KR101831300B1 - 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 - Google Patents

재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고순도 및 고수율로 대량 정제하는데 유용한 방법을 제공한다. 본 발명의 정제방법은 별도의 활성화 공정 없이 간단하게 인체 내에서 발현되는 천연형과 동일한 기능을 갖는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고수율 및 고순도로 정제할 수 있다. 특히, 본 발명의 정제방법에 따르면 대장균 내에서 발현된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 변형체들이 효율적으로 제거되어 높은 생리활성을 나타내는 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 수득할 수 있다.

Description

재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법{METHOD OF PURIFYING HUMAN GRANULOCYTE-COLONY STIMULATING FACTOR FROM RECOMBINANT E. COLI}
본 발명은 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자(human granulocyte-colony stimulating factor; hG-CSF)를 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득된 세포 침전물로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리하는 단계; (c) 단계 (b)에서 수득된 상청액에 산을 처리하고 그로부터 생성된 침전물을 여과하여 분리하는 단계: (d) 단계 (c)에서 수득된 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계; (e) 단계 (d)에서 수득된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (f) 단계 (e)에서 수득된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 재조합 대장균으로부터 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고수율로 정제하는 방법에 관한 것이다.
콜로니 자극인자(colony stimulating factor; CSF)로 통칭되는 인자는 T-세포, 단구성 대식세포, 섬유아세포 및 내피세포와 같은 세포에서 생산되며, 이들 세포는 정상적으로 생체 내에 광범위하게 분포되어 있다. CSF에는 GM-CSF, M-CSF, G-CSF 등이 알려져 있다. 이들 중 GM-CSF는 과립구 대식세포-콜로니 자극인자(granulocyte macrophage-CSF)로 과립성 백혈구 또는 단구성 대식세포의 줄기세포(stem cell)에 작용하여 세포 증식을 자극하고 분화를 유도함으로써 과립성 백혈구 또는 단구성 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는다. M-CSF(macrophage-CSF)는 대식세포-콜로니 자극인자로, 주로 단구성 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는다. G-CSF(granulocyte-CSF)는 과립구-콜로니 자극인자로 과립성 백혈구의 콜로니 생성을 촉진하고 최종 단계로의 분화를 유도하는 작용을 갖는다.
종래 G-CSF를 분리, 정제하는 방법으로, 세포를 배양하여 그 상층액으로부터 G-CSF 단백질을 분리하는 방법이 있으나, 이 방법은 G-CSF의 수율이 낮아 대량생산에 적합하지 않았다. 그 외에, 일본 쥬가이사는 인간 과립구 콜로니 자극인자의 아미노산 서열을 함유하는 게놈 DNA 유전자 또는 cDNA 유전자를 이용하여 동물세포로부터 당쇄화된 인간 과립구 콜로니 자극인자 당단백질을 제조하는 방법을 개발하였다(대한민국 특허 제47178호, 제53723호 및 제57582호). 그러나 당쇄화된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 당은 이 자극인자의 활성에 필수적이지 않은 것으로 이미 알려져 있고, 동물세포의 이용은 고가의 동물세포용 배지 및 공정을 요구하여 비경제적인 단점이 있다.
원핵세포를 이용하여 비당쇄화된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 제조하는 방법에서는, 개시코돈 위치에 존재하는 ATG 코돈에 의해 N-말단에 메티오닌이 부가된 형태로 생산되어 천연형과는 다른 인간 과립구 콜로니 자극인자가 형성된다. 또한, 균체 내 생산방법을 이용한 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산은 숙주세포 또는 배양 물질로부터 유래하는 불순물에 의해 오염될 수 있어 고순도 의약품을 정제하기 위해서는 까다로운 정제공정을 거쳐야 한다. 뿐만 아니라 대장균을 숙주로 사용하는 경우, 대부분의 인간 과립구 콜로니 자극인자는 불용성 물질로 세포질 내에 축적되므로 리폴딩(refolding) 공정을 거쳐 활성화된 형태로 전환시켜야 하기 때문에 매우 비효율적이다. 또한, 이 공정 도중에 부분적으로 환원된 상태, 분자간 이황화 결합체 또는 잘못된 이황화 결합체 등이 유발되어 이들을 다시 제거해야 하는 번거로움 및 역가의 손실이 초래되고, 이황화 결합에 참여하지 않는 1개의 시스테인 잔기는 유리(free) 상태로 존재하여 추가적인 역가의 손실뿐만 아니라 단백질의 용액 내 안정성을 저하시킨다는 문제점이 있다.
따라서 미생물을 이용하면서, 아미노 말단에 메티오닌 잔기가 부가되지 않은 천연형과 동일한 인간 과립구 콜로니 자극인자를 대량으로 얻을 수 있는 방법이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위한 일환으로, 이미 공지된 대장균의 분비 단백질인 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 분비서열을 변화시켜 높은 발현률을 나타내는 새로운 분비서열(대한민국 특허 제316347호)을 제조하였고, 이를 이용하여 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 대장균의 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 변형된 분비서열 다음에 엔테로톡신 유전자 대신 인간 과립구 콜로니 자극인자 유전자를 연결시킨 재조합 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하고 이를 이용하여 대장균을 형질전환시킴으로써, 미생물의 분비 시스템을 이용하여 생물학적 활성을 갖는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 페리플라즘 내로 발현시킬 수 있음을 확인하였다(대한민국 특허 제356140호).
이처럼 페리플라즘 내로의 단백질 분비를 이용한 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생산은 N-말단에 메티오닌이 없는 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자를 가용화 형태로 얻을 수 있고, 페리플라즘 내의 단백질 양이 전체 세포질 내의 단백질에 비해 상대적으로 적은 10% 미만이므로 훨씬 더 용이하게 정제할 수 있으며, 세포를 파쇄하는 공정이 불필요하여 세포질 내에 존재하는 당류 및 핵산류 등의 오염을 최소화할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 페리플라즘 내로의 단백질 생산은 발현량이 낮아 산업화에 어려움이 있으므로, 발현된 단백질을 고수율 및 고순도로 정제할 수 있는 효율적인 방법이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 당업계의 직면한 요구를 해결하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 재조합 대장균을 배양하여 분비된 단백질을 얻고, 이를 산 침전 → 양이온 교환 크로마토그래피 → 소수성 상호작용 크로마토그래피 → 음이온 교환 크로마토그래피의 순차적인 처리에 적용하면 천연형의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고순도로 대량 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은
(a) 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 세포 침전물로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 상청액에 산을 처리하고 그로부터 생성된 침전물을 여과하여 분리하는 단계:
(d) 단계 (c)에서 수득된 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 수득된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 수득된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 재조합 대장균으로부터 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고수율로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 재조합 대장균으로부터 분리, 정제된 높은 생리활성을 나타내고 변형체들이 제거된 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 제공하는 것이다.
본 발명은 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 별도의 활성화 공정 없이 간단하면서도 고순도로 대량 정제하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 정제방법은
(a) 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 세포 침전물로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 상청액에 산을 처리하고 그로부터 생성된 침전물을 여과하여 분리하는 단계:
(d) 단계 (c)에서 수득된 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계;
(e) 단계 (d)에서 수득된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 수득된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 정제방법의 특징은 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 산 침전 후 일련의 크로마토그래피(양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피)에 적용함으로써 약제학적 사용에 적합한 고도로 순수한 형태의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제할 수 있다는 것이다.
이하, 본 발명에 따른 정제방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a)는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하는 단계이다. 이 단계에 사용되는 재조합 대장균은 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는, 바람직하게는 페리플라즘 내로 발현하는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 인간 과립구 콜로니 자극인자는 재조합 대장균에서 가용성으로 발현된다. 본 발명에서, 인간 과립구 콜로니 자극인자를 페리플라즘 내로 발현하는 재조합 대장균은, 분비서열과 인간 과립구 콜로니 자극인자가 융합된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 재조합 대장균이다. 상기 재조합 대장균의 대표적인 예로는, 본 발명자들의 선행 특허 제356140호에 개시된, 대장균의 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 변형된 분비서열과 인간 과립구 콜로니 자극인자가 융합된 발현벡터로 형질전환된 대장균 HM10310, HM10311(KCCM-10154), HM10409, HM10410(KCCM-10151), HM10411(KCCM-10152), HM10413, HM10414, HM10415, HM10510(KCCM-10153), HM10511 및 HM10512를 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
인간 과립구 콜로니 자극인자를 재조합 대장균의 페리플라즘 내로 발현시키기 위하여, 상기 재조합 대장균을 LB 배지가 들어 있는 발효조 중에서 탄소원으로서 포도당 1 내지 300 g/ℓ, 무기염류로서 KH2PO4 2 내지 15 g/ℓ, (NH4)2HPO4 0.5 내지 3 g/ℓ, NaCl 2 내지 10 g/ℓ 및 MgCl2 0.5 내지 10 g/ℓ와, 각종 미량원소, 효모 추출물과 트립톤을 추가로 첨가하면서 유가식 배양(fed-batch culture)을 할 수 있다. 이러한 배지 조성은 재조합 대장균의 고농도 배양과 대장균에서 인간 과립구 콜로니 자극인자의 페리플라즘 내로의 고발현에 특히 적합하다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 재조합 대장균 HM10411(KCCM-10152)을 사용하여 실험한 결과에 따르면, 상기 배지 조성이 재조합 대장균의 배양 농도, 대장균 내 인간 과립구 콜로니 자극인자의 발현량 및 페리플라즘 내로의 분비율을 탁월하게 증가시키는 것으로 확인되었다. 이렇게 수득된 재조합 대장균 배양액을 원심분리하여 세포 침전물을 얻는다.
단계 (b)는 단계 (a)에서 수득된 세포 침전물로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리하는 단계이다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 인간 과립구 콜로니 자극인자를 페리플라즘 내로 발현하는 재조합 대장균을 사용하는 경우, 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 페리플라즘 단백질은 삼투압 추출에 의해 세포로부터 분리될 수 있다. 이 경우, 단계 (b)는 세포 침전물에 수크로스가 함유된 완충용액을 가한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하고, 상기 세포 침전물에 증류수를 가한 후 원심분리하여 페리플라즘 단백질을 포함하는 상청액을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계에서 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함한 페리플라즘 단백질들이 삼투압에 의해 추출된다. 먼저, 세포 침전물을 수크로스가 함유된 완충용액, 예를 들어 10% 내지 30% 수크로스가 함유된 완충용액으로 처리하면 세포가 수축된 상태로 존재한다. 이 상태의 세포 침전물에 증류수를 처리하면 수축된 세포가 다시 팽창하면서 세포벽이 느슨해진다. 그로 인해 세포막이 파괴되지 않으면서 세포막과 세포벽 사이에 위치하는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함한 페리플라즘 단백질들이 느슨해진 세포벽을 통해 추출된다. 단계 (b)의 삼투압 추출에는 수크로스, 글로코스, MgCl2, 염화나트륨 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 수크로스 완충용액이 사용된다. 이렇게 추출된 추출액을 원심분리하여 페리플라즘 단백질이 포함된 상청액을 수득한다.
단계 (c)는 단계 (b)에서 수득된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액에 산을 처리하고 그로부터 생성된 침전물을 여과하여 분리하는 산 침전 단계이다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 인간 과립구 콜로니 자극인자를 페리플라즘 내로 발현하는 재조합 대장균을 사용하는 경우, 페리플라즘 단백질을 포함하는 상청액으로부터 산 침전에 의해 가용성 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리할 수 있다. 구체적으로, 단계 (b)에서 수득된 상청액에 산을 처리하여 상청액의 pH를 5.0 내지 5.8, 바람직하게는 5.3 내지 5.5로 조절하게 되면, 상청액 내 페리플라즘 단백질을 포함하는 불용성 물질이 침전되고, 이 침전물을 여과하여 제거하면 가용성 인간 과립구 콜로니 자극인자가 포함된 상청액을 수득할 수 있다. 단계 (c)의 산 침전에 적합한 산으로는 아세트산, 인산, 구연산 등을 예로 들 수 있고, 아세트산이 바람직하다. 여과는 적절한 필터를 사용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 0.45 내지 3 ㎛ 필터를 사용하여 수행한다. 본 발명에서는 인간 과립구 콜로니 자극인자가 페리플라즘으로 분비되는 재조합 대장균을 사용하기 때문에, 대장균 전체를 파쇄할 필요 없이 배양액으로부터 간단히 페리플라즘 분획을 얻어 인간 과립구 콜로니 자극인자를 추출할 수 있다.
단계 (d)는 단계 (c)에서 수득된 가용성 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계로, 이 과정을 통해 숙주세포 유래 또는 배지 성분 유래의 불순물이 다량 제거됨으로써 정제 효율을 높일 수 있다.
본 발명에 사용되는 양이온 교환 크로마토그래피의 칼럼 기능기(functional group)는 약 양이온(weak cation)인 카르복시메틸(CM-), 카르복시(C-)뿐만 아니라, 강 양이온(strong cation)인 설포(S-), 설포메틸(SM-), 설포에틸(SE-), 설포프로필(SP-) 및 포스포(P-) 등이 다양하게 이용될 수 있으며, 칼럼 레진으로는 세파로스(Sepharose), 세파덱스(Sephadex), 아가로스(agarose), 세파셀(Sephacel), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 셀룰로스(Cellulose) 및 토요펄(Toyoperl) 등이 다양하게 이용될 수 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 정제방법은 SP-세파로스 칼럼을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한다.
본 발명에서 양이온 교환 크로마토그래피는 pH 4.0 내지 6.0, 바람직하게는 pH 5.0 내지 6.0을 유지하면서, 염의 농도가 500 mM 이하, 바람직하게는 200 내지 500 mM이고 아세트산을 함유한 완충용액을 용출액으로 사용하여 실시한다. 이에 사용되는 양이온 교환 칼럼은 용출물을 로딩하기 전에 완충용액으로 평형화될 수 있다. 양이온 교환 칼럼의 평형화는 pH 5.0 내지 6.0의 수성 완충용액을 조건에 따라 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 양이온 교환 칼럼은 10 mM 소듐 아세테이트를 함유하는 완충용액(pH 5.4)으로 미리 평형화된다. 이처럼 평형화된 양이온 교환 칼럼에 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 여과액을 로딩하여 흡착시킨 후, 상기 평형화 완충용액으로 칼럼을 세척하여 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 및 불순물을 제거한다. 이어서 상기 평형화 완충용액에 염화나트륨이 첨가된 용출 완충용액을 양이온 교환 칼럼에 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다. 이때, 용출 완충용액은 칼럼 부피의 3 내지 7배의 용량으로 흘려주는 것이 바람직하다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 5 내지 20 mM 소듐 아세테이트 및 300 내지 400 mM NaCl을 함유하는 pH 5.2 내지 5.6의 완충용액을 4 내지 6배 칼럼 용량으로 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다.
상기 단계에서 숙주세포 유래 펩티드 또는 배양액의 배지 성분들은 그대로 칼럼을 통과하거나 세척 과정에서 제거되어 다량의 불순물을 효과적으로 제거할 수 있다.
단계 (e)는 단계 (d)에서 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하는 단계로, 전단계의 양이온 교환 크로마토그래피 용출액에 포함되어 있던 불순물을 더욱 제거하여 순도를 높이는 단계이다.
본 발명에 사용되는 소수성 상호작용 크로마토그래피는 시판되고 있는 여러 종류의 매질에 결합된 소수성, 적합하게는 방향족 또는 지방족의 전하를 띄지 않는 리간드를 갖는 겔에서 수행될 수 있다. 전하를 띄지 않는 리간드가 형성되도록 통상의 결합 기술에 의해 리간드를 매질에 결합시킬 수 있다. 이러한 기술로는, 글리시딜-에테르 결합을 이용하는 방법, 아가로스 매질을 수중에서 글리시독시프로필트라이메톡시 실란으로 활성화한 후 알코올 중에서 리간드를 고정하는 방법, 아가로스 매질을 1,4-부탄디올 다이글리시딜 에테르와 같은 비스-에폭사이드로 활성화한 후 아미노알킬 또는 알킬 머캅탄과 같은 리간드에 결합시키는 방법, 1,1-카르보닐다이이미다졸 활성화 및 다이비닐설폰 활성화 방법 등이 있다. 상기 모든 기술로부터 얻은 겔은 전체 pH 범위에서 전하를 띄지 않는다. 지방족 리간드는 예를 들면, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸과 같은 직쇄 알킬이거나, 아이소- 또는 네오알킬과 같은 측쇄 알킬이거나, 올리고에틸렌 글리콜일 수 있다. 방향족 리간드는 바람직하게는 페닐이다. 매질은 공지의 다양한 강친수성 매질 중에서 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들면 세파로스(Sepharose)와 같은 아가로스 매질, TSK-GEL과 같은 유기 고분자 매질, 고다공성 유기 고분자 매질 등이 있다. 바람직한 매질은 아가로스 매질이다. 적합한 아가로스 매질에는 세파로스(Amersham Biosciences), 바이오-겔 A(Bio-Gel A)(Bio-Rad Laboratories), 미니릭크(Minileak)(Kem-En-Tec Diagnostics A/S) 등이 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 소수성 상호작용 크로마토그래피는 부틸-세파로스 겔에서 실시한다.
본 발명에서 소수성 상호작용 크로마토그래피는 pH 7.0 내지 8.5, 바람직하게는 pH 7.5 내지 8.0을 유지하면서, 염의 농도가 100 mM 이하, 바람직하게는 0 내지 50 mM인 완충용액을 용출액으로 사용하여 실시한다. 이에 사용되는 소수성 상호작용 칼럼은 용출물을 로딩하기 전에 완충용액으로 평형화될 수 있다. 소수성 상호작용 칼럼의 평형화는 pH 6.8 내지 8.5의 수성 완충용액을 조건에 따라 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 300 mM 암모늄 설페이트 및 10 mM Tris를 함유하는 완충용액(pH 7.5)으로 미리 소수성 상호작용 칼럼을 평형화시킨다. 이처럼 평형화된 소수성 상호작용 칼럼에 앞선 단계에서 얻은 용출액을 로딩하여 인간 과립구 콜로니 자극인자를 칼럼에 흡착시킨 후, 상기 평형화 완충용액으로 칼럼을 세척하여 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 및 불순물을 제거한다. 이어서 상기 평형화 완충용액에서 암모늄 설페이트를 제거한 용출 완충용액을 소수성 상호작용 칼럼에 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다. 이때, 용출 완충용액은 칼럼 부피의 1 내지 4배의 용량으로 흘려주는 것이 바람직하다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 5 내지 20 mM Tris를 함유하는 pH 7.0 내지 8.0의 완충용액을 1.2 내지 2.5배 칼럼 용량으로 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다.
일반적으로, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 실시하기에 앞서 분획의 전도성을 높이기 위해 분획에 염을 첨가할 수 있다. 그런 다음 낮은 이온 세기의 완충액을 사용하여 매질로부터 용출한다. 바람직하게 본 발명의 소수성 상호작용 크로마토그래프는 단계 (d)에서 얻은 용출액에 암모늄 설페이트를 첨가하여 평형화 완충용액과 유사하게 전도성을 높인 후 평형화된 소수성 상호작용 칼럼에 로딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시에서 소수성 상호작용 크로마토그래피는 전단계의 양이온 교환 크로마토그래피의 용출액을 전처리 없이 그대로 로딩할 수 있으며, 인간 과립구 콜로니 자극인자는 칼럼에 흡착하고 불순물은 그대로 컬럼을 통화하거나 세척 단계에서 제거되므로 정제 효율을 더욱 높일 수 있다.
단계 (f)는 단계 (e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 용출된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계로, 전단계의 소수성 상호작용 크로마토그래피 용출액에 포함되어 있던 불순물을 완전히 제거하는 단계이다.
본 발명에 사용되는 음이온 교환 크로마토그래피는 일반적으로 3급 또는 4급 아민 그룹(예컨대, 다이에틸아미노에틸, 트라이에틸아미노에틸, 벤조릴화된 다이에틸아미노에틸 등)으로 유도체화된 불용성의 입자성 지지체를 포함하는 매질을 사용하여 실시한다. 적합한 지지체에는 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 폴리스티렌 비드 등이 포함된다. 트라이에틸아미노에틸 그룹으로 유도체화된 지지체가 바람직하다. 적합한 음이온 교환 매질로는 Q-세파로스(Amersham Biosciences), 마크로-프렙 Q(Macro-Prep Q)(Bio-Rad Laboratories), Q-하이퍼디(Q-HyperD)(BioSepra, Inc.), 프락토겔(Fractogel) EMD-TMAE 650(Merck) 등을 예로 들 수 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서, 본 발명의 음이온 교환 크로마토그래피는 Q-세파로스 칼럼을 사용한다.
본 발명에서 음이온 교환 크로마토그래피는 pH 6.8 내지 8.5, 바람직하게는 pH 7.0 내지 8.0을 유지하면서, 염의 농도가 300 mM 이하, 바람직하게는 100 내지 250 mM인 완충용액을 용출액으로 사용하여 실시한다. 이에 사용되는 음이온 교환 칼럼은 용출물을 로딩하기 전에 완충용액으로 평형화될 수 있다. 음이온 교환 칼럼의 평형화는 pH 6.8 내지 8.5의 수성 완충용액을 조건에 따라 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 10 mM Tris 및 100 mM 요소를 함유하는 완충용액(pH 7.5)으로 미리 음이온 교환 칼럼을 평형화시킨다. 이처럼 평형화된 음이온 교환 칼럼에 앞선 단계에서 얻은 용출액을 로딩하여 인간 과립구 콜로니 자극인자를 칼럼에 흡착시킨 후, 상기 평형화 완충용액으로 칼럼을 세척하여 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 및 불순물을 제거한다. 이어서 상기 평형화 완충용액에 염화나트륨이 첨가된 용출 완충용액을 음이온 교환 칼럼에 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다. 이때, 용출 완충용액은 칼럼 부피의 1.5 내지 5배의 용량으로 흘려주는 것이 바람직하다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 5 내지 20 mM Tris, 50 내지 200 mM 요소 및 150 내지 250 mM NaCl을 함유하는 pH 7.0 내지 8.0의 완충용액을 2 내지 4배 칼럼 용량으로 흘려주어 칼럼에 흡착되어 있는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출한다.
전술한 바와 같은, 본 발명에 따른 산 침전 및 일련의 크로마토그래피 조합을 통해 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자는 역상 고속 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 결과, 99% 이상의 고순도를 나타내면서 고수율로 정제되었을 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 방법에 따라 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자는 N-말단 서열분석에서 천연형의 인간 과립구 콜로니 자극인자와 동일한 서열을 갖고 있으며, 숙주세포 유래의 단백질은 100 ng/mg 이하, 숙주세포 유래 DNA는 100 pg/mg 이하, 내독소는 10 EU/IU hG-CSF 이하로 포함하면서 우수한 생리활성을 가지고 있음을 확인하였다. 상기 결과로부터, 본 발명에 따른 정제방법으로 재조합 대장균의 페리플라즘으로 분비된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하면, 역가 손실 및 칼럼 공정 선택의 한계를 동시에 극복하면서 생리활성 및 순도가 매우 높은 인간 과립구 콜로니 자극인자를 대량으로 수득할 수 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명의 정제방법에 따라 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 역시 본 발명의 범위 내에 포함된다.
상기 약학적 조성물의 제조에 관한 사항 및 그 효과는 당해 분야에서 숙련자에게 잘 알려져 있으므로, 본 발명에서는 그의 상세한 설명을 생략한다.
또한, 본 발명에 따른 정제방법은 재조합 대장균의 대량 배양액으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고수율 및 고순도로 정제할 수 있다는데 발명의 특징이 있다. 본 발명에서 "대량 배양액"이라는 용어는 50 ℓ 이상의 배지에서 발효 수준으로 재조합 대장균을 배양하여 얻은 배양액을 의미하며, 바람직하게 80 ℓ 이상, 더욱 바람직하게는 100 ℓ 이상의 배양액이다. 발명의 바람직한 일 양태에서는, 1 ℓ의 멸균 배지에 재조합 대장균을 접종하여 1차 종균 배양액을 얻고, 이를 다시 14 ℓ의 멸균 배지에 접종하여 2차 종균 배양액을 얻은 후, 최종적으로 120 ℓ의 멸균 배지에 접종하여 발효하고, 추가 배지를 이용하여 유가식 배양을 수행함으로써 재조합 대장균의 배양액 180 ℓ을 수득한다. 대한민국 등록특허 제356140호에 기술된 방법에 따라 재조합 대장균의 대량 배양액으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 분리, 정제하는 경우에는 1 ℓ당 70 ㎎의 인간 과립구 콜로니 자극인자가 생산되는 등 종래의 방법은 고순도를 유지하면서 고수율로 목적 단백질을 분리, 정제하는데 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 정제방법은 배양액의 부피를 100 ℓ 이상으로 스케일-업(scale-up)시키더라도 산 침전 및 일련의 크로마토그래피 조합을 통해 99% 이상의 고순도를 나타내는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 1 ℓ당 110 ㎎이라는 높은 수율로 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 정제방법은 재조합 대장균의 대량 배양액으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 분리, 정제하는데 효과적으로 적용될 수 있으므로, 이의 산업적 응용 시 종래 정제방법에 비해 더 높은 생산성을 기대할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면 별도의 활성화 공정 없이 간단하게 인체 내에서 발현되는 천연형과 동일한 기능을 갖는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 고수율 및 고순도로 정제할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법에 따르면 대장균 내에서 발현된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 변형체들이 효율적으로 제거되어 높은 생리활성을 나타내는 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 수득할 수 있다.
도 1은 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 발현되어 페리플라즘 내로 분비된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 삼투압 추출 단계, 산 침전 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계에서 수득된 각각의 용액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
레인 1: 표준품
레인 2: 단계 (b)의 1차 원심분리 상층액
레인 3: 단계 (b)의 2차 원심분리 상층액
레인 4: 단계 (c)의 산 침전 후 수득된 상청액
레인 5: 단계 (c)의 여과 후 수득된 여과액
레인 6: 단계 (d)의 SP-세파로스 칼럼 통과액
레인 7: 단계 (d)의 SP-세파로스 칼럼 용출액 1
레인 8: 단계 (d)의 SP-세파로스 칼럼 용출액 2
레인 9: 단계 (e)의 부틸-세파로스 칼럼 통과액
레인 10: 단계 (e)의 부틸-세파로스 칼럼 용출액
도 2는 본 발명의 정제방법에 따라 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수득된 칼럼 용출액을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 정제방법에 따라 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수득된 칼럼 용출액을 역상 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 정제방법에 따라 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 수득된 칼럼 용출액을 크기 배제 고압 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
참조예 1: 페리플라즘 내로 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균의 배양
대장균의 열안정성 엔테로톡신 Ⅱ의 변형된 분비서열과 인간 과립구 콜로니 자극인자가 융합된 발현벡터 pT017SG로 형질전환된 대장균 HM10411(KCCM-10152, 대한민국 특허 제356140호)을 1 ℓ의 멸균 LB 배지(트립톤 10 g/ℓ, 효모 추출물 5 g/ℓ, NaCl 10 g/ℓ)가 들어 있는 유리 배양용기에 접종하여 1차 종균 배양(seed culture)을 수행하였다. 상기 배양액을 강력하게 교반 및 통기시키면서 37℃에서 11 내지 13시간 동안 배양한 후 멸균 LB 배지 14 ℓ가 들어 있는 배양용기에 접종하여 2 내지 3시간 동안 2차 종균 배양을 수행하였다. 이로부터 수득된 배양액을 발효를 위한 종자균으로 사용하여 탄소원으로서 포도당 1.4 g/ℓ, 무기염류로서 KH2PO4 10 g/ℓ, (NH4)2HPO4 2.5 g/ℓ, NaCl 5 g/ℓ 및 MgCl2 1.2 g/ℓ와, 각종 미량원소, 효모 추출물 및 트립톤이 첨가된 120 ℓ의 멸균 배지에 접종하였다. 발효 중에 추가로 포도당과 효모 추출물을 첨가하면서 유가식 배양(fed-batch culture)을 25시간 이상 진행하여 배양액 부피 180 ℓ로 종료하였다. 발효가 종료된 후, 발효액을 7,000 rpm으로 원심분리하여 균체를 얻고 -70℃에 보관하였다.
실시예 1: 재조합 대장균 배양액으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자의 정제
<1-1> 페리플라즘 단백질의 삼투압 추출
상기 참조예에서 얻은 대장균 균체를 170 ℓ의 수크로스 완충용액(20% 수크로스, 1 mM EDTA, 30 mM Tris, pH 7.5)에 현탁하고 90분간 교반한 후 7,000 rpm으로 1차 원심분리하여 펠렛을 분리하였다. 분리된 펠렛에 4℃의 증류수 170 ℓ를 첨가한 후 다시 7,000 rpm으로 2차 원심분리하여 펠렛은 제거하고 페리플라즘 단백질이 포함된 상청액을 분리하였다. 이 과정에서 대장균 균체의 페리플라즘 내에 존재하는 단백질이 추출되었다. 상기 1차 원심분리 및 2차 원심분리 과정에서 수득된 상청액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 1의 레인 2 및 3).
<1-2> 산 침전
상기 실시예 <1-1>에서 수득된 페리플라즘 단백질이 포함된 상청액에 1% 아세트산을 가하여 pH를 5.6 내지 5.7로 조절하였다. 이때, 산 처리로 인해 상청액 내 포함되어 있던 불용성 물질들이 침전되었고, 이를 여과하여 제거함으로써 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 여과액을 수득하였다. 상기에서 산 처리 후 수득된 상청액 및 여과 후 수득된 여과액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 1의 레인 4 및 5).
<1-3> 양이온 교환 크로마토그래피
상기 실시예 <1-2>에서 수득된 여과액으로 SP-세파로스(SP-sepharose) 칼럼을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 완충용액 1(10 mM 소듐 아세테이트, pH 5.4)로 미리 평형화된 SP-세파로스 칼럼에 상기 여과액을 40 ㎝/시간의 유속으로 로딩하여 흡착시킨 후, 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하였다. 이어서 이 칼럼에 칼럼 부피의 5배 용량으로 300 mM 염화나트륨이 포함된 완충용액 1(10 mM 소듐 아세테이트, pH 5.4)을 흘려주어 칼럼으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출하였다. 상기 양이온 교환 크로마토그래피 과정에서 수득된 통과액 및 용출액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 1의 레인 6 내지 8).
<1-4> 소수성 상호작용 크로마토그래피
상기 실시예 <1-3>에서 수득된 용출액에 최종 농도가 300 mM이 되도록 암모늄 설페이트를 첨가하여 희석한 후, 부틸-세파로스(Butyl-sepharose) 칼럼을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 완충용액 2(300 mM 암모늄 설페이트, 10 mM Tris, pH 7.5)로 미리 평형화된 부틸-세파로스 칼럼에 상기 용출액을 80 ㎝/시간의 유속으로 로딩하여 흡착시킨 후, 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하였다. 이어서 이 칼럼에 칼럼 부피의 1.5배 용량으로 암모늄 설페이트를 포함하지 않는 완충용액 2(10 mM Tris, pH 7.5)를 흘려주어 칼럼으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출하였다. 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피 과정에서 수득된 통과액 및 용출액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 1의 레인 9 및 10).
<1-5> 음이온 교환 크로마토그래피
상기 실시예 <1-4>에서 수득된 용출액에 최종 농도가 50 mM이 되도록 요소를 첨가한 후 Q-세파로스 칼럼을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 다음과 같이 수행하였다. 완충용액 3(10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM 요소)으로 미리 평형화된 큐-세파로스 칼럼에 상기 용출액을 60 ㎝/시간의 유속으로 로딩하여 흡착시킨 후, 흡착되지 않은 단백질을 동일 완충용액으로 충분히 세척하여 제거하였다. 이어서 이 칼럼에 칼럼 부피의 3배 용량으로 250 mM 염화나트륨이 포함된 완충용액 3(10 mM Tris, pH 7.5, 100 mM 요소)을 흘려주어 칼럼으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 용출하였다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피 과정에서 수득된 용출액을 SDS-PAGE로 분석하였다(도 2의 레인 2).
상기 실시예 <1-1> 내지 <1-5>의 과정을 통해 재조합 대장균으로부터 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 순도를 확인하기 위하여, SDS-PAGE, N-말단 서열분석, 역상 고압 크로마토그래피 및 크기 배제 고압 크로마토그래피를 수행하였다.
실험예 1: SDS-PAGE 분석
먼저, 상기 실시예 <1-1> 내지 <1-5>의 각 과정에서 수득된 상청액, 칼럼 통과액 및 용출액과 표준품으로 G-CSF(NIBSC, Code No. 88/502)를 통상의 방법에 따라 SDS-PAGE로 분석하였다. SDS-PAGE 분석 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 도 1에서 레인 1은 표준품 G-CSF이고, 레인 2는 실시예 <1-1>의 삼투압 추출 과정에서 수득된 1차 원심분리 상층액이고, 레인 3은 실시예 <1-1>의 삼투압 추출 과정에서 수득된 2차 원심분리 상층액이고, 레인 4는 실시예 <1-2>의 산 침전 과정에서 산 처리 후 수득된 상청액이고, 레인 5는 실시예 <1-2>의 산 침전 과정에서 여과 후 수득된 여과액이고; 레인 6은 실시예 <1-3>의 SP-세파로스 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼 통과액이고, 레인 7 및 8은 실시예 <1-3>의 SP-세파로스 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼 용출액 1 및 2이고, 레인 9는 실시예 <1-4>의 부틸-세파로스 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼 통과액이고, 레인 10은 실시예 <1-4>의 부틸-세파로스 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼 용출액이다. 도 2에서 레인 1은 표준품 Met-hG-CSF이고, 레인 2는 실시예 <1-5>의 Q-세파로스 칼럼 크로마토그래피에서 칼럼 용출액이다.
SDS-PAGE 분석 결과, 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 분리, 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자가 이들의 천연형과 동일한 분자량을 가짐을 확인하였다.
실험예 2: N-말단 서열 분석
상기 실시예 <1-> 내지 <1-5>의 과정을 통해 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자를 SDS-PAGE 겔에 전기영동한 후, PVDF 막에 트렌스퍼하였다. 트렌스퍼한 막을 폰슈(Ponceau) S 용액으로 염색한 후 한국기초과학지원연구원(서울 분소)에 N-말단 아미노산 분석(아미노산 15개)을 의뢰하였다.
그 결과, 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 분리, 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 N-말단 서열이 천연형의 인간 과립구 콜로니 자극인자와 동일하였으며, 이때 숙주 유래 단백질은 100 ng/mg 이하, 숙주 유래 DNA는 100 pg/mg 이하, 내독소는 10 EU/IU hG-CSF 이하로 확인되었다.
실험예 3: 역상 고압 크로마토그래피 분석
상기 실시예 <1-5>에서 수득된 용출액을 부틸실릴 실리카 칼럼에 주입한 후, 이동상으로 0.1% TFA/물과 0.1% TFA/아세토니트릴을 상기 칼럼에 흘려주면서 역상 고압 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 방법으로 분석한 크로마토그램을 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 분리, 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자는 이와 유사한 성질의 미세변형체들이 효과적으로 제거되어 순도가 매우 높음을 확인하였다.
실험예 4: 크기 배제 고압 크로마토그래피 분석
상기 실시예 <1-5>에서 수득된 용출액을 친수성 실리카 겔 칼럼(분자량 20,000 내지 200,000)에 주입하고, 이동상으로 20 mM 인산칼륨(pH 6.0)/200 mM 염화나트륨 용액을 흘려주면서 크기 배제 고압 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 방법으로 분석한 크로마토그램을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 분리, 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자는 이와 유사한 성질의 이상 펩티드가 효과적으로 제거되어 순도가 매우 높음을 확인하였다.
상기 실험예 1 내지 4를 통해 본 발명의 정제방법에 따라 재조합 대장균으로부터 99% 이상의 순도를 갖는 천연형 인간 과립구 콜로니 자극인자를 배양액 1 ℓ당 110 mg의 수율로 획득할 수 있음을 확인하였다. 비교군으로 대한민국 특허 제356140에서 개시된 정제방법(이온교환수지, 흡착 및 겔 여과 칼럼 또는 항체 칼럼럼 크로마토그래피)에 따라 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제한 결과, 99% 이상의 순도를 갖는 인간 과립구 콜로니 자극인자를 배양액 1 ℓ당 70 mg의 수율로 획득하였다. 따라서 본 발명의 정제방법이 대한민국 특허 제356140에서 개시된 정제방법에 비해 99% 이상 고순도의 인간 과립구 콜로니 자극인자를 얻는데 있어 50% 이상 향상된 방법임을 알 수 있다.
실험예 5: 생체 외 역가 분석
본 발명의 정제방법에 따라 수득된 인간 과립구 콜로니 자극인자의 생리활성을 조사하기 위해, 실시예 <1-5>에서 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자와 국제 표준품(NIBSC)을 마우스 유래 골수세포를 대상으로 생체 내 역가 분석을 실시하였다. 구체적으로, 4 내지 6주령 마우스의 대퇴부를 절단하여 골수세포를 회수한 후 이를 적절한 농도가 되도록 배양하였다. 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자와 국제 표준품 시료를 각 농도별(100.00, 33.33, 11.11, 3.70, 1.23, 0.41, 0.14, 0.05, 0.02, 0.01 ng/㎖)로 상기에서 배양한 골수세포와 혼합한 후 이를 2 내지 3일간 배양하였다. 상기 배양액에 [메틸-H2] 티미딘을 첨가하고 10 내지 20시간 동안 추가로 배양한 후 세포를 분리하여 베타-카운터를 이용해 CPM 값을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 정제방법에 따라 분리, 정제된 인간 과립구 콜로니 자극인자가 국제 표준품 기준인 0.6 내지 1.4×108 IU/mg을 만족함을 확인하였다.

Claims (20)

  1. (a) 인간 과립구 콜로니 자극인자를 발현하는 재조합 대장균을 배양한 후 원심분리하여 세포 침전물을 수득하는 단계;
    (b) 단계 (a)에서 수득된 세포 침전물로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액을 분리하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 수득된 상청액에 산을 처리하고 그로부터 생성된 침전물을 여과하여 분리하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 수득된 여과액을 양이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계;
    (e) 단계 (d)에서 수득된 용출액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
    (f) 단계 (e)에서 수득된 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피에 적용하는 단계를 포함하는, 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 인간 과립구 콜로니 자극인자가 재조합 대장균의 페리플라즘 내로 발현되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 대장균이 대장균 BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310), 대장균 BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG(HM 10311; 기탁번호: KCCM-10154), 대장균 BL21(DE3)/pTO1SG(HM 10409), 대장균 BL21(DE3)/pTO1S17SG(HM 10410; 기탁번호: KCCM-10151), 대장균 BL21(DE3)/pTO17SG(HM 10411; 기탁번호: KCCM-10152), 대장균 BL21(DE3)/pTO17TG(HM 10413), 대장균 BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414), 대장균 BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415), 대장균 BL21(DE3)/pBAD2M3VG(HM 10510; 기탁번호: KCCM-10153), 대장균 BL21(DE3)/pBAD17SG(HM 10511) 및 대장균 BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG(HM 10512)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 인간 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 상청액이 세포 침전물로부터 삼투압 추출에 의해 분리되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 삼투압 추출이 세포 침전물에 10 중량% 내지 30 중량% 수크로스가 함유된 완충용액을 처리한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻고, 이 세포 침전물에 증류수를 첨가한 후 원심분리하여 이루어지는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 산 처리에 의해 상청액의 pH가 5.0 내지 5.8로 조절되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 산이 아세트산, 인산 및 구연산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 양이온 교환 크로마토그래피가 교차 결합 아가로스 칼럼 (cross-linked agarose column), 교차 결합 덱스트란 칼럼 (cross-linked dextran column), 아가로스(agarose), 셀룰로스 칼럼, 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리아크릴레이트(Polyacrylate), 셀룰로스(Cellulose) 및 실리카 칼럼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 단계 (d)에서 양이온 교환 크로마토그래피가 교차 결합 아가로스 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서 양이온 교환 크로마토그래피가 pH 4.0 내지 6.0을 유지하면서, 염의 농도가 200 내지 500 mM이고 아세트산을 함유한 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (d)에서 양이온 교환 크로마토그래피가 200 내지 500 mM 염화나트륨 및 5 내지 20 mM 소듐 아세테이트를 포함하는 pH 5.0 내지 6.0의 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피가 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 아이소알킬, 네오알킬 및 올리고에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 갖는 아가로스 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피가 부틸 작용기를 갖는 아가로스 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피가 pH 7.0 내지 8.5를 유지하면서, 염의 농도가 0 내지 100 mM인 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (e)에서 소수성 상호작용 크로마토그래피가 5 내지 20 mM Tris를 포함하는 pH 7.0 내지 8.0의 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 음이온 교환 크로마토그래피가 교차 결합 아가로스 칼럼 (cross-linked agarose column), 폴리메타그릴레이트 레진 칼럼 (polymethacrylate resin column), 하이드로겔 칼럼 (hydrogel column), 및 교차 결합 폴리메타크릴레이트 레진 칼럼(cross-linked polymethacrylate resin column)으로 이루어진 군으로부터 선택된 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계 (f)에서 음이온 교환 크로마토그래피가 교차 결합 아가로스 칼럼을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 단계 (f)에서 음이온 교환 크로마토그래피가 pH 6.5 내지 8.5를 유지하면서, 염의 농도가 100 내지 300 mM인 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 단계 (f)에서 음이온 교환 크로마토그래피가 100 내지 300 mM 염화나트륨, 5 내지 20 mM Tris 및 50 내지 200 mM 요소를 포함하는 pH 7.0 내지 8.0의 완충용액을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  20. 삭제
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