CN112646045A - 一种重组角蛋白分离纯化方法 - Google Patents
一种重组角蛋白分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112646045A CN112646045A CN202110014907.3A CN202110014907A CN112646045A CN 112646045 A CN112646045 A CN 112646045A CN 202110014907 A CN202110014907 A CN 202110014907A CN 112646045 A CN112646045 A CN 112646045A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- chromatographic column
- recombinant keratin
- keratin
- separation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 title claims abstract description 102
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 title claims abstract description 102
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 84
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 42
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 37
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 29
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 14
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 14
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000010432 diamond Substances 0.000 claims description 13
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 7
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 6
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 229940127554 medical product Drugs 0.000 abstract description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 210000000003 hoof Anatomy 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4741—Keratin; Cytokeratin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；2)采用Ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。本发明为重组角蛋白提供了一种有效的分离纯化方法，过程简单，且不会对重组角蛋白结构造成破坏，分离纯化效率高，重组角蛋白的分离纯度能够达到90％‑95％，使得重组角蛋白能够用于医疗产品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及角蛋白分离技术领域，尤其是涉及一种重组角蛋白分离纯化方法。
背景技术
角蛋白是一类具有缔结和保护功能的纤维状动物蛋白质，是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于动物的毛发、羽毛和蹄中；由于角蛋白具有良好的生物活性高和组织相容性，能够起到消炎、止血、神经修复、减少创面渗出和促进创伤组织再生，修复、愈合的作用；由于角蛋白具有高抗性的理化性质和特殊的生物学作用，再加上现有的角蛋白分离需要复杂的化学工艺才能实现，并且分离过程中容易造成角蛋白结构的破坏，分离的效率也较低，分离得到得角蛋白的纯度较低；由于上述限制使得角蛋白目前只在化妆品领域应用较为广泛；无法在对角蛋白纯度要求更高的医疗产品领域内使用。
现在市场上为了避免从动物中提取角蛋白的提取工艺对角蛋白造成的各种不利的影响，现在市场上逐步开始研究重组角蛋白，然后通过将重组的角蛋白在大肠杆菌中表达和培养；但是现在还没有针对就重组角蛋白进行分离纯化的方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种重组角蛋白分离纯化方法，解决了现在针对就重组角蛋白还没有有效的分离纯化方法等技术问题。
为了实现前述发明目的，本发明提供了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后，再进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；收集到的菌泥通过低温高压匀浆可使细菌充分破碎，重组角蛋白分散于溶液中，便于后续充分回收蛋白质。
2)采用Ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；角蛋白序列构建时末端添加了His标签，而镍柱里面的琼脂糖微球体与Ni2+发生螯合，螯合后的Ni2+能与His上的咪唑环发生特殊的相互作用，使重组角蛋白挂柱而杂质流出，然后再用亲和能力更强的咪唑置换出柱子上的重组角蛋白，从而实现重组角蛋白的分离。亲和层析操作简便，并能将大部分重组角蛋白进行分离纯化。
3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。阴离子交换基质通过离子交换作用结合带有负电荷的重组角蛋白，使得重组角蛋白被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，利用带负电荷更多的溶液进行置换将吸附在柱子上的重组角蛋白洗脱下来。阴离子层析柱分辨率高、工作容量大且简单易操作，可对重组角蛋白进行进一步纯化。
优选地，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris pH7.0。
优选地，所述步骤1)中高压匀浆的压力为800～2000Bar，高压匀浆3～5次。
优选地，所述步骤1)中采用冷冻高速离心机收集上清液，所述冷冻高速离心机的分离转速为8000～12000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min。
优选地，所述步骤1)中采用0.22um中空纤维或者滤膜过滤上清液。
优选地，所述步骤2)的具体操作为：取装有Ni亲和层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
优选地，所述步骤3)的具体操作为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5MNaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
优选地，所述步骤2)中Ni亲和层析柱中的介质为Ni SMart Beads 6FF、Ni NTABeads 6FF、Ni-TED Purose 6Fast Flow、Ni-TED Purose 6FF或Ni Sepharose 6Fast Flow中的一种；
所述步骤2)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M UreapH8.0；
所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M UreapH8.0；
所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M Urea pH8.0+50-500mM咪唑；
所述步骤2)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致。
优选地，所述步骤3)中阴离子层析柱中的介质为Q Bestarose HighPerformance、Q Sepharose High Performance、Q Beads 6FF、DEAE Bestarose HighPerformance、Q Bestarose Big Beads、Q sepharose Big Beads、Diamond Q、Capto Q、Diamond Q mustang、Capto Q mustang、Capto DEAE、Diamond DEAE或Diamond DEAEmustang中的一种；
所述步骤3)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0；
所述步骤3)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致。
优选地，所述步骤1)中、步骤2)中和步骤3中均需要进行蛋白指标检测；所述蛋白指标检测采用SDS-PAGE凝胶电泳检测法和高效液相色谱检测法进行检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明针对重组角蛋白提出了一种有效的分离纯化方法，对重组角蛋白进行二次分离，首先使得重组角蛋白的分离过程简单，操作方便，更重要的是整个分离过程不会对重组角蛋白结构造成破坏，保证重组角蛋白的分离效率，使得重组角蛋白的分离纯度能够达到90～95％，确保分离的重组角蛋白的纯度能够满足在医疗产品领域内使用；使得重组角蛋白的应用领域更加广泛。
具体实施方式
下面将结合本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本发明的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本发明提供了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后，再进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)采用Ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；
3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。
优选地，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris pH7.0。
优选地，所述步骤1)中高压匀浆的压力为800～2000Bar，高压匀浆3～5次。
优选地，所述步骤1)中采用冷冻高速离心机收集上清液，所述冷冻高速离心机的分离转速为8000～12000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min。
优选地，所述步骤1)中采用0.22um中空纤维或者滤膜过滤上清液。
优选地，所述步骤2)的具体操作为：取装有Ni亲和层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
优选地，所述步骤3)的具体操作为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5MNaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
优选地，所述步骤2)中Ni亲和层析柱中的介质为Ni SMart Beads 6FF、Ni NTABeads 6FF、Ni-TED Purose 6Fast Flow、Ni-TED Purose 6FF或Ni Sepharose 6Fast Flow中的一种；
所述步骤2)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M UreapH8.0；
所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M UreapH8.0；
所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M Urea pH8.0+50-500mM咪唑；
所述步骤2)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致。
优选地，所述步骤3)中阴离子层析柱中的介质为Q Bestarose HighPerformance、Q Sepharose High Performance、Q Beads 6FF、DEAE Bestarose HighPerformance、Q Bestarose Big Beads、Q sepharose Big Beads、Diamond Q、Capto Q、Diamond Q mustang、Capto Q mustang、Capto DEAE、Diamond DEAE或Diamond DEAEmustang中的一种；
所述步骤3)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0任一种或两种；
所述步骤3)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致。
优选地，所述步骤1)中、步骤2)中和步骤3中均需要进行蛋白指标检测；所述蛋白指标检测采用SDS-PAGE凝胶电泳检测法和高效液相色谱检测法进行检测。
实施例1
本发明提供了一种重组角蛋白分离纯化方法，包括如下步骤：
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于5-100mM PB缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为800Bar，高压匀浆3次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为8000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)取装有Ni SMart Beads 6FF介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用5-100mMPB缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用5-100mM PB缓冲液清洗杂质，用5-100mM PB缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
3)取装有Q Bestarose High Performance介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用5-100mM PB缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致；再用5-100mM PB缓冲液清洗杂质，最后用5-100mM PB缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
实施例2
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于Tris pH7.0缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为1200Bar，高压匀浆4次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为9000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)取装有Ni NTA Beads 6FF介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用Tris+8MUreapH8.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用Tris+8M UreapH8.0缓冲液清洗杂质，用Tris+8MUreapH8.0+50-500mM咪唑缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5MNaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
3)取装有DEAE Bestarose High Performance介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用Tris pH7.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致；再用Tris pH7.0缓冲液清洗杂质，最后用Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5MNaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
实施例3
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于5-100mM PB缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为1600Bar，高压匀浆4次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为10000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)取装有Ni-TED Purose 6FastFlow介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用5-100mM PB缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用5-100mM PB缓冲液清洗杂质，用5-100mM PB缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
3)取装有Q sepharose Big Beads介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用5-100mM PB缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致；再用5-100mM PB缓冲液清洗杂质，最后用5-100mM PB缓冲液和Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
实施例4
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于Tris pH7.0缓冲液后进行高压匀浆后，设置高压匀浆的压力为2000Bar，高压匀浆5次；再采用冷冻高速离心机收集上清液，设置冷冻高速离心机的分离转速为11000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min，进行离心处理收集上清液；最后对上清液用0.22um中空纤维对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)取装有Ni-TED Purose 6FF介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用Tris+8MUreapH8.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致；再用Tris+8M Urea pH8.0缓冲液清洗杂质，用Tris+8MUreapH8.0+50-500mM咪唑缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5MNaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱；
3)取装有Diamond DEAE mustang介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用TrispH7.0缓冲液平衡层析柱后上样，平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致；再用Tris pH7.0缓冲液清洗杂质，最后用5-100mM缓冲液和Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
通过对实施例1-4中步骤1)、步骤2)、步骤3)操作后的重组角蛋白进行检测得到表1。
表1为各实施例中蛋白的浓度测定表
从表中可以看出，通过本发明对重组角蛋白能够进行有效的分离，并且本发明对重组角蛋白的分离纯度完全能够达到90-95％，使得分离后的重组角蛋白的纯度完全满足用于医疗产品等领域的要求，使得重组角蛋白的应用范围更广。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (10)
1.一种重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将表达重组角蛋白的大肠杆菌进行发酵，然后再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥，再将菌泥溶解于缓冲液后进行高压匀浆后，再进行离心收集上清液，最后对上清液进行过滤得到含有重组角蛋白的滤液；
2)采用Ni亲和层析柱对步骤1)中得到含有重组角蛋白的滤液进行分离，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；
3)采用阴离子层析柱对步骤2)得到的含重组角蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集二次洗脱缓冲液。
2.根据权利要求1所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris pH7.0。
3.根据权利要求1或2所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中高压匀浆的压力为800～2000Bar，高压匀浆3～5次。
4.根据权利要求3所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中采用冷冻高速离心机收集上清液，所述冷冻高速离心机的分离转速为8000～12000r/min，分离温度为4℃，分离时间为10min。
5.根据权利要求1或4任一所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中采用0.22um中空纤维或者滤膜过滤上清液。
6.根据权利要求5所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤2)的具体操作为：取装有Ni亲和层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱后，用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含重组角蛋白的洗脱缓冲液；最后用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
7.根据权利要求6所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤3)的具体操作为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用纯水处理层析柱，之后用平衡缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，最后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含有重组角蛋白的洗脱缓冲液；用0.5M NaOH溶液清洗结合能力强的杂质，用20％乙醇保存层析柱。
8.根据权利要求6所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤2)中Ni亲和层析柱中的介质为Ni SMart Beads 6FF、Ni NTA Beads 6FF、Ni-TED Purose 6Fast Flow、Ni-TED Purose 6FF或Ni Sepharose 6Fast Flow中的一种；
所述步骤2)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M Urea pH8.0；
所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M Urea pH8.0；
所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或者Tris+8M Urea pH8.0+50-500mM咪唑；
所述步骤2)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的紫外吸收值与平衡缓冲液的紫外吸收值保持一致。
9.根据权利要求7所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤3)中阴离子层析柱中的介质为Q Bestarose High Performance、Q Sepharose High Performance、QBeads 6FF、DEAE Bestarose High Performance、Q Bestarose Big Beads、Q sepharoseBig Beads、Diamond Q、Capto Q、Diamond Q mustang、Capto Q mustang、Capto DEAE、Diamond DEAE或Diamond DEAE mustang中的一种；
所述步骤3)中平衡缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中清洗缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris pH7.0；
所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mM PB缓冲液或Tris+0.1-0.5M NaCl pH7.0任一种或两种；
所述步骤3)中平衡缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与平衡缓冲液的PH和电导保持一致。
10.根据权利要求7所述的重组角蛋白分离纯化方法，其特征在于，所述步骤1)中、步骤2)中和步骤3中均需要进行蛋白指标检测；所述蛋白指标检测采用SDS-PAGE凝胶电泳检测法和高效液相色谱检测法进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110014907.3A CN112646045A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种重组角蛋白分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110014907.3A CN112646045A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种重组角蛋白分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112646045A true CN112646045A (zh) | 2021-04-13 |
Family
ID=75367467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110014907.3A Pending CN112646045A (zh) | 2021-01-06 | 2021-01-06 | 一种重组角蛋白分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112646045A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113512574A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-10-19 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白生产方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1408872A (zh) * | 2001-09-29 | 2003-04-09 | 上海汉殷药业有限公司 | 一种重组人角质细胞生长因子的质粒载体、其宿主及制备重组人角质细胞生长因子的方法 |
| US20090171070A1 (en) * | 1999-01-30 | 2009-07-02 | Novozymes Biopharma Uk Limited | Process for the Purification of Recombinant Albumin |
| CN105848746A (zh) * | 2013-09-05 | 2016-08-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于层析重复利用的方法 |
| CN109503704A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-03-22 | 平湖优谱生物技术有限公司 | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 |
| CN112156224A (zh) * | 2020-01-20 | 2021-01-01 | 海南海默斯医学生物科技有限公司 | 用于制备角蛋白液体敷料的组合物及其制备方法和应用 |
| CN112957286A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-15 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白医用面膜及其制备方法 |
-
2021
- 2021-01-06 CN CN202110014907.3A patent/CN112646045A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090171070A1 (en) * | 1999-01-30 | 2009-07-02 | Novozymes Biopharma Uk Limited | Process for the Purification of Recombinant Albumin |
| CN1408872A (zh) * | 2001-09-29 | 2003-04-09 | 上海汉殷药业有限公司 | 一种重组人角质细胞生长因子的质粒载体、其宿主及制备重组人角质细胞生长因子的方法 |
| CN105848746A (zh) * | 2013-09-05 | 2016-08-10 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于层析重复利用的方法 |
| CN109503704A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-03-22 | 平湖优谱生物技术有限公司 | 一种重组人铁蛋白分离纯化方法 |
| CN112156224A (zh) * | 2020-01-20 | 2021-01-01 | 海南海默斯医学生物科技有限公司 | 用于制备角蛋白液体敷料的组合物及其制备方法和应用 |
| CN112957286A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-06-15 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白医用面膜及其制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| PHILIP M. CUMMINS 等: "Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application", 《PROTEIN CHROMATOGRAPHY》 * |
| TIMOTHY M.PABST 等: "Comparison of strong anion-exchangers for the purification of a PEGylated protein", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| 刘长林 等: "《研究设计型化学实验教程》", 31 December 2013, 华中师范大学出版社 * |
| 周勤: "《医药分子生物学实验教程》", 31 March 2008, 中山大学出版社 * |
| 李薇等: "人细胞角蛋白8(CK8)基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达", 《细胞与分子免疫学杂志》 * |
| 黄鹏: "密码子优化提高重组金葡菌肠毒素O在大肠杆菌中的表达水平", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113512574A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-10-19 | 海默斯（重庆）医学生物技术有限公司 | 一种重组角蛋白生产方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10590161B2 (en) | Ion exchange purification of mRNA | |
| JP3676817B2 (ja) | 新規因子ｉｘ精製法 | |
| Luding et al. | Isolation of lysozyme from chicken egg white using polyacrylamide-based cation-exchange cryogel | |
| JP2012532932A5 (zh) | ||
| KR101831300B1 (ko) | 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 | |
| US10981975B2 (en) | Method for efficient purification of human serum albumin | |
| Clemmitt et al. | Immobilised metal affinity chromatography of β-galactosidase from unclarified Escherichia coli homogenates using expanded bed adsorption | |
| CN112646045A (zh) | 一种重组角蛋白分离纯化方法 | |
| CN109879930B (zh) | 一种重组蛋白的纯化方法 | |
| CN107868120B (zh) | 一种达托霉素的纯化方法 | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| CN115925890A (zh) | 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法 | |
| CN108355618B (zh) | 牛来源透明质酸酶亲和介质及其吸附方法 | |
| CN112175063B (zh) | 一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺 | |
| CN116497009A (zh) | 一种从蛇毒粉中提取降纤酶的方法 | |
| CN114409765A (zh) | 抗体的纯化方法 | |
| CN107033236B (zh) | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 | |
| EP3919613A1 (en) | Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna | |
| WO1995029187A1 (en) | Chromatographic process for the copurification of chondroitinase i and ii proteins | |
| CN116262774A (zh) | 一种重组蛋白纯化方法 | |
| EP1448297B1 (de) | Verfahren zur Reduktion des Ligand-Leakage von Affinitätschromatographie-Matrices | |
| CN1250567C (zh) | 钙离子结合蛋白的提纯方法 | |
| CN105541994B (zh) | 一种血小板生成素或其变体或衍生物的纯化方法 | |
| CN111233983A (zh) | 猪圆环病毒cap蛋白一步法大规模纯化及内毒素去除工艺 | |
| CN113121638B (zh) | 一种纯化重组蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210413 |