酶、激素、融合蛋白质、含Fc的蛋白质、免疫缀合物、细胞因子或白细胞介素。
43.权利要求32的方法，其中第一多肽是第一抗体或第一免疫黏附素，第二多肽是第二抗体或第二免疫黏附素。
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