SU891775A1 - Способ получени пектолитического ферментного препарата из @ - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТОЛИТИЧЕСКОГО

ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ASPERGILLUS FOETIDUS

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к Ферментной м робиологической промышленности, и может быть использовано в производстве высокоактивных ферментных препаратов мацерирующего действи  из технических или частично очищенных ферментных препаратов или из их раст воров, получаемых выращиванием гриба Aspergillus foetidus. Данное изобретение решает задачу получени  высокоактивных ферментов, например, из Пектофоетидина ПЮх, обладающих свойствами биохимического реактива или медицинского терапевтического средства, примен емых дл  мацерировани  растительных тканей. Известен способ пектоли тического ферментного препарата из AspergПlus feet i dus , заключающийс  в приготовлении экстракта фермента, его концентрировании (обычно путем ультрафильтрации), внесении стабилизатора (Alg ( количестве 1-3%) в ферментсодержащий раствор и последующей его сушке распылением. Ферментный экстракт получают по .обычной методике, т.е. экстрагированием водой из поверхностной культуры гриба. , Пeктoлит iчecкa  активность в экстракте составл ет 6 ед/мл, в конечном продукте 170-199 ед/мл (при влажности препарата 12-13%) ц1J и 12. Недостатком известного способа  вл етс  невозможность получени  высокоактивного пектолитического ферментного препарата (обладающего мацерирующим действием). Цель изобр.етени  - повышение активности получаемого из Aspergillus foetidus пектолитического ферментного препарата. Указанна  цель достигаетс  способом получени  пектолитического ферментного препарата из Aspergillus foetidus, заключающимс  в приготовле

НИИ экстракта фермента, его хромате графической очистке (при активности 20-50 ед/мл исходного экстракта), концентрировании с последующим выделением целевого продукта осаждением 3-3,5 объемами органического раство;рител .

Приготовление экстракта фермента заключаетс  в растворении в воде Пектофоетидина П10х с активностью 100-200 ед/г в количестве 2025 весЛ в течение 12-18 ч при 3-8Рс В качестве органического растворител  дл  осаждени  используют этиловый , пропиловый или изопропиловый спирт либо ацетон.

Хроматографическ то очистку ферментпого экстракта провод т по из- веетной методике.

Предлагаемый способ позвол ет получать пектолитический ферментный препарат с активностью до 7501200 ед/г (выход по активности 60-75% ).

Получаемые препараты, обладают мацерирующей активностью,, сопоетави ,мой (а в некоторых случа х превывтющей ) с активностью импортных препаратов , например Macerozyme R-1 Q и могут быть использованы взамен дорогосто щих импортных препаратов.

Способ осуществл етс  следу ощим образом.

В качестве исходного материала используют фермент Пектофо„етидш1 П1 Ох или осадок (невысушенный) , полученный спиртовым осаждением концентрата-выт жки Пектофоетидина Их. приготовлени  экстракта из Пектофоетидина П10х берут концентрацию препарата в пределах 15-30%, предпочтительно 20-25%, настаивают с водой 12-18 ч при охлалодении до 3-8 С

Готовый экстракт с пектиназной активностью 22-50 ед/мл пропускают через хроматографическую колонку, наполненную гелем Акрилекс Р-2, Р-6 собранный из колонки элзоат концентрируют , например, вакуум-выпаркой или ультрафильтрацией в 3-9 раз, предпочтительно в 4-6 раз. Из полученного концентрата раствора очищенного фермента выдел ют препарат осг1ждением 3-3,5 объемами органического растворител , например этанола изопропанола или ацетона.

Дп  получени  высокоактивных препаратов фермента используют культуру гриба AspergiHus foetidus или

917/5 . 4

полученные из нее препараты, iiaiii.nмер Пектофоетидин ПЮх, Нормальна  работа хроматографической обеспечиваетс  при условии, что фер5 ментньй HjienapaT Пектофоетидин П10х обладает активностью 100-200 ед/г и полученный из него экстракт активностью предпочтительно 40-50 ед/мл. - При этом получают препарат с активностью до 1000 ед/г и вьппе. Если концентраци  Пектофоетидина ПЮх в экстракте выще 30%, то получают плохо фильтруемые и трудно центрифугируемые экстракты, непригодные дл 

15 .хроматографии. При очень низких концентраци х ферментного препарата хроматографическа  колонка работает неэффективно.

Хроматографию осуществл ют использу  одновременное нагнетание раствора снизу и отсасьшание сверху колонки , производ т вымьшание высокомолекул рного вещества - фермента - элю ирузощим раствором, вз тым в количестве 40-;50% от полного объема колонки , со скоростью подачи его в два раза превышающей скорость подачи раствора высокомолекул рного вещества. На данной стадии очистки фермента достигаетс  отделегше от низкомолекул рных примесей (солей, аминокислот, углеводов и др.). В качестве наполнител  колонки используют полиакриламидные гели типа Акрилекс. Из них Акрилекс Р-2 обеспечивает наибольшую скорость процесса, быстроту регенерации и более многократное использование , С Акрилексом Р-6 получают более качественное отделение пигментов, но скорость хроматографии на этом геле в 2-3 раза ниже, чем на Акрилексе Р-2. В качестве элюирующего раствора используют воду с небольшими добавками солей или без них.

Полученный из колонки элюат, раствор очищенного фермента, по част м или целиком подвергают концентрированию . Концентрирование осуществл ют в 3-9 раз известным способом (вакуум-выпарка или ультрафильтраци ).

50 Эта стади  необходима дл  сниже1ш 

объема жидкости, увеличени  концентрации фермента и уменьшени  расхода органического растворител . После концентрировани  в 3-9 раз фермент

.55 может быть полиостью и без инактивации осажден ,5 объемами органического растворител , например этанола , изопропанола, ацетона. . 5 Пример 1. Дл  пршотоБлени  25%-ного экстракта 0,25 кг Пектофоетидина ПЮх с активностью 120 ед/г, полученного с Рарсказовского биохимического завода, смешивают с 0,75 л воды и оставл ют в холодильнике (3-8 с) сто ть в течение 16 ч. Центрифугированием отдел ют нерастворившуюс  часть и получают 0,75 л экстрак та. Весова  концентраци  экстракта 0,5 л фракции упаривают на роторном испарителе при температуре 40 С и получают 0,078 л концентрата с активностью 265 ед/мл, выход количественный . Степень концентрировани  6,4 раза, К 0,078 л концентрированного элюа та при 0-5 С добавл ют 0,23 л (3 объ ема) этанола, предварительно охлажденного до 0-5 С, перемешивают 15 мин, осадок отдел ют центрифугированием при 2500 об/мин (10 мин). Осадок высушивают в вакууме. Выход 11,2 г, активность 1200 ед/г, выход по активности на стадии концентрировани  спиртового осаждени  и высушивани  75%. Общий выход пектиназы в расчете на исходный Пектофоетидин П10х составл ет 60%. Пример 2. Дл  приготовлени  20%-ного экстракта 0,2 кг пектофоетидина ПЮх с активностью 204 ед/г полученного с Рассказовского биохимического завода, смешивают с 0,8 л воды и оставл ют на 17 ч при 5 С, центрифугируют в течение 45 мин при 2500 об/мин,получают экстракт объем 0,65 л с активностью около 50 ед/мл Весь экстракт ввод т в колонку (6,3x1 м) с гелем Акрилекс Р-2 и собирают две фракции объемом: I 1 ,0 л, 1-0,2 л. Фракцию 11 лиофилизируют и получают 7 г препарата с 5 по отношению к исходному ферментному препарату составл ет 25%, активность в экстракте равна 36 ед/мл, общий выход на стадии составл ет 90%. 0,68 л экстракта пропускают через колонку с гелем Акрилекс Р-2 (диаметр колонки 10 см, высота около 100 см) в соответствии с известным способом. Собирают три фракции. Результаты показаны в табл.1. Таблица 1 активностью-более 2000 ед/г. Фракцию 1 концентрируют упариванием в 4,4 раза до объема 0,23 л. Концентрат дел т на три части по 0,076 л кажда  и из каждой части выдел ют препараты, добавл   этиловый, пропиловый и изопропиловый спирты к каждой части соответственно. Осаждение фермента спиртами осуществл ют следующим образом. К охлажденному до 5°С концентрату (0,076 л) добавл ют при перемешивании 0,18 л (3,5 объема J спирта, охлажденного до температуры (-5) (-15)с. Смесь перемешивают и через 10-15 мин центрифугируют. Все три препарата имеют вес около 2,7 г каждый и их активность в пределах 750-850 ед/г. Наиболее светлый осадок получаетс  с этиловым спиртом. Пример 3. Приготовление экстракта и хроматографию на колонке с Акрилексом Р-2 осуществл ют так же, как в примере 1. Далее 0,95 л элюата с активностью 10160 ед/л раздел ют на две части 0,18 и 0,77 л соответственно. Первую часть подвергают ультрафильтрации через мембрану М-20 (Амикон) под давлением 6,7 атм до объема 0,036 л в концентрате (кратность концентрировани  5) , из которого фермент осаждают добавлением трех объемов

Claims (2)

Формула изобретения

1. Авторское свидетельство СССР №659613, кл. С 12 0 13/10, 1976 (прототип) .

1. Способ получения пектолитичес25 кого ферментного препарата из Aspergillus foet i dus, предусматривающий приготовление экстракта фермента и его концентрирование, отличающийся тем, что, с целью повыше-

30 ния активности целевого продукта, экстракт фермента с активностью 2050 ед/мл перед концентрированием подвергают хроматографической очистке, а целевой продукт выделяют из ₃₅ ферментного концентрата путем осаждения 3-3,5 объемами органического растворителя.

2. Способ по п.1,отличаю40 щ и й с я тем, что экстракт фермента готовят растворением в воде Пектофоетидина ПЮх с активностью 100200 ед/г в количестве 20-25 вес.% в течение 12-18 ч при 3-8°С.

43 3. Способ поп.1,отличающ и й с я тем, что в качестве органического растворителя используют этиловый, пропиловый или изопропиловый спирт или ацетон.

р Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

. 2. Авторское свидетельство СССР №679588, кл. С 07 G 7/02, 1977. Тираж 531 , Подписное

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная,4