KR101069686B1 - 항암 및 면역 활성을 갖는 다당류를 생산하는 신규한 펠리누스 균주 - Google Patents
항암 및 면역 활성을 갖는 다당류를 생산하는 신규한 펠리누스 균주 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 펠리누스 속(Phellinus sp.) KACC93057P 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 균주로부터 분리된 면역 항암 활성 다당류, 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 또는 항암 활성 증강용 약학 조성물, 상기 균사체 추출물을 포함하는 건강기능식품용 조성물 및 상기 균주로부터 면역 항암 활성 다당류를 생산하는 방법에 관한 것이다.
펠리누스, 펠리누스 린테우스, 펠리누스 바우미, 상황버섯, 다당류, 항암, 면역 활성
Description
본 발명은 신규한 펠리누스 속 (Phellinus sp.) KACC93057P 균주에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 균주로부터 분리된 면역 항암 활성 다당류, 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 또는 항암 활성 증강용 약학 조성물, 상기 균사체 추출물을 포함하는 건강기능식품용 조성물 및 상기 균주로부터 면역 항암 활성 다당류를 생산하는 방법에 관한 것이다.
식품 및 천연식물 자원의 생리활성물질에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는 가운데 그 중에서도 버섯류에 대한 생리활성 연구가 많이 보고되고 있다. 버섯류는 항암효과, 항변이원성 효과, 항콜레스테롤성 효과 등 여러 가지 생리활성 기능을 나타내기 때문에 암 및 기타 성인병에 대한 예방 및 개선 효과가 기대되는 좋은 재료라 할 수 있다.
현재 지구상에는 약 15,000여종의 버섯이 자생하고 있는데, 독성이 있는 것을 제외하면 대부분 식용으로 사용이 가능하다. 버섯류는 생물의 분류 체계상 담자균류에 속하는 미생물로 오래 전부터 식용으로 사용되어 왔으며, 각종 질병에 대한 민간전통 약재로 전래되어 왔다. 또한 버섯류는 다당류인 글루칸(glucan) 및 그 유도체를 다량 함유하고 있으며, 글루칸과 같은 다당류는 항암작용이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 버섯은 대부분 식용으로 사용되고 있어서, 부작용이 적고 독성면에서도 안전할 뿐만 아니라 인체 면역계 기능을 강화시키고 항암효과가 탁월한 것으로 알려져 있다. 이와 같이 인체에 유용한 버섯류 중 특히 상황버섯의 효능이 주목받게 된 것은 인체의 면역력을 높이는 역할을 하는 다당류 베타글루칸(β-glucan)이 밝혀졌기 때문이다.
상황버섯은 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라고도 한다. 갓은 지름 6～12cm, 두께 2～10cm로, 반원 모양, 편평한 모양, 둥근 산 모양, 말굽 모양 등 여러 가지 모양을 하고 있으며, 표면에는 어두운 갈색털이 짧고 촘촘하게 나 있다가 자라면서 없어지고 각피화한다. 검은빛을 띤 갈색의 고리 홈이 나 있으며 가로와 세로로 등이 갈라지고, 가장자리는 선명한 노란색이고 아랫면과 살은 황갈색이다. 자루가 없고 포자는 연한 황갈색으로 공 모양이다. 야생버섯은 3 ~ 4년간 계속 성장하며 모양은 초기에는 노란 진흙덩이가 뭉친 것 같은 형태를 유지하다가 다 자란 후의 모습은 나무 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 버섯의 외부 표면은 단단한 목질 조각으로 동심상의 뚜 렷한 환구와 종횡으로 갈라진 직사각형의 균혈 형태를 이루고 있으며 갓 주변부와 밑 부분의 관공은 처음에는 선황색이나 곧 황갈색으로 되며 불명확한 여러층으로 되어 있다. 또한 상황버섯은 현대의 임파선 질환과 유방암 계통의 질환에 쓰였다는 기록이 있으며, 신농본초경(神農本草經)과 본초강목, 봉황록에도 다양한 질환, 특히 소화기계질환에 쓰였다는 기록이 있다. 이와 같이 상황버섯은 항암 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며, 귀중한 약재로서 국내에서는 대량으로 재배하고 있다. 약용하기 위해 달이면 노란색이거나 연한 노란색으로 맑게 나타나며, 맛과 향이 없는 것이 특징이다.
최근에는 이러한 상황버섯을 비롯한 이들 버섯 균사체 추출물의 항종양작용, 면역조절 효과 및 임상실험에 의한 안전성이 입증 됨에 따라 각종 산업적 응용연구가 활발히 진행되기에 이르렀다(Bae et al, 한국균학회지. 24(2);142-148; 김, 1994 충남대학교 석사 학위 논문).
그러나 이와 같은 장점에도 불구하고 상황버섯은 자연계에서의 번식이 용이하지 않고, 자실체의 인공재배가 어렵기 때문에, 이에 대한 대체 연구로 상황버섯 자실체와 유사한 약리작용을 갖고 있는 상황버섯 균사체의 액체 배양에 관한 연구에 관심이 모아지고 있다. 그 동안 상황버섯 균사체의 액체배양에 관한 연구로는 펠리누스 아비에티스(Phellinus abietis) 균사체의 배양액으로부터 α-만노시다제(α-mannosidase)와 만난아제(mannanase)의 분리 및 이들의 특성에 관한 연구(Zouchova, 등, Folia Microbiol. 22: 98-105)를 비롯하여, 펠리누스 린테우스 균사체 추출물의 항암성분 및 면역 활성에 관한 연구보고(Kim, 1991. 충남대학교 석사 학위 논문: Kim, 1994. 충남대학교 석사 학위 논문) 및 균사체 생육에 대한 배지조성의 검토 연구(Ji et al, 1996. 한국균학회지. 24(3): 214-222)등이 있다. 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)의 자실체 열수 추출물은 혈액 순환, 위 기능 강화 및 소화 촉진, 빈혈 방지 및 해열 등 많은 생리적 효과를 가지고 있으며 장기간 복용하여도 부작용이 거의 없으므로(Jong 등, 1991. J. Immunopharmacol 11: 115-122) 건강식품이나 의약품 소재로 크게 주목 받고 있다.
최근에는 균사체 배양방법이 확립되어 배양물을 이용한 많은 연구가 진행 중이며, 펠리누스 속의 균사체 배양물로부터 분리된 성분으로는 숙신 산(succinic acid), p-하이드록시패닐 아세트 산(p-hydroxyphenyl acetic acid)의 메틸 에스테르(methyl ester), p-하이드록시벤잘디하이드(p-hydroxybenzaldehyde), 2,5-디하이드록실-메틸퓨란(2,5-dihydroxyl-methylfuran), 2-하이드록시메틸-5-메톡실퓨란(2-hydroxymethyl-5-methoxymethylfuran) 및 N-아세틸아민(N-acetylamine)이 보고 되었다 (Song et al. 1994, Hakhoeji 37: 100-104). 그 밖에 펠리누스 속(Phellinus sp.)의 성분으로는 다당류가 대표적이며 그 외 세라마이드(ceramide)와 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 트리터팬(triterpene), 스테롤(sterol) 등이 보고된 바 있다(Song et al.,1995 Chem. Pharm.Bull. 43,2105-2108). 이와 같이 펠리누스 속으로부터 분리되는 성분은 다양한 질환에 탁월한 효능을 나타내나, 상기 서술한 바와 같이 기존에 알려진 종들은 대부분 자실체 생산이 어렵고 성장이 느려 산업화 가공 에 난점이 존재해 왔다. 따라서 산업적 생산이 가능함과 동시에 보다 높은 항암 및 면역 활성을 갖는 신규 균주를 찾고자 현재까지도 많은 연구가 진행되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 상황버섯 유사종에 대한 분자생물학적인 분리 동정을 하여 신규한 펠리누스 속 균주를 동정하는 한편, 상기 균사체로부터 추출한 항암 및 면역 증강 물질을 확인하고자 예의 노력한 결과, 신규한 펠리누스 속으로부터 빠른 생장률 및 높은 항암 활성 및 면역 증강 활성을 갖는 다당류를 분리할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역 항암 활성 물질을 생산하는 신규한 펠리누스 속(Phellinus sp.) KACC93057P 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주로부터 분리된 면역 항암 활성 다당류를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 항암 활성 증강용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 건강기능식품용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, a) 여과 살균한 맥아 추출물, 글루코오스 및 효모 추출액을 포함하는 멸균 배지에 균주를 접종하는 단계; b) 상기 균주를 20℃ 내지 30℃에서 배양하는 단계; c) 배양된 균주를 마쇄하는 단계; 및 d) 마쇄된 균주 를 여과 및 추출하는 단계를 포함하는 KACC93057P 균주로부터 면역 항암 활성 다당류를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 면역 항암 활성 물질을 생산하는 펠리누스 속(Phellinus sp.) KACC93057P 균주에 관한 것이다.
본 발명의 용어 '펠리누스 (Phellinus sp.)'란 소나무비늘버섯 과 (Hymenochaetaceae family) 펠리누스 속 (Phellinus)에 속하는 종으로서, 백색부후균으로, 줄기가 없고 주로 다년생의 자실체를 갖고 있으며, 균모(Pileus)는 편평하거나 말굽형인 버섯류를 말한다. 본 발명의 기탁번호 KACC93057P인 펠리누스 속 균주는 안성의 수목 그루터기에서 채집한 균주로서, 기존에 알려진 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus) 및 펠리누스 바우미(Phellinus baumii)와 형태적, 생리학적 특성이 상이한 바, 기존의 펠리누스 속과는 다른 신규한 펠리누스(Phellinus) 속의 균주로 정의하고 이를 2007년 06월 08일에 농업생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KACC93057P를 부여받았다.
보다 상세하게 본 발명의 균주, KACC93057P가 펠리누스 속의 다른 균주, 펠리누스 린테우스 또는 펠리누스 바우미와 다른 균주로 구분될 수 있는지 형태학적으로 비교 검토하기 위하여, 본 발명의 KACC93057P 균주와 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미 균사체 절편을 배양하여 균사성장, 균사체의 색깔 및 균사체의 형 태를 관찰하였다. 그 결과, KACC93057P는 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미에 비하여 빠른 생장력을 보였다. 또한 균사체의 색깔 및 형태에 있어서 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미는 균사 중심부위에서 옅은 노란색을 띠고 가장자리는 흰 균사가 실 모양으로 뻗어있는 형태를 나타내는 반면, 본 발명의 KACC93057P는 균사 전체에 있어 진 노란색을 띠고, 기 균사가 결집하여 솜모양으로 배지 전체에 형성되는 양상을 나타내었다(도 5).
또한 유전학적으로 다른 공지의 펠리누스 속과 구분되는지 분석하기 위하여 rDNA ITS (rDNA Inter Transcribed Space) 간의 유사성을 분석한 결과 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미와는 94.8% 정도의 염기서열 상동성이 나타났으나, 다른 속과는 90% 이하의 낮은 상동성을 보였으며, RFLP (restrectionn fragment length polymorphism) 패턴에서 전혀 상이한 밴드 패턴을 나타내었다. 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미 간의 상기 서열의 유사성은 98% 이상을 보이나 이들을 다른 종으로 분류하고 있다는 사실로 미루어 볼 때, 본 발명의 균주는 공지의 펠리누스 속 균주와는 구분되는 신규 종 또는 신규 펠리누스 속 균주로 정의될 수 있을 것이다.
다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 균주로부터 분리된 면역 항암 활성 다당류에 관한 것이다.
본 발명에서의 용어, '면역 항암 활성'이란 체내의 면역 시스템을 작동 시킬 수 있는 능력 또는 암 세포의 발생, 성장, 전이 등을 억제할 수 있는 모든 활성을 의미하며, 바람직하게 면역 시스템의 작동이란 비장 내 면역 세포를 증가시켜 외부 항원에 대한 면역력을 증강시키는 행위 및 항체 형성능을 의미하고, 암 세포의 발생, 성장, 전이 억제 활성은 암 세포의 생장을 예방하거나 억제하는 모든 행위를 포함하며, 특히 암 세포의 사멸을 촉진하는 행위를 의미한다. 본 발명의 KACC93057P 균주는 이러한 면역 활성 및 항암 활성을 나타내는 다당류를 생산할 수 있는 균주이다.
본 발명에서의 용어, '다당류'란, 본 발명의 펠리누스 속 KACC93057P 균주가 함유하고 있는 성분으로서, 다당류의 주요 성분은 당류와 단백질로 구성되어 있다. 그 중 당류는 글루코스, 만노스 및 갈락토오스 등을 포함하고, 단백질은 발린, 알라닌, 글리신 등 15종의 아미노산을 포함한다. 본 발명자들은 본 발명의 KACC93057P 균사체 추출물이 포함하고 있는 다당류는 면역 항암 활성의 주요 성분으로서 높은 항체 형성률을 나타낼 뿐만 아니라 암 세포를 사멸시키는 효과를 가져옴을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 '균사체 추출물'이란 본 발명의 KACC93057P 균주로부터 수득한 추출물로서, 상기 다당류가 포함되어 있는 면역 항암 활성을 가지는 추출물을 의미한다.
본 발명에서의 용어, '면역 활성 증강'이란, 생체의 내부 환경이 외부 인자 인 항원에 대하여 방어하는 현상이 증가하거나 강화되는 것을 말하며, 상기 언급한 바와 같이 체내 대식 세포의 활성, B 세포를 비롯한 체내 면역 반응에 관여하는 세포수의 증가, 항체 생산량 증가 등을 포함하는 모든 체내 방어 현상의 강화를 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 면역활성물질을 분비한다고 알려진 LPS 및 공지의 균체, 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미와 비교하여 본 발명의 KACC93057P 균주의 면역활성능을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 KACC93057P 균주에 의한 항체 형성 세포수 증가는, 항체 형성 세포수를 가장 많이 증가시킨 LPS와 유사하게 나타났으며, 이는 펠리누스 린테우스 또는 펠리누스 바우미 보다 현저하게 높은 수치였다(도 7).
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 균주의 균사체 추출물을 포함하는 항암 활성 증강용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 균사체 추출물은 항암 활성을 가진 조성물 자체로서 직접적으로 사용 가능함은 물론, 항암 보조제로서 사용할 수도 있다.
본 발명에서의 용어, '항암'이란, 암세포의 증식을 억제하거나 암세포를 죽이는 것을 의미하며, 이러한 항암 활성을 나타낼 수 있는 암의 종류로는 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 자궁암 등이 존재하나 상기 예들에 의해 본 발명의 항암 활성 대상이 되는 암의 종류가 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명의 KACC93057P의 균사체 추출물은 자궁암 세포를 사멸시킬 수 있는 항암 활성을 가진다. 본 발명 의 바람직한 실시예에서는 본 발명의 KACC93057P 균주의 균사체 추출물을 자궁암 세포주인 HeLa 세포에 처리한 결과, 자궁암 세포가 사멸하였고, 이러한 세포 사멸 활성은 기존에 알려진 펠리누스 린테우스 또는 펠리누스 바우미 보다 더 높은 수준이었다 (도 8).
본 발명에 따른 균사체 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양의 균사체 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 유효한 양'이란, 면역 관련 질환 또는 암을 예방 또는 치료하기에 충분한 추출물의 양을 말한다.
상기 '약학적으로 허용되는'이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명에 따른 KACC93057P 균사체 추출물은 필요에 따라 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.
상기 균사체 추출물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캅셀제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 균사체 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제로는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 본 발명의 펠리누스 균주인 KACC93057P의 균사체 추출물을 포함하는 건강기능식품용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, '건강기능식품'이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등 의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.
본 발명의 KACC93057P 균사체 추출물을 건강기능식품으로의 사용하는 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 함께 사용될 수 있고, 이는 필요에 따라 선택되어 적절하게 사용될 수 있다. 또한 첨가되는 KACC93057P 균사체 추출물의 혼합량은 그 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 목적)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 균사체 추출물은 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 특정 범위로의 제한 없이 적절한 양으로 사용될 수 있음은 자명하다.
또한 본 발명의 균사체 추출물이 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주 성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
아울러 본 발명의 균사체 추출물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합되어 제조될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 a) 여과 살균한 맥아 추출물, 글루코오스 및 효모 추출액을 포함하는 멸균 배지에 균주를 접종하는 단계; b) 상기 균주를 20℃ 내지 30℃에서 배양하는 단계; c) 배양된 균주를 마쇄하는 단계; 및 d) 마쇄된 균주를 여과 및 추출하는 단계를 포함하는 KACC93057P 균주로 부터 면역 항암 활성 다당류를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 KACC93057P 균주로부터 항암 면역 활성을 갖는 다당류를 추출하는 방법에 있어서, 각 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 당업자에 의해 적절한 접종, 배양, 여과 및 추출 방법이 사용될 수 있다. 다만, 보다 적절한 배양 조건으로 균주를 대량으로 생산하는 한편, 효율적으로 활성 다당류를 추출하기 위해서는 적절한 조성을 가진 배양 배지에서 최적의 조건으로 배양함으로써 높은 수득률을 얻을 수 있다. 바람직하게 본 발명의 균주를 배양하기 위한 배지는 맥아 추출물, 글루코오스 및 효모 추출액을 포함하는 배지이며, 이를 20 내지 30℃에서 배양하고, 배양된 균주를 마쇄하여 여과 및 추출하는 경우, 보다 높은 면역 항암 활성 다당류를 추출할 수 있게 된다. 더욱 바람직하게 상기 배지 조성은 맥아 추출물 1%, 글루코오스 0.4% 및 효모 추출액 0.4%일 수 있으며, 배양 온도는 23℃ 내지 27℃에서 20일간 배양할 수 있고, 상기 배양으로 부터 수득되는 경우 더 높은 수율로 다당류를 수득할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 방법으로 수득된 추출물을 증발기 (evaporator)로 농축한 후, 농축물에 에탄올을 첨가한 뒤 에탄올 침전물을 수거하여 건조된 수득물을 사용하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 KACC93057P 균주는 기존 균주보다 2배 이상의 균사체 성장률을 나타내는 바, 다량의 균사체 확보가 가능할 뿐만 아니라 기존의 균사체 추출물보다 면역 활성 및 항암 활성이 높으므로, 본 발명의 KACC93057P 균주를 이용하는 경우, 우수한 약리 활성을 갖는 물질을 대량 생산할 수 있다.
실시예 1. ITS(Inter transscribed space) rDNA 분석에 의한 KACC93057P의 유전학적 동정
KACC93057P 균주 배양은 PDA(potato dextroses agare)에서 14일간 배양하여 균총의 가장자리에서 균사절편을 분리하고 5 ㎖의 YGM Broth (1% 맥아 추출물, 0.4 % 글루코오스, 0.4 % 효모 추출액 브로스(broth)) 시험관에 접종하고 10일 동안 배양 하였다. 배양이 완료된 균사체를 여과지에 걸러낸 다음 배양 여과액을 씻어 낸 뒤 동결건조 하였다. 동결 건조한 균사체를 이쑤시게로 곱게 마쇄한 다음, 100 ㎍정도를 1.5 ㎖의 테스트 튜브(test tube)에 옮기고 추출용 완충액(200 mM Tris-HCl, pH 8.0; 200 mM NaCl; 25mM EDTA; 0.5% SDS) 400 ㎕와 단백분해효소 K(Proteinase K (20mg/㎖))를 첨가하여 유리봉으로 버퍼(buffer)상에서 잘 석어 준 다음 37℃ 에서 1시간 동안 항온하였다. 이 혼합액에 2 × CTAB 버퍼를 동량첨가 하여 65℃에서 15분간 방치하고 클로로포름(chloroform) 이소아밀알콜(isoamylalcohol)을 24:1로 넣고 철저히 혼합한 후 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브에 옮긴 후 0.7 볼륨의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하고 실온에서 10분간 방치한 다음 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 DNA를 침전하였다. 70%의 에탄올(ethanol)로 DNA 침전물을 세척하여 진공 건조한 후 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 100 ㎕에 용해하였다. 10 mg/㎖ RNase 2㎕을 넣어 37 ℃에서 30분간 처리하여 그 용액속에 함유된 RNA를 제거 한 뒤 주형 DNA로 사용 하였다.
KACC93057P의 유전체 DNA로부터 rDNA ITS 영역을 분리하기 위하여 사용된 프라이머는 이미 곰팡이 ITS rDNA 영역을 PCR로 증폭할 수 있게 개발된 ITS 1(5'-TCCGTAGGTGAACCTCGGC-3')과 ITS 4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 사용하였다. PCR 증폭을 위하여 PCR 반응 용액은 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.01% 젤라틴, 100ng 프라이머, 50 ng 주형 DNA, 200㎛ dNTP(dCTP, dTTP, dATP, dGTP), 20 pmol의 ITS 1과 10pmol의 ITS 2 프라이머 및 2.5 unit Taq 중합효소(Promega)를 넣고 전체 반응 용액은 50 ㎕가 되게 하였다. PCR 반응을 위한 조건은 PTC-200(MJ. Reasearch사)의 PCR 기기를 이용하여 처음 94℃에서 4분간 DNA를 변형시킨후, 94℃에서 1분 동안 변성(denaturing), 어닐링(annealing)은 58℃에서 1분 및 DNA 합성은 72℃에서 2분으로 총 35 사이클(cycle)을 실시하였으며, 최종 DNA 합성은 7분으로 하였다. PCR에 의해 증폭된 rDNA ITS 영역을 5'-TCCGTAGGTGAACCTCGGC-3' 프라이머로 하고 (주)그린진바이오텍에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. 그 결과로서 516 bp ITS 염기서열이 결정 되었다(도 1). 유연관계분석은 NCBI GeneBank에서 기 보고된 Phellinus 종의 ITS 영역의 염기서열을 불러들여 본 연구의 KACC93057P의 ITS 염기서열과 비교분석하여 실시하였다. 염기서열 Alignment와 계통 발생 분지도 (Phylogenic dendrogram)은 DNA 스타 프로그램(Sta Program)의 Neighbor-Joining method에 의하여 작성되었다.
염기서열 상동성을 표로 나타낸 결과로서 펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)와 펠리누스 바우미(Phellinus baumii)는 94.8%의 가장 높은 염기서열 상동성이 나타났다(도 2). 그러나 다른 펠리누스(Phellinus) 종이나 다른 속에는 90% 이하의 낮은 일치율을 보였다. 염기서열 상동성을 기준으로하여 유전적 유연관계를 그림으로 나타낸 것으로서 KACC93057P는 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미와의 유전적 근연관계를 나타내고 있다(도 3). 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미는 98% 이상의 높은 염기서열 상동성을 보이나 다른 종으로 구분하고 있다. 본 발명의 KACC93057P는 94.8%의 비교적 낮은 일치율을 보여 새로운 변이 균주나 신규 종으로 생각될 수 있다. 미생물의 rDNA는 비교적 진화적으로 보존적인 염기서열을 가지고 있어 속 간에도 90% 이상의 일치성이 나타난다. 일반적으로 98% 이상일 때 같은 종으로 취급하고 있으며 그 이하의 상동성은 다른 종으로 판단하고 있다.
추가로 PCR증폭산물인 rDNA ITS 영역을 제한효소 MspⅠ으로 절단하여 3%의 고농도 아가로스 젤(Agarose gel)에서 전기영동하고 EtBr(Ethidium bromide)로 염색하여 PCR 다형성 밴드를 구분하는 PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism) 방법을 적용 한 결과, 도 4의 (a)와 같이 다른 다형성밴드를 나타내고 있다. 이는 다양한 rDNA 영역상에 일반적으로 PCR-RFLP의 밴드양상이 다르면 다른 종으로 분류하는 것이 통례이다. URP2R로 프라이머로 PCR 증폭하여 1.5%에 전기영동하여 EtBr로 염색하여 PCR 다형성밴드를 관찰한 것으로 KACC93057P는 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미와는 전혀 다른 PCR 다형성 밴드를 생산하였다(도 4b). URP 프라이머는 20mer로 구성된 매우 안정적인 랜덤 프라이머(random primer)로서 균류의 종간 종내 계통간의 유전적 다양성을 검출하기 위해 널리 이용되고 있다 (강 등 2002년).
결과적으로, ITS rDNA와 URP-PCR 분석의 결과를 종합하여 볼 때 KACC93057P는 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미와는 종을 달리하는 신규한 펠리누스 균주로 간주될 수 있다.
실시예 2. KACC93057P 균주의 형태적 특성
ITS rDNA 염기서열 분석, PCR-RFLP, URP-PCR분석에서 KACC93057P 균주는 펠리누스 속에 속하며 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미와는 매우 유사하나 분류학적으로 인정할 만한 유전적 특성을 나타내어 다른 종으로서의 가능성을 시사하였다. 곰팡이 균주의 특성을 나타내기 위하여 균사체의 형태적 특성과 성장률 등이 일반적으로 적용되고 있다. KACC93057P 균주와 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미 균사의 형태적 특징으로는 균총의 색과 기균사 정도 등을 조사 하였다. 이러한 관찰을 위하여 KACC93057P 균주, 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미 균사체 절편을 PDA 평판 배지의 중앙에 이식한 후 25±2℃의 항온기에서 14일간 배양하여 균사 성장, 균사체 색깔 및 형태를 육안으로 관찰하였다. PDA 배지 상에서 배양 14일 된 KACC93057P, 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미에 대하여 균총의 형태적 특성을 나타내고 있다. PDA 배지상에서 KACC93057P는 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미에 비하여 0.5배 이상의 빠른 생장을 보였으며 균총 색상은 진 노란색이 균사전체에 나타나고 있었고, 균총의 모양은 기 균사가 결집하여 솜모양으로 배지 전체에 형성되었다. 반면에 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미는 균사 중심부위에서 옅은 노란색을 나타내고 가장자리에는 흰 균사가 실모양으로 뻗어 있는 형태로 KACC93057P와는 다른 균사 형태였다.
따라서 균사의 형태적, 생리학적 특성검정에서도 KACC93057P는 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미와는 다른 균사 생장율과 균사 형태를 나타내는 고유의 특성을 나타내고 있어 새로운 펠리누스 속 균주로 정의할 수 있다.
실시예 3. KACC93057P 균사체로부터의 다당류 분리 및 약리활성조사
펠리누스 린테우스(Phellinus linteus)의 자실체 열수 추출물은 혈액순환, 위(stamoch)기능 강화 및 소화촉진, 빈혈방지 및 해열 등 많은 생리적 효과를 가지고 있으며 장기간 복용하여도 부작용이 거의 없으므로 건강식품이나 의약품 소재로 크게 주목 받고 있다. 펠리누스 종들로부터 다당류가 분리되어 면역증강 활성과 항암활성에 대한 활발한 연구가 진행되고 있으며 메시마 엑스라는 다당류체 약제가 제품으로 상용화되어 항제로서 일본에 수출된 바 있다. 따라서 본 발명의 KACC93057P균주로부터 다당류를 분리하여 약리활성을 조사하였다. 대조구로서 이미 많은 연구가 수행되었으며 유전적으로 유사적 특성을 보인 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미균주를 함께 사용하여 비교 검토 하였다.
3-1. 펠리누스 배양 균사체로부터 다당류 추출
균사체의 액체배양을 위하여 프라스틱멸균병(500㎖)에, 여과 살균한 YGM 브로스(Broth) (1% 맥아 추출물, 0.4 % 글루코오스, 0.4 % 효모 추출액/물 1L)를 각각 120㎖씩 분주하였다. 접종원은 PDA 평판배지에서 배양된 균사체의 가장자리로부터 직경 5mm의 콜크 보러(cork borer)로 찍어 일정한 크기의 균사절편을 만들어 액체 YGM 브로스(Broth)에 접종하고 프라스틱병 입구에 배지가 접촉하지 않도록 측면으로 뉘어 균사체가 적황색을 띄며 프라스틱병의 측면까지 고르게 퍼질 때까지 25±2℃의 항온기에서 20일간 정치배양 하였다. KACC93057P, 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미 균주를 배양한 다음 20일 후에 촬영한 사진 (도 6)으로 KACC93057P 균주는 다른 균주에 비하여 2배 이상의 균사량을 보였으며, 균사체 색상은 금빛 밝은 노란색으로 다른 펠리누스 균주와 다른 형태를 보였다. 각각의 균주당 20개의 배양병으로부터 균사체를 수거하여 증류수로 배지 성분을 잘 씻어내고 500 ㎖의 물을 첨가하여 호모게나이저로 균사체를 마쇄하였다. 마쇄된 균사체를 100 ℃에서 30분 동안 열을 가하고 3M 여과지로 여과하여 추출하였다. 여과지에 남은 균사체를 다시 250 ㎖의 물을 첨가하여 위의 방법으로 2회 반복하여 균사 추출물을 얻었다. 최종 1000 ㎖의 균사체 추출물을 증발기 (evaporator)로 1/4로 농축하여 4볼륨의 95%의 에탄올을 첨가하여 -20 ℃에서 하룻 밤 동안 방치하였다. 다음날 에탄올 침전물을 수거하고 건조한 후 실험에 사용 하였다.
3-2.
Phellinus
균사체로부터 분리한 다당류의 면역증강활성 분석
펠리누스 균사체로부터 분리한 다당류에 대한 항체 형성능을 알아보기 위해, 마우스 BDF1 (5~6주령, female) 비장 조직을 무균적으로 적출한 후 비장 조직을 파쇄하여 적정 세포(titrated cell)를 48 웰에 500 ㎕씩 분주한 뒤, KACC93057 균주, 펠리누스 린테우스 및 펠리누스 바우미 균주의 균사체로부터 추출한 다당류를 식염수에 40 ㎎/㎖ 농도로 조정하여 처리구로 준비 하였으며, 음성(Negative) 대조구로는 생리식염수 군(VH), 양성(Positive) 대조구로 B-림프구(B-lymphocyte)에 대한 미토겐(mitogen)으로 이용되는 LPS (Lipopolysaccharide)를 25ug/㎖ 농도로 처리하여 10% CO2, 7% O2, 83% N2의 혼합가스로 약 5psi의 압력의 스테인레스 조직 배양 챔버(stainless tissue culture chamber)를 8 ~ 10 rocks/min의 속도로 교반시키며 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. Trinitrophenyl-heptenated SRBC에 대한 AFC는 김 등의 방법(1995)에 따라 면역 활성 지표는 비장세포 106 당 용혈현상을 나타내는 항체 형성 세포(plaque forming cell)의 수로 판정 하였다. 그 결 과, 면역활성물질로 잘 알려진 대조구 LPS(Lipopolysaccharide)는 42개의 용혈세포를 형성하였으며 KACC93057P 균주는 34개의 항체 형성 세포(plaque forming cell)를 형성함으로써 펠리누스 린테우스의 23개, 펠리누스 바우미 균주의 8개보다 높은 면역활성을 나타내었다(도 7). 항체 형성 세포(plaque forming cell)의 용혈현상은 자가면역, 동족면역 혹은 어떤 약제에 노출된 후 생성된 항체나 보체가 적혈구 막에 결합하여 일어나는 현상으로써 용혈반형성 세포는 원형질 세포(Plasma Cell)로서 이들이 생성한 항체의 분비로 인해 용혈반이 형성된다. 따라서 다당류 투여로 항체 형성 세포수가 증가함은 면역력이 높다는 것을 의미한다.
3-3.
Phellinus
균사체로부터 분리한 다당류의 항암활성
사람 자궁암 세포주인 HeLa 세포는 포유류 세포 중 가장 먼저 인공배양에 성공한 세포주로서 현재 여러가지 다양한 항암 연구에 이용되어 왔다. 5개의 T-75 플레이트에 배양된 HeLa 세포를 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 후 생리 식염수로 약 1회 세척 후 5% FBS DMEM(JBI LM001-11)배지에 세포를 희석하였다. 희석된 세포는 5.0x104cells/well의 농도로 맞추어 96 웰 플레이트에 도포한 후, 약 24시간 동안 배양하여 세포가 플레이트의 바닥에 흡착이 되도록 한 후 배지를 걷어 내었다. 펠리누스 균사체로부터 분리한 다당류의 농도를 5% FBS DMEM(JBI LM001-11)배지로 10 mg/㎖, 20 mg/㎖, 40 mg/㎖, 80 mg/㎖로 조정하여 세포에 처리 한 후 24시간 동안 배양기에서 배양하고, 무 혈청 배지에 MTT 포마잔(Formazan) (Sigma M2003-1G)를 0.5mg/㎖로 녹여 웰당 200 ㎕를 첨가하였다. 약 2 ~ 3시간 동안 배양 한 후 배지를 제거하고, DMSO를 100 ㎕/well 첨가한 후 실온에서 약 30분 정도 반응시켰다. 그리고, ELISA 리더를 이용하여 540nm의 흡광도로 측정하였고, 아무것도 처리하지 않은 군의 흡광도를 100%로 잡고 각각의 세포 생존률을 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이 KACC93057P 균주의 10 mg/㎖ 다당류를 투여한 시점에서 HeLa 세포가 10%정도 사멸하기 시작하여 40 mg/㎖에서 65% 정도만이 생존하는 높은 항암 효과를 나타내었다. 이는 펠리누스 린테우스와 펠리누스 바우미 균주로부터 추출한 다당류 보다 높은 항암 활성을 나타내는 바 KACC93057P의 약리활성에서의 우수성을 확인하였다.
본 발명의 신규한 균주인 KACC93057P는 기존의 펠리누스 속에 비해 높은 생장률과 균사체 생산량을 나타내며, 면역 활성 및 항암 활성이 뛰어나 기존 균주보다 항암 및 면역 활성이 우수한 균주를 대량생산할 수 있으며 자실체를 생산할 수 있는 종균으로서 개발하여 판매 보급 할 수 있다.
도 1은 KACC93057P 균주의 ITS rDNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 KACC93057P 균주의 ITS rDNA 염기서열과 유전자 은행에 등록된 펠리누스 속 또는 유사종의 ITS rDNA 염기서열과 비교하여 염기서열 일치성을 백분율로 나타낸 것이다.
도 3은 KACC93057P 균주의 ITS rDNA 염기서열과 유전자 은행에 등록된 펠리누스 속 또는 유사종의 ITS rDNA 염기서열과 비교하여 유전적 유연관계를 계통도 (Dendrogram)로 나타낸 것이다.
도 4는 ITS rDNA 영역을 PCR로 증폭하여 Msp I 제한효소로 절단한 다음 아가로스 겔에서 전기영동한 사진 (도 4(a))이며, URP-2R 프라이머로 PCR 증폭하여 아가로스 겔에서 전기영동한 사진 (도 4(b)) 이다. M: 1kb DNA 마커, 1. 펠리누스 린테우스 균주, 2. KACC93057P 균주, 3. 펠리누스 바우미 균주
도 5는 PDA 평판배지에 접종하고 14일 후에 사진 촬영한 펠리누스 린테우스균주 KACC93057P 균주와 펠리누스 바우미 균주의 균총의 형태적 특징을 나타낸 것이다.
도 6은 다당류 분리를 위하여 125 ㎖의 YGM 배지가 들어 있는 500 ㎖ 용 프라스틱병에 펠리누스 린테우스 균주, KACC93057P 균주와 펠리누스 바우미 균주를 접종하고 정치 배양 20일 후에 균사체 형태를 나타낸 것이다.
도 7은 펠리누스 균사체로부터 분리한 다당류의 면역활성을 조사하기 위하여 마우스 BDF1 (5~6주령, 암컷) 비장세포 106에 대한 항체 형성능으로 항체(plaque) 형성 비장 세포 수를 조사한 것이다. VH: 식염수처리(음성 대조구), LPS: Lipopolysaccharide 25㎍/㎖ 처리(양성 대조구, 1. 펠리누스 린테우스 균주의 다당류 (40mg/㎖), 2. KACC93057P 균주의 다당류 (40mg/㎖), 3. 펠리누스 바우미 균주의 다당류 (40mg/㎖)
도 8은 사람 자궁암 세포주인 HeLa 세포에 대한 다당류의 농도별 생존률을 조사하여 항암활성을 나타낸 것이다.
Claims (8)
- 면역 항암 활성 물질을 생산하는 펠리누스 속(Phellinus sp.) KACC93057P 균주.
- 제1항의 균주로부터 분리된 면역 항암 활성 다당류.
- 펠리누스 KACC93057P 균사체 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 약학 조성물.
- 펠리누스 KACC93057P 균사체 추출물을 포함하는 항암 활성 증강용 약학 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 자궁암으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암에 대한 항암 활성을 나타내는 약학 조성물.
- 펠리누스 KACC93057P 균사체 추출물을 포함하는 면역 또는 항암 활성 증강용 건강기능식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료수, 차, 드링크제, 젤리 및 주스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 건강기능식품인 건강기능식품 조성물.
- a) 여과 살균한 맥아 추출물, 글루코오스 및 효모 추출액을 포함하는 멸균 배지에 제1항의 균주를 접종하는 단계;b) 상기 균주를 20℃ 내지 30℃에서 배양하는 단계;c) 배양된 균주를 마쇄하는 단계; 및d) 마쇄된 균주를 여과 및 추출하는 단계를 포함하는 제1항의 균주를 이용하여 면역 항암 활성을 갖는 다당류를 생산하는 방법.
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