KR100706132B1

KR100706132B1 - 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물

Info

Publication number: KR100706132B1
Application number: KR1020040071445A
Authority: KR
Inventors: 한상욱; 홍남두; 유재국
Original assignee: 한상욱
Priority date: 2004-09-07
Filing date: 2004-09-07
Publication date: 2007-04-11
Also published as: KR20060022577A

Abstract

본 발명은 글루칸(glucan)을 생성하는 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 펠리누스 린테우스 균주의 배양 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 GLM(Glucose Monohydrate + Mannose), CSP(corn steep powder; 옥수수 침출 분말) 또는 CSL(corn steep liquor; 옥수수 침출액), 효모 추출물, 소이 펩톤(soy peptone), 맥아 추출물 및 증류수로 구성되는 펠리누스 린테우스 균사체(mycelium)의 배양을 위한 배지 조성물 및 고압멸균기를 이용하여 증기압에서 50 내지 60 분간 가열멸균하고 냉각한 배지에 상기 균주의 자실체의 조직 또는 포자를 한천배지에서 계대배양한 후, 상기 조성물로 이루어지는 배지에 접종하는 단계로 이루어지는 펠리누스 린테우스 균주의 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배지 조성물을 사용하면 우수한 약리 효과를 갖는 글루칸을 생성하는 펠리누스 린테우스 균사체의 배양 및 추출이 용이하고, 발효 수율과 배양시간의 단축으로 생산성이 우수할 뿐만 아니라 저렴한 비용으로 펠리누스 린테우스의 균사체를 얻을 수 있다.

글루칸, 액체배지, 펠리누스

Description

펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물{Composition for the culturing of Phellinus linteus mycelium}

본 발명은 특정 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 상기 조성물을 이용한 특정 균주의 배양방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 글루칸(glucan)을 생성하는 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 균주의 배양을 위한 배지 조성물 및 이를 이용한 펠리누스 린테우스 균주의 배양 방법에 관한 것이다.

오늘날 암의 치료에는 화학 요법, 방사선 요법 및 외과적 수술법 등 다양한 여러 방법이 시도되고 있으나, 치료의 범위가 제한되고 여러 가지 부작용이 발생하기 때문에 그 사용이 제한적이다. 이런 관점에서 직접적인 세포 독성을 갖는 기존의 치료 방법을 대체하거나 보완하여 환자의 암세포에 대한 면역기능을 증진시켜 인체에 무해하면서도 효율적으로 암을 치료하려는 시도가 있어왔다.

이중에서 담자균류가 생산하는 항암성 다당류들은 부작용이 적어 독성면에서 매우 안전하면서도 인체내 면역계의 기능을 강화시켜 탁월한 항암효과가 있는 것으 로 알려져 있다. 특히 담자균의 일종으로 민주름버섯(Aphllophorales)목에 속하는 버섯류의 많은 종류가 각종 질병, 특히 종양에 대한 치료 효과가 있다는 사실은 오래 전부터 알려져, 이들은 주로 한방약 또는 민간약으로 전승되어 왔다. 그 중 구멍장이 버섯(Polyporaceae)과의 진흙버섯(Phellinus)속에 속하는 펠리누스 린테우스는 한방에서 상황(桑黃)으로 불리우는 매우 희귀한 버섯으로, 오래된 뽕나무의 그루터기 등에 붙어 자라는 다년생의 단단한 목질버섯이다. 또한 상황은 잘라진 단면까지도 특징적인 진한 황색을 띠며 자실체(fruiting body) 상부에 나이테 모양의 무늬를 갖는다. 이러한 상황은 고대로부터 귀중한 한약재로 지한제(止汗劑) 또는 부인과 질환에 사용되어 왔으며, 1960년대에는 매우 강력한 항암활성을 갖는 것이 확인된 바 있다.

이중에서 펠리누스 린테우스 균주가 생산하는 다당류와 관련된 기존의 발명으로는 대한민국 특허공보 제 1992-2658호(한만우, 다당류및 그 제조방법)와 제 1995-29192호(유익동 등, 다당류 및 그 제조방법)가 보고되었다. 또한, 본 발명자들에 의해 국내에서 수집 분리한 상황버섯 중 항암면역 효과가 우수할 뿐만 아니라 미생물학적 특성이 기존의 균주와는 전혀 다른 새로운 펠리누스 린테우스 균주(KCTC 0399BP)로부터 신규 면역증강활성 다당류를 분리하여 그 성분이 글루칸이라는 것을 밝힌 바 있다(대한민국 특허공개 제1998-15617).

그러나, 상기 다당류를 포함하여 상황의 여러 물질이 종양의 치료에 큰 효과 가 있다는 사실을 인지하고 있었음에도 불구하고 자연계에 널리 분포하지 않는 희귀종이기 때문에 자실체의 입수가 어려울 뿐만 아니라 균사체(mycelium)의 분리 및 배양도 용이하지가 않아 적극적으로 활용되지 못하는 실정이다.

상황과 같은 희귀한 야생버섯에서 유효 약리성분을 공업적으로 생산하여 식품 또는 의약품으로 이용하기 위하여 두 가지 방법이 주로 사용되어 왔다. 즉, 자실체를 채집하거나 인공적으로 자실체를 재배하여 그 자실체를 재료로 이용하는 방법과, 자실체로부터 균사를 분리하고 그 균사체를 배양하여 배양 균사체로부터 유효성분을 추출하는 방법이다.

그러나, 야생 자실체를 채집하여 이용하는 방법은 자원의 고갈과 생태계 파괴라는 문제가 뒤따를 뿐 아니라 펠리누스 린테우스와 같은 희귀 담자균의 경우 필요량의 확보가 절대적으로 불가능하다. 또한 재배를 통하여 그 자실체를 얻는 방법 역시 재배하는데 특별한 시설과 많은 경비가 소요되며 일정기간 동안 밖에 생산할 수 밖에 없고, 특히 배양 기간도 3 내지 6개월이 걸리는 등, 많은 제약조건이 있어 바람직하지 못하다.

한편, 자실체로부터 균사체를 분리하여 배양하는 방법은 상기의 문제점을 일시에 해결할 수 있으나 이 역시 다음과 같은 기술상의 난제로 인하여 일반화되지 못하고 있는 실정이다. 즉 균사체를 순수하게 분리하는 것이 용이치 않으며, 세균 등에 비해 배양조건이 까다롭고, 또한 성장이 느리기 때문에 잡균의 오염 가능성이 높아 오염없이 발효조에서 배양할 수 있는 설비 및 배양조건을 확립하기가 매우 어렵다는 난점이 있다.

이와 관련하여 대한민국 특허출원 제1995-29192호는 펠리누스 린테우스 균주를 통상적인 배지, 예를 들어 효모 추출물, 펩톤 및 인산 제 2칼륨이 함유된 배지에서 배양하여 대량생산하였다고 기재하고 있다. 그러나 상기 발명은 액체배지에서 생산한 것으로 이러한 액체배지 내에서의 균사체 배양의 문제점은 다당체 이외에 버섯 자체가 갖는 다양한 2차 대사산물을 거의 생산하지 못하므로 2차 대사산물의 약리활성 성분을 기대하는 것이 불가능하다는 단점이 있다.

그러나 고형배지를 사용하는 경우 버섯자체가 갖는 다양한 2차 대사산물로서 약리활성 성분을 고농도로 함유한 자실체 및 균사체를 얻을 수 있으나, 이러한 본 발명의 사용균주인 펠리누스 린테우스 균주는 통상적인 고형배지인 펩톤배지, 페퍼배지, 마이어배지, 맥아추출물배지, 톱밥, 글루코오스를 함유하는 배지를 사용하는 방법(대한민국 특허공고 제1988-2475호, 제1983-1909호 등)에 의해서는 배양이 되지 않아, 현재까지 대량생산을 위한 인공배양에 성공하지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 연구하던 중, 미생물학적 특성이 기존의 펠리누스 린테우스와 다르고 국내에서 수집한 상황버섯 중 글루칸을 생성하여 항암효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있으나 아직 그 배양법이 확립되지 못한 펠리누스 린테우스 균주(KCTC 0399BP)를 이용하여 기존의 배지와는 그 조성을 달리하는 액체배지를 사용함으로, 종래의 액체배지에서 생산에 따른 균사체 배양의 문제점인 다당체 이외에 버섯 자체가 갖는 다양한 2차 대사산물을 거의 생산하지 못하므로 2차 대사산물의 약리활성 성분의 생산이 거의 불가능하다는 단점을 해소한 인공배양 방법을 확립하여, 대한민국 특허출원 제 2002-75631호 및 2003-86498호로 출원하였다.

상기 출원발명의 액체배지는 또한 우수한 약리 효과를 갖는 글루칸을 생성하는 펠리누스 린테우스 균사체의 배양 및 추출이 용이하고, 발효 수율과 배양시간의 단축됨을 보이는 장점이 있었다.

이에 본 발명자 등은 상기 본 발명자등의 선출원 발명에 대해 보다 유용한 효능을 갖는 배지조성에 대해 계속적인 연구를 수행한 결과 균사체의 배양에 더욱 양호한 조건의 배지를 밝혀 냄으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 글루칸을 생성하는 펠리누스 린테우스 균주의 배양을 위한 최적의 액체배지 조성물 및 이를 이용한 펠리누스 린테우스 균주의 배양 방법을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GLM(Glucose Monohydrate + Mannose), CSP(corn steep powder) 또는 CSL(corn steep liquor), 효모 추출물, 소이 펩톤(soy peptone), 맥아 추출물 및 증류수로 구성되는 펠리누스 린테우스 균사 체(mycelium)의 대량생산을 위한 액체배지 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물로 구성되는 액체배지를 이용한 펠리누스 린테우스 균사체를 배양하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 GLM(Glucose Monohydrate + Mannose), CSP(corn steep powder; 옥수수 침출 분말) 또는 CSL(corn steep liquor; 옥수수 침출액), 효모 추출물, 소이 펩톤(soy peptone), 맥아 추출물 및 증류수로 구성되는 펠리누스 린테우스 균사체(mycelium)의 대량생산을 위한 액체배지 조성물을 제공한다.

상기 GLM은 함수포도당(Glucose Monohydrate)에 일정량의 만노스(Mannose)가 부가된 것으로, 함수포도당 대 만노스의 바람직한 조성비율은 99.0 ~ 99.5 : 0.5 ~ 1.0이다.

상기 함수포도당 대 만노스의 조성비율을 벗어나면, 펠리누스 린테우스 균사체의 생장에 바람직하지 못하다.

본 발명에서 사용한 펠리누스 린테우스는 미생물 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자은행에 KCTC 0399BP호로 기탁된 균주로서, 다음과 같은 미생물학적 특징을 갖고 있다 (표 1).

펠리누스 린테우스 KCTC 0399BP 균주의 미생물학적 특징

구 분	특 징
자실체의 형태	·대 (stipe)가 없고 말굽모양의 목질로 되어 있음 ·갓은 반원형으로 편평하고 폭이 약 10 cm 정도이며, 표면은 암갈색이고 이면은 황갈색 내지 암갈색임 ·관공은 다층으로 형성됨
포자	·유구형 (類球形)이며 담황색임 ·크기는 약 5 ㎛임
강모체 (剛毛體)	·다수이며 후막형(厚膜形)임 ·크기는 20~40 x 8~12 ㎛임

본 발명에 있어서 펠리누스 린테우스 균주 배양용 조성물은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 이용하나 그 조성비율이 기존의 것과 현저히 다른 것이 특징적이다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 증류수 1 ℓ에 대하여 GLM 10~100g, CSP 10~50 g 또는 CSL 20~100 g, 효모 추출물 0.003~5 g, 소이 펩톤 0.0003~0.5 g 및 맥아 추출물 0.003~5 g을 첨가하여 이루어지는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 증류수 1 ℓ에 대하여 GLM 10~80g, CSP 10~30 g 또는 CSL 20~80 g, 효모 추출물 0.05~0.8 g, 소이 펩톤 0.005~0.08 g 및 맥아 추출물 0.05~0.8 g을 첨가하여 이루어진다.

본 발명의 배지의 주성분인 GLM은 상기한 바와 같이 함수포도당에 일정량의 만노스가 부가된 혼합물이고, CSP 또는 CSL은 옥수수에서 침출된 것으로서, 그 성분이 효율적인 탄소원으로 이용될 뿐만 아니라 풍부한 단백질을 함유하고 있어 유용한 질소원이기도 하다. 이때, CSL은 CSP에 대신 영양원으로 사용하는 경우 펠리누스 린테우스 최종 배양액의 고형물은 대략 30%(w/v) 정도이고, 단백질 함량은 대략 50% 정도이므로, CSP 대신에 CSL을 사용하는 경우 대략 2 내지 3배의 질량(w/v)을 사용하면 유사한 결과를 얻을 수 있다. 또한, CSP 또는 CSL에는 각종 당류, 유 기산, 비타민, 무기질 성분이 풍부하다.

그리고, 상기 균주의 배양을 위해서 GLM, CSP 또는 CSL로 공급하기 어려운 필수 아미노산, 무기염류, 비타민 등의 미량 영양소는 효모 추출물, 소이 펩톤 또는 맥아 추출물을 통하여 제공된다. 특히 상기 효모 추출물은 효모의 열수 추출물로서 아미노산과 비타민을 다량 함유하고 있고, 소이 펩톤은 콩의 효소 분해물로서 아미노산 및 펩티드를 다량함유하고 있으며, 맥아 추출물은 맥아를 발효시킨 뒤 열수 추출한 것으로 탄수화물이 풍부한 것이 특징이다. GLM과 CSP 또는 CSL을 배지의 주재로 함으로써 종래의 배지보다 약 20% 이상 높은 항암 및 면역활성을 보이는 글루칸의 수율이 가능한 펠리누스 린테우스 균사체를 얻을 수 있다.

상기 액체배지는 영양성분의 조성이 복잡한 천연배지의 한 종류로서, 화학조성이 명확한 합성배지에 비하여 계절이나 시기에 관계없이 상업적으로 공급이 용이하고, 저렴한 가격으로 배지를 조제할 수 있을 뿐만 아니라 pH의 조절, 침전물의 생성과 같은 배지 조제시에 주의하여야 할 사항이나 조제의 어려움이 거의 없어서 누구나 손쉽게 제조할 수 있는 장점이 있다. 아울러, 기타 배지나 합성배지에 비하여 균사체 및 글루칸의 수율이 뛰어나고, 천연배지의 단점인 수율이나 배양결과의 불안정성도 본 발명의 액체배지에서는 거의 발생하지 않으므로, 배양의 스케일-업(scale-up)도 용이할 뿐만 아니라 실험실 규모에서와 거의 일치되는 배양 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 액체배지를 이용하면 펠리누스 린테우스 균사체의 대량 배양이 용이하여, 글루칸을 높은 생산성으로 얻을 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 고압멸균기를 이용하여 증기압에서 50 내지 60 분간 가열멸균하고 냉각한 배지에 펠리누스 린테우스 균주의 자실체의 조직 또는 포자를 한천배지에서 계대배양한 후, 상기 계대배양물을 상기 액체배지에서 주배양하는 것을 특징으로 하는 펠리누스 린테우스 균주의 배양방법을 제공한다.

이때, 배양온도는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 보통 15 내지 35℃에서 배양하는 것이 바람직하며, 배양기간은 배지의 조성이나 배양온도에 따라 달라질 수 있으나, 10 내지 30일 정도 배양하는 것이 바람직하며, 10 내지 20일간 배양하는 것이 가장 바람직하다.

펠리누스 린테우스 균주를 계대배양하여 초기 배양물을 얻기 위해서는 한천배지를 사용하는데, PSA(potato sucrose agar)배지, PDA(potato dextrose agar)배지, MEA(malt extract agar)배지, QEA(quercus extract agar)배지, PEA(poplar extract agar)배지, RBEA(rice bran extract agar)배지, WBEA(wheat bran extract agar)배지, MCM(mushroom complete medium)배지, CDA(Czapedox agar)배지, SCA(Spawn complex agar)배지, OMA(oatmeal agar)배지 등이 이용될 수 있으며, 특히 MCM 배지에서 우수한 생장능을 보인다.

펠리누스 린테우스 균주의 액체배양 과정을 살펴보면 다음과 같다.

우선, 펠리누스 린테우스 균주의 액체배양을 위하여, 균주의 자실체의 조직 또는 포자를 감자, 맥아 추출물, 뽕나무 톱밥(Quercus sawdust), 포플러 톱밥(Poplar sawdust), 쌀겨, 밀겨 및 오트밀 등을 주성분으로 하는 한천배지에 이식하여 15~35 ℃에서 수주간 배양한다. 이 배양조작을 2~3회 반복하여 계대배양하고, 잡균의 혼입이 없는 것을 확인한 후, 이를 상기와 같이 제조된 액체배지에 옮겨 온도 15~35 ℃에서 5~20 일간 배양한다.

이때, CSP의 주요 성분은 접종한 상황 균사체에 의해 그 성분이 대부분 분해 흡수되어 상황 균사체로 전환되며, 충분한 기간 동안 완숙되는 과정에서 상황의 고유하고 다양한 성분들이 생성됨으로써 상황의 고유한 진한 황색을 그대로 지닌 균사체가 생성된다. 따라서 이들 균사체를 활용하여 유효성분을 추출하면 일반 액체배양과 다를 뿐만 아니라 통상의 고체배양과 유사하거나 그 이상되는 수율로 펠리누스 린테우스 균사체 자체의 유효한 글루칸의 약리성분을 다량 획득할 수 있다. 구체적으로, 상기와 같이 액체배양된 균사체에 적당량의 물을 가하여 열탕추출하고 원심분리기로 여과한 다음, 추출액을 에탄올 침전, 투석 등의 과정을 거쳐 글루칸을 함유하는 고분자 추출물을 얻는다. 얻은 추출물을 실험동물세포에 가하여 세포를 배양함으로써 실험동물의 항암활성의 측정한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 한천배지의 제조

감자, 맥아 추출물, 뽕나무 톱밥(Quercus sawdust), 포플러 톱밥(Poplar sawdust), 쌀겨, 밀겨 또는 오트밀 등을 주성분으로 하는 다양한 한천 배지를 제조하였다(표 2 참고).

한천배지의 조성

배지	조성 ( g/l )
PSA 배지 (Potato sucrose agar)	감자 200, 서당 20, 한천 20
PDA 배지 (Potato dextrose agar)	감자 200, 덱스트로스 20, 한천 20
MEA 배지 (Malt extract agar)	맥아 추출물 20, 덱스트로스 20, 펩톤 1, MgSO₄·7H₂O 0.5, 한천 20
QEA 배지 (Quercus extract agar)	퀘르쿠스(Quercus) 톱밥 100, 덱스트로스 20, 한천 20
PEA 배지 (Poplar extract agar)	포플라 톱밥 100, 덱스트로스 20, 한천 20
RBEA 배지 (Rice bran extract agar)	쌀겨 30, 한천 20
WBEA 배지 (wheat bran extract agar)	밀겨 30, 한천 20
MCM 배지 (Mushroom complete medium)	덱스트로스 20, 펩톤 2, 효모 추출물 2, MgSO₄·7H₂O 0.5, KH₂PO₄ 0.46, 한천 20
CDA 배지 (Czapedox agar)	덱스트로스 20, MgSO₄·7H₂O 0.5, KH₂PO₄ 1, 한천 20
SCA 배지 (Spawn complex agar)	퀘르쿠스(Quercus) 60, 포플라 톱밥 60, 쌀겨 20, 한천 20
OMA 배지 (Oatmeal agar)	오트밀 30, 한천 20

<실시예 2 ~ 실시예 17> 액체배지의 제조

GLM, CSP, 효모 추출물, 소이 펩톤, 맥아 추출물 및 증류수로 구성되는 액체배지를 제조하였다. 좀 더 상세하게는, 증류수 1 ℓ에 대하여 GLM, CSP, 효모 추 출물, 소이 펩톤 및 맥아 추출물의 질량을 하기 표 3에 기재된 바와 같이 혼합하는 것을 기본 배지 조성비로하여 제조하였다.

	배지의 조성(증류수 1 ℓ기준)
	GLM (g)	CSP (g)	효모 추출물 (g)	소이 펩톤 (g)	맥아 추출물 (g)
실시예 2	80	15	0.1	0.01	0.1
실시예 3	70	15	0.003	0.0003	0.003
실시예 4	60	15	5	0.5	5
실시예 5	50	15	0.8	0.08	0.8
실시예 6	40	15	0.05	0.005	0.05
실시예 7	30	15	0.1	0.01	無
실시예 8	20	15	0.1	無	0.1
실시예 9	10	15	無	0.01	0.1
실시예 10	80	20	0.1	0.01	0.1
실시예 11	70	20	0.003	0.0003	0.003
실시예 12	60	20	5	0.5	5
실시예 13	50	20	0.8	0.08	0.8
실시예 14	40	20	0.05	0.005	0.05
실시예 15	30	20	0.1	0.01	無
실시예 16	20	20	0.1	無	0.1
실시예 17	10	20	無	0.01	0.1

<실시예 18 ~ 실시예 24> 액체배지의 제조

증류수 1 ℓ에 대하여 GLM과 CSP를 일정량으로 하고 효모 추출물, 소이 펩톤 및 맥아 추출물의 질량을 하기 표 4에 기재된 바와 같이 혼합하는 것을 기본 배지 조성비로하여 제조하였다.

	배지의 조성(증류수 1 ℓ기준)
	GLM (g)	CSP (g)	효모 추출물 (g)	소이 펩톤 (g)	맥아 추출물 (g)
실시예 18	80	20	0.003	0.0003	0.003
실시예 19	80	20	5	0.5	5
실시예 20	80	20	0.8	0.08	0.8
실시예 21	80	20	0.05	0.005	0.05
실시예 22	80	20	0.1	0.01	無
실시예 23	80	20	0.1	無	0.1
실시예 24	80	20	無	0.01	0.1

<실시예 25> 펠리누스 린테우스 균주의 배양

펠리누스 린테우스 균주(KCTC 0399BP)의 자실체의 조직 또는 포자를 실시예 1의 방법에 따라 제조된 한천배지에 이식하여 15~35℃에서 20일간 배양하였다. 상기와 같은 배양 과정을 3회 반복한 후, 잡균의 혼입이 없는 것을 확인한 다음 상기 균사체를 실시예 2 내지 실시예 24의 액체배지에 옮겨 15~35℃에서 8일간 배양하였고, 배양 종료 후 균사의 밀도 및 균사체의 질량을 측정 및 평가하여 그 결과를 하기의 표 5에 기재하였다(4번의 실험의 평균)

	균사의 밀도	균사체의 질량(8일 배양 후)
실시예 2	높음	21 ±0.5 g
실시예 3	매우 높음	18 ±1.0 g
실시예 4	높음	21.0 ±1.0 g
실시예 5	매우 높음	20.0 ±0.8 g
실시예 6	매우 높음	20.0 ±0.7 g
실시예 7	약간 높음	9 ±0.7 g
실시예 8	높음	12.0 ±1.0 g
실시예 9	약간높음	7.5 ±0.5 g
실시예 10	매우 높음	22.0 ±0.5 g
실시예 11	높음	19.0 ±1.0 g
실시예 12	매우 높음	21.0 ±1.0 g
실시예 13	매우 높음	22.0 ±0.8 g
실시예 14	매우 높음	20.5 ±0.7 g
실시예 15	매우 낮음	9.5 ±0.5 g
실시예 16	낮음	12.0 ±0.5 g
실시예 17	매우 낮음	7.5 ±0.5 g
실시예 18	높음	20.0 ±0.5 g
실시예 19	높음	23.0 ±0.5 g
실시예 20	매우 높음	22.0 ±0.5 g
실시예 21	매우 높음	21.5 ±0.5 g
실시예 22	매우 낮음	9.5 ±0.5 g
실시예 23	낮음	12.5 ±0.5 g
실시예 24	매우 낮음	9.5 ±0.5 g

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, GLM과 CSP를 주재로 하여, 미량의 효모 추출물, 소이 펩톤 및 맥아 추출물이 보충된 경우에 다양한 농도에서 균사체의 성 장 및 균사 밀도가 비교적 높음을 알 수 있고, 이들 보충영양물중 어느 하나가 결손된 경우에는 펠리누스 린테우스 균주(KCTC 0399BP)의 성장이 급격히 낮아지는 것을 알 수 있다.

<실시예 26> CSP에 대한 CSL을 이용한 펠리누스 린테우스 균주의 배양

CSP 대신에 CSL을 사용한 경우, 버섯의 균체량에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 다양하게 시판 중인 제품(대상, 두산 및 신동방)을 구입하여 비교실험 하였다. 이때, 나머지 조성물의 양은 실시예 10과 동일하도록 조성하였다. 비교실험은 상기 배양과 달리 속성 배양을 위하여, 29 ±0.5℃의 배양 온도, 1.0 vvm의 공기 공급량, 200 rpm의 교반속도, 주 배양액의 6.6%의 종균 배양액을 접종하여 48시간 동안 배양하여 이루어졌다.

	총 고형량 비교		단백질 함량 비교
	사용량(g)	균사체 건조중량(g)	사용량(g)	균사체의 단백질 질량(g)
CSP	20	19.5(기준값)	20	10.5(기준값)
CSL(대상)	49	16.44(84.3%)	29	8.31(79.1%)
CSL(두산)	40	11.39(58.4%)	20	7.41(70.7%)
CSL(신동방)	51	16.75(85.9%)	44.5	8.59(81.8%)

주: 상기 비교실험은 두 번 반복하여 평균값을 낸것임.

그 결과, CSL은 동일한 질량으로 환산하였을 때, 균체 질량에 있어서 CSP에 비하여 30 내지 40%의 균사체 생성량으로 비교적 균일한 결과를 나타내었다. 반 면, 단백질 질량에 있어서는 CSL은 동일한 질량의 CSP에 대하여 40 내지 70%의 생성량을 나타내어 균사체 질량과 비교할 때, 커다란 비교차를 나타내었다.

또한, 상기와 같이 본 발명의 배지 조성물에서 배양된 펠리누스 린테우스 KCTC 0399BP의 균사체로부터 배양의 목적 산물인 갈락코만노글루칸의 함유량과 그 약리 효과를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

<실험예 1> 글루칸의 추출

상기의 실시예 25로부터 얻어진 펠리누스 린테우스 KCTC 0399BP 균사체를 다음과 같은 방법으로 추출하였다. 즉, 균사체 100 g을 90~100℃에서 500 ㎖씩의 증류수에 넣고 2시간씩 열탕 추출한 후 균사체 케익은 제거하고 열수 추출물만을 회수하였다. 이 열수 추출물을 진공농축하여 100 ㎖로 만든 후 4배 부피의 95% 에탄올을 가하여 하룻밤 정치한 다음 3,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 이와 같이 하여 얻어진 추출물은 다시 100 ㎖의 물에 녹여서 분자량 3,000 이하의 물질을 투석할 수 있는 투석막을 이용하여 약 3일간 투석한 후 -70℃에서 동결건조하여 글루칸을 함유하는 고분자 추출물 3 g 가량을 얻었다.

<실험예 2> 추출한 글루칸의 항암 효과

본 발명자들은 상기 실험예 1로부터 추출된 글루칸의 생체내 및 시험관 내에서의 항암 면역 활성을 알아보았다. 구체적으로, 실험동물로는 특정 병원체 부재(specific pathogen free) BDF1 마우스(한국생명공학연구원; 수컷, 23-28 g)를 이용하였고, 육종-180 세포(sarcoma-180 cell)를 인산완충액에 5X10⁶ 세포/㎖의 농도로 만든 후, 상기 마우스의 복강에 0.2 ㎖(1X10⁶ 세포)를 이식함과 동시에 3주 동안 글루칸을 10 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏으로 투여하여 35일 동안 생쥐의 생존을 관찰하였다.

그 결과, 글루칸을 처리하지 않은 대조군은 평균 19일 동안 생존하였으나, 암세포주의 이식과 동시에 글루칸을 처리한 군은 약 25일 동안 생존하였다(표 7). 상기 결과로부터, 글루칸이 항암효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

그룹	투여량(㎎/㎏)	생쥐 수	평균 생존 기간(일)	ILS(%)
대조군	-	10	19.1±0.81	-
글루칸	10	10	24.7±1.48	39.2
글루칸	30	10	24.8±2.34	29.4

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 액체배지 조성물 및 배양방법을 사용하면 우수한 약리 효과를 갖는 글루칸을 생성하는 펠리누스 린테우스 균사체의 배양 및 추출이 기존의 액체배지나 통상의 고형배지보다 용이하고, 높은 발효 수율과 배양시간의 단축으로 생산성이 우수할 뿐만 아니라 저렴한 비용으로 펠리누스 린테 우스의 균사체를 대량으로 얻을 수 있다.

Claims

GLM(Glucose Monohydrate + Mannose), CSP(corn steep powder) 또는 CSL(corn steep liguid), 효모 추출물, 소이 펩톤, 맥아 추출물 및 증류수로 구성되며, 상기 GLM은 함수포도당(Glucose Monohydrate)에 일정량의 만노스(Mannose)가 부가된 것으로 함수포도당 대 만노스의 조성비율은 99.0 ~ 99.5 : 0.5 ~ 1.0임을 특징으로 하는 펠리누스 린테우스 균사체의 배양용 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 펠리누스 린테우스는 펠리누스 린테우스(수탁번호: KCTC 0399BP)인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 증류수 1 ℓ에 대하여 GLM 10~100g, CSP 10~50 g 또는 CSL 20~100 g, 효모 추출물 0.003~5 g, 소이 펩톤 0.0003~0.5 g 및 맥아 추출물 0.003~5 g을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 조성물은 증류수 1 ℓ에 대하여 GLM 10~80g, CSP 10~30 g 또는 CSL 20~80 g, 효모 추출물 0.05~0.8 g, 소이 펩톤 0.005~0.08 g 및 맥아 추출물 0.05~0.8 g을 첨가하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
고압멸균기를 이용하여 증기압에서 50 내지 60 분간 가열멸균하고 냉각한 배지에 펠리누스 린테우스 균주의 자실체의 조직 또는 포자를 한천배지에서 계대배양한 후, 상기 균주의 계대배양물을 제 4항 또는 제 5항의 조성물로 이루어진 액체배지에서 주배양하는 것을 특징으로 하는 펠리누스 린테우스 균주의 배양방법.
제 6항에 있어서, 한천배지 및 액체배지의 배양 온도는 15 내지 35℃인 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 7항에 있어서, 배양기간은 5 내지 20일인 것을 특징으로 하는 배양방법.