KR101745597B1 - 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도 - Google Patents

발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101745597B1
KR101745597B1 KR1020160065827A KR20160065827A KR101745597B1 KR 101745597 B1 KR101745597 B1 KR 101745597B1 KR 1020160065827 A KR1020160065827 A KR 1020160065827A KR 20160065827 A KR20160065827 A KR 20160065827A KR 101745597 B1 KR101745597 B1 KR 101745597B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leaf extract
fermented
pediococcus
fermentation
persimmon
Prior art date
Application number
KR1020160065827A
Other languages
English (en)
Inventor
이제현
김은주
양혜정
이남근
정종훈
Original Assignee
다인바이오 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다인바이오 주식회사 filed Critical 다인바이오 주식회사
Priority to KR1020160065827A priority Critical patent/KR101745597B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101745597B1 publication Critical patent/KR101745597B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/44—Ebenaceae (Ebony family), e.g. persimmon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/60—Moraceae (Mulberry family), e.g. breadfruit or fig
    • A61K36/605—Morus (mulberry)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/332—Promoters of weight control and weight loss
    • A23Y2280/15—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 유산균 발효에 의해 기능성이 향상된 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물을 제공한다. 본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 천연 작물로부터 유래하기 때문에 합성 화학물질에 비해 안전성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 발효 전보다 증가된 플라보놀(flavonol) 함량 또는 향상된 항비만 활성을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 다양한 식의약 또는 화장품 용도의 소재로 사용될 수 있고, 특히 항비만 용도의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도{Fermented persimmon leaves, femented persimmon leaves extract and use there of}
본 발명은 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 발효 전에 비해 플라보놀(flavonol)의 함량이 증가하거나 항비만 활성이 향상된 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 및 이들의 식의약적 용도에 관한 것이다.
생활수준 향상과 급속한 경제 발전에 따라 식생활 양상이 다양화되고 서구화됨으로 인해 고칼로리와 동물성 식품의 섭취가 증가하여 동맥경화, 뇌졸중, 고혈압, 비만, 그리고 당뇨병 등의 각종 성인병의 발병이 늘어나게 되었고, 특히 비만 인구는 현대사회로 들어오면서 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 급속하게 증가하고 있다(Jung et al. 2011; Hur 1990). 비만은 섭취량에 비해 소모하는 열량이 적어 발생하는 대사성 질환으로 식습관과 운동부족뿐만 아니라 다양한 환경적 및/또는 유전적 요인이 작용되는 복합증후군이다. 최근 부작용 위험이 높은 비만 치료제의 사용보다 안전하고 부작용의 위험이 낮은 천연 식물 소재에 대한 관심이 점차 높아지고 있으며, 특히 우리나라 자생식물을 이용하여 부가가치를 높이고 비만치료에 효과를 나타내는 기능성 소재를 개발하기 위한 여러 가지 연구가 요구되고 있다(Kim 2015).
감나무 잎은 예로부터 민간에서 차의 원료로 이용되어 왔으며, 동의보감과 본초강목 등의 고문에 약리작용과 효능이 보고되어 있다. 감잎에는 생리활성 물질인 catechin류와 같은 flavan-3-ol 화합물과 proanthocyanidin에 속하는 축합형 tannin 뿐만 아니라 kaempferol 배당체인 astragalin, myricetin의 배당체인 myricitrin, 그리고 quercetin의 배당체인 isoquercitrin 등이 존재하며, 혈압상승 억제, 활성산소의 free radical 억제 효과, 항산화, 항암, 그리고 생리활성물질의 효소 저해 효과 등 다양한 연구들이 보고되고 있다(Jung et al. 2011; Chung et al. 1990; Robards 2003).
누룩은 우리나라의 전통주인 탁주 및 약주의 양조에 있어서 쌀 등의 전분질 원료를 분해하는 amylase를 비롯한 각종 가수 분해효소를 공급하고 효모와 발효관련 미생물의 접종원으로 중요한 역할을 하고 있으며 이는 종류나 질에 따라 주질에 미치는 영향이 매우 크다(Jo et al. 1995). 누룩 미생물에 관한 연구는 1900년대 초부터 시작하여 세균, 효모 및 진균 등 다양한 종이 영양 배지를 이용하여 분리 및 동정되었다. 구체적으로 1906년에서 1945년 사이에 다양한 세균(4속 16종), 효모(8속 29종) 그리고 사상균(12속 59종) 등이 누룩 미생물로 보고되었으며 이후 분류 및 동정기술의 발달에 의해 세분화된 종들이 추가적으로 보고되었다(So et al. 2009; Lee et al. 2004). 누룩으로부터 유산균의 분리 및 동정은 누룩이 탁주의 발효에 있어 전분의 가수분해와 알코올 발효에 대한 역할 외에 탁주가 발효식품으로서 영양학적 가치를 높이는 데 주요한 역할을 하였다(Jo et al. 1995)
그러나 현재까지 유산균을 이용한 발효를 통해 감잎의 항비만 활성 증가에 관한 연구는 미비한 상태이다. 감잎 또는 감잎 발효물의 항비만 용도와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0591791호에는 감잎, 메밀잎 및 구기자잎에 치커리잎을 추출재료로 추가하여 열수추출한 추출액을 함유하는 것을 특징으로 하는 비만억제용 음료가 개시되어 있다. 또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1062174호에는 감잎으로부터 얻은 트리터페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 조성물이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0110378호에는 감잎을 바실러스 서브틸리스로 발효시켜 제조한 감잎 발효차의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만, 당뇨병, 또는 염증 치료 또는 예방용 조성물이 개시되어 있다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로, 본 발명의 목적은 다양한 생리활성을 가진 플라보놀(flavonol)의 함량이 증가하거나 항비만 활성이 향상된 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물을 제공하는데에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물의 식의약적 용도를 제공하는데에 있다.
본 발명의 발명자들은 누룩으로부터 분리된 다양한 유산균을 대상으로 감잎 또는 감잎 추출물의 발효 균주를 선별하였고, 그 결과 특정 균주가 감잎 또는 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol)의 함량 또는 항비만 활성을 크게 향상시킨다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 감잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물인 것을 특징으로 하는 발효 감잎을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 감잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물의 추출물 또는 감잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물인 것을 특징으로 하는 발효 감잎 추출물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 예는 전술한 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 천연 작물로부터 유래하기 때문에 합성 화학물질에 비해 안전성이 우수하다. 또한, 본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 발효 전보다 증가된 플라보놀(flavonol) 함량 또는 향상된 항비만 활성을 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 플라보놀(flavonol)이 가지는 다양한 생리활성으로 인해 히알루론산 생성 촉진, 항산화, 악성중피종 예방 또는 치료, C형 감염 바이러스 감염 치료, 어류의 항바이러스 개선, 줄기세포능 개선, 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료, 지질대사 질환의 예방 또는 치료, 혈당 강하, 운동수행능력 증강, 췌장 리파아제 저해 등과 같은 식의약 또는 화장품 용도의 소재로 사용될 수 있고, 특히 항비만 용도의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 뽕잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 각각 발효시켰을 때 플라보놀(flavonol)인 궤르세틴(quercetin)과 캠페롤(kaempferol)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 감잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 각각 발효시켰을 때 플라보놀(flavonol)인 궤르세틴(quercetin)과 캠페롤(kaempferol)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 반응표면법을 이용하여 뽕잎 추출물 발효에 주요 영향을 미치는 요인을 분석하였을 때의 분산분석표이다.
도 4는 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 뽕잎 추출물의 농도와 발효 시간이 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 5는 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 뽕잎 추출물의 농도와 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 6은 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 발효 시간과 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 7은 반응표면법을 이용하여 감잎 추출물 발효에 주요 영향을 미치는 요인을 분석하였을 때의 분산분석표이다.
도 8은 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 감잎 추출물의 농도와 발효 시간이 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 9는 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 감잎 추출물의 농도와 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 10은 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 발효 시간과 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다.
도 11은 뽕잎 추출물 또는 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물의 알파-글루코시다제 억제 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물과 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물을 동량으로 혼합한 혼합물 등의 포도당 흡수 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성 측정 값과 반응표면법으로 분석한 예측 값을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 비만 또는 당뇨)의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 비만 또는 당뇨)의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 플라보놀(flavonol)의 함량이 증가하거나 항비만 활성이 향상된 발효 감잎을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 발효 감잎은 감잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물이다.
상기 감잎을 발효시키기 위해 사용되는 유산균인 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)는 누룩에서 분리된 것으로서, 발효 감잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 바람직하게는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KFCC 11662P)이다. 또한, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 이용하여 발효 감잎을 제조할 때 발효 온도는 발효 감잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 33~39℃인 것이 바람직하고, 35~38℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 이용하여 발효 감잎을 제조할 때 발효 시간은 발효 감잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 37~57hr 인 것이 바람직하고, 38~56hr 인 것이 더 바람직하다.
상기 감잎을 발효시키기 위해 사용되는 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)는 누룩에서 분리된 것으로서, 발효 감잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 바람직하게는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C2-3(KFCC 11661P). 또한, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 이용하여 발효 감잎을 제조할 때 발효 온도는 발효 뽕잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 32~39℃인 것이 바람직하고, 33~38℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 이용하여 발효 감잎을 제조할 때 발효 시간은 발효 감잎의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 25~60hr 인 것이 바람직하고, 30~55hr 인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 일 측면은 플라보놀(flavonol)의 함량이 증가하거나 항비만 활성이 향상된 발효 감잎 추출물을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 발효 감잎 추출물은 감잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물의 추출물 또는 감잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시킨 산물이다.
상기 감잎 또는 감잎 추출물을 발효시키기 위해 사용되는 유산균인 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)는 누룩에서 분리된 것으로서, 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 바람직하게는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KFCC 11662P)이다. 또한, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 이용하여 발효 감잎 추출물을 제조할 때 발효 온도는 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 33~39℃인 것이 바람직하고, 35~38℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 이용하여 발효 감잎 추출물을 제조할 때 발효 시간은 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 37~57hr 인 것이 바람직하고, 38~56hr 인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 이용하여 감잎 추출물을 발효시킬 때 감잎 추출물 농도는 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.2~1.9 중량%인 것이 바람직하고, 1.4~1.8 중량%인 것이 더 바람직하다.
상기 감잎 또는 감잎 추출물을 발효시키기 위해 사용되는 유산균인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)는 누룩에서 분리된 것으로서, 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 바람직하게는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C2-3(KFCC 11661P)이다. 또한, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 이용하여 발효 감잎 추출물을 제조할 때 발효 온도는 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 32~39℃인 것이 바람직하고, 33~38℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 이용하여 발효 감잎 추출물을 제조할 때 발효 시간은 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 25~60hr 인 것이 바람직하고, 30~55hr 인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 이용하여 감잎 추출물을 발효시킬 때 감잎 추출물 농도는 발효 감잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.0~2.0 중량%인 것이 바람직하고, 1.4~1.8 중량%인 것이 더 바람직하다.
본 발명에서 감잎으로부터 발효 감잎 추출물을 얻기 위해서는 추출 과정이 필요한데, 이때 추출 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용할 수 있다. 용매 추출법을 이용하여 발효 감잎 추출물을 제조할 때 사용될 수 있는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하다. 추출 용매로 물을 사용하는 경우 물은 열수인 것이 바람직하다. 또한, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 또한, 추출 용매로 함수 알코올을 사용하는 경우 알코올 함량은 50~90%인 것이 바람직하다. 한편, 발효 감잎 추출물은 상기 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 이용한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다. 상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다. 또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물은 퀘르세틴(quercetin), 캠페롤(kaempferol), 미리세틴(myricetin) 등과 같은 플라보놀(flavonol) 함량이 발효 전의 감잎 또는 감잎 추출물에 비해 현저하게 증가하기 때문에 플라보놀의 공지된 다양한 기능성을 가지며 구체적으로 히알루론산 생성 촉진(대한민국 공개특허공보 제10-2006-0078292호), 항산화(대한민국 공개특허공보 제10-2015-0051624호), 악성중피종 예방 또는 치료(대한민국 공개특허공보 제10-2013-0124640호), C형 감염 바이러스 감염 치료(대한민국 공개특허공보 제10-2014-0102227호), 어류의 항바이러스 개선(대한민국 공개특허공보 제10-2015-0015694호), 줄기세포능 개선(대한민국 공개특허공보 제10-2013-0136158호), 비알코올성 지방간의 예방 또는 치료(대한민국 공개특허공보 제10-2012-0096328호), 지질대사 질환의 예방 또는 치료(대한민국 공개특허공보 제10-2011-0100882호), 혈당 강하(대한민국 공개특허공보 제10-2011-0100880호), 운동수행능력 증강(대한민국 공개특허공보 제10-2014-0048402호), 췌장 리파아제 저해(대한민국 공개특허공보 제10-2015-0101788호), 항당뇨 또는 항비만(Vessal et al. 2003; Abdelmoaty et al. 2010; Zang et al. 2011; Hana et al. 2015) 등에 유용한 식의약 또는 화장품 소재로 사용될 수 있고, 특히 항비만 용도의 소재로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 항비만 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 예에 따른 항비만 조성물은 전술한 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물을 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 일 예에 따른 항비만 조성물은 유효성분으로 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 외에 발효 뽕잎 또는 발효 뽕잎 추출물을 더 포함할 수 있다. 상기 발효 뽕잎은 뽕잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시킨 산물이고, 상기 발효 뽕잎 추출물은 뽕잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시킨 산물의 추출물이거나 뽕잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시킨 산물이다. 또한, 상기 뽕잎 또는 뽕잎 추출물을 발효시키기 위해 사용되는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)는 발효 뽕잎 또는 발효 뽕잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 바람직하게는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KCCM 80111)이다. 또한, 상기 뽕잎 또는 뽕잎 추출물을 발효시키기 위해 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 사용하는 경우 발효 온도는 발효 뽕잎 또는 발효 뽕잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 35~39℃인 것이 바람직하고, 35~38℃인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 뽕잎 또는 뽕잎 추출물을 발효시키기 위해 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 사용하는 경우 발효 시간은 뽕잎 또는 뽕잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 37~57hr 인 것이 바람직하고, 38~56hr 인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 뽕잎 추출물을 발효시키기 위해 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 사용하는 경우 발효시 뽕잎 또는 뽕잎 추출물의 플라보놀(flavonol) 함량 증가 또는 항비만 활성 향상을 고려할 때 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.2~1.9 중량%인 것이 바람직하고, 1.4~1.8 중량%인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 항비만 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품 조성물), 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서 유효성분인 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명의 항비만 조성물이 약학 조성물인 경우 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등과 같은 유효성분의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등 외에 지방전구세포의 지방세포로의 분화 억제, 지방 축적 억제, 비만 예방 또는 치료와 같은 항비만 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분인 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등을 기준으로 할 때 0.1 내지 2000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 1 내지 1000 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 항비만 조성물이 식품 조성물인 경우 그 형태는 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등을 포함하고, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물에서 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등과 같은 유효성분의 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 발효 감잎 또는 발효 감잎 추출물 등 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
1. 누룩으로부터 유산균의 분리 및 종균 배양액의 제조
전통 방식으로 제조된 누룩을 멸균수로 희석하고, 희석액을 1.5%의 한천이 포함된 MRS 배지(Difco, USA)에 도말한 후, 37℃에서 약 24시간 동안 배양하였다. 이후, 콜로니를 형성한 균주들을 분리하고 해당 배지에 계대배양한 후, 총 21종의 유산균을 분리하였다. 하기 표 1은 누룩으로부터 분리된 총 21종의 유산균을 나타낸 것이다.
균주
관리번호		 균주 종명 균주
관리번호		 균주 종명
A-3-72 Lactobacillus curvatus B-3-10 Klebsiella pneumoniae
B-0-24 Lactococcus lactis B-3-21 Enterococcus hirae
B-0-9 Lactobacillus curvatus B-3-22 Lactobacillus curvatus
A-30-10 Pediococcus acidilactici A-0-18 Pediococcus acidilactici
B-0-14 Weissella paramesenteroide C-2-17 Pediococcus acidilactici
B-0-23 Enterococcus avium A-3-2 Enterococcus lactis
B-3-11 Klebsiella pneumoniae B-3-1 Enterococcus hirae
A-0-1 Pediococcus acidilactici B-0-13 Leuconostoc citreum
A-3-71 Pediococcus pentosaceus C-1-3 Pediococcus pentosaceus
A-3-1 Pediococcus pentosaceus C-2-3 Pediococcus pentosaceus
B-3-19 Klebsiella pneumoniae
누룩으로부터 분리된 유산균 21종을 MRS 액상 배지(MRS broth, Difco, USA) 100㎖에 각각 1%(w/v)씩 접종하고, 37℃ 및 100 rpm의 조건을 가진 배양기(Shaking incubator SI-2S, UNIVERSAL SCIENTIFIC CO., LTD)에서 24 hr 동안 배양하여 종균 배양액을 제조하였다.
2. 뽕잎 또는 뽕잎 추출물의 발효에 적합한 유산균의 선정
(1) 뽕잎 추출물 및 발효 뽕잎 추출물의 제조
건조 뽕잎 분말을 뽕잎 중량의 약 30배에 해당하는 물에 첨가하고 100℃에서 9시간 동안 열수 추출하였다. 이후, 추출액을 여과망에 통과시켜 여과액을 수득하고 감압 농축기로 농축하였다. 이후, 농축액을 동결건조하여 뽕잎 추출물을 수득하였고, -70℃에 저장하면서 분석 시료로 사용하였다.
유산균의 종균 배양액을 원심분리하여 균체 펠렛을 회수하고, 회수된 균체 펠렛을 증류수 10㎖에 현탁하여 균체 현탁액을 제조하였다.
증류수 100㎖에 동결건조된 뽕잎 추출물 1g(1중량%에 해당함)을 첨가하여 용해시키고 균체 현탁액 1㎖를 접종한 후 37℃에서 72 hr 동안 배양하여 뽕잎 추출물을 발효시켰다. 뽕잎 추출물 발효액을 12,000 rpm 및 4℃의 조건에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하고 상등액을 동결건조하여 발효 뽕잎 추출물을 수득하였다.
(2) 발효 뽕잎 추출물의 플라보놀 함량 분석
앞에서 수득한 발효 뽕잎 추출물 200㎎을 증류수 1㎖에 용해시키고, 0.22㎛ Polyvinylidene Difluoride(PVDF) syringe filter로 여과한 후 분석 시료로 사용하였다. Flavonol인 quercetin과 kaempferol의 함량 분석은 ODS-column(XBridge, 250㎜×4.6㎜, 5㎛, Waters Corp.)이 장착된 photo diode array(PDA) system의 HPLC를 이용하여 수행하였다. 이동상 A 용매로 2% acetic acid를 함유한 물을 사용하고, 이동상 B 용매로 2% acetic acid를 함유한 45% acetonitrile을 사용하였고, B 용매의 농도를 초기 50%에서 25분 동안 100%로 증가시키는 농도 구배 방식으로 분석하였다. 용매의 유속은 1 ㎖/min 이었고, detector의 파장은 355 ㎚ 이었고, 시료 주입량은 10㎕ 이었고, 분석하는 동안 column oven은 30℃를 유지하였다.
도 1은 뽕잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 각각 발효시켰을 때 플라보놀(flavonol)인 궤르세틴(quercetin)과 캠페롤(kaempferol)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다. 도 1에서 X 축은 뽕잎 추출물의 발효에 사용된 유산균의 관리번호를 나타내고, Y 축은 발효 뽕잎 추출물 100g에 함유된 플라보놀의 양을 ㎎ 단위로 나타낸 것이다. 또한, 도 1에서 "Control"은 발효 처리를 하지 않은 뽕잎 추출물을 나타낸다. 도 1에서 보이는 바와 같이 뽕잎 추출물 자체에는 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)과 같은 플라보놀(flavonol)이 매우 미량으로 존재하여 0의 값으로 표시되었다. 도 1에서 보이는 바와 같이 뽕잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 발효시켰을 때 모든 발효 뽕잎 추출물에서 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)의 함량이 증가하였고, 특히 균 관리번호 C-2-17의 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시켜 수득한 발효 뽕잎 추출물에서 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)의 함량 증가가 현저하게 높았다.
(3) 뽕잎 추출물의 발효에 적합한 유산균의 선정 및 기탁
발효 뽕잎 추출물의 플라보놀 함량 분석 결과에 기초하여 뽕잎 추출물의 발효에 적합한 유산균으로 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C-2-17을 선정하고, 이를 한국미생물보존센터(대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내2가길 45 유림빌딩 3F)에 2016년 4월 28일자로 안전기탁하고 기탁번호 KCCM 80111을 부여받았다. 또한, 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C-2-17의 안전기탁을 5월 18일자로 특허기탁으로 변경하여 기탁번호 KFCC 11662P를 부여받았다.
3. 감잎 또는 감잎 추출물의 발효에 적합한 유산균의 선정
(1) 감잎 추출물 및 발효 감잎 추출물의 제조
건조 감잎 분말을 감잎 중량의 약 30배에 해당하는 물에 첨가하고 100℃에서 9시간 동안 열수 추출하였다. 이후, 추출액을 여과망에 통과시켜 여과액을 수득하고 감압 농축기로 농축하였다. 이후, 농축액을 동결건조하여 감잎 추출물을 수득하였고, -70℃에 저장하면서 분석 시료로 사용하였다.
유산균의 종균 배양액을 원심분리하여 균체 펠렛을 회수하고, 회수된 균체 펠렛을 증류수 10㎖에 현탁하여 균체 현탁액을 제조하였다.
증류수 100㎖에 동결건조된 감잎 추출물 1g(1 중량%에 해당함)을 첨가하여 용해시키고 균체 현탁액 1㎖를 접종한 후 37℃에서 72 hr 동안 배양하여 감잎 추출물을 발효시켰다. 감잎 추출물 발효액을 12,000 rpm 및 4℃의 조건에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하고 상등액을 동결건조하여 발효 감잎 추출물을 수득하였다.
(2) 발효 감잎 추출물의 플라보놀 함량 분석
앞에서 수득한 발효 감잎 추출물 200㎎을 증류수 1㎖에 용해시키고, 0.22㎛ Polyvinylidene Difluoride(PVDF) syringe filter로 여과한 후 분석 시료로 사용하였다. Flavonol인 quercetin과 kaempferol의 함량 분석은 ODS-column(XBridge, 250㎜×4.6㎜, 5㎛, Waters Corp.)이 장착된 photo diode array(PDA) system의 HPLC를 이용하여 수행하였다. 이동상 A 용매로 2% acetic acid를 함유한 물을 사용하고, 이동상 B 용매로 2% acetic acid를 함유한 45% acetonitrile을 사용하였고, B 용매의 농도를 초기 50%에서 25분 동안 100%로 증가시키는 농도 구배 방식으로 분석하였다. 용매의 유속은 1 ㎖/min 이었고, detector의 파장은 355 ㎚ 이었고, 시료 주입량은 10㎕ 이었고, 분석하는 동안 column oven은 30℃를 유지하였다.
도 2는 감잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 각각 발효시켰을 때 플라보놀(flavonol)인 궤르세틴(quercetin)과 캠페롤(kaempferol)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 X 축은 감잎 추출물의 발효에 사용된 유산균의 관리번호를 나타내고, Y 축은 발효 감잎 추출물 100g에 함유된 플라보놀의 양을 ㎎ 단위로 나타낸 것이다. 또한, 도 2에서 "Control"은 발효 처리를 하지 않은 감잎 추출물을 나타낸다. 도 2에서 보이는 바와 같이 감잎 추출물을 누룩으로부터 분리된 21종의 유산균으로 발효시켰을 때 대부분의 발효 감잎 추출물에서 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)의 함량이 증가하였다. 특히, 균 관리번호 C-2-3의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시켜 수득한 발효 감잎 추출물에서 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)의 함량 증가가 현저하게 높았다. 감잎 추출물을 균 관리번호 C-2-3의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시켜 수득한 발효 감잎 추출물에서 발효 처리를 하지 않은 감잎 추출물에 비해 궤르세틴(quercetin) 및 캠페롤(kaempferol)의 함량이 각각 1.82배 및 1.67배 증가하였다. 한편, 후술하는 방법으로 지방 분해 억제 활성을 분석한 결과, 발효 처리를 하지 않은 감잎 추출물의 경우 24.22%로 나타났고, 균 관리번호 C-2-3의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시켜 수득한 발효 감잎 추출물의 경우 29.05%로 나타났다.
(3) 감잎 추출물의 발효에 적합한 유산균의 선정 및 기탁
발효 감잎 추출물의 플라보놀 함량 분석 결과에 기초하여 감잎 추출물의 발효에 적합한 유산균으로 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C-2-3을 선정하고, 이를 한국미생물보존센터(대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내2가길 45 유림빌딩 3F)에 2016년 4월 28일자로 안전기탁하고 기탁번호 KCCM 80110을 부여받았다. 또한, 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C-2-3의 안전기탁을 5월 18일자로 특허기탁으로 변경하여 기탁번호 KFCC 11661P를 부여받았다.
감잎 추출물의 발효에 적합한 유산균으로 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C-2-17을 선정하고, 이를 한국미생물보존센터(대한민국 서울특별시 서대문구 홍제내2가길 45 유림빌딩 3F)에 2016년 4월 28일자로 안전기탁하고 기탁번호 KCCM 80111을 부여받았다. 또한, 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C-2-17의 안전기탁을 5월 18일자로 특허기탁으로 변경하여 기탁번호 KFCC 11662P를 부여받았다.
4. 중심합성계획 실험 및 반응표면법 분석을 이용한 뽕잎 추출물의 최적 발효 조건 탐색
(1) 중심합성계획법에 의한 발효 실험 조건의 설정
발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성을 극대화할 수 있는 최적 발효 조건을 탐색하기 위해 중심합성계획법(central composite design, CCD)을 이용하여 발효 실험 조건을 설정하였고, Design Expert S/W ver 7.1.6을 사용하여 실험 결과를 분석하였다. 구체적으로 뽕잎 추출물 농도, 발효 시간, 그리고 발효 온도를 독립변수로 하여 중심합성계획법에 따라 -α, -1, 0, 1, α의 5단계로 부호화하고, 이를 17구간으로 설정한 뒤 실험을 실시하였다. 독립변수에 의해 영향을 받는 종속 변수는 포도당 흡수 저해 활성이고, 3회 반복 측정한 후 그 평균값을 이용하여 회귀분석에 사용하였다. 하기 표 2는 뽕잎 추출물의 발효 실험에 중심합성계획법을 적용하기 위한 독립변수별 설정 조건을 나타낸 것이고, 하기 표 3은 중심합성계획법을 이용하여 실제로 설정한 뽕잎 추출물의 발효 실험 조건들이다.
5단계 부호 -α -1 0 1 α
뽕잎 추출물 농도(중량%) 0.66 1 1.5 2 2.34
발효 시간(hour) 11.73 24 42 60 72.27
발효 온도(℃) 29.95 32 35 38 40.05
* 뽕잎 추출물 농도 : 뽕잎 추출물의 발효 실험에서 뽕잎 추출물이 용해되는 증류수 중량 기준
* α : 1.682
실험 No. 발효 조건
뽕잎 추출물 농도(중량%) 발효 시간(hour) 발효 온도(℃)
1 1 24 32
2 2 24 32
3 1 60 32
4 2 60 32
5 1 24 38
6 2 24 38
7 1 60 38
8 2 60 38
9 0.66 42 35
10 2.34 42 35
11 1.5 11.73 35
12 1.5 72.27 35
13 1.5 42 29.95
14 1.5 42 40.05
15 1.5 42 35
16 1.5 42 35
17 1.5 42 35
(2) 포도당 흡수 저해 활성 측정 방법
CaCo-2 세포와 2-NBDG[2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino-2-deoxygluocose]를 이용하여 소장세포에서 혈액으로의 포도당 흡수 저해 활성을 측정하였다. 발효 뽕잎 추출물에 대한 포도당 흡수 저해 활성 측정 실험을 위해 Caco-2 세포를 96 well plate에 분주하고 96 well plate를 CO2 인큐베이터 안에 넣고 37℃에서 13일 동안 2.5×104 cells/well 농도로 배양하였다. 이후, PBS(Phosphate bufferd saline) 용액으로 각 well을 2회 세척한 다음 1 ㎎/㎖ 농도의 시료 용액(용매 : 증류수) 100 ㎕, 100 μM 농도의 2-NBDG 용액(용매 : Dimethyl sulfoxide, DMSO) 500 ㎕, PBS 용액 400 ㎕를 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응액을 제거하고, 세포를 차가운 PBS(Phosphate bufferd saline) 용액으로 3회 세척한 후 2-NBDG의 형광 세기를 형광분광광도계(spectrophotofluorometer; 여기 : 485㎚, 발광: 535㎚)로 측정하였다. 포도당 흡수 저해 활성 측정에 미치는 세포 농도의 영향을 보정해 주기 위해 Bradford protein assay를 다음과 같이 실시하였다. 형광 세기 측정이 끝난 well plate에서 세포를 떼어내어 모으고, lysis buffer를 넣고 -20℃에서 1시간 이상 방치한 후 4℃에서 12000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 얻은 상등액을 이용하여 BSA(bovine serum albumin) 반응을 진행하였다. 반응시킨 용액의 흡광도를 595㎚에서 측정하였다. 시료에 의한 포도당 흡수 저해 활성은 아래 식에 따라 환산하였다.
포도당 흡수능(Glucose uptake, %) = [Fs / Fc] × 100
포도당 흡수 저해 활성(%) = 100- 포도당 흡수능
Fs: 시료를 처리한 실험구의 형광세기
Fc: 시료를 처리하지 않은 실험구의 형광세기
* 양성 표준물질로 궤르세틴(quercetin)을 사용하였음.
(3) 반응표면법(Response surface method, RSM) 분석을 이용한 뽕잎 추출물의 발효 최적 조건 탐색
하기 표 4는 중심합성계획법을 이용하여 설정한 뽕잎 추출물의 발효 실험 조건별로 실험을 진행한 후, 수득한 발효 뽕잎 추출물로부터 측정한 포도당 흡수 저해 활성 값을 나타낸 것이다.
실험 No. 발효 조건 포도당 흡수 저해 활성
(%, 실험값)
뽕잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
1 1 24 32 6.27
2 2 24 32 0
3 1 60 32 2.29
4 2 60 32 4.37
5 1 24 38 13.15
6 2 24 38 22.21
7 1 60 38 27.04
8 2 60 38 19.06
9 0.66 42 35 5.21
10 2.34 42 35 13.72
11 1.5 11.73 35 19.67
12 1.5 72.27 35 28.81
13 1.5 42 29.95 22.64
14 1.5 42 40.05 28.61
15 1.5 42 35 35.52
16 1.5 42 35 34.66
17 1.5 42 35 36.44
다양한 발효 조건으로 실험을 진행하여 얻은 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성 값을 반응표면법으로 분석한 결과 포도당 흡수 저해 활성과 3개의 중요한 발효 공정 독립변수 간에 하기와 같은 2차 회귀식 관계가 성립하였다.
포도당 흡수 저해 활성(%) = 35.99 + 0.82×A + 1.94×B + 5.75×C - 1.09×A×B + 0.66×A×C + 1.29×B×C - 10.78×A2 - 5.55×B2 -5.06×C2
[A : 뽕잎 추출물 농도(중량%), B : 발효 시간(hr), C : 발효 온도(℃)]
도 3은 반응표면법을 이용하여 뽕잎 추출물 발효에 주요 영향을 미치는 요인을 분석하였을 때의 분산분석표이다. 도 3에서 보이는 바와 같이 2차 회귀식에서 C, A2, B2의 상수가 통계적으로 유의한 요소임을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3에서 R-square(결정계수)는 0.8200 이기 때문에 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대한 실험값과 2차 회귀 모델식으로부터 예측한 값이 거의 일치한다는 것을 알 수 있었다.
하기 표 5 및 표 6은 다양한 뽕잎 추출물 발효 조건별 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성을 반응표면법으로 예측한 값이다. 또한, 도 4는 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 뽕잎 추출물의 농도와 발효 시간이 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 4에서 "A"는 뽕잎 추출물 농도와 발효 시간 간의 contour plot이고, "B"는 뽕잎 추출물 농도와 발효 시간 간의 3차원 반응 표면 곡선이다. 또한, 도 5는 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 뽕잎 추출물의 농도와 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 4에서 "A"는 뽕잎 추출물 농도와 발효 온도 간의 contour plot이고, "B"는 뽕잎 추출물 농도와 발효 온도 간의 3차원 반응 표면 곡선이다. 또한, 도 6은 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성에 대해 발효 시간과 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 4에서 "A"는 발효 시간와 발효 온도 간의 contour plot이고, "B"는 발효 시간과 발효 온도 간의 3차원 반응 표면 곡선이다.
실험 No. 발효 조건 포도당 흡수 저해 활성
(%, 예측값)
뽕잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
1 2.00 60.00 38.00 23.98
2 1.03 26.80 32.47 12.36
3 1.50 42.00 35.00 35.99
4 1.00 60.00 38.00 23.19
5 1.97 26.80 32.47 14.56
6 1.03 26.80 37.53 19.19
7 1.00 60.00 32.00 10.41
8 1.97 26.80 37.53 23.47
9 2.00 60.00 32.00 8.57
10 1.50 55.20 37.55 63.46
11 1.17 56.63 35.39 30.03
12 1.62 24.48 36.69 29.71
13 1.29 51.87 35.14 33.59
14 1.48 58.35 32.59 24.34
15 1.66 40.39 36.44 36.60
16 1.04 49.17 34.98 26.31
17 1.91 36.87 33.08 22.88
18 1.02 46.51 37.05 26.90
19 1.38 50.95 34.93 34.80
20 1.84 37.03 36.59 32.59
실험 No. 발효 조건 포도당 흡수 저해 활성
(%, 예측값)
뽕잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
21 1.07 50.83 32.37 18.38
22 1.25 32.66 32.96 24.58
23 1.56 56.74 35.52 34.72
24 1.77 58.79 34.46 28.18
25 1.66 50.06 37.80 36.48
26 1.81 37.10 35.31 32.15
27 1.64 35.47 33.71 30.78
28 1.39 40.58 34.05 32.86
29 1.17 45.08 32.74 24.11
30 1.19 39.92 34.05 28.83
31 1.14 37.69 37.44 29.48
32 1.64 52.28 37.44 36.55
33 1.57 24.20 34.59 27.98
34 1.42 50.27 33.71 31.74
35 1.75 48.88 33.18 27.60
36 1.16 55.03 33.81 26.32
37 1.88 42.00 37.78 31.88
38 1.91 43.79 32.91 22.39
39 1.42 27.25 32.36 22.14
상기 표 5 및 표 6에서 보이는 바와 같이 발효 뽕잎 추출물의 포도당 흡수 저해 활성을 극대화할 수 있는 최적 발효 조건은 다음과 같다.
* 뽕잎 추출물 농도 : 1.66 중량%
* 발효 시간 : 40.39 hr
* 발효 온도 : 36.44℃
5. 중심합성계획 실험 및 반응표면법 분석을 이용한 감잎 추출물의 최적 발효 조건 탐색
(1) 중심합성계획법에 의한 발효 실험 조건의 설정
발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성을 극대화할 수 있는 최적 발효 조건을 탐색하기 위해 중심합성계획법(central composite design, CCD)을 이용하여 발효 실험 조건을 설정하였고, Design Expert S/W ver 7.1.6을 사용하여 실험 결과를 분석하였다. 구체적으로 감잎 추출물 농도, 발효 시간, 그리고 발효 온도를 독립변수로 하여 중심합성계획법에 따라 -α, -1, 0, 1, α의 5단계로 부호화하고, 이를 17구간으로 설정한 뒤 실험을 실시하였다. 독립변수에 의해 영향을 받는 종속 변수는 지방 분화 억제 활성이고, 3회 반복 측정한 후 그 평균값을 이용하여 회귀분석에 사용하였다. 하기 표 7은 감잎 추출물의 발효 실험에 중심합성계획법을 적용하기 위한 독립변수별 설정 조건을 나타낸 것이고, 하기 표 8은 중심합성계획법을 이용하여 실제로 설정한 감잎 추출물의 발효 실험 조건들이다.
5단계 부호 -α -1 0 1 α
감잎 추출물 농도(중량%) 0.66 1 1.5 2 2.34
발효 시간(hour) 11.73 24 42 60 72.27
발효 온도(℃) 29.95 32 35 38 40.05
* 감잎 추출물 농도 : 뽕잎 추출물의 발효 실험에서 뽕잎 추출물이 용해되는 증류수 중량 기준
* α : 1.682
실험 No. 발효 조건
감잎 추출물 농도(중량%) 발효 시간(hour) 발효 온도(℃)
1 1 24 32
2 2 24 32
3 1 60 32
4 2 60 32
5 1 24 38
6 2 24 38
7 1 60 38
8 2 60 38
9 0.66 42 35
10 2.34 42 35
11 1.5 11.73 35
12 1.5 72.27 35
13 1.5 42 29.95
14 1.5 42 40.05
15 1.5 42 35
16 1.5 42 35
17 1.5 42 35
(2) 지방 분화 억제 활성 측정 방법
1) 3T3-L1 지방전구세포의 배양
3T3-L1 세포주는 한국세포주은행(KCLRF, Korean Cell Line Research Foundation)에서 구입하여 사용하였다. 세포는 10%의 bovine calf serum(BCS, Gibco), 1% penicillin streptomycin(Gibco)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Gibco) 배지에 3T3-L1 세포주를 넣고 37℃의 온도 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
2) 3T3-L1 지방전구세포의 생존율 측정
3T3-L1 지방전구세포에 대한 발효 감잎 추출물의 독성 영향을 배제하기 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8)을 이용하여 세포 증식 중 살아있는 세포만을 확인하였다. 96-well plate에 5×104 cells/㎖의 농도로 세포를 분주하고 37℃의 온도 및 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양한 다음, 농도별로 시료 용액(0.5, 1, 2, 4 mg/㎖; 발효 감잎 추출물을 증류수에 용해시켜 제조함)를 첨가하여 24시간 동안 더 배양하였다. 배양 후 10㎕의 CCK-8 용액을 첨가하고 2시간 후, 1N HCl 용액 10 ㎕를 넣어 반응을 정지시킨 뒤 450㎚에서의 흡광도로 발색 정도를 측정하였다.
3) 3T3-L1 지방전구세포의 분화 및 약물 처리
3T3-L1 세포주를 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco)이 첨가된 DMEM 배지에서 24-well plate를 이용하여 2×105 cells/㎖ 농도로 배양시킨 후 confluent한 상태가 되면 분화를 유도하면서 시료용액을 처리(세포 생존율이 약 80% 이상인 농도인 0.5 ㎎/㎖; 발효 감잎 추출물을 증류수에 용해시켜 제조함) 하였다. 분화가 시작한 시점(0일)에서 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1 ㎍/㎖ insulin, 1 μM dexamethasone, 115 ㎍/㎖ isobutyl methylxanthine, 2 μM rosiglitazone 이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 4일 동안 배양하였다. 4일 후에 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1 ㎍/㎖ insulin이 포함된 DMEM 배지로 바꿔주고, 6일째부터 insulin을 첨가하지 않은 배지로 바꿔준 후 8일째 되는 시점까지 배양하였다. 또한, 분화 배지 교환 시 발효 감잎 추출물을 매번 동일 농도로 처리하였다. 양성 대조군으로 epigallocatechin gallate(EGCG, 0.1 mM)를 사용하였다.
4) Oil Red O 염색
3T3-L1 지방전구세포의 지방세포로의 분화 및 지방축적에 미치는 영향을 관찰하기 위해 분화가 종료된 후 DPBS(Dulbecco's Phosphate bufferd saline) 용액으로 각 well을 2회 세척하고, 60% isopropanol 수용액 0.5 ㎖를 넣어준 뒤 5분간 방치하였다. 그 다음 60% isopropanol 수용액을 제거한 뒤 10% formalin 용액으로 고정시킨 후 Oil Red O solution을 0.5 ㎖ 첨가하고 20분간 염색을 하였다. 염색이 끝나면 염색액을 제거하고 증류수로 4회 세척시킨 다음 현미경으로 관찰하였다. 정량적 분석을 위하여 100% isopropanol에 지방을 용출시킨 뒤 spectrophotometer를 이용하여 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시료에 의한 지방 분화 억제 활성은 아래 식에 따라 환산하였다.
지방 분화 억제 활성(%) = 100 - [Fs / Fc] × 100
Fs: 시료를 처리한 실험구의 흡광도
Fc: 시료를 처리하지 않은 실험구의 흡광도
(3) 반응표면법(Response surface method, RSM) 분석을 이용한 감잎 추출물의 발효 최적 조건 탐색
하기 표 9는 중심합성계획법을 이용하여 설정한 감잎 추출물의 발효 실험 조건별로 실험을 진행한 후, 수득한 발효 감잎 추출물로부터 측정한 지방 분화 억제활성 값을 나타낸 것이다.
실험 No. 발효 조건 지방 분화 억제 활성
(%, 실험값)
감잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
1 1 24 32 30.94
2 2 24 32 33.53
3 1 60 32 32.70
4 2 60 32 35.30
5 1 24 38 35.89
6 2 24 38 34.00
7 1 60 38 31.29
8 2 60 38 33.18
9 0.66 42 35 27.17
10 2.34 42 35 32.82
11 1.5 11.73 35 32.70
12 1.5 72.27 35 33.18
13 1.5 42 29.95 33.53
14 1.5 42 40.05 36.71
15 1.5 42 35 37.07
16 1.5 42 35 38.18
17 1.5 42 35 37.18
다양한 발효 조건으로 실험을 진행하여 얻은 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성 값을 반응표면법으로 분석한 결과 지방 분화 억제 활성과 3개의 중요한 발효 공정 독립변수 간에 하기와 같은 2차 회귀식 관계가 성립하였다.
지방 분화 억제 활성(%) = 37.41 + 1.08×A - 0.079×B + 0.53×C + 0.47×A×B - 0.65×A×C + 1.12×B×C - 2.43×A2 - 1.39×B2 -0.62×C2
[A : 감잎 추출물 농도(중량%), B : 발효 시간(hr), C : 발효 온도(℃)]
도 7은 반응표면법을 이용하여 감잎 추출물 발효에 주요 영향을 미치는 요인을 분석하였을 때의 분산분석표이다. 도 7에서 보이는 바와 같이 2차 회귀식에서 A, A2, B×C, B2의 상수가 통계적으로 유의한 요소임을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에서 R-square(결정계수)는 0.9066 이기 때문에 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대한 실험값과 2차 회귀 모델식으로부터 예측한 값이 거의 일치한다는 것을 알 수 있었다.
하기 표 10 및 표 11은 다양한 감잎 추출물 발효 조건별 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성을 반응표면법으로 예측한 값이다. 또한, 도 8은 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 감잎 추출물의 농도와 발효 시간이 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 8에서 "A"는 감잎 추출물 농도와 발효 시간 간의 contour plot이고, "B"는 감잎 추출물 농도와 발효 시간 간의 3차원 반응 표면 곡선이다. 또한, 도 9는 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 감잎 추출물의 농도와 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 9에서 "A"는 감잎 추출물 농도와 발효 온도 간의 contour plot이고, "B"는 감잎 추출물 농도와 발효 온도 간의 3차원 반응 표면 곡선이다. 또한, 도 10은 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성에 대해 발효 시간과 발효 온도가 미치는 영향을 반응표면법 분석으로 예측한 그래프이다. 도 10에서 "A"는 발효 시간와 발효 온도 간의 contour plot이고, "B"는 발효 시간과 발효 온도 간의 3차원 반응 표면 곡선이다.
실험 No. 발효 조건 지방 분화 억제 활성
(%, 예측값)
감잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
1 1.50 42.00 35.00 37.41
2 1.97 26.80 37.53 35.29
3 2.00 60.00 38.00 33.20
4 2.00 60.00 32.00 35.68
5 1.97 26.80 32.47 33.83
6 1.00 60.00 38.00 31.40
7 1.03 26.80 37.53 35.05
8 1.00 60.00 32.00 31.28
9 1.03 26.80 32.47 31.54
10 1.97 57.40 37.68 34.16
11 1.58 59.02 33.92 36.43
12 1.99 42.24 37.57 35.60
13 1.60 48.83 37.45 36.91
14 1.87 36.65 36.26 36.74
15 1.02 58.23 37.91 32.11
16 1.68 56.96 35.44 36.49
17 1.02 39.38 34.83 34.09
18 1.54 31.16 36.51 37.43
19 1.63 39.94 37.70 37.44
20 1.22 48.67 37.73 35.67
실험 No. 발효 조건 지방 분화 억제 활성
(%, 예측값)
감잎 추출물 농도
(중량%)		 발효 시간
(hour)		 발효 온도
(℃)
21 1.19 54.41 37.22 34.66
22 1.11 25.35 32.15 31.80
23 1.09 35.08 34.92 34.80
24 1.69 52.80 33.27 37.05
25 1.50 38.69 33.74 36.96
26 1.76 45.78 32.07 36.74
27 1.37 53.57 35.38 36.27
28 1.51 35.70 37.12 37.62
29 1.02 53.54 34.06 33.03
30 1.01 25.98 32.62 32.35
31 1.48 59.08 36.89 35.45
32 1.23 57.93 33.11 34.53
33 1.07 50.70 36.66 34.23
34 1.93 57.42 33.95 36.06
35 1.15 45.74 32.25 34.11
36 1.09 26.60 35.99 34.85
37 1.03 46.81 36.87 34.32
38 1.54 40.11 33.93 37.18
39 1.78 26.56 32.23 34.51
상기 표 10 및 표 11에서 보이는 바와 같이 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성을 극대화할 수 있는 최적 발효 조건은 다음과 같다.
* 감잎 추출물 농도 : 1.51 중량%
* 발효 시간 : 35.70 hr
* 발효 온도 : 37.12℃
6. 대량 발효를 통한 발효 추출물들의 제조 및 이들의 특성 평가
(1) 바이오리액터(Bioreactor)를 이용한 뽕잎 추출물의 대량 발효
동결건조 형태의 뽕잎 추출물을 3.5ℓ 용량의 바이오리액터에서 발효시키고 원심분리 및 동결건조 과정을 거쳐 발효 뽕잎 추출물을 제조하였다. 뽕잎 추출물의 발효시 공정 조건은 다음과 같다.
* 발효 균주 : 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KCCM 80111)
* 균주 접종량 : 1%(v/v)
* 뽕잎 추출물 농도 : 1.66 중량%
* 발효 시간 : 40.39 hr
* 발효 온도 : 36.44℃
(2) 바이오리액터(Bioreactor)를 이용한 감잎 추출물의 대량 발효
동결건조 형태의 감잎 추출물을 3.5ℓ 용량의 바이오리액터에서 발효시키고 원심분리 및 동결건조 과정을 거쳐 발효 감잎 추출물을 제조하였다. 감잎 추출물의 발효시 공정 조건은 다음과 같다.
* 발효 균주 : 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C2-3(KCCM 80110)
* 균주 접종량 : 1%(v/v)
* 감잎 추출물 농도 : 1.51 중량%
* 발효 시간 : 35.70 hr
* 발효 온도 : 37.12℃
(3) 대랑 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물의 알파-글루코시다제 억제 활성 측정
3 mM p-NPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside)와 0.25 유닛 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)를 이용하여 뽕잎 추출물의 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물의 알파-글루코시다제 억제 활성을 측정하였다. 구체적으로 알파-글루코시다아제 50 ㎕ 및 시료 용액(발효 뽕잎 추출물을 증류수에 용해시켜 제조함; 발효 뽕잎 추출물 농도는 5 ㎎/㎖, 10 ㎎/㎖임) 50 ㎕로 구성된 반응액을 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 또한, 양성 대조군으로 발효 뽕잎 추출물 대신 아카보스(acabose)를 사용하였다. 이 반응액에 3 mM p-NPG 100 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 10분 동안 추가 반응시킨 후, 0.1M 탄산나트륨 용액 750 ㎕를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 이후, 분광광도계를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였고 아래와 같은 환산식을 이용하여 알파-글루코시다제 억제 활성(또는 알파-글루코시다제 억제율)을 계산하였다.
억제율(Inhibition ratio, %) = {(Xb-Xa)/Xb}×100
Xb : 시료 처리한 반응액의 흡광도
Xa: 시료를 처리하지 않은 반응액의 흡광도
도 11은 뽕잎 추출물 또는 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물의 알파-글루코시다제 억제 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 11에서 "뽕잎(추출)"은 뽕잎의 열수 추출물을 처리한 실험군을 나타내고, "뽕잎(발효)"는 뽕잎의 열수 추출물을 대량으로 발효시켜 제조한 발효 뽕잎 추출물을 처리한 실험군을 나타낸다. 도 11에서 보이는 바와 같이 발효 뽕잎 추출물은 뽕잎 추출물 및 양성 대조 물질인 아카보스(acabose)보다 높은 알파-글루코시다제 억제 활성을 나타내었다.
(4) 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물 등의 포도당 흡수 저해 활성 측정
뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물과 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물을 동량으로 혼합한 혼합물 등에 대한 포도당 흡수 저해 활성을 전술한 방법과 동일한 방법(중심합성계획법에 의한 발효 실험 참조)으로 수행하였다. 도 12는 뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물, 대량 발효를 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물과 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물을 동량으로 혼합한 혼합물 등의 포도당 흡수 저해 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 12에서 "Control"은 시료를 처리하지 않은 대조군을 나타내고, "Quercetin"은 시료로 양성 표준 물질인 궤르세틴(Quercetin)을 처리한 실험군을 나타내고, "뽕잎 추출물"은 뽕잎의 열수 추출물을 처리한 실험군을 나타내고, "뽕잎 발효물"은 뽕잎의 열수 추출물을 대량으로 발효시켜 제조한 발효 뽕잎 추출물을 처리한 실험군을 나타내고, "뽕잎-감잎 발효 혼합물(5:5)"은 대량 발효을 통해 제조한 발효 뽕잎 추출물과 발효 감잎 추출물의 동량 혼합물을 처리한 실험군을 나타낸다. 도 12에서 Y 축은 시료를 처리하지 않은 대조군을 100으로 하여 다른 실험군의 상대적인 포도당 흡수능을 나타낸 것이으로서, 포도당 흡수 저해 활성은 포도상 흡수능이 낮을수록 높은 것으로 해석된다. 도 12에서 보이는 바와 같이 대량으로 발효시켜 제조한 발효 뽕잎 추출물 또는 대량으로 발효시켜 제조한 발효 뽕잎 추출물과 발효 감잎 추출물의 혼합물은 뽕잎 열수 추출물보다 높은 포도당 흡수 저해 활성을 보였고, 양성 표준 물질인 궤르세틴(Quercetin)과 동일 수준의 값을 보였다.
(5) 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성을 통한 예측 값 검증
대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성을 전술한 방법과 동일한 방법(중심합성계획법에 의한 발효 실험 참조)으로 측정하고 이를 반응표면법으로 분석한 예측 값과 비교하였다. 도 13은 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물의 지방 분화 억제 활성 측정 값과 반응표면법으로 분석한 예측 값을 나타낸 것이다. 도 13에서 "감잎 발효물"은 대량 발효를 통해 제조한 발효 감잎 추출물을 나타낸다. 도 13에서 보이는 바와 같이 실제 측정 값과 예측 값은 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다.
7. 발효 감잎 추출물 등을 포함하는 약학 조성물의 제조
하기의 약학 조성물 제조에서 발효 감잎 추출물은 발효 감잎, 발효 뽕잎 또는 발효 뽕잎 추출물로 대체가 가능하다.
<7-1> 산제의 제조
발효 감잎 추출물 20 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<7-2> 정제의 제조
발효 감잎 추출물 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<7-3> 캡슐제의 제조
발효 감잎 추출물 10 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
유 당 15 ㎎
스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<7-4> 환의 제조
발효 감잎 추출물 10 ㎎
유당 150 ㎎
글리세린 100 ㎎
자일리톨 50 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<7-5> 과립의 제조
발효 감잎 추출물 15 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<7-6> 주사제의 제조
발효 감잎 추출물 10 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합한 후, 이중 2㎖를 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
8. 발효 감잎 추출물 등을 포함하는 식품 조성물의 제조
하기의 식품 조성물 제조에서 발효 감잎 추출물은 발효 감잎, 발효 뽕잎 또는 발효 뽕잎 추출물로 대체가 가능하다.
<8-1> 밀가루 식품의 제조
밀가루 100 중량부에 발효 감잎 추출물 0.5 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<8-2> 유제품(dairy products)의 제조
우유 100 중량부에 발효 감잎 추출물 0.5 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<8-3> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 발효 감잎 추출물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 17 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
발효 감잎 추출물(1 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<8-4> 건강음료의 제조
액상과당(0.5 g), 올리고당(4 g), 설탕(2 g), 식염(0.5 g), 물(77 g)과 같은 부재료와 발효 감잎 추출물 1 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<8-5> 야채 주스의 제조
발효 감잎 추출물 2 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<8-6> 과일 주스의 제조
발효 감잎 추출물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 발효 감잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서,
    상기 발효 감잎 추출물은 감잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KFCC 11662P) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C2-3(KFCC 11661P)로 발효시킨 산물의 추출물 또는 감잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KFCC 11662P) 또는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) C2-3(KFCC 11661P)로 발효시킨 산물인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시 발효 온도는 33~39℃이고, 발효 시간은 37~57hr 인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시 발효 온도는 35~38℃이고, 발효 시간은 38~56hr 인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  11. 제 7항에 있어서, 상기 감잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시 감잎 추출물 농도는 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.2~1.9 중량%인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 감잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시 감잎 추출물 농도는 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.4~1.8 중량%인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  13. 제 7항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시 발효 온도는 32~39℃이고, 발효 시간은 25~60hr 인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시 발효 온도는 33~38℃이고, 발효 시간은 30~55hr 인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  15. 제 7항에 있어서, 상기 감잎 추출물을 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시 감잎 추출물 농도는 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.0~2.0 중량%인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 감잎 추출물을 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)로 발효시 감잎 추출물 농도는 물(water) 전체 중량을 기준으로 1.4~1.8 중량%인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  17. 삭제
  18. 제 7항 또는 제 9항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 뽕잎 추출물을 더 포함하고,
    상기 발효 뽕잎 추출물은 뽕잎을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시킨 산물의 추출물이거나 뽕잎 추출물을 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)로 발효시킨 산물인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 뽕잎 또는 뽕잎 추출물을 발효시키기 위해 사용되는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) C2-17(기탁번호 : KFCC 11662P)인 것을 특징으로 하는 항비만 조성물.
KR1020160065827A 2016-05-27 2016-05-27 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도 KR101745597B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160065827A KR101745597B1 (ko) 2016-05-27 2016-05-27 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160065827A KR101745597B1 (ko) 2016-05-27 2016-05-27 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101745597B1 true KR101745597B1 (ko) 2017-06-12

Family

ID=59219532

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160065827A KR101745597B1 (ko) 2016-05-27 2016-05-27 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101745597B1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101931050B1 (ko) 2018-03-16 2018-12-19 사단법인 제주자원식물황칠사업단 제주 황칠나무 특성 및 품질 관리를 위한 분석방법
KR20210024265A (ko) 2019-08-20 2021-03-05 주식회사 킥더허들 항비만용 조성물
KR20230025725A (ko) 2021-08-13 2023-02-23 주식회사 킥더허들 항비만용 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Korean Society of Grassland Forage Science, 2012, 32(4), 361-368*

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101931050B1 (ko) 2018-03-16 2018-12-19 사단법인 제주자원식물황칠사업단 제주 황칠나무 특성 및 품질 관리를 위한 분석방법
KR20210024265A (ko) 2019-08-20 2021-03-05 주식회사 킥더허들 항비만용 조성물
KR20230025725A (ko) 2021-08-13 2023-02-23 주식회사 킥더허들 항비만용 조성물

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101851195B1 (ko) 발효 뽕잎, 발효 뽕잎 추출물 및 이의 용도
KR100734975B1 (ko) 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 바실러스 서브틸리스ｓ10 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물
KR101600940B1 (ko) 식물성유산균 발효액을 포함하는 당뇨 및 고혈압 예방 및 치료용 조성물
KR101745597B1 (ko) 발효 감잎, 발효 감잎 추출물 및 이의 용도
KR101718323B1 (ko) 발효옻 추출물을 포함하는 위염, 위궤양, 십이지장 궤양, 위암 및 위점막 손상 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR102080719B1 (ko) 약콩 발효물을 포함하는 근감소증의 예방, 치료용, 근력 개선 또는 근육량 증대용 조성물
KR101037101B1 (ko) 신규한 바실러스 균주 및 이를 이용한 뽕잎발효물
KR20100122296A (ko) 발효차를 함유하는 혈액 순환 개선용 조성물 및 이를 포함하는 약제학적 및 건강 식품 조성물
KR101578581B1 (ko) 신종균 크리세오박테리움 ｔｈｇ-ｃ4-1 및 이를 이용한 지페노사이드 17 생산 방법
KR100871399B1 (ko) 면역 활성 증강용 동충하초 액체배양물로부터 얻어지는균체내 다당체와 균체외 다당체 및 그 생산 최적 배양조건
KR20230134112A (ko) 흑삼 추출물 및 흑삼에서 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 반려견의 면역력 증진용 조성물
KR101882475B1 (ko) 베타-글루코시다제 활성을 갖는 신규 유산균 및 이의 용도
KR101935689B1 (ko) 대추, 감초 및 도라지 혼합 추출물의 발효물을 함유하는 면역 증강용 조성물
KR101942959B1 (ko) 다래 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 당뇨합병증 예방 또는 치료용 조성물
KR101401515B1 (ko) 홍국균을 이용한 발효 천마의 제조방법 및 발효 천마의 용도
KR102501955B1 (ko) 동과 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물
KR20230095471A (ko) 오미자박 발효물을 유효성분으로 포함하는 근력개선용 조성물 및 그의 제조방법
KR101975018B1 (ko) 인삼열매-목이버섯 균사체 혼합 배양물을 포함하는 콜레스테롤 저하용 조성물
KR20120019311A (ko) 면역기능을 증진시키기 위하여 조제한 인삼의 상황버섯 균사체 발효물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성용 조성물
KR20200008978A (ko) 약콩 발효물을 함유하는 면역기능증진용 조성물
KR20200000743A (ko) 효모 추출물을 포함하는 당뇨 개선 또는 항산화용 조성물 및 효모 추출물의 제조 방법
KR101537579B1 (ko) 곰팡이 아스퍼질러스 테레우스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 신경보호용 조성물
KR102368532B1 (ko) 신규한 사카로마이세스 세리비지애 hdb 9012 균주, 이를 이용한 흑하랑 발효물의 제조 및 락투신 증강 방법
KR102496029B1 (ko) 신규 영지버섯 guc211 및 이를 함유하는 항당뇨용 조성물
KR102496034B1 (ko) 신규 차가버섯 guc111 및 이를 함유하는 항당뇨용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant