KR0143512B1

KR0143512B1 - 배양된 영지버섯 균사체로부터의 면역활성물질의 추출정제방법 및 그로부터 추출된 면역활성물질

Info

Publication number: KR0143512B1
Application number: KR1019940015058A
Authority: KR
Inventors: 정경수
Original assignee: 한경우
Priority date: 1994-06-28
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 1998-07-15
Also published as: KR960000075A

Abstract

본 발명은 구멍장이버섯과(polyporaceae)에 속하는 담지균류의 일종인 영지버섯(Ganoderna ucyudynm 영지)의 균사체를 폐효모 추출액이 함유된 인공 배지내에서 진탕 배양함으로써 그 균사체를 빠르면서도 값싸게 대량으로 생산할 수 있는 새롭고도 진보적인 액체 배양방법 및 이를 농축하여 면역활성 물질을 추출정제 하는 방법에 관한 것으로 이를 위해서 영지버섯(Ganoderma lucidum)균사체를 배지 1리터당 중량비로 포도당 2%∼10%, 콘스팁리커 0.2%∼5%, 폐효모추출액 0.1%∼2.0%를 주요 성분으로 함유하는 액체배지에서 배양하며 상기와 같은 방법으로 배양된 영지버섯 균사 배양물을 열탕 추출하여 균사체 케익은 제거하고 열수 추출물을 회수하며 이어서 에탄올에 침전시켜 원심분리하여 얻은 추출물을 투석하여 건조하므로써 다당체를 함유하는 면역활성 물질을 얻게 된다.

Description

배양된 영지버섯 균사체로부터의 면역활성 물질의 추출정제방법 및 그로부터 추출된 면역 활성 물질

본 발명은 구멍장이버섯과(polyporaceae)에 속하는 담지균류의 일종인 영지버섯(Ganoderna ucyudynm 영지)의 균사체를 폐효모 추출액이 함유된 인공 배지내에서 진탕 배양함으로써 그 균사체를 빠르면서도 값싸게 대량으로 생산할 수 있는 새롭고도 진보적인 액체 배양방법 및 이를 농축하여 면역활성 물질을 추출정제 하는 방법에 관한 것이다.

영지버섯은 고대로부터 신비의 상약으로 알려져 각종 질병에 대한 민간요법제(신농본초경 500년경 강홍경 및 본초강목 1552년 이시진)로 이용되어 왔다. 그러나 근년에는 영지 추출물 중 다당체, 즉 고분자 물질들이 항암작용(김병각등, 한국균학회지 8권, 107-113쪽, 1980년)을 위시하여 항앨러지작용(Kohda et al., Chem. Pharm. Bull., 1367-1374, 1985년), 면역증강작용, 항고혈압작용(Kanmatsuse et al., 약학잡지(일본), 105권, 942-947: Kabir et al., J. Nutr. Sci. Vitaminol., 34권, 1988년)등 다양한 생리활성을 발휘함이 알려져 있다. 이외에도 최근에는 영지버섯 균사배양물로부터 분리된 단백다당제 G009가 보건사회부의 신약개발연구과제의 하나로서 제약회사와 대학 연구진들에 의해 간장치료제로 개발 중에 있다. 영지뿐만 아니라 담자균류가 생성하는 항암성 다당류들은 부작용이 거의 없고 매우 안전하면서 인체 면역을 강화시켜 탁월한 항암효과를 나타내기 때문에 운지(Coriolus versicolor, 구름버섯)나 상황(Phellinus linteus)의 다당체 혹은 단백다당체들은 각각 코포랑(PS-K) 및 메시마-엑스 등 의약품으로 개발되어 암의 면역치료에 임상적으로 활용되고 있고 이외에도 표고버섯(Lentinusedodes)의 다당체 렌티난(lentinan), 치마버섯(Schizophyllum commune)의 다당체 치조필란(Schizophyllan)등도 항암효과가 잘 알려져 있다.

현재 유통되고 있는 영지버섯은 거의가 농가에서 길러낸 재배품이며 간혹 야생으로 부터 채집된 자연산 영지버섯이 유통되기도 한다. 그러나 자연산 영지버섯중에서는 영지버섯과 유사한 다른 버섯들이 혼입되어 있거나 해충 또는 미생물의 오염등으로 인하여 국민보건에 심각한 문제가 제기되고 있다. 뿐만 아니라 야생의 자실체를 채집하여 이용하는 방법은 자원의 고갈과 생태계 파괴라는 문제가 뒤따르고 있다. 한편 재배되고 있는 영지버섯은 재배 과정 중 버섯을 발생시킬 때 건실한 자실체를 생성시키기 위하여 용기당 1-2개의 영지버섯만 자라도록 하고 나머지 발이점들은 절단 제거한다. 따라서 영지버섯의 수확량은 느타리버섯등 다른 일반 식용버섯등에 비하여 현저히 낮을 뿐만 아니라 특별한 시설과 고도의 재배기술이 요구되고 배양기간도 3-6개월이 걸리는 등 많은 제약이 있기 때문에 자연히 비쌀 수 밖에 없다. 그럼에도 불구하고 다양하고 유익한 약리활성 때문에 영지버섯은 그 자체로 혹은 가공되어 기능식품(건강보조식품)이나 기호식품으로 널리 이용되고 있다.

그러나 영지버섯도 다른 버섯들과 마찬가지로 담자균류 즉 고등균류에 속하는 미생물의 일종이기 때문에 그 자실체로 부터 분리된 균사체를 액체 배지를 이용하여 대량 배양하면 상기의 문제점들을 일시에 해결할 수 있다. 그러나 영지버섯등 담자균류의 균사체는 일반적으로 세균등에 비해 배양조건이 까다롭고 성장이 느리며 균사체 수율이 그리 높지 못하기 때문에 배지 조성 및 배양 조건을 개선하기 위한 연구가 절실히 요구되고 있다.

이와 관련하여 기존의 영지버섯 균사체 배양방법을 고찰하여 보면 다음과 같다. 즉, 와다 도시꼬등의 배양방법(대한민국 특허공고 제88-2476호)은 활엽수, 톱밥 및 쌀겨 등을 배합한 고체배지를 이용하는 방법으로서 배지조제가 매우 번거로우며 배양시간도 보통 20-30일간이나 소요되는 단점이 있다.

한편, 신상철등(대한민국 특허공고 87-146)은 콘스팁리커를 함유하는 액체 배지를 이용하여 영지버섯의 균사체를 보다 간편하고 신속하게 배양하는 방법이 제안된 바 있으나 이 방법은 균사체 수율이 배제 1리터당 2.0∼2.9g에 불과하여 이 역시 만족할 만한 방법이 못된다.

한편, 이권행 등(1991, 한국균학회지 19권 1호, p.79-84)은 당밀, 구기자박, 인삼박, 탈지대두분, 콘스팁리커 등 산업폐자원이나 산업부산물을 이용한 배지에 영지 균사체를 배양하여 그 균사체 수율을 비교 연구한 바 있다. 그러나 그 연구 결과 얻어진 균사 수득량은 배지 100㎖당 불과 0.39g에서 최고 1.28g에 불과하였을 뿐만 아니라 최고 수율 1.28g을 나타낸 탈지대두박 배지가 선행기술인 콘스팁리커를 함유하는 액체 배지의 수율 1.25g에 비해 불과 2.4%수율 증가에 머물렀고 탈지대두박이 콘스팁리커에 비해 경제성이 없다는 이유등으로 영지버섯 균사배양에 가장 적합한 배지가 콘스팁리커 배지 임을 재확인한 결과에 불과하였다.

이에 따라 본 발명의 목적은 기존의 콘스팁리커 배지를 사용하는 방법보다 월등히 높은 균사체 수율을 얻는 획기적이고도 진보적인 액체 배양 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 이렇게 배양된 영지버섯 균사 배양물로 부터 면역활성 물질을 추출정제 해 내는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 맥주발효 공정등에서 부산물 내지 폐기물로 버려지는 폐효모 추출액 0.1%∼2.0%, 콘스팁리커 0.2%∼5.0%, 포도당 2%∼10%를 주요성분으로 함유(배지 1리터당 중량비)하는 액체 배지에서 영지버섯 균사체를 배양한다.

본 발명을 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 사용한 영지버섯 균사체로는 충남대학교 약학대학 미생물약품화학교실에 보존 중인 균주(M-GL-002)를 사용하였다.

본 발명에 있어서 영지버섯 균주의 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양을 이용하나 그 배지성분중 발효 공정에서 생성되는 폐효모 추출액을 함유하는 것이 기존의 방법과 다른 현저한 특성이라 할 수 있다.

즉 톱밥, 쌀겨 등을 전혀 사용치 않고 포도당을 일반 담자균류 배지보다 대폭 증량하였으며 질소원 및 각종 성장인자원으로서 콘스팁리커 및 폐효모추출액을 사용하였고 미량원소 등을 첨가함으로써 기존의 배지 조성을 개선하여 균사체 수득량이 획기적으로 증가된 액체배양이 가능하게 된 것이다. 여기서 폐효모 추출액이라 함은 발효산업에서 폐자원으로 발생하는 건조 폐효모를 열탕하여 얻은 상등액을 말한다.이때 포도당 뿐만 아니라 서당, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀 등도 사용할 수 있으며 질소원으로는 펩톤, 맥아추출물, 대두박, 어박 등을 추가로 사용할 수 있다. 필요에 따라서는 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산 및 기타 이온성 무기염류를 첨가하면 매우 효과적이다. 배지의 산성도(pH)는 4.0∼7.0까지 가능하나 5.0∼6.5가 더욱 좋다. 배양방법으로는 호기적 조건에서 진탕배양 혹은 통기교반 하는 것이 좋다.

배양온도는 상기의 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나 보통 20℃∼37℃에서 배양 하는 것이 적당하며 최적 온도치는 24℃∼30℃이다. 또한 배양기간은 진탕배양, 탱크배양의 경우 모두 통상 5일내지 15일간 배양함으로써 목적하는 대량 배양이 가능하다.

앞에서 기술한 바와 같은 조건으로 액체 배양하면 항암면역 추출재료가 되는 균사체 배양물을 얻을 수 있는데 본 물질은 균체는 물론 및 배양여액에도 존재하기 때문에 배양물 전체를 열탕추출 또는 고압추출하여 정제한다.

이하, 본 발명을 실시예에 따라 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

[실시예1]

영지버섯 균주(Ganoderma lucidum M-GL-002)의 푸라스크내 진탕배양.

영지버섯 균주(Ganoderma lucidum M-GL-002)를 액체 배양하기 위하여 종배지로는 배지 1리터당 포도당 50g, 펩톤 10g, 폐효모추출액 10㎖, 인산제2칼리 0.5g, 황산마그네슘 0.9g, 염화칼슘 0.3g을 넣은 배지를 사용하였다. 또 생산배지로는 배지 1ℓ당 가용성 전분 10g, 포도당 50g, 폐효모 추출액 5㎖, 펩톤 5g, 콘스팁리커 10㎖, 인산제2칼리 0.5g, 황산마그네슘 0.5g, 염화칼슘 0.3g 및 미량원소로써 MnCl2, FeSO4, ZnSO4등을 넣은 배지를 사용하였다. 종배지, 생산배지 모두 멸균전에 pH를 5.0으로 조절한 후 사용하였다. 상기의 종배지 50㎖가 담긴 250㎖ 용량의 삼각푸라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 감자-포도당-한천 사면배지 상의 영지버섯 균주(Ganoderma lucidum M-GL-002)를 소량의 배지 덩이와 함께 떼어내 접종하고 27℃에서 7일간 180rpm으로 진탕배양하여서 활성화된 1차 종배양액으로 하였다. 고온고압멸균한 전기믹서로 1차 종배양액을 10-15초간 균질화한 후 동일한 새 배지에 10%씩 접종하고 동일한 조건으로 7일간 진탕배양하여 2차 종배양액으로 하였다. 그런 다음에 2차 종배양액을 균질화하여 종배지 500㎖가 들어있는 2리터 푸라스크에 50㎖씩 접종하고 동일 조건으로 9일간 진탕배양하여 진탕배양을 완료하였다. 이렇게 배양하면 배지 1리터당 35g의 영지버섯 건조 균사를 얻을 수 있으며 이는 기존의 배양 방법보다 40%이상 수율이 증가된 것이다.

[실시예2]

영지버섯 균주(Ganoderma lucidum M-GL-002)의 대량 액내배양

상기 실시예 1의 방법대로 영지버섯 균주(Ganoderma lucidum M-GL-002) 균주의 2차 종배양을 시행한 후 2리터 푸라스크에 5일간 3차 배양을 실시하고 이어서 200리터의 생산배지가 들어 있는 500 리터 용량의 발효조를 미리 멸균시킨 후 제2차 종배양액 10리터를 접종하여 27℃에서 5일간 전배양하였다. 이때 배양조건으로는 통기 200리터/분, 각반은 100∼200rpm으로 하였다. 이어서 1500리터의 생산배지가 들어있는 2500리터 용량의 발효조를 미리 멸균시킨 후, 전배양체를 무균적으로 이송하여 통기 1500리터/분, 각반은 100∼200rpm으로 3일간 배양하였다. 이상과 같은 방법으로 균사체 액체배양을 연속적으로 수행함으로써 접종 10일만에 대량으로 균사체를 얻을 수 있는데 이때 리터당 30g의 균사체 수율을 얻을 수 있었다.

[실시예3]

상기의 실시예 1에서 얻어진 균사체를 다음과 같은 방법으로 추출한 후 분리정제 하였다. 즉, 얻어진 균사배양물 1리터를 90∼100℃에서 2시간씩 2회 열탕 추출한 후 균사체 케익은 제거하고 열수 추출물만을 회수하였다. 이 열수 추출물을 진공농축 한 후 3배량의 95% 에탄올을 가하여 하룻밤 정치한 다음 300rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이와 같이 얻어진 추출물을 다시 소량의 물에 녹여서 분자량 12000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 약 5일간 투석한 후 -70℃에서 동결 건조하면 다당체를 함유하는 고분자 추출물 1-3g가량을 얻을 수 있다.

[실시예4] 면역활성효과

상기 실시예 3에서 분리한 고분자 분획의 면역활성을 실험하였다. 즉, 아이씨알 마우스(ICR mouse)에 시료를 50㎎/㎏의 용량으로 7일간 복강내 주사한 후 비장을 적출하고 비장내 면역 세포들의 조성을 보고한 방법(정 경수, 신약개발의 실제와 문제, 한국응용약물학회 추계 심포지옴 초록집, P7-13, 1993년)에 따라 면역형광염색(immunofluorescence staining)및 유세포분석법(flow cytometry)으로 분석하였다. 즉 100메쉬 스텐 그물망에 비장을 올려 놓고 가볍게 문질러 조직을 분쇄한 후 인산염 배지(phosphate bufferes saline)로 세척하고 면역형광염색(immunofluorescence staining)을 시행하였으며 벡톤 디킨스(Becton Dikins)사의 팩스캔(FACScan)를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 시행, CD4⁺T임파구, CD8⁺T임파구 및 표면 Ig⁺임파구(B임파구)의 백분율을 구하였다. 그 결과 표1에 나타낸 바와 같이 영지버섯 균사 배양물로 부터 추출 분리한 고분자 성분이 CD₄ ⁺T임파구에 대한 B임파구의 상대 비율을 2.2에서 3.7로 무려 68%나 증가시킴으로써 항체생성 역할을 담당하는 B세포의 증식을 촉진하는 면역활성이 확인되었다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 의하면 기존의 배양 방법에서 보다 높은 수율로 수율로 영지버섯 균사체를 다량으로 배양할 수 있으며 이렇게 배양된 균사체를 추출하여 정제한 고분자 분획은 면역활성 효과가 매우 높으며 기호식품이나 기능식품(건강보조식품)에 첨가할 경우 면역증가효과등 우수한 생리활동을 기대할 수 있다.

Claims

포도당 2∼10%, 콘스팁리커 0.2∼5%, 폐효모추출액 0.1∼2.0%를 주요성분으로 함유하는 액체 배지를 배양하되 25∼30℃(최적온도는 27℃)에서 180rpm으로 진탕배양하여 활성화된 1차 종배양액을 얻은 다음 상기 1차 종배양액을 종배지에 접종하여 진탕배양하는 방법으로 수율이 증가된 영지버섯 균사 배양물을 90∼100℃에서 열탕 추출하여 얻은 추출물을 농축하고 에탄올에 침전시킨 후 침전물을 원심분리하고 물에 용해시켜 분자량 12000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 5일 정도 투석한 후 건조하므로써 다당체를 함유하는 면역활성물질을 얻음을 특징으로 하는 배양된 영지버섯 균사체로부터의 면역활성물질의 추출정제방법.