CN113106138A - 一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)预处理：将新鲜香菇洗净，用液氮速冻，研磨粉碎，过筛；(2)复合酶解：用生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶抑制剂，搅拌12‑16h；(3)提取活性蛋白：用超临界CO2流体萃取复合酶解后的香菇粉末，在分离釜中进行分离，得到活性蛋白；(4)分离活性蛋白：经SourceQ阴离子交换层析分离并除去多糖，再经Superdex200凝胶过滤层析，其间用人肺腺癌A549细胞检测其细胞毒性，分离得到抗肿瘤活性高的香菇蛋白质提取物LEP；(5)冻干保存。本发明通过复合酶解和超临界萃取工艺达到高效提取香菇活性蛋白的效果，采用活性跟踪分离方法提升了分离抗肿瘤活性蛋白的目的性。

Description

一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法。
背景技术
香菇属担子菌纲(Basidaiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomatacete)、香菇属(Lentinus)，学名Lentinus edodes，是世界第二大菌类，在我国广泛种植。香菇肉质肥厚细嫩，味道鲜美，香气独特，营养丰富，是一种食药同源的食物，有很高的经济、营养和药用价值。香菇中含有大量的碳水化合物和纤维素，低脂肪、高蛋白，还有多种矿物质和微量元素。目前发现香菇具有抗肿瘤、抗致癌物、保肝、降血脂、抗氧化、免疫调节、抗真菌、细菌、病毒等效果。
关于香菇的抗肿瘤活性早有报道，其中多糖类、蛋白类和其它化合物如麦角甾醇、黄酯酸、蒽醌等中都有抗肿瘤活性。现确定的抗肿瘤活性多糖有香菇多糖LNT、水溶性香菇胞外多糖SLN1和JLN1等，其分子结构、抗癌活性和作用机理已相对明确。而蛋白类的抗肿瘤研究目前主要集中在香菇C91-3菌丝体中，对其发酵液中的粗蛋白、Latcripin基因表达蛋白和转录组Unigene重组表达蛋白均有初步研究。黄敏等人在C91-3菌丝体的发酵液发现了具有体内、体外抗肿瘤活性蛋白LFP91-3，其可以通过诱导凋亡，抑制肿瘤细胞生长，增强小鼠自身免疫等，提高患瘤小鼠的生存期限。C91-3菌丝中Latcripin基因重组表达蛋白和转录组Unigene重组表达蛋白也具有抗肿瘤活性，其抗肿瘤机理包括抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡和诱导肿瘤细胞周期阻滞等。然而目前尚未有研究涉及从食用香菇中提取分离蛋白类物质，并研究其体外抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，以解决上述技术问题。
本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：
一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)预处理：将香菇子实体清洗干净，用纸巾吸净表面水分，在液氮中速冻并研磨成粉，过50-200目筛备用；
2)复合酶解：用生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶抑制剂，4℃搅拌12-16h；
3)提取活性蛋白：将上述酶解液加入装有搅拌和加热装置的超临界萃取釜中，密封盖顶，开启搅拌，输送CO2气体；通过调节排泄阀，缓慢释放萃取釜中带有活性物质的水和CO2的超临界体，至分离釜进行分离；缓慢降低分离釜中的压力和温度，超临界流体转变成CO2气体和含有活性物质的水层，收集水层，CO2气体可循环利用；
4)分离活性蛋白：将含有活性物质的水层与等体积20-100mM、pH 7.0-8.0Tris-HCl缓冲液混合，上样于Source Q阴离子交换层析柱，梯度洗脱香菇活性蛋白，并根据UV280nm处的吸光度将其分为不同组分；利用A549细胞检测各组分抗肿瘤活性，利用Superdex200凝胶过滤层析进一步分离活性最高的组分，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，用A549细胞检测活性，得到抗肿瘤活性高的香菇蛋白质提取物LEP；冻干保存。
作为优选，步骤2)中的香菇粉末直径小于0.1mm，香菇粉末与生理盐水的料液质量比为1：10。
作为优选，步骤2)中的纤维素酶添加量为30-50IU/g，半纤维素酶添加量为100-130IU/g，复合型蛋白酶抑制剂可选用罗氏蛋白酶抑制剂cocktail，添加量为1g/L。
作为优选，步骤3)中的萃取釜温度控制在35-40℃，压力为55-65MPa，搅拌速度为5-15m/s，调节CO2流量为20-30L/h，输送时间为1-3h。
作为优选，步骤3)中的分离釜内增加冷却装置，将分离釜的温度缓慢降至0℃，分离釜压力缓慢降至4.0-5.5MPa，在低温条件下移除CO2，可以更好的保持蛋白活力。
作为优选，步骤3)中的循环使用的CO2和新鲜的CO2依次通过热交换器、过滤器、压缩机进入萃取釜进行给气。
作为优选，步骤4)中的Source Q阴离子交换层析用含有0-1M NaCl的10-50mM、pH7.0-8.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱活性蛋白，洗脱体积为10-15个柱体积，以便分离香菇活性蛋白；在此条件下，香菇活性蛋白液中的多糖组分均被黏附在Source Q阴离子交换层析中，从而达到去除多糖的效果。
作为优选，步骤4)中Superdex 200凝胶过滤层析所用缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，是很好的生理缓冲液。
本发明采用复合酶解的处理方式，水解香菇中的纤维素和半纤维素，使提取原料的组织结构更加松散，便于从香菇中提取和分离蛋白质，保证提取的高效进行。
本发明采用超临界CO2萃取技术，利用超临界流体对天然物质的特殊溶解能力，从香菇中提取活性蛋白，再通过减压方式将超临界流体转变为普通的气体，进而使被萃取的蛋白液被分离出来。整个过程中没有引入新的物质，溶剂的安全性高，且可以重复利用，不会污染环境。
本发明采用Source Q阴离子交换层析作为蛋白分离的第一步骤，可以去除蛋白溶液中多糖组分带来的影响，并且可以通过增加梯度洗脱体积的方式取得更好的分离效果。
本发明中食用香菇抗肿瘤蛋白提取物对人肺癌细胞株A549的生长有明显的抑制作用。
将上述食用香菇Lentinus edodes中的抗肿瘤蛋白提取物命名为LEP(Lentinusedodes protein)。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供上述香菇蛋白提取物的用途。
本发明所提供的上述食用香菇蛋白质提取物的用途，为下述A或B：
A、抗肿瘤或抗肿瘤细胞的产品(如药品、保健品和/或食品)，其活性成分为上述香菇蛋白提取物；
B、上述香菇蛋白提取物在制备抗肿瘤或抗抗肿瘤细胞的产品(如药品、保健品和/或食品)中的应用。
上述用途中，所述肿瘤可为人肺腺癌细胞，如A549细胞。
本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明中香菇Lentinus edodes抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中香菇Lentinus edodes抗肿瘤蛋白提取物具有良好的抗肿瘤效果，可用于制备抗肿瘤的药品及食品。
附图说明
图1为本发明Lentinus edodes抗肿瘤蛋白提取物制备流程图；
图2A为实施例1中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(SourceQ阴离子交换层析)；
图2B为实施例1中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(Superdex 200凝胶过滤层析)；
图3A为实施例2中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(SourceQ阴离子交换层析)；
图3B为实施例2中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(Superdex 200凝胶过滤层析)；
图4A为实施例3中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(SourceQ阴离子交换层析)；
图4B为实施例3中香菇蛋白组分对肿瘤细胞A549的细胞活力测定示意图(Superdex 200凝胶过滤层析)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实例方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
从香菇Lentinus edodes中提取分离抗肿瘤蛋白质提取物LEP的制备方法(流程参见附图1)，包括如下步骤：
(1)预处理：将香菇子实体清洗干净，用纸巾吸净表面水分，在液氮中速冻并研磨成粉，过100目筛备用；
(2)复合酶解：取香菇粉末100g，加入1L生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶(3000IU)、半纤维素酶(12000IU)和蛋白酶抑制剂(cocktail1g)，4℃搅拌14h；
(3)提取活性蛋白：将上述酶解液加入装有搅拌和加热装置的超临界萃取釜中，温度控制在35℃，压力为55MPa，密封盖顶，开启搅拌，搅拌速度为10m/s，输送CO2气体，流量为20L/h，输送时间为2h；通过调节排泄阀，缓慢释放萃取釜中带有活性物质的水和CO2的超临界体，至分离釜进行分离；缓慢降低分离釜中的压力和温度，压力为5MPa，温度为0℃，超临界流体转变成CO2气体和含有活性物质的水层，收集水层，CO2气体可循环利用；
(4)分离活性蛋白：将含有活性物质的水层与等体积100mM、pH 8.0Tris-HCl缓冲液混合，上样于Source Q阴离子交换层析柱，梯度洗脱香菇活性蛋白，并根据UV 280nm处的吸光度将其分为F1、F2、F3组分；利用A549细胞检测各组分抗肿瘤活性，利用Superdex 200凝胶过滤层析进一步分离活性最高的组分F2，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，用A549细胞检测活性(参见附图2A、附图2B)；
(5)保存：将香菇抗肿瘤蛋白提取物中的低分子量组分收集起来，冷冻干燥得到5.32g淡黄色粉末，香菇抗肿瘤蛋白的提取效率为5.32％。
实施例2
从香菇Lentinus edodes中提取分离抗肿瘤蛋白质提取物LEP的制备方法(流程参见附图1)，包括如下步骤：
(1)预处理：将香菇子实体清洗干净，用纸巾吸净表面水分，在液氮中速冻并研磨成粉，过100目筛备用；
(2)复合酶解：取香菇粉末100g，加入1L生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶(5000IU)、半纤维素酶(13000IU)和蛋白酶抑制剂(cocktail1g)，4℃搅拌16h；
(3)提取活性蛋白：将上述酶解液加入装有搅拌和加热装置的超临界萃取釜中，温度控制在35℃，压力为55MPa，密封盖顶，开启搅拌，搅拌速度为10m/s，输送CO2气体，流量为20L/h，输送时间为2h；通过调节排泄阀，缓慢释放萃取釜中带有活性物质的水和CO2的超临界体，至分离釜进行分离；缓慢降低分离釜中的压力和温度，压力为5MPa，温度为0℃，超临界流体转变成CO2气体和含有活性物质的水层，收集水层，CO2气体可循环利用；
(4)分离活性蛋白：将含有活性物质的水层与等体积100mM、pH 8.0Tris-HCl缓冲液混合，上样于Source Q阴离子交换层析柱，梯度洗脱香菇活性蛋白，并根据UV 280nm处的吸光度将其分为F1、F2、F3组分；利用A549细胞检测各组分抗肿瘤活性，利用Superdex 200凝胶过滤层析进一步分离活性最高的组分F2，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，用A549细胞检测活性(参见附图3A、附图3B)；
(5)保存：将香菇抗肿瘤蛋白提取物中的低分子量组分收集起来，冷冻干燥得到5.79g淡黄色粉末，香菇抗肿瘤蛋白的提取效率为5.79％。
实施例3
从香菇Lentinus edodes中提取分离抗肿瘤蛋白质提取物LEP的制备方法(流程参见附图1)，包括如下步骤：
(1)预处理：将香菇子实体清洗干净，用纸巾吸净表面水分，在液氮中速冻并研磨成粉，过100目筛备用；
(2)复合酶解：取香菇粉末100g，加入1L生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶(5000IU)、半纤维素酶(13000IU)和蛋白酶抑制剂(cocktail1g)，4℃搅拌16h；
(3)提取活性蛋白：将上述酶解液加入装有搅拌和加热装置的超临界萃取釜中，温度控制在40℃，压力为60MPa，密封盖顶，开启搅拌，搅拌速度为15m/s，输送CO2气体，流量为25L/h，输送时间为3h；通过调节排泄阀，缓慢释放萃取釜中带有活性物质的水和CO2的超临界体，至分离釜进行分离；缓慢降低分离釜中的压力和温度，压力为4MPa，温度为0℃，超临界流体转变成CO2气体和含有活性物质的水层，收集水层，CO2气体可循环利用；
(4)分离活性蛋白：将含有活性物质的水层与等体积100mM、pH 8.0Tris-HCl缓冲液混合，上样于Source Q阴离子交换层析柱，梯度洗脱香菇活性蛋白，并根据UV 280nm处的吸光度将其分为F1、F2、F3组分；利用A549细胞检测各组分抗肿瘤活性，利用Superdex 200凝胶过滤层析进一步分离活性最高的组分F2，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，用A549细胞检测活性(参见附图4A、附图4B)；
(5)保存：将香菇抗肿瘤蛋白提取物中的低分子量组分收集起来，冷冻干燥得到5.94g淡黄色粉末，香菇抗肿瘤蛋白的提取效率为5.94％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)预处理：将香菇子实体清洗干净，用纸巾吸净表面水分，在液氮中速冻并研磨成粉，过50-200目筛备用；
2)复合酶解：用生理盐水浸没香菇粉末，加入纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶抑制剂，4℃搅拌12-16h；
3)提取活性蛋白：将上述酶解液加入装有搅拌和加热装置的超临界萃取釜中，密封盖顶，开启搅拌，输送CO2气体；通过调节排泄阀，缓慢释放萃取釜中带有活性物质的水和CO2的超临界体，至分离釜进行分离；缓慢降低分离釜中的压力和温度，超临界流体转变成CO2气体和含有活性物质的水层，收集水层，CO2气体可循环利用；
4)分离活性蛋白：将含有活性物质的水层与等体积20-100mM、pH 7.0-8.0Tris-HCl缓冲液混合，上样于Source Q阴离子交换层析柱，梯度洗脱香菇活性蛋白，并根据UV 280nm处的吸光度将其分为不同组分；利用A549细胞检测各组分抗肿瘤活性，利用Superdex 200凝胶过滤层析进一步分离活性最高的组分，并按照出峰位置分为高分子量组分和低分子量组分，用A549细胞检测活性，得到抗肿瘤活性高的香菇蛋白质提取物LEP；冻干保存。
2.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤2)中的香菇粉末直径小于0.1mm，香菇粉末与生理盐水的料液质量比为1：10。
3.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤2)中的纤维素酶添加量为30-50IU/g，半纤维素酶添加量为100-130IU/g，复合型蛋白酶抑制剂可选用罗氏蛋白酶抑制剂cocktai l，添加量为1g/L。
4.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤3)中的萃取釜温度控制在35-40℃，压力为55-65MPa，搅拌速度为5-15m/s，调节CO2流量为20-30L/h，输送时间为1-3h。
5.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤3)中的分离釜内增加冷却装置，将分离釜的温度缓慢降至0℃，分离釜压力缓慢降至4.0-5.5MPa，在低温条件下移除CO2，可以更好的保持蛋白活力。
6.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤3)中的循环使用的CO2和新鲜的CO2依次通过热交换器、过滤器、压缩机进入萃取釜进行给气。
7.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)中的Source Q阴离子交换层析用含有0-1M NaCl的10-50mM、pH 7.0-8.0Tris-HCl缓冲液梯度洗脱活性蛋白，洗脱体积为10-15个柱体积，以便分离香菇活性蛋白；在此条件下，香菇活性蛋白液中的多糖组分均被黏附在Source Q阴离子交换层析中，从而达到去除多糖的效果。
8.根据权利要求1所述的从香菇中提取分离抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于：步骤4)中Superdex 200凝胶过滤层析所用缓冲液为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
9.权利要求1所述香菇蛋白提取物的用途，包括A或B：
A、抗肿瘤或抗肿瘤细胞的产品，其活性成分为所述香菇蛋白提取物；
B、所述香菇蛋白提取物在制备抗肿瘤或抗肿瘤细胞的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的香菇蛋白提取物的用途，其特征在于：所述肿瘤为人肺腺癌细胞。
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