KR100491362B1 - 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조 방법 - Google Patents

면역 활성 증진 복합 다당체의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 조직체를 배지로 사용하고, 식물 조직 성분 중 면역력 증진 기능성을 가진 헤미셀룰로오스를 이용하지 못하도록 한 조건에서 담자균류를 균사 배양하므로써 면역 활성 기능이 우수한 복합 다당체를 효율적으로 얻어내는 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 면역 활성 증진 복합다당체의 제조방법은 식물 조직체를 열수나 수산화 나트륨으로 추출하여 수득한 추출물에 효소액을 처리하는 단계; 상기 효소로 처리된 추출물에 전배양된 담자균류의 균사액을 접종하고 담자균류의 균사체가 헤미셀룰로오스를 에너지원으로 사용하지 못하도록 하는 조건에서 배양하는 단계; 상기 배양후, 배양물로부터 헤미셀룰로오스를 분리, 정제하는 단계의 공정을 포함한다.
본 발명은 식물 조직체 추출물 및 담자균류 균사체에서 면역 활성 기능이 우수한 복합 다당체를 보다 효율적으로 얻어낼 수 있다.

Description

면역 활성 증진 복합 다당체의 제조 방법{Method for preparing immune enhancing polysaccharides}
본 발명은 식물 조직체 및 담자균류 균사체 배양물 유래 다당체로 이루어진 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 1차적으로 식물 조직체를 추출하고 효소를 이용하여 헤미셀룰로오스를 제외한 전분 및 단백질 등을 분해 시킨 후, 2차적으로 이들 분해 산물만을 이용하게 하여 담자균류를 균사 배양하고, 최종적으로 담자균류 균사 배양물로부터 얻어지는 면역력 증진 기능이 우수한 복합 성분의 다당체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 환자의 삶의 질(quality of life)을 높이는 의료로서 "환자에게 고통을 주지 않는 부작용이 없는" 등의 대체치료 요법이 구미(歐美), 일본을 비롯하여 전세계적으로 크게 부각되고 있는 실정이다. 이런 맥락에서 수년전부터 다수의 임상의(臨床醫)들이 면역력을 증진시키는 성분이 많이 함유된 식품을 섭취하게 하는 것을 암(癌)등의 치료에 보조적으로 적용하고 있으며, 성공적인 임상사례 등이 보고 되어 오고 있다. 또한 감기 등의 질환에 대한 치료보다는 예방의학의 중요성이 인식되면서 면역력 증진에 대한 요구성이 크게 대두되고 있다. 특히, 식물조직체 유래의 헤미셀룰로오스인 아라비녹살란(arabinoxylan)을 비롯, 영지버섯, 상황버섯 드의 버섯류, 인삼 유래 성분 등을 포함하여 상당히 다양한 면역력 증진 천연 소재들이 연구되어 오고 있으며, 이들 중의 상당수가 현재 건강보조식품으로 가공되어 시판되고 있다.
아라비녹실란은 자일로오스(xylose)로 이루어진 주 사슬에 아라비노오스 (arabinose)가 곁가지를 이루고 있는 헤미셀룰로오스이며, 다수의 곡류에 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 이 아라비녹실란은 일본 쯔루미(鶴見)박사 등의 연구에 의해 자연살상세포(Natural Killer cell)를 활성화 시키는 등 면역력을 높이는 데 효과가 있는 것으로 널리 알려지기 시작하여 현재 이와 관련된 연구 보고들이 계속 발표되고 있는 중이다. 이처럼 아라비녹실란의 유용성이 밝혀지면서 식물 조직 원료로부터 면역력 증강 물질을 추출하여 이용하고자 하는 기술이 보고 되고 있다. 특히, 글루코아밀라아제 및 담자균류의 효소반응을 이용하여 수용성 다당체를 얻고 생물학적 수식을 가하는 등 그 이용률을 높이는 기술(대한민국 특허 0344755)이 보고 되고는 있지만, 단지 균사체 유래의 다당체가 제외된 식물 조직체 유래 다당체만을 그 목적으로 하고 있다.
버섯 역시 면역 증강 및 항암효과에 대하여 이미 오래전부터 그 효능이 밝혀져 오고 있다. 건강 식품으로서의 그 이용의 역사 또한 깊다. 과거에는 버섯의 자실체(fruit body)를 주로 이용하였으나 최근에는 균사 배양이 생장속도가 빠르게 이뤄지는 등의 여러 장점 때문에 균사 배양을 통하여 생리활성 물질을 얻고자 하는 경향이 증가하고 있다. 특히 표고버섯 균사체(대한민국 특허 0010762) 및 상황버섯균사체(대한민국 특허 0174433)로 부터 면역 증진 기능과 관련된 버섯 균사체 유래의 다당체를 얻어내는 기술이 보고 되고 있다. 그러나 상기의 선행기술들은 균사 배양 과정 중 배지성분 전체를 균사체가 이용하게 방치시킴으로써 배지 성분 중에 포함되어 있는 동일 목적의 생리활성 성분 조차도 균사체가 이용하여 고갈되어 없어지게 되는 문제점을 가지고 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술의 문제점을 인식하여, 개선하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 식물 조직체 유래의 다당체 및 담자균류 균사체 배양물 유래의 다당체로 이루어진 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법을 제공하는 것이다.
이와같은 본 발명의 목적은, 식물 조직체를 열수나 수산화 나트륨으로 추출하여 수득한 추출물에 효소액을 처리하는 단계; 상기 효소로 처리된 추출물에 전배양된 담자균류의 균사액을 접종하고 담자균류의 균사체가 헤미셀룰로오스를 에너지원으로 사용하지 못하도록 하는 조건에서 배양하는 단계; 상기 배양후, 배양물로부터 헤미셀룰로오스를 분리, 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합다당체의 제조방법에 의해 달성된다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하자면 다음과 같다.
우선 식물 조직체, 특히 곡류를 열수 또는 수산화나트륨 등을 이용하여 추출한 후, 효소를 사용하여 추출물을 분해한다. 이때 효소로는 헤미셀룰로오스를 분해하지 않는 것이라면 어떤 종류이든 무방하다. 그러므로 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 등의 효소를 사용하는것이 가능하다. 이 과정을 통하여 담자균류의 생장을 촉진시키고 담자균류가 탄소원으로서 헤미셀룰로오스를 이용하는 것을 줄여주는 효과를 기대할 수가 있다.
상기 식물 조직체는 쌀, 보리, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 팥, 조, 기장 등과 같은 곡물로부터 선택하여 사용할 수 있다.
본 배양을 하기전에 담자균류의 균사를 종균배양(seed culture)하는 전배양과정이 포함되는 데, 표고버섯, 영지버섯, 차가버섯, 아가리쿠스버섯, 상황버섯, 운지 버섯, 복령 중의 한 종을 선택한다. 이 과정 중에는 담자균류의 균사체가 생장하면서 헤미셀룰라아제를 분비하지 못하도록 억제시키면서 배양하는 것이 중요하다. 이는, 예를들면, 배지 영양 성분 중의 다른 탄소원의 농도를 충분히 하여 배양하는 것에 의해 가능하다.
다음으로는 전배양한 종균 균사액을 효소로 처리한 식물조직체 추출물에 접종하여 본 배양을 실시하는 데, 배양기간을 조절함으로써 균사체가 탄소원으로서 전분 분해물 그리고 질소원으로서 단백질 분해물을 우선적으로 이용하여, 생장하도록 유도한다. 이 과정 중에 식물 조직체 추출성분들은 균사체 배양과정 중에 생성된 효소들에 의해 가용화되거나 생물학적으로 분해 또는 수식되어 추가적으로 생리활성이 높은 물질로 전환되는 것을 기대할 수 있다. 배양기간은 접종되는 균사체량 및 배지내 영양성분의 농도에 따라 조정된다.
상기 본 배양이 완료된 후, 배양물로부터 헤미셀룰로오스를 분리, 정제 한다.
헤미셀룰로오스의 분리 정제는 다음과 같이 행한다.
상기 배양물을 마쇄하고 가온하여 열수 추출을 수행한다. 열수 추출액은 원심분리하여 상등액을 수집하고 두배의 에탄올을 첨가하고 원심분리하여 침전물을 증류수에 녹이고 다시 에탄올로 처리하여 다시 침전물을 얻고, 이를 증류수에 녹이고 분무 건조기에서 건조시켜 다당체를 얻는다.
상기 방법에 의하면, 담자균류의 균사체중의 헤미셀룰로오스와 배지로 사용한 식물 조직체중의 헤미셀룰로오스 양자를 효율적으로 얻을수가 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
식물 조직체로부터 섬유소 추출 및 효소 처리
40g의 밀기울(Wheat bran)과 40g의 미강(rice bran), 그리고 20g의 대두박 (de-fatted soy powder)을 50mM 수산화나트륨용액 2ℓ에 첨가하여 80∼90℃에서 1시간 가온하여 추출하였다. 추출이 끝나면 pH를 5.2로 조정하고 아밀라아제 100㎎을 첨가한 후, 40℃에서 3시간 반응시켰다. 다시 셀룰라아제와 프로테아제를 각각 200㎎씩 첨가하고 40℃에서 10시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 121℃에서 20분간 멸균하여 식물 조직 추출물을 얻었다.
[실시예 2]
표고( Lentinus edodes ) 균사 종균(seed) 배양
표고버섯균사(KCTC 6737)를 액체배지[2%(w/v)몰트 익스트랙트, 5%(w/v)덱스트로오스, 0.5%(w/v)이스트 익스트랙트, 0.5%(w/v)박토 펩톤, pH 5.0] 0.4ℓ에 접종한 후, 25℃의 통기조건에서 7일간 배양하여 표고버섯 균사 종균 배양물을 얻었다.
[실시예 3]
표고버섯 균사 본 배양
멸균한 식물 조직 추출물 2ℓ에 표고 버섯 균사 종균 배양물 0.4ℓ을 접종한 후, 25℃의 통기 조건에서 14일간 배양하였다. 이때 배양기간동안의 균체량 및 구성당량의 변화를 측정하였으며, 이중 구성당은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 확인하였다. 이때, 구성당은 글루코오스, 아라비노오스, 그리고 자일로오스를 측정하였다.
구성당과 균체의 양에 대한 측정한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
[실시예 4]
다당체 추출 및 정제
상기 실시예 3의 과정이 완료된 후, 마쇄(homogenization)하고 이를 가온하여 80∼90℃에서 3시간 동안 열수 추출하였다. 이것을 10분간 원심 분리(6,000×g)하고, 상등액만을 수집하였다. 여기에 두 배 부피의 에탄올을 첨가하고 다시 원심분리(12,000×g)하여 침전물을 얻었다. 여기에 증류수를 첨가하여 녹인 후, 다시 두 배 부피의 에탄올을 첨가하여 원심분리(12,000×g)하여 침전물을 얻었다. 이를 증류수에 용해 시킨 후, 분무건조기(APV, Denmark)를 이용하여 최종적으로 다당체 추출 분말을 얻었다.
상기 실시예 3에서의 본 배양에서 배양기간을 달리하고, 실시예 4의 단계를 거쳐 구성당의 변화와 수득된 총당량을 비교 분석하였다.
그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
상기 실시예들에서, 균사체를 다량 확보하면서 면역 활성 증진 기능성을 가진 다당체를 가장 효율적으로 얻을 수 있는 배양기간에 대해서 측정한 결과, 도 1에 도시된 꺽은 선 그래프와 같이 6∼8일(日)인 것으로 확인하였다. 이 시기는 담자균류의 균사체가 헤미셀룰로오스를 탄소원으로 이용하지 않고, 보다 풍부하게 조절한 다른 탄소원을 주로 이용하여 생장한다고 판단된다. 이는 배양액 중의 글루코오스 농도가 초기 배지 농도와 비교하여 3% 이하가 되기 전까지는 아라비노오스와 자일로오스의 농도가 큰 변화 없이 유지되고 있다는 것과 이 시점이 균사체의 생장이 포화된 상태인 정상기(stationary phase)임을 확인하였기 때문이다(표 1, 2참조).
이와같은 사실을 근거로 균사체 배양의 중단을 결정할 수가 있는 데, 즉, 균체의 생장이 정상기에 있으면서 배지 내 글루코오스의 농도가 초기농도와 비교하여 3∼59%로 감소되는 시점을 배양 중단의 표징(標徵)으로 사용할 수 있다. 균체의 생장이 정상기에 위치해 있는지는 배양물을 원심분리하여 얻어진 균체의 무게를 측정하여 간단히 알 수 있으며, 배지 내 글루코오스의 농도는 기지(旣知)된 여러 정량방법 등을 통하여 측정할 수 있다.
본 발명은 식물 조직체 추출 성분 중 면역력 증진 기능성을 가진 헤미셀룰로오스를 이용하지 못하도록 한 조건에서 담자균류의 균사체를 배양함으로써 면역 활성 증진의 기능이 있는 식물 조직체와 담자균류 균사체 유래의 복합 다당체를 효율적으로 얻어낼 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시에 의해 수득한 구성당과 균사체의 배양기간별 농도와 초기 농도를 비교하여 상대적 함량 비율로 변화량을 도시한 꺽은 선 그래프.

Claims (7)

  1. 식물 조직체를 열수나 수산화 나트륨으로 추출하여 수득한 추출물을 헤미셀룰라아제는 포함되지 않는 효소액에 처리하는 단계와; 상기 효소액으로 처리된 추출물에 전배양된 담자균류의 균사액을 접종하고, 담자균류의 균사체가 헤미셀룰라아제를 분비하는 시기에 배양을 중단하여, 헤미셀룰로오스를 에너지원으로 사용하지 못하게 배양하는 단계; 및 상기 배양 후, 배양물로부터 헤미셀룰로오스를 분리, 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 효소는 아밀라아제, 프로테아제, 셀룰라아제 및 이들의 혼합물로 이루어진 효소군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 담자균류는 표고버섯, 영지버섯, 차가버섯, 아가리쿠스버섯, 상황버섯, 운지버섯, 복령 중의 한 종을 선택하여 배양하는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서, 식물 조직체는 쌀, 보리, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 팥, 조, 기장으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 배양기간은 균체의 생장이 정상기에 있고, 배지 내 글루코오스의 농도는 초기농도와 비교하여 3∼59%인 조건에서 배양을 정지시키는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  6. 제 1항에 있어서, 헤미셀룰로오스의 분리, 정제는 상기 배양물을 마쇄하여 열수 추출하고, 열수 추출액에서 원심분리하여 상등액을 수집하고, 에탄올을 처리하여 침전물을 얻고, 침전물은 증류수에 녹이고 에탄올로 처리한 후 원심분리하여 다시 침전물을 얻고, 이를 증류수에 녹이고 분무 건조기에서 건조시켜 행하는 것을 특징으로 하는 면역 활성 증진 복합 다당체의 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 의해서 제조된 아라비녹실란이 포함된 헤미셀룰로오스로 구성된 면역 활성 증진 복합 다당체.
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