RU2634408C1 - Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 - Google Patents

Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 Download PDF

Info

Publication number
RU2634408C1
RU2634408C1 RU2016138803A RU2016138803A RU2634408C1 RU 2634408 C1 RU2634408 C1 RU 2634408C1 RU 2016138803 A RU2016138803 A RU 2016138803A RU 2016138803 A RU2016138803 A RU 2016138803A RU 2634408 C1 RU2634408 C1 RU 2634408C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
histone
bismethionyl
protein
purification
recombinant
Prior art date
Application number
RU2016138803A
Other languages
English (en)
Inventor
Ирина Владимировна Соколова
Татьяна Владимировна Воробьева
Сергей Анатольевич Косарев
Елена Дмитриевна Шибанова
Дмитрий Алексеевич Гусаров
Валентина Дмитриевна Гусарова
Елена Васильевна Свешникова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2016138803A priority Critical patent/RU2634408C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2634408C1 publication Critical patent/RU2634408C1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии, в частности к способу получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3. Настоящий способ предусматривает культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок, разрушение биомассы дезинтегратором, экстракцию целевого белка перхлорной кислотой и последующую очистку целевого белка. Указанный способ отличается тем, что очистка белка включает очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины и очистку методом ВЭЖХ. Настоящий способ также включает концентрирование очищенного бисметионилгистона ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона фармакопейного качества с чистотой 98,5%. Настоящее изобретение позволяет получать бисметионилгистон Н1.3 фармакопейного качества. 2 пр.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, являющегося производным человеческого гистона Н1.3. Природный гистон Н1.3 - это высококонсервативный белок с выраженными антипролиферативными свойствами в отношении раковых клеток различного происхождения. Бисметионилгистон - молекула гистона, имеющая на N-концевой части дополнительные два остатка аминокислоты метионина, является производным природного гистона и проявляет аналогичные биологические свойства. В связи с этим рекомбинантный бисметионилгистон является аналогом лекарственного средства Ритуксимаб для изготовления лекарственных препаратов, применяемых для терапевтического лечения злокачественных опухолевых образований лимфоидного и миелоидного происхождения.
В Российской Федерации терапевтическое лечение злокачественных опухолей лимфоидного и миелоидного происхождения, рецидивирующих и часто устойчивых к химиотерапии, осуществляется за счет импортных коммерческих препаратов Ритуксимаба. Однако в некоторых случаях препараты Ритуксимаба могут не вызывать должного терапевтического эффекта, причины чего изучены плохо (Cartron, G., et al. Blood. 2002. V. 99(3). P. 754-758). Кроме того, терапия Ритуксимабом может приводить к образованию в организме больного антиидиотипических антител, приводя к аутоиммунному ответу (Smith, М. Oncogene. 2003. V. 22(47). Р. 7359-7368). Известно, что аналоги Ритуксимаба на основе линкерньгх или ядерных гистонов или их производных лишены подобных недостатков. В связи с этим разработка способа получения активной фармацевтической субстанции гистонов или их производных является актуальной задачей.
Известен способ получения рекомбинантного гистона H1.5, состоящий в культивировании штамма-продуцента E. coli B121(DE3), продуцирующего гистон H1.5. Способ заключается в разрушении бактериальных клеток, выделении целевого компонента с помощью катионообменной хроматографии, очистки выделенного белка последовательно на гидроксиапатитной и катионообменной хроматографии, доочистки от бактериальных эндотоксинов тангенциальной фильтрацией и лиофилизацией до получения активной фармацевтической субстанции (Руо, S.-H., et al. Prot. Exp. Purif. 2001. V. 23. P. 38-44).
К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий очистки и, следовательно, крайне низкий суммарный выход процесса (около 16%).
Известен способ получения рекомбинантного гистона HI, состоящий в культивировании дрожжевого штамма S. cerevisiae ENY.WA-4D, продуцирующего ряд подтипов гистона HI. Способ заключается в лизировании бактериальных клеток ферментом зимолиазой Т20, выделении целевого компонента с помощью экстракции перхлорной кислотой, очистке выделенного белка многостадийным осаждением с помощью ацетона с последующим перерастворением осадка и повторным осаждением с помощью сульфата аммония (Albig, W., et al. FEBS lett. 1998. V. 435. P. 245-250).
К недостаткам данного способа следует отнести большое количество стадий осаждения и перерастворения, а также недостаточную чистоту получаемого раствора, содержащего ряд подтипов гистона H1.
Известен наиболее близкий к заявленному способ получения производного гистона Н1.3, бисметионилгистона Н1.3, описанный в европейской патентной заявке (European Patent Application ЕР 1985628), в международной патентной заявке (International Patent Application WO 2008/122434) и патенте Российской Федерации RU 2498997. Способ заключается в:
1) культивировании штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;
2) разрушении биомассы дезинтегратором;
3) экстракции целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;
4) денатурации белка мочевиной до финальной концентрации 8 М;
5) очистке методом анионообменной хроматографии на сорбенте Q-Sepharose в денатурирующих условиях;
6) очистке методом катионнообменной хроматографии на сорбенте Macro-prep High S в денатурирующих условиях;
7) концентрировании диафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;
8) финишной стерильной фильтрации с получением раствора очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.
К недостаткам описанного способа следует отнести несоответствие получаемой активной фармацевтической субстанции фармакопейным требованиям по чистоте действующего компонента (требования составляют не менее 97%), что отмечено в комментариях авторов (Gross, P., et al. World Intellectual Property Organization Patent Application, WO 2008/122434 A1, 2008; European Patent Application EP 1985628).
Техническим результатом изобретения является повышение чистоты конечного продукта не менее 98,5%, сокращение стадий производства благодаря исключению процесса денатурации целевого белка и неочевидному снижениб бактериальных эндотоксинов на стадии катионообменной хроматографии, что дополнительно приводит увеличению срока службы ВЭЖХ-сорбента Kromasil и, соответственно, к экономической выгоде.
Способ осуществляют следующим образом.
Для получения рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 используют штамм-продуцент E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S. (Штамм депонирован в коллекции штаммов-продуцентов ИБХ РАН, № MSP-H1.3.)
Биосинтез продуцента проводят культивированием.
При культивировании клеток штамма-продуцента для получения инокулята питательную среду на основе экстракта пекарских дрожжей засевают культурой штамма-продуцента, затем выращивают посевной материал в колбах, который используют для засева ферментера. Ферментацию проводят до достижения культурой оптической плотности 10 ОЕ, с последующей индукцией синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. После окончания ферментации клетки штамма-продуцента целевого белка (биомассу) отделяют центрифугированием и разрушают на дезинтеграторе Гаулин. Выделение целевого бисметионилгистона Н1.3 проводят с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч, в результате чего осаждают балластные белки, а надосадочную жидкость, содержащую бисметионилгистон Н1.3, отделяют центрифугированием, доводят рН до 2,0-4,0 с помощью 4 М гидроксида натрия и отфильтровывают через фильтр 0,45 микрон.
Полученный белковый раствор наносят на предварительно уравновешенную колонну, упакованную катионообменным сорбентом. Проводят промывку сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины, что приводит к неочевидному снижению бактериальных эндотоксинов, за счет их частичного высвобождения из комплекса бисметионилгистон Н1.3 - эндотоксин (как сильно положительно и сильно отрицательно заряженных молекул). Проводят очистку, элюируя с увеличением ионной силы подвижной фазы. Собирают основную фракцию, прибавляют к ней пропиловый спирт до его концентрации 10% об. и наносят полученный раствор на предварительно уравновешенную колонну, упакованную ВЭЖХ сорбентом. Проводят очистку, элюируя с увеличением содержания органического модификатора в подвижной фазе и/или с понижением рН подвижной фазы. Собирают основную фракцию. При этом использование промывки раствором 4 М мочевины на предыдущей стадии помимо неочевидного снижения количества бактериальных эндотоксинов, связанных с бисметионилгистоном Н1.3, позволяет реже проводить регенерацию ВЭЖХ-сорбента и в менее жестких условиях, что продлевает срок его службы. Полученный белковый раствор подвергают ультрафильтрации с использованием системы для тангенциальной ультрафильтрации, что приводит к доочистке и уменьшению объема раствора бисметионилгистона Н1.3. Полученный раствор подвергают лиофильной сушке под вакуумом до получения активной фармацевтической субстанции.
Таким образом, проводят следующие стадии очистки:
1) культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок;
2) разрушение биомассы дезинтеграцией;
3) экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой;
4) очистку методом катионообменной хроматографии на сорбенте с использованием промывки сорбента 4 М мочевиной;
5) очистку методом ВЭЖХ;
6) концентрирование ультрафильтрацией с одновременной сменой буферной системы раствора белка;
7) лиофильную сушку с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 в качестве фармацевтической субстанции.
Таким образом, техническим результатом изобретения является
- уменьшение стадий технологического процесса;
- проведение стадий очистки без применения денатурирующих условий;
- повышение чистоты конечного продукта до 98,5%;
- получение фармацевтической субстанции бисметионилгистона Н1.3 в качестве лиофильно высушенного порошка, более стабильного при хранении.
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1
Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.
Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 20 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.
После окончания процесса биосинтеза клетки штамма-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе. Клетки разрушают дезинтеграцией.
Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5%-ным водным раствором перхлорной кислоты в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центрифугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.
Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом BioPro S75 (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 60 мл. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. После этого элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПАГЭ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом YMC Butil-15 микрон-30 нм (YMC Со, Германия), колоночный объем (КО) 80 мл. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. этилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 7 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 5 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 5 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 20 мл, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 200 мл, концентрируют до 20 мл и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3.
Пример 2
Культивирование клеток штамм-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S проводят следующим образом.
Первый этап - выращивание посевной культуры в колбах; второй - выращивание инокулята в ферментере объемом 200 л на питательной среде, содержащей ферментативный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, минеральные соли, глюкозу и канамицин. Среду готовят на основе деминерализованной воды. В ходе процесса подают глюкозу и аммиак для поддержания рН 7,0, концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне не менее 20%. При достижении значения оптической плотности 10 ОЕ (измерение проводят при длине волны 550 нм) проводят индукцию синтеза рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом. Последующий биосинтез рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 проводят в течение 2 ч.
После окончания процесса биосинтеза клетки штамм-продуцента в виде суспензии собирают на сепараторе до объема 70-80 л. Клетки разрушают на дезинтеграторе Гаулин.
Из полученной суспензии разрушенных клеток выделяют целевой компонент с помощью экстракции 2,5% перхлорной кислотой в течение 1 ч при комнатной температуре. Образованный осадок отделяют от надосадочной жидкости центирфугированием. В надосадочной жидкости доводят рН до 3,0 с помощью 4 М гидроксида натрия. Полученный белковый раствор очищают с помощью катионообменной хроматографии.
Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Macro-prep HS (Bio-Rad lab., США), КО 5 л. Готовят подвижную фазу «А», содержащую 10 мМ лимонной кислоты в воде для инъекций, рН 3,0. Готовят промывочный раствор «П» на основе фазы «А», содержащий 4 М мочевину, рН 3,0. Готовят подвижную фазу «Б», содержащую 10 мМ лимонной кислоты и 2 М хлорида натрия в воде для инъекций, рН 3,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч, пропуская через колонну не менее 3 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 6 КО/ч. Затем промывают сорбент с нанесенным белком промывочным раствором «П» 1 КО со скорость 6 КО/ч, промывают вновь 1 КО подвижной фазой «А» со скоростью 6 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 6 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Б» от 0 до 100% в течение 15 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 95% объединяют, добавляют к ним этиловый спирт до его концентрации 10% об., очищают с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Для этого упаковывают хроматографическую колонну сорбентом Kromasil С4-16 микрон-30 нм (Eka Chemicals, Швеция), колоночный объем (КО) 3,5 л. Готовят подвижную фазу «В», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 20% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 4,0. Готовят подвижную фазу «Г», содержащую 10 мМ лимонной кислоты, 50% об. пропилового спирта в воде для инъекций, рН 2,0. Подвижные фазы фильтруют через фильтр 0,22 микрон. Уравновешивают хроматографическую колонну подвижной фазой «В» со скоростью 2 КО/ч, пропуская через колонну не менее 1 КО. Наносят белковый раствор со скоростью 2 КО/ч. Затем элюируют через хроматографическую колонну подвижные фазы со скоростью 2 КО/ч, постепенно увеличивая содержание подвижной фазы «Г» от 0 до 100% в течение 10 КО. Фракции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 собирают и анализируют с помощью ПАГЭ и ОФ ВЭЖХ. Фракции с чистотой не менее 98% объединяют. Полученный раствор насосом подают в систему тангенциальной ультрафильтрации, концентрируют до объема 0,4 л, затем доливают в систему воды для инъекций (ВДИ) до объема 4 л, концентрируют до 0,4 л и эту операцию повторяют несколько раз. Полученный раствор анализируют на содержание высокомолекулярных примесей (методом Э-ВЭЖХ) и бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). После раствор подвергают лиофильной сушке до получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 с хроматографической чистотой не ниже 98,5% (по результатам Э-ВЭЖХ) и содержанием эндотоксинов не выше 0,5 EU/мг (по ЛАЛ-тесту).

Claims (1)

  1. Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3, включающий культивирование штамма-продуцента E. coli B121(DE3)/pEGT1/H1.3S, продуцирующего целевой белок; разрушение биомассы дезинтегратором; экстракцию целевого белка бисметионилгистона перхлорной кислотой; очистку методом катионообменной хроматографии с использованием промывки сорбента с нанесенным белком раствором 4 М мочевины; очистку методом ВЭЖХ; концентрирование ультрафильтрацией и лиофилизацию с получением порошка очищенного бисметионилгистона Н1.3 фармакопейного качества c чистотой 98,5%.
RU2016138803A 2016-10-03 2016-10-03 Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3 RU2634408C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016138803A RU2634408C1 (ru) 2016-10-03 2016-10-03 Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016138803A RU2634408C1 (ru) 2016-10-03 2016-10-03 Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2634408C1 true RU2634408C1 (ru) 2017-10-26

Family

ID=60153916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016138803A RU2634408C1 (ru) 2016-10-03 2016-10-03 Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2634408C1 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2498997C2 (ru) * 2007-04-05 2013-11-20 Зюмбиотек Гезелльшафт Цур Форшунг Унд Энтвиклунг Ауф Дем Гебит Дер Биотехнологи Мбх БИС-Met-ГИСТОНЫ

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2498997C2 (ru) * 2007-04-05 2013-11-20 Зюмбиотек Гезелльшафт Цур Форшунг Унд Энтвиклунг Ауф Дем Гебит Дер Биотехнологи Мбх БИС-Met-ГИСТОНЫ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIM Y et al. Polycistronic coexpression and nondenaturing purification of histone octamers, Analytical biochemistry, 2012. KLINKER H et al. Rapid purification of recombinant histones, PloS one, 2014. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20180194801A1 (en) Method for isolating and purifying recombinant human serum albumin from transgenic rice grain
CN103732610A (zh) 纯化天然或突变体形式的白喉毒素的方法
US20130211054A1 (en) Method for purifying human granulocyte-colony stimulating factor from recombinant e. coli
JP2009173945A (ja) Ｇｂｓトキシン／ｃｍ１０１の精製方法
CN112724242B (zh) 利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法
CN112745385A (zh) 重组人源化胶原蛋白及其产业化制备方法与产品应用
FI72143C (fi) Foerfarande foer framstaellning av maenniskointerferon.
CN107090442B (zh) 一种N糖基转移酶BtNGT及其应用
RU2054044C1 (ru) Способ получения рекомбинантного человеческого свободного от метионина на n-конце гамма-интерферона
US11926853B2 (en) Botulinum toxin producing method
RU2634408C1 (ru) Способ получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного бисметионилгистона Н1.3
CN112457377B (zh) 美洲大蠊多肽及其应用
CN104894200B (zh) 路氏双髻鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法
JPH04300898A (ja) 新規糖タンパク複合体およびその製造方法
JPS6019720A (ja) ヒト内来性癌制御因子およびその製造法
EP2511288B1 (en) Method of obtaining inhibitors of cysteine peptidases with an electrophoretic purity from biological materials
RU2687973C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА КОЛЛАЛИЗИН&αχιρχ;, ЛИОФИЛИЗАТА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ МЕСТНОГО И ПАРЕНТЕРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
JPS60243018A (ja) ヒト内来性癌制御因子
SU891775A1 (ru) Способ получени пектолитического ферментного препарата из @
JP3029331B2 (ja) 動物細胞生育促進剤
RU2039823C1 (ru) Способ получения рекомбинантного лимфотоксина человека
Neumüller Chemical studies on the influenza hemagglutination inhibitor normal allantoic fluid
CN115850522A (zh) 一种蓝铜肽的生物合成方法
CN103409378A (zh) 一种酪氨酰tRNA 合成酶突变体的制备方法及应用
CN116284221A (zh) 一种促肿瘤相关巨噬细胞向m1型极化的硒酵母活性肽及制备方法