CN114163517A - 一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法，涉及生物工程技术领域；本发明首次采用复合阳离子交换填料pH梯度洗脱达到一步去除内毒素并获取高纯度目标蛋白的效果，在精细纯化过程中采用pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液作为流动相B1，可将杂蛋白及内毒素洗脱干净；采用经碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水作为流动相B2，既可洗脱目标蛋白，又避免了采用常规含氯化钠缓冲液洗脱目标蛋白的弊端，在后续纯化步骤中无需进行长时间的脱盐过程，且得到的产品中目标蛋白含量较高，极大的简化纯化工艺，缩短纯化时间，是一种理想的大规模生产重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法。
背景技术
胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，其广泛分布于集体各个组织器官，如皮肤、骨骼、角膜、血管等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有重要作用。重组胶原蛋白以其天然的止血、低毒性、低抗原型、低免疫性、能引导细胞再生和与人体相容性较好等优点，而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。
在现有技术中，重组胶原蛋白的层析纯化过程基本是采用盐离子梯度洗脱的离子交换层析，此过程洗脱的目标蛋白若未经脱盐处理直接冷冻干燥，将导致冻干成品中蛋白含量低，影响产品在其他领域的直接使用；另一方面，在重组胶原蛋白的生产过程中，现有技术虽有利用热处理等方法降低粗品滤液中内毒素含量的报道，但随着行业的发展，此类方法对内毒素的去除效果远不能达到产品在医疗器械及药品领域的使用要求，在医疗器械或药品开发过程中需要对原料进一步的去除内毒素，才能达到相应的使用要求，极大限制了重组胶原蛋白的应用。
发明内容
为克服现有的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法，本发明的去除方法具有纯化工艺简单、稳定以及成本低廉的优点。
为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
第一方面，提供了一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法包括以下步骤：
(1)将重组人源化胶原蛋白发酵液在搅拌下加热至80～85℃并保持20～30min；
(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机离心固液分离，去除菌体及高温变性杂蛋白，收集上清液，所得上清液用0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，滤出液用碱试剂调节pH值至5.5～6.0，用纯化水调节溶液电导率至6.5～7mS/cm；
(3)将步骤(2)所得的滤出液经复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，洗脱过程采用流动相B1洗脱内毒素及杂质，流动相B2洗脱重组人源化胶原蛋白，洗脱液经冷冻干燥即可得重组人源化胶原蛋白；
所述流动相B1为pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；所述流动相B2为用碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水。
本发明的重组人源化胶原蛋白为III型胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，氨基酸数量为681个，分子量为60.22KDa，PI为8.73。
进一步地，上述磷酸盐缓冲液采用注射水配制。
进一步地，上述磷酸盐缓冲液的浓度为5～15mmol；优选地，上述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol。
进一步地，在步骤(2)或步骤(3)中，所述碱试剂为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁等常用碱试剂；优选地，所述碱试剂为氢氧化钠。
进一步地，步骤(3)中，所述复合型弱阳离子交换层析柱为采用流动相A平衡后的复合型弱阳离子交换层析柱。
进一步地，所述流动相A为磷酸盐缓冲液。
优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH值为5.5～6.5。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5～15mmol；优选地，上述磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol。
进一步地，所述复合型弱阳离子交换层析柱的填料为MMC Bestarose FF。
进一步地，所述MMC Bestarose FF填料的平均粒径为90μm。
第二方面，提供了一种重组人源化胶原蛋白，所述重组人源化胶原蛋白采用第一方面所述的纯化和内毒素去除方法制备而得，所述重组人源化胶原蛋白的内毒素含量低于0.05EU/mg。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明的纯化工艺简单、稳定，且成本低廉，在粗分离过程中利用重组人源化胶原蛋白耐热的特性，对发酵液加热使杂蛋白变性沉淀，酵母自身的蛋白酶失活，经过离心分离即可去除大部分的杂质及杂蛋白，同时也避免了重组人源化胶原蛋白在后续工艺中被蛋白酶降解，滤液无需添加其他处理工艺，经稀释并调节pH值及电导率后即可直接进行复合弱阳离子交换层析。
2.本发明首次采用复合阳离子交换填料pH梯度洗脱达到一步去除内毒素并获取高纯度目标蛋白的效果，在精细纯化过程中采用pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液作为流动相B1，可将杂蛋白及内毒素洗脱干净；采用经碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水作为流动相B2，即可洗脱目标蛋白，又避免了采用常规含氯化钠缓冲液洗脱目标蛋白的弊端(若采用常规含氯化钠缓冲液洗脱目标蛋白，既增大了洗脱液中外源内毒素的引入，又不可避免的因无机盐离子的引入导致直接冷冻干燥后产品蛋白质含量降低，后续超滤脱盐过程需要6～8小时的选择性半透膜超滤或透析才能将滤液电导率控制至0.1mS/cm以下，在此条件下的滤液冻干后才能获取蛋白含量较高的冻干粉)；与现有的纯化工艺相比，本发明在后续步骤中无需进行长时间的脱盐过程，且得到的产品中目标蛋白含量较高，既能极大的简化纯化工艺，还能缩短纯化时间，是一种理想的大规模生产重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法。
3、本发明在粗分离采用发酵液加热搅拌去除了绝大多数杂质，经过离心分离及过滤后，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化获取的重组人源化胶原蛋白纯度在98％以上，蛋白质含量在90％以上，内毒素含量低于0.05EU/mg，收率高达70％以上。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1为实施例2的重组人源化胶原蛋白冻干粉的高效液相色谱图。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步介绍和说明；显然，以下所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
对于本领域的技术人员来说，通过阅读本说明书公开的内容，本发明的特征、有益效果和优点将变得显而易见。
除非另外指明，所有百分比、分数和比率都是按本发明组合物的总质量计算的。本文术语“质量含量”可用符号“％”表示。
本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明的组合物和方法/工艺可包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
本发明实施例中含有重组人源化胶原蛋白的毕赤酵母发酵液的制备方法为：将设计并人工合成的重组人源化胶原蛋白核苷酸序列，序列如SEQ.ID.NO.2所示，以等量递增法重复连接至10片段后连接至质粒中，并提取该质粒，线性化后经电转化毕赤酵母GS115宿主菌，平板筛选得到含有重组人源化胶原蛋白目的基因的转化子，将得到的转化子用BMGY培养基摇瓶培养24h，作为一级种子在10L发酵罐中培养18h，作为二级种子接种到100L发酵罐中进行发酵生产，其中重组人源化胶原蛋白的氨基酸数量为681个，分子量为60.22KDa，PI为8.73，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
实施例1
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将71L重组人源化胶原蛋白发酵液以160rpm搅拌加热至81.4℃并保持21min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4600rpm离心16min，收集上清液49L。将49L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.08MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液56L；将滤出液用纯化水调电导率至6.8mS/cm，用氢氧化钠调节pH至5.8备用；
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为5.8的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为5.8的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为7.4的10mmol注射用水配制的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为8.0的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得6L洗脱液；冷冻干燥获得纯度为98.62％、蛋白含量为91％且内毒素限度检测0.05EU/mg合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为76％。
实施例2
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将72L重组人源化胶原蛋白发酵液以180rpm搅拌加热至83.5℃并保持22min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4200rpm离心15min，收集上清液50L。将50L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.10MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液58L；将滤出液用纯化水调电导率至6.6mS/cm，用氢氧化钠调节pH至6.0备用；
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为6.0的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为6.0的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为7.2的10mmol注射用水配制的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为8.2的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得5.7L洗脱液，冷冻干燥获得纯度为99.22％、蛋白含量为90.8％且内毒素限度检测0.05EU/mg合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为77％。
实施例2的重组人源化胶原蛋白冻干粉的高效液相色谱图如图1所示。
实施例3
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将70L重组人源化胶原蛋白发酵液以200rpm搅拌加热至82.5℃并保持20min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4000rpm离心15min，收集上清液51L。将51L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.11MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液57.4L；将滤出液用纯化水调电导率至7.0mS/cm，用氢氧化钠调节pH至5.5备用。
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为7.5的10mmol注射用水配制的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为8.5的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得5.5L洗脱液，冷冻干燥获得纯度为98.43％、蛋白含量为91.1％且内毒素限度检测0.05EU/mg合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为75％。
对比例1
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将71L重组人源化胶原蛋白发酵液以160rpm搅拌加热至81.0℃并保持20min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4000rpm离心15min，收集上清液49.3L。将49.3L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.08MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液55.8L。将滤出液用纯化水调电导率至6.7mS/cm，用氢氧化钠调节pH至5.7备用。
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为5.8的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为5.8的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为6.5的10mmol磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为8.7的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得5.9L洗脱液，冷冻干燥获得纯度为95.17％、蛋白含量为86.4％且内毒素限度检测0.05EU/mg不合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为73％。
根据测试数据及分析可得，流动相B1采用pH值为6.5的10mmol磷酸盐缓冲液进行洗脱，流动相B1的pH值降低(相对于实施例1-3)后会导致产品纯度降低、蛋白质含量降低及内毒素含量超标。
对比例2
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将70.6L重组人源化胶原蛋白发酵液以200rpm搅拌加热至82.3℃并保持20min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4000rpm离心15min，收集上清液50.8L。将50.8L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.11MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液57.2L。将滤出液用纯化水调电导率至6.9mS/cm，用氢氧化钠调节pH至5.6备用。
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为7.5的10mmol磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为7.8的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得7.3L洗脱液，冷冻干燥获得纯度为98.13％、蛋白质含量为91.2％且内毒素限度检测0.05EU/mg合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为53％。
通过测试数据及分析可得，流动相B2采用经氢氧化钠调pH值为7.8的注射用水洗脱，流动相B2的pH值降低(相对于实施例1-3)会导致产品洗脱体积增加且洗脱不充分，收率降低，冻干能耗大。
对比例3
本实施例提供一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其包括以下步骤：
1、粗分离
将70L重组人源化胶原蛋白发酵液以200rpm搅拌加热至81℃并保持20min后装入离心杯中配平后，经高速离心机4000rpm离心15min，收集上清液51L。将51L上清液过0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，过滤压力为0.10MPa，并在过滤结束后补加20L纯化水，以保证蛋白回收率，收集滤出液57L。将滤出液用纯化水调电导率至6.9mS/cm，用氢氧化钠调节pH至5.6备用。
2、精细分离纯化
将步骤1所得滤出液，通过复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，填料为MMCBestarose FF(复合型弱阳离子交换介质)，平均粒径为90μm，纯化过程先用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将滤出液上样至层析柱后用pH值为6.3的10mmol磷酸盐缓冲液再平衡层析柱，用pH值为7.5的10mmol磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白及内毒素物质，用经氢氧化钠调pH值为9.0的注射用水洗脱与层析柱结合的目的蛋白，获得5.2L洗脱液，冷冻干燥获得纯度为94.8％、蛋白质含量为90.4％且内毒素限度检测0.05EU/mg合格的重组人源化胶原蛋白冻干粉，收率为75％。
通过测试数据及分析可得，流动相B2采用经氢氧化钠调pH值为9.0的注射用水洗脱，流动相B2的pH值升高(相对于实施例1-3)会导致流动相B2的洗脱力过强，将杂质洗脱而导致洗脱液中蛋白质纯度降低。
综上所述，本发明选用pH值适宜的流动相B1和流动相B2，不仅可将杂蛋白及内毒素洗脱干净，还可保证洗脱液中无外源内毒素的带入，又可免除后续长时间的脱盐工艺，保证了冷冻干燥后冻干粉极高的蛋白质含量，极大的简化了纯化工艺，缩短纯化时间。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 西安德诺海思医疗科技有限公司
<120> 一种重组人源化胶原蛋白及其纯化和内毒素去除方法
<141> 2021-12-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro
1 5 10 15
Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly
20 25 30
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro
50 55 60
Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala
85 90 95
Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly
100 105 110
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu
115 120 125
Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro
145 150 155 160
Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
180 185 190
Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro
195 200 205
Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly
210 215 220
Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser
225 230 235 240
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala
245 250 255
Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser
260 265 270
Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro
275 280 285
Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly
290 295 300
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser
305 310 315 320
Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro
325 330 335
Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala
355 360 365
Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly
370 375 380
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu
385 390 395 400
Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly
405 410 415
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro
420 425 430
Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro
435 440 445
Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
450 455 460
Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro
465 470 475 480
Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly
485 490 495
Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser
500 505 510
Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala
515 520 525
Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser
530 535 540
Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Pro
545 550 555 560
Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala Gly Gly Pro Gly
565 570 575
Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Pro Ser Gly Ser
580 585 590
Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu Pro Gly Gly Pro
595 600 605
Gly Pro Leu Ser Ser Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Ser Gly Gly Gly
610 615 620
Ser Gly Gly Pro Gly Gly Pro Gly Pro Gly Gly Pro Pro Gly Leu Ala
625 630 635 640
Gly Gly Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly
645 650 655
Pro Ser Gly Ser Pro Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Gly Ala Gly Leu
660 665 670
Pro Gly Gly Pro Gly Pro Leu Ser Ala
675 680
<210> 2
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgagaaaa gaggtgctag cggtaagcca ggtccaccag gttctcaagg tgaatctggt 60
ggtccaggtg gtccaggtcc acaaggtcca ccaggtaaga acggtgaacc aggtccacca 120
ggttctaacg gtaacccagg tccaccaggt ccatctggtt ctccaggtaa ggacggtcca 180
ccaggtgaaa acggtaagcc aggtgaacca ggtccaaagt ctagataaga attc 234
Claims (10)
1.一种重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将重组人源化胶原蛋白发酵液在搅拌下加热至80～85℃并保持20～30min；
(2)将步骤(1)处理后发酵液经高速离心机离心固液分离，去除菌体及高温变性杂蛋白，收集上清液，所得上清液用0.22μm中空纤维膜进行过滤澄清，滤出液用碱试剂调节pH值至5.5～6.0，用纯化水调节溶液电导率至6.5～7mS/cm；
(3)将步骤(2)所得的滤出液经复合型弱阳离子交换层析柱层析纯化，洗脱过程采用流动相B1洗脱内毒素及杂质，流动相B2洗脱重组人源化胶原蛋白，洗脱液经冷冻干燥即可得重组人源化胶原蛋白；
所述流动相B1为pH值7.0～7.5的磷酸盐缓冲液；所述流动相B2为用碱试剂调节pH值至8.0～8.5的注射用水。
2.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液采用注射水配制。
3.根据权利要求1或2所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5～15mmol。
4.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，步骤(2)或步骤(3)中，所述碱试剂为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化镁。
5.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，步骤(3)中，所述复合型弱阳离子交换层析柱为采用流动相A平衡后的复合型弱阳离子交换层析柱。
6.根据权利要求5所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述流动相A为pH值5.5～6.5的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5～15mmol。
8.根据权利要求1所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述复合型弱阳离子交换层析柱的填料为MMC Bestarose FF。
9.根据权利要求8所述的重组人源化胶原蛋白的纯化和内毒素去除方法，其特征在于，所述MMC Bestarose FF填料的平均粒径为90μm。
10.一种重组人源化胶原蛋白，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的纯化和内毒素去除方法制备而得，所述重组人源化胶原蛋白的内毒素含量低于0.05EU/mg。
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