CN112175063B - 一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，属于生物医药技术领域。本发明高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺包括如下步骤：S1、粗纯处理：将重组表皮生长因子的发酵液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；S2、精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子；本发明采用两步高效液相色谱柱处理的方法对重组表皮生长因子进行精纯处理，可有效去除重组表皮生长因子发酵液中的各种杂质，得到高比活性、高纯度的表皮生长因子。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺。
背景技术
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，简称EGF)是广泛存在于哺乳动物体内的一类多肽物质，人表皮生长因子(hEGF)最早在1974年从人尿中提纯。hEGF是由53个氨基酸组成的小分子多肤组成，分子量约为6000道尔顿，等电点约为4.6，分子内有三对二硫键，因而对酸、碱、热等理化因素均较稳定。
hEGF是一种多功能细胞生长因子，具有广泛的生物学效应，通过与细胞膜上hEGF受体结合发挥生理作用。研究表明：表皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的细胞膜上都含有hEGF受体，其中表皮细胞含量最高。hEGF接近细胞后与细胞膜上的hEGEF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应，使得RNA、DNA和蛋白质合成增加，最终促进细胞生长繁殖、加速细胞新陈代谢。hEGF在医学上己用于烧烫伤、溃疡、各类创伤以及角膜损伤等的治疗。EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。
20世纪80年代以前，hEGF的来源主要是通过组织和体液提取，由于hEGF在组织和体液中的含量极微，造成提取成本高且产品纯度低，使hEGF的应用受到了限制。80年代以后，随着基因工程技术的发展，人们通过基因重组技术，利用大肠杆菌、酵母菌等生产hEGF获得了成功，为工业化生产基因重组人表皮生长因子(rhEGF)打下了基础。然而目前采用基因重组技术制得的rhEGF发酵液中的产物浓度低，提取和纯化工艺复杂，而且所获得的hEGF活性不高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，采用两步高效液相色谱柱处理的方法对重组表皮生长因子进行精纯处理，可有效去除重组表皮生长因子发酵液中的各种杂质，得到高比活性、高纯度的表皮生长因子。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：
一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，包括如下步骤：
S1、粗纯处理：将重组表皮生长因子的发酵液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
S2、精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子。
本发明的粗纯处理采用疏水高效液相色谱柱进行，能够有效去除发酵液中的色素，并能去除发酵液中不被疏水高效液相色谱柱吸附的大分子核酸等其他杂质，对发酵液进行初步浓缩纯化；本发明的精纯处理可进一步去除粗纯未去除的杂质，同时还可以去除内毒素。
作为优选，步骤S1所述重组表皮生长因子的发酵液采用大肠杆菌分泌表达，并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中。
作为优选，步骤S1所述疏水高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合疏水性基团，所述疏水性基团为苯基基团。
本发明优选苯基基团作为疏水高效液相色谱填料的键合基团，苯基基团疏水作用力强，对发酵液中的重组表皮生长因子和色素分离效果最佳。并且本申请重组表皮生长因子与疏水色谱填料之间的疏水作用是比较温和的相互作用，在洗脱后不会对其分子结构和活性造成损害。
作为优选，所述疏水高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径80mm×L500mm。
作为优选，所述疏水高效液相色谱柱的填料的颗粒度为4～6μm。
作为优选，步骤S1所述洗脱为先采用流动相Ⅰ对疏水高效液相色谱柱洗脱至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ继续对疏水高效液相色谱柱洗脱。
作为优选，所述流动相Ⅰ包括以下组分：调节PH至2.5～3.5的0.6～0.8mol/L氯化钠；所述流动相Ⅱ为调节PH至2.5～3.5的超纯水。
本发明选用疏水高效液相色谱填料对重组表皮生长因子发酵液进行粗纯处理，由于重组表皮生长因子发酵液中的色素分子大部分无疏水性，与疏水色谱填料吸附性不强，而表皮生长因子的疏水性能大于色素分子，能够与疏水色谱填料产生较强的吸附作用，因此本发明重组表皮生长因子发酵液中的色素在疏水作用条件下与疏水色谱填料吸附作用力小，在高离子强度的流动相Ⅰ冲洗作用下，大部分不吸附或弱吸附色素被流动相1洗脱下来，而达到色素被优先脱除的目的；然后通过流动相Ⅱ将重组表皮生长因子洗脱下来，从而达到将重组表皮生长因子和色素分离并浓缩重组表皮生长因子的目的，获得去除色素的重组表皮生长因子。本发明中流动相Il和流动相1的洗脱顺序不能颠倒，如果用流动相Il先洗脱，部分残留在填料表面的色素和EGF会被同时洗脱下来，色素的去除效果会相对差很多。
本发明的粗纯处理可方便高效去除重组表皮生长因子发酵液中色素，方法效率高、效果好，明显优于其他方法，如明显优于采用阴离子交换填料进行重组表皮生长因子发酵液中色素的分离，原因在于阴离子交换填料能吸附保留大部分色素，但同时也会吸附保留重组表皮生长因子，色素和重组表皮生长因子在阴离子交换填料的吸附强度相差不大，导致二者难以被有效分离；另外如采用阴离子填料进行分离，发酵液需要进行脱盐处理，增加了分离成本，也不利于规模化生产。
作为优选，步骤S2所述弱阴离子高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合弱阴离子基团，所述弱阴离子基团为DEAE-二乙基氨基乙基。
本发明采用弱阴离子高效液相色谱柱对粗纯产物进行处理，在本发明的吸附环境条件下对表皮生长因子和内毒素均有较好的吸附性能，并且在洗脱时采用不同洗脱液能将表皮生长因子和内毒素分别洗脱。
由于表皮生长因子为多肽类物质，电荷数较多，如采用强阴离子交换表皮生长因子很难被洗脱下来，采用弱阴离子对表皮生长因子的洗脱回收率高。
作为优选，所述弱阴离子高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径40mm×L500mm。
作为优选，所述弱阴离子高效液相色谱柱的填料的颗粒度为4～6μm。
本发明通过将疏水高效液相色谱柱和弱阴离子高效液相色谱柱的填料粒度限定在较小的范围内，提高了填料的表面面积，从而提升了截量。
作为优选，步骤S2所述洗脱为采用精纯洗脱液进行洗脱，所述精纯洗脱液为包含有0-300mmol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液，pH为6.5～7.5。
本发明采用Tris-HCL缓冲液可将表皮生长因子从弱阴离子高效液相色谱柱上洗脱，但不会洗脱内毒素，从而可将表皮生长因子和内毒素分离开。本发明在精纯洗脱液中添加离子化合物氯化钠，氯化钠可以用相反的电荷置换表皮生长因子在色谱填料表面上的吸附，从而提高表皮生长因子的洗脱效率和洗脱效果。特别说明，本发明Tris-HCL缓冲液中氯化钠的含量浓度为0-300mmol/L但不包括0mmol/L的情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：。
(1)本发明通过以疏水高效液相色谱柱浓缩粗纯处理和以弱阴离子高效液相色谱柱精纯处理的二步纯化工艺获得了高纯度的重组表皮生长因子，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达98％以上；
(2)本发明通过采用疏水高效液相色谱柱对重组表皮生长因子发酵液进行处理实现了发酵液中重组表皮生长因子和色素的有效分离；
(3)本发明通过采用弱阴离子高效液相色谱柱对发酵液进行处理
(4)本发明通过优选粗纯处理的洗脱液的组分，能够快速将色素重组表皮生长因子从色谱填料上依次洗脱，从而实现二者的快速高效分离；
(5)本发明通过优选精纯处理的洗脱液的组分，能够高效将表皮生长因子从弱阴离子高效液相色谱柱上洗脱，但不会洗脱内毒素，从而可将表皮生长因子和内毒素分离开。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
本实施例中高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，具有如下步骤：
(1)制备重组表皮生长因子发酵液：以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)粗纯处理：将重组表皮生长因子发酵液加入到疏水高效液相色谱柱中进行吸附，疏水高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径80mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合疏水性苯基基团，颗粒度为5μm，然后采用流动相Ⅰ(调节PH至3.0的0.7mol/L氯化钠)对疏水高效液相色谱柱洗脱至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ(调节PH至3.0的超纯水)继续对疏水高效液相色谱柱洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，弱阴离子高效液相色谱柱的柱尺寸为直径40mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合弱阴离子基团DEAE-二乙基氨基乙基，颗粒度为5μm，然后采用精纯洗脱液对弱阴离子高效液相色谱柱进行洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子，精纯洗脱液为包含有150mmol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液，pH调节为7.0。
实施例1收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为83％，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达99.3％。
实施例2
本实施例中高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，具有如下步骤：
(1)制备重组表皮生长因子发酵液：以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)粗纯处理：将重组表皮生长因子发酵液加入到疏水高效液相色谱柱中进行吸附，疏水高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径80mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合疏水性苯基基团，颗粒度为5μm，然后采用流动相Ⅰ(调节PH至2.5的0.6mol/L氯化钠)对疏水高效液相色谱柱洗脱至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ(调节PH至2.5的超纯水)继续对疏水高效液相色谱柱洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，弱阴离子高效液相色谱柱的柱尺寸为直径40mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合弱阴离子基团DEAE-二乙基氨基乙基，颗粒度为5μm，然后采用精纯洗脱液对弱阴离子高效液相色谱柱进行洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子，精纯洗脱液为包含有100mmol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液，pH调节为6.5。
实施例2收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为80％，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达98.2％。
实施例3
本实施例中高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，具有如下步骤：
(1)制备重组表皮生长因子发酵液：以大肠杆菌为基因工程菌分泌表达重组表皮生长因子制成重组表皮生长因子发酵液，制备过程中添加有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
(2)粗纯处理：将重组表皮生长因子发酵液加入到疏水高效液相色谱柱中进行吸附，疏水高效液相色谱柱的柱尺寸为：直径80mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合疏水性苯基基团，颗粒度为5μm，然后采用流动相Ⅰ(调节PH至3.5的0.8mol/L氯化钠)对疏水高效液相色谱柱洗脱至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ(调节PH至3.5的超纯水)继续对疏水高效液相色谱柱洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
(3)精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附，弱阴离子高效液相色谱柱的柱尺寸为直径40mm×L500mm，填料以硅胶为基质，表面键合弱阴离子基团DEAE-二乙基氨基乙基，颗粒度为5μm，然后采用精纯洗脱液对弱阴离子高效液相色谱柱进行洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子，精纯洗脱液为包含有300mmol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液，pH调节为7.5。
实施例3收集到的重组表皮生长因子的活性回收率为82％，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达98.5％。
对比例1
与实施例1不同的是，仅采用弱阴离子高效液相色谱柱对表皮生长因子发酵液进行吸附和洗脱，即省去实施例1中的步骤(2)，并在吸附和洗脱前对重组表皮生长因子发酵液进行脱盐预处理，其他与实施例1相同。
观察对比例1的试验过程发现色素分子几乎完全被弱阴离子高效液相色谱填料吸附，洗脱后色素也被同时洗脱下来并被浓缩，由于在弱阴离子高效液相色谱柱中，色素分子比重组表皮生长因子相对要保留强些，但差异性不大，导致二者难以通过洗脱被有效分离，经多次试验仅采用弱阴离子高效液相色谱柱对表皮生长因子发酵液进行处理，重组表皮生长因子的活性回收率仅在50-65％，经Tricine-SDS-PAGE电泳检测和HpLC-C18检测纯度可达72.6％。
对比例2
精纯洗脱液为不包含有氯化钠的Tris-HCL缓冲液，其他与实施例1相同。实施例3收集到的重组表皮生长因子的活性回收率仅为69％
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种高效液相色谱法制备高纯度重组表皮生长因子的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、粗纯处理：将重组表皮生长因子的发酵液加入到疏水高效液相色谱柱进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为粗纯产物；
S2、精纯处理：将粗纯产物加入到弱阴离子高效液相色谱柱中进行吸附和洗脱，收集洗脱液即为高纯度重组表皮生长因子；
步骤S1所述疏水高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合疏水性基团，所述疏水性基团为苯基基团；
所述疏水高效液相色谱柱的填料的颗粒度为5μm；
步骤S2所述弱阴离子高效液相色谱柱的填料以硅胶为基质，表面键合弱阴离子基团，所述弱阴离子基团为DEAE-二乙基氨基乙基；
所述弱阴离子高效液相色谱柱的填料的颗粒度为5μm；
步骤S1所述洗脱为先采用流动相Ⅰ对疏水高效液相色谱柱洗脱至无色素流出，然后采用流动相Ⅱ继续对疏水高效液相色谱柱洗脱；
所述流动相Ⅰ包括以下组分：调节PH至3.0的0.7mol/L氯化钠；所述流动相Ⅱ为调节PH至3.0的超纯水；
步骤S1所述重组表皮生长因子的发酵液采用大肠杆菌分泌表达，并添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导分泌表皮生长因子至胞外发酵液中；
步骤S2所述洗脱为采用精纯洗脱液进行洗脱，所述精纯洗脱液为包含有150mmol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液，pH为7.0。
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