KR20210051240A

KR20210051240A - 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화방법

Info

Publication number: KR20210051240A
Application number: KR1020190136235A
Authority: KR
Inventors: 최용석; 이재강; 강희; 송영주
Original assignee: 사조동아원 주식회사
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2019-10-30
Publication date: 2021-05-10

Abstract

본 발명은 밀가루 제분 부산물인 밀 배아에 셀루클러스트(celluclast)첨가를 통해 암, 퇴행성 질환의 원인이 되는 산소의 과다 즉, 유리(활성)산소기(프리래디컬, free radical)의 생성을 억제하는 수용성 항염활성 물질인 2,6-디메톡시-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-benzoquinone : DMBQ)의 추출 함량을 증대하여 추출된 물질을 건조하여 건강기능식품 및 항암 관련 식품등의 소재로 첨가 적용이 가능토록 하며 또한, 저평가 되어 있는 밀 배아의 고부가가치 식품화를 통하여 밀 농가 수입확대 등 국민 건강 증진 및 농가 수입확대를 위한 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법에 관한 것으로서,
상기와 같은 본 발명의 구체적인 해결적 수단은,
"밀 배아에 물을 가수한 다음 셀루클러스트를 첨가하여 중탕기에 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 동결 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법과,
밀 배아 50g에 물 250mL을 가수한 다음 셀루클러스트 1.5L를 첨가하여 30℃의 중탕기에 6 ~ 30시간 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 -50℃에서 동결시키고 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법과,
상기 중탕기 반응시간은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간중 어느 하나를 선택하여 이루어진 것을 특징으로 하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법"을 그 구성적 특징으로 함으로서,

상기와 같이 구성된 본 발명은 밀가루 제분 부산물인 밀 배아에 셀루클러스트를 첨가를 통해 면역력 및 항암 기능성 물질 즉 수용성 항염활성 물질인 2,6-디메톡시-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-benzoquinone : DMBQ)의 추출 함량을 증대하여 추출된 물질을 건조하여 건강기능식품 및 항암 관련 식품등의 소재로 첨가 적용이 가능토록 함으로서 현재 전량 수입에 의존하고 있는 밀배아 추출물의 국산화로 가격경쟁력 강화 및 수입 대체 효과가 있으며, 밀 배아 추출물의 항암 기능성 관련하여 국외에서 항암효과 관련 150편 이상의 기능성이 인정된 바 암 환자의 치료비 경제적 부담을 덜어주고, 예방에 활용하는 등 국민 건강 증진에 이바지 할 수 있으며, 국산밀 원맥의 높은 가격으로 국산밀 밀가루의 원가부담을 밀배아 부가가치로 상쇄하여 국산밀 밀가루 가격 경쟁력 제고를 통하여 농가 소득증대의 효과를 발휘할 수 있다.

Description

수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법{Enzymatic treatment for activating water-soluble anti-inflammatory substances from wheat germ containing water-soluble anti-inflammatory substances}

본 발명은 밀가루 제분 부산물인 밀 배아에 셀루클러스트(celluclast)첨가를 통해 암, 퇴행성 질환의 원인이 되는 산소의 과다 즉, 유리(활성)산소기(프리래디컬, free radical)의 생성을 억제하는 수용성 항염활성 물질인 2,6-디메톡시-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-benzoquinone : DMBQ)의 추출 함량을 증대하여 추출된 물질을 건조하여 건강기능식품 및 항암 관련 식품등의 소재로 첨가 적용이 가능토록 하며 또한, 저평가 되어 있는 밀 배아의 고부가가치 식품화를 통하여 밀 농가 수입확대 등 국민 건강 증진 및 농가 수입확대를 위한 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법에 관한 것이다.

최근 세계 각 나라는 물론 우리나라 소비자들도 안전하고 기능성과 영양이 우수한 식품에 관심이 증가되면서 새로운 기능성 소재를 개발하려는 연구가 급증하고 있다. 특히 식량자원 중에 가공과정에서 부산물로 배출되던 물질 중에서 고 기능성 물질을 확인하고 이를 이용하여 새로운 건강식품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

옥수수, 쌀 및 밀은 세계의 3대 작물로, 밀은 쌀을 주식으로 사용하는 아시아를 제외한 대부분의 나라에서 주식으로 사용되고 있다. 밀은 제분하여 밀가루로 빵이나 국수 등 뿐 만 아니라 다양한 식품가공에 사용되어 왔다. 아시아권의 나라에서도 최근 밀가루 가공품의 사용량이 증가하고 있으며 우리나라의 경우 연간 1인의 쌀 소비량인 2017년 61.8 kg의 1/2보다 많은 33-35 kg을 소비하여 하루 한 끼를 밀가루로 소비하는 추세를 보이고 있다(KOSTAT 2018).

밀은 벼과(―科 Gramineae) 밀속(―屬 Triticum)의 풀 또는 그 곡물을 일컫는 것으로서 빵을 만드는 데 쓰는 밀(Triticum vulgare/T. aestivum), 스파게티나 마카로니 같은 파스타를 만드는 데 쓰는 듀럼 밀(T. durum), 케이크 크래커 쿠키 페이스트리 중력분 등에 쓰는 부드러운 콤팍툼 밀(T. compactum) 등이 있다.

건조한 지방에서 자란 밀은 대개 경질(硬質) 밀로 단백질이 11~15％ 함유되어 있고 글루텐 함량이 풍부해서 빵을 만드는 데 가장 적합하고, 반면에 습기찬 지방에서 자란 밀은 연질(軟質) 밀로서 단백질이 8~10％ 함유되어 있고 글루텐 함량이 적어서 케이크 크래커 쿠키 페이스트리, 가정용 밀가루 등에 알맞다.

이와 같이 밀에는 사람이 필요로 하는 주 에너지원으로는 보통 한 알갱이에는 물 12％, 탄수화물 70％, 단백질 12％, 지방 2％, 무기질 1.8％, 조섬유 2.2％ 등이 함유되어 있다.

이와 같은 밀 곡물에서 가장 영양가 있는 부분인 밀배아는 단백질, 지질, 피토스테롤, 식이섬유, 비타민B, 비타민E, 페놀산 및 미네랄이 많이 함유하고 있는 바와 같이 밀배아는 영양분이 많지만 불포화 지방산이 많아서 산패되기 쉽기 때문에 가공 중에 제거되며 현재는 동물의 사료에만 이용된다.

따라서, 밀배아를 가공처리하여 기능성 식품으로 개발하는 것은 자원의 낭비를 막고 고부가 가치를 창출할 수 있다.

밀 배아는 beta-glucosides로 존재하는 2-methoxyhydroquinones와 dimethoxyhydroquinones이 풍부한 천연물로서 이러한 hydroquinones은 b-glucosidic bonds가 끊어지면서 2-methoxy benzoquinone (MBQ)와 2,6-dimethoxy-benzoquinone (DMBQ)으로 산화된다.

밀배아 자체에는 젖산 박테리아와 같은 몇 가지 미생물이 있는데 이 미생물은 30 ℃에서 β-glucosidase 활성을 갖고 있으므로 조건이 적절하면 hydroquinones을 방출한다. 발효는 밀배아로부터 hydroquinones의 방출을 증가시킬 수 있다.

이와 같은 밀배아에는 생리 활성 화합물이 상당량 들어있고. 약 10-15 %의 지질, 26-35 %의 단백질, 17 %의 당, 1.5-4.5 %의 섬유 및 4 %의 미네랄을 함유하고 있다.(Brandolini A & Hidalgo A 2012). 밀 배아에는 특히 α-tocopherol 등의 항산화물질과 피토스테롤(phytosterols) 및 폴리코사놀(polycosanols)이 있으며 비타민으로 비타민 B(thiamin), 리보플라빈(riboflavin)과 니아신(niacin)을 함유하고 있다(Gelmz N 등 2009, Megahed MG 2011).

현재 약 8-14%의 지방질(평균 10%)을 포함하는 밀배아는 일부 식품, 의료 및 화장품 산업에서 사용되고 있지만 소비량을 증가하기 위해서는 기능성과 항산화활성을 개선할 필요가 있다. 밀 배아에 함유된 항산화 물질로는 지용성 비타민인 토코페놀류와 페놀성 화합물, 플라보노이드 및 카로티노이드가 포함되므로 배아에서 얻는 배아 유는 항산화물질과 식물성 스테롤을 함유하는 좋은 식품이라고 할 수 있다. 그렇기 때문에 통밀 및 밀의 외피, 배아 등의 분획으로부터 항산화활성의 연구가 꾸준히 이루어져 왔으나(Liyana-Pathirana CM & Shahidi F, 2007; Vaher M 등, 2010; Zhou 등, 2004) 항산화활성을 증가시키기 위해 효소를 사용한 연구는 없는 실정이다.

한국 특허출원 제10-2014-0168153호 한국 특허등록 제10-0491362호 한국 특허등록 제10-1345729호

본 발명은 밀가루 제분 부산물인 밀배아에 셀루클러스트 첨가를 통해 암, 퇴행성 질환의 원인이 되는 산소의 과다 즉, 유리(활성)산소기(프리래디컬, free radical)의 생성을 억제하는 수용성 항염활성 물질인 2,6-디메톡시-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-benzoquinone : DMBQ)의 추출 함량을 증대하여 추출된 물질을 건조하여 건강기능식품 및 항암 관련 식품등의 소재로 첨가 적용이 가능토록 하며 또한, 저평가 되어 있는 밀 배아의 고부가가치 식품화를 통하여 밀 농가 수입확대 등 국민 건강 증진 및 농가 수입확대를 위한 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법을 제공함에 그 목적이 있는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위한 구체적인 해결적 수단은,

"밀 배아에 물을 가수한 다음 셀루클러스트를 첨가하여 중탕기에 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 동결 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법과,

밀 배아 50g에 물 250mL을 가수한 다음 셀루클러스트 1.5L를 첨가하여 30℃의 중탕기에 6 ~ 30시간 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 -50℃에서 동결시키고 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법과,

상기 중탕기 반응시간은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간중 어느 하나를 선택하여 이루어진 것을 특징으로 하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법"을 그 구성적 특징으로 함으로서 상기의 목적을 달성할 수 있다.

상기와 같이 구성된 본 발명은 밀가루 제분 부산물인 밀 배아에 셀루클러스트를 첨가를 통해 면역력 및 항암 기능성 물질 즉 수용성 항염활성 물질인 2,6-디메톡시-벤조퀴논(2,6-dimethoxy-benzoquinone : DMBQ)의 추출 함량을 증대하여 추출된 물질을 건조하여 건강기능식품 및 항암 관련 식품등의 소재로 첨가 적용이 가능토록 함으로서 현재 전량 수입에 의존하고 있는 밀배아 추출물의 국산화로 가격경쟁력 강화 및 수입 대체 효과가 있으며, 밀 배아 추출물의 항암 기능성 관련하여 국외에서 항암효과 관련 150편 이상의 기능성이 인정된 바 암 환자의 치료비 경제적 부담을 덜어주고, 예방에 활용하는 등 국민 건강 증진에 이바지 할 수 있으며, 국산밀 원맥의 높은 가격으로 국산밀 밀가루의 원가부담을 밀배아 부가가치로 상쇄하여 국산밀 밀가루 가격 경쟁력 제고를 통하여 농가 소득증대의 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 UWG에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프,
도 2는 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 EWG에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프,
도 3은 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 DMBQ에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프,
도 4는 본 발명에 있어서 UWG와 EWG를 마우스 복막대식세포에 투입후 세포단백질을 회수하여 Western blotting 방법으로 iNOS와 COX2 단백질 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도면,
도 5는 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 TNF-α의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프,
도 6은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 IL-6의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프,
도 7은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 IL-12의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프,
도 8은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 항염 사이토카인에 해당하는 IL-10의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프,
도 9는 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 EWG 처리후 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면,
도 10은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG, DMBQ 각각 처리후 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면,
도 11은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG, DMBQ 각각 처리후 LPS로 자극시 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면,
도 12는 본 발명에 있어서 LPS에 의해 만들어지는 염증성 단백질은 NF-λB 및 MAPK에 의한 AP-1이 핵내로 이동하면서 발현되는데 UWG, EWG, DMBQ가 이러한 신호분자에 미치는 영향을 알기 위해 NF-λB가 핵안으로 들어가기 전에 나타나는 IλBα 분해와 MAPK의 인산화를 Western blotting 방법으로 분석한 도면,
도 13은 본 발명에 있어서 Luciferase reporter 분석을 통해 NF-λB의 전사 활성을 분석한 결과 그래프,
도 14는 본 발명에 있어서 Luciferase reporter 분석을 통해 AP-1의 전사 활성을 분석한 결과 그래프,
도 15는 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 EWG 처리후 Nrf2의 변화를 보기 위해 핵단백질을 분리하여 Western blotting 방법으로 분석한 그래프,
도 16은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG 처리후 Nrf2의 변화를 보기 위해 핵단백질을 분리하여 Western blotting 방법으로 분석한 그래프,
도 17은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청의 TNF-α 변화를 나타낸 그래프,
도 18은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청 IL-6 농도의 변화를 나타낸 그래프,
도 19는 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청 IL-10 농도의 변화를 나타낸 그래프,
도 20은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후 간의 HO-1의 유전자 발현 수준을 실시간으로 측정한 그래프이다.

본 명세서에 개시되어 있는 본 발명의 개념에 따른 실시 예들에 대해서 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시 예들을 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로서, 본 발명의 개념에 따른 실시 예들은 다양한 변경들을 가할 수 있고 여러 가지 형태들을 가질 수 있으므로 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함하며, 명세서 및 청구범위에 사용되는 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 않음은 물론, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 발명의 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아닌바, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이를 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 가능하거나 존재할 수 있음을 이해하여야 할 것이다.

또한, 본 발명의 명세서에서 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

이하 본 발명의 바람직한 일실시 형태를 첨부하는 도면을 참조하여 설명한다.

도 1은 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 UWG에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프이며, 도 2는 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 EWG에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프이고, 도 3은 본 발명에 있어서 MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 DMBQ에서 마우스 복막대식세포의 생존률을 나타낸 그래프이며,도 4는 본 발명에 있어서 UWG와 EWG를 마우스 복막대식세포에 투입후 세포단백질을 회수하여 Western blotting 방법으로 iNOS와 COX2 단백질 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도면이고, 도 5는 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 TNF-α의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프이며, 도 6은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 IL-6의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프이고, 도 7은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 IL-12의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프이며, 도 8은 본 발명에 있어서 LPS로 자극한 마우스 복막대식세포가 분비하는 항염 사이토카인에 해당하는 IL-10의 양을 ELISA로 분석한 결과 그래프이고, 도 9는 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 EWG 처리후 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면이며, 도 10은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG, DMBQ 각각 처리후 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면이고, 도 11은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG, DMBQ 각각 처리후 LPS로 자극시 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 도면이며, 도 12는 본 발명에 있어서 LPS에 의해 만들어지는 염증성 단백질은 NF-λB 및 MAPK에 의한 AP-1이 핵내로 이동하면서 발현되는데 UWG, EWG, DMBQ가 이러한 신호분자에 미치는 영향을 알기 위해 NF-λB가 핵안으로 들어가기 전에 나타나는 IλBα 분해와 MAPK의 인산화를 Western blotting 방법으로 분석한 도면이고, 도 13은 본 발명에 있어서 Luciferase reporter 분석을 통해 NF-λB의 전사 활성을 분석한 결과 그래프이며, 도 14는 본 발명에 있어서 Luciferase reporter 분석을 통해 AP-1의 전사 활성을 분석한 결과 그래프이고, 도 15는 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 EWG 처리후 Nrf2의 변화를 보기 위해 핵단백질을 분리하여 Western blotting 방법으로 분석한 그래프이며, 도 16은 본 발명에 있어서 마우스 복막대식세포에 UWG, EWG 처리후 Nrf2의 변화를 보기 위해 핵단백질을 분리하여 Western blotting 방법으로 분석한 그래프이고, 도 17은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청의 TNF-α 변화를 나타낸 그래프이며, 도 18은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청 IL-6 농도의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 19는 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후에 혈청 IL-10 농도의 변화를 나타낸 그래프, 도 20은 본 발명에 있어서 LPS의 체계적인 반응에 대한 UWG 및 EWG의 영향을 4주 동안 UWG (U) 또는 EWG (E)로 처리한 후, 마우스에 LPS를 복강내 주사하고, 1시간 후 간의 HO-1의 유전자 발현 수준을 실시간으로 측정한 그래프이다.

우선, 본 발명은 밀 배아에 물을 가수한 다음 셀루클러스트를 첨가하여 중탕기에 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 동결 건조하는 것이며,

바람직하게는, 밀 배아 50g에 물 250mL을 가수한 다음 셀루클러스트 1.5L를 첨가하여 30℃의 중탕기에 6 ~ 30시간 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 -50℃에서 동결시키고 건조하는 것이고,

더욱 바람직하게는, 상기 중탕기 반응시간은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간중 어느 하나를 선택하여 이루어진 것이다.

구체적으로는 상기 셀루클러스트(Celluclast)는 0.5 % 함유한다.

상기와 같은 구성에 대하여 실험 분석 내용을 살펴보면,

1) 시료 준비

밀배아는 사조 동아원 (Dangjin, South Korea)에서 공급받았다. 250 ml의 물과 50 그램의 분쇄되지 않은 밀배아를 플라스크에 넣고 0.5 % Celluclast 1.5L (Novozymes, Bagsvaerd, Denmark)을 가하여 30℃ 수조에서 24 시간 동안 배양하였다.

시료를 1,000 x g에서 15 분 동안 원심 분리한 후, 상등액은 취하여 vacuum evaporator(Eyela, Tokyo, Japan)를 사용하여 동결건조하였다. 이하 효소인 셀루클러스트(Celluclast)로 처리된 밀배아 수용성 추출물(이하 'EWG' 라 한다)과 효소처리하지 않은 밀배아 수용성 추출물(이하 'UWG'라 한다).

UWG는 동일한 조건 하에서 Celluclast 1.5L 없이 만들었다.

2) DMBQ 분석

DMBQ 분석은 HPLC 방법을 이용하였다. 먼저 1g의 UWG 또는 EWG를 100mL의 deionized water(DW)에 용해시킨 후 300mL의 클로로포름으로 1분간 섞어 3회 추출하였다. 클로로포름 층을 회수하여 35 ℃에서 vacuum evaporator로 동결건조하였다. 이때 얻은 가루를 10 mL의 클로로포름에 재용해시키고 0.45-μm polyvinylidene fluoride filter 를 통해 여과하였다. HPLC에 사용한 기구는 다음과 같은 사양이다. 290nm에서 작동하는 photodiode array detector(Waters) 및 ProntoSIL 120-5-C18 ACE-EPS column (250 × 4.6 mm, 5μm)이 장착된 HPLC system (Alliance; Waters, Milford, MA, USA)이다. 주입 용량은 5 μL이고 유속은 0.8 mL/분이었다. Eluent A는 0.1 % (v /v) 포름산이 함유된 DW이며 eluent B는 acetonitrile로 사용하였다. 이원 이동상 (binary mobile phase)의 용매 조성은 다음과 같으며, 각 세그먼트는 5 분 동안 지속되었다 (linear gradient 0- 25% B, hold at 25% B, linear gradient 25- 35% B, hold at 35% B, linear gradient 35-85% B, hold at 85% B, linear gradient 85-0% B, and hold at 0% B). 표준물질로 사용한 DMBQ는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

3) 실험동물

본 실험에 사용된 실험용 마우스는 생후 7주령 수컷 Balb/c로 Koatech (Pyungtek, South Korea)에서 구입하였고 12 시간의 명암 주기로 온도 및 습도가 제어되고 병원체가 없는 동물 시설에서 수용했다. 모든 동물은 실험 전에 1 주일 동안 적응기간을 거쳤다. 동물 프로토콜 (KHUASP (GC) -19-005)은 경희대학교의 기관 동물윤리위원회에 의해 승인되었으며, 실험 동물의 관리 및 사용에 관한 미국 국립 연구위원회 (1996)에 따라 마우스를 관리했다.

4) 마우스 복강 대식세포 분리

마우스 복강 대식세포를 분리하기 위해 2 mL의 3.5 % 멸균 thioglycollate (BD, Sparks, MD, USA)를 복강으로 주사하였다. 4일 후에 마우스를 CO₂ 흡입으로 희생시켰고, 1 % fetal bovine serum (FBS; HyClone, Logan, UT, USA) 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 (Welgene, South Korea)을 함유하는 차가운 DMEM (HyClone)을 시린지에 넣고 복강세포를 얻었다. 원심 분리 후, 세포는 resuspension하고 Countess II 자동 세포 계수기 (Thermo Scientific, WA, USA, WA)를 사용하여 세포수를 결정하였다. 실험에 측정하기 위해 필요한 플레이트에 세포를 분주하고 37 ℃에서 overnight incubation하였다. 어세이를 들어 가기 전에 non-adherent cell은 제거하였다.

5) 세포독성 측정

세포를 96-well plates에 4반복으로 seeding하고, UWG, EWG 및 DMBQ를 다양한 농도로 넣고 24시간동안 배양하였다. 세포생존률을 보기 위해 MTT 분석법을 사용하였다. 실험 방법은 다음과 같다. 배지를 제거하고 세포를 phosphate buffered saline (PBS)로 세척하였다. 이후 DMEM에 용해된 MTT(Sigma)를 각 well에 첨가하여 최종 농도는 0.5mg/mL이 되도록 하였다. 37 ℃에서 1 시간 동안 incubation한 후 배지를 제거하였다. 0.1 mL DMSO를 첨가하고 15 분 동안 incubation하여 MTT를 용해시켰다. 흡광도는 iMark microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 570 nm에서 측정하였다. 세포 생존율은 대조군 세포의 백분율로 표시하였다.

6) Western blotting

Western blotting에 필요한 단백질을 얻기 위한 실험 조건은 다음과 같다. iNOS, COX2 및 HO-1을 검출하기 위해, 세포를 24 시간 동안 UWG, EWG 또는 DMBQ의 넣고 100ng/mL LPS (Sigma)의 넣고 자극하였다. MAPK의 활성을 보기 위해서는 세포를 1 시간 동안 UWG, EWG 또는 DMBQ로 전처리한 후 15 분 동안 LPS로 자극하였다. 핵내 Nrf2의 경우, EWG로 세포를 0분, 30분, 60분, 90분, 120분간 자극하여 배양 조건을 잡았으며 이후 60분, 90분간 UWG 또는 EWG와 함께 배양하였다. 배지를 제거후 세포를 PBS로 세척한 후에 phosphatase inhibitor cocktail (Sigma) 및 protease inhibitor cocktail (Quartett, Berlin, Germany)을 포함하는 lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH 7.5; 150mM NaCl; 1mM EDTA; 20mM NaF; 0.5 % NP-40; 1 % Triton X-100)로 세포를 lysis하였다. 핵 단백질 추출물은 제조사의 프로토콜에 따라 Nuclear Extraction Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. 단백질 농도는 Bradford assay를 사용하여 측정하였다. 단백질을 8 % 또는 10 % sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용하여 크기 별로 분리한 다음 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (BioRad)으로 옮겼다. 5 % skim milk가 함유된 TBST (0.1 % Tween 20/ Tris-buffered saline)로 blocking buffer를 제조한 후 PVDF membrane을 1 시간 동안 blocking buffer에 반응시켰다. 1 차 항체인 iNOS, COX2 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), HO-1, IκBα, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), phospho-JNK, JNK, phospho-p38, p38, phospho-ERK1/2, ERK1/2, Nrf2, or lamin B1 (Cell Signaling Technology, CA, USA)를 blocking buffer에 1:1000으로 희석하여 4 ℃에서 overnight 반응시켰다. 이후 PVDF membrane을 TBST로 세척하고 anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated antibody (Bethyl, Montgomery, TX, USA)를 blocking buffer에 1 : 5000으로 희석하여 1 시간 동안 상온에서 반응시켰다. 단백질 밴드는 EzWestLumi plus (ATTO, Tokyo, Japan)로 검출하고 EZ-Capture MG (ATTO)를 사용하여 분석하였다.

7) Cytokine 분석

TNF-α, IL-6, IL-12p70 및 IL-10의 분석은 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 방법으로 분석하였다. ELISA에 사용한 시약은 DuoSet ELISA Development Systems(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다. 먼저 96well immunoplate에 PBS로 희석한 capture antibody를 0.1 mL씩 분주한 후, 4℃에서 overnight 반응시켰다. Washing buffer (0.5% Tween/PBS)로 well을 세척 후, blocking buffer (10% FBS가 함유된 PBS)를 well 당 0.2 mL 넣고 1시간동안 상온에 두어 반응시켰다. Washing buffer로 well을 세척 후, 제조사의 표준물질, 상등액 또는 혈청을 blocking buffer에 희석하여 well에 0.1mL씩 분주하여 2시간동안 반응시켰다. Washing buffer로 세척한 후, blocking buffer에 biotin이 결합된 detection antibody와 HRP를 희석하여 well당 0.1 mL씩 처리하여 1시간동안 상온에서 반응시켰다. Washing buffer로 세척 후, TMB 용액을 well당 0.1 mL씩 처리한 후 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 2N H₂SO₄ 용액을 well당 0.05 mL씩 첨가함으로써 반응을 완료시킨 뒤, 450 nm에서 microplate reader를 사용하여 흡광도를 측정하였다.

8) Luciferase assy

NF-λB 또는 AP-1 전사 활성은 5 개의 NF-λB 반응 요소를 함유하는 pGL4.32 또는 6 개의 AP-1 반응성 요소를 함유하는 pGL4.44로 형질 변환된 RAW264.7 세포와 firefly luciferase reporter gene (luc2P) (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다. 형질 변환된 RAW264.7 세포를 96 well plates에 분주하고 37 ℃에서 overnight 동안 incubation하였다. 배지를 교환한 훙제거하고 후, 세포를 2 시간 동안 UWG, EWG 또는 DMBQ로 전처리 한 후 6 시간 동안 LPS로 자극 하였다. 루시퍼 라제 활성은 Dual-Glo®luciferase assay system(Promega)을 사용하여 측정되었다.

9) In vivo 동물실험

마우스를 정상군, 대조군, UWG (0.3g/kg, 3g/kg), EWG (0.3g/kg, 3g/kg)으로 무작위로 나누었다. 각군당 동물의 수는 정상군의 경우 5마리이고 나머지 군은 13마리씩 할당하였다. UWG 및 EWG는 물에 현탁시키고 4 주 동안 매일 1 회 경구투여를 하였다. 정상군과 대조군은 동일한 양의 물을 투여하였다. 대조군, UWG 및 EWG 그룹은 실험 종료시 1.3 mg / kg의 LPS를 복강 내 주사하였다. 1 시간 후, 마우스를 에테르로 마취시킨 후에 심장에서 혈액을 채혈하였고 간을 분리하였다. 원심분리후 얻은 혈청은 -20 ℃에서 보관후 ELISA에 사용하였다.

10) Realtime RT PCR

간의 RNA는 Tri-RNA Reagent (Favorgen, Kaohsiung, Taiwan)을 사용하여 분리하고 High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. Real-time PCR은 StepPlus One real-time PCR system (Applied Biosystems)에서 SYBR Green Mix (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 각 cDNA 발현양은 표준 곡선 계산 방법으로 정하였다. 표적 유전자는 GAPDH로 normalization하였다.

11) 통계 방법

모든 결과는 평균 ± 표준편차로 나타냈다. 군간 차이를 비교하기 위해 Student t-test나 ANOVA를사용하였다. ANOVA후 군간에 유의한 차이가 나면 Tukey's post-hoc test를 추가로 이용하여 비교하였다. 모든 통계 분석은 IBM SPSS 소프트웨어 버전 22.0 (Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.

상기와 같이 실험한 결과,

1) DBMQ 분석

HPLC로 DMBQ 양을 분석한 결과 UWG에는 DMBQ가 검출되지 않았으며 EWG에는 0.244 ± 0.001 mg / g의 DMBQ이 검출되었다.

2) UWG와 EWG의 세포생존률

MTT 실험방법으로 세포 생존률을 측정한 결과 UWG를 처리한 세포에서의 세포 생존율 증가하는 경향을 보였다. 도 1에 도시된 바와 같이 마우스 복강대식세포는 일반적으로 배양시 세포분열을 하지 않으므로 MTT 방법에서 얻은 흡광도의 증가는 세포의 효소활성이 증가한 것으로 보였다.

반면에, 도 2에 도시된 바와 같이 EWG를 처리한 세포는 MTT 값이 증가하지 않았으며 농도가 올라갈수록 감소하는 경향이 나타났다.

또한, 도 3에 도시된 바와 같이 EWG (0-216ng/mL)의 농도에 상응하는 DMBQ 농도에 대한 세포의 생존을 측정한 결과 EWG 800μg/mL에 농도와 동일한 DMBQ의 최고 농도에서 대조군과 비교하여 세포 생존률이 50 % 감소하였다.

이를 통해 고농도 EWG에서 보인 세포대사의 감소는 DMBQ에 기인하는 것으로 해석된다.

3) UWG와 EWG가 염증성 효소인 iNOS와 COX2에 미치는 영향

본 발명은 UWG의 항염활성이 효소처리에 의해 변하는지를 확인하기 위해 LPS를 이용하여 대식세포를 자극하고 동시에 UWG와 EWG를 세포에 직접 처리하였다.

세포단백질을 회수하여 Western blotting 방법으로 iNOS와 COX2 단백질 발현량을 분석한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 UWG와 EWG 모두 iNOS 단백질 합성을 감소시켰으며 EWG의 감소가 더 강력하였다.

또한, DMBQ가 iNOS 발현에 영향을 주는지 알기 위해 EWG의 200㎍/mL에서 함유된 DMBQ의 양을 수율에 따라 산출하여 0.049㎍/mL의 농도로 세포에 처리한 결과, DMBQ는 iNOS 발현을 완전히 억제하여 EWG의 iNOS 억제가 DMBQ에 의한 가능성을 제시하였다. COX2 단백질 발현은 추출물이나 DMBQ에 의해 영향을 받지 않았다.

4) UWG와 EWG가 염증성 사이토카인 분비에 미치는 영향

LPS로 자극한 대식세포가 분비하는 사이토카인중 염증성 사이토카인에 해당하는 TNF-α, IL-6 및 IL-12의 양을 ELISA로 분석한 결과, 도 5와 도 6에 도시된 바와 같이 UWG, EWG 또는 DMBQ는 TNF-α 및 IL-6의 분비에 변화를 주지 않았다.

한편, 도 7에 도시된 바와 같이 UWG 및 EWG는 IL-12 분비를 억제하였는데 효능은 비슷한 수준이었으며 농도의존적으로, DMBQ도 IL-12 분비를 억제하였다.

이러한 결과는 UWG가 IL-12 생성을 특이적으로 억제하는 물질을 함유하고 있으며 효소처리가 IL-12를 억제하는 물질의 생성에 영향을 주지 않음을 보여준다.

5) UWG와 EWG가 항염 단백질에 미치는 영향

LPS에 대해 만들어지는 항염 사이토카인인 IL-10의 양을 ELISA로 분석하였다.

도 8에 도시된 바와 같이 UWG는 IL-10 생산을 증가시켰으며, EWG 또한 IL-10 분비를 증가시켰지만 UWG보다는 약간 적었다.

즉, DMBQ는 IL-10 분비를 감소시켰으며 이로 인해 IL-10을 유도하는 EWG의 활성이 UWG에 비해 줄어든 것으로 보인다.

IL-10 이외에 항염단백질인 HO-1의 단백질 발현량을 Western blotting 방법으로 분석하였다.

도 9에 도시된 바와 같이 먼저 EWG 처리 후 HO-1 단백질 발현의 시간을 분석한 결과 24 시간에 최대라는 것을 확인하였고 그 결과를 바탕으로 세포를 UWG, EWG 및 DMBQ와 함께 24시간 배양하였다.

그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이 UWG도 HO-1 단백질 합성을 자극하였고 EWG는 UWG에 비해 HO-1 합성이 더 증가하였으나, DMBQ는 HO-1 발현을 않았다.

즉, 이러한 경향은 LPS로 자극했을 때에도 비슷하게 나타났고 도 11에 도시된 바와 같이 EWG가 HO-1 유도를 촉진한 것은 DMBQ와 무관한 것임을 알 수 있었다.

6) UWG와 EWG가 염증성 신호분자에 미치는 영향

지질 다당체(Lipopolysaccharide : LPS)에 의해 만들어지는 염증성 단백질은 NF-λB 및 MAPK에 의한 AP-1이 핵내로 이동하면서 발현된다. UWG, EWG, DMBQ가 이러한 신호분자에 미치는 영향을 알기 위해 NF-λB가 핵안으로 들어가기 전에 나타나는 IλBα 분해와 MAPK의 인산화를 Western blotting 방법으로 분석하였다. 도 12에 도시된 바와 같이 EWG는 IλBα 분해와 JNK 인산화를 강력하게 억제하였고 p38 및 ERK 인산화도 어느 정도 조절하였다. UWG와 DMBQ는 이들 신호 분자에 대한 조절이 뚜렷하지 않았다. 도 13 및 도 14에 도시된 바와 같이 Luciferase reporter 분석을 통해 NF-λB와 AP-1의 전사 활성을 분석한 결과 200㎍/mL의 농도에서 UWG와 EWG는 NF-λB와 AP-1 활성을 유의하게 감소시켰으며, EWG가 더욱 강력하였다. DMBQ는 이들 단백질의 전사 활성에 영향을 미치지 않았다. 따라서 EWG 항염기전에는 NF-λB와 MAPK에 의한 AP-1 조절이 관여함을 알 수 있었다.

7) UWG와 EWG가 핵내 Nrf2 양에 미치는 영향

HO-1의 조절은 nuclear factor erythroid 2-related factor (Nrf2)가 핵안으로 이동하면서 일어난다. UWG와 EWG 모두 HO-1을 유도하였으므로 Nrf2의 변화를 보기 위해 핵단백질을 분리하여 Western blotting 방법으로 분석하였다. 도 15에 도시된 바와 가티 먼저 Nrf2 핵 이동이 일어나는 시간을 알기 위해 EWG를 세포에 처리하고 0, 30, 60, 90, 120분 후에 핵단백질을 회수한 결과 60분에서 뚜렷한 단백질 양이 나타났고 90분에 최대양이 나타났다. 도 16에 도시된 바와 같이 이러한 결과를 기초로 세포에 UWG와 EWG를 60, 90분간 처리후 핵의 Nrf2의 양을 비교한 결과 HO-1와 마찬가지로 둘다 모두 Nrf2의 핵이동이 확인되었으며 특히 EWG가 더 강하게 나타났다. 따라서 EWG의 HO-1 발현증가는 Nrf2 활성과 관련이 있음을 알 수 있었다.

8) UWG와 EWG 경구투여가 LPS에 의한 급성 염증반응에 미치는 영향

각 시료는 0.3 g/kg, 3 g/kg의 농도로 경구투여하였으며 최고 농도인 3 g/kg은 발효 밀배아 추출물에 대한 논문을 참고하였다. 4주간 투여후 LPS를 복강으로 자극하여 1시간 후에 혈액을 채혈하였다. 도 17에 도시된 바와 같이 혈청의 TNF-α 감소는 UWG 및 EWG 군에서 모두 나타났다. 그러나 이러한 유의한 억제는 UWG의 경우 3g/kg에서 나타났으며 EWG에서는 이의 1/10의 농도인 0.3 g/kg에서 비슷한 억제를 보여주었다. 그러나 EWG는 0.3 g/kg과 3 g/kg의 TNF-α 값이 비슷하여 농도의존적인 효능은 나타나지 않았다. 따라서 효소처리에 의해 TNF-α 를 억제하는 물질이 더 많이 나타났음을 알 수 있었다. 도 18에 도시된 바와 같이 혈청 IL-6 농도에 UWG와 EWG 모두 변화가 없었다. 도 19에 도시된 바와 같이 혈청내 IL-10의 경우 UWG가 0.3g/kg와 3 g/kg 농도에서 모두 증가하였는데 반해 EWG는 3 g/kg농도에서야 유의하게 증가하였다. IL-10를 유도하는 물질은 효소처리에 의해 증가하지 않는 것으로 보였다. 도 20에 도시된 바와 같이 결과는 in vitro 결과와 비슷한 패턴을 보인 것에서 같이 IL-10을 유도하는데 EWG보다 간의 HO-1 유전자 발현 증가는 0.3g/kg을 투여한 EWG군에서만 나타나 농도의 영향을 받는 것으로 나타났다.

이상과 같이 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않음은 물론이며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술적 지식을 가진 자에 의해 상기 기재된 내용으로부터 다양한 수정 및 변형이 가능할 수 있음은 물론이다.

따라서 본 발명에서의 기술적 사상은 아래에 기재되는 청구범위에 의해 파악되어야 하되 이의 균등 또는 등가적 변형 모두 본 발명의 기술적 사상의 범주에 속함은 자명하다 할 것이다.

Claims

밀 배아에 물을 가수한 다음 셀루클러스트를 첨가하여 중탕기에 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 동결 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법.
제 1 항에 있어서,
밀 배아 50g에 물 250mL을 가수한 다음 셀루클러스트 1.5L를 첨가하여 30℃의 중탕기에 6 ~ 30시간 반응시킨 후 여과한 다음, 원심 분리한 후 상등액에서 DMBQ을 추출하여 진공증발기를 이용하여 -50℃에서 동결시키고 건조하는 것을 포함하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법.
제 2 항에 있어서,
상기 중탕기 반응시간은 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간중 어느 하나를 선택하여 이루어진 것을 특징으로 하는 수용성 항염활성 물질이 함유된 밀 배아로 부터 수용성 항염활성 물질을 활성화하기 위한 효소처리 가공방법.